BR112014031876B1 - Bactéria acetogênica carboxidotrófica, processo para converter co em biodiesel, e, plasmídeo - Google Patents
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Abstract
BACTÉRIA ACETOGÊNICA CARBOXIDOTRÓFICA, PROCESSO PARA CONVERTER CO E/OU CO2 EM BIODIESEL, E, PLASMÍDEO. Um micro-organismo recombinante acetogênico carboxidotrófico é modificado para que produza biodiesel e, opcionalmente, um ou mais de outros produtos através da fermentação de um substrato compreendendo CO. O biodiesel é produzido pela fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO. O micro-organismo recombinants é modificado para expressar uma ou mais enzimas exógenas na via de biossíntese do biodiesel não presentes em um microorganismo parental, do qual deriva o microrganismo recombinante. As uma ou mais enzimas compreendem uma aciltransferase inespecifica.
Description
[001] A presente invenção refere-se aos microrganismos recombinantes e métodos para a produção de biodiesel por fermentação microbiana de um substrato composto por CO.
[002] Bactérias incluindo Clostridium autoethanogenum ou C. ljungdahlii acetogênicas carboxidotróficas produzem ácidos graxos na biossíntese de lipídios e membranas celulares.
[003] Em cepas de Clostridia do tipo selvagem, flux down a via de ácidos graxos é significativo com lipídios representando normalmente 5-6 % (w/w) da massa de célula seca (respectivamente de 1-1.5 % (w/w) de massa de células molhada) (Lepage et al., 1987, Microbiology 133: 103-110). Normalmente, mais de 95% dos lipídeos estão na faixa muito bem definida de comprimento de cadeia C16-C18 (Lepage et al., 1987, Microbiology 133: 103-110), com 12:0, 14:0, 14:1, 16:0, 16:1, 17Δ, 18:0, 18:1, 19Δ de ácidos graxos presentes.
[004] Os ácidos graxos (FAs) e seus derivados são energéticos e, portanto, têm potencial como biocombustíveis para uso como um combustível de jato/transporte de "abastecimento rápido" e/ou para a produção de outros compostos químicos industriais. Exemplos de derivados de ácidos graxos incluem biodiesel, ácidos graxos livres, alquenos e alcanos.
[005] O biodiesel é um éster mono-alquil e pode ser usado sozinho em motores a diesel padrão ou pode ser misturado com o petrodiesel. Ele também pode ser usado como uma alternativa de baixo teor de carbono para óleo de aquecimento. Em 2009, em todo o mundo foram usados mais de 3,5 bilhões de galões de biodiesel. O biodiesel é normalmente derivado quimicamente de gordura vegetal ou animal por transesterificação de lipídios na presença de álcool para produzir glicerina e um éster mono-alquil. O biodiesel produzido por este processo pode entretanto causar danos aos motores a diesel devido às variações nos óleos a partir de diversas fontes animais e vegetais que não são muito definidas com uma ampla gama de comprimento de cadeia de carbono (Fukuda et al., 2001, Biosci Bioeng 92: 405-416). Os pontos críticos são a diluição do óleo do motor, carbonização dos anéis de pistão, corrosão dos componentes hidráulicos e depósitos no sistema de injeção, resultantes do processo de produção e envelhecimento do combustível, resultando em alguns fabricantes automotivos recusarem o uso do biodiesel derivado de animais ou vegetal em alguns de seus modelos (Kopke et al., 2011, The Past, Present, and Future of Biofuels - Biobutanol as Promising Alternative, Em: dos Santos Bernades (Ed.) Biofuel ProductionRecent Developments and Prospects, InTech, 451-486).
[006] A atual geração de biocombustíveis que usam culturas alimentares ou não alimentares para produzir açúcar ou celulose com base em matérias-primas pode ter desvantagens relativas ao uso da terra, a segurança alimentar, a volatilidade dos problemas de abastecimento e ambientais.
[007] É um objeto da invenção superar esses problemas e fornece um método de produção de biodiesel, ou pelo menos para fornecer ao público com uma escolha útil.
[008] A invenção geralmente fornece, dentre outros, métodos para a produção de biodiesel por fermentação microbiana de um substrato compreendendo CO, e microrganismos recombinantes de uso de tais métodos.
[009] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um micro organismo recombinante acetogênico carboxidotrófico capaz de produzir biodiesel e, opcionalmente, um ou mais outros produtos por fermentação de um substrato compreendendo CO.
[0010] Em uma determinada modalidade, o micro-organismo é adaptado para expressar uma ou mais enzimas exógenas na via de biossíntese de biodiesel não presentes em um micro-organismo de origem, do qual deriva o micro-organismo recombinante (pode ser referido neste documento como uma enzima exógena). Em outra modalidade, o micro-organismo é adaptado para superexpressar uma ou mais enzimas endógenas na via de síntese de biodiesel que estão presentes em um micro-organismo de origem, do qual deriva o micro-organismo recombinante (pode ser referido neste documento como uma enzima endógena).
[0011] Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante é adaptado para produzir uma quantidade maior de biodiesel do que seria produzida por um micro-organismo de origem, do qual deriva o microorganismo recombinante.
[0012] Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas que o microorganismo é adaptado para expressar ou superexpressar é uma aciltransferase.
[0013] Em uma modalidade, a enzima é uma enzima aciltransferase, conforme definido na SEQ ID NO: 1, ou uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[0014] Em uma modalidade, o micro-organismo de origem é capaz de fermentar um substrato composto por CO, para produzir um álcool, mas não de converter o álcool em biodiesel e o micro-organismo recombinante é adaptado para expressar uma ou mais enzimas envolvidas na conversão de etanol para biodiesel.
[0015] Em uma modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos adaptados para aumentar a expressão de um ou mais ácidos nucleicos endógenos e os quais um ou mais ácidos nucleicos endógenos codificam uma ou mais das enzimas referidas neste documento antes.
[0016] Em uma modalidade, o um ou mais ácidos nucleicos exógenos adaptados para aumentar a expressão é um elemento regulador. Em uma modalidade, o elemento regulador é um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor constitutivo. Em uma modalidade, o promotor é selecionado a partir do grupo constituído por agrupamento do gene Wood- Ljungdahl, promotor de piruvato: ferredoxina oxidoredutase, um promotor de operon Rnf complexo, um promotor de operon do ATP sintetase e promotores de operon Fosfotransacetilase/acetato quinase.
[0017] Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante de carboxidotrófico acetogênico é adaptado adicionalmente para expressar uma ou mais enzimas exógenas na via de biossíntese de ácido graxo. Em um outro aspecto, o micro-organismo é adaptado para superexpressar uma ou mais enzimas endógenas na via de biossíntese de ácido graxo.
[0018] Em uma modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando e adaptados para expressar uma ou mais das enzimas referidas neste documento antes. Em uma modalidade, os micro-organismos compreendem um ou mais ácido nucleico exógeno codificando e adaptado para expressar pelo menos duas enzimas. Em uma outra modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando e adaptados para expressar cinco ou mais das enzimas.
[0019] Em uma modalidade, o um ou mais ácidos nucleicos exógenos é um construto ou vetor de ácido nucleico, em uma modalidade particular um plasmídeo, que codifica uma ou mais das enzimas referidas neste documento anteriormente em qualquer combinação.
[0020] Em uma modalidade, o ácido nucleico exógeno é um plasmídeo de expressão.
[0021] Em uma modalidade particular, o micro-organismo de origem é selecionado do grupo de bactérias acetogênicas carboxidotrófico compreendendo Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii, e Thermoanaerobacter kiuvi.
[0022] Em uma modalidade, o micro-organismo de origem é Clostridium autoethanogenum ou Clostridium ljungdahlii. Em uma determinada modalidade, o micro-organismo é Clostridium autoethanogenum DSM23693 um derivado da cepa DSM10061. Em outra modalidade particular, o micro-organismo é Clostridium ljungdahlii DSM13528 (ou ATCC55383).
[0023] Em um segundo aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico codificando uma ou mais enzimas que quando expresso em um micro-organismo permite que os micro-organismos produzam biodiesel por fermentação de um substrato composto por CO.
[0024] Em uma modalidade, o ácido nucleico codifica duas ou mais enzimas que quando expresso em um micro-organismo permitem que os micro-organismos produzam biodiesel por fermentação de um substrato composto por CO.
[0025] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção codificam cinco ou mais enzimas.
[0026] Em uma modalidade, as enzimas são escolhidas entre o grupo consistindo de acil transferase e uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[0027] Em uma modalidade, o ácido nucleico codificando acila transferase é da SEQ ID NO: 1 ou é uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[0028] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção compreendem ainda um promotor. Em uma modalidade, o promotor permite a expressão constitutiva dos genes sob seu controle. Em uma modalidade particular um promotor de agrupamento Wood-Ljungdahl é usado. Em outras modalidades particulares promotor piruvato: ferredoxina oxidoredutase, um promotor de operon Rnf complexo, promotor de operon do ATP sintase ou um promotor de operon Fosfotransacetilase/acetato quinase é usado. Em uma modalidade particular, o promotor é de C. autoethanogenum.
[0029] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um construto ou vetor de ácido nucleico compreendendo um ou mais ácidos nucleicos do segundo aspecto.
[0030] Em uma modalidade particular, o construto ou vetor do ácido nucleico é um construto ou vetor de expressão. Em uma modalidade particular, o construto ou vetor de expressão é um plasmídeo.
[0031] Em um quarto aspecto, a invenção fornece um organismo hospedeiro que compreende qualquer uma ou mais dos ácidos nucleicos do segundo aspecto ou vetores ou construtos do terceiro aspecto.
[0032] Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo um construto ou vetor de expressão conforme referidos no terceiro aspecto da invenção e um construto ou vetor de metilação.
[0033] Preferencialmente, a composição é capaz de produzir um micro-organismo recombinante de acordo com o primeiro aspecto da invenção.
[0034] Em uma modalidade particular o construto/vetor de expressão e/ou o construto/vetor de metilação é um plasmídeo.
[0035] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um método para a produção de biodiesel e, opcionalmente, um ou mais dos produtos de fermentação microbiana, compreendendo uma fermentação de substrato composto por CO, usando um micro-organismo recombinante do primeiro aspecto da invenção.
[0036] Em uma modalidade o método compreende as etapas de: a. fornecer um substrato compreendendo CO para um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção; e b. fermentar anaerobicamente a cultura no biorreator para produção de biodiesel.
[0037] Em uma modalidade o método compreende as etapas de: a. capturar o gás contendo CO produzido como resultado de um processo industrial b. fermentação anaeróbica do gás contendo CO para produzir biodiesel por uma cultura contendo um ou mais micro-organismos do primeiro aspecto da invenção.
[0038] Em modalidades particulares de aspectos do método, a fermentação ocorre em meio de cultura aquoso.
[0039] Em modalidades particulares dos aspectos do método, a fermentação do substrato ocorre em um biorreator.
[0040] Preferencialmente, o substrato que compreende CO é um substrato gasoso compreendendo CO. Em uma modalidade, o substrato compreende um gás de descarte industrial. Em determinadas modalidades, o gás é gás de descarte de aciaria ou gás de síntese.
[0041] Em uma modalidade, o substrato conterá normalmente uma maior proporção de CO, tal como pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO em volume, de 20% a 70% de CO em volume, de 30% a 60% de CO em volume, e de 40% a 55% de CO em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% de CO em volume.
[0042] Em modalidades particulares os métodos compreendem adicionalmente a etapa da recuperação do biodiesel e, opcionalmente, um ou mais dentre outros produtos do caldo de fermentação.
[0043] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece biodiesel quando produzido pelo método do sexto aspecto.
[0044] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para a produção de um micro-organismo do primeiro aspecto da invenção compreendendo a transformação de um micro-organismo de origem acetogênica carboxidotrófica pela introdução de um ou mais ácidos nucleicos de forma que o micro-organismo seja capaz de produzir biodiesel, ou produzir uma maior quantidade de biodiesel em comparação com o micro-organismo de origem e, opcionalmente, um ou mais dentre outros produtos por fermentação de um substrato composto por CO, no qual o micro-organismo de origem não é capaz de produzir biodiesel, ou biodeiesel em um nível inferior o micro-organismo recombinante, é produzido pela fermentação de um substrato composto por CO.
[0045] Em uma modalidade particular, um micro-organismo de origem é transformado pela introdução de um ou mais ácidos nucleicos exógenos adaptados para expressar uma ou mais enzimas na via de biossíntese de biodiesel. Em uma outra modalidade, um micro-organismo de origem é posteriormente transformado através da introdução de um ou mais os ácidos nucleicos exógenos adaptado para expressar um ou mais enzima na via de biossíntese de ácido graxo. Em uma outra modalidade, um microorganismo de origem é posteriormente transformado por expressar ou superexpressar um ou mais ácidos nucleicos endógenos adaptados para expressar um ou mais enzima na via de biossíntese de ácido graxo. Em uma modalidade, um micro-organismo de origem é transformado com um ou mais ácidos nucleicos adaptados para superexpressar as uma ou mais enzimas endógenas na via de biodiesel que estão naturalmente presentes no microorganismo de origem.
[0046] Em determinadas modalidades, a uma ou mais enzimas são como descritas neste documento anteriormente.
[0047] Em uma modalidade, uma bactéria acetogênica carboxidotrófica geneticamente modificada é composta por um ácido nucleico exógeno que codifica uma acetiltransferase inespecífica (cera éster sintase/acil coenzima A:diacylglycerol aciltransferase). A bactéria pode ser um Clostidium, incluindo mas não limitado a Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum e Clostridium magnum. Outras espécies de Clostridia, que podem ser utilizadas, embora não sejam acetogenic, incluem, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. thermocellum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. kluyveri, e C. pasterianum
[0048] A bactéria pode também ser, por exemplo, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii, ou Thermoanaerobacter kiuvi. A acetiltransferase inespecífica exógena pode ser Acinetobacter baylyi inespecífica acetiltransferase. O ácido nucleico pode ser em um plasmídeo. O ácido nucleico que codifica a acetiltransferase inespecífica pode ser códon otimizado para C. autoethanogenum ou para outra bactéria hospedeira.
[0049] Outra modalidade é um processo para a conversão de CO e/ou CO2 em biodiesel. Um substrato contendo CO gasoso e/ou contendo CO2 é passado a um biorreator que contem uma cultura das bactérias acetogênicas carboxidotróficas em um meio de cultura. A bactéria compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma acetiltransferase inespecífica (sintase de éster de cera/acil Coenzima A:diacilglicerol aciltransferase). O bactérias converte o CO e/ou CO2 diretamente em biodiesel, sem a necessidade de fornecer álcoois (por exemplo, etanol ou butanol) ou ácidos graxos. O biodiesel é recuperado do biorreator. O substrato pode incluir um gás de resíduos industrial. A cultura pode ser cultivada e mantida estritamente como por via anaeróbia. O biodiesel pode incluir ésteres etílicos de ácidos graxos e/ou ésteres butílicos de ácido graxo.
[0050] Outra modalidade é um plasmídeo que replica em uma bactéria acetogênica carboxidotrófica. O plasmídeo compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma acetiltransferase inespecífica (sintase de éster de cera/acil Coenzima A:diacilglicerol aciltransferase). O ácido nucleico que codifica a acetiltransferase inespecífica pode ser códon otimizado para C. autoethanogenum. Opcionalmente o plasmídeo pode ser misturado, por exemplo pela passagem através de uma bactéria que contém uma metilase desejada.
[0051] A invenção também pode ser dita amplamente como consistindo nas partes, elementos e características referidas ou indicadas na especificação do pedido, individual ou coletivamente, em qualquer ou em todas as combinações de duas ou mais das referidas partes, elementos ou características, e onde números inteiros específicos são mencionados neste documento que tem equivalentes conhecidos na técnica à qual a invenção se refere, esses equivalentes conhecidos são considerados para serem incorporados neste documento como se estabelecidos individualmente.
[0052] Esses e outros aspectos da presente invenção, que devem ser considerados em todos seus novos aspectos, tornar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição, que é dada à título de exemplo apenas, com referência às figuras acompanhantes, nas quais:
[0053] Figura 1: Conversão do monóxido de carbono e/ou hidrogênio em um álcool como etanol ou álcool butílico e, em seguida, a conversão posterior de álcool e um éster de ácido graxo-CoA para uma acilester de ácido graxo (biodiesel) por uma aciltransferase inespecíficos.
[0054] Figura 2: Mapa genético do plasmídeo de expressão pMTL85245-atf
[0055] Figura 3: O resultado GC-MS confirmando a produção de biodiesel a partir de CO.
[0056] A seguir está uma descrição da presente invenção, incluindo as modalidades preferenciais da mesma, dadas em termos gerais. A invenção é elucidada ainda a partir da divulgação dada sob o título "Exemplos" neste documento abaixo, que fornece dados experimentais que apoiam a invenção, exemplos específicos de vários aspectos da invenção, e meios de executar a invenção.
[0057] Conforme referido neste documento, um "caldo de fermentação" é um meio de cultura que compreende pelo menos um meio nutriente e células bacterianas.
[0058] Conforme referido neste documento, um "micro-organismo transportador (shuttle)" é um micro-organismo no qual uma enzima metiltransferase é expressa e é diferente do micro-organismo de destino.
[0059] Conforme referido neste documento, um "micro-organismo de destino" é um micro-organismo no qual os genes incluídos em um construto/vetor de expressão são expressos e é diferente do micro-organismo transportador.
[0060] O termo "produto de fermentação principal" destina-se a significar um produto de fermentação que é produzido na maior concentração e/ou rendimento.
[0061] Os termos "aumentar a eficácia", "maior eficácia" e similares, quando usados em relação a um processo de fermentação, incluem, mas não estão limitados a, aumentar um ou mais da taxa de crescimento de microorganismos que catalisam a fermentação, a taxa de crescimento e/ou de produção do produto em concentrações elevadas do produto, o volume do produto desejado produzido por volume de substrato consumido, a taxa de produção ou nível de produção do produto desejado, e a proporção relativa do produto desejado produzido em comparação a outros subprodutos da fermentação.
[0062] A frase "substrato compreendendo monóxido de carbono" e termos similares devem ser entendidos como incluindo qualquer substrato no qual o monóxido de carbono está disponível para uma ou mais cepas das bactérias para o crescimento e/ou fermentação, por exemplo.
[0063] A frase "substrato gasoso compreendendo monóxido de carbono" e frases e termos similares incluem qualquer gás que contenha um nível de monóxido de carbono. Em determinadas modalidades, o substrato contém pelo menos cerca de 20% a cerca de 100% de CO em volume, de 20% a 70% de CO em volume, de 30% a 60% de CO em volume, e de 40% a 55% de CO em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende cerca de 25%, ou cerca de 30%, ou cerca de 35%, ou cerca de 40%, ou cerca de 45%, ou cerca de 50% de CO, ou cerca de 55% de CO, ou cerca de 60% de CO em volume.
[0064] Embora não seja necessário para o substrato conter qualquer hidrogênio, a presença de H2 não deve ser prejudicial à formação do produto de acordo com os métodos da invenção. Em modalidades particulares, a presença de hidrogênio resulta numa eficácia geral maior da produção de álcool. Por exemplo, me modalidades particulares, o substrato pode compreender uma razão de 2:1, ou 1:1, ou 1:2 aproximada de H2:CO. Em uma modalidade, o substrato compreende cerca de 30% ou menos de H2 em volume, 20% ou menos de H2 em volume, cerca de 15% ou menos de H2 em volume ou cerca de 10% ou menos de H2 em volume. Em outras modalidades, o fluxo de substrato compreende baixas concentrações de H2, por exemplo, menos de 5%, ou menos de 4%, ou menos de 3%, ou menos de 2%, ou menos de 1%, ou é substancialmente livre de hidrogênio. O substrato também pode conter um pouco de CO2, por exemplo, tal como cerca de 1% a cerca de 80% de CO2 em volume, ou 1% a cerca de 30% de CO2 em volume. Em uma modalidade, o substrato compreende menos ou igual a cerca de 20% de CO2 em volume. Em modalidades particulares, o substrato compreende menos ou igual a cerca de 15% de CO2 em volume, menos ou igual a cerca de 10% de CO2 em volume, menos ou igual a cerca de 5% de CO2 em volume ou substancialmente nenhum CO2.
[0065] Na descrição que se segue, as modalidades da invenção são descritas em termos de distribuição e fermentação de um "substrato gasoso contendo CO". No entanto, ele deve ser contemplado que o substrato gasoso pode ser fornecido em formas alternativas. Por exemplo, o substrato gasoso contendo CO pode ser fornecido dissolvido em um líquido. Essencialmente, um líquido é saturado com um gás contendo monóxido de carbono e, em seguida, esse líquido é adicionado ao biorreator. Isto pode ser obtido usando a metodologia padrão. À título de exemplo, um gerador de dispersão de microbolhas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Número 3 / Outubro, 2002) poderia ser usado. À título de outro exemplo, o substrato gasoso contendo CO pode ser absorvido em um suporte sólido. Esses métodos alternativos são abrangidos pelo uso do termo "substrato contendo CO" e similares.
[0066] Em modalidades particulares da invenção, o substrato gasoso contendo CO é um gás de descarte ou de escape industrial. "Gases de escape ou de descarte industriais" devem ser tomados amplamente como incluindo quaisquer gases compreendendo CO produzido por um processo industrial e inclui os gases produzidos como um resultado da fabricação de produtos de metal ferroso, fabricação de produtos não-ferrosos, processos de refinação de petróleo, gaseificação de carvão, gaseificação de biomassa, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, e fabricação de coque. Outros exemplos podem ser fornecidos em outro lugar neste documento.
[0067] A menos que o contexto requeira de outra forma, as frases "fermentação", "processo de fermentação" ou "reação de fermentação" e similares, conforme usadas neste documento, destinam-se a abranger a fase de crescimento e fase de biossíntese do produto do processo. Conforme será descrito ainda neste documento, em algumas modalidades, o biorreator podem compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tal, a adição de metais ou de composições a uma reação de fermentação deve ser entendida como incluindo a adição de um ou ambos esses reatores.
[0068] O termo "biorreator" inclui um dispositivo de fermentação que consiste em um ou mais recipientes e/ou torres ou arranjo de tubulação, que inclui o Reator de Tanque Agitado Contínuo (CSTR), Reator com Células Imobilizadas (ICR), Reator de Leito Gotejante (TBR), Coluna de Bolhas, Fermentador de Elevação de Gases, Misturador Estático, ou outro recipiente ou outro dispositivo adequado para o contato de gás-líquido. Em algumas modalidades, o biorreator pode compreender um primeiro reator de crescimento e um segundo reator de fermentação. Como tal, quando se refere à adição do substrato no biorreator ou à reação de fermentação, deve ser entendido como incluindo a adição a um ou a ambos esses reatores, onde apropriado.
[0069] "Ácidos nucleicos exógenos" são ácidos nucleicos que se originam fora do micro-organismo ao qual eles são introduzidos. Os ácidos nucleicos exógenos podem ser derivados de qualquer fonte apropriada, incluindo, mas não se limitando, ao micro-organismo ao qual eles devem ser introduzidos, (por exemplo, em um micro-organismo de origem a partir do qual o micro-organismo recombinante é derivado), cepas ou espécies de micro-organismos que diferem do organismo ao qual eles são introduzidos, ou eles podem ser criados artificial ou recombinantemente. Em uma modalidade, os ácidos nucleicos exógenos representam sequências de ácido nucleico naturalmente já presentes dentro do micro-organismo ao qual eles devem ser introduzidos, e eles são introduzidos para aumentar a expressão ou superexpressar um gene específico (por exemplo, aumentado o número de cópias da sequência (por exemplo, um gene) ou introduzindo um promotor forte ou constitutivo para aumentar a expressão)). Em outra modalidade, os ácidos nucleicos exógenos representam sequências de ácido nucleico que não estão naturalmente presentes dentro do micro-organismo ao qual eles devem ser introduzidos e permitem a expressão de um produto que não está naturalmente presente dentro do micro-organismo ou maior expressão de um gene já presente no micro-organismo (por exemplo, no caso da introdução de um elemento regulador, tal como um promotor). O ácido nucleico exógeno pode ser adaptado para se integrar no genoma do micro-organismo ao qual ele deve ser introduzido ou deve permanecer em um estado extracromossômico.
[0070] "Exógenos" também podem ser usados para se referir às proteínas. Isto refere-se a uma proteína que não está presente no microorganismo de origem do qual deriva o micro-organismo recombinante.
[0071] O termo "endógenos" como usado aqui em relação a um micro-organismo e um ácido nucleico ou proteína recombinante refere-se a qualquer ácido nucleico ou proteína que está presente em um microorganismo de origem, do qual deriva o micro-organismo recombinante.
[0072] "Biodiesel" referido neste documento refere-se a um éster alquílico de ácidos graxos por exemplo, que compreende qualquer éster etílico de ácidos graxos (FAEE) e/ou éster butílico de ácido graxo (FABE). O biodiesel produzido pode ser uma mistura de ésteres alquílicos de ácidos graxos.
[0073] A "via de biossíntese de biodiesel" referida neste documento refere-se à via dos acil graxos CoA para biodiesel. Enzimas exemplares nesta via incluem mas não estão limitadas a acil transferase [EC:2.3.-.-] e acil-CoA sintetase/ácidos graxos de cadeia longa--CoA ligase [EC:6.2.3.1].
[0074] A "via de biossíntese de ácido graxo" refere-se à via de acetil- CoA para a produção de um acil CoA graxo. Enzimas exemplares nesta via incluem mas não estão limitadas a acetil-CoA carbóxilase/biotina carbóxilase [EC:6.3.4.14/EC:6.4.1.2/EC:6.4.1.3], maloniltransferase/malonate decarbóxilase [EC:2.3.1.39], sintetase de ácidos graxos [EC:2.3.1.85/EC:2.3.1.86/EC:2.3.1.-], 3-oxoacil-[proteína transportadora de acil] sintase [EC:2.3.1.41/EC:2.3.1.179/EC:2.3.1.180], 3-oxoacil-[proteína transportadora de acil] reductase [EC:1.1.1.100], 3-hidroximiristoil ACP dehidrase [EC:4.2.1.-], 3-hidroxidecanoil-[proteína transportadora de acil] dehidratase [EC:4.2.1.60], enoil-[proteína transportadora de acil] reductase [EC:1.3.1.9, EC:1.3.1.-, EC:1.3.1.-], acil graxo -ACP tioesterase [EC:3.1.2.- 3.1.2.14], oleoil-[proteína transportadora de acil] hidrolase [EC:3.1.2.14], acil-[proteína transportadora de acil] desaturase [EC:1.14.19.2], acetil-CoA aciltransferase [EC:2.3.1.16], 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenase [EC:1.1.1.35], enoil-CoA hidratase / de cadeia longa 3-hidroxiacil-CoA dehidrogenase [EC:1.1.1.211, EC:4.2.1.17], enoil-CoA hidratase [EC:4.2.1.17], trans-2- enoil-CoA reductase [EC:1.3.1.38], palmitoil-protein tioesterase [EC:3.1.2.22], proteína de alongamento do ácido graxo [EC:2.3.1.-], 3- ketoacil-CoA sintase [EC:2.3.1.-], beta-keto reductase [EC:1.1.1.-], 3-hidroxi acil-CoA dehidratase [EC:4.2.1.-], enoil reductase [EC:1.3.1.-], palmitoil- CoA hidrolase [EC:3.1.2.2].
[0075] Deve ser contemplado que a invenção pode ser praticada usando ácidos nucleicos cuja sequência varia a partir das sequências especificamente exemplificadas neste documento, desde que eles realizem substancialmente a mesma função. Para as sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína ou peptídeo, isto significa que a proteína ou peptídeo codificado tem substancialmente a mesma função. Para as sequências de ácido nucleico que representam sequências de promotor, a sequência variante terá a capacidade de promover a expressão de um ou mais genes. Esses ácidos nucleicos podem ser referidos neste documento como "variantes funcionalmente equivalentes". À título de exemplo, as variantes funcionalmente equivalentes de um ácido nucleico incluem variantes alélicas, fragmentos de um gene, genes que incluem mutações (deleção, inserção, substituições nucleotídicas e similares) e/ou polimorfismos e similares. Genes homólogos de outros micro-organismos também podem ser considerados como exemplos de variantes funcionalmente equivalentes das sequências especificamente exemplificadas neste documento. Estes incluem genes homólogos em espécies como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, c. ljungdahlii, Acinetobacter baylyi cujos detalhes estão publicamente disponíveis em sites como Genbank ou NCBI. A frase "variantes funcionalmente equivalentes" também devem ser tomadas como incluindo ácidos nucleicos cuja sequência varia como um resultado da otimização de códon para um organismo específico. "Variantes funcionalmente equivalentes" de um ácido nucleico neste documento terão preferencialmente pelo menos aproximadamente 70%, preferencialmente aproximadamente 80%, mais preferencialmente aproximadamente 85%, preferencialmente aproximadamente 90%, preferencialmente aproximadamente 95% ou maior identidade de sequência de ácido nucleico com o ácido nucleico identificado.
[0076] Também deve ser contemplado que a invenção pode ser praticada usando polipeptídeos cuja sequência varia a partir das sequências de aminoácidos especificamente exemplificadas neste documento. Essas variantes podem ser referidas neste documento como "variantes funcionalmente equivalentes". Uma variante funcionalmente equivalente de uma proteína ou um peptídeo inclui aquelas proteínas ou peptídeos que compartilham pelo menos 40%, preferencialmente 50%, preferencialmente 60%, preferencialmente 70%, preferencialmente 75%, preferencialmente 80%, preferencialmente 85%, preferencialmente 90%, preferencialmente 95% ou maior identidade de aminoácidos com a proteína ou peptídeo identificado e tem substancialmente a mesma função que o peptídeo ou proteína de interesse. Essas variantes incluem, dentro de seu escopo, fragmentos de uma proteína ou peptídeo, em que o fragmento compreende uma forma truncada do polipeptídeo em que as deleções podem ser de 1 a 5, a 10, a 15, a 20, a 25 aminoácidos, e podem se estender do resíduo 1 ao 25 em cada terminal do polipeptídeo, e em que as deleções podem ser de qualquer comprimento dentro da região; ou podem estar em uma localização interna. As variantes funcionalmente equivalentes dos polipeptídeos específicos neste documento também devem ser tomadas como incluindo polipeptídeos expressos por genes homólogos em outras espécies de bactérias, por exemplo, conforme exemplificado no parágrafo anterior.
[0077] "Substancialmente a mesma função" neste documento destina- se a dizer que o ácido nucleico ou polipeptídeo é capaz de realizar a função do ácido nucleico ou do polipeptídeo do qual é uma variante. Por exemplo, uma variante de uma enzima da invenção será capaz de catalisar a mesma reação que essa enzima. No entanto, não deve ser considerado como significando que a variante tem o mesmo nível de atividade que o polipeptídeo ou ácido nucleico do qual é uma variante.
[0078] Um pode avaliar se uma variante funcionalmente equivalente substancialmente tem a mesma função que o ácido nucleico ou polipeptídeo que é uma variante usando métodos conhecidos para aquele versado na técnica. No entanto, a título de exemplo, ensaios para testar a atividade de aciltransferase são descritos em Kalscheuer et al., 2004, Appl Environ. Microbiol., 70: 7119-25; Stoveken et al., 2005, J. Bacteriol., 187: 1369-76.
[0079] "Excesso express", "super expressão" e termos e frases similares quando usado em relação à invenção devem ser considerados amplamente para incluir qualquer aumento na expressão de uma ou mais proteínas (incluindo a expressão de um ou mais ácidos nucleicos com a mesma codificação) em comparação com o nível de expressão da proteína (incluindo ácidos nucleicos) de um microrganismo de origem nas mesmas condições. Não deve ser considerado como significando que a proteína (ou ácido nucleico) é expresso em qualquer nível específico.
[0080] Um "micro-organismo de origem " é um micro-organismo usado para gerar um micro-organismo recombinante da invenção. O microorganismo de origem pode ser aquele que ocorre na natureza (ou seja, um micro-organismo de tipo selvagem) ou aquele que foi modificado anteriormente, mas que não expressa ou superexpressa uma ou mais das enzimas que são objeto da presente invenção. Desta forma, os microrganismos recombinantes da invenção podem ter sido modificados para expressar ou superexpressar uma ou mais enzimas que não foram expressas ou superexpressas no micro-organismo de origem.
[0081] Os termos "construtos" ou "vetores" do ácido nucleico e termos similares devem ser considerados amplamente para incluir quaisquer ácidos nucleicos (incluindo DNA e RNA) adequados para uso como um veículo para transferir material genético em uma célula. Os termos devem ser considerados incluindo plasmídeos, vírus (incluindo o bacteriófago), cosmídeos e cromossomos artificiais. Os construtos ou vetores podem incluir um ou mais elementos reguladores, uma origem de replicação, um sítio de multiclonagem e/ou um marcador selecionável. Em uma modalidade particular, os construtos ou vetores são adaptados para permitir a expressão de um ou mais genes codificados pelo construto ou vetor. Os construtos ou vetores de ácido nucleico incluem ácidos nucleicos nús, bem como ácidos nucleicos formulados com um ou mais agentes para facilitar a entrega de uma célula (por exemplo, lipossoma-conjugados do ácido nucleico, um organismo no qual está contido o ácido nucleico).
[0082] Os inventores surpreendentemente têm mostrado que um micro-organismo recombinante pode ser projetado para produzir um biodiesel a partir de um substrato contendo CO. Os inventores têm projetado organismos recombinantes e inventado respectivos métodos de utilização para a produção de biodiesel de derivados de ácido graxo. Os inventores também contemplam que outros derivados de ácidos graxos, incluindo ácidos graxos livres, alcanos e alquenos podem ser produzidos como parte da invenção. Todos estes produtos podem ser derivados intermediários principais de ácidos graxos, acil-CoA de ácido graxo (tioésteres com CoA) ou ácido graxo ACPs (proteínas transportadora de acila).
[0083] O biodiesel produzido pela invenção é um composto energético com cadeia longa, e sua síntese precisa que a célula invista energia na forma de nucleosídeo trifosfatos como o ATP. Em um processo aeróbio e/ou usando o açúcar como substrato requer energia suficiente para ser fornecido da glicólise para produzir várias moléculas de ATP. A produção de biodiesel através da via de biossíntese de ácido graxo em um processo aeróbio e/ou usando o açúcar como substrato procede de uma maneira relativamente simples devido à pentose C5 e C6 moléculas de hexose que são convertidas em mais ácidos graxos de cadeia impulsionados pela alta disponibilidade de ATP, embora um grande número de reações é necessário. A presente invenção pode ter vantagens sobre a produção de biocombustíveis a partir de substratos à base de açúcar e fornece um meio alternativo para a produção de biodiesel utilizando gases residuais incluindo monóxido de carbono de processos industriais.
[0084] Para acetogênicos anaeróbicos, utilizando um substrato C1 como CO ou CO2, é mais difícil de construir moléculas longas como ácidos graxos como ao contrário na glicólise, nenhuma energia líquida é obtida a partir da fosforilação do substrato-nível do carbono fixando a via de Wood- Ljungdahl aliás ativação de CO2 para formiato ainda requer uma molécula de ATP e um gradiente de membrana é necessário. Até o presente o produto com mais átomos de carbono relatados em acetogens (organismos nativos e recombinantes) são compostos de C4, butanol e 2,3-butanodiol.
[0085] Os inventores têm mostrado que é possível produzir estas moléculas de ácido graxo de cadeia mais como biodiesel usando a matéria- prima C1 CO através do intermediário de acetil-CoA . Como o substrato CO ou CO2 está na via Wood-Ljungdahl diretamente canalizada em acetil-CoA (o ponto de partida da biossíntese de ácidos graxos), menos reações e enzimas são necessários a partir de açúcar via glicólise, tornando o processo mais rápido e eficiente, apesar de menos ATP está disponível. Embora menos ATP esteja disponível em acetogênicos carboxidotríficos, os inventores consideram que esta via mais direta pode sustentar um fluxo metabólico mais elevado (devido à maior força de química motivo de reações intermediárias).
[0086] Em uma determinada modalidade da invenção, os inventores descobriram que a produção de biodiesel (um éster de ácido graxo de alquila) por um micro-organismo recombinante da invenção é habilitada pela introdução de micro-organismos de uma transferase de acila exógena. Os métodos tradicionais de produção de biodiesel envolvem a transesterificação de um lipídico (triglicéridos) na presença de álcool para produzir glicerina e biodiesel. No entanto, a presente invenção fornece um micro-organismo recombinante que é capaz de co-produzir álcool (incluindo etanol e/ou butanol), bem como ácidos graxos. Os inventores acreditam que esta co- produção fornece os substratos necessários para proporcionar uma força de condução para a produção em vivo de biodiesel, compreendendo FAEE (ésteres de ácidos graxos) e/ou FABE (ésteres de ácidos graxos butílico).
[0087] para obter uma modalidade da invenção, uma aciltransferase inespecífica (cera éster sintase/acil Coenzima A:diacylglycerol aciltransferase) de Acinetobacter baylyi foi introduzida para o microorganismo acetogênico. O micro-organismo produz um álcool (por exemplo o etanol ou álcool butílico) e um acil-CoA graxo que é convertido em um éster alquílico de ácidos graxos (ou seja, biodiesel) (Fig. 1) (Kalscheuer et al., 2004, Appl Environ. Microbiol., 70: 7119-25; Stoveken et al., 2005, J. Bacteriol., 187: 1369-76). Ácido graxo de acil-CoAs são um produto direto de ácidos graxos e são produzidos pela ação de por exemplo acil-CoA sintetase (ácidos graxos de cadeia longa- CoA ligase) que pode estar presente em acetogênicos carboxidotríficos. Produção in vivo de FAEE usando esta enzima não foi mostrada exceto com suplementação de ácidos graxos ou álcool a ser fornecida a reação externamente (Kalscheuer et al, 2006, Microbiology, 152, 2529-36). Enquanto todos os organismos produzem ácidos graxos precursores, para os organismos que não produzem (quantidades elevadas de) álcoois como E. coli, modificações genéticas adicionais tornam-se necessárias. Produção bacteriana de FABE não foi demonstrada anteriormente em tudo. A presente invenção não exige tal fornecimento externo de álcool, portanto, pode fornecer um número de vantagens. Incluído nestas vantagens é a redução do custo da matéria-prima, uma redução significativa na complexidade do equipamento e parâmetro de controle e etapas de manipulação e separação limitadas exigidas pelo processo.
[0088] Embora os inventores tenham demonstrado a eficácia da invenção em Clostridium autoethanogenum, eles contemplam que a invenção é aplicável ao grupo mais amplo de micro-organismos acetogênicos carboxidotróficos e discutido posteriormente neste documento.
[0089] Conforme discutido anteriormente, a invenção fornece um micro-organismo recombinante capaz de produzir biodiesel e, opcionalmente, um ou mais outros produtos por fermentação de um substrato compreendendo CO.
[0090] Em uma modalidade particular, o micro-organismo é adaptado para expressar uma ou mais enzimas exógenas na via de biossíntese de biodiesel. em uma outra modalidade, o micro-organismo é adaptado para superexpressar uma ou mais enzimas endógenas na via de biossíntese de biodiesel.
[0091] Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante é adaptado para produzir uma quantidade maior de biodiesel do que seria produzida por um micro-organismo de origem, do qual deriva o microorganismo recombinante.
[0092] Em uma modalidade, o micro-organismo de origem do qual o micro-organismo recombinante é derivado, é capaz de fermentar um substrato composto por CO, para produzir um álcool, mas não de converter o álcool em biodiesel e o micro-organismo recombinante é adaptado para expressar uma ou mais enzimas envolvidas na conversão de etanol para biodiesel.
[0093] Em uma modalidade, o micro-organismo recombinante de carboxidotrófico acetogênico é adaptado adicionalmente para expressar uma ou mais enzimas exógenas na via de biossíntese de ácido graxo. Em um outro aspecto, o micro-organismo é adicionalmente adaptado para superexpressar uma ou mais enzimas endógenas na via de biossíntese de ácido graxo.
[0094] O micro-organismo pode ser adaptado para expressar ou superexpressar as uma ou mais enzimas por qualquer número de métodos recombinantes incluindo, por exemplo, aumentando a expressão de genes endógenos (por exemplo, através da introdução de um promotor forte ou constitutivo para expressão de unidade de um gene), aumentando o número de cópia de um gene que codifica uma enzima especial introduzindo ácidos nucleicos exógenos codificando e adaptado para expressar a enzima, ou introduzindo um ácido nucleico exógeno codificando e adaptado para expressar uma enzima não naturalmente presente dentro do micro-organismo de origem.
[0095] Em determinadas modalidades, o micro-organismo de origem pode ser transformado oferecer uma combinação de) um aumento ou sobre- expressão de um ou mais genes endógenos e b) a introdução de um ou mais genes exógenos. Por exemplo, um ou mais genes que codificam uma ou mais enzimas no biodiesel e, opcionalmente, a via de biossíntese de ácido graxo podem ser nativos para o micro-organismo de origem, mas não pode incluir um ou mais outros genes que codificam uma ou mais outras enzimas na via.
[0096] Em uma modalidade, as uma ou mais enzimas na via de biossíntese de biodiesel são escolhidas entre o grupo consistindo de acil transferase e uma respectiva variante funcionalmente equivalente. A título de exemplo, apenas, informações de sequência para transferase de acila são fornecidas.
[0097] As enzimas e variantes funcionais de uso em microrganismos da invenção podem ser derivadas de qualquer fonte apropriada, incluindo diferentes gêneros e espécies de bactérias ou outros organismos. No entanto, em uma modalidade, a aciltransferase é derivada de Acinetobacter baylyi conforme descrito na SEQ ID NO: 1, ou uma respectiva variante funcionalmente equivalente. Em uma determinada modalidade, a acil transferase tem as características de identificação de aciltransferase inespecífica YP_045555.1; ID do gene: 2879218 de Acinetobacter baylyi. Um acil-CoA sintetase/ácidos graxos de cadeia longa-CoA ligase por exemplo é dado sob os números de adesão P69451 ou ID do Gene:946327.
[0098] Em uma modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos adaptados para aumentar a expressão de um ou mais ácidos nucleicos nativos para o micro-organismo de origem e os quais um ou mais ácidos nucleicos endógenos codificam uma ou mais das enzimas referidas neste documento antes. Em uma modalidade, o um ou mais ácidos nucleicos exógenos adaptados para aumentar a expressão é um elemento regulador. Em uma modalidade, o elemento regulador é um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor constitutivo de preferência é altamente ativo em condições adequadas de fermentação. Promotores induzíveis também poderiam ser usados. Em uma modalidade preferencial, o promotor é selecionado a partir do grupo constituído por agrupamento do gene Wood-Ljungdahl, promotor de piruvato: ferredoxina oxidoredutase, um promotor de operon Rnf complexo, um promotor de operon do ATP sintetase e promotores de operon Fosfotransacetilase/acetato quinase. Será apreciado por aqueles versados na técnica que outros promotores que podem direcionar a expressão, de preferência um alto nível de expressão sob condições apropriadas de fermentação, seriam eficazes como alternativas para as modalidades exemplificadas.
[0099] Em uma modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando e adaptados para expressar uma ou mais das enzimas referidas neste documento antes. Em uma modalidade, os micro-organismos compreendem um ou mais ácido nucleico exógeno codificando e adaptado para expressar pelo menos duas enzimas. Em uma outra modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando e adaptados para expressar três das enzimas. Em uma outra modalidade, o micro-organismo é composto por um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando e adaptados para expressar cinco das enzimas.
[00100] Em uma determinada modalidade, o micro-organismo compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos codificando uma acil transferase ou uma variante funcionalmente equivalente respectivas.
[00101] Em uma modalidade, a acil transferase é codificada pela sequência de ácido nucleico exemplificada na SEQ ID NO: 1, ou uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[00102] O micro-organismo pode incluir um ou mais ácidos nucleicos exógenos. Onde é desejável transformar o micro-organismo de origem com dois ou mais elementos genéticos (tais como genes ou elementos reguladores (por exemplo, um promotor)) eles podem estar contidos em um ou mais ácidos nucleicos exógenos.
[00103] Em uma modalidade, o um ou mais ácidos nucleicos exógenos é um construto ou vetor de ácido nucleico, em uma modalidade particular é um plasmídeo que codifica uma ou mais das enzimas referidas neste documento anteriormente em qualquer combinação.
[00104] Os ácidos nucleicos exógenos podem permanecer extra cromossômicos mediante a transformação dos micro-organismos de origem ou podem integrar o genoma dos micro-organismos de origem. Desta forma, podem incluir sequências de nucleotídeos adicionais adaptadas para auxiliar a integração (por exemplo, uma região que permite a recombinação homóloga e alvo de integração no genoma do hospedeiro) ou a expressão e a replicação de um construto extracromossômica (por exemplo, a origem de replicação, promotor e outros elementos reguladores ou sequências).
[00105] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos exógenos que codificam uma ou mais das enzimas como mencionado neste documento antes, compostos por um promotor adaptado para promover a expressão de uma ou mais enzimas codificadas pelos ácidos nucleicos exógenos. Em uma modalidade, o promotor é um promotor constitutivo de preferência é altamente ativo em condições adequadas de fermentação. Promotores induzíveis também poderiam ser usados. Em uma modalidade preferencial, o promotor é selecionado a partir do grupo constituído por agrupamento do gene Wood-Ljungdahl, um promotor de piruvato: ferredoxina oxidoredutase, um promotor de operon Rnf complexo, um promotor de operon do ATP sintetase e promotores de operon Fosfotransacetilase/acetato quinase. Será apreciado por aqueles versados na técnica que outros promotores que podem direcionar a expressão, de preferência um alto nível de expressão sob condições apropriadas de fermentação, seriam eficazes como alternativas para as modalidades exemplificadas.
[00106] Em uma modalidade, o ácido nucleico exógeno é um plasmídeo de expressão.
[00107] Em uma modalidade particular, o micro-organismo de origem é selecionado do grupo de bactérias acetogênicas carboxidotróficas compreendendo Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Butyribacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii, e Thermoanaerobacter kiuvi.
[00108] Em uma modalidade particular do primeiros ou segundo aspecto, o micro-organismo de origem é selecionado a partir do grupo de Clostridia carbóxidotrophic compreendendo Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum.
[00109] Em uma modalidade, o micro-organismo é selecionado de um agrupamento de Clostridia carbóxidotrophic que compreende a espécie C. autoethanogenum, C. ljungdahlii, e "C. ragsdalei" e isolados relacionados. Estes incluem mas não estão limitados às cepas C. autoethanogenum JAI-1T (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), C. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), C. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), C. ljungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC 55383) (Tanner, Miller, & Yang, 1993), C. ljungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (Patente US 5.593.886), C. ljungdahlii C-01 (ATCC 55988) (Patente US 6.368.819), C. ljungdahlii O-52 (ATCC 55989) (Patente US 6.368.819), or “C. ragsdalei P11T“ (ATCC BAA-622) (WO 2008/028055), e isolatos relacionados tais como “C. coskatii” (Patente US 2011/0229947), “Clostridium sp. MT351” (Michael Tyurin & Kiriukhin, 2012) e respectivas cepas mutantes tais como C. ljungdahlii OTA-1 (Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. Tese de doutorado, North Carolina State University, 2010).
[00110] Estas cepas formam um subagrupamento dentro do agrupamento rRNA Clostridial I(Collins et al., 1994), tendo pelo menos 99% de nível de identidade do gene 16S rRNA, embora sendo espécies distintas, conforme determinado pela reassociação de experimentos de DNA-DNA e DNA impressão digital (WO 2008/028055, Patente US 2011/0229947).
[00111] As cepas de agrupamento são definidas por características comuns, tendo tanto um semelhante genótipo e fenótipo e todos eles compartilham o mesmo modo de conservação de energia e metabolismo fermentativa. As cepas de aglomerado faltam citocromos e conservar energia através de um complexo de Rnf.
[00112] Todas as cepas deste agrupamento têm um tamanho de genoma de em torno de 4,2 MBp (Kopke et al, 2010) e uma composição de GC de cerca de 32% mol (Abrini et al., 1994; Kopke et al, 2010; Tanner et al, 1993) (WO 2008/028055; Patente US 2011/0229947) e operons de gene chave essencial conservados codificando as enzimas da via de Wood- Ljungdahl (desidrogenase de monóxido de carbono, formil tetrahidrofolato sintetase, metileno-tetrahidrofolato desidrogenase, cyclohydrolase formil tetrahidrofolato, metileno-tetrahidrofolato redutase e monóxido de carbono desidrogenase/Acetyl-CoA sintase), de hidrogenase desidrogenase formiato, Rnf complexo (rnfCDGEAB), oxidorredutase piruvato: ferredoxina, aldeído: ferredoxina oxiredutase (Kopke et al, 2010, 2011). A organização e o número de genes da via Wood-Ljungdahl, responsáveis pela absorção de gás, apresentou-se como sendo o mesmo em todas as espécies, apesar das diferenças de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos (Kopke et al., 2011).
[00113] Todas as cepas têm uma morfologia semelhante e tamanho (células de crescimento logarítmicas são entre 0.5-0.7 x 3x5 μm), são mesófilas (temperatura ótima de crescimento entre 30 e 37 ° C) e estritamente anaeróbico (Abrini et al., 1994; Tanner et al, 1993)(WO 2008/028055). Além disso, todos eles compartilham os mesmos traços filogenéticos principais, como a mesma faixa de pH (pH 4-7.5, com um pH ideal inicial de 5,5-6), forte crescimento autotrófica em CO contendo gases com taxas de crescimento semelhantes e um perfil metabólico com etanol e ácido acético como produto final de fermentação principal, com pequenas quantidades de 2,3-butanodiol e ácido láctico formado sob determinadas condições (Abrini et al., 1994; Kopke et al, 2011; Tanner et al, 1993) no entanto, as espécies se diferenciar na utilização de substrato de vários açúcares (por exemplo, ramnose, arabinose), ácidos (por exemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (arginina, histidina) ou outros substratos (por exemplo, betaína, butanol). Algumas das espécies foram encontradas ser auxotróficas para certas vitaminas (por exemplo, tiamina, biotina), enquanto outros não foram. A redução de ácidos carboxílicos em seus álcoois correspondentes tem sido demonstrada em uma gama desses organismos (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012).
[00114] As características descritas, portanto, não são específicas para um organismo como C. autoethanogenum ou C. ljungdahlii, mas sim características gerais para Clostridium sintetizando etanol, carbóxidotrophic. Assim, a invenção pode ser antecipada para trabalhar através destas tensões, apesar de haver diferenças de desempenho.
[00115] Micro-organismos acetogênico carboxidotrófico recombinante da invenção podem ser preparados a partir de um micro-organismo acetogênico carboxidotrófico de origem e um ou mais exógenos ácidos nucleicos usando qualquer número de técnicas conhecidas na técnica para a produção de microrganismos recombinantes. A título de exemplo, apenas, transformação (incluindo transdução ou transfection) pode ser alcançada por eletroporação, eletrofusão, ultrasonication, transformação mediada por polietileno glicol, conjugação ou competência química e natural. Técnicas de transformação adequado são descritas por exemplo em Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T:Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labviary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
[00116] A eletroporação tem sido descrito por vários acetogênicos carboxidotríficos como C. ljungdahlii (Kopke et al., 2010; Leang, Ueki, Nevin, & Lovley, 2012) (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. autoethanogenum (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), Acetobacterium woodii (Stratz, Sauer, Kuhn, & Dürre, 1994) ou Moorella thermoacetica (Kita et al., 2012) e é um método padrão usado em muitos dentre Clostridia tais como C. acetobutylicum (Mermelstein, Welker, Bennett, & Papoutsakis, 1992), C. cellulolyticum (Jennert, Tardif, Young, & Young, 2000) ou C. thermocellum (MV Tyurin, Desai, & Lynd, 2004).
[00117] Eletrofusão foi descrita para Clostridium sp acetogenic. MT351 (Tyurin e Kiriukhin, 2012).
[00118] A indução profage foi descrita para acetogênica carboxidotrófica, assim como em caso de C. scatologenes c. (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 forGeneration of Mutants, Projeto de Mestrado na Western Kentucky University).
[00119] A conjugação tem sido descrita como método de escolha para Clostridium difficile acetogênico (Herbert, O'Keeffe, Purdy, Elmore, & Minton, 2003) e muitos outros Clostridia incluindo C. acetobuylicum (Williams, Young, Young, 1990 &).
[00120] Em uma modalidade, a cepa de origem usa CO como sua única fonte de carbono e energia.
[00121] Em uma modalidade, o micro-organismo de origem é Clostridium autoethanogenum ou Clostridium ljungdahlii. Em uma modalidade particular, o micro-organismo é Clostridium autoethanogenum DSM23693. Em outra modalidade particular, o micro-organismo é Clostridium ljungdahlii DSM13528 (ou ATCC55383).
[00122] A invenção também fornece um ou mais ácidos nucleicos ou construções de ácido nucleico de uso na geração de um micro-organismo recombinante da invenção.
[00123] Em uma modalidade, o ácido nucleico compreende sequências que codificam uma ou mais enzimas na via da biossíntese do biodiesel que quando expresso em um micro-organismo permitem que os micro-organismos produzam biodiesel por fermentação de um substrato composto por CO. Em uma modalidade particular, a invenção fornece um ácido nucleico codificando duas ou mais enzimas que quando expressas em um micro-organismo permite que os micro-organismos produzam biodiesel por fermentação de um substrato composto por CO. Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção codificam três destas enzimas, ou cinco destas enzimas.
[00124] Em uma modalidade particular, as enzimas são escolhidas entre o grupo consistindo de acil transferase e uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[00125] Sequências de aminoácidos exemplar e as sequências de ácido nucleico que codificam enzimas aqui descritas são fornecidas ou podem ser obtidas do GenBank como mencionado anteriormente. No entanto, pessoas versadas compreenderão as alternativa das sequências de ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou variantes funcionalmente equivalentes das mesmas, considerando as informações contidas aqui, no GenBank e em outros bancos de dados e o código genético.
[00126] Em uma modalidade, a acil transferase é codificada pela sequência de ácido nucleico exemplificada na SEQ ID NO: 1, ou uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[00127] Em uma modalidade, o ácido nucleico mais codifica uma ou mais enzimas exógenas na via de biossíntese de ácido graxo. Em um outro aspecto, o ácido nucleico codifica adicionalmente uma ou mais enzimas endógenas na via de biossíntese de ácido graxo.
[00128] Em uma modalidade, os ácidos nucleicos da invenção compreenderá ainda um promotor. Em uma modalidade, o promotor permite a expressão constitutiva dos genes sob seu controle. No entanto, os promotores induzíveis também podem ser utilizados. Pessoas versadas na técnica compreenderão os promotores de uso na invenção. De preferência, o promotor pode direcionar um alto nível de expressão sob condições adequadas de fermentação. Em uma modalidade particular um promotor de agrupamento Wood-Ljungdahl é usado. Em outra modalidade, um promotor da fosfotransacetilase/acetate quinase é usado. Em outra modalidade um promotor piruvato: ferredoxina oxidoredutase, um promotor de operon Rnf complexo e um promotor de operon do ATP sintase. Em uma modalidade particular, o promotor é de C. autoethanogenum.
[00129] Os ácidos nucleicos da invenção podem permanecer extra cromossômicos mediante a transformação dos micro-organismos de origem ou podem ser adaptados para integrar o genoma dos micro-organismos. Desta forma, ácidos nucleicos da invenção podem incluir sequências de nucleotídeos adicionais adaptadas para auxiliar a integração (por exemplo, uma região que permite a recombinação homóloga e integração direcionada no genoma do hospedeiro) ou a expressão e a replicação estável de um construto extracromossômico (por exemplo, a origem da replicação, promotor e outras sequências reguladoras).
[00130] Em uma modalidade, o ácido nucleico é o construto ou vetor de ácido nucleico. Em uma determinada modalidade, o construto ou vetor de ácidos nucleicos é um construto de expressão ou vetor, no entanto outros construtos e vetores, tais como aqueles usados para a clonagem são englobados pela invenção. Em uma modalidade particular, o construto ou vetor de expressão é um plasmídeo.
[00131] Será apreciado que um construto/vetor de expressão da presente invenção pode conter qualquer número de elementos reguladores além do promotor, bem como os genes adicionais adequados para expressão de proteínas ainda mais, se desejado. Em uma modalidade o construto/vetor de expressão inclui um promotor. Em outra modalidade, o construto/vetor de expressão inclui dois ou mais promotores. Em uma determinada modalidade, o construto/vetor de expressão inclui um promotor para cada gene a ser expresso. Em uma modalidade, o construto/vetor de expressão inclui um ou mais sítios de ligação ribosomal, de preferência um sítio de ligação ribosomal para cada gene a ser expresso.
[00132] Será apreciado por aqueles versados na técnica que as sequências de ácidos nucleicos e sequências de construto/vetor aqui descritas podem conter nucleotídeos de ligação padrão tais como aqueles necessários para sítios de ligação ribossomal e/ou sítios de restrição. Tais sequências de ligação não devem ser interpretadas como sendo obrigatórias e não fornecem uma limitação sobre as sequências definidas.
[00133] Os ácidos nucleicos e construtos de ácido nucleico, incluindo construtos/vetores da expressão da invenção podem ser construídos usando qualquer número de técnicas padrão da técnica. Por exemplo, síntese química ou técnicas de recombinação podem ser usadas. Essas técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Mais técnicas exemplares são descritas na seção Exemplos neste documento posteriormente. Essencialmente, os genes individuais e dos elementos reguladores serão operavelmente ligados um ao outro de forma que os genes podem ser expressos para formar as proteínas desejadas. Vetores apropriados para uso na invenção serão apreciados por aqueles comummente versados na técnica. No entanto, a título de exemplo, os seguintes vetores podem ser adequados: vetores pMTL80000, pIMP1, pJIR750 e os plasmídeos exemplificados na seção de exemplos nneste documento posteriormente.
[00134] Deve ser apreciado que os ácidos nucleicos da invenção pode ser de qualquer forma adequada, incluindo DNA, RNA ou cDNA.
[00135] A invenção fornece também organismos hospedeiros, particularmente microrganismos, e incluindo vírus, bactérias e levedura, constituído por uma ou mais dos ácidos nucleicos aqui descritos.
[00136] Os um ou mais ácidos nucleicos exógenos podem ser entregues a um micro-organismo de origem como ácidos nucleicos nus ou podem ser formulados com um ou mais agentes para facilitar o processo de transformação (por exemplo, lipossoma-conjugados do ácido nucleico, um organismo no qual está contido o ácido nucleico). Um ou mais ácidos nucleicos pode ser o DNA, RNA, ou combinações destes, como é apropriado. Inibidores de restrição podem ser utilizados em determinadas modalidades; ver, por exemplo, Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412.)
[00137] Os micro-organismos da invenção podem ser preparados a partir de um micro-organismo de origem e um ou mais ácidos nucleicos usando qualquer número de técnicas conhecidas na técnica para a produção de microrganismos recombinantes. A título de exemplo, apenas, transformação (incluindo transdução ou transfection) pode ser alcançada por eletroporação, utrasonicação, transformação mediada por polietileno glicol, competência química ou natural, transformação por protoplasma, indução de rpofage ou conjugação. Técnicas de transformação adequadas são descritas por exemplo em Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
[00138] A eletroporação tem sido descrita por vários acetogênicas carboxidotróficas como C. ljungdahlii (Kopke et al. 2010, Poc. Nat. Acad. Sci. EUA 107: 13087-92; PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), C. autoethanogenum (PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), ou Acetobacterium woodii (Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37) e é um método padrão usado em muitos Clostridia como C. acetobutylicum (Mermelstein et al., 1992, biotecnologia, 10, 190-195), C. cellulolyticum (Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080) ou C. thermocellum (Tyurin et al., 2004, Appl Environ. Microbiol. 70: 883-890). Indução de profage foi demonstrada por acetogênica carboxidotrófica, bem como no caso de C. scatologenes (Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 to Generation of Mutants, Projeto de Mestrado na Western Kentucky University), enquanto a conjugação tem sido descrita como método de escolha para muitos Clostridia incluindo Clostridium difficile (Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110) ou C. acetobuylicum (Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826) e poderia ser usado em uma forma similar para acetogênicos carboxidotróficas.
[00139] Em determinadas modalidades, devido os sistemas de restrição que são ativos no micro-organismo a ser transformado, é necessário misturamos o ácido nucleico a ser introduzido o micro-organismo. Isso pode ser feito usando uma variedade de técnicas, incluindo as descritas abaixo e ainda mais exemplificado na seção de Exemplos neste documento posteriormente.
[00140] A título de exemplo, em uma modalidade, um microorganismo recombinante da invenção é produzido por um método compreende as seguintes etapas: introdução um micro-organismo de transporte de (i) de um construto/vetor da expressão conforme descrito neste documento e (ii) um construto/vector de metilação compreendendo um gene metiltransferase; expressão do gene metiltransferase; isolamento de um ou mais construtos/vetores do microorganismos de transporte; e, introdução de um ou mais construto/vetor de um microorganismo de destino.
[00141] Em uma modalidade, o gene metiltransferase é expresso constitutivamente. Em uma outra modalidade, a expressão do gene metiltransferase é induzida.
[00142] O micro-organismo de transporte é um micro-organismo, de preferência um micro-organismo com restrição negativa, que facilita a metilação das sequências de ácidos nucleicos que compõem o construto/vetor de expressão. Em uma determinada modalidade, o micro-organismo de transporte é um E. coli, Bacillus subtillis ou Lactococcus lactis com restrição negativa.
[00143] O construto/vetor de metilação é composto por uma sequência de ácido nucleico que codifica uma metiltransferase.
[00144] Uma vez que o construto/vetor de expressão e o construto/vetor de metilação sejam introduzidos no micro-organismo de transporte, o gene metiltransferase presente no construto/vetor de metilação é induzido. A indução pode ser por qualquer sistema de promotor adequado, embora em uma modalidade particular da invenção, o construto/vetor de metilação é composto por um promotor lac induzivel e é induzida pela adição de lactose ou um análogo dos mesmos, mais de preferência isopropil-β-D- thio-galactoside (IPTG). Outros promotores adequados incluem a ara, tet ou sistema T7. Em uma modalidade adicional da invenção, o promotor de construto/vetor de metilação é um promotor constitutivo.
[00145] Em uma determinada modalidade, o construto/vector de metilação tem uma origem de replicação específica para a identidade dos micro-organismos de transporte de forma que qualquer gene presente no construto/vetor de metilação são expressos no micro-organismo de transporte. De preferência, o construto/vetor de expressão tem uma origem de replicação específica para a identidade dos micro-organismos de destino que qualquer gene presente no construto/vetor de expressão são expressos no microorganismo de destino.
[00146] A expressão da enzima metiltransferase resulta na metilação dos genes presentes no construto/vetor de expressão. O construto/vector de expressão pode então ser isolado do micro-organismo de transporte de acordo com qualquer um de uma série de métodos conhecidos. A título de exemplo, apenas, a metodologia descrita na seção Exemplos descrita a seguir pode ser utilizada para isolar o construto/vetor de expressão.
[00147] Em uma determinada modalidade, ambos construto/vetor são simultaneamente isolado.
[00148] O construto/vetor de expressão odem ser introduzidos os micro-organismos de destino usando qualquer número de métodos conhecidos. Entretanto, a título de exemplo, a metodologia descrita na seção Exemplos descrita a seguir pode ser utilizada. Uma vez que o construto/vetor de expressão é misturado, as sequências de ácido nucleico presentes no construto/vector de expressão são capazes de ser incorporados ao microorganismo de destino e expressos com sucesso.
[00149] Prevê-se que um gene metiltransferase pode ser introduzido em um micro-organismo de transporte e superexpresso. Assim, em uma modalidade, a enzima metiltransferase resultante pode ser recolhida usando métodos conhecidos e utilizadain vitro para metilar um plasmídeo de expressão. O construto/vetor de expressão pode então ser introduzido no micro-organismo de destino para a expressão. Em outra modalidade, o gene metiltransferase é introduzido o genoma dos micro-organismos de transporte seguido de introdução do construto/vetor de expressão para o microorganismo de transporte, isolamento de uma ou mais construções/vetores de micro-organismos de transporte e então a introdução da expressão construto/vetor para o micro-organismo de destino.
[00150] Prevê-se que o construto/vetor de expressão e o construto/vetor de metilação conforme definido acima podem ser combinados para fornecer uma composição da matéria. Esta uma composição tem particular utilidade em mecanismos de barreira de restrição para produzir os microrganismos recombinantes da invenção.
[00151] Em uma modalidade particular o construto/vetor de expressão e/ou o construto/vetor de metilação são plasmídeos.
[00152] As pessoas versadas na técnica apreciarão um número de metiltransferases adequadas para uso na produção dos micro-organismos da invenção. No entanto, a título de exemplo o Bacillus subtilis metiltransferase ΦT1 do fago e a metiltransferase descritos nos exemplos aqui depois pode ser utilizado. Em uma modalidade, a metiltransferase tem a sequência de aminoácidos do SEQ ID NO: 12 ou é uma respectiva variante funcionalmente equivalente. Ácidos nucleicos codificando a metiltransferases adequadas serão prontamente apreciados tendo em conta a sequência da metiltransferase desejada e o código genético. Em uma modalidade, o ácido nucleico codificando uma metiltransferase é conforme descrito nos Exemplos neste documento depois (por exemplo, o ácido nucleico do SEQ ID NO: 17 ou é uma respectiva variante funcionalmente equivalente.
[00153] Qualquer número de construtos/vetores adaptados para permitir a expressão de um gene metiltransferase pode ser usado para gerar o construto/vetor de metilação. Entretanto, a título de exemplo, o plasmídeo descrito na seção Exemplos a seguir pode ser utilizada. (por exemplo, SEQ ID NO: 14).
[00154] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um método para a produção de biodiesel e, opcionalmente, um ou mais dos produtos de fermentação microbiana, compreendendo uma fermentação de substrato composto por CO, usando um micro-organismo recombinante da invenção. Os métodos da invenção podem ser utilizados para reduzir as emissões de carbono atmosférico totais de um processo industrial.
[00155] De preferência, a fermentação compreende as etapas de fermentação anaeróbia de um substrato em um biorreator para produzir pelo menos biodiesel usando um micro-organismo recombinante da invenção.
[00156] Em uma modalidade o método compreende as etapas de: a. fornecer um substrato compreendendo CO para um biorreator contendo uma cultura de um ou mais micro-organismos da invenção; e b. fermentar anaerobicamente a cultura no biorreator para produção de biodiesel.
[00157] Em uma modalidade o método compreende as etapas de: a. capturar o gás contendo CO produzido como resultado de um processo industrial; b. fermentação anaeróbica do gás contendo CO para produzir biodiesel por uma cultura contendo um ou mais micro-organismos da invenção.
[00158] Em uma modalidade da invenção, o substrato gasoso fermentado pelos micro-organismos é um substrato gasoso contendo CO. O substrato gasoso pode ser um CO contendo gás residual obtido como um subproduto de um processo industrial, ou de outra fonte como de canos de descargas de automóvel. Em determinadas modalidades, o processo industrial é selecionado do grupo constituído por produtos de metal ferrosos, fabricação, tais como uma fábrica de aço, fabricação de produtos não-ferrosos, processos de refinação de petróleo, gaseificação de carvão, produção de energia elétrica, produção de negro de fumo, produção de amônia, produção de metanol e fabricação de coque. Nestas modalidades, o gás contendo CO pode ser capturado do processo industrial antes que ele seja emitido para a atmosfera, usando qualquer método conveniente. O CO pode ser um componente do gás de síntese (gás composto por monóxido de carbono e hidrogênio). O CO produzido a partir de processos industriais normalmente é queimado para produzir CO2 e, portanto, a invenção tem particular utilidade na redução de emissões dos gases CO2 de efeito estufa e produzir biodiesel para uso como biocombustível. Dependendo da composição do substrato gasoso contendo CO, também pode ser desejável tratá-lo para remover quaisquer impurezas indesejáveis, tais como partículas de poeira antes de introduzi-lo para a fermentação. Por exemplo, o substrato gasoso pode ser filtrado ou depurado usando métodos conhecidos.
[00159] Será apreciado que, para ocorrer o crescimento das bactérias e a produção de biodiesel, além do gás de substrato contendo CO, um meio nutriente líquido adequado precisará ser alimentado para o biorreator.
[00160] Em modalidades particulares de aspectos do método, a fermentação ocorre em meio de cultura aquoso. Em modalidades particulares dos aspectos do método, a fermentação do substrato ocorre em um biorreator.
[00161] O substrato e o meio podem ser alimentados para o biorreator em uma forma contínua, por lote ou por batelada alimentada. Um meio nutritivo irá conter as vitaminas e minerais suficientes para permitir o crescimento de microrganismo utilizado. O meio anaeróbico adequado para a fermentação usando CO é conhecidas na técnica. Por exemplo, os meios adequados são descritos em Biebel (2001). Em uma modalidade da invenção o meio é conforme descrito na seção de Exemplos aqui depois.
[00162] A fermentação desejavelmente deve ser realizada sob condições adequadas de fermentação para a produção de biodiesel para ocorrer. As condições de reação que devem ser consideradas incluem: pressão, temperatura, taxa de fluxo de gás, taxa de vazão de líquidos, pH de meio, potencial redox de meio, taxa de agitação (se estiver usando um reator de tanque de agitação contínua), nível de inóculo, concentrações de substrato gás máximo para assegurar que CO na fase líquida não se limitando e concentração máxima do produto para evitar a inibição do produto.
[00163] Além disso, é frequentemente desejável aumentar a concentração de CO de um fluxo de substrato (ou pressão parcial de CO em um substrato gasoso) e, assim, aumentar a eficiência das reações de fermentação onde CO é um substrato. Operando a pressões aumentadas permite um aumento significativo da taxa de transferência de CO da fase gasosa para a fase líquida, onde ele pode ser tomado até pelo microrganismo como uma fonte de carbono para a produção de fermentação. Isto significa que o tempo de retenção (definido como o volume de líquido em bioreator dividido pela taxa de fluxo de entrada de gás) pode ser reduzido quando biorreatores são mantidas em uma pressão elevada, ao invés de pressão atmosférica. As condições de reação ideal dependerá em parte o microrganismo específico da invenção usada. No entanto, em geral, é preferível que a fermentação seja realizada em uma pressão superior à pressão ambiente. Também, uma vez que uma determinada taxa de conversão COpara-biodiesel é em parte uma função do tempo de retenção de substrato e alcançando um tempo de retenção desejado por sua vez determina o volume necessário de um biorreator, a utilização de sistemas pressurizados pode reduzir significativamente o volume exigido do bioreator e consequentemente o custo capital do equipamento de fermentação. De acordo com exemplos fornecidos na Patente US N° 5.593.886, volume de reator pode ser reduzido na proporção linear a um aumento da pressão de operação de reator, ou seja, biorreatores operados a 10 atmosferas de pressão somente precisam de um décimo do volume daqueles operados em 1 atmosfera de pressão.
[00164] A título de exemplo, os benefícios da realização de uma fermentação de gás-para-etanol em pressões elevadas tem sido descrita. Por exemplo, WO 02/08438 descreve fermentações de gás-para-etanol realizadas sob pressões de 30 psig e 75 psig, dando produtividades de etanol de 150 g/l/dia e 369 g/l/dia respectivamente. No entanto, exemplo de fermentações executadas usando meio similar e composições de entrada de gás à pressão atmosférica foram encontradas para produzir entre 10 e 20 vezes menos etanol por litro por dia.
[00165] É também desejável que a taxa de introdução do substrato gasoso contendo CO é tal a fim de garantir que a concentração de CO na fase líquida não se torne limitante. Isso ocorre porque uma consequência das condições limitadas de CO pode ser que um ou mais produtos sejam consumidos pela cultura.
[00166] A composição dos fluxos de gás usada para alimentar uma reação de fermentação pode ter um impacto significativo sobre a eficiência e/ou custos dessa reação. Por exemplo, O2 pode reduzir a eficiência de um processo de fermentação anaeróbia. Processamento de gases indesejados ou desnecessários nas fases de um processo de fermentação, antes ou após a fermentação pode aumentar a carga sobre tais estágios (por exemplo, onde o fluxo de gás é comprimido antes de entrar em um biorreator, energia desnecessária pode ser usado para comprimir gases que não são necessários na fermentação). Por conseguinte, pode ser desejável para tratar fluxos de substrato, particularmente os fluxos de substrato provenientes de fontes industriais, remover componentes indesejados e aumentar a concentração de componentes desejáveis.
[00167] Em determinadas modalidades a cultura de uma bactéria da invenção é mantido em meio de cultura aquoso. De preferência o meio de cultura aquoso é um meio de crescimento microbiano anaeróbico mínimo. Suportes adequados são conhecidos na técnica e descritos por exemplo na Patente US N°s 5.173.429 e 5.593.886 e WO 02/08438 e conforme descrito na seção de exemplos neste documento posteriormente.
[00168] Biodiesel, ou um fluxo misto contendo biodiesel e/ou um ou mais outros produtos, podem ser recuperados do caldo de fermentação por métodos conhecidos na técnica, tais como destilação fracionada ou evaporação, pervaporação, gás de stripping e fermentação extrativa, incluindo por exemplo, extração líquido-líquido. Produtos podem também difundir ou secretar em meios a partir de dos quais eles podem ser extraídos por separação de fases.
[00169] Em certas modalidades preferidas da invenção, o biodiesel e um ou mais produtos são recuperados do caldo de fermentação continuamente retirar uma parte do caldo o biorreator, separando células microbianas de caldo (convenientemente por filtração), e recuperar um ou mais produtos de caldo. Álcoois podem convenientemente ser recuperados por exemplo por destilação. Acetona pode ser recuperada por exemplo por destilação. Quaisquer ácidos produzidos podem ser recuperados por exemplo por adsorção em carvão ativado. As células microbianas separadas são preferencialmente retornadas para o biorreator de fermentação. O permeato de célula livre restante após qualquer alcool(s) e acido(s) serem removidos também de preferência é retornado para o biorreator de fermentação. Nutrientes adicionais (tais como vitaminas do complexo B) podem ser adicionados ao permeato de célula livre para reabastecer o meio nutritivo antes de ele ser retornado para o biorreator.
[00170] Também, se o pH do caldo foi ajustado conforme descrito acima para aumentar a adsorção do ácido acético para o carvão ativado, o pH deve ser re-ajustado a um pH similar do caldo em biorreator a fermentação, antes de ser devolvido para o biorreator.
[00171] A invenção será agora descrita em maiores detalhes tendo como referência os seguintes Exemplos não limitantes.
[00172] Um Clostridium autoethanogenum acetogenic carbóxidotroph foi projetado com aciltransferase inespecífica de Acinetobacter baylyi para a produção de um éster acílico de ácido graxo de biodiesel, éster butílico de ácido butanóico (FABE). A produção de butanol foi demonstrada anteriormente usando uma cepa geneticamente modificada de Clostridium autoethanogenum (WO 2012/053905).
[00173] Todas as etapas de subclonagem foram realizadas em E. coli usando cepas e condições de crescimento padrão, conforme descrito anteriormente (Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989; Ausubel et al, Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons, Ltd., Hoboken, 1987).
[00174] C. autoethanogenum DSM10061 e DSM23693 (um derivado de DSM10061) foram obtidos de DSMZ (The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstraβe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemanha). O crescimento foi realizado a 37° C, utilizando técnicas e condições estritamente anaeróbias (Hungate, 1969, Methods in Microbiology, Vol. 3B. Academic Press, Nova Iorque: 117-132; Wolfe, 1971, Adv. Microb. Physiol., 6: 107-146). Os meios PETC quimicamente definidos sem extrato de levedura (Tab. 1) e 30 psi de monóxido de carbono contendo gás de resíduo de siderurgia (coletado em New Zealand Steel em Glenbrook, NZ; composição: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) como única fonte de carbono e energia foi usada. Tabela 1: meio PETC
[00175] O padrão de recombinação de DNA e técnicas de clonagem moleculares foram usadas nesta invenção e são descritas por Sambrook et al, 1989 e Ausubel et al, 1987. A aciltransferase inespecífica (YP_045555.1; ID do Gene: 2879218) de Acinetobacter baylyi foi otimizado por códon e sintetizado (SEQ ID NO: 1).
[00176] DNA genômico de Clostridum autoethanogenum DSM 10061 foi isolada usando um método modificado por Bertram e Dürre (1989). Uma cultura durante a noite de 100 ml foi colhida (6.000 x g, 15 min, 4 ° C), lavada com tampão de fosfato de potássio (10 mM, pH 7,5) e suspensa em 1,9 ml de tampão de STE (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 200 mM de sacarose; pH 8.0). 300 μl lisozima (~100.000 U) foram adicionados e a mistura foi incubada a 37 °C por 30 min, seguido por adição de 280 μl de uma solução de SDS 10% (p/v) e outra incubação durante 10 min. O RNA foi digerido em temperatura ambiente por adição de 240 μl de uma solução de EDTA (0.5 M, pH 8), 20 μl Tris-HCl (1 M,pH 7.5) e 10 μl de RNase A (Fermentas). Em seguida, foram adicionados 100 μl de Proteinase K (0,5 U) e proteólise ocorreu por 1-3 h a 37 ° C. Finalmente, foram adicionados 600 μl de perclorato de sódio (5 M), seguido por uma extração de fenol/clorofórmio e uma precipitação de isopropanol. A qualidade e quantidade de DNA foi inspecionada por espectrometria.
[00177] A região promotora de quinase phosphotransacetylase/acetato de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 4) foi amplificado por PCR de DNA genômico com oligonucleotídeos Ppta-ack-NotI-F (SEQ ID NO: 2: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) e Ppta-ack-NdeI-R (SEQ ID NO: 3: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC) e polimerase de alta fidelidade de DNA iProof (Bio-Rad Labratories) aplicando o programa a seguir: desnaturação inicial a 98 °C por 30 segundos, seguido por 35 ciclos de desnaturação (98 oC por 10 segundos), recozimento (55 oC por 30 segundos) e alongamento (72 oC por 30 segundos), antes de uma etapa da extensão final (72 oC por 10 minutos).
[00178] A região promotora de 498 bp amplificada do operon de quinase phosphotransacetylase/acetato (Ppta-ack) foi clonada no vetor E. coli- Clostridium de transporte pMTL 85241 (FJ797651.1; Nigel Minton, Universidade de Nottingham; Heap et al., 2009) usando sítios de restrição NotI e NdeI e cepa DH5α-T1R (Invitrogen). Posteriormente o gene aciltransferase sintetizado (SEQ ID NO: 1) foi clonado usando NdeI e EcoRI para formar o plasmídeo pMTL85245-atf (SEQ ID NO: 5; Fig. 2). A inserção foi completamente sequenciada usando oligonucleotídeos dados na Tabela 2 e os resultados confirmaram que o gene atf estava livre de mutações. Tabela 2: Oligonucleotídeos para sequenciamento
[00179] A metilação da expressão FAEE do plasmídeo pMTL85245- atf foi realizada in vivo no E. coli usando uma metiltransferase híbrida sintetizada tipo II (SEQ ID NO: 12) projetada a partir dos genes de metiltransferase C. autoethanogenum, C. ragsdalei e C. ljungdahlii. A metiltransferase é fundida a um promotor induzível lac (SEQ ID NO: 13) no vetor pGS20 (SEQ ID NO: 14).
[00180] Ambos plasmídeo de expressão e plasmídeo de metilação foram transformados nas mesmas células de restrição negativa E. coli XL1- Blue MRF' Kan (Stratagene), que é possível devido a suas origens Gram-(-) compatíveis de replicação (cópia alta de ColE1 em plasmídeo de expressão e cópia baixa p15A em plasmídeo de metilação). A metilação in vivo foi induzida pela adição de 1 mM IPTG e os plasmídeos metilados foram isolados usando QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN). A mistura resultante foi usada para experiências de transformação com C. autoethanogenum DSM23693, mas apenas o plasmídeo abundante (alta-cópia) de expressão tem uma origem de replicação de Gram-(+) (repL) que lhe permite replicar em Clostridia.
[00181] Durante a experiência de transformação completa, C. autoethanogenum DSM23693 foi cultivado em meios PETC (Tab. 1) suplementado com 1 g/L de extrato de levedura e 10 g/l de frutose, assim como 30 psi de gás residual de moinho de aço (coletado do local da New Zealand Steel na Glenbrook, NZ; composição: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) como fonte de carbono.
[00182] Para tornar as células competentes, uma cultura de 50 ml de C. autoethanogenum DSM23693 foi repicada para meio fresco durante 3 dias consecutivos. Estas células foram usadas para inocular o meio PETC de 50 ml contendo 40 milímetros DL-treonina em um OD600nm de 0,05. Quando a cultura atingiu um OD600nm de 0,4, as células foram transferidas para uma câmara anaeróbica e colhidas em 4.700 x g e 4 ° C. A cultura foi lavada duas vezes com tampão de eletroporação gelada (sacarose de 270 mM, 1 mM MgCl2, fosfato de sódio de 7 mM, pH 7,4) e finalmente suspenso em um volume de 600 μl de tampão de eletroporação fresco. Esta mistura foi transferida para uma cubeta de eletroporação pre-resfriada com uma lacuna de eletrodo de 0,4 cm contendo 1 μg da mistura do plasmídea metilados e imediatamente pulsado usando o sistema de eletroporação Gene pulser Xcell (Bio-Rad) com as seguintes configurações: 2.5 kV, 600 Q, e 25 μF. Constantes de tempo de 3.7-4.0 ms foram alcançados. A cultura foi transferida para a meio fresco de 5 ml. Regeneração das células foi monitorada no comprimento de onda de 600 nm, utilizando um Espectrofotômetro de Epsilon de Helios do Spectronic (Thermo) equipado com um suporte de tubo. Após uma queda inicial na biomassa, as células começaram a crescer novamente. Uma vez que a biomassa duplicou a partir desse ponto, as células foram colhidas, suspensas em 200 μl de meio fresco e colocadas na placas PETC seletivas (contendo 1,2% de Bacto™ Ágar (BD)) com 4 μg/ml de claritromicina. Depois de 4-5 dias de inoculação com 30 psi de gás de moinho de aço a 37 ° C, as colônias eram visíveis.
[00183] As colônias foram usadas para inocular um meio PETC de 2 ml contendo 4 μg/μl de claritromicina. Quando o crescimento ocorreu, a cultura foi escalonada em 5 ml e depois o meio PETC de 50 ml contendo 4 μg/ml claritromicina e 30 psi de gás de moinho de aço como fonte única de carbono.
[00184] Para verificar a transferência de DNA, realizou-se uma mini prep de plasmídeo em 10ml de volume de cultura de usando kit miniprep de plasmídeo Zyppy (Zymo). Uma vez que que a qualidade do plasmídeo isolado não era suficiente para um digestão de restrição devido à atividade do exonuclease Clostridial [Burchhardt e Dürre, 1990], um PCR foi realizada com o plasmídeo isolado e oligonucleotídeos fornecidos na Tabela 2 para confirmar a presença do plasmídeo. O PCR foi realizado usando iNtRON Maximise Premix PCR kit (Intron Bio tecnologias) com as seguintes condições: desnaturação inicial em 94 oC por 2 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação (94 oC durante 20 segundos), recozimento (55 oC durante 20 segundos) e alongamento (72 oC por 60 segundos), antes de uma etapa da extensão final (72 oC por 5 minutos).
[00185] Para confirmar a identidade dos clones, DNA genômico foi isolado (veja acima) das culturas de 50 ml de C. autoethanogenum DSM23693. Uma PCR foi realizada contra os 16s rRNA de gene usando oligonucleotídeos fD1 (SEQ ID NO: 15: ccgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) e rP2 (SEQ ID NO: 16: cccgggatccaagcttACGGCTACCTTGTTACGACTT) [Weisberg et al., 1991] e iNtRON Maximise Premix PCR kit (Intron Bio Technologies) com as seguintes condições: desnaturação inicial em 94 oC por 2 minutos, seguida por 35 ciclos de desnaturação (94 oC durante 20 segundos), recozimento (55 oC durante 20 segundos) e alongamento (72 oC por 60 segundos), antes de uma etapa da extensão final (72 oC por 5 minutos). Resultados do sequenciamento foram pelo menos 99,9% de identidade contra o 16s rRNA (rrsA) de gene de C. autoethanogenum (Y18178, GI:7271109).
[00186] Para demonstrar a produção de FAEE, meio PETC foi preparado e inoculado com cepa de C. autoethanogenum abrigando plasmídeo de expressão pMTL85245-atf. Frascos de soro com 50 mL de meio de PETC (tabela 1) foram pressurizados com 30 psi de um fluxo de gás contendo CO do gás residual de siderurgia (coletado do local da New Zealand Steel em Glenbrook, NZ; composição: 44% CO, 32% N2, 22% CO2, 2% H2) e cultivado por 5 dias. O mesmo experimento foi realizado também com o tipo selvagem da cepa de C. autoethanogenum sem plasmídeo.
[00187] As culturas foram analisadas por GC-MS usando amostragem headspace. amostra de 2 mL em frasco de 20 mL foram expostos por 10 min a 40° C, a uma fibra (Supelco PDMS 100 fibras) e em seguida analisados usar um Agilent 6890 GC com MSD 5973 equipado com um 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm coluna ZB-Wax às seguintes condições: Temperatura do injetor: 250 ° C; Injeção splitless; desorb durante 10 minutos a 250 ° C; constante fluxo de 1ml/min; Forno: 40° C segurar por 5 min, aumentar em 10° C/min a 190° C, aguarde 5 min, aumentar em 3°C/min para 208° C, aumentar em 10° C/min até 220° C, aguardar 10 min, voltar à 40°C até 60°C/min; MSD: Modo de varredura, intervalo de massa 38-650 AMU em 1,47 varreduras por segundo. Dois picos que corresponde à substância de biodiesel de éster butílico de ácido butanóico de acordo com o banco de dados padrão de referência do Instituto Nacional de Padrões e de Tecnologia (NIST) foram encontrados na cepa carregando o plasmídeo de expressão, mas não na cepa tipo selvagem sem plasmídeo, bem como alguns produtos de ácidos graxos no intervalo C14-C18 como 1-Octandecanol (C18) ou Tetradecanal (C14), Heptadecane (C17), 9-Octadecanal (C18) e 11-Hexadecanal (C16)(Tab. 3; Fig. 3). Álcoois como etanol e butanol foram detectados por HPLC executada usando um sistema de Agilent 1100 Series HPLC equipado com um RID operado a 35 °C (Detector de índice de refração) e uma coluna de Aminex HPX - 87H (300 x 7,8 mm, partícula tamanho 9 μm) mantida a 35 ° C. O RID foi operado a 35 ° C (Detector de índice de refração) e um orgânico da Alltech IOA-2000 coluna ácida (150 x 6.5 mm, partícula tamanho 8 μm) manteve a 60 ° C. Utilizou-se água ligeiramente acidificada (0,005 M H2SO4) como fase móvel com um caudal de 0,25 ml/min. Para remover as proteínas e outros resíduos de células, 400 amostras de μl foram misturadas com 100 μl de um ácido 5- sulfosalicílico de 2% (p/v) e centrifugadas a 14.000 x g, durante 3 min para separar resíduos precipitados. 10 μl do sobrenadante foram então injetado no HPLC para análises. Tabela 3: Resultados da análise de CG-MS da cepa de C. autoethanogenum abrigando o plasmídeo de expressão pMTL85245-atf:
[00188] A invenção foi descrita neste documento, com referência a determinadas modalidades preferenciais, a fim de permitir que o leitor pratique a invenção sem experimentação indevida. No entanto, uma pessoa ordinariamente versada na técnica irá prontamente reconhecer que muitos dos componentes e parâmetros podem ser variados ou modificados em certa medida ou substituídos por equivalentes conhecidos sem se afastar do escopo da invenção. Ele deve ser apreciado que tais modificações e equivalentes são incorporados neste documento conforme estabelecidos individualmente. Títulos, cabeçalhos ou similares são fornecidos para melhorar a compreensão do leitor deste documento e não deve ser lido de forma a limitar o escopo da presente invenção.
[00189] As divulgações inteiras de todos os pedidos, patentes e publicações, citados acima e abaixo, se houver, por este meio são incorporados por referência. No entanto, a referência a quaisquer pedidos, patentes e publicações nesta especificação não é e não deve ser considerado como uma confirmação ou qualquer forma de sugestão que constitua parte válida do estado da técnica ou forme parte do conhecimento geral comum em qualquer país do mundo.
[00190] Ao longo desta especificação e quaisquer reclamações que seguem, salvo indicação em contrário, as palavras "compreendem", "compreendendo" e similares, são para ser interpretado em um sentido inclusivo em oposição a um sentido exclusivo, quer dizer, no sentido de "incluindo, mas não limitado a." Referências Abrini, J., Naveau, H., & Nyns, E. J. (1994). Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of microbiology, 161(4), 345-351. Collins, M. D., Lawson, P. A., Willems, A., Cordoba, J. J., Fernandez-Garayzabal, J., Garcia, P., Cai, J., et al. (1994). The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. International journal of systematic bacteriology, 44(4), 812-26. Herbert, M., O’Keeffe, T. a., Purdy, D., Elmore, M., & Minton, N. P. (2003). Gene transfer into Clostridium difficile CD630 and characterisation of its methylase genes. FEMS Microbiology Letters, 229(1), 103-110. Jennert, K. C., Tardif, C., Young, D. I., & Young, M. (2000). Gene transfer to Clostridium cellulolyticum ATCC 35319. Microbiology (Reading, England), 146 Pt 12, 3071-80. Kita, A., Iwasaki, Y., Sakai, S., Okuto, S., Takaoka, K., Suzuki, T., Yano, S., et al. (2012). Development of genetic transformation and heterologous expression system in carbóxidotrophic thermophilic acetogen Moorella thermoacetica. Journal of Bioscience and Bioengineering, xx(xx). Kopke, M., Held, C., Hujer, S., Liesegang, H., Wiezer, A., Wollherr, A., Ehrenreich, A., et al. (2010). Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(29). Kopke, M., Mihalcea, C., Liew, F., Tizard, J. H., Ali, M. S., Conolly, J. J., Al-Sinawi, B., et al. (2011). 2,3-Butanediol Production By Acetogenic Bacteria, an Alternative Route To Chemical Synthesis, Using Industrial Waste Gas. Applied and environmental microbiology, 77(15), 5467-75. Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., & Lovley, D. R. (2012). A Genetic System for Clostridium ljungdahlii: A Chassis for Autotrophic Production of Biocommodities and a Model Homoacetogen. Applied and environmental microbiology, (November). Mermelstein, L. D., Welker, N. E., Bennett, G. N., & Papoutsakis, E. T. (1992). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Bio/technology (Nature Publishing Company), 10(2), 190-195. Perez, J. M., Richter, H., Loftus, S. E., & Angenent, L. T. (2012). Biocatalytic reduction of short-chain carbóxilic acids into their corresponding alcohols with syngas fermentation. Biotechnology and bioengineering, 1-30. Stratz, M., Sauer, U., Kuhn, a, & Dürre, P. (1994). Plasmid Transfer into the Homoacetogen Acetobacterium woodii by Electroporation and Conjugation. Applied and environmental microbiology, 60(3), 1033-7. Tanner, R. S., Miller, L. M., & Yang, D. (1993). Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. International journal of systematic bacteriology, 43(2), 232. Tyurin, Michael, & Kiriukhin, M. (2012). Electrofusion of cells of Acetogen Clostridium sp. MT 351 with erm (B) or cat in the chromosome. Journal of Biotech, 1-12. Tyurin, MV, Desai, S., & Lynd, L. (2004). Electrotransformation of Clostridium thermocellum. Applied and environmental mictrobiology 70(2), 883-890. Williams, D. R., Young, D. I., & Young, M. (1990). Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum. Journal of general microbiology, 136(5), 819-26.
Claims (17)
1. Bactéria acetogênica carboxidotrófica geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma aciltransferase inespecífica, em que o ácido nucleico consiste na SEQ ID NO: 1.
2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é um Clostridium.
3. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que a aciltransferase inespecífica é derivada de Acinetobacter baylyi.
4. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico está em um plasmídeo.
5. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que a bactéria é derivada de Clostridium autoethanogenum.
6. Bactéria de acordo com a reivindicação 1 caracterizada pelo fato de que a bactéria é derivada de Clostridium ljundahlii.
7. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria é derivada de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides, Oxobacter pfennigii ou Thermoanaerobacter kiuvi.
8. Bactéria de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a aciltransferase inespecífica é códon otimizado para Clostridium autoethanogenum.
9. Processo para converter CO em biodiesel, o processo caracterizado pelo fato de que compreende: passar um substrato gasoso contendo CO por um biorreator contendo uma cultura da bactéria acetogênica carboxidotrófica como definida na reivindicação 1 em um meio de cultura, de forma que a bactéria converta o CO em biodiesel; e recuperar o biodiesel do biorreator.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende um gás residual industrial.
11. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a cultura é anaeróbia.
12. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o biodiesel compreende ésteres etílicos de ácidos graxos.
13. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o biodiesel compreende ésteres butílicos de ácidos graxos.
14. Plasmídeo que se replica em uma bactéria acetogênica carboxidotrófica, o referido plasmídeo caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma aciltransferase inespecífica, em que o ácido nucleico consiste na SEQ ID NO: 1.
15. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a aciltransferase inespecífica é códon otimizado para Clostridium autoethanogenum.
16. Plasmídeo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é metilado.
17. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende gás de síntese.
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