CN112941096B

CN112941096B - 重组质粒组合、基因改造酵母菌及生产奇数链脂肪酸方法

Info

Publication number: CN112941096B
Application number: CN201911259420.0A
Authority: CN
Inventors: 史硕博; 孟琼宇; 丁文涛
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2039-12-10
Also published as: WO2021114913A1; CN112941096A

Abstract

本发明涉及真核生物酵母菌基因改造和发酵领域，提供了一种重组质粒组合、基因改造酵母菌及生产奇数链脂肪酸方法，包括至少一个表达质粒；所述表达质粒包括至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性、脂肪酸合成酶活性、丙酰辅酶A合成酶活性、醛脱氢酶活性或酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；上述重组质粒组合可以对微生物进行基因工程改造，使得改造的微生物内能够进行关键酶的表达调节，以建立奇数链脂肪酸的合成途径，可以利用丙酸或非丙酸的L‑苏氨酸和(或)葡萄糖直接合成奇数链脂肪酸，发酵成本低，能够进一步通过基因改造的方法继续提高奇数链脂肪酸产量和比例。

Description

重组质粒组合、基因改造酵母菌及生产奇数链脂肪酸方法

技术领域

本发明涉及真核生物酵母菌基因改造和发酵领域，具体涉及一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合、基因改造酵母菌和生产奇数链脂肪酸的方法。

背景技术

奇数链脂肪酸(Odd chain fatty acid，OCFA)的功能类似不饱和脂肪酸，有助于提高细胞膜的流动性。自然界绝大多数脂肪酸都是偶数链脂肪酸，奇数链脂肪酸极为稀少，因此奇数链脂肪酸相比常规的偶数链脂肪酸具有更高的价值。在生产方面，奇数链脂肪酸无论化学合成还是天然提取都较为困难，前者污染严重，后者成本过高。利用微生物生产奇数链脂肪酸是解决奇数链脂肪酸生产困难问题的重要途径。

目前，较为常用的微生物发酵方法是利用基因工程大肠杆菌来生产奇数链脂肪酸。如Wu H(Biotechnology and Bioengineering,2014,111(11):2209-2219)等报道了利用基因工程大肠杆菌来生产奇数链脂肪酸的方法；中国专利文献CN103906845B披露的相似的利用基因工程大肠杆菌来生产奇数链脂肪酸的方法。上述这些已披露的方法以基因工程改造的大肠杆菌作为发酵微生物，以含有丙酸或丙酸盐的培养基培养。然而，大肠杆菌发酵过程中存在如下缺陷：(1)可能合成内毒素，增加产品食用风险；(2)发酵过程极易污染，而大型发酵设备灭菌困难，对操作条件和设备要求较高；(3)不能以淀粉、葡萄糖等廉价碳源直接合成奇数链脂肪酸，因此大幅提高了生产成本。

近几年，也有人提出利用其他微生物生产奇数链脂肪酸。如Park YK(Biotechnology for Biofuels,2018,11(1):158)等报道了利用产油酵母Yarrowialipolytica以丙酸为底物合成奇数链脂肪酸的方法；Bhatia,SK等报道了利用未改造的Rhodococcus sp.以丙酸作为碳源合成奇数链脂肪酸的研究；CN201511003214.5披露了利用裂殖壶菌以乳酸盐或丙酸盐为底物生产奇数链脂肪酸的方法。然而，上述方法仍然需要添加丙酸或丙酸盐作为碳源，不仅提高了发酵成本，还存在由于丙酸不是微生物利用的最佳碳源导致微生物生长缓慢、发酵周期延长等问题，同时Rhodococcus sp和裂殖壶菌的遗传背景不清晰、基因改造操作技术不完善，使得通过基因改造的方法继续提高微生物奇数链脂肪酸产量和比例较为困难。除上述报道外，2019年，Wang FZ(Biotechnology forBiofuels,2019,12:141)等报道了利用裂殖壶菌以简单碳源葡萄糖生产奇数链脂肪酸的研究，虽然不需添加丙酸为发酵底物，但其同样存在遗传背景不清晰、基因改造操作技术不完善，使得通过基因改造的方法继续提高微生物奇数链脂肪酸产量和比例困难，以及发酵成本过高的问题仍然没有解决。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中的基因工程改造的微生物继续提高奇数链脂肪酸产量和比例困难，发酵成本过高的缺陷，进而提供一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合、基因改造酵母菌和生产奇数链脂肪酸的方法，以真核细胞生物酵母菌为出发微生物，利用重组质粒组合进行通过基因工程改造获得细胞内酶表达调节的酵母菌并且在微生物细胞内建立奇数链脂肪酸的合成途径，使得基因工程改造的酵母菌不仅能够利用丙酸或非丙酸培养基环境生产奇数链脂肪酸，并且能够利用L-苏氨酸和(或)葡萄糖直接合成奇数链脂肪酸，发酵成本低，能够进一步通过基因改造的方法继续提高奇数链脂肪酸产量和比例。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，包括至少一个表达质粒；所述表达质粒包括至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性、脂肪酸合成酶活性、丙酰辅酶A合成酶活性、醛脱氢酶活性或酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸。

优选的，所述醛脱氢酶活性为乙醛脱氢酶活性。

优选的，所述酮酸脱羧酶活性为α-酮酸脱羧酶活性。

优选的，所述表达质粒包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有脂肪酸合成酶活性、丙酰辅酶A合成酶活性、乙醛脱氢酶活性或α-酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸。

优选的，所述表达质粒包括：至少一个编码丙酰辅酶A合成酶的多肽的多核苷酸。

优选的，所述表达质粒包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶活性的多肽的多核苷酸。

更优选的，所述表达质粒包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；

至少一个编码具有α-酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶活性的多肽的多核苷酸。

进一步的，所述表达质粒包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；

至少一个编码具有α-酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；

至少一个编码具有乙醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶活性的多肽的多核苷酸。

进一步的，所述表达质粒还包括至少一个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸合成酶活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性或天冬氨酸转氨酶活性的多肽的多核苷酸；优选的，所述编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸为突变的多核苷酸。

进一步的，包括至少一个敲除质粒；所述敲除质粒是基于L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因、乙酰乳酸合成酶基因或苏氨酸醛缩酶基因设计的，用以敲除L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因、乙酰乳酸合成酶基因或苏氨酸醛缩酶基因。

进一步的，包括至少一个丙酮酸激酶活性减弱质粒；所述酶活性减弱质粒是基于丙酮酸激酶基因的强启动子设计的敲除质粒，用以敲除丙酮酸激酶基因的强启动子。

一种基因工程改造的酵母菌，包括至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性、脂肪酸合成酶活性、丙酰辅酶A合成酶、醛脱氢酶活性或酮酸脱羧酶的多肽的多核苷酸。

优选的，所述醛脱氢酶活性为乙醛脱氢酶活性。

优选的，所述酮酸脱羧酶活性为α-酮酸脱羧酶活性。

优选的，所述酵母菌包括如下所述的多核苷酸：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；和

优选的，所述酵母菌包括至少一个编码丙酰辅酶A合成酶活性的多肽的多核苷酸。

优选的，所述基因工程改造的酵母菌包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶的多肽的多核苷酸。

更优选的，所述基因工程改造的酵母菌包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；

至少一个编码具有酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶的多肽的多核苷酸。

进一步的，所述基因工程改造的酵母菌包括：

至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；

至少一个编码具有酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；

至少一个编码具有乙醛脱氢酶活性的多肽的多核苷酸；和

至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶的多肽的多核苷酸。

进一步的，还包括至少一个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸合成酶活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性或天冬氨酸转氨酶活性的多肽的多核苷酸；优选的，所述编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸为突变的多核苷酸。

进一步的，还包括L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因、乙酰乳酸合成酶基因或苏氨酸醛缩酶基因被敲除。

进一步的，还包括丙酮酸激酶的表达水平被减弱。

进一步的，所述酵母菌包括但不限于酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或假丝酵母；优选的，为酿酒酵母或乳酸克鲁维酵母；更优选的，为酿酒酵母。

本发明提供了一种所述的重组质粒组合或所述基因工程改造的酵母菌在合成奇数链脂肪酸/脂或提高奇数链脂肪酸/脂比例的用途。

所述的奇数链脂肪酸/脂是指奇数链脂肪酸或奇数链脂肪酸脂。

优选的，所述奇数链脂肪酸包括C13:0、C15:0、C15:1、C17:0、C17:1、C19:0和C19:1中的至少一种；优选的，所述奇数链脂肪酸酯是指含有奇数链脂肪酸中的至少一种的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和/或磷脂。

本发明提供了一种制备奇数链脂肪酸的方法，包括利用所述的重组质粒组合或所述基因工程改造的酵母菌。

进一步的，在所述的方法中，在制备过程中使用的培养基中：含有浓度为0.01-100g/L的丙酸或丙酸盐；优选的，丙酸或丙酸盐的浓度为1-10g/L；更优选的，丙酸或丙酸盐的浓度为1-4g/L；或

含有浓度为0.01-200g/L的L-苏氨酸或L-苏氨酸盐；优选的，L-苏氨酸或L-苏氨酸盐的浓度为1-20g/L；更优选的，L-苏氨酸或L-苏氨酸盐的浓度为10g/L；或

含有浓度为0.01-300g/L的葡萄糖；优选的，葡萄糖的浓度为10-100g/L；更优选的，葡萄糖的浓度为20g/L。

上述涉及的酶的国际酶学委员会编号为：

丙酰辅酶A合成酶为E.C.6.2.1.17；

苏氨酸脱氨酶为E.C.4.3.1.17或E.C.4.3.1.19；

丙酰辅酶A转移酶为E.C.2.8.3.1；

α-酮酸脱羧酶为E.C.4.1.1.1或E.C.4.1.1.43或E.C.4.1.1.72或E.C.4.1.1.74；

乙醛脱氢酶为E.C.1.2.1.3或E.C.1.2.1.4或E.C.1.2.1.5；

脂肪酸合成酶为E.C.1.3.1.9或E.C.2.3.1.38或E.C.2.3.1.39或E.C.2.3.1.86或E.C.3.1.2.14或E.C.4.2.1.59；

天冬氨酸激酶为E.C.2.7.2.4；

高丝氨酸脱氢酶为E.C.2.7.1.39；

苏氨酸合成酶为E.C.4.2.3.1；

丙酮酸羧化酶为E.C.6.4.1.1；

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶E.C.4.1.1.31；

天冬氨酸转氨酶为E.C.2.6.1.1或E.C.2.6.1.27或E.C.2.6.1.3或E.C.2.6.1.7；

L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶为E.C.2.3.1.31；

乙酰乳酸合成酶为E.C.2.2.1.6；

苏氨酸醛缩酶为E.C.4.1.2.48；

丙酮酸激酶为E.C.2.7.1.40。

本发明技术方案，具有如下优点：

(1)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，包括至少一个表达质粒；所述表达质粒包括至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性、脂肪酸合成酶活性、丙酰辅酶A合成酶、醛脱氢酶活性或酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；上述重组质粒组合可以对微生物如真核细胞生物酵母菌进行基因工程改造，使得改造的微生物内能够进行关键酶的表达调节，以建立奇数链脂肪酸的合成途径，可以利用丙酸或非丙酸培养基环境生产奇数链脂肪酸，并且能够利用L-苏氨酸和(或)葡萄糖直接合成奇数链脂肪酸，发酵成本低，能够进一步通过基因改造的方法继续提高奇数链脂肪酸产量和比例。

(2)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，所述表达质粒包括：至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；和至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶活性的多肽的多核苷酸；上述重组质粒组合可以对微生物如真核细胞生物酵母菌进行基因工程改造，改造后的微生物能够利用L-苏氨酸和(或)葡萄糖直接合成奇数链脂肪酸，增加奇数链脂肪酸产量和比例。

(3)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，所述表达质粒包括：至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性的多肽的多核苷酸；至少一个编码具有酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；和至少一个编码具有丙酰辅酶A合成酶的多肽的多核苷酸；上述重组质粒组合可以对微生物如真核细胞生物酵母菌进行基因工程改造，改造后的微生物能够利用L-苏氨酸和(或)葡萄糖直接合成奇数链脂肪酸，增加奇数链脂肪酸产量和比例。

(4)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，所述表达质粒还包括至少一个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸合成酶活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性或天冬氨酸转氨酶活性的多肽的多核苷酸；上述重组质粒组合可以对微生物如真核细胞生物酵母菌进行基因工程改造，改造后的微生物内表达调节酶，进一步建立奇数链脂肪酸的合成途径，增加奇数链脂肪酸产量和比例。

(5)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，所述表达质粒还包括至少一个敲除质粒；所述敲除质粒是基于L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因、乙酰乳酸合成酶基因或苏氨酸醛缩酶基因设计的；上述重组质粒组合可以对微生物进行基因工程改造，失活微生物细胞内的L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶、乙酰乳酸合成酶或苏氨酸醛缩酶的表达，以减少代谢之路的通量的损失。

(6)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，包括至少一个丙酮酸激酶活性减弱质粒；上述重组质粒组合对微生物进行基因工程改造后，减少微生物细胞内的丙酮酸激酶的表达，以促使葡萄糖到丙酰辅酶A代谢通量的进一步提高。

(7)本发明提供了一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，所述编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸为突变的多核苷酸；上述的目的在于，包含上述突变的多核苷酸的上述重组质粒组合对微生物进行基因工程改造后，可以去除苏氨酸对代谢途径的反馈抑制。

(8)本发明提供了一种基因工程改造的酵母菌，包括至少一个编码具有苏氨酸脱氨酶活性、脂肪酸合成酶活性、丙酰辅酶A合成酶活性、醛脱氢酶活性或酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸；上述基因工程改造的酵母菌，可以通过表达苏氨酸脱氨酶、丙酰辅酶A合成酶、脂肪酸合成酶、醛脱氢酶或酮酸脱羧酶等编码基因，在酵母中建立奇数链脂肪酸合成途径，实现以葡萄糖或苏氨酸为底物发酵合成奇数链脂肪酸(如图22所示)，可以利用丙酸或非丙酸培养基环境生产奇数链脂肪酸，并且能够利用L-苏氨酸和(或)葡萄糖直接合成奇数链脂肪酸，发酵成本低，能够进一步通过基因改造的方法继续提高奇数链脂肪酸产量和比例，酵母菌是传统发酵微生物，具有生长快速、产出效率高，成本降低，安全且环保的优点。

(9)本发明提供了一种基因工程改造的酵母菌，还包括至少一个编码具有天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸合成酶活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性或天冬氨酸转氨酶活性的多肽的多核苷酸；上述基因工程改造的酵母菌，通过过表达从磷酸烯醇式丙酮酸到丙酰辅酶A整个代谢途径(如图22)的全部或部分酶以增加代谢通量，进一步提高奇数链脂肪酸产量和比例。

(10)本发明提供了一种基因工程改造的酵母菌，还包括L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因、乙酰乳酸合成酶基因或苏氨酸醛缩酶基因被敲除；上述基因工程改造的酵母菌，可以减少代谢支路的通量损失。

(11)本发明提供了一种基因工程改造的酵母菌，还包括丙酮酸激酶的表达水平被减弱；上述目的在于，以促使葡萄糖到丙酰辅酶A代谢通量的进一步提高；进一步的，所述编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸为突变的多核苷酸，通过突变天冬氨酸激酶活性的多肽，以去除苏氨酸对代谢途径的反馈抑制，可以减少代谢支路的通量损失。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中表达质粒Y33-prpE的图谱；

图2是本发明实施例1中表达质粒Y22-tdcB的图谱；

图3是本发明实施例1中表达质粒Y33-CpPCT的图谱；

图4是本发明实施例1中表达质粒Y33-PduP的图谱；

图5是本发明实施例1中表达质粒Y22-tdcB-kivD的图谱；

图6是本发明实施例1中表达质粒Y22-tdcB-kivD-ALD4的图谱；

图7是本发明实施例2中表达质粒Y33-thrAmu的图谱；

图8是本发明实施例2中表达质粒T4-thrBC的图谱；

图9是本发明实施例2中表达质粒Y33-thrABC的图谱；

图10是本发明实施例3中表达质粒Y33-HOM3mu的图谱；

图11是本发明实施例3中表达质粒T4-ppc-aspC的图谱；

图12是本发明实施例3中表达质粒Y33-HOM3mu-ppc-aspC的图谱；

图13是本发明实施例4中表达质粒Y33-Thrsix的图谱；

图14是本发明实施例5中表达质粒Y22-tdcB-kivD-V2的图谱；

图15是本发明实施例5中表达质粒Y22-tdcB-kivD-prpE的图谱；

图16是本发明实施例6中表达质粒pCas-MET2-del的图谱；

图17是本发明实施例6中表达质粒pCas-ILV6-del的图谱；

图18是本发明实施例6中表达质粒pCas-GLY1-del的图谱；

图19是本发明实施例7中表达质粒pCas-PYK1p-del的图谱；

图20是本发明实施例8中各个酵母菌所产生脂肪酸的种类柱状图；

图21是本发明实施例11中各重组菌株脂肪酸生产情况柱状图；

图22是本发明的以葡萄糖为底物发酵合成奇数链脂肪酸的路线图；

图23是本发明的丙醛到丙酰辅酶A的酶促转化路线图；

图24是本发明的以L-苏氨酸为底物prpE途径合成奇数链脂肪酸的路线图；

图25是本发明的表达质粒Y33-PGKCYC的图谱；

图26是本发明的表达质粒Y22-PGKCYC的图谱；

图27是本发明的表达质粒Y33-PGKCYC-Mss的图谱；

图28是本发明的表达质粒pT4的图谱；

图29是本发明的表达质粒pST1.G.Ura3的图谱。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中使用的培养基组方及发酵方法如下：

种子液培养使用YPD培养基，含有下列成分(g/L)：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖。

发酵培养基为矿物质培养基，含有下列成分(g/L)：3.5g/L KH₂PO₄，2g/L Na₂HPO₄(2)，1.5g/L MgSO₄.7 H₂O，1.5g/L NH₄Cl，1.5g/L酵母提取物；pH调整到6.0；灭菌后每升矿物质培养基还需加入微量营养液(含20g/L MnCl₂.4H₂O，20g/L CaCl₂.2H₂O，1g/LFeSO₄.7H₂O，1g/L NaMoO₄.2H₂O)1mL；灭菌后加入20g/L葡萄糖。也可根据实验需求在上述基础上添加丙酸钠或L-苏氨酸。

完全极限培养基(CM)含有下列成分：无氨基酵母氮源(不含硫酸铵)YNB w/o AA0.67％(w/v)，葡萄糖2％(w/v)，Dropout powder 0.083％(w/v)，其它营养成分(mg/L)：腺嘌呤50mg/L，尿嘧啶50mg/L，组氨酸100mg/L，亮氨酸100mg/L，色氨酸100mg/L。其中Dropoutpowder含(mg/L)：

苏氨酸150mg/L，酪氨酸30mg/L，颉氨酸150mg/L，赖氨酸30mg/L，谷氨酸100mg/L，丝氨酸150mg/L，天冬氨酸100mg/L，甲硫氨酸20mg/L，苯丙氨酸50mg/L，异亮氨酸30mg/L，精氨酸20mg/L。

省却上述特定的成分可配制成省却特定成分的CM培养基，液体培养基pH5.6，固体培养基加1.5％的琼脂粉，pH6.5，在121℃下灭菌15min；然后再加入40％(w/v)葡萄糖使之终浓度为20g/L。

下述实施例中涉及的脂肪酸检测方法：

取1mL发酵液在微波消解内管(玻璃管)中冷冻干燥(-50℃，约36小时)。依次加入内标(C14:1，10mg/mL)5μL，正己烷2mL，BF₃-甲醇溶液(14％)1mL，混合均匀后用氮气吹拂30秒，盖紧瓶盖。将准备好的盛有样品的微波消解内管装入盛有15mL蒸馏水的微波消解外管中，拧紧外管盖，放入微波消解仪(Milestone Start D,Sorisole Bergamo,Italy)中，120℃消解5分钟。待冷却后取出内管，加入1mL超纯水，混合均匀后，取200μL上层正己烷相进行气质联用仪(GC-MS)分析。

GC-MS分析方法：

所用仪器为岛津GCMS-QP2020，色谱柱为DB-5ms(30m×0.25mm I.D.,0.25-μmfilm thickness)，载气为氦气。进样口温度280℃，总流量50mL/min，柱流量1.78mL/min，分流比9；柱温初始40℃持续2分钟，升温到130℃(速率30℃/分钟)，再升温到280℃(速率5℃/分钟)，保持3分钟。

下述实施例中涉及的基因、引物、质粒等由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。

下述实施例中涉及的质粒Y33-PGKCYC、Y22-PGKCYC、Y33-PGKCYC-Mss由北京化工大学软物质科学与工程高精尖创新中心史硕博课题组提供；

质粒Y33-PGKCYC的构建方法：

首先获取酿酒酵母PGK1启动子片段：以酿酒酵母基因组为模板，以如下引物进行聚合酶链式反应(PCR)

引物PGK1-F(5’-3’)：

CAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTC；

引物PGK1-R(5’-3’)：

TGCGGCCCTCTAGATTCGAGGTCGACTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAGATAATTAC；

表1.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(酿酒酵母基因组)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表2.PCR反应程序：

然后获取酿酒酵母CYC1终止子片段：以酿酒酵母基因组为模板，以如下引物进行聚合酶链式反应(PCR)

引物CYC1-F(5’-3’)：

TATAAAACAGTCGACCTCGAATCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTT；

引物CYC1-R(5’-3’)：

ACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCGCAAATTAAAGCCTTCGAGC；

表3.PCR反应体系：

表4.PCR反应程序：

将载体YCplac33(ATCC87586)用HindⅢ和EcoRⅠ进行酶切(37℃，2小时)，之后回收载体(5.5kb)，并与上述2个PCR片段(PGK1启动子和CYC1终止子片段)利用NEBuilder高保真DNA组装克隆试剂盒(NEB公司#E5520S)进行组装(50℃，1小时)，获得质粒Y33-PGKCYC，获得的质粒Y22-PGKCYC的图谱如图25所示。

质粒Y22-PGKCYC的构建方法：

质粒Y22-PGKCYC的构建方法与Y33-PGKCYC相同，只是出发质粒由YCplac33替换为YCplac22(ATCC87585)，获得的质粒Y22-PGKCYC的图谱如图26所示。

质粒Y33-PGKCYC-Mss的构建方法：

以质粒Y33-PGKCYC为模板，Mss-F和Mss-R为引物进行PCR：

Mss-F(5’-3’)：

TACCGAGCTCGAATTCGTTTAAACACTGGCCGTCGTTTTACA；

Mss-R(5’-3’)：

GTTTAAACGAATTCGAGCTCGGTACCGCAAATTAAAG；

表5.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	1.5
下游引物	1.5
		模板(Y33-PGKCYC)	0.1
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33.4
总体积	50

表6.PCR反应程序：

PCR产物用DpnⅠ消化(37℃，2小时)后，直接转化大肠杆菌，即获得Y33-PGKCYC-Mss，质粒Y33-PGKCYC-Mss的图谱如图27所示。

质粒pT4构建方法

将含有RPS2终止子和TDH1终止子的DNA片段(SEQ ID NO.17)人工合成并插入到市售pUC57-Kan载体(BamHⅠ和XbaⅠ之间)中(苏州泓迅生物科技股份有限公司合成)，所得质粒即为pT4，图谱如图28所示。

质粒pST1.G.Ura3构建方法

将含有gRNA scaffold、SNR52终止子、URA3基因和SNR52启动子的DNA片段(SEQ IDNO.18)人工合成，并插入到市售pUC18载体(HindⅢ和EcoRⅠ之间)中(苏州泓迅生物科技股份有限公司合成)，所得质粒即为pST1.G.Ura3。

质粒pCas由北京化工大学软物质科学与工程高精尖创新中心Jens Nielsen实验室提供(Zhang Y,Wang J,Wang Z,Zhang Y,Shi S,Nielsen J,Liu Z:A gRNA-tRNA arrayfor CRISPR-Cas9 based rapid multiplexed genome editing in Saccharomycescerevisiae.Nat Commun 2019,10(1):1053)。

Saccharomyces cerevisiae W303-1A(ATCC 208352)、Pichia pastoris GS115(ATCC20864)、Kluyveromyces lactis(CBS2359)、Yarrowia lipolytica PO1f(ATCC MYA-2613)；Torulaspora delbrueckii CICC 31863、Candida sp CICC 1785购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；Lipomyces starkeyi(2.2291)购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心；酿酒酵母菌株YJZ45由北京化工大学软物质科学与工程高精尖创新中心Jens Nielsen实验室提供(Zhou YJ,Buijs NA,Zhu Z,Qin J,Siewers V,Nielsen J:Production of fatty acid-derived oleochemicals and biofuels by syntheticyeast cell factories.Nat Commun 2016,7:11709)。

实施例1表达质粒的构建

(1)丙酰辅酶A合成酶(prpE)表达质粒Y33-prpE的构建

选取沙门氏菌(Salmonella enterica)的丙酰辅酶A合成酶的多核苷酸序列(prpE)进行密码子优化，优化后的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列用SalI和XbaI酶切后，插入载体Y33-PGKCYC(SEQ ID NO.2所示)SalI和XbaI酶切位点之间，获得丙酰辅酶A合成酶表达质粒Y33-prpE.，其质粒图谱如图1所示。

(2)苏氨酸脱氨酶(tdcB)表达质粒Y22-tdcB构建

选取表达来自大肠杆菌(Escherichia coli)的苏氨酸脱氨酶tdcB基因(NC_000913.3(3265039..3266028)，SEQ ID NO.3所示)。以大肠杆菌基因组为模板，以如下引物进行聚合酶链式反应(PCR)

引物tdcB-F(5’-3’)：

CAACAAATATAAAAACAGTCGACATGCATATTACATACGATCTG；

引物tdcB-R(5’-3’)：

AATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAAGCGTCAACGAAACC；

表7.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(大肠杆菌基因组)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表8.PCR反应程序：

将上述扩增得到的基因片段用SalI和XbaI进行酶切，插入Y22-PGKCYC(SEQ IDNO.4所示)的SalI和XbaI酶切位点之间，获得苏氨酸脱氨酶(tdcB)表达质粒Y22-tdcB，其质粒图谱如图2所示。

(3)丙酰辅酶A转移酶(CpPCT)表达质粒Y33-CpPCT的构建

选取来自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰辅酶A转移酶，编码基因CpPCT针对酿酒酵母进行密码子优化(优化后的CpPCT的多核苷酸序列SEQ ID NO.5)后，在基因合成公司进行合成，用SalI和XbaI进行酶切，并插入载体Y33-PGKCYC上SalI和XbaI酶切位点之间，获得质粒Y33-CpPCT，其质粒图谱如图3所示。

(4)辅酶A酰化的丙醛脱氢酶(PduP)的表达质粒Y33-PduP构建

选取来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的辅酶A酰化的丙醛脱氢酶，编码基因PduP针对酿酒酵母进行密码子优化(优化后的多核苷酸序列SEQ ID NO.6)后，在基因合成公司进行合成，用SalI和XbaI进行酶切，并插入载体Y33-PGKCYC上SalI和XbaI酶切位点之间，获得质粒Y33-PduP，其质粒图谱如图4所示。

(5)苏氨酸脱氨酶(tdcB)和酮酸脱羧酶(kivD)共表达质粒Y22-tdcB-kivD构建

选取表达来自乳酸链球菌(Lactococcus lactis)的酮酸脱羧酶，其编码基因kivD针对酿酒酵母进行密码子优化(优化后的基因kivD如SEQ ID NO.7所示)。kivD基因连同TEF1启动子、PGK1终止子经基因合成公司合成后，用KpnI和SacI酶切后，插入前述构建的质粒Y22-tdcB的KpnI和SacI酶切位点之间，获得苏氨酸脱氨酶(tdcB)和酮酸脱羧酶(kivD)共同表达质粒Y22-tdcB-kivD，其质粒图谱如图5所示。

(6)苏氨酸脱氨酶(tdcB)、酮酸脱羧酶(kivD)和乙醛脱氢酶(ALD4)共表达质粒Y22-tdcB-kivD-ALD4构建

在前述的共同表达质粒Y22-tdcB-kivD的基础上构建共表达质粒Y22-tdcB-kivD-ALD4.以酿酒酵母基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ALD4-F(5’-3’)：AAACAGTCGACATGTTCAGTAGATCTACGCT；

引物ALD4-R(5’-3’)：

TGCGGCCCTCTAGATTACTCGTCCAATTTGGCA；

表9.PCR反应体系：

表10.PCR反应程序：

将上述获得的扩增片段用SalI和XbaI酶切后插入Y33-PGKCYC载体上的SalI和XbaI酶切位点之间，获得ALD4表达质粒Y33-ALD4；

以Y33-ALD4为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ALD4-F2(5’-3’)：

CAGTGAATTCTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTCAAGAC；

引物ALD4-R2(5’-3’)：

AGCTCGAGCTCGCAAATTAAAGCCTTCGAGC；

表11.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(Y33-ALD4)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表12.PCR反应程序：

/>

将上述扩增的片段用SacI和EcoRI酶切后，插入到前述的质粒Y22-tdcB-kivD质粒的SacI和EcoRI酶切位点之间，获得苏氨酸脱氨酶(tdcB)、酮酸脱羧酶(kivD)和乙醛脱氢酶(ALD4)同时表达的质粒Y22-tdcB-kivD-ALD4，其质粒图谱如图6所示。

实施例2天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合成酶共表达质粒Y33-thrABC构建

天冬氨酸激酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸合成酶均选自大肠杆菌来源，分别由thrA(NC_000913.3(337..2799)、thrB(NC_000913.3(2801..3733)和thrC(NC_000913.3(3734..5020)编码。

a.首先构建thrA表达质粒

1)以大肠杆菌基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ThrA-F(5’-3’)：

TTATCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAGTCGACATGCGAGTGTTGAAGTTCGGC；

引物ThrA-R(5’-3’)：

TGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATCAGACTCCTAACTTCCATGAGAGG；

表13.PCR反应体系：

表14.PCR反应程序：

将上述扩增的片段用SalI和XbaI酶切后插入到Y33-PGKCYC-Mss(SEQ ID NO.8)载体SalI和XbaI酶切位点之间，得到thrA表达质粒Y33-thrA。

2)然后对thrA基因进行点突变(C1034T)以去除苏氨酸对thrA的反馈抑制，以表达质粒Y33-thrA为模板，以如下引物进行PCR扩增：

引物ThrA-MuF(5’-3’)：

CACGCGCCCGTATTTtCGTGGTGCTGATTACGC；

引物ThrA-MuR(5’-3’)：

GAAAATACGGGCGCGTGACATCGCGGCA；

表15.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(Y33-ThrA)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表16.PCR反应程序：

将上述扩增产物用内切酶DpnI消化后转化大肠杆菌，即获得带有目标突变的thrA表达质粒，命名为Y33-thrAmu，其质粒图谱如图7所示。

b.构建thrB和thrC表达质粒

1)thrB基因片段扩增

以大肠杆菌基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ThrB-GG1-F(5’-3’)：

CCCGGTCTCAGAATGGTTAAAGTTTATGCCC；

引物ThrB-GG1-R(5’-3’)：

CCCGGTCTCAAGGTTAGTTTTCCAGTACTCGT；

表17.PCR反应体系：

表18.PCR反应程序：

上述扩增反应得到thrB基因片段。

2)thrC基因片段扩增

以大肠杆菌基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ThrC-GG2-F(5’-3’)：

CCCGGTCTCAGATGAAACTCTACAATCTGAAAGA；

引物ThrC-GG2-R(5’-3’)：

CCCGGTCTCACGATTACTGATGATTCATCATCAATTTAC；

表19.PCR反应体系：

表20.PCR反应程序：

上述扩增反应得到thrC基因片段。

3)启动子扩增

合成TDH3和ADH1双启动子多核苷酸片段(SEQ ID NO.9)作为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物P1-GGF(5’-3’)：

CCCGGTCTCAATTCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC；

引物P1-GGR(5’-3’)：

CCCGGTCTCACATCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTC；

表21.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(TDH3-ADH1片段)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表22.PCR反应程序：

/>

上述扩增反应得到TDH3和ADH1双启动子多核苷酸片段。

4)thrB和thrC共表达质粒T4-thrBC

将上述步骤1)-3)获得的thrB基因片段、thrC基因片段和TDH3和ADH1双启动子多核苷酸片段与载体pT4一起进行Golden gate克隆，获得thrB和thrC共表达质粒T4-thrBC，其质粒图谱如图8所示。

c.thrAmu、thrB和thrC同时表达的质粒Y33-thrABC构建

以T4-thrBC为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物T4-Mss-F(5’-3’)：

GCTTTAATTTGCGGTACCGAGCTCGAATTCGTTTCTAAGACTACAGTAAGAGCAGT；

引物T4-Mss-R(5’-3’)：

GTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGTTTAAACAATCTGACTGGTTGGCTG；

表23.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(T4-thrBC)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表24.PCR反应程序：

扩增得到thrB和thrC片段，质粒Y33-thrAmu用MssI酶切后与上述片段进行NEBuilder克隆，获得天冬氨酸激酶(thrAmu)、高丝氨酸脱氢酶(thrB)和苏氨酸合成酶(thrC)同时表达的质粒Y33-thrABC，其质粒图谱如图9所示。

实施例3天冬氨酸激酶、天冬氨酸转氨酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶共表达质粒Y33-HOM3mu-ppc-aspC构建

天冬氨酸激酶来自酿酒酵母，由HOM3基因(NC_001137.3(256375..257958))编码；天冬氨酸转氨酶来自大肠杆菌，由aspC基因(NC_000913.3(984519..985709))编码；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶来自大肠杆菌，由ppc基因(NC_000913.3(4150447..4153098))编码。

a.构建HOM3表达质粒Y33-HOM3mu

1)以酿酒酵母基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物HOM3-F(5’-3’)：

CTACTTTTTACAACAAATATAAAAACAGTCGACATGCCAATGGATTTCCAACCTA；

引物HOM3-R(5’-3’)：

TGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCTAGATTAAATTCCAAGTCTTTTCAATTGT；

表25PCR反应体系：

表26.PCR反应程序：

将上述扩增得到的片段用SalI和XbaI酶切后插入到Y33-PGKCYC-Mss载体SalI和XbaI酶切位点之间，得到HOM3表达质粒Y33-HOM3。

2)然后对HOM3基因进行点突变(G1387A)以去除苏氨酸对HOM3的反馈抑制，以步骤1)获得的表达质粒Y33-HOM3为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物HOM3-MuF(5’-3’)：

TTACTACTCTTGCTAAAGAAGGCATCAACATTG；

引物HOM3-MuR(5’-3’)：

TAGCAAGAGTAGTAAACATGGTACCAGCA；

表27.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(Y33-HOM3)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表28.PCR反应程序：

将上述扩增产物转化大肠杆菌，即获得带有目标突变的HOM3表达质粒，命名为Y33-HOM3mu，其质粒图谱如图10所示。

b.构建aspC和ppc同时表达的表达质粒

1)扩增ppc基因片段

以大肠杆菌基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增：

引物ppc-GG1-F(5’-3’)：

CCCGGTCTCAGAATGAACGAACAATATTCCGCAT；

引物ppc-GG1-R(5’-3’)：

CCCGGTCTCAAGGTTAGCCGGTATTACGCATACC；

表29.PCR反应体系：

表30.PCR反应程序：

2)扩增aspC基因片段

以大肠杆菌基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增：

引物aspC-GG2-F(5’-3’)：

CCCGGTCTCAGATGTTTGAGAACATTACCGC；

引物aspC-GG2-R(5’-3’)：

CCCGGTCTCACGATTACAGCACTGCCACAATC；

表31.PCR反应体系：

表32.PCR反应程序：

3)合成TDH3和ADH1双启动子多核苷酸片段，与实施例2中的合成TDH3和ADH1双启动子多核苷酸片段的步骤相同。

4)ppc和aspC表达质粒T4-ppc-aspC构建

将上述步骤1)-3)获得的ppc基因片段、aspC基因片段和TDH3和ADH1双启动子多核苷酸片段与载体pT4一起进行Golden gate克隆，获得ppc和aspC共表达质粒T4-ppc-aspC，其质粒图谱如图11所示。

c.HOM3mu、ppc和aspC同时表达的质粒Y33-HOM3mu-ppc-aspC构建

以前述步骤获得的质粒T4-ppc-aspC为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物T4-Mss-F(5’-3’)：

GCTTTAATTTGCGGTACCGAGCTCGAATTCGTTTCTAAGACTACAGTAAGAGCAGT；

引物T4-Mss-R(5’-3’)：

GTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGTTTAAACAATCTGACTGGTTGGCTG；

表33.PCR反应体系：

表34.PCR反应程序：

上述扩增的ppc和aspC表达片段，质粒Y33-HOM3mu用MssI酶切后与上述片段进行NEBuilder克隆，获得天冬氨酸激酶(HOM3mu)、天冬氨酸转氨酶(aspC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)同时表达的质粒Y33-HOM3mu-ppc-aspC，其质粒图谱如图12所示。

实施例4同时表达天冬氨酸激酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸合成酶的质粒Y33-Thrsix的构建

以实施例2获得的Y33-thrABC为模板，利用如下引物进行PCR扩增：

引物PGTr-F(5’-3’)：

CTGCCTTGAGCTCCAGCCAACCAGTCAGATTGTTTTATTTTAGATTCCTGACTTCAACTC；

引物TDTr-R(5’-3’)：

GTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGTTTAAACAAGGCAGCAATATATTGTTTACTT；

表35.PCR反应体系：

表36.PCR反应程序：

上述扩增得到thrA、thrB和thrC表达的多核苷酸片段；将实施例3获得的质粒Y33-HOM3mu-ppc-aspC用MssI酶切后与上述片段进行NEBuilder组装，获得同时表达天冬氨酸激酶(HOM3mu)、天冬氨酸转氨酶(aspC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸激酶(thrAmu)、高丝氨酸脱氢酶(thrB)和苏氨酸合成酶(thrC)的质粒Y33-Thrsix，其质粒图谱如图13所示。

实施例5同时表达苏氨酸脱氨酶(tdcB)、酮酸脱羧酶(kivD)和丙酰辅酶A合成酶(prpE)质粒Y22-tdcB-kivD-prpE的构建

a.表达质粒Y22-tdcB-kivD-V2的构建

1)kivD基因扩增

以kivD基因(SEQ ID NO.7)为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物kivD-F2(5’-3’)：

ATAAACAAACAAAATGTACACCGTGGGTGACTACT；

引物kivD-R2(5’-3’)：

ACACTTATTTTTTTTATAACTTTAGCTTTTGTTCTGCTCCGCAA；

表37.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(kivD合成序列)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表38.PCR反应程序：

2)扩增TDH3启动子(SEQ ID NO.10)

以酵母基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物TDH3p-F(5’-3’)：

CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTATACTAGCGTTGAATGTTAGC；

引物TDH3p-R(5’-3’)：

TCACCCACGGTGTACATTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG；

表39.PCR反应体系：

表40.PCR反应程序：

3)扩增ADH1终止子(SEQ ID NO.11)

以酵母基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ADH1t-F(5’-3’)：

GAGCAGAACAAAAGCTAAAGTTATAAAAAAAATAAGTGTATACAAATT；

引物ADH1t-R(5’-3’)：

GACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCGGTACCGAGCTCTCGGCATGCCGGTAG；

表41PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(酿酒酵母)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表42.PCR反应程序：

4)表达质粒Y22-tdcB-kivD-V2的获得

取实施例1中的质粒Y22-tdcB用SacI酶切后，与步骤1)-3)获得的kivD基因、TDH3启动子和ADH1终止子片段进行NEBuilder组装，获得tdcB和kivD同时表达的质粒Y22-tdcB-kivD-V2，其质粒图谱如图14所示。

b.表达质粒Y22-tdcB-kivD-prpE的构建

1)扩增prpE基因(连带终止子)

取实施例1的质粒Y33-prpE为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物prpE-F3(5’-3’)：

ACATAAACAAACAAAATGTCCTTCTCCGAATTTTATC；

引物prpE-R3(5’-3’)：

TTCCCAGTCACGACGTTG；

表43.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(Y33-prpE)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表44.PCR反应程序：

2)扩增TDH3启动子

以酵母基因组为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物TDH3p-F2(5’-3’)：

TTGACGCTAACATTCAACGCTAGTATAGCTCGAATTTCATTATCAATACTGCCATTTCA；

引物TDH3p-R2(5’-3’)：

AAATTCGGAGAAGGACATTTTGTTTGTT TATGTGTGTTTATTCG；

3)Y22-tdcB-kivD-prpE构建

将上述获得的质粒Y22-tdcB-kivD-V2用EcoRI酶切后，与上述扩增的prpE基因(连带终止子)、TDH3启动子片段一起进行NEBuilder组装，获得同时表达苏氨酸脱氨酶(tdcB)、酮酸脱羧酶(kivD)和丙酰辅酶A合成酶(prpE)的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE，其质粒图谱如图15所示。

实施例6L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)、乙酰乳酸合成酶(ILV6)、苏氨酸醛缩酶(GLY1)基因敲除质粒的构建

利用CRISPR技术无痕敲除目标基因，针对每个欲敲除的基因构建敲除质粒。

a.MET2基因敲除质粒pCas-MET2-del

以质粒pST1.G.Ura3为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物MET2-del-F(5’-3’)：

AAAGGTCTCAGATCGTAGAGGAGCAACCTGTGGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA；

引物MET2-del-R(5’-3’)：

AAAGGTCTCTAAACGACTCAAGCACTAGTTCCGGGATCATTTATCTTTCACTGCGG；

表45.PCR反应体系：

成分	体积(微升)
		上游引物	2.5
下游引物	2.5
		模板(pST1.G.Ura3)	0.5
5×Q5 Reaction Buffer	10
		dNTPs(10mM)	1
Q5 DNA polymerase(NEB公司)	0.5
		超纯水	33
总体积	50

表46.PCR反应程序：

将上述扩增的片段与质粒pCas进行Golden gate克隆，所得质粒命名为pCas-MET2-del，其质粒图谱如图16所示。

b.ILV6基因敲除质粒pCas-ILV6-del

以质粒pST1.G.Ura3为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物ILV6-del-F(5’-3’)：

AAAGGTCTCAGATCATAGTCTAGGACGGCGTAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA；

引物ILV6-del-R(5’-3’)：

AAAGGTCTCTAAACGACCAATTCTTGGGAGTCAGGATCATTTATCTTTCACTGCGG；

表47.PCR反应体系：

表48.PCR反应程序：

将上述扩增得到的片段，与质粒pCas进行Golden gate克隆，所得质粒命名为pCas-ILV6-del，其质粒图谱如图17所示。

c.GLY1基因敲除质粒pCas-GLY1-del

以质粒pST1.G.Ura3为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物GLY1-del-F(5’-3’)：

AAAGGTCTCAGATCCGAACAGACCGTTGCCCGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA；

引物GLY1-del-R(5’-3’)：

AAAGGTCTCTAAACGCACACAAACGCAAACATAAGATCATTTATCTTTCACTGCGG；

表49.PCR反应体系：

表50.PCR反应程序：

将上述扩增得到片段，与质粒pCas进行Golden gate克隆，所得质粒命名为pCas-GLY1-del，其质粒图谱如图18所示。

实施例7丙酮酸激酶(PYK1)基因启动子敲除表达质粒pCas-PYK1p-del的构建

利用CRISPR技术无痕敲除目标基因，构建丙酮酸激酶(PYK1)基因启动子敲除表达质粒pCas-PYK1p-del。

PYK1启动子敲除质粒构建

利用CRISPR技术无痕敲除PYK1启动子，以实现弱启动子替换，以质粒pST1.G.Ura3为模板，以如下引物进行PCR反应：

引物PYK1p-del-F(5’-3’)：

AAAGGTCTCAGATCCGATGGCAAAACGACCCACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA；

引物PYK1p-del-R(5’-3’)：

AAAGGTCTCTAAACTATGATGCTAGGTACCTTTAGATCATTTATCTTTCACTGCGG；

表51.PCR反应体系：

表52.PCR反应程序：

将上述扩增得到片段，与质粒pCas进行Golden gate克隆，所得质粒命名为pCas-PYK1p-del，其质粒图谱如图19所示。

实施例8野生型酵母菌以丙酸为底物合成奇数链脂肪酸

本实施例测试了酵母菌：Saccharomyces cerevisiae W303-1A、Pichia pastorisGS115、Kluyveromyces lactis CBS2359、Torulaspora delbrueckii CICC 31863、Yarrowia lipolytica op1f、Lipomyces starkeyi 2.2291、Candida sp.CICC 1785。各菌株基因型见下表53：

表53各菌株基因型

采用上述菌株，利用YPD培养基和矿物质培养基进行发酵，所述矿物质培养基中含有丙酸钠(4g/L，pH调整到6.0)和含有20g/L的葡萄糖。其中葡萄糖作为碳源，丙酸钠作为发酵底物合成奇数链脂肪酸。

发酵方法为：酵母菌株接种于5mL YPD培养基中，28℃、250rpm转速在摇床中培养24小时；用灭菌水洗涤1次，接种于15mL发酵培养基(矿物质培养基)中，初始菌株OD600值0.3，28℃、250rpm转速在摇床中培养60小时，得含有奇数链脂肪酸的发酵液。

将不同酵母菌上述合成的奇数链脂肪酸进行GC-MS分析，结果如下表54，各个酵母菌所产生脂肪酸的种类如图20所示。

表54不同酵母菌发酵产生的奇数链脂肪酸

菌株	总脂肪酸产量mg/L	奇数链脂肪酸产量mg/L	奇数链脂肪酸比例％
				S.cerevisiae	88.5	12.6	14.2
P.pastoris	186.5	39.2	21.0
				K.lactis	302.1	142.4	47.1
T.delbrueckii	57.5	10.5	18.2
				Y.lipolytica	175.9	12.9	7.3
L.starkeyi	43.2	16.8	38.9
				Candida sp.	35.3	6.2	17.4

由上表54和图20可知，不同的酵母菌在含有丙酸的培养基中均能合成奇数链脂肪酸。其中乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis CBS2359能够产生142.4mg/L奇数链脂肪酸，占总脂肪酸的47.1％。

实施例9表达丙酰辅酶A合成酶酵母菌株以丙酸为底物合成奇数链脂肪酸

(1)利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y33-prpE转化酿酒酵母菌株。

所用酿酒酵母菌株为YJZ45(MATa MAL2-8c SUC2 hfd1Δpox1Δfaa1Δfaa4Δhis3Δ::HIS3+(TPIp-MmACL-FBA1t)+(TDH3p-RtME-CYC1t)+(tHXT7p-’MDH3-TDH2t)+(PGK1p-CTP1-ADH1t)+(TEF1p-‘tesA-HIS3t)ura3Δ::(TPIp-RtFAS1-FBA1t)+(TEF1p-RtFAS2-CYC1t)+amdSym acc1::KlURA3+TEF1p-ACC1)

获得基因工程改造菌株YJZ45-prpE(MATa MAL2-8c SUC2 hfd1Δpox1Δfaa1Δfaa4Δhis3Δ::HIS3+(TPIp-MmACL-FBA1t)+(TDH3p-RtME-CYC1t)+(tHXT7p-’MDH3-TDH2t)+(PGK1p-CTP1-ADH1t)+(TEF1p-‘tesA-HIS3t)ura3Δ::(TPIp-RtFAS1-FBA1t)+(TEF1p-RtFAS2-CYC1t)+amdSymacc1::KlURA3+TEF1p-ACC1PGK1p-prpE-CYC1t)。

(2)利用表达丙酰辅酶A合成酶酵母菌株YJZ45-prpE进行发酵

分别挑取酵母菌株YJZ45-prpE和对照的酵母菌株YJZ45的单菌落接种于5mL省却特定成分尿嘧啶的液体CM培养基中，30℃、250rpm摇床培养12-16小时，获得种子液。随后将所得种子液转接到10mL发酵培养基即省却特定成分尿嘧啶的液体CM培养基中，初始OD600＝0.3，并加入丙酸钠(pH调整到6.0)使终浓度达到4g/L，30℃、250rpm摇床培养60小时，取样检测脂肪酸含量GC-MS分析，结果如下表55所示：

表55菌株YJZ45-prpE发酵产生的奇数链脂肪酸产量

由此可见，表达丙酰辅酶A合成酶的重组酿酒酵母菌株YJZ45-prpE在含有丙酸培养基中发酵产出的奇数链脂肪酸产量能够达到223.5mg/L,占总脂肪酸的21.6％。

实施例10以L-苏氨酸为底物合成奇数链脂肪酸

培养基中直接添加丙酸不仅对酵母菌生长产生抑制，而且还会提高发酵成本。因此，本实施例披露了利用基因改造酵母菌将苏氨酸转化为奇数链脂肪酸的方法。本发明提出了从丙醛到丙酰辅酶A的3种酶促转化方案(如图23所示)：1)丙醛在醛脱氢酶(ALD)的催化下转化为丙酸，丙酸在丙酰辅酶A转移酶(PCT)的催化下与乙酰辅酶A反应生成丙酰辅酶A；2)丙醛在辅酶A酰化的丙醛脱氢酶(PduP)的催化下直接转化为丙酰辅酶A；3)丙醛在丙酰辅酶A合成酶(prpE)的催化下转化为丙酰辅酶A。但是丙醛在细胞内的含量也及其微少，为了在细胞内实现这些途径，本实施例通过表达苏氨酸脱氨酶和酮酸脱羧酶将L-苏氨酸转化为丙醛(如图23中的(4))。具体如下

(1)表达不同多肽组合酵母菌株的获得：

利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y22-tdcB和Y33-CpPCT转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得菌株W303-tdcB-PCT，即表达苏氨酸脱氨酶和丙酰辅酶A转移酶的重组菌株；

利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y22-tdcB和Y33-PduP转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得菌株W303-tdcB-PduP，即表达苏氨酸脱氨酶和辅酶A酰化的丙醛脱氢酶的重组菌株；

利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y22-tdcB和Y33-prpE转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得菌株W303-tdcB-prpE，即表达苏氨酸脱氨酶和丙酰辅酶A合成酶的重组菌株。

(2)表达不同多肽组合酵母菌株进行发酵

将上述步骤(1)的菌株和对照菌株进行发酵，发酵方法同实施例9，区别在于发酵培养基中不含有丙酸钠，而是含有10g/L的L-苏氨酸。

(3)产出脂肪酸含量分析

步骤(2)中利用表达不同多肽组合酵母菌株进行发酵产生的奇数链脂肪酸产量进行GC-MS分析，如下表56所示

表56各重组菌株脂肪酸生产情况

由上表可知，在表达苏氨酸脱氨酶(tdcB)同时表达丙酰辅酶A转移酶(CpPCT)、辅酶A酰化的丙醛脱氢酶(PduP)或者丙酰辅酶A合成酶(prpE)的情况下，能够显著提高重组酵母菌在含有L-苏氨酸的培养基中合成奇数链脂肪酸比例。其中苏氨酸脱氨酶(tdcB)和丙酰辅酶A合成酶(prpE)同时表达能够合成最高的奇数链脂肪酸，达到53.3mg/L，占总脂肪酸比例为33.6％。

实施例11以L-苏氨酸为底物prpE途径的表达优化合成奇数链脂肪酸

从实施例10中的L-苏氨酸到丙酰辅酶A的3种酶促催化方案在酵母中都可以实现，但是为了prpE途径获得最佳的奇数链脂肪酸转化效率，本实施例对prpE途径中各个步骤的催化酶进行了不同来源的挑选与表达(如图24)，以获得最佳的奇数链脂肪酸合成效果。

(1)重组酵母菌株的构建

利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y22-tdcB和Y33(YCplac33，ATCC87586)转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得表达tdcB的酵母菌株W303-tdcB；

利用醋酸锂转化法将Y22(YCplac22，ATCC87585)和实施例1的Y33-prpE转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得表达prpE的酵母菌株W303-prpE；

利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y22-tdcB-kivD-ALD4和Y33转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得同时表达tdcB、kivD和ALD4的酵母菌株W303-tdcB-kivD-ALD4；

利用醋酸锂转化法实施例1的Y22-tdcB-kivD-ALD4和Y33-prpE转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得表达tdcB、kivD、ALD4和prpE的酵母菌株W303-tdcB-kivD-ALD4-prpE。

(2)发酵

将上述步骤(1)中的菌株进行发酵，发酵方法同实施例9，不同之处在于发酵培养基中不加丙酸钠，而是加入L-苏氨酸终浓度达到10g/L。

(3)脂肪酸含量GC-MS分析

各重组菌株脂肪酸生产情况如图21所示，由此可见，组合表达苏氨酸脱氨酶(tdcB)、酮酸脱羧酶(kivD)、乙醛脱氢酶(ALD4)以及丙酰辅酶A合成酶(prpE)能够增加酿酒酵母以L-苏氨酸为底物合成奇数链脂肪酸的产量。其中同时表达tdcB和prpE能够产生105mg/L奇数链脂肪酸，占总脂肪酸的37.2％。

实施例12以葡萄糖为底物基因过表达合成奇数链脂肪酸

在培养基中添加苏氨酸虽然对酵母生长没有明显的抑制现象，但却会提高发酵的成本，因此也存在一定的弊端。发明人研究发现酵母菌自身就能够以葡萄糖等常规碳源和氮源合成苏氨酸，进而合成奇数链脂肪酸。只是酵母细胞内苏氨酸浓度较低，合成奇数链脂肪酸产量也低。因此，本实施例披露了通过基因改造改变酵母菌代谢网络(如图22所示)，进而提高从葡萄糖到奇数链脂肪酸转化效率的方法。

(1)重组酵母菌株的构建

利用醋酸锂转化法将实施例1的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和Y33转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得tdcB、kivD和prpE同时表达的酵母菌株W303-tkp；

利用醋酸锂转化法将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例3的质粒Y33-HOM3mu转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得表达tdcB、kivD、prpE和HOM3点突变基因的酵母菌株W303-tkp-HOM3mu；

利用醋酸锂转化法将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例2的质粒Y33-thrAmu转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得表达tdcB、kivD、prpE和thrA点突变基因的酵母菌株W303-tkp-thrAmu；

利用醋酸锂转化法将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例3的质粒Y33-HOM3mu-ppc-aspC转化酿酒酵母菌株W303-1A，获得表达tdcB、kivD、prpE、HOM3点突变、ppc和aspC基因的酵母菌株W303-tkp-HOM3mu-ppc-aspC；

利用醋酸锂转化法将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例2的质粒Y33-thrABC转化酒酵母菌株W303-1A，获得表达tdcB、kivD、prpE、thrA点突变、thrB和thrC基因的酵母菌株W303-tkp-thrABC；

利用醋酸锂转化法将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例4的质粒Y33-Thrsix转化酿酒母菌株W303-1A，获得表达tdcB、kivD、prpE、HOM3点突变、ppc、aspC、thrA点突变、thrB和thrC基因的酵母菌株W303-tkp-Thrsix。

(2)发酵

将步骤(1)中的重组酵母菌株进行发酵，发酵方法同实施例9，不同之处在于发酵培养基中不加丙酸钠，而是只含有葡萄糖终浓度达到20g/L。

(3)脂肪酸含量GC-MS分析结果

各重组菌株脂肪酸生产情况如下表57所示：

表57各重组菌株脂肪酸生产情况

由上表可见，组合表达苏氨酸脱氨酶基因(tdcB)、酮酸脱羧酶基因(kivD)以及丙酰辅酶A合成酶基因(prpE)的重组酵母菌株能够以常规培养基(以葡萄糖为碳源)合成奇数链脂肪酸。此外，含有组合表达天冬氨酸激酶(thrA\HOM3，可带有点突变以使酶活力提高)、高丝氨酸脱氢酶(ThrB)、苏氨酸合成酶(ThrC)、天冬氨酸转氨酶(aspC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)中的1个或多个的菌株可以增加奇数链脂肪酸的产量和所占的比例。其中含有全部上述基因能够以20g/L葡萄糖为底物产生22.5mg/L奇数链脂肪酸，占总脂肪酸的21.8％。

实施例13以葡萄糖为底物基因敲除合成奇数链脂肪酸

(1)基因敲除donor制备

针对每个欲敲除的L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)、乙酰乳酸合成酶(ILV2/ILV6)、苏氨酸醛缩酶(GLY1)基因分别合成donor引物：

引物MET2-donor1-F(5’-3’)：

CTGGACATTGAGGAGATTAAGGAAACTAACCCATTGCTCAAACTAGTTCAAGGGCAGAGGATTACCGATGCC；

引物MET2-donor2-R(5’-3’)：

CGTCTTCGTTTCATCGTTACCAACGTCACCTCCCCAAGCTCTTGGAGCGGCATCGGTAATCCTCTGCCCTTG；

引物ILV6-donor1-F(5’-3’)：

TACATAGTTCGTATATACAGAATCTTTAGAACATCTGAGCTCACTAACCCAGTCTTTCTAGTTAGTCTCT；

引物ILV6-donor2-R(5’-3’)：

TACGTTATATAGATGTATAGAGGAGAGTCCCGAGGGCGATCGCAAGGCCGAGAGACTAACTAGAAAGACT；

引物GLY1-donor1-F(5’-3’)：

TGTTTCCGCTGGCTAGTTCGTAACCACCTCCTTTCCTAGGCTTACACTCACTTTTACTCCaTGGGACTTTG；

引物GLY1-donor2-R(5’-3’)：

ATAGAGTATGGAGGTTGCATCAAGTGAGTTCTGATGGCAATCTGGTTGGACAAAGTCCCAtGGAGTAAAAG；

取上述引物按照下表58配制反应体系：

表58反应体系

组分	体积
		上游引物(100μM)	10μL
下游引物(100μM)	10μL
		Q5酶	1μL
Q5 buffer	10μL
		dNTP	10μL
ddH₂O	9μL
		总体积	50μL

取上述反应体系按照下表59的反应程序进行PCR反应：

表59反应程序

上述反应程序结束后利用乙醇沉淀的方法回收多核苷酸，分别对应MET2、ILV6和GLY1的donor。

(2)敲除菌株的构建

2.1利用醋酸锂转化法分别将实施例6的3个敲除质粒500ng和10000ng donor片段转化酿酒酵母W303-1A，利用CM-Ura(CM培养基缺少尿嘧啶)平板进行筛选，即获得MET2、ILV6和GLY1分别敲除的酵母菌株。

2.2敲除质粒的丢失：将MET2、ILV6和GLY1分别敲除的酵母菌株接种于液体YPD中培养24小时，之后涂YPD平板。挑选单菌落分别涂布于YPD平板和CM-Ura平板，在YPD平板生长但在CM-Ura(CM培养基缺少尿嘧啶)平板上不能生长的单菌落即为丢失敲除质粒的酵母菌株。将MET2、ILV6和GLY1分别敲除且敲除质粒已丢失的酵母菌株命名为W303Δmet2、W303Δilv6和W303Δgly1。

2.3表达质粒的加入：将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例4的质粒Y33-Thrsix共同分别转化W303Δmet2、W303Δilv6和W303Δgly1，获得目标基因敲除且表达tdcB、kivD、prpE、HOM3(点突变)、ppc、aspC、thrA(点突变)、thrB和thrC基因的酵母菌株，分别命名为Δmet2-tkp-Thrsix、Δilv6-tkp-Thrsix和Δgly1-tkp-Thrsix。

(3)发酵

将步骤(2)中的菌株Δmet2-tkp-Thrsix、Δilv6-tkp-Thrsix和Δgly1-tkp-Thrsix进行发酵，发酵方法同实施例9，不同之处在于发酵培养基中不加丙酸钠，而是只含有葡萄糖终浓度达到20g/L。

(4)脂肪酸含量GC-MS分析结果

各重组菌株脂肪酸生产情况如下表60所示：

表60各重组菌株脂肪酸生产情况

由此可见，敲除酵母菌的L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶(MET2)、乙酰乳酸合成酶(ILV6)和苏氨酸醛缩酶(GLY1)中的任何一个都能够提高奇数链脂肪酸的产量和比例，奇数链脂肪酸产量最高达到38.1mg/L，奇数链脂肪酸比例最高达到28.4％。

实施例14以葡萄糖为底物限制丙酮酸激酶(PYK1)表达合成奇数链脂肪酸

PYK1是本发明奇数链脂肪酸合成的糖酵解途径中的关键酶，表达强度高。本发明通过降低PYK1的表达增加磷酸烯醇式丙酮酸的积累进而提高经由苏氨酸的奇数链脂肪酸的合成。为了降低PYK1表达，需用弱启动子替代PYK1自身启动子。

(1)弱启动子donor准备：选用酿酒酵母基因组为模板，分别以如下引物进行PCR，获得弱启动子片段COX9(SEQ ID NO.12)、QCR10(SEQ ID NO.13)、ATP14(SEQ ID NO.14)、ISU1(SEQ ID NO.15)、PFK1(SEQ ID NO.16)：

引物COX9-P1(5’-3’)：

TAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCAGTACTTCAAATCTACGTCCAAG；

引物COX9-P2(5’-3’)：

TAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCAGTCTGTGTAAGTCGCTTGT；

引物QCR10-P1(5’-3’)：

TAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCAATTTACAAGCACATCCCTGA；

引物QCR10-P2(5’-3’)：

ACGTTTAATGAGGTCAATCTTTCTAATCTAGACATTGAGGTTAGTTTTAAGTCTTATGG；

引物ATP14-P1(5’-3’)：

TAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCAGAAGAAAAAGCGGGAAACG；

引物ATP14-P2(5’-3’)：

ATGTCTAGATTAGAAAGATTGACCTCATTAAACGTTTTTGATTAGGACTGGTACGC；

引物ISU1-P1(5’-3’)：

TAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCACTTGAAAAGAAAGAGAACAGC；

引物ISU1-P2(5’-3’)：

ACGTTTAATGAGGTCAATCTTTCTAATCTAGACATCAGGTTAAATATGTGTTATGTGT；

引物PFK1-P1(5’-3’)：

TAATCCAGAAACTGGCACTTGACCCAACTCTGCCATGTAAAAAATGCAATCACGTTTTC；

引物PFK1-P2(5’-3’)：

ACGTTTAATGAGGTCAATCTTTCTAATCTAGACATCTTTGATATGATTTTGTTTCAGATT；

表61.PCR反应体系：

表62.PCR反应程序：

以上述扩增获得的弱启动子分别作为模板，用以下引物进行PCR扩增，获得两端带有约70bp同源序列的弱启动子片段(donor)：

引物PYK1-HF(5’-3’)：

CCTCTATGGCGTGTGATGTCTGTATCTGTTACTTAATCCAGAAACTGGCACTTGACC；

引物PYK1-HR(5’-3’)：

ATGATGGAGGTTCTTCTCAAGTCAGAACCAGCAACAACGTTTAATGAGGTCAATCTTTC；

表63.PCR反应体系：

表64.PCR反应程序：

(2)弱启动子菌株的构建

2.1利用醋酸锂转化法将实施例7的敲除质粒(pCas-PYK1p-del)500ng和3000ng步骤(1)的两端带有约70bp同源序列的弱启动子donor片段转化酿酒酵母W303-1A，利用CM-Ura(CM培养基缺少尿嘧啶)平板进行筛选，即获得弱启动子替换PYK1启动子的酵母菌株。

2.2敲除质粒的丢失：将弱启动子替换PYK1启动子的酵母菌株接种于液体YPD中培养24小时，之后涂YPD平板。挑选单菌落分别涂布于YPD平板和CM-Ura平板，在YPD平板生长但在CM-Ura平板上不能生长的单菌落即为丢失敲除质粒的酵母菌株。

将弱启动子COX9、QCR10、ATP14、ISU1、PFK1分别替换PYK1启动子、且丢失敲除质粒的酵母菌株分别命名为W303-COX9p、W303-QCR10p、W303-ATP14p、W303-ISU1p和W303-PFK1p。

2.3表达质粒的加入：将实施例5的质粒Y22-tdcB-kivD-prpE和实施例4的质粒Y33-Thrsix共同分别转化W303-COX9p、W303-QCR10p、W303-ATP14p、W303-ISU1p和W303-PFK1p，获得PYK1减少表达且表达tdcB、kivD、prpE、HOM3(点突变)、ppc、aspC、thrA(点突变)、thrB和thrC基因的酵母菌株，分别命名为COX9p-tkp-Thrsix、QCR10p-tkp-Thrsix、ATP14p-tkp-Thrsix、ISU1p-tkp-Thrsix和PFK1p-tkp-Thrsix。

(3)发酵

将上述菌株进行发酵，发酵方法同实施例9，不同之处在于发酵培养基中不加丙酸，而是加入葡萄糖终浓度达到20g/L。

(4)脂肪酸含量GC-MS分析结果

各重组菌株脂肪酸生产情况如下表65所示：

表65各重组菌株脂肪酸生产情况

由上表可知，用弱启动子替换PYK1启动子部分序列可以降低PYK1基因表达，并增加奇数链脂肪酸的产量和比例。其中，用弱启动子QCR10替换PYK1启动子的重组菌株可以产生38.7mg/L奇数链脂肪酸，占总脂肪酸比例达到29.4％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京化工大学

<120> 重组质粒组合、基因改造酵母菌及生产奇数链脂肪酸方法

<130> HA201803820

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgtccttct ccgaatttta tcagaggtcc atcaacgagc cagaagcatt ttgggccgaa 60

caagccagaa gaatcgattg gagacagcca ttcacccaaa ccttggatca ctccagacct 120

ccatttgcta ggtggttttg cggcggtact actaaccttt gccataacgc cgtcgatagg 180

tggagagata agcaaccaga ggctttggct ttgatcgcag tttcctccga aaccgacgaa 240

gaaagaacct tcaccttctc ccagttgcac gacgaagtca acatcgttgc cgctatgttg 300

ttgtccttgg gagttcaaag aggcgacaga gtcttggtct acatgccaat gatcgccgaa 360

gctcaaatca ccttgttggc ttgcgctaga attggtgcca tccattccgt cgttttcggt 420

ggtttcgctt ctcattccgt tgcagctaga atcgacgacg ctagaccagc tttgatcgtt 480

tcagcagacg caggagctag aggaggtaaa atcttgccat acaagaagtt gttggacgac 540

gccattgctc aagctcaaca ccaaccaaag cacgtcttgt tggtggatag aggtttggct 600

aagatggctt gggtggacgg tagagatttg gacttcgcta ccttgaggca gcaacatttg 660

ggagcttccg ttccagttgc ttggttagaa tccaacgaga cctcttgcat cttgtacacc 720

tccggtacta caggtaagcc aaaaggcgtt cagagagacg ttggaggtta cgcagttgct 780

ttggctacct ccatggatac cattttcggc ggtaaagcag gcggagtttt cttttgcgct 840

tccgatatcg gttgggttgt tggtcattcc tacatcgtct acgctccatt gttggcaggt 900

atggctacta tcgtctacga gggtttgcca acttacccag attgcggcgt ttggtggaaa 960

atcgtggaga agtaccaggt caacaggatg ttttccgctc caaccgccat tagagtcttg 1020

aagaagttcc caaccgccca aatcaggaac cacgatttgt cctccttgga ggctttgtac 1080

ttggcaggag aaccattgga cgaaccaaca gcttcttggg ttaccgaaac tttgggcgtt 1140

ccagtcatcg acaactattg gcagaccgaa tccggttggc caattatggc tttggcaaga 1200

gccttggacg atagaccatc aagattgggt tccccaggag ttccaatgta cggttacaac 1260

gtccagttgt tgaacgaagt taccggcgaa ccttgcggta ttaacgagaa gggcatgttg 1320

gttatcgaag gtccattgcc accaggttgt atccaaacca tttggggaga cgacgctaga 1380

ttcgtcaaga cctattggtc cttgttcaac agacaggtct acgctacttt cgattggggt 1440

atcagggacg cagagggtta ctacttcatc ttgggcagaa ccgacgacgt tatcaacatc 1500

gccggtcata gattgggtac tagagaaatc gaggaatcca tctcctccta cccaaacgtt 1560

gccgaagttg ccgttgttgg tattaaggac gctttgaagg gtcaagttgc agttgccttc 1620

gtcatcccaa agcaatccga tactttggcc gatagagaag ccgctagaga cgaagagaac 1680

gctattatgg ccttggttga taatcagatc ggacatttcg gtagaccagc tcacgtttgg 1740

ttcgtttccc aattgccaaa gaccaggtcc ggtaagatgt tgagaaggac catccaggct 1800

atttgcgaag gtagagaccc aggcgatttg actactatcg acgatccagc ctccttgcaa 1860

cagatcagac aggccatcga ggaataa 1887

<210> 2

<211> 6622

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 60

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 120

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 180

gctttatttt agattcctga cttcaactca agacgcacag atattataac atctgcataa 240

taggcatttg caagaattac tcgtgagtaa ggaaagagtg aggaactatc gcatacctgc 300

atttaaagat gccgatttgg gcgcgaatcc tttattttgg cttcaccctc atactattat 360

cagggccaga aaaaggaagt gtttccctcc ttcttgaatt gatgttaccc tcataaagca 420

cgtggcctct tatcgagaaa gaaattaccg tcgctcgtga tttgttcgca aaaagaacaa 480

aactgaaaaa acccagacac gctcgacttc ctgtcttcct attgattgca gcttccaatt 540

tcgtcacaca acaaggtcct agcgacggct cacaggtttt gtaacaagcg atcgaaggtt 600

ctggaatggc gggaaagggt ttagtaccac atgctatgat gcccactgtg atctccagag 660

caaagttcgt tcgatcgtac tgttactctc tctctttcaa acagaattgt ccgaatcgtg 720

tgacaacaac agcctgttct cacacactct tttcttctaa ccaagggggt ggtttagttt 780

agtagaacct cgtgaaactt acatttacat atatataaac ttgcataaat tggtcaatgc 840

aagaaataca tatttggtct tttctaattc gtagtttttc aagttcttag atgctttctt 900

tttctctttt ttacagatca tcaaggaagt aattatctac tttttacaac aaatataaaa 960

cagtcgacct cgaatctaga gggccgcatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca 1020

cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag 1080

gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt 1140

tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt 1200

gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcggta ccgagctcga attcactggc 1260

cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 1320

agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 1380

ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 1440

tctgtgcggt atttcacacc gcatatatcg ctgggccatt ctcatgaaga atatcttgaa 1500

tttattgtca tattactagt tggtgtggaa gtccatatat cggtgatcaa tatagtggtt 1560

gacatgctgg ctagtcaaca ttgagccttt tgatcatgca aatatattac ggtattttac 1620

aatcaaatat caaacttaac tattgacttt ataacttatt taggtggtaa cattcttata 1680

aaaaagaaaa aaattactgc aaaacagtac tagcttttaa cttgtatcct aggttatcta 1740

tgctgtctca ccatagagaa tattacctat ttcagaatgt atgtccatga ttcgccgggt 1800

aaatacatat aatacacaaa tctggcttaa taaagtctat aatatatctc ataaagaagt 1860

gctaaattgg ctagtgctat atatttttaa gaaaatttct tttgactaag tccatatcga 1920

ctttgtaaaa gttcacttta gcatacatat attacacgag ccagaaattg taacttttgc 1980

ctaaaatcac aaattgcaaa atttaattgc ttgcaaaagg tcacatgctt ataatcaact 2040

tttttaaaaa tttaaaatac ttttttattt tttattttta aacataaatg aaataattta 2100

tttattgttt atgattaccg aaacataaaa cctgctcaag aaaaagaaac tgttttgtcc 2160

ttggaaaaaa agcactacct aggagcggcc aaaatgccga ggctttcata gcttaaactc 2220

tttacagaaa ataggcatta tagatcagtt cgagttttct tattcttcct tccggtttta 2280

tcgtcacagt tttacagtaa ataagtatca cctcttagag ttcgatgata agctgtcaaa 2340

catgagaatt aattccacat gttaaaatag tgaaggagca tgttcggcac acagtggacc 2400

gaacgtgggg taagtgcact agggtccggt taaacggatc tcgcattgat gaggcaacgc 2460

taattatcaa catatagatt gttatctatc tgcatgaaca cgaaatcttt acttgacgac 2520

ttgaggctga tggtgtttat gcaaagaaac cactgtgttt aatatgtgtc actgtttgat 2580

attactgtca gcgtagaaga taatagtaaa agcggttaat aagtgtattt gagataagtg 2640

tgataaagtt tttacagcga aaagacgata aatacaagaa aatgattacg aggatacgga 2700

gagaggtatg tacatgtgta tttatatact aagctgccgg cggttgtttg caagaccgag 2760

aaaaggctag caagaatcgg gtcattgtag cgtatgcgcc tgtgaacatt ctcttcaaca 2820

agtttgattc cattgcggtg aaatggtaaa agtcaacccc ctgcgatgta tattttcctg 2880

tacaatcaat caaaaagcca aatgatttag cattatcttt acatcttgtt attttacaga 2940

ttttatgttt agatctttta tgcttgcttt tcaaaaggct tgcaggcaag tgcacaaaca 3000

atacttaaat aaatactact cagtaataac ctatttctta gcatttttga cgaaatttgc 3060

tattttgtta gagtctttta caccatttgt ctccacacct ccgcttacat caacaccaat 3120

aacgccattt aatctaagcg catcaccaac attttctggc gtcagtccac cagctaacat 3180

aaaatgtaag ctctcggggc tctcttgcct tccaacccag tcagaaatcg agttccaatc 3240

caaaagttca cctgtcccac ctgcttctga atcaaacaag ggaataaacg aatgaggttt 3300

ctgtgaagct gcactgagta gtatgttgca gtcttttgga aatacgagtc ttttaataac 3360

tggcaaaccg aggaactctt ggtattcttg ccacgactca tctccatgca gttggacgat 3420

cgatgataag ctgtcaaaca tgagaattgg gtaataactg atataattaa attgaagctc 3480

taatttgtga gtttagtata catgcattta cttataatac agttttttag ttttgctggc 3540

cgcatcttct caaatatgct tcccagcctg cttttctgta acgttcaccc tctaccttag 3600

catcccttcc ctttgcaaat agtcctcttc caacaataat aatgtcagat cctgtagaga 3660

ccacatcatc cacggttcta tactgttgac ccaatgcgtc tcccttgtca tctaaaccca 3720

caccgggtgt cataatcaac caatcgtaac cttcatctct tccacccatg tctctttgag 3780

caataaagcc gataacaaaa tctttgtcgc tcttcgcaat gtcaacagta cccttagtat 3840

attctccagt agatagggag cccttgcatg acaattctgc taacatcaaa aggcctctag 3900

gttcctttgt tacttcttct gccgcctgct tcaaaccgct aacaatacct gggcccacca 3960

caccgtgtgc attcgtaatg tctgcccatt ctgctattct gtatacaccc gcagagtact 4020

gcaatttgac tgtattacca atgtcagcaa attttctgtc ttcgaagagt aaaaaattgt 4080

acttggcgga taatgccttt agcggcttaa ctgtgccctc catggaaaaa tcagtcaaga 4140

tatccacatg tgtttttagt aaacaaattt tgggacctaa tgcttcaact aactccagta 4200

attccttggt ggtacgaaca tccaatgaag cacacaagtt tgtttgcttt tcgtgcatga 4260

tattaaatag cttggcagca acaggactag gatgagtagc agcacgttcc ttatatgtag 4320

ctttcgacat gatttatctt cgtttcctgc atgtttttgt tctgtgcagt tgggttaaga 4380

atactgggca atttcatgtt tcttcaacac tacatatgcg tatatatacc aatctaagtc 4440

tgtgctcctt ccttcgttct tccttctgtt cggagattac cgaatcaaaa aaatttcaaa 4500

gaaaccgaaa tcaaaaaaaa gaataaaaaa aaaatgatga attgaattga aaagctaatt 4560

cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 4620

tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 4680

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 4740

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 4800

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 4860

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 4920

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag 4980

ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc 5040

gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 5100

cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 5160

cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 5220

acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 5280

caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 5340

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 5400

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 5460

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 5520

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 5580

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 5640

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 5700

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 5760

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 5820

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 5880

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 5940

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 6000

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 6060

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 6120

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 6180

agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 6240

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 6300

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 6360

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 6420

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 6480

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 6540

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc 6600

gttggccgat tcattaatgc ag 6622

<210> 3

<211> 990

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

atgcatatta catacgatct gccggttgct attgatgaca ttattgaagc gaaacaacga 60

ctggctgggc gaatttataa aacaggcatg cctcgctcca actattttag tgaacgttgc 120

aaaggtgaaa tattcctgaa gtttgaaaat atgcagcgta cgggttcatt taaaattcgt 180

ggcgcattta ataaattaag ttcactgacc gatgcggaaa aacgcaaagg cgtggtggcc 240

tgttctgcgg gcaaccatgc gcaaggggtt tccctctcct gcgcgatgct gggtatcgac 300

ggtaaagtgg tgatgccaaa aggtgcgcca aaatccaaag tagcggcaac gtgcgactac 360

tccgcagaag tcgttctgca tggtgataac ttcaacgaca ctatcgctaa agtgagcgaa 420

attgtcgaaa tggaaggccg tatttttatc ccaccttacg atgatccgaa agtgattgct 480

ggccagggaa cgattggtct ggaaattatg gaagatctct atgatgtcga taacgtgatt 540

gtgccaattg gtggtggcgg tttaattgct ggtattgcgg tggcaattaa atctattaac 600

ccgaccattc gtgttattgg cgtacagtct gaaaacgttc acggcatggc ggcttctttc 660

cactccggag aaataaccac gcaccgaact accggcaccc tggcggatgg ttgtgatgtc 720

tcccgcccgg gtaatttaac ttacgaaatc gttcgtgaat tagtcgatga catcgtgctg 780

gtcagcgaag acgaaatcag aaacagtatg attgccttaa ttcagcgcaa taaagtcgtc 840

accgaaggcg caggcgctct ggcatgtgct gcattattaa gcggtaaatt agaccaatat 900

attcaaaaca gaaaaaccgt cagtattatt tccggcggca atatcgatct ttctcgcgtc 960

tctcaaatca ccggtttcgt tgacgcttaa 990

<210> 4

<211> 5873

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttta 240

ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc acagatatta taacatctgc ataataggca 300

tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag agtgaggaac tatcgcatac ctgcatttaa 360

agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt ttggcttcac cctcatacta ttatcagggc 420

cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg aattgatgtt accctcataa agcacgtggc 480

ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc gtgatttgtt cgcaaaaaga acaaaactga 540

aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct tcctattgat tgcagcttcc aatttcgtca 600

cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg ttttgtaaca agcgatcgaa ggttctggaa 660

tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta tgatgcccac tgtgatctcc agagcaaagt 720

tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt tcaaacagaa ttgtccgaat cgtgtgacta 780

caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt ctaaccaagg gggtggttta gtttagtaga 840

acctcgtgaa acttacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtca atgcaagaaa 900

tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt tttcaagttc ttagatgctt tctttttctc 960

ttttttacag atcatcaagg aagtaattat ctacttttta caacaaatat aaaacagtcg 1020

acctcgaatc tagagggccg catcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca ttcacgccct 1080

ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt ctaggtccct 1140

atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca aatttttctt 1200

ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt gcttgagaag 1260

gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc ggtaccgagc tcgaattcac tggccgtcgt 1320

tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca 1380

tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 1440

gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg 1500

cggtatttca caccgcatat atcgctgggc cattctcatg aagaatatct tgaatttatt 1560

gtcatattac tagttggtgt ggaagtccat atatcggtga tcaatatagt ggttgacatg 1620

ctggctagtc aacattgagc cttttgatca tgcaaatata ttacggtatt ttacaatcaa 1680

atatcaaact taactattga ctttataact tatttaggtg gtaacattct tataaaaaag 1740

aaaaaaatta ctgcaaaaca gtactagctt ttaacttgta tcctaggtta tctatgctgt 1800

ctcaccatag agaatattac ctatttcaga atgtatgtcc atgattcgcc gggtaaatac 1860

atataataca caaatctggc ttaataaagt ctataatata tctcataaag aagtgctaaa 1920

ttggctagtg ctatatattt ttaagaaaat ttcttttgac taagtccata tcgactttgt 1980

aaaagttcac tttagcatac atatattaca cgagccagaa attgtaactt ttgcctaaaa 2040

tcacaaattg caaaatttaa ttgcttgcaa aaggtcacat gcttataatc aactttttta 2100

aaaatttaaa atactttttt attttttatt tttaaacata aatgaaataa tttatttatt 2160

gtttatgatt accgaaacat aaaacctgct caagaaaaag aaactgtttt gtccttggaa 2220

aaaaagcact acctaggagc ggccaaaatg ccgaggcttt catagcttaa actctttaca 2280

gaaaataggc attatagatc agttcgagtt ttcttattct tccttccggt tttatcgtca 2340

cagttttaca gtaaataagt atcacctctt agagttcgat gataagctgt caaacatgag 2400

aattaattcc acatgttaaa atagtgaagg agcatgttcg gcacacagtg gaccgaacgt 2460

ggggtaagtg cactagggtc cggttaaacg gatctcgcat tgatgaggca acgctaatta 2520

tcaacatata gattgttatc tatctgcatg aacacgaaat ctttacttga cgacttgagg 2580

ctgatggtgt ttatgcaaag aaaccactgt gtttaatatg tgtcactgtt tgatattact 2640

gtcagcgtag aagataatag taaaagcggt taataagtgt atttgagata agtgtgataa 2700

agtttttaca gcgaaaagac gataaataca agaaaatgat tacgaggata cggagagagg 2760

tatgtacatg tgtatttata tactaagctg ccggcggttg tttgcaagac cgagaaaagg 2820

ctagcaagaa tcgggtcatt gtagcgtatg cgcctgtgaa cattctcttc aacaagtttg 2880

attccattgc ggtgaaatgg taaaagtcaa ccccctgcga tgtatatttt cctgtacaat 2940

caatcaaaaa gccaaatgat ttagcattat ctttacatct tgttatttta cagattttat 3000

gtttagatct tttatgcttg cttttcaaaa ggcttgcagg caagtgcaca aacaatactt 3060

aaataaatac tactcagtaa taacctattt cttagcattt ttgacgaaat ttgctatttt 3120

gttagagtct tttacaccat ttgtctccac acctccgctt acatcaacac caataacgcc 3180

atttaatcta agcgcatcac caacattttc tggcgtcagt ccaccagcta acataaaatg 3240

taagctctcg gggctctctt gccttccaac ccagtcagaa atcgagttcc aatccaaaag 3300

ttcacctgtc ccacctgctt ctgaatcaaa caagggaata aacgaatgag gtttctgtga 3360

agctgcactg agtagtatgt tgcagtcttt tggaaatacg agtcttttaa taactggcaa 3420

accgaggaac tcttggtatt cttgccacga ctcatctcca tgcagttgga cgatatcaat 3480

gccgtaatca ttgaccagag ccaaaacatc ctccttaggt tgattacgaa acacgccaac 3540

caagtatttc ggagtgcctg aactattttt atatgctttt acaagacttg aaattttcct 3600

tgcaataacc gggtcaattg ttctctttct attgggcaca catataatac ccagcaagtc 3660

agcatcggaa tctagtgcac attctgcggc ctctgtgctc tgcaagccgc aaactttcac 3720

caatggacca gaactacctg tgaaattaat aacagacata ctccaagctg cctttgtgtg 3780

cttaatcacg tatactcacg tgctcaatag tcaccaatgc cctccctctt ggccctctcc 3840

ttttcttttt tcgaccgaat taattcttga agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3900

ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3960

aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 4020

atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 4080

caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 4140

cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 4200

tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 4260

tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 4320

gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 4380

tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4440

gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4500

aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4560

gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4620

atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4680

caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4740

ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4800

attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4860

agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4920

aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980

catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040

ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100

tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160

ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220

ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280

ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340

gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400

aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460

acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520

gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580

gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640

cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700

aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760

gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct 5820

cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga aga 5873

<210> 5

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atgaggaagg ttccaatcat taccgccgac gaagccgcta aattgatcaa ggacggcgat 60

accgttacta cttccggttt cgtcggtaac gctattccag aagcattgga cagagccgtt 120

gaaaagaggt tcttggaaac cggcgaacca aagaacatca cctacgtcta ttgcggctcc 180

caaggtaaca gagacggtag aggagcagaa catttcgctc acgaaggctt gttgaagagg 240

tacatcgcag gtcattgggc tacagttcca gctttgggta agatggccat ggagaacaag 300

atggaggctt acaacgtttc tcaaggcgct ttgtgccact tgttcagaga tattgcttcc 360

cataagccag gcgtttttac caaggtcggt atcggcacct tcattgatcc aagaaacggc 420

ggcggtaagg ttaacgatat tactaaggag gacatcgtcg aattggtcga gatcaagggt 480

caggagtact tgttctaccc agctttccca atccacgtcg ctttgatcag aggtacttat 540

gccgacgaat caggtaacat caccttcgaa aaggaggttg ctccattgga aggtacttcc 600

gtttgccaag ccgttaaaaa ttctggcggt atcgtcgtcg tccaagttga aagagtcgtc 660

aaggcaggta ctttagatcc aagacacgtt aaggtcccag gtatctacgt tgattatgtt 720

gttgttgccg atccagaaga ccaccaacaa tccttggatt gcgagtacga cccagcttta 780

tccggcgaac acagaagacc agaagttgtt ggcgaaccat tgccattgtc cgctaaaaag 840

gtcatcggta gaagaggcgc cattgaattg gagaaggacg ttgccgttaa tttgggcgtt 900

ggtgctccag aatacgttgc ttcagttgct gacgaagagg gtatcgttga cttcatgacc 960

ttgaccgcag aatcaggagc tattggaggt gttccagcag gaggagttag atttggcgca 1020

tcttacaacg ccgacgcttt gattgaccag ggttaccaat tcgattacta cgacggaggc 1080

ggtttggatc tttgctacct tggtttggcc gagtgcgacg aaaagggtaa catcaatgtt 1140

tcaagattcg gtccaagaat tgcaggttgc ggcggtttca ttaacatcac ccagaacacc 1200

ccaaaggtct tcttttgcgg tacttttacc gccggcggtt tgaaggttaa gattgaagac 1260

ggtaaggtca tcatcgtcca agagggtaag cagaagaagt tcttgaaggc cgtcgaacag 1320

attaccttca acggcgacgt tgcattggct aacaagcagc aagtcaccta catcaccgag 1380

aggtgcgtat tcttgttgaa ggaggacggt ttgcacttgt ccgaaatcgc tccaggtatc 1440

gatttgcaga cccagatctt ggacgtcatg gatttcgccc caatcatcga tagagacgct 1500

aacggtcaga tcaagttgat ggacgcagct ttgttcgccg aaggtttgat gggcttgaag 1560

gagatgaagt cctaa 1575

<210> 6

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

atgcagatca acgacatcga atccgccgtt aggaagatct tggccgaaga gttggacaac 60

gcttcttctt cttccgctaa cgttgcagct actaccgata acggtcacag aggcatcttc 120

accaacgtta acgacgctat tgcagcagct aaggccgctc aagaaatcta cagggacaag 180

ccaatcgccg ttagacaaca agtcatcgac gctatcaagg agggtttcag gccatacatc 240

gagaagatgg ccaaggacat caaggaggaa accggtatgg gtacagtcga agctaagatc 300

gccaagttga acaacgcctt gtacaacacc ccaggtccag aaatcttgga accagttgtg 360

gaaaacggcg acggaggtat ggttatgtac gaaagattgc catacggcgt tattggcgca 420

gttggtccat ctactaaccc atccgaaacc gtcatcgcaa acgctatcat gatgttggcc 480

ggcggtaata ctttgtactt cggcgctcat ccaggagcta aaaacgttac taggtggacc 540

atcgagaaga tgaacgactt catcgcagac gctaccggtt tgcataactt ggtcgtttcc 600

atcgaaaccc caaccatcga atccgtccaa cagatgatga agcacccaga catcgctatg 660

ttggcagtta caggaggtcc agcagttgtt catcaagcca tgacttccgg taagaaagcc 720

gtaggagcag gtccaggtaa tccaccagct atggttgacg ctacagccga tattgatttg 780

gccgctcata acattatcac ctccgcttct ttcgacaacg acatcctttg caccgcagaa 840

aaggaggttg ttgccgaatc ctccatcaag gacgagttga tcaggaagat gcaagacgag 900

ggtgctttcg tggttaacag agaacaagcc gacaagttgg ccgatatgtg catccaagag 960

aacggcgctc cagatagaaa gttcgttggt aaggacgcca cctacatctt ggatcaagct 1020

aacatcccat acaccggtca tccagtcgaa atcatctgcg agttgccaaa ggaacaccca 1080

ttggtcatga ccgagatgtt gatgccaatc ttgccagtcg tttcttgccc aactttcgac 1140

gacgttttga agaccgccgt ggaagttgaa aagggtaacc atcataccgc caccatccat 1200

tccaacaact tgaagcacat caacaacgcc gcccatagaa tgcagtgttc catcttcgtc 1260

gtgaacggtc catcttacgt tggtacaggt gttgcagata acggtgctca ttcaggagca 1320

tccgctttga ccattgctac tccaacaggt gaaggtactt gcacagctag aaccttcacc 1380

aggagagtca gattgaactc cccacaaggt ttcagcgtca ggaattggta ctaa 1434

<210> 7

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atgtacaccg tgggtgacta cttgctggac cgtctgcacg agctgggtat cgaggaaatc 60

ttcggtgtgc caggtgatta caacctgcaa ttcctggacc agatcattag ccgcaaagac 120

atgaagtggg tcggtaatgc gaatgagctg aacgcgagct atatggcaga tggttatgcg 180

cgtaccaaaa aggcagcagc gtttttgacg actttcggcg tgggtgagct gtcggccgtt 240

aatggtttgg ccggttccta cgccgagaac ctgccagtcg ttgaaattgt gggtagcccg 300

accagcaaag tccagaacga aggcaaattc gtccatcaca ctttggcgga cggtgacttc 360

aaacacttta tgaaaatgca cgagccggtt acggccgcac gtacgttgct gacggcagag 420

aacgctactg tggagattga tcgtgtactg agcgcactgt tgaaggagcg caagccggtt 480

tacatcaatc tgccagttga cgttgcggca gcaaaggcgg agaagccgag cctgccgctg 540

aaaaaggaaa acccgacgtc caataccagc gaccaggaaa ttctgaacaa gattcaagag 600

agcctgaaaa acgcgaaaaa gccgattgtg atcacgggcc acgagatcat cagctttggc 660

ctggaaaaca ccgttaccca attcatttct aaaacgaagt tgccgattac gaccctgaac 720

tttggcaaat ctagcgtcga tgaaaccctg ccgtcctttt tgggcatcta taatggcaaa 780

ctgagcgaac cgaacctgaa agagtttgtc gaaagcgctg atttcattct gatgctgggt 840

gtgaagctga ccgactctag cacgggtgcg ttcacccacc atctgaatga aaacaaaatg 900

atctctctga acatcgatga gggtaaaatc ttcaatgaga gcattcaaaa cttcgatttt 960

gaatccctga ttagcagcct gctggacctg agcggtattg agtataaagg caaatacatc 1020

gacaagaagc aagaagattt tgtgccgagc aatgcgttgc tgtcccaaga ccgtctgtgg 1080

caggctgtgg aaaatctgac ccagagcaat gaaacgattg tcgccgagca gggcaccagc 1140

ttctttggtg caagctcgat ctttctgaaa ccgaaaagcc atttcattgg tcaaccgctg 1200

tggggtagca ttggctacac ctttccggct gcgctgggtt cccagatcgc ggacaaggag 1260

agccgccatc tgctgttcat cggcgatggt agcctgcaac tgaccgtgca ggaactgggc 1320

ctggcgatcc gcgagaagat caaccctatc tgcttcatca ttaacaatga cggttatacc 1380

gttgaacgtg agattcacgg cccgaatcag agctataatg atattccgat gtggaattac 1440

agcaaactgc ctgagagctt cggcgcgacc gaggaacgtg tggtcagcaa aattgtccgc 1500

accgaaaatg agtttgtttc tgttatgaag gaagcccaag ccgatccgaa ccgtatgtac 1560

tggatcgagc tggttctggc gaaggaagat gcgccgaagg tcttgaagaa gatgggtaag 1620

ctgtttgcgg agcagaacaa aagctaa 1647

<210> 8

<211> 6630

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 60

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 120

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa 180

gctttatttt agattcctga cttcaactca agacgcacag atattataac atctgcataa 240

taggcatttg caagaattac tcgtgagtaa ggaaagagtg aggaactatc gcatacctgc 300

atttaaagat gccgatttgg gcgcgaatcc tttattttgg cttcaccctc atactattat 360

cagggccaga aaaaggaagt gtttccctcc ttcttgaatt gatgttaccc tcataaagca 420

cgtggcctct tatcgagaaa gaaattaccg tcgctcgtga tttgttcgca aaaagaacaa 480

aactgaaaaa acccagacac gctcgacttc ctgtcttcct attgattgca gcttccaatt 540

tcgtcacaca acaaggtcct agcgacggct cacaggtttt gtaacaagcg atcgaaggtt 600

ctggaatggc gggaaagggt ttagtaccac atgctatgat gcccactgtg atctccagag 660

caaagttcgt tcgatcgtac tgttactctc tctctttcaa acagaattgt ccgaatcgtg 720

tgacaacaac agcctgttct cacacactct tttcttctaa ccaagggggt ggtttagttt 780

agtagaacct cgtgaaactt acatttacat atatataaac ttgcataaat tggtcaatgc 840

aagaaataca tatttggtct tttctaattc gtagtttttc aagttcttag atgctttctt 900

tttctctttt ttacagatca tcaaggaagt aattatctac tttttacaac aaatataaaa 960

cagtcgacct cgaatctaga gggccgcatc atgtaattag ttatgtcacg cttacattca 1020

cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag ttagacaacc tgaagtctag 1080

gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa cgttatttat atttcaaatt 1140

tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca ttatactgaa aaccttgctt 1200

gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcggta ccgagctcga attcgtttaa 1260

acactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 1320

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 1380

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 1440

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatatcgct gggccattct catgaagaat 1500

atcttgaatt tattgtcata ttactagttg gtgtggaagt ccatatatcg gtgatcaata 1560

tagtggttga catgctggct agtcaacatt gagccttttg atcatgcaaa tatattacgg 1620

tattttacaa tcaaatatca aacttaacta ttgactttat aacttattta ggtggtaaca 1680

ttcttataaa aaagaaaaaa attactgcaa aacagtacta gcttttaact tgtatcctag 1740

gttatctatg ctgtctcacc atagagaata ttacctattt cagaatgtat gtccatgatt 1800

cgccgggtaa atacatataa tacacaaatc tggcttaata aagtctataa tatatctcat 1860

aaagaagtgc taaattggct agtgctatat atttttaaga aaatttcttt tgactaagtc 1920

catatcgact ttgtaaaagt tcactttagc atacatatat tacacgagcc agaaattgta 1980

acttttgcct aaaatcacaa attgcaaaat ttaattgctt gcaaaaggtc acatgcttat 2040

aatcaacttt tttaaaaatt taaaatactt ttttattttt tatttttaaa cataaatgaa 2100

ataatttatt tattgtttat gattaccgaa acataaaacc tgctcaagaa aaagaaactg 2160

ttttgtcctt ggaaaaaaag cactacctag gagcggccaa aatgccgagg ctttcatagc 2220

ttaaactctt tacagaaaat aggcattata gatcagttcg agttttctta ttcttccttc 2280

cggttttatc gtcacagttt tacagtaaat aagtatcacc tcttagagtt cgatgataag 2340

ctgtcaaaca tgagaattaa ttccacatgt taaaatagtg aaggagcatg ttcggcacac 2400

agtggaccga acgtggggta agtgcactag ggtccggtta aacggatctc gcattgatga 2460

ggcaacgcta attatcaaca tatagattgt tatctatctg catgaacacg aaatctttac 2520

ttgacgactt gaggctgatg gtgtttatgc aaagaaacca ctgtgtttaa tatgtgtcac 2580

tgtttgatat tactgtcagc gtagaagata atagtaaaag cggttaataa gtgtatttga 2640

gataagtgtg ataaagtttt tacagcgaaa agacgataaa tacaagaaaa tgattacgag 2700

gatacggaga gaggtatgta catgtgtatt tatatactaa gctgccggcg gttgtttgca 2760

agaccgagaa aaggctagca agaatcgggt cattgtagcg tatgcgcctg tgaacattct 2820

cttcaacaag tttgattcca ttgcggtgaa atggtaaaag tcaaccccct gcgatgtata 2880

ttttcctgta caatcaatca aaaagccaaa tgatttagca ttatctttac atcttgttat 2940

tttacagatt ttatgtttag atcttttatg cttgcttttc aaaaggcttg caggcaagtg 3000

cacaaacaat acttaaataa atactactca gtaataacct atttcttagc atttttgacg 3060

aaatttgcta ttttgttaga gtcttttaca ccatttgtct ccacacctcc gcttacatca 3120

acaccaataa cgccatttaa tctaagcgca tcaccaacat tttctggcgt cagtccacca 3180

gctaacataa aatgtaagct ctcggggctc tcttgccttc caacccagtc agaaatcgag 3240

ttccaatcca aaagttcacc tgtcccacct gcttctgaat caaacaaggg aataaacgaa 3300

tgaggtttct gtgaagctgc actgagtagt atgttgcagt cttttggaaa tacgagtctt 3360

ttaataactg gcaaaccgag gaactcttgg tattcttgcc acgactcatc tccatgcagt 3420

tggacgatcg atgataagct gtcaaacatg agaattgggt aataactgat ataattaaat 3480

tgaagctcta atttgtgagt ttagtataca tgcatttact tataatacag ttttttagtt 3540

ttgctggccg catcttctca aatatgcttc ccagcctgct tttctgtaac gttcaccctc 3600

taccttagca tcccttccct ttgcaaatag tcctcttcca acaataataa tgtcagatcc 3660

tgtagagacc acatcatcca cggttctata ctgttgaccc aatgcgtctc ccttgtcatc 3720

taaacccaca ccgggtgtca taatcaacca atcgtaacct tcatctcttc cacccatgtc 3780

tctttgagca ataaagccga taacaaaatc tttgtcgctc ttcgcaatgt caacagtacc 3840

cttagtatat tctccagtag atagggagcc cttgcatgac aattctgcta acatcaaaag 3900

gcctctaggt tcctttgtta cttcttctgc cgcctgcttc aaaccgctaa caatacctgg 3960

gcccaccaca ccgtgtgcat tcgtaatgtc tgcccattct gctattctgt atacacccgc 4020

agagtactgc aatttgactg tattaccaat gtcagcaaat tttctgtctt cgaagagtaa 4080

aaaattgtac ttggcggata atgcctttag cggcttaact gtgccctcca tggaaaaatc 4140

agtcaagata tccacatgtg tttttagtaa acaaattttg ggacctaatg cttcaactaa 4200

ctccagtaat tccttggtgg tacgaacatc caatgaagca cacaagtttg tttgcttttc 4260

gtgcatgata ttaaatagct tggcagcaac aggactagga tgagtagcag cacgttcctt 4320

atatgtagct ttcgacatga tttatcttcg tttcctgcat gtttttgttc tgtgcagttg 4380

ggttaagaat actgggcaat ttcatgtttc ttcaacacta catatgcgta tatataccaa 4440

tctaagtctg tgctccttcc ttcgttcttc cttctgttcg gagattaccg aatcaaaaaa 4500

atttcaaaga aaccgaaatc aaaaaaaaga ataaaaaaaa aatgatgaat tgaattgaaa 4560

agctaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat 4620

gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 4680

tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 4740

ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 4800

ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 4860

gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct 4920

caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 4980

ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact 5040

cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa 5100

gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga 5160

taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt 5220

tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga 5280

agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg 5340

caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat 5400

ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat 5460

tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc 5520

agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga 5580

tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc 5640

agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 5700

gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc 5760

gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt 5820

tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt 5880

gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 5940

accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc 6000

accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa 6060

gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 6120

ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag 6180

atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 6240

gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa 6300

cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt 6360

gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg 6420

gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc 6480

tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac 6540

cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct 6600

ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 6630

<210> 9

<211> 1418

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tttgtttgtt tatgtgtgtt tattcgaaac taagttcttg gtgttttaaa actaaaaaaa 60

agactaacta taaaagtaga atttaagaag tttaagaaat agatttacag aattacaatc 120

aatacctacc gtctttatat acttattagt caagtagggg aataatttca gggaactggt 180

ttcaaccttt tttttcagct ttttccaaat cagagagagc agaaggtaat agaaggtgta 240

agaaaatgag atagatacat gcgtgggtca attgccttgt gtcatcattt actccaggca 300

ggttgcatca ctccattgag gttgtgcccg ttttttgcct gtttgtgccc ctgttctctg 360

tagttgcgct aagagaatgg acctatgaac tgatggttgg tgaagaaaac aatattttgg 420

tgctgggatt cttttttttt ctggatgcca gcttaaaaag cgggctccat tatatttagt 480

ggatgccagg aataaactgt tcacccagac acctacgatg ttatatattc tgtgtaaccc 540

gccccctatt ttgggcatgt acgggttaca gcagaattaa aaggctaatt ttttgactaa 600

ataaagttag gaaaatcact actattaatt atttacgtat tctttgaaat ggcagtattg 660

ataatgataa actcgaactg aaaaagcgtg ttttttattc aaaatgattc taactccctt 720

acgtaatcaa ggaatctttt tgccttggcc tccgcgtcat taaacttctt gttgttgacg 780

ctaacattca acgctagtat acatgtaggt ggcggagggg agatatacaa tagaacagat 840

accagacaag acataatggg ctaaacaaga ctacaccaat tacactgcct cattgatggt 900

ggtacataac gaactaatac tgtagcccta gacttgatag ccatcatcat atcgaagttt 960

cactaccctt tttccatttg ccatctattg aagtaataat aggcgcatgc aacttctttt 1020

cttttttttt cttttctctc tcccccgttg ttgtctcacc atatccgcaa tgacaaaaaa 1080

atgatggaag acactaaagg aaaaaattaa cgacaaagac agcaccaaca gatgtcgttg 1140

ttccagagct gatgaggggt atctcgaagc acacgaaact ttttccttcc ttcattcacg 1200

cacactactc tctaatgagc aacggtatac ggccttcctt ccagttactt gaatttgaaa 1260

taaaaaaaag tttgctgtct tgctatcaag tataaataga cctgcaatta ttaatctttt 1320

gtttcctcgt cattgttctc gttccctttc ttccttgttt ctttttctgc acaatatttc 1380

aagctatacc aagcatacaa tcaactatct catataca 1418

<210> 10

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tttgtttgtt tatgtgtgtt tattcgaaac taagttcttg gtgttttaaa actaaaaaaa 60

agactaacta taaaagtaga atttaagaag tttaagaaat agatttacag aattacaatc 120

aatacctacc gtctttatat acttattagt caagtagggg aataatttca gggaactggt 180

ttcaaccttt tttttcagct ttttccaaat cagagagagc agaaggtaat agaaggtgta 240

agaaaatgag atagatacat gcgtgggtca attgccttgt gtcatcattt actccaggca 300

ggttgcatca ctccattgag gttgtgcccg ttttttgcct gtttgtgccc ctgttctctg 360

tagttgcgct aagagaatgg acctatgaac tgatggttgg tgaagaaaac aatattttgg 420

tgctgggatt cttttttttt ctggatgcca gcttaaaaag cgggctccat tatatttagt 480

ggatgccagg aataaactgt tcacccagac acctacgatg ttatatattc tgtgtaaccc 540

gccccctatt ttgggcatgt acgggttaca gcagaattaa aaggctaatt ttttgactaa 600

ataaagttag gaaaatcact actattaatt atttacgtat tctttgaaat ggcagtattg 660

ataatgataa actcgaactg aaaaagcgtg ttttttattc aaaatgattc taactccctt 720

acgtaatcaa ggaatctttt tgccttggcc tccgcgtcat taaacttctt gttgttgacg 780

ctaacattca acgctagtat 800

<210> 11

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tcggcatgcc ggtagaggtg tggtcaataa gagcgacctc atgctatacc tgagaaagca 60

acctgaccta caggaaagag ttactcaaga ataagaattt tcgttttaaa acctaagagt 120

cactttaaaa tttgtataca cttatttttt ttataact 158

<210> 12

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

gtacttcaaa tctacgtcca agtagggtag aatcaatttc ttcttgatct tatcccaaat 60

gatacgggtc atttcatcac cgtccaactc gacaacgggt tgtttgacct taatcttact 120

gaaagcagca aggcgagagg tggaaaataa tcttctagat aacatactca tgctgggcga 180

tcttccttgt gcgtctgttg tctcacaatt gcttgaagga agatttcata agatcatatg 240

agtccctctt tatatgggca agtggaatta tgtgagtcaa aatccgcgcg tgacccgtaa 300

agcgttatca gaaggtgcaa acggtgctat ttagctcata aaaggaatga ttcaagctct 360

tttggattgt aagacacctt tatttagtcc aagatcattg cagacccttg ttatggtctt 420

tagcagagtc ctcctctata tctcttcatt tactgcaacc tgattggccc gctaccacga 480

tgcccgcttt gttcctgtgg tattaaaaga atcgatgaaa gagactctta tcttcaggga 540

aaattaggac cgagaattag agcaagcaag atatttgcaa actactaact acaagcgact 600

tacacagac 609

<210> 13

<211> 604

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

atttacaagc acatccctga agggaccgac aagcatgaag aacagatcag gagcattttg 60

gaaactgccc cgattttacc aggacagaca ttcactgaaa aattttctat tccggcttat 120

aaaaagcatg gaatccaaaa gaattaggct tctcattcta ttttaattat actagtacga 180

tttctcactc tgtaatttaa tatcagtgta atatgcacct agttatgggt agtttttgct 240

aacgttacga gccgcgaaac tgtcctcaat cttcaccact acctctaatg actgaagaat 300

gctatgcgat ataacgctgt cgcactttga atatatactt atatttacat agttttcaag 360

tgcgtattac tattgcaaag tagtattttg tcacgtgatt ttgatccaat taaaactaaa 420

tatggttcaa cccgttgttt ccgcatcaaa aaaccatacc atttatcaag gggacgggat 480

atatcacata acagtttgaa tgcataattt gttatagata tcttctggaa taatcttcac 540

agcaaaagcg caagtcgaat aatatatcga taaatacaat ccataagact taaaactaac 600

ctca 604

<210> 14

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gaagaaaaag cgggaaacgg atttctcgtt ctaggcctcg gcggctctta aaattgtaaa 60

atgaaaatga gaataaaatt aaactataca cagctgatca gcgttctaat gaaaaaaaaa 120

tgcattggaa ggaaaagccg aaatacttca ttttctgggc attgacgttc tgttgcctct 180

tgtgcataca cacttgtttt tattgaaatc gagcttattg taagagaact tgcgcttatc 240

ttcaaatgcc gctttcctcg aaaaagcatt taaacatcat tcaagattat tagtctatca 300

agcttgtcca gactgcttgt tattatgtaa aacaagtatg ttggtattgt atttgattgc 360

cgattctcat atcgccatac acgaaccaat tatgcatcat aaaaaaagcg tagttctttt 420

acccgaccaa ccaacttctt cctttgtcct caatatcaaa gaaaaaaaaa aaaacccact 480

gctcagatgt tataaggaag gggtgttaac ttatatacag gttcatctac cagtcaccag 540

tccatacaaa cttgaaccgt ctgcgtacca gtcctaatca aa 582

<210> 15

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

cttgaaaaga aagagaacag cgaaaagaga tgaataatcc atggcaatga ctgcacgctc 60

atgggtatca attggctagg tctaatattg ttattgtttg gagtatggcg tagagaagtg 120

gttccttaac cttaattaat gcccgtgcca tgatgattgc atcactgaga cgtaatgtgg 180

aaacaccact tctcggtccg cggacatcaa ccgaaggaaa aatgacaagc tatttccgtg 240

tatatccgcg ccaatccctt cggggccgaa gttcggaggc tttatctccg cttagccaag 300

gccgtcaaag gcgataaggt gcgttgcacc ccaattagcc atggagaagg aaaaaaaaag 360

catgtatgat catgatgatg caaaaattga gaggaaaaat gactcaggct atttatataa 420

gtaaatgaaa gggtttcgtt gtagcctttt ctgctctctt ccttcgctct tccgcatata 480

tatttgtgtt cagagattat tcttaaatcc ataagaacat cccttcatat aacaattgaa 540

taaggaaaac acaacacata acacatattt aacctg 576

<210> 16

<211> 606

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tgtaaaaaat gcaatcacgt tttcacattt ttttttttct tgcggaattg cggaatttcc 60

cagttggcag cgttatccga tttgagatcg acttgcatca acctttgaaa aatataagga 120

tgagaaagtg aaatcggttt tttttttcca ttgtcgtcat caacatgatt ttttaaataa 180

ataaatacga ttttttattt tttttccctt ctttgttttt gttttgctta ttcccatctt 240

cattattaaa ttcttccgct cttaataaag gagttttttt attatcttct tgtgtaatca 300

tcctttttct ttaattttct tccttttctt tttctcttta ctggtttttt tacttcttta 360

ttctcaacca tctaaagaat attattgctt tctaccaata aaatctgtta attctatttg 420

gattgtcgtc tactcaagtc tcgcctagta aataaacgat aaacaaattt gaagtaagaa 480

taacaatata gggagagaaa tttttctatt tttaatttcg aaacaggtac caaaaaatct 540

aagttcactt tagcactatt tgggaaagct tttatataaa aaatctgaaa caaaatcata 600

tcaaag 606

<210> 17

<211> 994

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggatcccgtc tcaccagacg atacagaggc taagaataac gcagataatc gctctaacga 60

aacgtactaa aagatttctt ttgaagtaac tagataccct ggtcttatac taggtatctt 120

tgtcagaaac ggcctaagac tacagtaaga gcagttggaa cctggtacct aaaattttga 180

tctattgtag tcgcctaatc ttgcttctct tgctgaataa atagcgctat ccgctgtacc 240

gtaccaagag tgacctacag cgtttgatag gcaaaagagt taaggacaga ctgggtttca 300

atcaaaataa atgccaaaag gatttgactt tatatttgat aatgctcact ctaaacggaa 360

ggcacatgca tcgcataatt ggaacgagaa ataaagtgtt attataagtg tacaaaatta 420

tttaatggtt gattataaaa aactatttta taatttgtag acaacaagca agcttaggtt 480

gagacccccg gggagagtcg acctgcaggg tctcaatcgg aattcataaa gcaatcttga 540

tgaggataat gatttttttt tgaatataca taaatactac cgtttttctg ctagattttg 600

tgaagacgta aataagtaca tattactttt taagccaaga caagattaag cattaacttt 660

acccttttct cttctaagtt tcaatactag ttatcactgt ttaaaagtta tggcgagaac 720

gtcggcggtt aaaatatatt accctgaacg tggtgaattg aagttctagg atggtttaaa 780

gatttttcct ttttgggaaa taagtaaaca atatattgct gccttgagct ccagccaacc 840

agtcagatta gcagtatata ggctgcgagt tactagcggg caaaatctgg agttatcgcc 900

taaagcgtta tctgatccct attcggcagc agtttggtcg gtttgagtag tcaataacgt 960

tctatcgtat ctcgttcgtc gagagacgtc taga 994

<210> 18

<211> 1499

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

gaattcgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 60

aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttta ttttttgtca ctattgttat gtaaaatgcc 120

acctctgaca gtatggaacg caaacttctg tctagtggat aacagaattt ttctatggcc 180

aatttaggat cccgcgaacc caactgcaca gaacaaaaac ctgcaggaaa cgaagataaa 240

tcatgtcgaa agctacatat aaggaacgtg ctgctactca tcctagtcct gttgctgcca 300

agctatttaa tatcatgcac gaaaagcaaa caaacttgtg tgcttcattg gatgttcgta 360

ccaccaagga attactggag ttagttgaag cattaggtcc caaaatttgt ttactaaaaa 420

cacatgtgga tatcttgact gatttttcca tggagggcac agttaagccg ctaaaggcat 480

tatccgccaa gtacaatttt ttactcttcg aagacagaaa atttgctgac attggtaata 540

cagtcaaatt gcagtactct gcgggtgtat acagaatagc agaatgggca gacattacga 600

atgcacacgg tgtggtgggc ccaggtattg ttagcggttt gaagcaggcg gcagaagaag 660

taacaaagga acctagaggc cttttgatgt tagcagaatt gtcatgcaag ggctccctat 720

ctactggaga atatactaag ggtactgttg acattgcgaa gagcgacaaa gattttgtta 780

tcggctttat tgctcaaaga gacatgggtg gaagagatga aggttacgat tggttgatta 840

tgacacccgg tgtgggttta gatgacaagg gagacgcatt gggtcaacag tatagaaccg 900

tggatgatgt cgtttctaca ggatctgaca ttattattgt tggaagagga ctatttgcaa 960

agggaaggga tgctaaggta gagggtgaac gttacagaaa agcaggctgg gaagcatatt 1020

tgagaagatg cggccagcaa aactaaaaaa ctgtattata agtaaatgca tgtatactaa 1080

actcacaaat tagagcttca atttaattat atcagttatt accctgtgtc tagtctttga 1140

aaagataatg tatgattatg ctttcactca tatttataca gaaacttgat gttttctttc 1200

gagtatatac aaggtgatta catgtacgtt tgaagtacaa ctctagattt tgtagtgccc 1260

tcttgggcta gcggtaaagg tgcgcatttt ttcacaccct acaatgttct gttcaaaaga 1320

ttttggtcaa acgctgtaga agtgaaagtt ggtgcgcatg tttcggcgtt cgaaacttct 1380

ccgcagtgaa agataaatga tctagttttc acaagaaaac aagcgcaagt ggtttagtgg 1440

taaaatccaa cgttgccatc gttgggcccc cggttcgatt ccgggcttgc gcaaagctt 1499

Claims

1.一种用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合，其特征在于，包括至少一个表达质粒；所述表达质粒包括编码具有丙酰辅酶A合成酶活性、苏氨酸脱氨酶活性、脂肪酸合成酶活性、醛脱氢酶活性、酮酸脱羧酶活性、天冬氨酸激酶活性、高丝氨酸脱氢酶活性、苏氨酸合成酶活性、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性和天冬氨酸转氨酶活性的多肽的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的重组质粒组合，其特征在于，所述编码具有天冬氨酸激酶活性的多肽的多核苷酸为突变的多核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的重组质粒组合，其特征在于，包括至少一个敲除质粒；所述敲除质粒是基于L-高丝氨酸-O-乙酰基转移酶基因、乙酰乳酸合成酶基因或苏氨酸醛缩酶基因设计的。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组质粒组合，其特征在于，包括至少一个丙酮酸激酶活性减弱质粒；所述酶活性减弱质粒是基于丙酮酸激酶基因的强启动子设计的敲除质粒。

5.一种基因工程改造的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌转化了权利要求1所述的用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合。

6.根据权利要求5所述的基因工程改造的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌转化了权利要求2所述的用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合。

7.根据权利要求5或6所述的基因工程改造的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌转化了权利要求3所述的用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合。

8.根据权利要求5或6所述的基因工程改造的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌转化了权利要求4所述的用于奇数链脂肪酸合成的重组质粒组合。

9.权利要求1-4任一项所述的重组质粒组合或权利要求5-8任一项所述的酵母菌在合成奇数链脂肪酸/脂或提高奇数链脂肪酸/脂比例的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述奇数链脂肪酸包括C13:0、C15:0、C15:1、C17:0、C17:1、C19:0和C19:1中的至少一种。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述奇数链脂肪酸酯是指含有奇数链脂肪酸中的至少一种的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和/或磷脂。

12.一种制备奇数链脂肪酸的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-4任一项所述的重组质粒组合或权利要求5-8任一项所述基因工程改造的酵母菌。