ES2728726T3 - Bacteria modificada por ingeniería genética con actividad de monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH) reducida - Google Patents

Abstract

Una bacteria acetógena carboxidotrófica modificada por ingeniería genética que tiene actividad disminuida o eliminada de CODH1 y/o CODH2 en comparación con una bacteria parental.

Description

DESCRIPCIÓN

Bacteria modificada por ingeniería genética con actividad de monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH) reducida

Antecedentes de la invención

Determinados microorganismos pueden producir combustibles, tales como etanol, y otros productos químicos, tales como 2,3-butanodiol, mediante fermentación de sustratos gaseosos que comprenden uno o más de monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2) e hidrógeno (H2). Sin embargo, la producción eficaz de tales combustibles y productos químicos puede estar limitada por la desviación de sustratos de carbono hacia subproductos no deseados o por el crecimiento lento de los microorganismos. En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de microorganismos modificados por ingeniería genética que tengan perfiles de crecimiento y/o producto mejorados. Sumario de la invención

La invención proporciona microorganismos modificados por ingeniería genética con actividad de monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH) alterada y métodos relacionados con los mismos. En particular, la invención proporciona una bacteria acetógena carboxidotrófica modificada por ingeniería genética que tiene actividad de CODH1 y/o CODH2 reducida o eliminada. La invención proporciona además un método para producir un producto mediante el cultivo de la bacteria en presencia de un sustrato gaseoso que comprende uno o más de CO, CO2 y H2. La bacteria puede modificarse para comprender al menos una mutación negativa en un gen CODH1 y/o gen CODH2, lo que da como resultado una actividad de CODH1 y/o CODH2 reducida o eliminada. Específicamente, la mutación o las mutaciones negativas pueden reducir o eliminar la expresión de un gen CODH1 y/o gen CODH2. En una realización, la mutación negativa es una mutación de desactivación.

Asimismo, la bacteria puede modificarse para tener mayor actividad de CODH/ACS. En una realización, la bacteria puede sobreexpresar un gen CODH/ACS, lo que da como resultado mayor actividad de CODH/ACS.

La bacteria puede producir varios productos o subproductos, incluyendo etanol, 2,3-butanodiol, acetato y/o lactato. En una realización preferida, la bacteria produce uno o más de etanol y 2,3-butanodiol. La bacteria también puede tener características de crecimiento alteradas en comparación con una bacteria parental, tales como fase de latencia reducida o tasa de crecimiento aumentada. Preferentemente, la bacteria produce una mayor cantidad de etanol, produce una mayor cantidad de 2,3-butanodiol, produce una menor cantidad de acetato, tiene una fase de latencia más corta y/o tiene una tasa de crecimiento mayor en comparación con una bacteria parental.

La bacteria generalmente consume un sustrato gaseoso, tal como un sustrato gaseoso que comprende uno o más de CO, CO2 y H2. El sustrato gaseoso puede obtenerse de gas de síntesis o un proceso industrial, por ejemplo. En una realización preferida, la bacteria se obtiene de una bacteria parental de Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii o Clostridium ragsdalei.

Breve descripción de los dibujos

Las figs. 1A-1D son gráficos que muestran perfiles de crecimiento y metabolitos de un mutante de CODH1 (triángulos), un mutante de Co Dh2 (cruces) y C. autoethanogenum t S DSM10061 (círculos) en 206,84 kPa (30 psi) de CO. En particular, la fig. 1A muestra el crecimiento, la fig. 1B muestra la producción de etanol, la fig. 1C muestra la producción de acetato y la fig. 1D muestra la producción de 2,3-butanodiol. N = 3. Barra de error = error típico de la media.

Las figs. 2A-2C son gráficos que muestran perfiles de crecimiento y metabolitos de un mutante de CODH1 (triángulos) y C. autoethanogenum TS DSM10061 (círculos) sobre gas de acería. En particular, la fig. 2A muestra el crecimiento, la fig. 2B muestra la producción de etanol y la fig. 2C muestra la producción de acetato. N = 3. Barra de error = error típico de la media.

Las figs. 3A-3C son gráficos que muestran perfiles de crecimiento y metabolitos de un mutante de CODH1 (triángulos), un mutante de CODH2 (cruces) y C. autoethanogenum TS DSM10061 (círculos) en condiciones de H2 CO2. En particular, la fig. 3A muestra el crecimiento, la fig. 3B muestra la producción de etanol y la fig. 3C muestra la producción de acetato. N = 3. Barra de error = error típico de la media.

La fig. 4 es un diagrama que muestra un mapa plasmídico de pMTL83157-CODH/ACS.

Las figs. 5A-5E son gráficos que muestran el efecto de la sobreexpresión de CODH/ACS en los perfiles de crecimiento y metabolitos de C. autoethanogenum DSM10061 con sobreexpresión de CODH/ACS (pMTL83157-CODH/ACS) (cuadrados) y de control de plásmido pMTL83157 (círculos) en CO al 100 %. En particular, la fig. 5A muestra el crecimiento, la Fig. 5B muestra la producción de acetato, la fig. 5C muestra la producción de etanol, la fig. 5C muestra la producción de etanol, la fig. 5D muestra la producción de 2,3-butanodiol y la fig. 5E muestra la producción de lactato. N = 3. Barra de error = error típico de la media.

Las figs. 6A-6B son gráficos que muestran el crecimiento de C. autoethanogenum DSM10061 con CODH/ACS inactivado (cuadrados) y TS (círculos). La fig. 6A muestra la incapacidad del mutante de desactivación de CODH/ACS para crecer en CO. La fig. 6B muestra la incapacidad del mutante de desactivación de CODH/ACS para crecer en CO2 H2.

Las figs. 7A-7D son gráficos que muestran el efecto de la inactivación de CODH/ACS en los perfiles de crecimiento y metabolitos de un mutante de desactivación de CODH/ACS (cuadrados), un mutante de desactivación de CODH/ACS complementado con el plásmido pMTL83157- Co DH/ACS (triángulos) y C. autoethanogenum DSM10061 TS (círculos) en fructosa. En particular, la fig. 7A muestra el crecimiento, la Fig. 7B muestra la producción de acetato, la fig. 7C muestra la producción de etanol, y la fig. 7D muestra la producción de 2,3-butanodiol.

La fig. 8 es un diagrama que muestra que la inactivación de CODH/ACS puede evitar que la ruta de Wood-Ljungdahl actúe como sumidero para reducir los equivalentes generados durante la glucólisis, de modo que los equivalentes reductores excesivos generen fuerza motriz para la producción de etanol y 2,3-butanodiol.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona, entre otros, nuevos microorganismos modificados por ingeniería genética con actividad de monóxido de carbono deshidrogenasa (CODH) reducida o eliminada y métodos relacionados con los mismos.

Las enzimas CODH (EC 1.2.99.2) son oxidorreductasas que catalizan la oxidación reversible de CO a CO2 y generan equivalentes reductores según la ecuación: CO H2O ^ CO2 2H+ 2e_. Las CODH son bien conocidos en la naturaleza y se han descrito en diversos organismos, incluyendo acetógenos carboxidotróficos.

Las CODH se pueden clasificar en general en dos categorías: (i) la CODH de Mo-Cu-Se de tipo Cox aeróbica de carboxidobacterias, que comprende un sitio activo de molibdeno altamente conservado y utiliza oxígeno (en ocasiones nitrato) como aceptor de electrones terminal; y (ii) la Ni-CODH de tipo anaeróbico, que transfiere los electrones liberados de la oxidación del CO a una gama de aceptadores de electrones fisiológicos, incluyendo ferredoxina, citocromos, flavodoxina, rubredoxina y NAD(P)+. Los equivalentes reductores se pueden aprovechar entonces en varias rutas, incluyendo acetogénesis, metanogénesis, reducción de sulfato, hidrogenogénesis y reducción de metales.

La Ni-CODH sensible a O2 se puede dividir adicionalmente en dos grupos: (i) CODH mono-funcional que actúa fisiológicamente en la oxidación del CO; y (ii) CODH como parte de un complejo de CODH/ACS bifuncional que acopla la reducción de CO2 en el resto de Co a la biosíntesis de acetil-CoA.

C. autoethanogenum, por ejemplo, es capaz de crecer de manera autótrofa utilizando CO como la única fuente de carbono y energía. La secuenciación del genoma descubrió tres Ni-CODH potenciales en este acetógeno: CAETHG_3005 (CODH1), CAETHG_3899 (CODH2), y CAETHG_1620-1621 (AcsA, que codifica el componente de CODH del complejo de CODH/ACS bifuncional). CODH1 se colocaliza genéticamente cadena arriba de una proteína de unión a Fe-S de ferredoxina 4Fe-4S potencial y ferredoxina-NAD(+) reductasa, mientras que CODH2 parece ser un huérfano. De forma similar, también se describe que los acetógenos carboxidotróficos C. ljungdahlii y C. carboxidivorans tienen tres CODH, una CODH/ACS bifuncional y dos CODH monofuncionales adicionales. Adicionalmente, al menos CODH1 se encuentra en todos los acetógenos carboxidotróficos secuenciados, incluyendo C. ljungdahlii, C. ragsdalei, C. difficile y A. woodii.

La técnica anterior acepta en general que las CODH, incluyendo CODH1 y CODH2, están implicadas en la utilización de CO. Por ejemplo, el documento US 2010/0151543 describe cómo la sobreexpresión de CODH dentro del acetógeno Clostridia puede aumentar el flujo de electrones de los componentes de gas de síntesis a los cofactores de nucleótidos oxidados NAD+ y NAD^p+, por lo que los cofactores de nucleótidos (NADH y NADPH) estimulan entonces la generación de compuestos intermedios en la ruta de Wood-Ljungdahl.

Asimismo, el documento WO2013/073860 A1 describe cómo la sobreexpresión de CODH/ACS en el acetógeno Clostridia puede aumentar la producción de etanol.

Sin embargo, los inventores han identificado sorprendentemente que la alteración de CODH1 y/o CODH2 en un microorganismo acetógeno carboxidotrófico no afecta negativamente la utilización del gas. De hecho, los inventores han descubierto que la alteración de CODH1 y/o CODH2 en un microorganismo acetógeno carboxidotrófico da como resultado un microorganismo que produce una mayor cantidad de etanol, produce una menor cantidad de acetato, tiene una fase de latencia más corta y/o tiene una tasa de crecimiento mayor en comparación con un microorganismo parental sin modificar.

La invención proporciona una bacteria acetógena carboxidotrófica modificada por ingeniería genética que tiene actividad de CO D H1 y/o CODH2 reducida o eliminada. La invención proporciona además un método para producir un producto mediante el cultivo de la bacteria en presencia de un sustrato gaseoso que comprende uno o más de CO, CO2 y H2.

Microorganismos

El microorganismo de la invención está modificado por ingeniería genética, es decir, no es de origen natural. La expresión "modificación genética" o "ingeniería genética" se refiere en general a la manipulación del genoma o ácidos nucleicos de un microorganismo. Análogamente, la expresión "modificado por ingeniería genética" se refiere a un microorganismo que comprende un genoma o ácidos nucleicos manipulados. Los métodos de modificación genética incluyen, por ejemplo, expresión génica heteróloga, inserción o supresión de genes o promotores, mutación del ácido nucleico, alteración de la expresión génica o inactivación, ingeniería enzimática, evolución dirigida, diseño basado en el conocimiento, métodos de mutagénesis aleatoria, transposición de genes y optimización de codones. Un "microorganismo" es un organismo microscópico, especialmente una bacteria, arquea, virus u hongo. El microorganismo de la invención es normalmente una bacteria. Como se usa en el presente documento, debe entenderse que la indicación de "microorganismo" abarca "bacteria".

Un "microorganismo parental" es un microorganismo utilizado para generar un microorganismo de la invención. El microorganismo parental puede ser un microorganismo de origen natural (es decir, un microorganismo de tipo silvestre) o un microorganismo que se ha modificado previamente (es decir, un microorganismo mutante o recombinante). El microorganismo de la invención puede modificarse para expresar o sobreexpresar una o más enzimas que no se expresaron o sobreexpresaron en el microorganismo parental. De forma similar, el microorganismo de la invención puede modificarse para contener uno o más genes que no estaban contenidos en el microorganismo parental. En una realización, el microorganismo parental es C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. En una realización preferida, el microorganismo parental es C. autoethanogenum LZ1561, que está depositado con la referencia de DSMZ DSM23693.

La expresión "procedente de" indica que un ácido nucleico, proteína o microorganismo se modifica o adapta a partir de un ácido nucleico, proteína o microorganismo diferente (por ejemplo, un parental o de tipo silvestre), para producir un nuevo ácido nucleico, proteína o microorganismo. Dichas modificaciones o adaptaciones incluyen normalmente inserción, supresión, mutación o sustitución de ácidos nucleicos o genes. En general, el microorganismo de la invención procede de un microorganismo parental. En una realización, el microorganismo de la invención procede de C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. En una realización preferida, el microorganismo de la invención procede de C. autoethanogenum LZ1561, que está depositado con la referencia de DSMZ DSM23693.

El microorganismo de la invención puede clasificarse adicionalmente basándose en características funcionales. Por ejemplo, el microorganismo puede ser o puede proceder de un microorganismo fijador de C 1, un anaerobio, un acetógeno, un etanológeno, un carboxidótrofo y/o una combinación de los mismos. La Tabla 1 proporciona una lista representativa de microorganismos e identifica sus características funcionales.

1 Acetobacterium woodi puede producir etanol a partir de fructosa, pero no de gas.

2 Se ha señalado que Acetobacterium woodi puede crecer en CO, pero la metodología es cuestionable.

3 No se ha investigado si Clostridium magnum puede crecer en CO.

4 Se ha señalado que una cepa de Moorella thermoacetica, Moorella sp. HUC22-1, produce etanol a partir de gas. 5 No se ha investigado si Sporomusa ovata puede crecer en CO.

6 No se ha investigado si Sporomusa silvacetica puede crecer en CO.

7 No se ha investigado si Sporomusa sphaeroides puede crecer en CO.

"C1" se refiere a una molécula de un carbono, por ejemplo, CO, CO2, CH4 o CH3OH. "C1-oxigenado" se refiere a una molécula de un carbono que también comprende al menos un átomo de oxígeno, por ejemplo, CO, CO2 o CH3OH. "Fuente de carbono C1" se refiere a una molécula de carbono que sirve como fuente de carbono parcial o exclusiva para el microorganismo. Por ejemplo, una fuente de carbono C1 puede comprender uno o más de CO, CO2, CH4, CH3OH o CH2O2. Preferentemente, la fuente de carbono C1 comprende uno o ambos de CO y CO2. Un "microorganismo fijador de C1" es un microorganismo que tiene la capacidad de producir uno o más productos a partir de una fuente de carbono C1. Normalmente, el microorganismo es una bacteria fijadora de C1. En un aspecto, el microorganismo procede de un microorganismo fijador de C1 identificado en la Tabla 1.

Un "anaerobio" es un microorganismo que no requiere oxígeno para crecer. Un anaerobio puede reaccionar negativamente o incluso morir si está presente oxígeno por encima de un umbral determinado. Normalmente, el microorganismo es un anaerobio. En un aspecto, el microorganismo procede de un anaerobio identificado en la Tabla 1.

Un "acetógeno" es un microorganismo que produce o es capaz de producir acetato (o ácido acético) como producto de la respiración anaerobia. Normalmente, los acetógenos son bacterias anaerobias que utilizan la ruta de Wood-Ljungdahl como su mecanismo principal para la conservación de energía y para la síntesis de acetil-CoA y productos derivados de acetil-CoA, tales como acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Los acetógenos utilizan la ruta de acetil-CoA como un (1) mecanismo para la síntesis reductora de acetil-CoA a partir de CO2, (2) proceso de conservación de energía, aceptador de electrones terminales, (3) mecanismo para la fijación (asimilación) de CO2 en la síntesis de carbono celular (Drake, Acetogenic Prokaryotes, en: The Prokaryotes, 3a edición, p. 354, Nueva York, NY, 2006). Todos los acetógenos de origen natural son fijadores de C1, anaerobios, autótrofos y no metanotróficos. Normalmente, el microorganismo de la invención es un acetógeno. En una realización preferida, el microorganismo de la invención procede de un acetógeno identificado en la Tabla 1.

Un "etanológeno" es un microorganismo que produce o es capaz de producir etanol. Normalmente, el microorganismo es un etanológeno. En un aspecto, el microorganismo procede de un etanológeno identificado en la Tabla 1.

Un "autótrofo" es un microorganismo capaz de crecer en ausencia de carbono orgánico. En su lugar, los autótrofos utilizan fuentes de carbono inorgánicas, tales como CO y/o CO2. Normalmente, el microorganismo es un autótrofo. En un aspecto, el microorganismo procede de un autótrofo identificado en la Tabla 1.

Un "carboxidótrofo" es un microorganismo capaz de utilizar CO como única fuente de carbono. Normalmente, el microorganismo de la invención es carboxidótrofo. En una realización preferida, el microorganismo de la invención procede de un carboxidótrofo identificado en la Tabla 1.

De manera más amplia, el microorganismo de la invención puede proceder de cualquier género o especie carboxidotrófica y acetógena identificada en la Tabla 1.

En una realización preferida, el microorganismo de la invención procede del grupo de Clostridia que comprende la especie C. autoethanogenum, C. Ijungdahlii y C. ragsdalei. Estas especies fueron señaladas por primera vez y caracterizadas por Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994 (C. autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacterio!, 43: 232-236, 1993 (C. Ijungdahlii), y Huhnke, WO 2008/028055 (C. ragsdalei).

Estas tres especies tienen muchas similitudes. En particular, estas especies son todas miembros fijadores de C1, anaerobios, acetógenos, etanológicos y carboxidotróficos del género Clostridium. Estas especies tienen genotipos y fenotipos y modos de conservación de energía y metabolismo fermentativo similares. Por otra parte, estas especies se agrupan en el grupo I de homología de ARNr clostridial con ADN de ARNr 16S que es más de 99 % idéntico, tienen un contenido de ADN G C de aproximadamente 22-30 % en moles, son grampositivas, tienen morfología y tamaño similares (células en crecimiento logarítmico entre 0,5-0,7 x 3-5 |jm), son mesófilas (crecen de forma óptima a 30-37 °C), tienen intervalos de pH similares de aproximadamente 4-7,5 (con un pH óptimo de aproximadamente 5,5-6), carecen de citocromos y conservan energía a través de un complejo Rnf. Además, se ha mostrado reducción de ácidos carboxílicos en sus alcoholes correspondientes en estas especies (Pérez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Es importante destacar que estas especies también muestran fuerte crecimiento autótrofo en gases que contienen CO, producen etanol y acetato (o ácido acético) como productos principales de fermentación y producen cantidades pequeñas de 2,3-butanodiol y ácido láctico en determinadas condiciones.

Sin embargo, estas tres especies también tienen varias diferencias. Estas especies se aislaron de diferentes fuentes: C. autoethanogenum de intestino de conejo, C. ljungdahlii de desperdicios de gallineros y C. ragsdalei de sedimento de agua dulce. Estas especies difieren en su utilización de diversos azúcares (por ejemplo, ramnosa, arabinosa), ácidos (por ejemplo, gluconato, citrato), aminoácidos (por ejemplo, arginina, histidina) y otros sustratos (por ejemplo, betaína, butanol). Por otra parte, estas especies difieren en su auxotrofia para determinadas vitaminas (por ejemplo, tiamina, biotina). Estas especies tienen diferencias en las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de genes y proteínas de la ruta de Wood-Ljungdahl, aunque se ha encontrado que la organización general y el número de estos genes y proteínas es igual en todas las especies (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011).

Por tanto, en resumen, muchas de las características de C. autoethanogenum, C. ljungdahlii o C. ragsdalei no son específicas de esa especie, sino que son más bien características generales para este grupo de miembros fijadores ^{de C}1^{, anaerobios, acetógenos, etanológicos y carboxidotróficos del género Clostridium. Sin embargo, ya que estas} especies son, de hecho, distintas, la modificación o manipulación genética de una de estas especies puede no tener un efecto idéntico en otra de estas especies. Por ejemplo, pueden observarse diferencias en el crecimiento, rendimiento o producción del producto.

El microorganismo de la invención también puede proceder de un aislado o mutante de C. autoethanogenum, C. ljungdahlii o C. ragsdalei. Los aislados y mutantes de C. autoethanogenum incluyen JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (documento WO 2009/064200) y LZ1561 (DSM23693) (documento WO 2012/015317). Los aislados y mutantes de C. ljungdahlii incluyen ATCC 49587 (Tanner, Int JSyst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PETCT (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (documento US 5.593.886), C-01 (ATCC 55988) (documento US 6.368.819), O-52 (ATCC 55989) (documento US 6.368.819) y OTA-1 (Tirado-Acevedo, Producción de bioetanol a partir de gas de síntesis usando C. ljungdahlii, Tesis doctoral, Universidad Estatal de Carolina del Norte, 2010). Los aislados y mutantes de C. ragsdalei incluyen PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (documento WO 2008/028055).

Enzimas

"CODH1" se refiere a CODH que cataliza la oxidación reversible de CO a CO2 y genera equivalentes reductores según la ecuación: CO H2O ^ CO2 2H+ 2e\ Se debe considerar que la referencia a "CODH1" en el presente documento incluye la referencia a variantes funcionalmente equivalentes de la misma. La CODH1 puede ser, por ejemplo, CODH1 de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 1), C. ragsdalei (SEQ ID NO: 5), C. ljungdahlii (ADK13979.1), C. difficile (YP_001086644.1) o A., woodii (YP_005269573).

"CODH2" se refiere a CODH que cataliza la oxidación reversible de CO a CO2 y genera equivalentes reductores según la ecuación: CO H2O ^ CO2 2H+ 2e\ Se debe considerar que la referencia a "CODH2" en el presente documento incluye la referencia a variantes funcionalmente equivalentes de la misma. La CODH2 puede ser, por ejemplo, CODH2 de C. autoethanogenum (SEQ ID NO: 3), C. ragsdalei (SEQ ID NO: 7), C. Ijungdahlii (ADK14854.1), C. scatologenes (SEQ ID NO: 9), C. acetobutylicum (AAK78101.1 y AAK80452.1), C. carboxidivorans "P7" (ZP_05390164.1), C. hydrogenoformans (ABB14220.1, ABB14432.1 y ABB15066.1) o C. Beijerinckii (YP_001310115.1). Asimismo, se pueden encontrar homólogos de CODH2 en C. botulinum (CBO_2218; A5I3Y9), pero no en C. perfringens, C. thermocellum, C. pasteurianum o C. kluyveri.

El "CODH/ACS" bifuncional es exclusivo de las bacterias acetógenas y, además de la oxidación reversible de CO, también cataliza la síntesis de acetil-CoA a partir de CO, un grupo metilo y CoA. El complejo enzimático CODH/ACS consiste en múltiples subunidades: subunidad CODH (AcsA); subunidad ACS (AcsB); subunidad grande de proteína de hierro-azufre corrinoide (AcsC); subunidad pequeña de proteína de hierro-azufre corrinoide (AcsD); subunidad metiltransferasa (AcsE); y, proteína accesoria de CODH (CooC). Los inventores han descubierto que aumentar el nivel de actividad de CODH/ACS mejora el crecimiento y/o la formación de productos. Sorprendentemente, la sobreexpresión de una sola subunidad CODH del complejo de CODH/ACS es suficiente para aumentar la actividad del complejo.

La subunidad AcsB de CODH/ACS puede ser, por ejemplo, AcsB de C. autoethanogenum (gen CAETHG_1608, proteína WP_023162339.1), C. ljungdahlii (gen CLJU_c37550, proteína WP_013240359.1), C. ragsdalei (gen HQ876032.1, proteína AEI90761.1), C. carboxidivorans (gen Ccar3245, WP_007061841.1), C. scatalogenes (proteína WP_029162953.1), C. difficile (gen CD0728, proteína WP_021369307.1) y A. woodii (gen Awo_c10760, proteína WP_014357691.1).

La subunidad AcsC de CODH/ACS puede ser, por ejemplo, AcsC de C. autoethanogenum (gen CAETHG_1610, proteína WP_023162341.1), C. ljungdahlii (gen CLJU_c37570, proteína WP_013240361.1), C. ragsdalei (gen HQ876032.1, proteína ^a Eⁱ90763.1), C. carboxidivorans (gen Ccar3247, proteína ^w P_007061843.1), C. scatalogenes (proteína WP_029162955.1), C. difficile (gen CD0730, proteína ^w P_021369309.1) o A. woodii (gen Awo_c10720, proteína WP_014357687.1).

La subunidad AcsD de CODH/ACS puede ser, por ejemplo, AcsD de C. autoethanogenum (gen CAETHG_1611, proteína WP_023162342.1), C. ljungdahlii (gen CLJU_c37580, proteína WP_013240362.1), C. ragsdalei (gen HQ876032.1, proteína ^a Eⁱ90764.1), C. carboxidivorans (gen Ccar3248, proteína ^w P_007061844.1), C. scatalogenes (proteína WP_029162956.1), C. difficile (gen CD0731, proteína w P_021369310.1) o A. woodii (gen Awo_c10710, proteína WP_014357686.1).

La subunidad AcsE de CODH/ACS puede ser, por ejemplo, AcsE de C. autoethanogenum (gen CAETHG_1609, proteína WP_023162340.1), C. ljungdahlii (gen CLJU_c37560, proteína WP_013240360.1), C. ragsdalei (gen HQ876032.1, proteína ^a Eⁱ90762.1), C. carboxidivorans (gen Ccar3246, proteína ^w P_007061842.1), C. scatalogenes (proteína WP_029162954.1), C. difficile (gen CD0729, proteína w P_021369308.1) o A. woodii (gen Awo_c10730, proteína WP_014357688.1).

La proteína accesoria CooC de CODH/ACS puede ser, por ejemplo, CooC de C. autoethanogenum (gen CAETHG_1612, proteína WP_023162343.1), C. ljungdahlii (gen CLJU_c37590, proteína WP_013240363.1), C. ragsdalei (gen hQ876032.1, proteína AEI90765.1), C. carboxidivorans (gen Ccar3249, proteína WP_007061845.1), C. scatalogenes (proteína w P_029162957.1), C. difficile (gen CD0732, proteína WP_021369311.1) o A. woodii (gen Awo_c10709, proteína WP_014357685.1).

Se proporciona información de secuencia para CODH1, CODH2 y CODH/ACS para identificar secuencias ejemplares aplicables a la invención y para permitir que un experto en la materia practique realizaciones específicas de la invención sin experimentación indebida. Debería apreciarse que las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos para CODH1, CODH2 y CODH/ACS pueden diferir de un microorganismo a otro. En consecuencia, la invención no debe interpretarse como limitada a estas secuencias y realizaciones específicas, sino más bien para extenderse a variantes funcionalmente equivalentes de cualquier CODH1, CODH2 o CODH/ACS específica a la que se hace referencia en el presente documento, incluyendo homólogos en otras cepas y especies.

El término "variantes" incluye ácidos nucleicos y proteínas cuya secuencia varía con respecto a la secuencia de un ácido nucleico y proteína de referencia, tal como una secuencia de un ácido nucleico y proteína de referencia descrita en la técnica anterior o ejemplificada en el presente documento. La invención puede practicarse usando ácidos nucleicos o proteínas variantes que realizan sustancialmente la misma función que el ácido nucleico o proteína de referencia. Por ejemplo, una proteína variante puede realizar sustancialmente la misma función o catalizar sustancialmente la misma reacción que una proteína de referencia. Un gen variante puede codificar la misma o sustancialmente la misma proteína que un gen de referencia. Un promotor variante puede tener sustancialmente la misma capacidad para promover la expresión de uno o más genes que un promotor de referencia.

Dichos ácidos nucleicos o proteínas pueden denominarse en el presente documento "variantes funcionalmente equivalentes". A modo de ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico pueden incluir variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes mutados, polimorfismos y similares. Los genes homólogos de otros microorganismos también son ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Estos incluyen genes homólogos en especies tales como C. acetobutylicum, C. beijerinckii o C. Ijungdahlii, cuyos detalles están disponibles públicamente en sitios web tales como Genbank o NCBI. Las variantes funcionalmente equivalentes también incluyen ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones para un microorganismo particular. Una variante funcionalmente equivalente de un ácido nucleico tendrá preferentemente al menos aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 98 % o mayor identidad de secuencia de ácido nucleico (porcentaje de homología) con el ácido nucleico de referencia. Una variante funcionalmente equivalente de una proteína tendrá preferentemente al menos aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 98 % o mayor identidad de aminoácidos (porcentaje de homología) con la proteína de referencia. La equivalencia funcional de un ácido nucleico o proteína variante puede evaluarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los ensayos enzimáticos de uso en la evaluación de la actividad de CODH1, CODH2, CODH/ACS y variantes de las mismas incluyen la purificación anaeróbica de CODH seguida de la medición espectrofotométrica del cambio en la absorbancia a 604 nm utilizando metil viológenos como aceptores de electrones (Ragsdale, J Biol Chem, 258: 2364-2369, 1983).

El microorganismo de la invención tiene actividad de CODH1 y/o CODH2 reducida o eliminada y, en una realización, actividad de CODH/ACS aumentada. La "actividad de la enzima", o simplemente "actividad", se refiere en general a la actividad enzimática, incluyendo, pero sin limitación, a la actividad de una enzima, la cantidad de una enzima o la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción. En consecuencia, "aumentar" la actividad enzimática incluye aumentar la actividad de una enzima, aumentar la cantidad de una enzima o aumentar la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción. De forma similar, "disminuir" o "reducir" la actividad de la enzima incluye disminuir la actividad de una enzima, disminuir la cantidad de una enzima o disminuir la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción. En una realización, la función o actividad de CODH1 y/o CODH2 disminuye. En otra realización, la función o actividad de CODH1 y / o CODH2 se elimina o elimina sustancialmente. En otra realización, la función o actividad de CODH/ACS aumenta. En una realización relacionada, la función o actividad de una o más subunidades o proteínas accesorias de CODH/ACS aumenta, particularmente la función o actividad de la subunidad CODH.

Como un enfoque, se puede lograr un cambio en la actividad de la enzima mediante la mutación de un gen que codifica una proteína. "Mutado" se refiere a un ácido nucleico o proteína que se ha modificado en el microorganismo de la invención en comparación con el microorganismo de tipo silvestre o parental del que procede el microorganismo de la invención. En una realización, la mutación puede ser una supresión, inserción o sustitución en un gen que codifica una enzima. En otra realización, la mutación puede ser una supresión, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos en una enzima.

En particular, una "mutación negativa" es una mutación que reduce o elimina (es decir, "altera") la expresión o actividad de un gen o enzima. La mutación negativa puede inactivar parcialmente, inactivar completamente o suprimir el gen o enzima. La mutación negativa puede ser una mutación de desactivación (KO), por la que el gen o proteína se hace inoperante. La mutación negativa puede ser cualquier mutación que reduzca, prevenga o bloquee la biosíntesis de un producto producido por una enzima. La mutación negativa puede incluir, por ejemplo, una mutación en un gen que codifica una enzima, una mutación en un elemento regulador genético implicado en la expresión de un gen que codifica una enzima, la introducción de un ácido nucleico que produce una proteína que reduce o inhibe la actividad de una enzima o la introducción de un ácido nucleico (por ejemplo, ARN antisentido, ARNip, CRISPR) o proteína que inhibe la expresión de una enzima. El microorganismo de la invención comprende normalmente al menos una mutación negativa en un gen de CODH1 y/o gen de CODH2. Dicha mutación puede disminuir o eliminar la expresión del gen de CODH1 y/o del gen de CODH2 en comparación con un microorganismo parental.

La mutación negativa se puede introducir utilizando cualquier método conocido en la técnica. En particular, la mutación negativa se puede introducir inactivando permanentemente un gen mediante inserción dirigida de ADN extraño en la secuencia codificante. Se puede usar una herramienta genética conocida como ClosTron para insertar de manera estable un intrón (1,8 kb) en un locus específico. Específicamente, ClosTron utiliza la especificidad del intrón L1.ltrB del grupo móvil II de L. lactis para propagarse en el sitio especificado a través de un mecanismo de retrodirección, mediado por ARN (Heap, J Microbiol Meth, 80: 49-55, 2010). Otro enfoque implica la transferencia de plásmidos con ramas de homología para suprimir permanentemente parte del gen o el gen completo mediante el empleo de recombinación homóloga. Por ejemplo, un método genético denominado "ACE", o intercambio acoplado a alelo (Heap, Nucl Acids Res, 40: e59, 2012) se puede utilizar para llevar a cabo esta supresión sin depender del uso de un marcador contraseleccionable.

En algunas realizaciones, el microorganismo de la invención tiene actividad aumentada de CODH/ACS en combinación con actividad reducida o eliminada de CODH1 y/o CODH2. En particular, el microorganismo puede sobreexpresar un gen de CODH/ACS. En el presente documento, "gen CODH / ACS" se refiere a cualquier gen que codifique cualquier subunidad o proteína accesoria del complejo enzimático CODH/ACS. En una realización preferida, el microorganismo expresa un gen que codifica la subunidad CODH del complejo enzimático CODH/ACS. "Sobreexpresado" se refiere a un aumento en la expresión de un ácido nucleico o proteína en el microorganismo de la invención en comparación con el microorganismo de tipo silvestre o parental del cual procede el microorganismo de la invención. Se puede lograr sobreexpresión por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo la modificación del número de copias del gen, tasa de transcripción del gen, tasa de traducción del gen o tasa de degradación enzimática.

Pueden administrarse ácidos nucleicos a un microorganismo de la invención usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden administrarse ácidos nucleicos como ácidos nucleicos desnudos o pueden formularse con uno o más agentes, tales como liposomas. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN, ADNc o combinaciones de los mismos, según sea apropiado. Se pueden usar inhibidores de restricción en determinadas realizaciones. Los vectores adicionales pueden incluir plásmidos, virus, bacteriófagos, cósmidos y cromosomas artificiales. En una realización preferida, se administran ácidos nucleicos al microorganismo de la invención usando un plásmido. A modo de ejemplo, se puede lograr transformación (incluyendo transducción o transfección) mediante electroporación, ultrasonidos, transformación mediada por polietilenglicol, competencia química o natural, transformación por protoplastos, inducción de profagos o conjugación. En determinadas realizaciones que tienen sistemas de enzimas de restricción activos, puede ser necesario metilar un ácido nucleico antes de la introducción del ácido nucleico en un microorganismo.

Asimismo, pueden diseñarse ácidos nucleicos para comprender un elemento regulador, tal como un promotor, para aumentar o de otro modo controlar la expresión de un ácido nucleico particular. El promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible. Idealmente, el promotor es un promotor de la ruta de Wood-Ljungdahl, un promotor de ferredoxina, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor de operón del complejo Rnf, un promotor de operón de ATP sintasa o un promotor de operón de fosfotransacetilasa/acetato quinasa.

Los ácidos nucleicos utilizados en la invención pueden ser codones optimizados para la expresión en una cepa o especie particular, particularmente C. autoethanogenum (incluyendo C. autoethanogenum LZ1561), C. Ijungdahlii o C. ragsdalei. La "optimización de codones" se refiere a la mutación de un ácido nucleico, tal como un gen, para la traducción optimizada o mejorada del ácido nucleico en una cepa o especie particular. La optimización de codones puede dar como resultado tasas de traducción más rápidas o mayor precisión de traducción.

Crecimiento y productos

El microorganismo de la invención tiene un crecimiento y/o perfil metabólico alterado en comparación con el microorganismo parental del que procede. Por ejemplo, el microorganismo puede producir una mayor cantidad de etanol, producir una mayor cantidad de 2,3-butanodiol, producir una menor cantidad de acetato, tener una fase de latencia más corta y/o tener una tasa de crecimiento mayor en comparación con el microorganismo parental.

El microorganismo de la invención puede tener una fase de latencia alterada. "Fase de latencia" o "fase de latencia de crecimiento" se refiere a la cantidad de tiempo que tarda un cultivo o población de microorganismos en alcanzar la fase de crecimiento logarítmico inicial o la fase de crecimiento logarítmico/exponencial después de la inoculación. En una realización, el microorganismo tiene una fase de latencia más corta en comparación con un microorganismo parental. Por ejemplo, el microorganismo puede tener una fase de latencia que es aproximadamente 20 %, 25 % o 30 % más corta que la fase de latencia del microorganismo parental. En una realización, el microorganismo tiene una fase de latencia que es aproximadamente de 25 % a 30 % más corta que la fase de latencia del microorganismo parental. En otras realizaciones, el microorganismo puede tener una fase de latencia que es aproximadamente 3, 5 u 8 ^{veces más corta que la fase de latencia del microorganismo parental. En una realización, la fase de latencia puede ser aproximadamente de 7,8 a} 8 ^{días más corta que la fase de latencia del microorganismo parental. En otra} realización, la fase de latencia puede ser de aproximadamente 1-4 días o menos o aproximadamente 2,9 días o menos. En algunos casos, el microorganismo puede tener una fase de latencia drásticamente más corta que el microorganismo parental. Por ejemplo, el microorganismo puede tener una fase de latencia que es aproximadamente 10, 50, 100 o 200 veces más corta que la fase de latencia del microorganismo parental. En una ^{realización, la fase de latencia puede ser de aproximadamente} 0,1 ^{días o menos.}

El microorganismo de la invención puede tener una tasa de crecimiento alterada. "Tasa de crecimiento" se refiere a la tasa a la que un cultivo o población de microorganismos aumenta con el tiempo. Las tasas de crecimiento se expresan normalmente en el presente documento usando las unidades h-1. En una realización, el microorganismo tiene una tasa de crecimiento aumentada o mayor en comparación con el microorganismo parental. Por ejemplo, el microorganismo puede tener una tasa de crecimiento que es aproximadamente 20 %, 40 %, 60 %, 80 % o 100 % mayor que la tasa de crecimiento del microorganismo parental. En determinadas realizaciones, el microorganismo tiene una tasa de crecimiento que es aproximadamente 2, 3, 4 o 5 veces mayor que la tasa de crecimiento del microorganismo parental.

El microorganismo de la invención puede producir una cantidad alterada de biomasa. "Biomasa" se refiere a la población colectiva de microorganismos generados a partir de un proceso de crecimiento o fermentación. En una realización, la fermentación del microorganismo produce una cantidad aumentada o mayor de biomasa en comparación con la fermentación del microorganismo parental. Por ejemplo, la fermentación del microorganismo puede producir aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 100 %, 120 %, 150 %, 180 %, 200 % o 220 % más biomasa en comparación con la fermentación del microorganismo parental. En una realización, la fermentación del microorganismo produce aproximadamente 200 % a 220 % más biomasa en comparación con la fermentación del microorganismo parental.

El microorganismo de la invención puede producir una cantidad alterada de etanol. En una realización, el microorganismo produce una cantidad aumentada o mayor de etanol en comparación con un microorganismo parental. Por ejemplo, el microorganismo puede producir aproximadamente 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 % o 120 % más etanol en comparación con el microorganismo parental. En una realización, el microorganismo produce aproximadamente de 20 % a 113 % más etanol en comparación con el microorganismo parental.

El microorganismo de la invención puede producir una cantidad alterada de 2,3-butanodiol. En una realización, el microorganismo produce una cantidad aumentada o mayor de 2,3-butanodiol en comparación con un microorganismo parental. Por ejemplo, el microorganismo puede producir aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 140 %, 160 %, 180 %, 200 %, 220 %, 240 %, 260 %, 270 %, 280 %, 300 %, 320 % o 340 % más 2,3-butanodiol en comparación con el microorganismo parental. En una realización, el microorganismo produce aproximadamente de 220 % a 230 % más 2,3-butanodiol en comparación con el microorganismo parental. En otra realización, el microorganismo produce al menos aproximadamente 330 % más 2,3-butanodiol en comparación con el microorganismo parental. En una realización adicional, el microorganismo produce aproximadamente de 300 % a 330 % más 2,3-butanodiol en comparación con el microorganismo parental. En una realización adicional, el microorganismo produce aproximadamente 0,5-20 g/l de 2,3-butanodiol.

El microorganismo de la invención puede producir una cantidad alterada de acetato. El término "acetato" incluye tanto sal de acetato sola como una mezcla de ácido acético molecular o libre y sal de acetato. En una realización, el microorganismo produce una cantidad disminuida o menor de acetato en comparación con un microorganismo parental. Por ejemplo, el microorganismo puede producir aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % menos acetato en comparación con el microorganismo parental. En una realización, el microorganismo produce aproximadamente de 18 % a 37 % menos acetato en comparación con el microorganismo parental. En otra realización, el microorganismo produce aproximadamente 0-5 g/l de acetato.

El microorganismo de la invención puede producir una cantidad alterada de lactato. En una realización, el microorganismo produce una cantidad disminuida o menor de lactato en comparación con un microorganismo parental.

En una realización particularmente preferida, el microorganismo de la invención produce una cantidad aumentada de etanol y/o 2,3-butanodiol y una cantidad disminuida de acetato en comparación con un microorganismo parental. El microorganismo y los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para aumentar la eficacia de un proceso de fermentación. "Aumentar la eficacia", "eficacia aumentada", y similares incluyen, pero sin limitación, aumento de la tasa de crecimiento de microorganismos, tasa de producción o volumen del producto, volumen de producto por volumen de sustrato consumido o selectividad del producto. La eficacia puede medirse en relación con el rendimiento de un microorganismo parental del que procede el microorganismo de la invención.

El microorganismo de la invención también puede producir uno o más productos adicionales. Por ejemplo, Clostridium autoethanogenum produce o puede modificarse por ingeniería genética para producir etanol (documento WO 2007/117157), acetato (documento WO 2007/117157), butanol (documentos WO 2008/115080 y WO 2012/053905), butirato (documento WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (documento WO 2009/151342), lactato (documento WO 2011/112103), buteno (documento WO 2012/024522), butadieno (documento WO 2012/024522), metil etil cetona (2-butanona) (documentos WO 2012/024522 y WO 2013/185123), etileno (documento ^w O 2012/026833), acetona (documento WO 2012/115527), isopropanol (documento Wo 2012/115527), lípidos (documento WO 2013/036147), 3-hidroxipropionato (3-HP) (documento W^o 2013/180581), isopreno (documento WO 2013/180584), ácidos grasos (documento WO 2013/191567), 2-butanol (documento WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (documento WO 2014/0369152) y 1-propanol (documento WO 2014/0369152). En determinadas realizaciones, la biomasa microbiana en sí misma puede considerarse un producto.

La invención proporciona además métodos para producir uno o más productos, tales como etanol y/o 2,3-butanodiol, cultivando un microorganismo de la invención. También se desvelan métodos para reducir las emisiones de carbono atmosféricas totales de un proceso industrial utilizando un microorganismo de la invención para convertir CO, CO2 y/o H2 de un gas residual industrial en productos útiles.

Sustrato

"Sustrato" se refiere a una fuente de carbono y/o energía para el microorganismo de la invención. Normalmente, el sustrato es gaseoso y comprende una fuente de carbono C1, por ejemplo, CO y/o CO2. Preferentemente, el sustrato comprende una fuente de carbono C1 de CO o CO CO2. El sustrato puede comprender además otros componentes distintos de carbono, tales como H2, N2 o electrones.

El sustrato generalmente comprende al menos alguna cantidad de CO, tal como aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % en moles de CO. El sustrato puede comprender una gama de CO, tal como aproximadamente 20-80, 30-70, o 40-60 % en moles de CO. Preferentemente, el sustrato comprende aproximadamente 40-70 % en moles de CO (por ejemplo, gas de acería o alto horno), aproximadamente 20-30 % en moles de CO (por ejemplo, gas de horno de oxígeno básico) o aproximadamente 15-45 % en moles de CO (por ejemplo, gas de síntesis). En algunas realizaciones, el sustrato puede comprender una cantidad relativamente baja ^{de CO, tal como aproximadamente} 1-10 ^o 1-20 ^{% en moles de Co . El microorganismo de la invención normalmente} convierte al menos una parte del CO del sustrato en un producto. En algunas realizaciones, el sustrato no comprende o sustancialmente no comprende CO.

El sustrato puede comprender alguna cantidad de H2. Por ejemplo, el sustrato puede comprender aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15, 20 o 30 % en moles de H2. En algunas realizaciones, el sustrato puede comprender una cantidad relativamente alta de H2, tal como aproximadamente 60, 70, 80 o 90 % en moles de H2. En realizaciones adicionales, el sustrato no comprende o sustancialmente no comprende H2. Se pueden producir corrientes de gas rico en H2, por ejemplo, mediante reforma por vapor de hidrocarburos, en particular, reforma por vapor de gas natural, oxidación parcial de carbón o hidrocarburos, electrólisis del agua y captura de subproductos de celdas electrolíticas utilizadas para producir cloro y de refinería o corrientes químicas.

El sustrato puede comprender alguna cantidad de CO2. Por ejemplo, el sustrato puede comprender aproximadamente 1-80 o 1-30 % en moles de CO2. En algunas realizaciones, el sustrato puede comprender menos de aproximadamente 20, 15, 10 o 5 % en moles de CO2. En otra realización, el sustrato no comprende o sustancialmente no comprende CO2. Las corrientes de gas rico en CO2 incluyen, por ejemplo, gases de escape de la combustión de hidrocarburos, tal como combustión de gas natural o petróleo, subproductos de la producción de amoníaco, cal o fosfato y pozos de dióxido de carbono natural.

Aunque el sustrato es normalmente gaseoso, el sustrato también se puede proporcionar en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato se puede disolver en un líquido saturado con un gas que contiene CO usando un generador de dispersión de microburbujas. A modo de ejemplo adicional, el sustrato puede adsorberse sobre un soporte sólido. El sustrato y/o la fuente de carbono C1 pueden ser un gas residual obtenido como un subproducto de un proceso industrial o de alguna otra fuente, tal como de gases de escape de automóviles o gasificación de biomasa. En determinadas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tal como una fabricación en acería, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinación de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoníaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el sustrato y/o la fuente de carbono C1 pueden capturarse del proceso industrial antes de que se emita a la atmósfera, utilizando cualquier método conveniente.

El sustrato y/o la fuente de carbono C1 pueden ser gas de síntesis, tal como gas de síntesis obtenido por gasificación de carbón o residuos de refinería, gasificación de biomasa o material lignocelulósico o reforma de gas natural. En otra realización, el gas de síntesis puede obtenerse a partir de la gasificación de residuos sólidos municipales o residuos sólidos industriales.

La composición del sustrato puede tener una influencia significativa en la eficacia y/o el coste de la reacción. Por ejemplo, la presencia de oxigeno (O2) puede reducir la eficacia de un proceso de fermentación anaerobia. En función de la composición del sustrato, puede ser deseable tratar, frotar o filtrar el sustrato para retirar cualquier impureza no deseada, tal como toxinas, componentes no deseados o partículas de polvo, y/o aumentar la concentración de componentes deseables.

Efecto del sustrato y modificaciones genéticas

La composición del sustrato puede afectar al perfil de crecimiento y/o metabólico del microorganismo de la invención. Por ejemplo, un microorganismo que crece en CO puede tener un perfil de crecimiento y/o metabólico diferente al de un microorganismo que crece en CO2 H2. Adicionalmente, la combinación particular de modificaciones genéticas puede afectar al perfil de crecimiento y/o metabólico del microorganismo de la invención. Por ejemplo, un microorganismo que comprende una mutación negativa en un gen CODH1 puede tener un perfil de crecimiento y/o metabólico diferente al de un microorganismo que comprende una mutación negativa en un gen CODH2, que puede tener un perfil de crecimiento y/o metabólico diferente al de un microorganismo que comprende una mutación negativa tanto en un gen CODH1 como en un gen CODH2. La sobreexpresión de CODH/ACS en cualquiera de estos microorganismos puede alterar adicionalmente el perfil de crecimiento y/o metabólico de los microorganismos. La combinación estratégica de modificaciones genéticas y el crecimiento de microorganismos en sustratos particulares puede producir perfiles de crecimiento y/o metabólicos adaptados a aplicaciones específicas u objetivos de producción.

El crecimiento de una cepa con desactivación de CODH1 en CO generalmente da como resultado disminución de la producción de biomasa, disminución de la producción de acetato, aumento de la producción de etanol y producción similar de 2,3-butanodiol. El crecimiento de una cepa con desactivación de CODH1 en CO2 H2 da como resultado en general una disminución de la fase de latencia y crecimiento más rápido. Por ejemplo, una cepa con desactivación de CODH1 que crece en CO2 H2 puede no tener fase de latencia y puede producir aproximadamente 0,4 g/l de biomasa.

El crecimiento de una cepa con desactivación de CODH2 en CO generalmente da como resultado disminución de la fase de latencia, disminución de la producción de etanol, disminución de la producción de acetato y aumento o producción similar de 2,3-butanodiol. Por ejemplo, una cepa con desactivación de CODH2 que crece en CO puede tener una fase de latencia de 2-4 días y puede producir aproximadamente 0,1-4 g/l de acetato. El crecimiento de una cepa con desactivación de CODH2 en CO2 H2 da como resultado en general disminución de la fase de latencia y crecimiento más rápido. Por ejemplo, una cepa con desactivación de CODH2 que crece en CO2 H2 puede tener una fase de latencia de 4 días.

El crecimiento de una cepa con sobreexpresión de CODH/ACS en CO da como resultado en general disminución de la fase de latencia, aumento de la producción de etanol, producción de acetato similar y aumento de la producción de lactato.

Fermentación

Normalmente, el cultivo se realiza en un biorreactor. El término "biorreactor" incluye un dispositivo de cultivo/fermentación que consiste en uno o más vasos, torres o disposiciones de tuberías, tales como un reactor de tanque agitado continuo (CSTR), reactor celular inmovilizado (ICR), reactor de lecho percolador (TBR), columna de burbujeo, fermentador de elevación de gases, mezclador estático u otro vaso u otro dispositivo adecuado para contacto de gas-líquido. En algunas realizaciones, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de cultivo/fermentación. El sustrato puede proporcionarse a uno o ambos de estos reactores. Como se usa en el presente documento, los términos "cultura" y "fermentación" se usan indistintamente. Estos términos abarcan tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis del producto del proceso de cultivo/fermentación.

El cultivo se mantiene en general en un medio de cultivo acuoso que contiene nutrientes, vitaminas y/o minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo. Preferentemente, el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento microbiano anaeróbico, tal como un medio de crecimiento microbiano anaeróbico mínimo. Se conocen bien en la técnica medios adecuados.

El cultivo/fermentación debería llevarse a cabo convenientemente en condiciones apropiadas para la producción del producto diana. Normalmente, el cultivo/fermentación se realiza en condiciones anaeróbicas. Las condiciones de reacción para considerar incluyen presión (o presión parcial), temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH del medio, potencial rédox del medio, velocidad de agitación (si se usa un reactor de tanque agitado continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato de gas para garantizar que el gas en la fase líquida no vuelva limitante y concentraciones máximas de producto para evitar la inhibición del producto. En particular, la velocidad de introducción del sustrato se puede controlar para garantizar que la concentración de gas en la fase líquida no se vuelva limitante, ya que los productos pueden ser consumidos por el cultivo en condiciones limitadas de gas.

El funcionamiento de un biorreactor a presiones elevadas permite una tasa aumentada de transferencia de masa de gas de la fase gaseosa a la fase líquida. En consecuencia, en general, es preferible realizar el cultivo/fermentación a presiones mayores que la presión atmosférica. Además, ya que una tasa de conversión de gas dada es, en parte, una función del tiempo de retención del sustrato y el tiempo de retención dicta el volumen requerido de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen del biorreactor necesario y, en consecuencia, el coste de capital del equipo de cultivo/fermentación. Esto, a su vez, significa que el tiempo de retención, definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido por el caudal de gas de entrada, se puede reducir cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de la presión atmosférica. Las condiciones de reacción óptimas dependerán en parte del microorganismo particular utilizado. Sin embargo, en general, es preferible operar la fermentación a una presión mayor que la presión atmosférica. Además, ya que una tasa de conversión de gas dada es en parte una función del tiempo de retención del sustrato y lograr un tiempo de retención deseado a su vez dicta el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen del biorreactor necesario y, en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación. Los productos diana pueden separarse o purificarse a partir de un caldo de fermentación utilizando cualquier método o combinación de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, destilación fraccionada, evaporación, pervaporación, extracción de gas, separación de fases y fermentación extractiva, incluyendo, por ejemplo, extracción líquido-líquido. En determinadas realizaciones, se recuperan productos diana del caldo de fermentación retirando continuamente una parte del caldo del biorreactor, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración) y recuperando uno o más productos diana del caldo. Se pueden recuperar alcoholes y/o acetona, por ejemplo, por destilación. Los ácidos pueden recuperarse, por ejemplo, mediante adsorción sobre carbón activado. Las células microbianas separadas se devuelven preferentemente al biorreactor. El permeado sin células que permanece después de haber retirado productos diana preferentemente también se devuelve al biorreactor. Se pueden añadir nutrientes adicionales (tales como vitaminas B) al permeado sin células para reponer el medio antes de devolverlo al biorreactor.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la inactivación por inserción basada en intrones del grupo II de los genes de CODH1 y CODH2 implicados en la fijación de carbono en C. autoethanogenum DSM10061.

Se obtuvo C. autoethanogenum DSM10061 de la DSMZ, la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares, Inhoffenstrape 7B, 38124 Braunschweig, Alemania. La cepa de conjugación de E. coli CA434 fue proporcionada amablemente por el profesor Nigel Minton (Universidad de Nottingham, Reino Unido).

El genoma de C. autoethanogenum DSM 10061 codifica las monóxido de carbono deshidrogenasas (CODH) CODH1 (SEQ ID NO: 1 y 2) y CODH2 (SEQ ID NO: 3 y 4). Estos CODH se inactivaron utilizando la herramienta de alteración génica mediada por intrones del grupo II de ClosTron (Heap, J Microbiol Meth, 80: 49-55, 2010). El algoritmo de Perutka alojado en el sitio web de ClosTron se usó para identificar el sitio diana del intrón del grupo II entre las bases 600/601 y 528/529 en la cadena con sentido de los genes de CODH1 y CODH2, respectivamente. Se utilizó el mismo algoritmo para diseñar las regiones de direccionamiento de intrones para CODH1 (SEQ ID NO: ^{15) y CODH2 (SEQ ID NO:} 16^{) que fueron sintetizadas comercialmente por DNA2.0 Inc. (CA) y se administraron en} el vector pTML007C-E2 (HQ263410.1). Los vectores finales, pMTL007C-E2-CODH1-600!601s y pMTL007C-E2-CODH2-528!529s contenían un marcador de ermB activado por retrotransposición (RAM) que confirió resistencia a la claritromicina antibiótica tras la inserción en el sitio diana.

Los plásmidos pMTL007C-E2-CODH1-600!601s y pMTL007C-E2-CODH2-528!529s se introdujeron en C. autoethanogenum DSM 10061 como se ha descrito anteriormente y en el documento WO 2012/053905. La mezcla de transformación se aplicó puntualmente en medio de agar YTF y se incubó a 37 °C dentro de la estación de trabajo anaeróbica. Después de 24 horas, las células se rasparon y se resuspendieron en 500 pl de PBS y se extendieron en medio de agar YTF complementado con 7,5 pg/ml de tianfenicol (Sigma). Los transformantes se seleccionaron utilizando 7,5 pg/ml de tianfenicol. Se observaron colonias después de 3 días de incubación.

Primero se hicieron secuencialmente estrías de colonias individuales en medios YTF complementados con 7,5 pg/ml ^{de tianfenicol y 10 pg/ml de trimetoprim, seguidos de medios YTF que contienen} 6 ^{pg/ml de claritromicina. Se seleccionaron aleatoriamente >} 8 ^{colonias para la inserción del grupo II por PCR (kit Maxime PCR PreMix) usando} oligonucleótidos flanqueantes.

La amplificación de colonias resistentes a claritromicina usando oligonucleótidos flanqueantes y análisis de electroforesis en gel mostró la presencia de la banda de ClosTron mayor (> 2 kb) en lugar de la banda de tipo silvestre menor (< 520 pb), lo que indicó que el intrón del grupo II de ClosTron se había insertado con éxito en los sitios CODH especificados (CODH1::CTer-mB-601s y CODH2::CTermB-529s). Estos amplicones se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y la secuencia se validó mediante secuenciación de Sanger (Source Bioscience, Reino Unido).

Como una etapa de validación final, los clones verificados por PCR se sometieron a análisis de transferencia de Southern para confirmar la inserción única de ClosTron. Se aisló ADN genómico de los mutantes ClosTron según Bertram, Arch Microbiol, 151: 551-557, 1989 y después se digirió con la enzima de restricción HindIII. Los productos de digestión se sometieron a análisis de transferencia de Southern utilizando una sonda DIG marcada aleatoriamente (Roche) y se realizaron según las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos EBS2 (SEQ ID NO: 27) e Intrón-SalI-R1 (SEQ ID NO: 28) se utilizaron para generar la sonda, utilizando el plásmido pMTL007C-E2 como molde. La sonda resultante se hibridó con el intrón del grupo II. El análisis de transferencia de Southern detectó una única banda por clon mutante, lo que indica un único acontecimiento de inserción del intrón del grupo II en el genoma de C. autoethanogenum DSM10061. Estos mutantes validados se denominaron CODH1::CTermB-601s (o "mutante de CODH1") y CODH2::CTermB-529s (o "mutante de CODH2").

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra el efecto de la inactivación de CODH1 en C. autoethanogenum DSM10061 cultivado en condiciones de CO.

La capacidad del mutante de CODH1 para crecer de forma autótrofa con 100 % de CO se ensayó por triplicado en frascos de suero de 250 ml que contenían 50 ml de medios de PETC presurizados con 206,84 kPa (30 psi) de CO. Se inoculó un equivalente de DO6000,5 de cultivo activo en cada frasco de suero y se recogieron muestras de fase líquida para mediciones de DO a una longitud de onda de 600 nm y análisis de metabolitos mediante HPLC.

Se realizaron análisis de metabolitos mediante HPLC utilizando un sistema de HPLC Agilent serie 1100 equipado con un RID operado a 35 °C (detector de índice de refracción) y una columna de ácido orgánico Alltech IOA-2000 (150 x 6,5 mm, tamaño de partícula 5 pm) mantenida a 60 °C. Se utilizó agua ligeramente acidificada (H2SO40,005 M) como fase móvil con un caudal de 0,7 ml/min. Para eliminar proteínas y otros residuos celulares, se mezclaron muestras de 400 pl con 100 pl de un ácido 5-sulfosalicílico al 2 % (p/v) y se centrifugaron a 14.000 x g durante 3 min para separar los residuos precipitados. Después se inyectaron 10 pl del sobrenadante en la HPLC para análisis. Como se muestra en las Figs. 1A-1D, el mutante CODH1 mostró perfiles metabólicos favorables en forma de etanol potenciado a expensas de la biomasa (42 % menos) y la formación de acetato. El mutante de CODH1 produjo 64 % más etanol (Fig. 1B), 25 % menos acetato (Fig. 1C) y 2,3-butanodiol similar (Fig. 1D) que TS.

También se observó un patrón similar cuando el mutante de CODH1 y TS se cultivaron en gas de acería que comprendía 51,24 % de C^o , 31,22 % de N2, 11,98 % de CO2 y 3,05 % de H2 de una acería en Glenbrook, Nueva Zelanda. El experimento se realizó por triplicado en frascos de suero de 250 ml que contenían 100 ml de medio de PETC y se presurizó a 206,84 kPa (30 psi) con gas de acería. En términos de crecimiento en CO (en gas de acería), el mutante de CODH1 produjo 113 % más etanol (Fig. 2B), de nuevo a expensas de la biomasa (17 % menos) (Fig. 2A) y acetato (18 % menos) (Fig. 2C) que TS.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra el efecto de la inactivación de CODH2 en C. autoethanogenum DSM 10061 cultivado en condiciones de CO.

La capacidad del mutante de CODH2 para crecer de forma autótrofa en 100 % de CO se ensayó en las mismas condiciones que el mutante de CODH1, descrito anteriormente. En comparación con TS, el mutante de CODH2 presentó reducción de la fase de latencia de 1 día utilizando al mismo tiempo 100 % de CO como sustrato (Fig. 1A). La fase exponencial temprana del mutante de CODH2 se produjo el día 3,8, en comparación con la fase exponencial de TS el día 4,8 (Fig. 1A). El mutante de CODH2 produjo 27 % menos acetato (Fig. 1^c ) y 27 % menos etanol que TS (Fig. 1B). Sin embargo, la producción de 2,3-butanodiol máxima del mutante de CODH2 fue mayor que TS (Fig. 1D). Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra el efecto de la inactivación de CODH1 o CODH2 en C. autoethanogenum DSM10061 cultivado en condiciones de H2 CO2.

Para ensayar la capacidad de los mutantes de CODH1 y CODH2 para crecer en hidrógeno y dióxido de carbono, TS y los mutantes CODH se inocularon por separado en 50 ml de medio PETC (sin fructosa) en frascos de suero de 250 ml por triplicado, y el espacio libre superior se intercambió con 137,90 kPa (20 psi) de H2 68,95 kPa (10 psi) de CO2. Los cultivos se dejaron crecer a 37 °C con agitación y se recogieron muestras para mediciones de DO600 y análisis por HPLC.

En condiciones de H2 CO2, el mutante de CODH1 presentó un perfil de crecimiento notablemente mejorado con ^{respecto a TS. TS experimentó una fase de latencia de} 6 ^{días antes de alcanzar una DO600 máxima de 0,184 el día} 22,7, mientras que el mutante de CODH1 fue capaz de crecer sin fase de latencia evidente y alcanzó una DO600 máxima de 0,40 el día 1,6 (Fig. 3A). El mutante de CODH2 presentó una fase de latencia más corta y un crecimiento más rápido que TS y alcanzó una DO600 máxima de 0,20 (Fig. 3A). El análisis por HPLC mostró que el mutante de CODH1 produjo niveles muy similares de acetato y etanol, el mutante de CODH2 y TS en condiciones de H2 CO2 (Figs. 3B-5C).

Ejemplo 5

Este ejemplo describe el efecto esperado de la inactivación combinada de CODH1 y CODH2 en C. autoethanogenum DSM10061 cultivado en condiciones de CO.

Dado el perfil de metabolitos deseable del mutante de CODH1 en condiciones de CO y la fase de latencia reducida de los mutantes de CODH1 y CODH2 en condiciones tanto de CO como de H2 CO2, la inactivación combinada de CODH1 y CODH2 puede dar como resultado una cepa que tiene perfiles de crecimiento y metabolitos superiores en condiciones autotróficas. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, la inactivación de estas dos CODH puede aumentar la disponibilidad de CO y/o CO2 para reacción con la CODH/ACS y dar como resultado formación más eficaz de acetil-CoA.

Por ejemplo, el intercambio acoplado a alelo o ACE (Heap, Nucl Acids Res, 40: e59, 2012) se puede utilizar para generar una interrupción doble de CODH (es decir, CODH1 y CODH2). Utilizando esta técnica, el gen pyrE (SEQ ID NO: 19) de C. autoethanogenum DSM10061 puede suprimirse para que se pueda utilizar pyrE como un marcador seleccionable positivo y negativo para estadios posteriores de la manipulación genética. Los mutantes con pyrE suprimido son auxotróficos para uracilo y resistentes al profármaco ácido 5'-fluoroorótico. Como siguiente etapa, un plásmido ClosTron que se dirige a una de las CODH puede introducirse en mutante de supresión de pyrE y las colonias resistentes a la claritromicina pueden verificarse mediante PCR, secuenciación y transferencia de Southern. Una vez que se ha confirmado la inactivación por ClosTron de un CODH en este mutante de supresión de pyrE, se puede introducir un plásmido de supresión de ACE que contiene pyrE como un marcador seleccionable negativo para suprimir la otra CODH. Como etapa final, puede introducirse un plásmido de ACE con el gen pyrE para restaurar la integridad de pyrE, lo que da como resultado un mutante de alteración de CODH1 y CODH2 combinado en un fondo TS con gen pyrE funcional.

Ejemplo 6 (ejemplo de referencia)

Este ejemplo demuestra la construcción e introducción del plásmido de sobreexpresión de CODH/ACS en C. autoethanogenum DSM 10061.

C. autoethanogenum DSM 10061 se obtuvo de la DSMZ, la colección alemana de microorganismos y cultivos celulares, Inhoffenstrape 7B, 38124 Braunschweig, Alemania. Se obtuvieron cepas de E. coli DH5a-T1R y XL1-Blue MRF' de Invitrogen y Stratagene, respectivamente.

Las secuencias de ADN del promotor Wood-Ljungdahl (P^{w l}) (SEQ ID NO: 18) y las subunidades AcsA (SEQ ID NO: 12) y AcsB (SEQ ID NO: 14) de monóxido de carbono deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa (CODH/ACS) bifuncionales, ambas de C. autoethanogenum DSM10061, se obtuvieron a partir de la secuenciación del genoma. Se descubrió que el grupo de Wood-Ljungdahl de C. autoethanogenum estaba altamente expresado en condiciones autótrofas (Kopke, Curr Opin Biotechnol, 22: 320-325, 2011) de modo que se usó P^wl para la expresión de CODH/ACS. Se aisló ADN genómico de C. autoethanogenum DSM10061 usando un método modificado por Bertram, Arch Microbiol, 151: 551-557, 1989. Se recogió un cultivo de una noche de 100 ml (6.000 x g, 15 min, 4 °C), se lavó con tampón de fosfato de potasio (10 mM, pH 7,5) y se suspendió en 1,9 ml de tampón de STE (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 200 mM; pH 8,0). Se añadieron 300 pl de lisozima (~100.000 ^u ) y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min, seguido de la adición de 280 pl de una solución de SDS al 10 % (p/v) y otra incubación durante 10 min. Se digirió ARN a temperatura ambiente mediante la adición de 240 pl de una solución de EDTA (0,5 ^{M, pH} 8^{), 20 pl de Tris-HCl (1 M, pH 7,5) y 10 pl de RNasa A (Fermentas). Después, se añadieron 100 pl de} proteinasa K (0,5 U) y tuvo lugar proteólisis durante 1-3 h a 37 °C. Finalmente, se añadieron 600 pl de perclorato de sodio (5 M), seguido de una extracción con fenolcloroformo y una precipitación con isopropanol. La cantidad y calidad de ADN se inspeccionó espectrofotométricamente.

El gen de CODH/ACS y Pwl se amplificaron mediante PCR utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad de Phusion (New England Biolabs). La P^wl de 573 pb amplificada se clonó en el vector lanzadera de E. coli-Clostridium pMTL 83151 (número de referencia de GenBank FJ797647; Nigel Minton, Universidad de Nottingham; Heap, J Microbiol Meth, 78: 79-85, 2009) utilizando sitios de restricción NotI y NdeI y cepa DH5a-T1R (Invitrogen), lo que da como resultado el plásmido pMTL83157. Dado que la secuencia codificante de CODH/ACS contiene un sitio NdeI interno, se usó PCR solapante de corte y empalme (SOE) (Warrens, Gene, 186: 29-35, 1997) para eliminar este sitio NdeI sin alteración del codón. Tanto el producto de PCR de 1946 pb de CODH/ACS como el plásmido pMTL83157 se digirieron con NdeI y Sacl, y se ligaron para producir el plásmido pMTL83157-CODH/ACS (Fig. 4) (SEQ ID NO: 20). La inserción del plásmido de expresión pMTL83157-CODH/ACS se secuenció completamente utilizando los oligonucleótidos CODH/ACS-NdeI-F (SEQ iD NO: 31) y CODH/ACS-SacI-R (SEQ ID NO: 32). La secuenciación de Sanger utilizando cebadores CODH/ACS-NdeI-F y CODH/ACS-SacI-R confirmó que el sitio NdeI interno de CODH/ACS se había alterado con éxito y estaba exento de mutaciones.

Los plásmidos pMTL83157 y pMTL83157-CODH/ACS se introdujeron en C. autoethanogenum DSM10061 conjugando con la cepa de E. coli donante CA434 como donante. Se cultivaron cepas donantes durante una noche en medio LB complementado con 25 |jg/ml de cloranfenicol y 100 |jg/ml de espectinomicina. Se recogieron células de 1,5 ml de cultivo mediante centrifugación y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Dentro de ^{una estación de trabajo anaeróbica, el sedimento de células del donante se resuspendió en} 200 ^{j l de receptor de} crecimiento exponencial C. autoethanogenum DSM10061. La mezcla de conjugación se aplicó puntualmente en medio de agar YTF y se incubó a 37 °C dentro de una estación de trabajo anaeróbica. Después de 24 horas, las células se rasparon y se resuspendieron en 500 j l de PBS y se extendieron en medio de agar YTF complementado con 7,5 jg/ml de tianfenicol (Sigma) y 10 jg/ml de trimetoprim (Sigma). Se seleccionaron transconjugantes de C. autoethanogenum utilizando 7,5 jg/ml de tianfenicol mientras que la cepa de E. coli CA434 se contraseleccionó utilizando 10 jg/ml de trimetoprim. Se observaron colonias después de 3 días de incubación y se volvieron a sembrar en estrías en el mismo medio de agar selectivo para purificación.

Análogamente, el plásmido podría introducirse en otros acetógenos carboxidotróficos, tales como C. Ijungdahlii o C. ragsdalei, utilizando protocolos similares.

Para comprobar la identidad de los transconjugantes, el ARNr 16s se amplificó y se secuenció por Sanger utilizando los oligonucleótidos Univ-0027-F (SEQ ID NO: 25) y Univ-1492-R (SEQ ID NO: 26). Se extrajo ADN plasmídico de transconjugantes de C. autoethanogenum y se transformaron en E. coli XL1-Blue MRF' (Stratagene) antes de llevar a cabo el análisis de digestión de restricción del plásmido. Esto se denomina habitualmente 'rescate de plásmido' porque los plásmidos aislados de Clostridia no son de suficiente calidad para el análisis de digestión de restricción. La electroforesis en gel de los plásmidos digeridos por restricción con Pmel y Fsel rescatados de transconjugantes pMTL83157 mostró la presencia de los fragmentos esperados (2600 pb y 2424 pb). La electroforesis en gel de los plásmidos digeridos por restricción con NdeI y SacI rescatados de transconjugantes pMTL83157-CODH/ACS mostró la presencia de los fragmentos esperados (4995 pb y 1932 pb).

Ejemplo 7 (ejemplo de referencia)

Este ejemplo demuestra el efecto de la sobreexpresión de CODH/ACS en C. autoethanogenum DSM 10061 cultivado en condiciones de CO.

El efecto de la sobreexpresión de CODH/ACS contra un control de plásmido (pMTL83157) se comparó en experimentos de crecimiento por lotes con CO como única fuente de carbono y energía. En 100 % de CO, la cepa con sobreexpresión de CODH/ACS mostró una reducción en la fase de latencia del crecimiento de 4,2 días, produjo 21 % más etanol y produjo títulos de lactato 2,7 veces mayores generando al mismo tiempo cantidades similares de acetato que el control del plásmido (Figs. 5A-5E).

Ambas cepas se cultivaron de forma autótrofa en 100 % de CO y se ensayaron por triplicado en frascos de suero de 250 ml que contenían 50 ml de medio de PETC y presurizados a 206,84 kPa (30 psi) de CO. El tianfenicol se complementó hasta una concentración final de 7,5 jg/ml. Se inoculó una DO600 de valor 0,5 de cultivo activo en cada frasco de suero y se recogieron muestras de fase líquida para mediciones de DO a una longitud de onda de 600 nm y análisis de metabolitos mediante HPLC.

El análisis de metabolitos se realizó utilizando el sistema de HPLC Varian ProStar equipado con un RID (detector de índice de refracción) operado a 35 °C y una columna Biorad Aminex HPX-87H (1300 x 7,8 mm, tamaño de partícula 9 jm ) mantenida a 35 °C. Se utilizó agua ligeramente acidificada (H2SO40,005 M) como fase móvil con un caudal de 0,5 ml/min. Para eliminar proteínas y otros residuos celulares, las muestras se centrifugaron a 14000 rpm durante 5 minutos y el sobrenadante se filtró con filtros Spartan 13/0,2 RC. Después se inyectaron 20 j l del sobrenadante en la HPLC para análisis.

Ejemplo 8 (ejemplo de referencia)

Este ejemplo describe el efecto esperado de la sobreexpresión de CODH/ACS en C. Ijungdahlii cultivado en condiciones de CO.

El plásmido de sobreexpresión de CODH/ACS descrito anteriormente también se puede introducir en C. Ijungdahlii. C. Ijungdahlii se puede cultivar en 100 % de CO. En estas condiciones, la C. Ijungdahlii que sobreexpresa CODH/ACS debería mostrar una fase de latencia del crecimiento reducida mejorando al mismo tiempo la producción ^{de etanol y lactato en al menos} 20 ^%.

Ejemplo 9 (ejemplo de referencia)

Este ejemplo describe el efecto esperado de la sobreexpresión de CODH/ACS en C. autoethanogenum cultivado en condiciones de CO2 H2.

La cepa con sobreexpresión de CODH/ACS y la cepa de control del plásmido de C. autoethanogenum pueden cultivarse en medios PETC-MES con 80 % de CO2 y 20 % de H2 como únicas fuentes de carbono y energía. En estas condiciones, la C. autoethanogenum que sobreexpresa CODH/ACS debería mostrar una fase de latencia del ^{crecimiento reducida y producción de etanol y lactato aumentada en al menos} 20 ^%.

Ejemplo 10 (ejemplo de referencia)

Este ejemplo demuestra la inactivación de CODH/ACS en C. autoethanogenum DSM10061.

El CODH/ACS cadena arriba (CAETHG_1621) de C. autoethanogenum DSM10061 se inactivó usando la herramienta de alteración génica mediada por intrones del grupo II de ClosTron (Heap, J Microbiol Meth, 80: 49-55, 2010^{). El algoritmo de Perutka alojado en el sitio web de ClosTron se usó para identificar el sitio diana del intrón del} grupo II entre las bases 142/143 en la cadena con sentido de CAETHG_1621. El mismo algoritmo se usó para diseñar la región de direccionamiento de intrones (SEQ ID NO: 17) que fue sintetizada comercialmente por DNA2.0 Inc. (CA) y administrada en el vector pTML007C-E2 (número de referencia de GenBank HQ263410.1). El vector final, pMTL007C-E2-CODH/ACS-142! 143s, contenía un marcador de ermB activado por retro-transposición (RAM) que confirió resistencia a la claritromicina antibiótica al insertarse en el sitio diana.

El plásmido pMTL007C-E2-CODH/ACS-142!143s se conjugó en C. autoethanogenum DSM10061 como se ha descrito anteriormente. Se seleccionaron transconjugantes de C. autoethanogenum utilizando 7,5 pg/ml de tianfenicol mientras que la cepa de E. coli CA434 se contraseleccionó utilizando 10 pg/ml de trimetoprim. Se observaron colonias después de 3 días de incubación. Primero se hicieron secuencialmente estrías de colonias individuales en medios YTF complementados con 7,5 pg/ml de tianfenicol y 10 pg/ml de trimetoprim, seguidos de ^{medios YTF que contienen} 6 ^{pg/ml de claritromicina. Se seleccionaron aleatoriamente >} 8 ^{colonias para la inserción} del grupo II por PCR (kit Maxime PCR PreMix) usando oligonucleótidos flanqueantes.

La amplificación de colonias resistentes a claritromicina usando oligonucleótidos flanqueantes y análisis de electroforesis en gel mostró la presencia de la banda de ClosTron mayor (> 2 kb) en lugar de la banda de tipo silvestre menor (< 520 pb), lo que indicó que el intrón del grupo II de ClosTron se había insertado con éxito en el sitio CODH/ACS especificado. Estos amplicones se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y la secuencia se validó mediante secuenciación de Sanger (Source Bioscience, Reino Unido).

Como una etapa de validación final, los clones verificados por PCR se sometieron a análisis de transferencia de Southern para confirmar la inserción única de ClosTron. Se aisló ADN genómico de los mutantes ClosTron según Bertram, Arch Microbiol, 151: 551-557, 1989 y después se digirió con la enzima de restricción HindIII. Las digestiones se sometieron a análisis de transferencia de Southern utilizando una sonda DIG marcada aleatoriamente (Roche). Se utilizaron oligonucleótidos EBS2 (SEQ ID NO: 27) e Intrón-Sal I-R1 (SEQ ID NO: 28) para generar la sonda, utilizando el plásmido pMTL007C-E2 como un molde. La sonda resultante se hibridó con el intrón del grupo II. El análisis de transferencia de Southern detectó una única banda por clon mutante, lo que indica un único acontecimiento de inserción del intrón del grupo II en el genoma de C. autoethanogenum DSM10061. El mutante validado se denominó CODH/ACS::CTermB-143s (o "mutante de desactivación de CODH/ACS"). Para ensayo de complementación, el plásmido de sobreexpresión pMTL83157-CODH/ACS se conjugó en el mutante de desactivación de CODH/ACS.

En consecuencia, es necesario CODH/ACS para el crecimiento autótrofo (CO o H2 CO2) de C. autoethanogenum. Ejemplo 11 (ejemplo de referencia)

Este ejemplo demuestra el efecto de la inactivación de CODH/ACS en C. autoethanogenum DSM10061 cultivado en fructosa.

^{Mientras que C. autoethanogenum no puede crecer en CO (Fig.} 6^{A) o CO2 y H2 (Fig.} 6^{B) después de la inactivación} de la enzima CODH/ACS, la cepa todavía es capaz de crecer en azúcares, tales como fructosa. Sorprendentemente, se descubrió que, en estas condiciones, la cepa con inactivación de CODH/ACS deja de producir acetato. Esto es especialmente sorprendente ya que la formación de acetato es normalmente una característica distintiva de los acetógenos. Durante el crecimiento heterótrofo, los acetógenos normalmente fijan CO2 (producido durante el metabolismo del azúcar) en presencia de H2 en biomasa y productos a través de las acciones de CODH/ACS y otros genes de la ruta de Wood-Ljungdahl, también conocida como la ruta reductora de acetil-CoA.

El mutante de inactivación de CODH/ACS, la cepa complementada y C. autoethanogenum DSM10061 TS se cultivaron por triplicado en frascos de suero de 250 ml que contenían 50 ml de medio PETC complementado con 10 g/l de fructosa (concentración final) en atmósfera de N2. Se inoculó un equivalente de DO6000,5 de cultivo activo en cada frasco de suero y se recogieron muestras de fase líquida para mediciones de DO a una longitud de onda de 600 nm y análisis de metabolitos mediante HPLC.

La inactivación de CODH/ACS redujo significativamente la DO600 máxima en 61 % desde el nivel de TS de 4,53 a 1.77 (Fig. 7A). Esto también fue acompañado de un aumento en la fase de latencia del crecimiento en el mutante de desactivación de CODH/ACS (Fig. 7A). La complementación de la actividad de CODH/ACS por la expresión del plásmido de pMTL83157-CODH/ACS en mutante de desactivación aumentó la DO600 máxima a 3.11 y también acortó la fase de latencia del crecimiento más cerca del nivel de TS (Fig. 7A).

Una característica sorprendente del mutante de desactivación de CODH/ACS es la falta de producción de acetato, ya que solo se detectó momentáneamente acetato 2,61 mM el día 2,8 (Fig. 7B). Por el contrario, el TS produjo acetato hasta 85,96 mM el día 3,0 (Fig. 7B).

Sin producción significativa de acetato, la mayor parte del carbono de la fructosa se desvió hacia productos reducidos de etanol y 2,3-butanodiol en el mutante de desactivación de CODH/ACS. La inactivación de CODH/ACS aumentó los niveles máximos de etanol en 113 % desde el nivel de TS de 48,3 mM hasta 102,7 mM (Fig. 7C). Asimismo, el nivel máximo de 2,3-butanodiol del mutante de desactivación de CODH/ACS también fue 138 % mayor que el TS (10,95 mM frente a 4,61 mM) (Fig. 7D). La expresión del plásmido de complementación pMTL83157-CODH/ACS en el mutante de desactivación de CODH/ACS restauró con éxito los niveles de acetato, etanol y 2,3-butanodiol más cercanos a los niveles de TS (Fig. 7B-7D), lo que confirma el papel de CODH/ACS en C. autoethanogenum durante el crecimiento heterótrofo.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría particular, parece que la inactivación de CODH/ACS evita que la ruta de Wood-Ljungdahl actúe como sumidero para reducir los equivalentes generados durante la glucólisis, de modo que ^{los equivalentes reductores excesivos generen fuerza motriz para la producción de etanol y 2,3-butanodiol (Fig.} 8^). DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos a las que se hace referencia en el presente documento se resumen brevemente a continuación.

continuación

Se ha de interpretar que los términos "un", "uno/una" y "el/la" y referentes similares en el contexto de descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) abarcan tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene" se deben interpretar como expresiones abiertas (es decir, que significan "incluyendo, pero sin limitación") a menos que se indique otra cosa. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento está destinada meramente a servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que ^{se indique otra cosa en el presente documento y cada valor por separado se incorpora en la memoria descriptiva} como si se citase de manera individual en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o se contradiga claramente de otro modo por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, está destinado meramente a iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique otra cosa. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debería interpretarse como indicativo de que cualquier elemento no

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una bacteria acetógena carboxidotrófica modificada por ingeniería genética que tiene actividad disminuida o eliminada de CODH1 y/o CODH2 en comparación con una bacteria parental.

2. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la bacteria comprende al menos una mutación negativa en un gen CODH1 y/o gen CODH2.

3. La bacteria de la reivindicación 2, en donde la mutación negativa:

(a) disminuye o elimina la expresión del gen CODH1 y/o el gen CODH2 en comparación con una bacteria parental; o

(b) es una mutación de desactivación.

4. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la bacteria tiene además actividad incrementada de CODH/ACS en comparación con la bacteria parental.

5. La bacteria de la reivindicación 4, en donde la bacteria sobreexpresa un gen CODH/ACS en comparación con la bacteria parental.

6. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la bacteria produce:

(a) uno o más de etanol y 2,3-butanodiol; o

(b) una mayor cantidad de etanol, produce una menor cantidad de acetato, tiene una fase de latencia más corta y/o tiene una tasa de crecimiento mayor en comparación con la bacteria parental.

7. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la bacteria consume un sustrato gaseoso que comprende uno o más de CO, CO2 y H2.

8. La bacteria de la reivindicación 1, en donde la bacteria parental es Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii o Clostridium ragsdalei.

9. Un método para producir un producto, que comprende cultivar la bacteria de la reivindicación 1 en presencia de un sustrato gaseoso que comprende uno o más de CO, CO2 y H2, por lo que la bacteria produce el producto.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la bacteria comprende al menos una mutación negativa en un gen CODH1 y/o gen CODH2.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la mutación negativa:

(a) disminuye o elimina la expresión del gen CODH1 y/o el gen CODH2 en comparación con una bacteria parental; o

(b) es una mutación de desactivación.

12. El método de la reivindicación 9, en donde la bacteria tiene además actividad incrementada de CODH/ACS en comparación con la bacteria parental.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la bacteria sobreexpresa un gen CODH/ACS en comparación con la bacteria parental.

14. El método de la reivindicación 9, en donde:

(a) el producto comprende uno o más de etanol y 2,3-butanodiol; o

(b) la bacteria produce una mayor cantidad de etanol, produce una menor cantidad de acetato, tiene una fase de latencia más corta y/o tiene una tasa de crecimiento mayor en comparación con la bacteria parental.

15. El método de la reivindicación 9, en donde la bacteria parental es Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii o Clostridium ragsdalei.