ES2928891T3 - Producción de polihidroxibutirato en microorganismos de Wood-Ljungdahl - Google Patents

Abstract

La invención proporciona microorganismos y métodos para la producción de polihidroxibutirato (PHB) a partir de sustratos gaseosos. En particular, la invención proporciona un microorganismo Wood-Ljungdahl no natural que comprende (a) una enzima que convierte acetil-CoA en acetoacetil-CoA, (b) una enzima que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA y (c) una enzima que convierte 3-hidroxibutiril-CoA en polihidroxibutirato y métodos relacionados con la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de polihidroxibutirato en microorganismos de Wood-Ljungdahl

Campo de la invención

La presente invención se refiere a microorganismos genomodificados y a métodos para la producción de polihidroxibutirato (PHB) por fermentación microbiana, particularmente, por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso.

Antecedentes de la invención

Los plásticos derivados del petróleo se han vuelto esenciales para la vida moderna, en gran parte debido a su ligereza, dureza, durabilidad y resistencia a la degradación. Sin embargo, la dependencia de los plásticos derivados del petróleo ha provocado muchos problemas graves, incluyendo el agotamiento del crudo, la contaminación y su acumulación en vertederos. Para disminuir el impacto ambiental de los plásticos, se están realizando intentos para reemplazar los polímeros derivados del petróleo convencionales con biopolímeros tales como polilactida, polisacáridos, poliésteres alifáticos y polihidroxialcanoatos, que poseen propiedades fisicoquímicas similares a las de los plásticos convencionales (Anjum, Int J Biol Macromol, 89: 161-174, 2016). Sin embargo, los microorganismos y los métodos de producción de dichos biopolímeros están aún muy poco desarrollados. C. Humphreys et al.: "Whole genome sequence and manual annotation of Clostridium autoethanogenum, an industrially relevant bacterium", BMC GENOMICS, vol.

16, no. 1, 2015, enseñan que Clostridium autoethanogenum es una bacteria acetógena capaz de producir biocombustibles y productos químicos básicos de alto valor a partir de los gases C1 presentes en el gas de síntesis mediante la acción de la vía reductora de la acetil-CoA (Wood-Ljungdahl).

En el documento US-A1-2009/191593 se desvelan microorganismos de origen no natural que pueden convertir CO y ^H2 ^{o CO}2 ^{y H}2 ^{en acetil-coenzima A.}

J. Mifune et al.: "Engineering of pha operon on Cupriavidus necator chromosome for efficient biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) from vegetable oil", POLYMER DEGRADATION AND ^s T^a BILITY, vol. 95, ^n.° 8^{, páginas 1305-1312, enseñan la síntesis de polihidroxibutirato en Cupriavidus necator a partir de acetil-CoA.}

Sumario de la invención

La invención proporciona un microorganismo genomodificado capaz de producir PHB. En concreto, la invención proporciona un microorganismo de Wood-Ljungdahl de origen no natural capaz de producir polihidroxibutirato que comprende:

a. un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga acetil-CoA C-acetiltransferasa (EC 2.3.1.9) que convierte acetil-CoA en acetoacetil-CoA,

b. un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga acetoacetil-CoA reductasa (EC 1.1.1.36) o un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (EC 1.1.1.157) que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA y c. un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga polihidroxialcanoato sintasa (EC 2.3.1.-) que convierte 3-hidroxibutiril-CoA en polihidroxibutirato.

La enzima que convierte la acetil-CoA en acetoacetil-CoA es una acetil-CoA C-acetiltransferasa (EC 2.3.1.9). Por ejemplo, la acetil-CoA C-acetiltransferasa puede obtenerse de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida o Streptomyces coelicolor.

La enzima que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA es una acetoacetil-CoA reductasa (EC 1.1.1.36) o una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (EC 1.1.1.157). Por ejemplo, la acetoacetil-CoA reductasa puede obtenerse de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida o Streptomyces coelicolor. En otro ejemplo, la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa puede obtenerse de Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum o Clostridium kluyveri.

La enzima que convierte la 3-hidroxibutiril-CoA en polihidroxibutirato es una polihidroxialcanoato sintasa (EC 2.3.1.-). Por ejemplo, la polihidroxialcanoato sintasa puede obtenerse de Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum o Streptomyces coelicolor.

En una realización, el microorganismo es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa, y Thermoanaerobacter. Por ejemplo, el microorganismo puede obtenerse de un microorganismo precursor seleccionado del grupo que consiste en Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides y Thermoanaerobacter kiuvi. En una realización preferida, el microorganismo se selecciona de una bacteria precursora seleccionada del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii y Clostridium ragsdalei. En una realización, el microorganismo consume sustratos gaseosos que comprenden uno o más de CO, CO² y H². En otra realización, el microorganismo es anaerobio. En otra realización más, el microorganismo no es capaz de degradar el PHB.

La invención también proporciona un método para producir PHB, que comprende cultivar el microorganismo de la invención en presencia de un sustrato gaseoso. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede comprender uno o más de CO, CO² y H². En una realización, el cultivo se realiza en condiciones anaerobias. En otra realización, el cultivo se realiza sin sustratos hidrocarbonados. En otra realización más, el cultivo se realiza sin luz.

Estas y otras características y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción detallada junto con las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que muestra una vía enzimática para la producción de polihidroxibutirato (PHB).

La figura 2 es un mapa plasmídico de pPHB_01.

La figura 3 es un gráfico que muestra la producción de PHB en C. autoethanogenum que lleva un plásmido con una vía de biosíntesis de PHB (pPHB_01) o un plásmido vacío (pMTL83157) como control negativo. Las bacterias se cultivaron en condiciones anaerobias en frascos clasificados a presión sólo con CO y CO² como fuentes de carbono. El rendimiento de PHB (expresado como % en peso de masa celular seca) se determinó mediante HPLC (high performance liquid chromatography, cromatografía líquida de alta resolución). Los valores representan promedios de muestras biológicas por triplicado más o menos las desviaciones estándar sobre esos promedios. En muestras que comprendían el plásmido pMTL83157 (vacío), no se detectó PHB.

Las figuras 4A-4D son gráficos que muestran el crecimiento de C. autoethanogenum en diversas condiciones de crecimiento. Las bacterias comprendían un plásmido vacío (pMTL83157) o un plásmido que comprendía la vía de síntesis de PHB (pPHB_01). Cada gráfica representa un conjunto diferente de condiciones. La figura 4A (condición 1) muestra una repetición de las condiciones utilizadas para generar los datos observados en la figura 3, utilizando una mezcla de gases compuesta por 50/18/3/29 de CO/CO²/H²/N² como única fuente de carbono. La figura 4B ^(condición 2^{) muestra condiciones idénticas a las de la condición} 1 ^{pero con un nuevo sustrato gaseoso} (50/30/10/10 CO/CO²/H²/N²). La figura 4C (condición 3) muestra condiciones idénticas a las de la condición 2 pero con un tiempo de incubación prolongado. La figura 4D (condición 4) muestra condiciones idénticas a las de la condición 3 pero con renovación periódica del sustrato gaseoso. Los valores representan promedios de muestras biológicas por triplicado más o menos las desviaciones estándar sobre esos promedios.

La figura 5 es un gráfico que muestra la producción de PHB en C. autoethanogenum en las condiciones 1-4, como se describe en relación con las figuras 4A-4D. Los valores representan promedios de muestras biológicas por triplicado más o menos las desviaciones estándar sobre esos promedios. En muestras que comprendían el plásmido pMTL83157 (vacío), no se detectó PHB.

^{La figura} 6 ^{es un gráfico que muestra la producción de PHB en C. autoethanogenum a partir de fuentes de carbono} gaseoso en una fermentación continua. Las bacterias se conjugaron con el plásmido pPHB_01 que comprendía una vía de síntesis de PHB. Al finalizar la fermentación se midió el PHB. Los sustratos gaseosos comprendían hidrógeno al 20 % o hidrógeno al 2 % como parte de sus mezclas de 50/20/20/10 de CO/CO²/H²/Ar o 50/20/2/28 de CO/CO²/H²/N² , respectivamente. Se mantuvo un pH de 5. Los valores representan promedios de fermentaciones por duplicado más o menos las desviaciones estándar sobre esos promedios.

La figura 7 es un gráfico que muestra una mayor producción de PHB en C. autoethanogenum a partir de fuentes de carbono gaseoso en una fermentación continua. Las bacterias se conjugaron con el plásmido pPHB_01 que comprendía una vía de síntesis de PHB. Al finalizar la fermentación se midió el PHB. Los sustratos gaseosos comprendían hidrógeno al 20 % o hidrógeno al 2 % como parte de sus mezclas de 50/20/20/10 de CO/CO²/H²/Ar o 50/20/2/28 de CO/CO²/H²/N² , respectivamente. Con hidrógeno al 20 %, la menor concentración de biomasa tuvo una concentración de biomasa disminuida en comparación con la de los otros procesos. Con hidrógeno al 20 %, ^{el pH se modificó, comenzando con un pH de} 6 ^{que después se redujo a 5,5. Con hidrógeno al 20 %, se mantuvo un pH de} 6 ^{durante todo el proceso de fermentación hasta que los cultivos disminuyeron. Los valores representan} promedios de fermentaciones por duplicado más o menos las desviaciones estándar sobre esos promedios.

^{La figura} 8 ^{es un gráfico que muestra valores de PHB de simulaciones que utilizan reconstrucciones de modelos} metabólicos a escala genómica (GEM). El PHB detectado experimentalmente se comparó con los niveles de PHB predichos por GEM utilizando la maximización del rendimiento de PHB. También se probó la maximización del rendimiento de PHB con una captación de 2 mmol/g de PCS/h de NADH, NADPH, Fd^red o ATP. Las condiciones probadas fueron PHB20 (control); PHBMcB (Menor concentración de Biomasa) y PHBpH5,5 (pH de 5,5). Se descubrió que el ATP era el que más limitaba el PHB (se alcanzó un valor de PHB más alto), seguido de Fd^red, NADPH y por último NADH. Los datos representan un promedio ± error estándar de dos quimiostatos de copias biológicas.

Descripción de la invención

Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que los procesos catalíticos, tales como el proceso de Fischer-Tropsch, pueden utilizarse para convertir gases que comprenden dióxido de carbono (CO²), monóxido de carbono (CO) y/o hidrógeno (H2), tal como gas residual industrial o gas de síntesis (sintegás), en diversos combustibles y productos químicos. Sin embargo, recientemente, la fermentación de gases ha surgido como una plataforma alternativa para la fijación biológica de dichos gases. En concreto, se ha demostrado que los microorganismos acetógenos (es decir, Wood-Ljungdahl) convierten gases que comprenden CO, CO² y/o H² en productos tales como etanol y 2,3-butanodiol. La conveniencia de producir moléculas poliméricas más complejas, tal como PHB, a partir de estos gases, está bien documentada (Drzyzga, J Chem Technol Biotechnol, 90: 1735-1751, 2015). Sin embargo, la vía de Wood-Ljungdahl actúa en el límite termodinámico de la vida (Schuchmann, Nat Rev Microbiol, 12: 809-821,2014), lo que dificulta que los microorganismos de Wood-Ljungdahl acumulen incluso suficiente carbono para el crecimiento y el mantenimiento de las células, y mucho menos producir productos de carbono complejos. Estas dificultades metabólicas se ven agravadas por la mala disolución de los sustratos gaseosos (p. ej., CO, CO² y/o H²) en los medios de fermentación, en comparación con los sustratos hidrocarbonados o glucídicos. Por lo tanto, parece poco probable que puedan diseñarse microorganismos de Wood-Ljungdahl para sintetizar PHB u otros polihidroxialcanoatos, especialmente porque estos polímeros los producen de manera natural especies tales como Rhodospirillum rubrum y Cupriavidus necator como un medio para almacenar el exceso de carbono. De hecho, hasta la fecha, los intentos de diseñar microorganismos acetógenos para producir PHB a partir de CO, CO² y/o H² han sido infructuosos (The European SYNPOL Project, Biopolymers from syngas fermentation, 2012-2017).

Sin embargo, después de diligentes esfuerzos de investigación e ingeniería, los inventores han conseguido por primera vez, la síntesis de PHB en microorganismos de Wood-Ljungdahl. Esto representa un hito importante en el camino hacia la producción de biopolímeros renovables y sostenibles.

En un primer aspecto, la invención proporciona un microorganismo de Wood-Ljungdahl capaz de producir PHB. En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para producir PHB mediante el cultivo del microorganismo de Wood-Ljungdahl anteriormente mencionado en presencia de un sustrato gaseoso.

Vía

Dado que los microorganismos de Wood-Ljungdahl no producen PHB de manera natural, la producción de PHB en un microorganismo de Wood-Ljungdahl requiere la introducción de al menos una enzima heteróloga. El microorganismo ^{de la invención generalmente comprende tres enzimas heterólogas, de acuerdo con la reivindicación} 1^{, más} específicamente (a) una enzima que convierte la acetil-CoA en acetoacetil-CoA, (b) una enzima que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA y (c) una enzima que convierte 3-hidroxibutiril-CoA en polihidroxibutirato. Esta ^{vía se muestra en la figura} 1^.

(1) Conversión de acetil-CoA en acetoacetil-CoA

La conversión de acetil-CoA en acetoacetil-CoA la cataliza una enzima heteróloga (es decir, no natural). La enzima es la acetil-CoA C-acetiltransferasa (también conocida como tiolasa o 3-cetotiolasa), que tiene actividad definida por EC 2.3.1.9 (es decir, 2 acetil-CoA ^ CoA acetoacetil-CoA). La acetil-CoA C-acetiltransferasa puede obtenerse de cualquier microorganismo hospedador adecuado, tal como Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida o Streptomyces coelicolor.

En concreto, la acetil-CoA C-acetiltransferasa puede ser o puede obtenerse de Acinetobacter baumannii PhaA (SCZ16966), Aeromonas hydrophilia PhaA (WP_043162470), Alcaligenes latus PhaA (AAC83659), Arthrospira platensis PhaA (WP_006617472), Bacillus subtilis PhaA (CUB52080), Burkholderia cepacia PhaA (WP_043187452), Clostridium acetobutylicum ThIA (WP_0109661571), Cupriavidus necator PhaA (WP_013956452.1), Cupriavidus necator BktB (WP_011615089.1), Cupriavidus necator phaA (WP_010810132.1), Escherichia coli AtoB (NP_416728.1), Haloferax mediterranei PhaA (WP_004059344), Pseudomonas aeruginosa PhaA (WP_038823536), Pseudomonas fluorescens PhaA (WP_073525707), Pseudomonas mandelii PhaA (WP_019582144), Pseudomonas oleovorans PhaA (WP_0748593l4), Pseudomonas putida PhaA (WP_058540218) o Streptomyces coelicolor PhaA (WP_011030221).

(2) Conversión de acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA

La conversión de acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA la cataliza una enzima heteróloga (es decir, no natural). La enzima es la acetoacetil-CoA reductasa, que tiene actividad definida por EC 1.1.1.36 (es decir, (R)-3-hidroxiacil-CoA NADP+ ^ 3-oxoacil-CoA NADPH H+). La acetoacetil-CoA reductasa puede obtenerse de cualquier microorganismo hospedador adecuado, tal como Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida o Streptomyces coelicolor. En concreto, la acetoacetil-CoA reductasa puede ser de Acinetobacter baumannii PhaB (WP_095389464), Aeromonas hydrophilia PhaB (WP_041216919), Alcaligenes latus PhaB (AAC83660), Arthrospira platensis PhaB (WP_043469113), Bacillus subtilis PhaB (WP_070548955), Burkholderia cepacia PhaB (WP_059234032), Cupriavidus necator PhaB (WP_010810131.1), Haloferax mediterranei PhaB (WP_004572392), Pseudomonas aeruginosa PhaB (WP _031690879), Pseudomonas fluorescens PhaB (WP_030141425), Pseudomonas mandelii PhaB (WP_094467462), Pseudomonas oleovorans PhaB (WP_074858624), Pseudomonas putida PhaB (BAB96554) o Streptomyces coelicolor PhaB (WP_011027734). En otra realización preferida, la enzima es 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, que tiene actividad definida por EC 1.1.1.157 (es decir, (S)-3-hidroxibutanoil-CoA NADP+ = 3-acetoacetil-CoA NADPH H+). La 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa puede ser o puede obtenerse de cualquier microorganismo hospedador adecuado, tal como Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum o Clostridium kluyveri. En concreto, la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa puede ser de Clostridium beijerinckii Hbd (WP_011967675.1), Clostridium acetobutylicum Hbd (NP_349314.1) o Clostridium kluyveri Hbd1 (WP_011989027.1).

Preferentemente, la enzima que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA es específica de (R), es decir, produce (R)-3-hidroxibutiril-CoA, ya que la (R)-3-hidroxibutiril-CoA es el sustrato clásico para la producción enzimática de PHB. Sin embargo, en algunos casos, la enzima que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA es específica de (S), es decir, produce (S)-3-hidroxibutiril-CoA. Sin desear quedar ligado a teoría alguna en particular, los inventores creen que la actividad epimerasa natural o introducida en bacterias acetógenas puede permitir la interconversión de (S)- y (R)-3-hidroxibutiril-CoA, dicha (S)-3-hidroxibutiril-CoA puede convertirse en (R)-3-hidroxibutiril-CoA, que después puede convertirse en PHB.

(3) Conversión de 3-hidroxibutiril-CoA en PHB

La conversión de 3-hidroxibutiril-CoA en PHB la cataliza una enzima heteróloga (es decir, no natural). La enzima es polihidroxialcanoato sintasa, que tiene actividad definida por EC 2.3.1.-, tal como EC 2.3.1.B2 (tipo I) (es decir, 3-^{hidroxibutiril-CoA [(R)-3-hidroxibutanoato]n = [(R)-}3^{-hidroxibutanoato]n+1 CoA), EC 2.3.1.B3 (tipo II) (es decir, 3-hidroxiacil-CoA [(R)-3-hidroxiacil]n = [(R)-}3^{-hidroxiacil]n+1 CoA) o e C 2.3.1.B4 (tipo III) (es decir, 3-hidroxiacil-CoA [(R)-3-hidroxiacil]n = [(R)-}3^{-hidroxiacil]n+1 CoA). Esta enzima también puede denominarse polihidroxialcanoato} polimerasa, polihidroxibutirato sintasa, polihidroxibutirato polimerasa, y similares. La polihidroxialcanoato sintasa puede obtenerse de cualquier microorganismo hospedador adecuado, tal como Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum o Streptomyces coelicolor. En concreto, la polihidroxialcanoato sintasa puede ser o puede obtenerse de Acinetobacter baumannii PhaC (SCY71072), Aeromonas cavia PhaC (WP_045524574), Aeromonas hydrophilia PhaC1 (WP_017780191) o PhaC2 (AAV41872), Alcaligenes latus PhaC (WP_084267317), Arthrospira platensis PhaC (WP_006617456), Bacillus subtilis PhaC (CUB58881), Burkholderia cepacia PhaC (WP_027784567), Cupriavidus necator PhaC (WP_011615085 o WP_013956451.1), Haloferax mediterranei PhaC (WP_004056138), Pseudomonas aeruginosa PhaC1 (WP_038823539) o PhaC2 (WP_025271419), Pseudomonas fluorescens PhaC1 (WP_057399292) o PhaC2 (WP_030141001), Pseudomonas mandelii PhaC1 (WP_094467460) o PhaC2 (WP_010465951), Pseudomonas oleovorans PhaC1 (AAL17611) o PhaC2 (WP_037049875), Pseudomonas putida PhaC1 (BAB96552) o PhaC2 (WP _029886362), Pseudomonas sp. 61-3 PhaC1 (BAA36198) o PhaC2 (BAA36202), Rhodospirillum rubrum PhaC1 (WP_011388028), PhaC2 (WP_011390166) o PhaC3 (WP_011398569) o Streptomyces coelicolor PhaC.

Se pueden introducir una o más mutaciones interruptoras en una o más enzimas endógenas para reducir o eliminar la competencia con las enzimas heterólogas introducidas. En concreto, una "mutación interruptora" es una mutación que reduce o elimina (es decir, "interrumpe") la expresión o actividad de un gen o enzima. La mutación interruptora puede inactivar parcialmente, inactivar totalmente o delecionar el gen o la enzima. La mutación interruptora puede ser una mutación inactivadora (KO, del inglés "knockout"). La mutación interruptora puede ser cualquier mutación que reduzca, impida o bloquee la biosíntesis de un producto generado por una enzima. La mutación interruptora puede incluir, por ejemplo, una mutación en un gen que codifica una enzima, una mutación en un elemento regulador genético implicado en la expresión de un gen que codifica una enzima, la introducción de un ácido nucleico que produce una proteína que reduce o inhibe la actividad de una enzima o la introducción de un ácido nucleico (p. ej., ARN antisentido, ARNip, ARN guía) y/o proteína (p. ej., una proteína Cas) que inhibe la expresión de una enzima. La mutación interruptora puede introducirse utilizando cualquier método conocido en la técnica.

Por ejemplo, el microorganismo de la invención puede tener una mutación interruptora en una enzima tioesterasa endógena. Se han identificado tres supuestas tioesterasas en Clostridium autoethanogenum: (1) "tioesterasa 1" (AGY74947.1; anotada como palmitoil-CoA hidrolasa), (2) "tioesterasa 2" (AGY75747.1; anotada como 4-hidroxibenzoil-CoA tioesterasa) y (3) "tioesterasa 3" (AGY75999.1; anotada como supuesta tioesterasa). También se han identificado tres supuestas tioesterasas en Clostridium Ijungdahlii: (1) "tioesterasa 1" (ADK15695.1; anotada como predicha acil-CoA tioesterasa 1), (2) "tioesterasa 2" (ADK16655.1; anotada como predicha tioesterasa) y (3) "tioesterasa 3" (ADK16959.1; anotada como predicha tioesterasa). La mutación interruptora puede afectar a cualquiera de estas tioesterasas o a cualquier otra tioesterasa que pueda ser endógena al microorganismo de la invención.

Microorganismo

Un "microorganismo" es un organismo microscópico, especialmente una bacteria, arquea, virus u hongo. El microorganismo de la invención es normalmente una bacteria. Como se usa en el presente documento, la referencia a un "microorganismo" debe considerarse que abarca un "bacteria".

El microorganismo de la invención es de origen no natural. La expresión "de origen no natural", cuando se usa en referencia a un microorganismo, pretende significar que el organismo tiene al menos una modificación genética que normalmente no se encuentra en una cepa de origen natural de la especie de referencia, incluidas las cepas de tipo silvestre de las especies de referencia. Los microorganismos de origen no natural se desarrollan normalmente en un laboratorio o centro de investigación. Por el contrario, "tipo silvestre" se refiere a la forma clásica de un organismo, cepa, gen o característica tal como se presenta en la naturaleza.

Las expresiones "modificación genética", "alteración genética", o "ingeniería genética", se refieren en términos generales a la manipulación artificial (hecha por el hombre) del genoma o de los ácidos nucleicos de un microorganismo. Del mismo modo, las expresiones "modificado genéticamente", "alterado genéticamente", o "genomodificado", se refieren a un microorganismo que comprende dicha modificación genética, alteración genética o genomodificación. Estos términos pueden usarse para diferenciar un microorganismo generado en laboratorio de un microorganismo de origen natural. Los métodos de modificación genética incluyen, por ejemplo, expresión de genes heterólogos, inserción o deleción de genes o promotores, mutación de ácidos nucleicos, expresión génica alterada o inactivación, ingeniería enzimática, evolución dirigida, diseño basado en el conocimiento, métodos de mutagénesis aleatoria, reordenación de genes y optimización de codones.

"Recombinante" indica que un ácido nucleico, una proteína o un microorganismo es el producto de una modificación genética, genomodificación o recombinación. En general, el término "recombinante" se refiere a un ácido nucleico, a una proteína o a un microorganismo que comprende, o está codificado por, material genético procedente de numerosas fuentes, tal como dos o más cepas o especies diferentes de microorganismos. El microorganismo de la invención es normalmente un recombinante.

La expresión "procedente de" indica que un ácido nucleico, una proteína o un microorganismo se modifica o adapta a partir de un ácido nucleico, una proteína o un microorganismo (p. ej., un precursor o de tipo silvestre) diferente, para producir un ácido nucleico, una proteína o un microorganismo nuevo. Dichas modificaciones o adaptaciones normalmente incluyen inserción, deleción, mutación o sustitución de ácidos nucleicos o genes. En general, el microorganismo de la invención procede de un "microorganismo precursor", que es un microorganismo que se utiliza para generar un microorganismo de la invención. El microorganismo precursor puede ser un microorganismo de origen natural (es decir, un microorganismo de tipo silvestre) o un microorganismo que se ha modificado previamente (es decir, un microorganismo mutante o recombinante). El microorganismo de la invención puede modificarse para que exprese o sobreexprese una o más enzimas que no se expresaban o sobreexpresaban en el microorganismo precursor. De forma similar, el microorganismo de la invención puede modificarse para que comprenda uno o más genes que no estaban comprendidos en el microorganismo precursor. El microorganismo de la invención también puede modificarse para que no exprese o para que exprese menores cantidades de una o más enzimas que se expresaban en el microorganismo precursor. En una realización, el microorganismo de la invención procede de un microorganismo precursor seleccionado del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii o Clostridium ragsdalei. En una realización preferida, el microorganismo de la invención se selecciona del microorganismo precursor Clostridium autoethanogenum LZ1561, que se depositó el 7 de junio de 2010 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH) ubicada en Inhoffenstrap 7B, D-38124 Braunschwieg, Alemania, el 7 de junio de junio de 2010 según los términos del Tratado de Budapest y el número de registro asignado DSM23693. Esta cepa se describe en la solicitud de patente internacional n.° PCT/NZ2011/000144, que se publicó como documento WO 2012/015317.

El microorganismo de la invención también puede clasificarse basándose en características funcionales. El microorganismo de la invención es un microorganismo de Wood-Ljungdahl de origen no natural y puede ser un microorganismo fijador de C1, un anaerobio, un acetógeno, un etanológeno y/o un carboxidótrofo. La Tabla 1 proporciona una lista representativa de microorganismos e identifica sus características funcionales.

1 Acetobacterium woodi puede producir etanol a partir de fructosa, pero no a partir de gas.

² No se ha investigado si Clostridium magnum puede crecer con CO.

³ Una cepa de Moorella thermoacetica, HUC22-1 de Moorella sp., se ha indicado que produce etanol a partir de gas.

⁴ No se ha investigado si Sporomusa ovata puede crecer con CO.

⁵ No se ha investigado si Sporomusa silvacetica puede crecer con CO.

⁶ No se ha investigado si Sporomusa sphaeroides puede crecer con CO.

"Wood-Ljungdahl" se refiere a la vía de Wood-Ljungdahl de fijación de carbono como se describe, p. ej., en Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008. "Microorganismos de Wood-Ljungdahl" se refiere, como era de esperar, a microorganismos que comprenden la vía de Wood-Ljungdahl. En general, el microorganismo de la invención comprende una vía de Wood-Ljungdahl natural. En el presente documento, una vía de Wood-Ljungdahl puede ser una vía de Wood-Ljungdahl natural, no modificada o puede ser una vía de Wood-Ljungdahl con cierto grado de modificación genética (p. ej., sobreexpresión, expresión heteróloga, inactivación, etc), siempre que siga manteniendo la función de convertir Co , CO² y/o CH² en acetil-CoA.

"C1" se refiere a una molécula de un carbono, por ejemplo, CO, CO² o CH³OH. "C1-oxigenado" se refiere a una molécula de un carbono que también comprende al menos un átomo de oxígeno, por ejemplo, CO, CO² o CH³OH. "Fuente de carbono C1" se refiere a una molécula de carbono que sirve como fuente de carbono parcial o única para ^{el microorganismo de la invención. Por ejemplo, una fuente de carbono C}1 ^{puede comprender uno o más de CO, CO2 ,} CH³OH o CH²O². Preferentemente, la fuente de carbono C1 comprende uno o ambos de CO y CO². Un "microorganismo fijador de C1" es un microorganismo que tiene la capacidad de producir uno o más productos a partir de una fuente de carbono C1. Normalmente, el microorganismo de la invención es una bacteria fijadora de C1. El microorganismo puede seleccionarse de un microorganismo fijador de C1 identificado en la Tabla 1. El metano (CH⁴) podría considerarse como una fuente de carbono C1, pero solo si la bacteria de la invención fue diseñada para comprender una vía metabólica de metano, como se describe, p. ej., en el documento WO 2016/138050, dado que las bacterias acetógenas no son capaces de usar metano de manera natural como fuente de carbono.

Un "anaerobio" es un microorganismo que no requiere oxígeno para su crecimiento. Un anaerobio puede reaccionar negativamente o incluso morir si hay oxígeno por encima de un umbral determinado. Sin embargo, algunos anaerobios son capaces de tolerar niveles bajos de oxígeno (p. ej., oxígeno al 0,000001-5 %). Normalmente, el microorganismo de la invención es un anaerobio. En una realización preferida, el microorganismo de la invención es un anaerobio identificado en la Tabla 1.

Los "acetógenos" son bacterias anaerobias obligadas que utilizan la vía de Wood-Ljungdahl como su mecanismo principal para la conservación de energía y para la síntesis de acetil-CoA y productos derivados de acetil-CoA, tales como acetato (Ragsdale, Biochim Biophys Acta, 1784: 1873-1898, 2008). Los acetógenos utilizan la vía de Wood-Ljungdahl como un (1) mecanismo para la síntesis reductora de acetil-CoA a partir de CO² , (2) terminal de aceptación de electrones, proceso de conservación de energía, (3) mecanismo para la fijación (asimilación) de CO² en la síntesis de carbono celular (Drake, Acetogenic Prokaryotes, En: The Prokaryotes, 3a edición, pág. 354, Nueva York, NY, 2006). Todos los acetógenos de origen natural son fijadores de C1, anaerobios, autótrofos y no metanótrofos. Normalmente, el microorganismo de la invención es un acetógeno. El microorganismo puede seleccionarse de un acetógeno identificado en la Tabla 1.

Un "etanológeno" es un microorganismo que produce o es capaz de producir etanol. Normalmente, el microorganismo de la invención es un etanológeno. El microorganismo puede seleccionarse de un etanológeno identificado en la Tabla 1.

Un "autótrofo" es un microorganismo capaz de crecer sin carbono orgánico. En cambio, los autótrofos utilizan fuentes de carbono inorgánico, tales como CO y/o CO². Normalmente, el microorganismo de la invención es un autótrofo. El microorganismo puede seleccionarse de un autótrofo identificado en la Tabla 1.

Un "carboxidótrofo" es un microorganismo capaz de utilizar CO como única fuente de carbono y energía. Normalmente, el microorganismo de la invención es un carboxidótrofo. El microorganismo puede seleccionarse de un carboxidótrofo identificado en la Tabla 1.

De manera más amplia, el microorganismo de la invención puede seleccionarse de cualquier género o especie identificado en la Tabla 1. Por ejemplo, el microorganismo puede ser un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa y Thermoanaerobacter. En concreto, el microorganismo puede seleccionarse de una bacteria precursora seleccionada del grupo que consiste en Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides y Thermoanaerobacter kiuvi.

En una realización preferida, el microorganismo de la invención se selecciona del grupo de Clostridia que comprende las especies Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii y Clostridium ragsdalei. Estas especies fueron informadas y caracterizadas por primera vez por Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351,1994 (Clostridium autoethanogenum), Tanner, Int J System Bacteriol, 43: 232-236, 1993 (Clostridium ljungdahlii) y Huhnke, documento WO 2008/028055 (Clostridium ragsdalei).

Estas especies tienen muchas similitudes. En concreto, todas estas especies son miembros fijadores de C1, anaerobios, acetógenos, etanológenos y carboxidotrofos del género Clostridium. Estas especies tienen genotipos y fenotipos y modos de conservación de energía y metabolismo fermentativo similares. Asimismo, estas especies están agrupadas en el grupo I de homología de ARNr de los clostridios con ADN de ARNr 16S que tiene una identidad mayor del 99 %, tienen un contenido de G+C en el ADN de aproximadamente 22-30 % en moles, son grampositivas, tienen una morfología y un tamaño similares (células en crecimiento logarítmico entre 0,5-0,7 * 3-5 pm), son mesófilas (crecen de manera óptima a 30-37 °C), tienen intervalos de pH similares de aproximadamente 4-7,5 (con un pH óptimo de aproximadamente 5,5-6), carecen de citocromos y conservan energía a través de un complejo de Rnf. Además, en estas especies, se ha demostrado la reducción de ácidos carboxílicos en sus correspondientes alcoholes (Perez, Biotechnol Bioeng, 110:1066-1077, 2012). Es importante destacar que, estas especies también muestran un fuerte crecimiento autótrofo en gases que comprenden CO, producen etanol y acetato (o ácido acético) como principales productos de fermentación y producen pequeñas cantidades de 2,3-butanodiol y ácido láctico en determinadas condiciones.

Sin embargo, estas tres especies también tienen diversas diferencias. Estas especies se aislaron de diferentes fuentes: Clostridium autoethanogenum de intestino de conejo, Clostridium ljungdahlii de desechos de gallinero y Clostridium ragsdalei de sedimentos de agua dulce. Estas especies difieren en la utilización de diversos azúcares (p. ej., ramnosa, arabinosa), ácidos (p. ej., gluconato, citrato), aminoácidos (p. ej., arginina, histidina) y otros sustratos (p. ej., betaína, butanol). Asimismo, estas especies difieren en la auxotrofía de determinadas vitaminas (p. ej., tiamina, biotina). Estas especies tienen diferencias en las secuencias de los ácidos nucleicos y de aminoácidos de los genes y proteínas de la vía de Wood-Ljungdahl, aunque se ha comprobado que la organización general y el número de estos ^{genes y proteínas son idénticos en todas las especies (Kopke, Curr Opin Biotechnol,} 22^{: 320-325,} 2011^).

Por tanto, resumiendo, muchas de las características de Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii o Clostridium ragsdalei, no son específicas de esa especie, sino que más bien son características generales de este grupo de miembros fijadores de C1, anaerobios, acetógenos, etanológenos y carboxidotrofos del género Clostridium. Sin embargo, dado que estas especies son, de hecho, distintas, la modificación o manipulación genética de una de estas especies puede que no tenga el mismo efecto en otra de estas especies. Por ejemplo, pueden observarse diferencias en el crecimiento, el rendimiento o la producción del producto.

El microorganismo de la invención también puede seleccionarse de un aislado o mutante de Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii o Clostridium ragsdalei. Los aislados y mutantes de Clostridium autoethanogenum incluyen JA1-1 (DSM10061) (Abrini, Arch Microbiol, 161: 345-351, 1994), LBS1560 (DSM19630) (documento WO 2009/064200) y LZ1561 (DSM23693) (documento WO 2012/015317). Los aislados y mutantes de Clostridium ljungdahlii incluyen A^t CC 49587 (Tanner, Int J Syst Bacteriol, 43: 232-236, 1993), PET^c T (DSM13528, ATCC 55383), ERI-2 (ATCC 55380) (documento US 5.593.886), C-01 (ATCC 55988) (documento US 6.368.819), O-52 (ATCC 55989) (documento US 6.368.819) y OTA-1 (Tirado-Acevedo, Production of bioethanol from synthesis gas using Clostridium ljungdahlii, tesis doctoral, North Carolina State University, 2010). Los aislados y mutantes de Clostridium ragsdalei incluyen PI 1 (ATCC BAA-622, ATCC PTA-7826) (documento w O 2008/028055).

Preferentemente, el microorganismo de la invención no es fotótrofo ni fotosintético. Preferentemente, el microorganismo de la invención no es metanótrofo.

Preferentemente, el microorganismo de la invención no es miembro del género Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Cupriavidus (Ralstonia), Rhizobium, Rhodospirillum o Pseudomonas. En concreto, preferentemente, el microorganismo de la invención no procede de Rhodospirillum rubrum, Bacillus cereus, Cupriavidus nacator (anteriormente Ralstonia eutropha) o Pseudomonas putida Preferentemente, el microorganismo de la invención no procede de Escherichia coli.

Enzimas

"Endógeno" o "natural" se refiere a un ácido nucleico o a una proteína que está presente o que se expresa en el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que procede el microorganismo de la invención. Por ejemplo, un gen endógeno o una proteína endógena es un gen o una proteína que está presente de manera natural en el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que procede el microorganismo de la invención. La expresión de un gen endógeno puede estar controlada por un elemento regulador exógeno, tal como un promotor exógeno.

"Exógeno" se refiere a un ácido nucleico o a una proteína que se origina fuera del microorganismo de la invención. Por ejemplo, un gen exógeno o una enzima exógena puede crearse artificialmente o de forma recombinante e introducirse o expresarse en el microorganismo de la invención. También se puede aislar un gen exógeno o una enzima exógena de un microorganismo heterólogo e introducirse o expresarse en el microorganismo de la invención. Los ácidos nucleicos exógenos pueden adaptarse para integrarse en el genoma del microorganismo de la invención o para permanecer en un estado extracromosómico en el microorganismo de la invención, por ejemplo, en un plásmido.

"Heterólogo" se refiere a un ácido nucleico o a una proteína que no está presente en el microorganismo de tipo silvestre o precursor del que procede el microorganismo de la invención. Por ejemplo, un gen heterólogo o una enzima heteróloga puede proceder de una cepa o de una especie diferente e introducirse o expresarse en el microorganismo de la invención.

Las enzimas que (a) convierten acetil-CoA en acetoacetil-CoA, (b) convierten acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA o (c) convierten 3-hidroxibutiril-CoA en PHB, según la reivindicación 1, son heterólogas (es decir, no naturales) para la bacteria.

Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso por el cual un polinucleótido se transcribe a partir de un molde de ADN (tal como en un ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso por el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas.

"Actividad enzimática", o simplemente "actividad", se refiere, en líneas generales, a actividad enzimática, incluyendo, aunque sin limitación, la actividad de una enzima, la cantidad de una enzima o la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción. Por consiguiente, "aumentar" la actividad enzimática incluye aumentar la actividad de una enzima, aumentar la cantidad de una enzima o aumentar la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción. De forma similar, "disminuir" la actividad enzimática incluye disminuir la actividad de una enzima, disminuir la cantidad de una enzima o disminuir la disponibilidad de una enzima para catalizar una reacción.

"Optimización de codones" se refiere a la mutación de un ácido nucleico, tal como un gen, para la traducción optimizada o mejorada del ácido nucleico en una cepa o especie particular. La optimización de codones puede dar como resultado velocidades de traducción más rápidas o una mayor precisión de traducción. Los genes de la invención pueden tener codones optimizados para su expresión en Clostridium, en particular, Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium Ijungdahlii o Clostridium ragsdalei. Como se usa en el presente documento, las expresiones "codones optimizados" y "codones adaptados" pueden utilizarse indistintamente.

El término "variantes" incluye ácidos nucleicos y proteínas cuya secuencia varía de la secuencia de un ácido nucleico y una proteína de referencia, tal como una secuencia de un ácido nucleico y una proteína de referencia desvelados en la técnica anterior o ilustrados en el presente documento. Los ácidos nucleicos o las proteínas variantes realizan sustancialmente la misma función que el ácido nucleico o la proteína de referencia. Por ejemplo, una proteína variante puede realizar sustancialmente la misma función o catalizar sustancialmente la misma reacción que una proteína de referencia. Un gen variante puede codificar la misma o sustancialmente la misma proteína que un gen de referencia. Un promotor variante puede tener sustancialmente la misma capacidad para promover la expresión de uno o más genes como un promotor de referencia.

Dichos ácidos nucleicos o proteínas pueden denominarse en el presente documento "variantes funcionalmente equivalentes". A modo de ejemplo, las variantes funcionalmente equivalentes de un ácido nucleico pueden incluir variantes alélicas, fragmentos de un gen, genes mutados, polimorfismos y similares. Los genes homólogos de otros microorganismos también son ejemplos de variantes funcionalmente equivalentes. Estos incluyen genes homólogos en especies tales como Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii o Clostridium ljungdahlii, cuyos detalles están disponibles al público en páginas web tales como Genbank o NCBI. Las variantes funcionalmente equivalentes también incluyen ácidos nucleicos cuya secuencia varía como resultado de la optimización de codones de un microorganismo particular. Una variante funcionalmente equivalente de un ácido nucleico tendrá preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 %, o más, de identidad de secuencia del ácido nucleico (porcentaje de homología) con el ácido nucleico de referencia. Una variante funcionalmente equivalente de una proteína tendrá preferentemente al menos aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 98 %, o más, de identidad de aminoácidos (porcentaje de homología) con la proteína de referencia. La equivalencia funcional de un ácido nucleico o proteína variante puede evaluarse usando cualquier método conocido en la técnica.

Las enzimas descritas en el presente documento se expresan normalmente a partir de un ácido nucleico que se ha introducido en el microorganismo de la invención. Los ácidos nucleicos pueden suministrarse a un microorganismo de la invención usando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden suministrarse como ácidos nucleicos desnudos o pueden formularse con uno o más agentes, tales como liposomas. Los ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN, ADNc o combinaciones de los mismos, según sea apropiado. En determinadas realizaciones pueden utilizarse inhibidores de restricción. Los vectores adicionales pueden incluir plásmidos, virus, bacteriófagos, cósmidos y cromosomas artificiales. En una realización preferida, los ácidos nucleicos se suministran al microorganismo de la invención usando un plásmido. A modo de ejemplo, la transformación (incluyendo transducción o transfección) puede conseguirse mediante electroporación, ultrasonido, transformación mediada por polietilenglicol, competencia química o natural, transformación de protoplastos, inducción de profagos o conjugación. En determinadas realizaciones que tienen sistemas activos de enzimas de restricción, puede ser necesario metilar un ácido nucleico antes de la introducción del ácido nucleico en un microorganismo.

Asimismo, los ácidos nucleicos pueden diseñarse para que comprendan un elemento regulador, tal como un promotor, para aumentar, o controlar de otro modo, la expresión de un ácido nucleico concreto. El promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor inducible. Idealmente, el promotor es un promotor de la vía de Wood-Ljungdahl, un promotor de ferredoxina, un promotor de piruvato:ferredoxina oxidorreductasa, un promotor del operón del complejo Rnf, un promotor del operón de ATP sintasa o un promotor del operón de fosfotransacetilasa/acetato cinasa.

Sustratos

"Sustrato" se refiere a una fuente de carbono y/o de energía para el microorganismo de la invención. Normalmente, el sustrato es gaseoso y comprende una fuente de carbono C1, por ejemplo, CO y/o CO². Preferentemente, el sustrato comprende una fuente de carbono C1 de CO o CO CO². El sustrato puede comprender además otros componentes que no sean carbono, tales como H² , N² o electrones.

El sustrato generalmente comprende al menos alguna cantidad de CO, tal como aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % en moles de CO. El sustrato puede comprender un intervalo de CO, tal como aproximadamente 20-80, 30-70 o 40-60 % en moles de CO. Preferentemente, el sustrato comprende aproximadamente 40-70 % en moles de CO (p. ej., gas de acería o alto horno), aproximadamente 20-30 % en moles de CO (p. ej., gas de horno de oxígeno básico) o aproximadamente 15-45 % en moles de CO (p. ej., sintegás). El sustrato puede comprender una cantidad relativamente baja de CO, tal como aproximadamente 1-10 o 1-20 % en moles de CO. El microorganismo de la invención normalmente convierte al menos una parte del CO del sustrato en un producto. Es posible que el sustrato no comprenda o no comprenda sustancialmente (<1 % en moles) CO.

El sustrato puede comprender alguna cantidad de H². Por ejemplo, el sustrato puede comprender aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15, 20 o 30 % en moles de H². El sustrato puede comprender una cantidad relativamente alta de H² , tal como aproximadamente 60, 70, 80 o 90 % en moles de H². Es posible que el sustrato no comprenda o no comprenda ^{sustancialmente} (<1 ^{% en moles) H2.}

El sustrato puede comprender alguna cantidad de CO². Por ejemplo, el sustrato puede comprender aproximadamente 1-80 o 1-30 % en moles de CO². El sustrato puede comprender menos de aproximadamente 20, 15, 10 o 5 % en moles de CO². Es posible que el sustrato no comprenda o no comprenda sustancialmente (<1 % en moles) CO².

El crecimiento de una cepa productora de PHB puede compararse con el de una cepa de control ("plásmido vacío" o "EP" por las siglas del inglés empty plasmid") usando dos mezclas de gases diferentes que contengan CO y CO² con un 20 % de H² parecido al sintegás (50 % de CO, 20 % de CO² , 20 % de H² , 10 % de Argón), denominadas condiciones "PHB20" y "EP20", respectivamente, o 2 % de H² parecido al gas residual de acería (50 % de CO, 20 % de CO² , 2 % de H² , 28 % de Nitrógeno), denominadas condiciones "PHB2" y "EP2", respectivamente.

Aunque el sustrato es normalmente gaseoso, el sustrato también puede proporcionarse en formas alternativas. Por ejemplo, el sustrato puede disolverse en un líquido saturado con un gas que comprenda CO usando un generador de dispersión de microburbujas. A modo de ejemplo adicional, el sustrato puede adsorberse sobre un soporte sólido.

El sustrato y/o la fuente de carbono C1 puede ser un gas residual obtenido como subproducto de un proceso industrial o de alguna otra fuente, tal como los de los gases de escape de los automóviles o la gasificación de biomasa. El proceso industrial puede seleccionarse del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como la fabricación de una acería, fabricación de productos no ferrosos, refinado de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. El sustrato y/o la fuente de carbono C1 puede capturarse a partir del proceso industrial antes de ser emitido a la atmósfera, usando cualquier método conveniente.

El sustrato y/o la fuente de carbono C1 puede ser sintegás, tal como el sintegás obtenido por gasificación de carbón o residuos de refinería, gasificación de biomasa o material lignocelulósico o reformado de gas natural. El sintegás puede obtenerse de la gasificación de residuos sólidos urbanos o residuos sólidos industriales.

La composición del sustrato puede tener un impacto significativo sobre la eficacia y/o el coste de la reacción. Por ejemplo, la presencia de oxígeno (O²) puede reducir la eficacia de un proceso de fermentación anaerobia. Dependiendo de la composición del sustrato, puede ser deseable tratar, lavar o filtrar el sustrato para eliminar cualquier impureza no deseable, tales como toxinas, componentes no deseados o partículas de polvo y/o aumentar la concentración de componentes deseables.

En determinadas realizaciones, la fermentación o el cultivo se realiza sin sustratos hidrocarbonados, tales como azúcar, almidón, lignina, celulosa o hemicelulosa.

Como se usa en el presente documento, la expresión "PHBMcB" se usa para referirse a experimentos con una menor concentración de biomasa en estado de equilibrio, tal como una concentración de biomasa 3 veces menor en estado de equilibrio. Como se usa en el presente documento, la expresión "PHBpH5,5" se utiliza para referirse a experimentos ^{realizados a un pH de 5,5. Véase la figura} 8^.

Productos

El microorganismo de la invención se cultiva para producir PHB.

El PHB es un polímero de monómeros de 3-hidroxibutirato. El PHB producido según el proceso de la invención, puede comprender cualquier número de monómeros de 3-hidroxibutirato, por ejemplo, aproximadamente 10-1 000000 monómeros. Como ejemplos adicionales, el PHB puede comprender aproximadamente 10-100000 monómeros, 100­ 100000 ^{monómeros, 100-10}000 ^{monómeros, 500-5}000 ^monómeros, 1000-10000 ^{monómeros o 5}000-20000 monómeros. Se prefiere que el PHB comprenda aproximadamente 100-12000 monómeros.

El peso molecular del PHB producido por la bacteria de la invención puede estar en el intervalo de aproximadamente 1000-100000000 Da. Por ejemplo, el peso molecular del PHB puede ser de aproximadamente 1000-10000 Da, 10 000-1 000000 Da, 10000-10000000 Da o 10000000-100000000 Da. Preferentemente, el peso molecular del PHB puede ser de aproximadamente 1000-1 000000 Da, tal como 10000-100000 Da, 10000-500000 Da, 100000­ 500000 Da, 300000-800000 Da o 500000-1 000000 Da.

La producción de PHB se refiere frecuentemente como un porcentaje del peso celular seco. El microorganismo de la invención puede producir, por ejemplo, 0,005-0,995 % en peso de PHB. Preferentemente, el microorganismo de la invención produce aproximadamente 0,01 % en peso, 0,1 % en peso, 0,5 % en peso, 1 % en peso, 1,5 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 5 % en peso, 10 % en peso, 20 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 50 % en peso, 60 % en peso, 70 % en peso, 80 % en peso, 90 % en peso o 95 % en peso de p Hb .

Las características físicas del PHB son muy conocidas en la técnica. Como aproximación, el PHB tiene un módulo de Young de 1497-3500 MPa, una resistencia a la tracción de 18-43 MPa, un alargamiento a la rotura de 1,9-45 %, una cristalinidad de 60-80 %, una temperatura de fusión de 162-180 °C, una temperatura de cristalización de 45-116 °C y/o una temperatura de transición vítrea de -1,2-10 °C.

Además, pero no incluido en las reivindicaciones, el microorganismo de la invención también puede ser capaz de producir o puede diseñarse para ser capaz de producir otros productos, tales como etanol (documento WO 2007/117157), acetato (documento WO 2007/117157), butanol (documentos WO 2008/115080 y WO 2012/053905), butirato (documento WO 2008/115080), 2,3-butanodiol (documentos WO 2009/151342 y WO 2016/094334), lactato (documento WO 2011/112103), buteno (documento WO 2012/024522), butadieno (documento WO 2012/024522), metil etil cetona (2-butanona) (documentos WO 2012/024522 y WO 2013/185123), etileno (documento w O 2012/026833), acetona (documento WO 2012/115527), isopropanol (documento W o 2012/115527), lípidos (documento W^o 2013/036147), 3-hidroxipropionato (3-HP) (documento WO 2013/180581), isopreno (documento WO 2013/180584), ácidos grasos (documento WO 2013/191567), 2-butanol (documento WO 2013/185123), 1,2-propanodiol (documento WO 2014/036152), 1-propanol (documento WO 2014/0369152) y productos derivados del corismato (documento WO 2016/191625). Además de uno o más productos diana, el microorganismo de la invención también puede ser capaz de producir etanol, acetato y/o 2,3-butanodiol. La propia biomasa microbiana puede considerarse como un producto.

Preferentemente, el microorganismo de la invención no es capaz de degradar el PHB. Los organismos que producen de manera natural PHB y otros polihidroxialcanoatos generalmente sintetizan los polímeros como material de almacenamiento de carbono cuando otros nutrientes (p. ej., nitrógeno y fósforo) son limitantes y hay un exceso de carbono. Después, estos organismos pueden despolimerizar/degradar los polímeros cuando se repone el nutriente limitante para tener acceso al carbono almacenado. Con el fin de maximizar la producción de PHB, productores no naturales, tales como los microrganismos de la presente invención, a menudo tienen la ventaja de no ser capaces de degradar enzimáticamente los polímeros una vez que se producen. Básicamente, esto bloquea el carbono de los polímeros de forma permanente y puede aumentar el rendimiento.

"Selectividad" se refiere a la relación de la producción de un producto diana respecto a la producción de todos los productos de fermentación producidos por un microorganismo. El microorganismo de la invención se puede diseñar para producir PHB con una cierta selectividad o con una selectividad mínima. El PHB puede representar al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 50 % o 75 % de todos los productos de fermentación producidos por el microorganismo de la invención. El PHB puede suponer al menos un 10 % de todos los productos de fermentación producidos por el microorganismo de la invención, de manera que el microorganismo de la invención tenga una selectividad por el PHB de al menos un 10 %. El PHB puede suponer al menos un 30 % de todos los productos de fermentación producidos por el microorganismo de la invención, de manera que el microorganismo de la invención tenga una selectividad por el PHB de al menos un 30 %.

Fermentación

La invención también proporciona un método de producción de PFH que comprende, cultivar el microorganismo de la invención en presencia de un sustrato gaseoso, de modo que el microorganismo produce PHB. El sustrato gaseoso generalmente comprende uno o más de CO, CO² y H².

Normalmente, el cultivo se realiza en un biorreactor. El término "biorreactor" incluye un dispositivo de cultivo/fermentación que consiste en uno o más recipientes, torres o estructuras de tuberías, tal como un reactor de tanque con agitación continua (CSTR, continuous stirred tank reactor), un reactor de células inmovilizadas (ICR, immobilized cell reactor), un reactor de lecho percolador (TBR, trickle bed reactor), una columna de burbujeo, un fermentador de elevación de gases, un mezclador estático u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido. El biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de cultivo/fermentación. El sustrato se puede proporcionar a uno de estos reactores o a ambos. Como se usa en el presente documento, los términos "cultivo" y "fermentación" se utilizan indistintamente. Estos términos abarcan tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis del producto del proceso de cultivo/fermentación.

El cultivo generalmente se mantiene en un medio de cultivo acuoso que contiene nutrientes, vitaminas y/o minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo. Preferentemente, el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento microbiano anaerobio, tal como un medio de crecimiento microbiano anaerobio mínimo. En la técnica se conocen bien medios adecuados.

Es deseable que el cultivo se lleve a cabo en condiciones apropiadas para la producción de PHB. Normalmente, el cultivo se realiza en condiciones anaerobias. Las condiciones de reacción a tener en cuenta incluyen presión (o presión parcial), temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH de los medios, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque con agitación continua), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato gaseoso para garantizar que, en la fase líquida, el gas no se vuelve limitante y concentraciones máximas del producto para evitar la inhibición del producto.

El funcionamiento de un biorreactor a presiones elevadas, permite aumentar la tasa de transferencia de masa de gas de la fase gaseosa a la fase líquida. Por consiguiente, generalmente es preferible realizar la fermentación a presiones más altas que la presión atmosférica. Además, dado que una determinada tasa de conversión de gas es en parte una función del tiempo de retención del sustrato y que el tiempo de retención dictamina el volumen requerido de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen del biorreactor necesario y, en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación. A su vez esto significa que el tiempo de retención, definido como el volumen líquido del biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada, puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada, en vez de a presión atmosférica. Las condiciones de reacción óptimas dependerán en parte del microorganismo particular utilizado. Sin embargo, en general, es preferible llevar a cabo la fermentación a presiones más altas que la presión atmosférica. Además, dado que una determinada tasa de conversión de gas es en parte una función del tiempo de retención del sustrato y que conseguir un tiempo de retención deseado, a su vez, dictamina el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen necesario del biorreactor y en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación.

En determinadas realizaciones, la fermentación se realiza sin luz o con una cantidad de luz insuficiente para satisfacer las necesidades energéticas de los microorganismos fotosintéticos o fotótrofos.

Los métodos de la invención pueden implicar además la separación o purificación de PHB. El PHB se puede separar o purificar utilizando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden recogerse células por precipitación (Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50-55, 2001) o separación continua (Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643­ 651, 2009; Heinrich, AMB Express, 2: 59, 2012) seguido de liofilización. Después de la liofilización, el polímero puede eliminarse de las células con materiales tales como acetato de etilo (Chen, Appl Microbiol Biotechnol, 57: 50-55, 2001), acetona (Elbahloul, Appl Environ Microbiol, 75: 643-651, 2009), o hipoclorito de sodio (Heinrich, AMB Express, 2: 59, 2012). A continuación, el polímero puede eliminarse de la masa celular residual/solubilizada. Se han publicado y desarrollado un gran número de procesos alternativos para la purificación de polihidroxialcanoatos, pero aún no se han establecido para la purificación a gran escala (Kunasundari, Express Polym Lett, 5, 620-634, 2011).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la construcción de un microorganismo de Wood-Ljungdahl capaz de sintetizar PHB.

Genes de la vía de PHB (phaC, phaA y phaB) de C. necator (SEQ ID NO: 1, 4 y 7) se introdujeron en C. autoethanogenum, un microorganismo de Wood-Ljungdahl que no produce PHB de manera natural. Cabe destacar que, estas especies tienen diferencias significativas en cuanto al contenido cromosómico de GC. Específicamente, C. ^{necator tiene un contenido de GC de} 66 ^{% (Pohlmann, Nat Biotechnol, 24: 1257-1262, 2006) y C. autoethanogenum} tiene solo un contenido de GC de 31 % (Brown, Biotechnol Biofuels, 7: 40, 2014). Anticipando los problemas de expresión génica basados en el uso de codones, las secuencias de los genes de PHB de C. necator se adaptaron a los codones para que se ajustaran mejor a un perfil de expresión más alto para las proteínas de C. autoethanogenum. ^{Los genes, con secuencias novedosas (SEQ ID NO: 3,} 6 ^{y 9) que codifican las mismas proteínas que las de C. necator,} se sintetizaron y ensamblaron en el vector de expresión pMTL83157 (SEQ ID NO: 10). Este plásmido es similar al de la serie pMTL8000 (Heap, J Microbiol Methods, 78: 79-85, 2009) con un promotor natural de Wood-Ljungdahl tomado de C. autoethanogenum para impulsar la transcripción génica. Los genes se colocaron secuencia abajo del promotor en el mismo orden en que aparecían en el genoma de C. necator: phaC, phaA y phaB. También se utilizó un marcador de selección de antibióticos, catP. El plásmido resultante se denominó pPHB_01 (SEQ ID NO: 11) (figura 2). El plásmido pPHB_01 se insertó en C. autoethanogenum por conjugación bacteriana utilizando la cepa HB101 de E. coli, como se describe en cualquier otro lugar (Mock, J Bacteriol, 197: 2965-2980, 2015). Por separado, para actuar como un control negativo, un plásmido pMTL83157 "vacío" se insertó en C. autoethanogenum. Después, estas cepas se usaron para probar la producción de PHB a partir de sustratos gaseosos.

En una realización preferida, el microorganismo comprende una enzima que convierte aceil-CoA en acetoacetil-CoA que comprende una enzima que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, la enzima que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA comprende una enzima que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, y/o la enzima que convierte 3-hidroxibutiril-CoA en polihidroxibutirato comprende una enzima que tiene una identidad ^{de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:} 8^.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la producción de PHB a partir de sustratos gaseosos en frascos Schott.

Las cepas construidas en el Ejemplo 1 se cultivaron en lotes pequeños para probar la producción de PHB. Todo el trabajo se realizó en estrictas condiciones anaerobias (Hungate, Methods in microbiology, páginas 117-132, Academic Press, Nueva York, NY, 1969). Se inocularon con las cepas frascos Schott a presión que contenían medio PETC modificado (Kopke, Appl Environ Microbiol, 77: 5467-5475, 2011) con tiamfenicol para la retención del plásmido y ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico para el amortiguamiento, y se añadió a los frascos gas compuesto por CO, CO² , H² y N² (al 50, 18, 3 y 29 %, respectivamente) como única fuente de carbono a 21 psi. Los cultivos se cultivaron a 37 °C con agitación rotatoria.

El crecimiento celular se controló periódicamente hasta que los cultivos entraron en fase estacionaria. Al finalizar el crecimiento, las células ya no se manipularon en condiciones anaerobias. Las células se recogieron mediante centrifugación, sus sobrenadantes se desecharon, se congelaron a -20 °C y se secaron mediante liofilización.

El rendimiento de PHB se calculó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de manera similar a la descrita en cualquier otro lugar (Karr, Appl Environ Microbiol, 46, 1339-1344, 1983). Resumiendo, las células secas se trataron con ácido sulfúrico concentrado y se calentaron para convertir el PHB en ácido crotónico. Las muestras se enfriaron, diluyeron, filtraron y analizaron mediante HPLC con un detector UV-Vis para cuantificar el ácido crotónico. En la figura 3 se resumen los resultados de la producción inicial de PHB, que muestra la producción satisfactoria de ~1,15 % en peso de PHB en un microorganismo de Wood-Ljungdahl.

Sin embargo, dados los bajos rendimientos, en comparación con productores naturales, tales como Cupriavidus and Pseudomonas, que son capaces de sintetizar polímeros como PHB de manera que representen más del 90 % de su peso, parece que la síntesis de PHB a partir de gas en los microorganismos de Wood-Ljungdahl no es tan sencilla como en los productores naturales que crecen en sustratos no gaseosos. Sin desear quedar ligado a teoría alguna en particular, los inventores postulan que la producción de PHB en microorganismos de Wood-Ljungdahl, puede requerir una adaptación de codones para superar las diferencias en la preferencia de pH, requerimientos de oxígeno, usos de sustrato, etc. entre los microorganismos de Wood-Ljungdahl y los productores naturales de PHB.

Después de lograr la síntesis de PHB en C. autoethanogenum a partir de sustratos gaseosos, el trabajo descrito anteriormente se repitió con condiciones de crecimiento alteradas en un esfuerzo por explorar las condiciones que pueden favorecer/mejorar el rendimiento de PHB. En concreto, se realizaron experimentos para repetir las condiciones descritas anteriormente (condición 1, figura 4A), para cambiar la composición del gas a 50/30/10/10 CO/CO²/H²/N² (condición 2, figura 4B), prolongar la incubación del cultivo a la fase estacionaria (condición 3, figura 4C) y renovar periódicamente el gas en los frascos (condición 4, figura 4D). Como se muestra en las figuras 4A-4D, el crecimiento fue similar tanto para la cepa modificada como para la cepa de control en todas las condiciones probadas.

Las células se recogieron y analizaron para determinar la producción de PHB como se describe anteriormente. Los resultados se representan en la figura 5, que muestra una producción de ~1,65 % en peso de PHB en la condición 1, ~1,50 % en peso de PHB en la condición 2, ~1,50 % en peso de PHB en la condición 3 y ~0,85 % en peso de PHB en la condición 4.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la producción de PHB a partir de sustratos gaseosos en una fermentación continua.

La cepa construida en el Ejemplo 1 se probó con fermentación continua utilizando gas como fuente principal de carbono, en condiciones similares a las descritas en Valgepea, Cell Syst, 4: 505-515, 2017. De manera similar a la de los experimentos realizados en frascos Schott, los cultivos continuos se cultivaron y manipularon en condiciones anaerobias. A diferencia de los frascos Schott, los cultivos se cultivaron de manera continua durante aproximadamente 20 días con alimentación constante de medios. Se utilizaron dos composiciones de gas diferentes para el crecimiento y la producción de PHB: 50/20/20/10 CO/CO²/H²/Ar y 50/20/2/28 CO/CO²/H²/N². La captación de gas se controló mediante espectrometría de masas (MS, mass spectrometry) y se tomaron muestras periódicamente para cuantificar los metabolitos líquidos mediante HPLC.

El PHB no se cuantificó hasta la finalización de la fermentación continua. De manera similar a los experimentos realizados en frascos Schott, las células se recogieron mediante centrifugación, se congelaron y se secaron mediante liofilización. Posteriormente, las células secas se analizaron para detectar PHB mediante tratamiento con ácido sulfúrico y calor para convertir el PHB en ácido crotónico. A continuación, se llevó a cabo la cuantificación de PHB ^{mediante HPLC. En la figura} 6 ^{se muestran los resultados de la producción de PHB en la fermentación continua. En} concreto, los microorganismos cultivados en hidrógeno gaseoso al 20 % produjeron ~0,45 % en peso de PHB y los microorganismos cultivados en hidrógeno gaseoso al 2 % produjeron ~025 % en peso de PHB.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra la optimización del fermentador para aumentar la producción de PHB.

Se probaron varias condiciones dentro de fermentaciones continuas para aumentar el contenido de PHB en las células. Las reservas de acetil-CoA y NADPH aumentaban a menores concentraciones de biomasa (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017). Por lo tanto, se probó si una menor concentración de biomasa en estado de equilibrio daría como resultado una mayor cantidad de PHB aumentando las concentraciones de las reservas de acetil-CoA y NADPH. La disminución de la tasa de captación de CO y, por extensión, de la concentración de biomasa en el fermentador, demostró aumentar el flujo de recursos celulares hacia el PHB (figura 7).

Otro factor que aumentó el PHB fue el pH. A un pH más alto, menos ácido acético se difundiría y desacoplaría la fuerza motriz de protones (PMF, proton motive force) (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017). Por lo tanto, se probó si ^{aumentar el pH de 5 a 5,5 o} 6 ^{consumiría menos energía para mantener la PMF. La energía adicional disponible} proporcionaría ATP adicional para respaldar la producción de PHB al reducir la producción de acetato necesaria para la producción de ATP. Cambiar el pH de 5,0 a 5,5 o 6,0 dio como resultado una mayor producción de PHB (~12,5 veces a pH 5,5). Sin embargo, es difícil mantener un valor de pH de 6,0, ya que C. autoethanogenum crece de manera óptima a un pH más ácido.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra cambios a nivel transcripcional y del metaboloma cuando se produce PHB, en comparación con la cepa de control (plásmido vacío).

El análisis de los datos del transcriptoma de la secuenciación del ARN se basó en una secuencia de comandos (script) en R publicada anteriormente

(Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017) con las siguientes modificaciones: uso de la secuencia de referencia CP006763.1 del NCBI de C. autoethanogenum y su genoma anotado descrito en Brown, Biotechnol. Biofuels, 7: 40, ^{2014; adición de la secuencia de nucleótidos de los tres genes de PHB (SEQ ID NO: 3,} 6^{, 9).}

Para realizar el análisis estadístico de los datos de metabolómica intracelular, se utilizó un paquete de metabolómica disponible en R (Livera y Bowne, R package, 2014). Esta secuencia de comandos normaliza e integra los datos de metabolómica en un ajuste de modelo lineal (De Livera, Anal. Chem., 84: 10768-10776, 2012). Las concentraciones de metabolitos intracelulares se normalizaron por biomasa (pmol/g de PCS) antes de importar los datos a la secuencia de comandos. Para el análisis estadístico de los datos del metaboloma se usó un ajuste de modelo lineal utilizando datos estadísticos corrientes (es decir, no bayesianos) (De Livera, Anal. Chem., 84: 10768-10776, 2012; De Livera, Metabolomics Tools for Natual Product Discovery, 2013).

Aunque no se suministró arginina, se observó una regulación positiva de la vía de la arginina desiminasa, una vía alternativa encontrada para proporcionar ATP en acetógenos (Valgepea, Metab. Eng. 41: 202-211, 2017) (valor de q ^{<0,01): arginina desiminasa (CAETHG_3021, ~7 veces); ornitina carbamoiltransferasa (CAETHG_3022,} ~6 ^veces); carbamato cinasa (CAETHG 3025, ~3,3 veces). Además, tres genes que codificaban el complejo Rnf, que forma parte del complejo de conservación de energía en acetógenos (Schuchmann y Müller, Nat. Rev. Microbiol. 12: 809-821, 2014), mostraron un aumento de ~2 veces en la cepa de PHB: (CAETHG 3231, valor de q=0,02; CAETHG_3228, valor de q=0,04 y CAETHG_3230, valor de q=0,03). Estas observaciones resaltan cambios en el metabolismo energético debido a la producción heteróloga. Además, la expresión de dos genes de la vía de Wood-Ljungdahl (WLP) que codifican la C^o deshidrogenasa/acetil-CoA sintasa (CAETHG_1610, ~1,4 veces; CAETHG_1611, ~1,2 veces) y un gen que codifica una (FeFe)-hidrogenasa (CAETHG_1691, ~2,5 veces) se reguló positivamente en la cepa de PHB. Estos cambios pueden reflejar el aumento necesario para la producción de acetil-CoA y NADPH para la producción de PHB (figura 1).

A nivel del metaboloma, la cepa de PHB tenía una relación NADH/NAD⁺ intracelular más alta en comparación con el EP. Esto sugiere posibles cambios en el estado redox después de la expresión de PHB. La producción de acetato, el principal subproducto natural del metabolismo de C. autoethanogenum (Abrini, Arch. Microbiol., 161: 345-351, 1994; Marcellin, Green Chem., 18: 3020-3028, 2016), disminuyó en comparación con la de la cepa de EP en sintegás (valor de p <0,01; prueba de la t bilateral con la misma varianza). No se observó ningún cambio en el gas residual de acería.

Ejemplo 6

Este ejemplo muestra los resultados de reconstrucciones de modelos metabólicos a escala genómica (GEM, genomescale metabolic). Se utilizó el modelo metabólico a escala genómica GEM iCLAU786 (Valgepea, Cell Syst., 4: 505­ 515, 2017) con la adición de la vía de PHB. Se realizaron simulaciones para la cepa de PHB cultivada en sintegás en todas las condiciones indicadas anteriormente.

Las simulaciones de flujo confirmaron que se disipaba menos CO² en las condiciones con mayor PHB (es decir, "menor concentración de biomasa" y a un "pH de 5,5"). Además, como se ha observado anteriormente (Valgepea, Cell Syst., 4: 505-515, 2017), estas simulaciones también mostraron que el CO² se redujo directamente a formiato por H² a través de la actividad de la formiato-H² liasa del complejo enzimático de la hidrogenasa-formiato deshidrogenasa con bifurcación de electrones (HytA-E/FdhA) (Wang, J. Bacteriol., 195: 4373-4386, 2013). Esto ofrece una ventaja sobre

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo de Wood-Ljungdahl de origen no natural, capaz de producir polihidroxibutirato, que comprende:

a. un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga acetil-CoA C-acetiltransferasa (EC 2.3.1.9) que convierte acetil-CoA en acetoacetil-CoA,

b. un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga acetoacetil-CoA reductasa (EC 1.1.1.36) o un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (EC 1.1.1.157) que convierte acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA, y

c. un ácido nucleico que codifica una enzima heteróloga polihidroxialcanoato sintasa (EC 2.3.1.-) que convierte 3-hidroxibutiril-CoA en polihidroxibutirato.

2. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde la acetil-CoA C-acetiltransferasa es de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Clostridium acetobutylicum, Cupriavidus necator, Escherichia coli, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida o Streptomyces coelicolor.

3. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde la acetoacetil-CoA reductasa es de Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida o Streptomyces coelicolor.

4. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa es de Clostridium beijerinckii, Clostridium acetobutylicum o Clostridium kluyveri.

5. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde la polihidroxialcanoato sintasa es de Acinetobacter baumannii, Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophilia, Alcaligenes latus, Arthrospira platensis, Bacillus subtilis, Burkholderia cepacia, Cupriavidus necator, Haloferax mediterranei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mandelii, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. 61-3, Rhodospirillum rubrum o Streptomyces coelicolor.

6. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es un miembro de un género seleccionado del grupo que consiste en Acetobacterium, Alkalibaculum, Blautia, Butyribacterium, Clostridium, Eubacterium, Moorella, Oxobacter, Sporomusa y Thermoanaerobacter.

7. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii, Blautia producta, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium aceticum, Clostridium autoethanogenum, Clostridium carboxidivorans, Clostridium coskatii, Clostridium drakei, Clostridium formicoaceticum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium magnum, Clostridium ragsdalei, Clostridium scatologenes, Eubacterium limosum, Moorella thermautotrophica, Moorella thermoacetica, Oxobacter pfennigii, Sporomusa ovata, Sporomusa silvacetica, Sporomusa sphaeroides y Thermoanaerobacter kiuvi.

8. El microorganismo de la reivindicación 7, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Clostridium autoethanogenum, Clostridium coskatii, Clostridium ljungdahlii y Clostridium ragsdalei.

9. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es capaz de consumir sustratos gaseosos ^{que comprenden uno o más de CO, CO}2 ^{y H}2^.

10. El microorganismo de la reivindicación 1, en donde el microorganismo es:

a. anaerobio,

b. no es capaz de degradar el polihidroxibutirato, o

c. no fotótrofo, fotosintético o metanótrofo.

11. Un método para producir polihidroxibutirato que comprende, cultivar el microorganismo de la reivindicación 1, en presencia de un sustrato gaseoso, de modo que el microorganismo produce polihidroxibutirato.

^{12. El método de la reivindicación 11, en donde el sustrato gaseoso comprende uno o más de CO, CO}2 ^{y H}2^.

13. El método de la reivindicación 11, en donde el cultivo se realiza:

a. en condiciones anaerobias,

b. sin sustratos hidrocarbonados o

c. sin luz.