CN103502435A

CN103502435A - 重组微生物及其用途

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Publication number: CN103502435A
Application number: CN201280020456.3A
Authority: CN
Inventors: S·D·辛普森; M·科普克; F·刘; W·Y·陈
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: EP2678432B1; CA2995872A1; PL2678432T4; EP2678432A2; KR102121886B1; CA2825267C; KR20190097292A; EP2678432A4; WO2012115527A3; MY168208A; DK2678432T3; BR112013021524A2; AU2012221176A1; JP2014506478A; TWI541348B; KR102015672B1; CN108486169B; NZ614459A; JP6199747B2; KR20140012106A

Abstract

本发明尤其提供了用于通过对含CO的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法、用于这种方法的遗传修饰的微生物、适于制备遗传修饰的微生物的核酸、新的醇脱氢酶和编码所述醇脱氢酶的核酸。

Description

重组微生物及其用途

技术领域

本发明涉及用于通过对含一氧化碳的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法，以及用于这种方法的经遗传修饰的微生物。

背景技术

已知一些微生物例如丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）或拜季林斯基氏梭菌（Clostridium beijerinckii）在丁醇发酵过程中产生丙酮或异丙醇作为主要副产物（ABE或IBE发酵）[George HA,JohnsonJL,Moore WEC,Holdeman LV,Chen JS:Acetone,isopropanol,andbutanol production by Clostridium beijerinckii(syn.Clostridiumbutylicum)and Clostridium aurantibutyricum.Appl Environ Microbiol45:1160-1163]。但是，所有这些生物均依赖于基于糖或淀粉的底物。产乙酸的生物（例如密切相关的微生物自产醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum）、扬氏梭菌（C.ljungdahlii）和拉氏梭菌（C.ragsdalei））能够以含CO或CO₂/H₂的气体作为唯一能源和碳源进行化能自养生长，并合成产物例如乙酸、乙醇或2,3-丁二醇，但是不合成丙酮或异丙醇[Munasinghe PC,Khanal SK:Biomass-derived syngas fermentationinto biofuels:Opportunities and challenges.Bioresource Technol2010,5013-22]。

最近，在100L中试规模发酵罐中对拉氏梭菌（梭菌属菌株P11）的研究中报告了从柳枝稷（switchgrass）衍生的合成气产生了异丙醇[Kundiyana DK,Huhnke RL,Wilkins MR:Syngas fermentation in a100-L pilot scale fermentor:Design and process considerations.J BiosciBioeng2010,109:492-498]。但是，来自所述同一实验室的相关研究显示，这是由于所使用的合成气中的污染，因为其通过了含有20%丙酮的洗涤混合物[Ramachandriya KD:Effect of biomass generatedproducer gas,methane and physical parameters on producer gasfermentations by Clostridium strain P11.Masters thesis,OklahomaState University2009]。作者还注意到，异丙醇的产生可能是由于丙酸（而不是丙酮）还原。由本发明的发明人用拉氏梭菌（梭菌属菌株P11）和自产醇梭菌以及扬氏梭菌进行的实验从未显示丙酮、异丙醇或丙酸的产生。

许多适于产生化学产物（例如丙酮和异丙醇）的碳水化合物原料的成本受到它们作为人类食物或动物饲料的价值的影响，并且种植产淀粉或蔗糖的作物用于这类生产并不是在所有的地域中都是经济上可持续的。因此，需要开发将更低成本的和/或更丰富的碳源转化为有用的化学产物（例如丙酮和异丙醇）的技术。

CO是有机材料（例如煤或油和油衍生产品）不完全燃烧的主要的、无成本的、富含能量的副产物。例如，有报道称澳大利亚的钢铁工业每年产生并向大气中排放超过500,000吨CO。

本发明的目的是克服现有技术的一种或多种缺陷，或者至少为公众提供可用的选择。

发明内容

本发明广义上提供了，尤其是，用于通过对含CO的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法、用于这种方法的遗传修饰的微生物、适于制备遗传修饰的微生物的核酸以及新的醇脱氢酶和编码其的核酸。

在第一方面，本发明提供了一种能够通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物。

在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达异丙醇生物合成途径中非天然存于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物适于过表达异丙醇生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达丙酮生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的酶。在另一个实施方案中，所述微生物适于过表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的酶。

在一个实施方案中，所述亲代微生物能够发酵含CO的底物以产生丙酮而不能将丙酮转化为异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。

在另一个实施方案中，所述亲代微生物能够将丙酮转化为异丙醇而不能够发酵含CO的底物以产生丙酮，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶。

在一个实施方案中，所述亲代微生物不能发酵含CO的底物以产生丙酮和异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶以及在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。

在一个实施方案中，所述异丙醇和/或丙酮生物合成途径中的一种或多种酶选自：

乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）；

乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）;

乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）；

乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）；

α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）；和，

它们中任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）来源自丙酮丁醇梭菌。

在一个实施方案中，所述酶乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc）来源自拜季林斯基氏梭菌。

在一个实施方案中，所述α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）来源自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

在一个实施方案中，在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶选自：

醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）；

醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）和，

其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh）来源自自产醇梭菌、扬氏梭菌和/或拉氏梭菌。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ_IDNO.1的氨基酸序列，或者为其功能等价变体。在一个实施方案中，所述功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh2）来源自酿酒酵母（S.cerevisiae）。

在一个实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸被改造为适于增加所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸的表达，所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸编码上文提到的一种或多种酶。

在一个实施方案中，所述被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸为调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件为启动子。在一个实施方案中，所述启动子为组成型启动子。在一个实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个实施方案中，所述启动子具有SEQ_ID No.22或SEQ ID no.77的序列，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述微生物包含编码并被改造为适于表达上文提到的一种或多种酶的一种或多种外源核酸。在一个实施方案中，所述微生物包含编码并被改造为适于表达至少两种所述酶的一种或多种外源核酸。在其他实施方案中，所述微生物包含编码并被改造为适于表达3、4、5或6种所述酶的一种或多种外源核酸。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）中的每一种；或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）的一种或多种外源核酸或其功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）和醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）中的每一种；或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种；或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）和α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）中的每一种；或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）的一种或多种外源核酸或其功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种；或其任意一种或多种的功能等价变体。

在另一个具体实施方案中，所述微生物包含包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种；或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）的核酸包含序列SEQ_ID NO.18，或其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）的核酸包含序列SEQ_ID NO.19，或其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）的核酸包含序列SEQ_ID NO.20，或其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酸脱羧酶（Adc）的核酸包含序列SEQ_ID NO.21，或其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）的核酸包含序列SEQ_ID NO.71，或其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸包含序列SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4，或其任一个的功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸的功能等价变体与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh2）的核酸包含序列SEQ_ID NO.75，或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸为核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中为质粒，编码上文提到的一种或多种酶的任意组合。

在一个实施方案中，所述外源核酸为表达质粒。在一个具体实施方案中，所述表达质粒具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、48、83、84、95、98或101。

在一个实施方案中，所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌，其选自自产醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）、德氏梭菌（Clostridium drakei）、粪味梭菌（Clostridium scatologenes）、淤泥丁酸杆菌（Butyribacteriumlimosum）、甲基营养丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、巴氏嗜碱菌（Alkalibaculumbacchii）、Blautia producta、淤泥真杆菌（Eubacterium limosum）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、热自养穆尔氏菌（Moorellathermautotrophica）、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii）和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi）。

在一个实施方案中，所述亲代微生物为自产醇梭菌或扬氏梭菌。在一个具体的实施方案中，所述微生物是自产醇梭菌DSM23693。在另一个具体的实施方案中，所述微生物是扬氏梭菌DSM13528（或ATCC55383）。

在一个实施方案中，所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA、CtfB、Adc、KivD、Adh和Adh2的一个或多个基因。在一个具体实施方案中，所述亲代微生物缺少编码Adh的基因。在另一个具体实施方案中，所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA、CtfB、Adc和KivD的基因中的每一种。

在第二方面，本发明提供了一种醇脱氢酶（Adh），其具有SEQ_IDNO.1的氨基酸序列，或其任一个功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh）功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在第三方面，本发明提供了编码SEQ_ID NO.1的Adh的核酸或其功能等价变体。

在第四方面，本发明提供了具有选自以下的序列的核酸：

SEQ_ID NO.2

SEQ_ID NO.3

SEQ_ID NO.4；和，

其任一个功能等价变体。

在一个具体实施方案中，SEQ_ID NO.2、3或4的功能等价变体是与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核酸。

在第五方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸能够与所述核酸SEQ_ID NO.2、3或4、与其任一种互补的核酸或者其任一种的功能等价变体的至少一部分杂交。

在第六方面，本发明提供了具有选自以下的核酸：SEQ_ID NO.5;SEQ_ID NO.6;SEQ_ID NO.7;SEQ_ID NO.8;SEQ_ID NO.9;SEQ_ID NO.10;SEQ_ID NO.11;SEQ_ID NO.12;SEQ_ID NO.13;SEQ_ID NO.14;SEQ_ID NO.15;SEQ_ID NO.16;SEQ_ID NO.17;SEQ_ID NO.18;SEQ_ID NO.23;SEQ_ID NO.24;SEQ_ID NO.25;SEQ_IDNO.26;SEQ_ID NO.27;SEQ_ID NO.28;SEQ_ID NO.29;SEQ_ID NO.30;SEQ_ID NO.31;SEQ_ID NO.32;SEQ_ID NO.33;SEQ_ID NO.64;SEQ_ID NO.65;SEQ_ID NO.66；SEQ_ID NO.67;SEQ_ID NO.68;SEQ_ID NO.69;SEQ_ID NO.70;SEQ_ID NO.71;SEQ_ID NO.85;SEQ_ID NO.86;SEQ_ID NO.87;SEQ_ID NO.88;SEQ_ID NO.89;SEQ_ID NO.90;SEQ_ID NO.91;SEQ_ID NO.92;SEQ_ID NO.93;SEQ_ID NO.94;SEQ_ID NO.96;SEQ_ID NO.97;SEQ_ID NO.99;SEQ_ID NO.100.

在第七方面，本发明提供了编码一种或多种酶的核酸，其在微生物中表达时可使得所述微生物通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

在一个实施方案中，所述核酸编码两种或多种酶，其在微生物中表达时可使得所述微生物通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

在一个实施方案中，所述本发明的核酸编码3、4、5或6种这类酶。

在一个实施方案中，所述酶选自乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh2）、醇脱氢酶（Adh）和它们中任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸包含编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）和醇脱氢酶（Adh）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸序列或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO.42的序列的乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO.43的序列的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO43和SEQ_IDNO44的序列的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO.45的序列的乙酰乙酸脱羧酶（Adc）或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO38和SEQ_IDNO40的序列的醇脱氢酶（Adh）。在一个具体实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO.1的序列的醇脱氢酶（Adh）或其功能等价变体。在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh）的功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO.73的序列的α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述核酸编码具有SEQ_ID NO.75的序列的醇脱氢酶（Adh2）或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）的核酸序列包含SEQ_ID NO.18，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）的核酸序列包含SEQ_ID NO.19，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）的核酸序列包含SEQ_ID NO.20，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酸脱羧酶（Adc）的核酸序列包含SEQ_ID NO.21，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列包含SEQ_ID NO.39或41。在一个具体实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4，或为其任一个的功能等价变体。在一个实施方案中，SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4的功能等价变体与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一个实施方案中，所述编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）的核酸序列包含SEQ_ID NO.72或76，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh2）的核酸序列包含SEQ_ID NO.74或77，或为其功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子可使得在其控制下的基因组成型表达。在一个具体实施方案中使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个具体实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个具体的实施方案中，所述启动子来自于自产醇梭菌。在一个具体实施方案中，所述启动子具有SEQ_ID NO.22、SEQ_ID NO.79的序列，或为其功能等价变体。

在第八方面，本发明提供了包含所述第七方面的一种或多种核酸的核酸构建体或载体。

在一个具体实施方案中，所述核酸构建体或载体为表达构建体或载体。在一个具体实施方案中，所述表达构建体或载体为质粒。在一个具体实施方案中，所述表达质粒具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、47、48、83、84、95、98或101。

在第九方面，本发明提供了包含任意一种或多种所述第七方面的核酸或所述第八方面的载体或构建体的宿主生物。

在第十方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明第八方面提到的表达构建体或载体以及甲基化构建体或载体。

优选地，所述组合物能够产生本发明第一方面的重组微生物。

在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体和/或所述甲基化构建体/载体为质粒。

在第十一方面，本发明提供了一种产生本发明的重组微生物的方法，包括：

a.将(i)本发明第八方面的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体导入穿梭微生物中；

b.表达所述甲基转移酶基因；

c.从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，

d.将至少所述表达构建体/载体导入目标微生物。

在一个实施方案中，步骤B中的甲基转移酶基因都是组成型表达的。在另一个实施方案中，步骤B中的甲基转移酶基因的表达是诱导的。

在一个实施方案中，所述甲基化构建体/载体和表达构建体/载体都在步骤C中分离。在另一个实施方案中，仅所述表达构建体/载体在步骤C中分离。

在一个实施方案中，仅将所述表达构建体/载体导入所述目标微生物中。在另一个实施方案中，将所述表达构建体/载体和所述甲基化构建体/载体都导入所述目标微生物中。

在一个相关的方面中，本发明提供了一种产生本发明的重组微生物的方法，包括：

a.通过甲基转移酶在体外甲基化本发明第八方面的表达构建体/载体；

b.将所述表达构建体/载体导入目标微生物中。

在另一个相关的方面中，本发明提供了一种产生本发明的重组微生物的方法，包括：

a.将甲基转移酶基因导入到穿梭微生物的基因组中

b.将本发明第八方面的表达构建体/载体导入到所述穿梭微生物中

c.从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，

d.将至少所述表达构建体/载体导入目标微生物中。

在第十二方面，本发明提供了一种通过使用本发明第一方面的重组微生物对含CO的底物的微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法。

在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(a)将含CO的底物提供至含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物的生物反应器；和

(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(a)在由工业过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；

(b)通过含有本发明第一方面的一种或多种微生物的培养物厌氧发酵所述含CO的气体以产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

在所述方法方面的具体实施方案中，将所述微生物维持在水性培养基中。

在所述方法方面的具体实施方案中，对所述底物的发酵发生在生物反应器中。

优选地，所述含CO的底物是含CO的气态底物。在一个实施方案中，所述底物包含工业废气。在某些实施方案中，所述气体是钢铁厂废气或合成气。

在一个实施方案中，所述底物通常会含有大比例的CO，例如至少约20体积%至约100体积%的CO、20体积%至70体积%的CO、30体积%至60体积%的CO和40体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%的CO、或约55体积%的CO、或约60体积%的CO。

在某些实施方案中，所述方法还包括从所述发酵液回收丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体中的一种或多种的步骤。

在第十三方面，本发明提供了通过所述第六方面的方法产生的丙酮、异丙醇以及丙酮和/或异丙醇的前体中的一种或多种。

在另一方面，本发明提供了一种用于产生本发明第一方面的微生物的方法，其包括用一种或多种外源核酸转化一氧化碳营养型产乙酸亲代微生物，使得所述微生物能够通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体，其中所述亲代微生物不能通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者它们的前体。

在一个具体实施方案中，用一种或多种外源核酸转化亲代微生物，所述外源核酸被改造为适于表达异丙醇生物合成途径中非天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，用一种或多种核酸转化亲代微生物，所述核酸被改造为适于过表达异丙醇生物合成途径中天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个具体实施方案中，用一种或多种外源核酸转化亲代微生物，所述外源核酸被改造为适于表达丙酮生物合成途径中非天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，用一种或多种外源核酸转化亲代微生物，所述外源核酸被改造为适于过表达丙酮生物合成途径中天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个具体实施方案中，用一种或多种核酸转化亲代微生物，所述核酸被改造为适于表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的非天然地存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，用一种或多种核酸转化亲代微生物，所述核酸被改造为适于过表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的天然存在于所述亲代微生物中一种或多种酶。

在某些实施方案中，所述一种或多种酶如上文所述。

在另一方面，本发明提供了一种重组微生物，其能够产生丙酮并且包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码被改造为适于将乙酰乙酯（acetoactate）转化为丙酮的一种或多种酶，其中所述重组微生物来源自能够产生乙酰乳酸而非丙酮的亲代微生物。在一个实施方案中，一种或多种酶包含KivD或其功能等价变体。

在另一方面，本发明提供了一种重组微生物，其能够产生丙酮并且包含一种或多种编码酶thlA、ctfA、ctfB和kivD中的每一种的外源核酸或其任意一种或多种的功能等价变体，其中所述重组微生物来源自不能产生乙酰乳酸、乙酰乙酰-CoA和丙酮的亲代微生物。

在另一方面，本发明提供了一种重组微生物，其能够产生丙酮并且包含一种或多种编码酶ctfA、ctfB和kivD中的每一种的外源核酸或其任意一种或多种的功能等价变体，其中所述重组微生物来源自不能产生乙酰乳酸和丙酮的亲代微生物。

广义上说，本发明还可单独或综合地包括本申请说明书中提及或指出的部分、要素和特征，包括两个或多个所述部分、要素或特征的任意或所有组合，并且当本文提及的具体整体在本发明所涉及的领域具有已知的等价物时，所述已知的等价物如同单独被提出一样纳入本文。

附图说明

本发明的这些方面和其他方面——应该以其所有新的方面考虑——将通过后文描述（仅作为示例）并参考附图而变得清楚，其中：

图1示出了自产醇梭菌（CAU）、扬氏梭菌（CLJ）和拉氏梭菌（CRA）的新的醇脱氢酶与拜季林斯基氏梭菌株NRRL-B593的仲醇脱氢酶的氨基酸比对。

图2示出了在典型的发酵运行中自产醇梭菌DSM23693的新的醇脱氢酶基因的表达，以及受Wood-Ljungdahl操纵子启动子、F₁F₀ATP酶操纵子启动子、Rnf复合体操纵子启动子和丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子控制的基因的表达。比较了多于200个目的基因的mRNA水平。

图3示出了丙酮表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc。

图4示出了用于在携带有质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc的经工程改造（engineered）的自产醇梭菌和扬氏梭菌中从含CO或CO/H₂的气体产生丙酮和异丙醇的途径。

图5示出了丙酮表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc的测序结果。

图6示出了所述设计的甲基化质粒。

图7示出了对分离自转化的自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528的质粒的PCR中ctfAB-adc（2.2kb）的检测。梯装条带（ladder）=1KB Plus DNA ladder（Invitrogen）；1=无模板对照；2=从自产醇梭菌分离的质粒；3=从扬氏梭菌分离的质粒；4=原始的pMTL85147-thlA-ctfAB-adc（阳性对照）。

图8示出了使用自产醇梭菌DSM23693+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc用钢铁厂气体进行的生长实验的结果。

图9示出了使用扬氏梭菌DSM13528+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc用钢铁厂气体进行的生长实验的结果。

图10示出了确认用自产醇梭菌DSM13528+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc（上图）和扬氏梭菌DSM13528+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc（下图）从钢铁厂气体产生丙酮的GC结果。

图11示出了确认用自产醇梭菌DSM23693+pMTL85147-thlA-ctfAB-adc从合成气产生丙酮的GC结果。

图12示出了丙酮对自产醇梭菌DSM23693的培养物的毒性。

图13示出了异丙醇对自产醇梭菌DSM23693的培养物的毒性。

图14示出了SEQ_ID NO1：自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌的新的醇脱氢酶的氨基酸序列。

图15示出了SEQ_ID NO2：自产醇梭菌的新醇脱氢酶基因的核酸序列。

图16示出了SEQ_ID NO3：扬氏梭菌的新醇脱氢酶基因的核酸序列。

图17示出了SEQ_ID NO4：拉氏梭菌的新醇脱氢酶基因的核酸序列。

图18示出了SEQ_ID NO18：丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶基因（thlA）的核酸序列。

图19示出了SEQ_ID NO19：拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（ctfA）基因的核酸序列。

图20示出了SEQ_ID NO20：拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（ctfB）基因的核酸序列。

图21示出了SEQ_ID NO21：拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的乙酰乙酸脱羧酶（adc）基因的核酸序列。

图22示出了SEQ_ID NO22：自产醇梭菌的Wood-Ljungdahl簇启动子（P_WL）的核酸序列。

图23示出了SEQ_ID NO34：设计的II型甲基转移酶基因的氨基酸序列。

图24示出了SEQ_ID NO35：设计的II型甲基转移酶基因的核酸序列。

图25示出了SEQ_ID NO38：拜季林斯基氏梭菌NRRL B-593的NADP依赖型醇脱氢酶的氨基酸序列。

图26示出了SEQ_ID NO39：拜季林斯基氏梭菌NRRL B-593的NADP依赖型醇脱氢酶的核酸序列。

图27示出了SEQ_ID NO40：布氏嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter brockii）ATCC53556的NADP依赖型醇脱氢酶的氨基酸序列。

图28示出了SEQ_ID NO41：布氏嗜热厌氧杆菌的醇脱氢酶的核酸序列。

图29示出了SEQ_ID NO42：丙酮丁醇梭菌ATCC824的硫解酶ThlA的氨基酸序列。

图30示出了SEQ_ID NO43：拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A CtfA的氨基酸序列。

图31示出了SEQ_ID NO44：拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A CtfB的氨基酸序列。

图32示出了SEQ_ID NO45：拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的乙酰乙酸脱羧酶Adc的氨基酸序列。

图33示出了SEQ_ID NO46：含有新醇脱氢酶的表达质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的核酸序列。

图34示出了SEQ_ID NO47：拜季林斯基氏梭菌的乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（ctfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（ctfB）和乙酰乙酸脱羧酶（adc）操纵子的核酸序列。

图35示出了SEQ_ID NO48：含有新醇脱氢酶的表达质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc-adh的核酸序列。

图36示出了SEQ_ID NO49：设计的甲基化质粒的核酸序列。

图37示出了SEQ_ID NO50：lac启动子的核酸序列。

图38示出了SEQ_ID NO51：自产醇梭菌F₁F₀ATP酶操纵子启动子区域的核酸序列。

图39示出了SEQ_ID NO52：自产醇梭菌Rnf复合体操纵子启动子区域的核酸序列。

图40示出了SEQ_ID NO53：自产醇梭菌丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子区域的核酸序列。

图41示出了含有新醇脱氢酶的表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh的测序结果。

图42示出了用携带对照质粒（pMTL85147）、丙酮表达质粒（pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc）和包含新醇脱氢酶的丙酮表达质粒（pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh）的大肠杆菌（E.coli）XL-1BlueMRF’Kan进行的丙酮和异丙醇生产的结果。

图43示出了含有新醇脱氢酶的表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh。

图44示出了SEQ_ID NO56：扬氏梭菌的Wood-Ljungdahl簇启动子（P_WL）的核酸序列。

图45示出了SEQ_ID NO57：拉氏梭菌的Wood-Ljungdahl簇启动子（P_WL）的核酸序列。

图46示出了SEQ_ID NO58：扬氏梭菌F₁F₀ATP酶操纵子启动子区域的核酸序列。

图47示出了SEQ_ID NO59：拉氏梭菌F₁F₀ATP酶操纵子启动子区域的核酸序列。

图48示出了SEQ_ID NO60：扬氏梭菌Rnf复合体操纵子启动子区域的核酸序列。

图49示出了SEQ_ID NO61：拉氏梭菌Rnf复合体操纵子启动子区域的核酸序列。

图50示出了SEQ_ID NO62：扬氏梭菌丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子区域的核酸序列。

图51示出了SEQ_ID NO63：拉氏梭菌丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子区域的核酸序列。

图52示出了在含有质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的自产醇梭菌中确认对用于异源基因thlA、ctfA、ctfB和adc的探针的扩增的qRT-PCR扩增曲线。

图53示出了在含有质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的扬氏梭菌中确认对用于异源基因thlA、ctfA、ctfB和adc的探针的扩增的qRT-PCR扩增曲线。

图54示出了SEQ_ID No.73：乳酸乳球菌KF147的α-酮异戊酸脱羧酶KivD的氨基酸序列，SEQ_ID No.72：α-酮酸脱羧酶（kivd）的核酸序列。

图55示出了Seq.ID No.76：α-酮酸脱羧酶（kivd）的密码子优化的序列，SEQ_ID No.75:酿酒酵母的醇脱氢酶Adh2的氨基酸序列，SEQ_ID No.74:醇脱氢酶（adh2）的核酸序列。

图56示出了Seq.ID No.78：密码子优化的α-酮酸脱羧酶（kivd）和醇脱氢酶（Adh2）的合成操纵子，包括带有核糖体结合位点的间隔序列，两侧有NdeI和KpnI，Seq.ID No.77：醇脱氢酶（Adh2）的密码子优化的序列。

图57示出了SEQ_ID No.82：大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85245的核酸序列，SEQ_ID No.79：自产醇梭菌的磷酸转乙酰酶乙酸激酶启动子的核酸序列。

图58示出了SEQ_ID No.83：表达质粒pMTL85245-kivd-adh2的核酸序列。

图59示出了SEQ_ID No.84：表达质粒pMTL85245-kivd的核酸序列。

图60示出了SEQ_ID No.93：表达质粒pMTL85245-P-thl-ctfAB-P-kivd的核酸序列。

图61示出了SEQ_ID No.98：表达质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2的核酸序列。

图62示出了SEQ_ID No.101：表达质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P-kivd–adh2的核酸序列。

图63示出了丙酮表达质粒pMTL85245-kivd-adh2。

图64示出了丙酮表达质粒pMTL85245-kivd。

图65示出了确认用作为对照株的自产醇梭菌DSM23693（上图）和自产醇梭菌DSM23693+pMTL85245-kivd-adh2（下图）从含CO的钢铁厂气体进行的丙酮和异丙醇生产的GC结果。

图66示出了确认用自产醇梭菌DSM23693+pMTL85245-kivd从含CO的钢铁厂气体进行的丙酮和异丙醇生产的GC结果。

图67示出了丙酮表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-P-kivd。

图68示出了丙酮表达质粒pMTL83147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh。

图69示出了丙酮表达质粒pMTL83147-thlA-ctfA-ctfB-adc-P-kivd-adh。

图70示出了确认用自产醇梭菌DSM23693（上图）和自产醇梭菌DSM23693+pMTL85245-Pwl-thlA-ctfAB-kivd从含CO的钢铁厂气体进行的丙酮和异丙醇生产的GC结果。

图71示出了确认用自产醇梭菌DSM23693+pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2从含CO的钢铁厂气体进行的丙酮和异丙醇生产的GC结果。

图72示出了确认用自产醇梭菌DSM23693+pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P-kivd-adh2从含CO的钢铁厂气体进行的丙酮和异丙醇生产的GC结果。

图73示出了在大肠杆菌和自产醇梭菌中异源表达的梭菌途径基因以及密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮酸脱羧酶Kivd和酿酒酵母的醇脱氢酶Adh2的测试基因组合。

图74示出了当用含CO的钢铁厂气体作为底物进料给自产醇梭菌DSM23693的稳定连续培养物时，丙酮向异丙醇的高浓度和速率的完全转化。

具体实施方式

以下是在广义上给出的对本发明（包括其优选的实施方案）的说明。下文在标题“实施例”下给出的公开内容进一步解释本发明，其提供了支持本发明的实验数据、本发明多个方面的具体实例以及实施本发明的方法。

在以前没有报告过通过对含CO的底物的微生物发酵产生丙酮和/或异丙醇。本发明的发明人现已证明（尤其是），通过遗传修饰，在能够使用CO作为碳源和能源的一氧化碳营养型产乙酸细菌种中进行的丙酮和异丙醇生产。令人惊奇地，本发明人还已经能够证明在存在含CO的气体的情况下通过密切相关的一氧化碳营养型产乙酸种自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌进行的丙酮到异丙醇的天然酶转化。鉴定了新的醇脱氢酶，其被证明在用自产醇梭菌进行的正常发酵运行以高水平组成型表达并能够以高浓度和比率将丙酮转化为异丙醇。本发明人还已发现在自产醇梭菌中令人惊奇地赋予针对丙酮和异丙醇的活性的两个基因。尚未报道过这些基因——来自乳酸乳球菌的α-酮酸脱羧酶（kivd）和来自酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2），可赋予针对丙酮或异丙醇或其任一前体的活性，而是将氨基酸前体转化为支链醇。本发明人证明了使用几种不同基因和酶组合在自产醇梭菌中从CO产生丙酮和异丙醇。

因此，本发明提供了，例如，用于通过微生物发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法、用于这种方法的遗传修饰的微生物、适于制备遗传修饰的微生物的核酸以及新的醇脱氢酶和编码所述醇脱氢酶的核酸。

本文中提到的“发酵液”是包含至少一种营养培养基和细菌细胞的培养基。

本文中提到的穿梭微生物是其中表达甲基转移酶的微生物，并且其不同于目标微生物。

本文中提到的目标微生物是其中表达包括在表达构建体/载体上的基因的微生物，并且其不同于所述穿梭微生物。

术语“主要发酵产物”意指以最高的浓度和/或产率产生的那种发酵产物。

当用于发酵过程时，术语“提高效率”、“提高的效率”等包括但不限于提高如下中的一个或多个：催化所述发酵的微生物的生长速率、在升高的丙酮和/或异丙醇浓度下的生长和/或产物产生速率、产生的所需产物的体积/消耗的底物的体积、所需产物的产生速率或产生水平、以及产生的所需产物与所述发酵的其他副产物相比的相对比例。

短语“含一氧化碳的底物”及类似术语应被理解为包括任意底物，其中一氧化碳可被一种或多种细菌菌株用于例如生长和/或发酵。

短语“含一氧化碳的气态底物”及类似短语和术语包括含有某一水平一氧化碳的任意气体。在某些实施方案中，所述底物含有至少约20体积%至约100体积%的CO、20体积%至70体积%的CO、30体积%至60体积%的CO和40体积%至55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物包含约25体积%、或约30体积%、或约35体积%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%的CO、或约55体积%的CO、或约60体积%的CO。

虽然所述底物不必需含有任何氢气，但是存在H₂应该不会对本发明方法的产物不利。在具体实施方案中，存在氢气可获得提高的醇产生的整体效率。例如，在具体实施方案中，所述底物可包含约2:1、或1:1或1:2比例的H₂:CO。在一个实施方案中，所述底物包含约30体积%或更低的H₂、20体积%或更低的H₂、约15体积%或更低的H₂、或者约10体积%或更低的H₂。在其他实施方案中，所述底物流包含低浓度的H₂，例如小于5体积%、或小于4体积%、或小于3体积%、或小于2体积%、或小于1体积%或者基本上不含氢气。例如，所述底物还可含有一些CO₂，例如约1体积%至约80体积%的CO₂或1体积%至约30体积%的CO₂。在一个实施方案中，所述底物包含小于或等于约20体积%的CO₂。在具体的实施方案中，所述底物包含小于或等于约15体积%的CO₂、小于或等于约10体积%的CO₂、小于或等于约5体积%的CO₂或者基本上不含CO₂。

在以下的说明书中，从递送和发酵“含CO的气态底物”的方面描述本发明的实施方案。但是，应理解，所述气态底物可以其他形式提供。例如，所述含CO的气态底物可以溶解于液体中的形式提供。实质上，将液体用含一氧化碳的气体饱和，然后将所述液体加入生物反应器中。这可使用标准的方法学实现。例如，可使用微泡分散发生器（Hensirisaket.al.Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobicfermentation;Applied Biochemistry and Biotechnology Volume101,Number3/October,2002）。又例如，可将所述含CO的气态底物吸附到固态支持物上。这些替代方法被术语“含CO的底物”等所涵盖。

在本发明的具体实施方案中，所述含CO的气态底物是工业排气或废气。“工业废气或工业排气”应被广义地认为包括工业过程产生的任何含CO的气体，并且包括铁金属产品生产、有色金属产品生产、石油精炼过程、煤的气化、生物质的气化、电力生产、炭黑生产和焦炭生产所产生的气体。本文其他部分还提供了另外的实例。

除非另有说明，否则本文所用的短语“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”等意图包括所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。如下所述，在一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，向发酵反应中加入金属或组合物应被理解为包括加入到这些反应器之一或两个中。

术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排布组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器（CSTR）、固定化细胞反应器（ICR）、滴流床反应器（TBR）、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或适用于气-液接触的其他容器或其他装置。在一些实施方案中，所述生物反应器可包含第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到向所述生物反应器或发酵反应中加入底物时，如果合适，应该理解为加入到这些反应器之一或两个中。

“外源核酸”是源自待导入其的微生物之外的核酸。外源核酸可源自任意适合的来源，包括但不限于待引入它们的微生物、与待引入它们的生物不同的微生物菌株或种，或者它们可通过人工或重组方法形成。在一个实施方案中，所述外源核酸代表天然存在于待导入它们的微生物中的核酸序列，将它们导入以增加具体基因的表达或过表达（例如，通过增加所述序列（例如基因）的拷贝数，或导入强的或组成型启动子以增加表达）。在另一个实施方案中，所述外源核酸代表非天然存在于待导入它们的微生物中的核酸序列，其使得可表达非天然存在于所述微生物中的产物或者增加所述微生物中天然基因的表达（例如在导入调节元件例如启动子的情况下）。所述外源核酸可被改造为适于整合到待导入其的微生物的基因组中，或者保持染色体外状态。

应理解，可使用序列不同于本文具体示例的序列的核酸实施本发明，条件是它们可执行基本相同的功能。对于编码蛋白质或肽的核酸序列，这意味着所编码的蛋白质或肽具有基本相同的功能。对于代表启动子序列的核酸序列，所述变体序列应具有促进一个或多个基因表达的能力。在本文中，这类核酸可称为“功能等价变体”。例如，核酸的功能等价变体包括等位基因变体、基因片段、包含突变（缺失、插入、核苷酸置换等）和/或多态性的基因等。来自其他微生物的同源基因也可被看作是本文具体示例的序列的功能等价变体的实例。这些包括在诸如丙酮丁醇梭菌、拜季林斯基氏梭菌、糖丁酸梭菌（C.saccharobutylicum）和糖乙酸多丁醇（C.saccharoperbutylacetonicum）的种中的同源基因，其详情在网站例如Genbank或NCBI可以公开获得。对来源自酿酒酵母和乳酸乳球菌的基因的情况中，可以在例如表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）（例如NP_765765.1、EGG67352.1、ZP_04826144.1、ZP_04797999.1）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）（例如ZP_04273468.1、ZP_04317620.1）和苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）（例如YP_003664720.1）中发现同源基因。短语“功能等价变体”还应被认为包括其序列因针对具体生物的密码子优化而改变的核酸。本文中，核酸的“功能等价变体”优选地与所鉴定的核酸具有至少约70%、优选约80%、更优选约85%、优选约90%、优选约95%或更高的核酸序列同一性。

应理解，可使用其序列不同于本文具体示例的氨基酸序列的多肽实施本发明。这些变体在本文中可称作“功能等价变体”。蛋白质或肽的功能等价变体包括与所鉴定的蛋白质或肽具有至少40%，优选50%、优选60%、优选70%、优选75%、优选80%、优选85%、优选90%、优选95%或更高的氨基酸同一性，并且具有与目标肽或蛋白质基本相同功能的那些蛋白质或肽。所述变体在其范围内包括蛋白质或肽的片段，其中所述片段包括截短形式的多肽，其中缺失可为1到5个、到10个、到15个、到20个、到25个氨基酸，并可在所述多肽的任一末端延伸1到25个残基，并且其中缺失可以是所述区域内的任意长度；或可以位于内部位置。本文中具体多肽的功能等价变体还应被认为包括由其他的细菌种（例如前段中示例的）中的同源基因表达的多肽。

本文中“基本相同的功能”意指所述核酸或多肽的变体能够执行所述核酸或多肽的功能。例如，本发明的酶的变体能够催化与所述酶相同的反应。但是，不应认为所述多肽或核酸的变体与所述多肽或核酸具有相同的活性水平。

人们可以使用任意数量的已知方法评估核酸或多肽的功能等价变体是否具有与所述核酸或多肽基本上相同的功能。但是，例如Wiesenborn et al[Thiolase from Clostridium acetobutylicum ATCC824and Its Role in the Synthesis of Acids and Solvents.Appl EnvironMicrobiol.1988,54:2717–2722]、Wiesenborn et al[Coenzyme Atransferase from Clostridium acetobutylicum ATCC824and its role inthe uptake of acids.Appl Environ Microbiol.1989,55:323-9.]、Peterson和Bennet[Purification of acetoacetate decarboxylase from Clostridiumacetobutylicum ATCC824and cloning of the acetoacetate decarboxylasegene in Escherichia coli.Appl Environ Microbiol.199056:3491–3498]、Ismail et al.[Purification and characterization of a primary-secondaryalcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.JBacteriol1993,175:5097-5105]、de la Plaza et al[Biochemical andmolecular characterization of a-ketoisovalerate decarboxylase,anenzyme involved in the formation of aldehydes from amino acids byLactococcus lactis.FEMS Microbiol Lett.2004238:367-374]或Khorkinet al[NADP-dependent bacterial alcohol dehydrogenases:crystalstructure,cofactor-binding and cofactor specificity of the ADHs ofClostridium beijerinckii and Thermoanaerobacter brockii.J Mol Biol.1998,22:278(5):967-981]中记载的方法可用于评估酶活性。

当用于本发明时，“过表达”、“过量表达”及类似术语和短语应被广义地认为包括，在相同条件下与亲代微生物的一种或多种蛋白表达水平相比所述蛋白表达的任何增加。其不应被认为意指所述蛋白以任何具体水平表达。

“亲代微生物”是用于产生本发明的重组微生物的微生物。所述亲代微生物可以是天然存在的微生物（即野生型微生物）或之前曾被修饰过但是不表达或不过表达本发明的一种或多种酶的微生物。因此，本发明的重组微生物已被修饰以表达或过表达在所述亲代微生物中不表达或不过表达的一种或多种酶。

术语核酸“构建体”或“载体”及类似术语应被广义地认为包括适合用作载体将遗传物质转移到细胞中的任意核酸（包括DNA和RNA）。该术语应被认为包括质粒、病毒（包括噬菌体）、粘粒和人工染色体。构建体或载体可包括一种或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或选择标记。在一个具体的实施方案中，所述构建体或载体被改造为适于使得由所述构建体或载体编码的一种或多种基因表达。核酸构建体或载体包括裸露核酸，以及用一种或多种可帮助向细胞的递送的试剂配制的核酸（例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的有机体）。

所述“异丙醇生物合成途径”是使CO或CO/H₂代谢为异丙醇的酶促途径，例如如图4中所示。

所述“丙酮生物合成途径”是使CO或CO/H₂代谢为丙酮的酶促途径，例如如图4中所示。

丙酮的“前体”包括乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA、乙酰乙酸、乙酰-磷酸和乙酸。

异丙醇的“前体”包括乙酰-CoA、乙酰乙酰-CoA、乙酰乙酸、丙酮、乙酰-磷酸和乙酸。

提到“醇脱氢酶”应被认为包括能够催化酮（例如丙酮）转化为仲醇（例如异丙醇）的醇脱氢酶，或者反之亦然。这样的醇脱氢酶包括仲醇脱氢酶和伯醇脱氢酶。“仲醇脱氢酶”是可将酮（例如丙酮）转化为仲醇（例如异丙醇）的醇脱氢酶，或反之亦然。“伯醇脱氢酶”是可将醛转化为伯醇的醇脱氢酶，或反之亦然；但是，许多伯醇脱氢酶也能够催化酮转化为仲醇，或反之亦然。这些醇脱氢酶也可称为“伯醇-仲醇脱氢酶”。

如上文所述，本发明提供了一种能够通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的重组微生物。

在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达异丙醇生物合成途径中非天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达异丙醇生物合成途径中天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中非天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达丙酮生物合成途径中天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个具体实施方案中，所述微生物被改造为适于表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的非天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。在另一个实施方案中，所述微生物被改造为适于过表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的天然存在于所述亲代微生物中的一种或多种酶。

在一个实施方案中，所述亲代微生物能够发酵含CO的底物以产生丙酮但不能将丙酮转化为异丙醇，并且所述重组微生物被改造为适于表达在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。

在另一个实施方案中，所述亲代微生物能够将丙酮转化为异丙醇但不能够发酵含CO的底物以产生丙酮，并且所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶。

在一个实施方案中，所述亲代微生物不能发酵含CO的底物以产生丙酮和异丙醇，并且所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶以及在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。

通过任意数量的重组方法将所述微生物改造为适于表达或过表达所述一种或多种酶，所述方法包括例如增加所述微生物中天然基因的表达（例如通过导入更强的启动子或组成型启动子以驱动基因表达），通过导入编码并被改造为适于表达具体酶的外源核酸、导入编码并被改造为适于表达在所述亲代微生物中并不天然存在的酶的外源核酸来增加编码所述酶的基因的拷贝数。

在某些实施方案中，所述亲代微生物可被转化以提供以下组合：所述亲代微生物中天然存在的一种或多种基因的表达或过表达以及一种或多种所述亲代微生物中非天然存在的基因的导入。例如，编码丙酮生物合成途径中的酶的一种或多种基因可以是所述亲代微生物中天然存在的，但是其可能不包括编码在丙酮到异丙醇的转化中涉及的酶的一种或多种基因，或者反之亦然。可将所述微生物工程改造以过表达所述编码丙酮生物合成途径中的酶的一种或多种天然基因，以及导入编码在丙酮到异丙醇的转化中涉及的酶的基因，或反之亦然。类似地，可将所述微生物工程改造以过表达丙酮生物合成途径（和/或丙酮到异丙醇的转化）中的一种或多种酶，以及导入编码在同一途径中涉及的酶的一种或多种基因。技术人员应了解本发明使用的多种其他组合。

在一个实施方案中，所述丙酮生物合成途径中的一种或多种酶选自：

乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）；

乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9)；

乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9)；

乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）；

α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）；和，

其任意一种或多种的功能等价变体。

仅为举例，所述每个肽的序列信息在下文的表6或表18中提供。

本发明的微生物中使用的酶可以来源自任何适当来源，包括不同属和种的细菌或其他生物。但是在一个实施方案中，乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）来源自丙酮丁醇梭菌。在一个实施方案中，乙酰-辅酶A乙酰转移酶具有下文表6中示例的氨基酸序列，或者其为所述序列的功能等价变体。

在一个实施方案中，酶α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）来源自乳酸乳球菌。

在一个实施方案中，每种酶具有下文表6或18中示例的氨基酸序列，或者其为所述序列的功能等价变体。

醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）；

醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）；和，

其功能等价变体。

同样，本发明使用的醇脱氢酶可来源自任何适当来源，包括不同属和种的细菌（例如下文表13中示例的细菌种）。但是，在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh）来源自自产醇梭菌、扬氏梭菌和/或拉氏梭菌。在一个实施方案中，所述醇脱氢酶具有SEQ_ID NO.1的氨基酸序列，或者其为所述序列的功能等价变体。在一个实施方案中，所述功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一个实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh2）来源自酿酒酵母。

在一个实施方案中，所述微生物包含一种或多种被改造为适于增加所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸的表达的外源核酸，并且所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸编码上文提到的一种或多种酶。在一个实施方案中，所述被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸为调节元件。在一个实施方案中，所述调节元件为启动子。在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子，其优选地在适合的发酵条件下具有高活性。还可以使用诱导型启动子。在优选实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇或磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子。在一个实施方案中，所述启动子具有SEQ_ID No.22或77的序列，或为其功能等价变体。在另一个实施方案中，可以使用Wood-Ljungdahl簇启动子（P_WL）（SEQ ID No.56或57）、F₁F_O-ATP酶操纵子的启动子区域（SEQ_ID NO51、58或59)、Rnf复合体操纵子启动子区域（SEQ_ID NO52、60或61），或丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（SEQ_ID NO53、62或63）启动子区域。本领域技术人员应了解，可指导表达（优选在适合的发酵条件下高水平表达）的其他启动子也可作为所示例的实施方案的其他替代方案起效。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）中的每一种的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）的一种或多种外源核酸，或其功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）和醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）中的每一种的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）和α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）中的每一种的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个具体实施方案中，所述微生物包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在另一个具体实施方案中，所述微生物包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种的一种或多种外源核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）由包含SEQ_ID NO.18的核酸或其功能等价变体编码。在一个实施方案中，乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）由包含SEQ_ID NO.19的核酸或其功能等价变体编码。在一个实施方案中，乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）由包含SEQ_ID NO.20的核酸或其功能等价变体编码。在一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶（Adc）由包含SEQ_ID NO.21的核酸或其功能等价变体编码。在一个实施方案中，α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）由包含SEQ_ID NO.72或76的核酸或其任一个的功能等价变体编码。在一个实施方案中，醇脱氢酶（Adh）由包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4的核酸或其任一个的功能等价变体编码。在一个实施方案中，醇脱氢酶（Adh2）由包含SEQ_ID NO.74或77的核酸或其任一个的功能等价变体编码。

所述微生物可以包含一种或多种外源核酸。在需要用两种或多种遗传元件（例如基因或调节元件（例如启动子））转化所述亲代微生物时，它们可被包含在一种或多种外源核酸中。

在一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸为核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中为质粒，其编码上文提到的一种或多种酶（任意组合形式）。在一个具体实施方案中，所述构建体编码ThlA、CtfA、CtfB和Adc中的每一种，以及任选的Adh。在另一个实施方案中，所述一种或多种外源核酸为核酸构建体或载体，在一个具体实施方案中为质粒，其编码Adh和任选的ThlA、CtfA、CtfB和/或Adc。在一个具体实施方案中，所述构建体编码全部的ThlA、CtfA、CtfB、Adc和Adh。根据本文他处的描述，显而易见的是，所述载体还可包含编码替代的酶组合的其他核酸组合。在一个具体实施方案中，所述载体以任意顺序包含核酸序列SEQ_ID NO.19、20、21和22中的1、2、3或4个，或其任一个的功能等价变体。在另一个实施方案中，所述载体以任意顺序包含SEQ_ID_NO.2、3和/或4，或其任一个的功能等价变体。在一个实施方案中，所述载体以任意顺序包含序列SEQ_ID NO.19、20、21和22中的1、2、3或4个，或其任一个的功能等价变体，以及SEQ_ID NO.2、3或4，或其任一个的功能等价变体。

在另一个实施方案中，所述载体包含SEQ ID No.72、76、74、77中的一个或多个，单独地或与由SEQ ID No.19、20、21、22、2、3和4表示的核酸中的一个或多个结合地。

在转化所述亲代微生物时，所述外源核酸可以保持在染色体外或可以整合到所述亲代微生物的基因组中。因此，它们可以包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造为适于帮助整合（例如可允许同源重组并靶向整合到宿主基因组中的区域）或帮助染色体外构建体的表达和复制（例如复制起点、启动子和其他调节元件或序列）。

在一个实施方案中，所述编码上文提到的一种或多种酶的外源核酸还会包含被改造为适于促进由所述外源核酸编码的一种或多种酶的表达的启动子。在一个实施方案中，所述启动子是组成型启动子，其优选地在适合的发酵条件下具有高活性。还可以使用诱导型启动子。在优选实施方案中，所述启动子选自Wood-Ljungdahl基因簇和磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在一个实施方案中，所述启动子具有SEQ_ID No.22、SEQ ID No.77的序列，或为其任一个的功能等价变体。在另一个实施方案中，可以使用Wood-Ljungdahl簇启动子（P_WL）（SEQ ID No.56或57）、F₁F_O-ATP酶操纵子的启动子区域（SEQ_ID NO51、58或59)、Rnf复合体操纵子启动子区域（SEQ_ID NO52、60或61），或丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（SEQ_ID NO53、62或63）启动子区域。本领域技术人员应了解，可指导表达（优选在适合的发酵条件下高水平表达）的其他启动子也作为所示例的实施方案的替代方案起效。

在一个实施方案中，所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌。在某些实施方案中，所述微生物选自：自产醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、德氏梭菌、粪味梭菌、科斯卡塔梭菌（Clostridium coskatii）、淤泥丁酸杆菌、甲基营养丁酸杆菌、伍氏醋酸杆菌、巴氏嗜碱菌、Blautia producta、淤泥真杆菌、热醋穆尔氏菌、热自养穆尔氏菌、普氏产醋杆菌和凯伍热厌氧菌。

在一个具体的实施方案中，所述亲代微生物选自产醇、产乙酸梭菌类群（cluster），包括自产醇梭菌种、扬氏梭菌种和拉氏梭菌种及相关分离株。其包括但不限于以下菌株：自产醇梭菌JAI-1^T（DSM10061）[Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol1994,4:345-351]、自产醇梭菌LBS1560（DSM19630）[Simpson SD,Forster RL,Tran PT,Rowe MJ,Warner IL:Novelbacteria and methods thereof.International patent2009,WO/2009/064200]、自产醇梭菌LBS1561（DSM23693）、扬氏梭菌PETC^T（DSM13528=ATCC55383）[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in ClostridialrRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol1993,43:232-236]、扬氏梭菌ERI-2（ATCC55380）[Gaddy JL:Clostridium stain whichproduces acetic acid from waste gases.US patent1997,5,593,886]、扬氏梭菌C-01（ATCC55988）[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbialprocess for the preparation of acetic acid as well as solvent for itsextraction from the fermentation broth.US patent,2002,6,368,819]、扬氏梭菌O-52（ATCC55989）[Gaddy JL,Clausen EC,Ko C-W:Microbial process for the preparation of acetic acid as well as solventfor its extraction from the fermentation broth.US patent,2002,6,368,819]、拉氏梭菌P11^T（ATCC BAA-622）[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.International patent2008,WO2008/028055]，相关分离株例如“科斯卡塔梭菌”[Zahn et al-Novel ethanologenic species Clostridium coskatii(US Patent Application number US20110229947)]或者突变菌株例如扬氏梭菌OTA-1（Tirado-Acevedo O.Production of Bioethanol fromSynthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii.PhD thesis,North CarolinaState University,2010）。这些菌株形成梭菌rRNA类群I中的亚群，并且它们的16S rRNA基因的同一性超过99%并具有相似的低GC含量（约30%）。但是，DNA-DNA重缔合和DNA指纹法实验显示这些株属于不同的种[Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation andCharacterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO2008/028055]。

该类群的所有种具有相似的形态和大小（对数生长的细胞为0.5-0.7×3-5μm），其是嗜温性的（最佳生长温度介于30-37℃）并且严格厌氧[Tanner RS,Miller LM,Yang D:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,anAcetogenic Species in Clostridial rRNA Homology Group I.Int J SystBacteriol1993,43:232-236；Abrini J,Naveau H,Nyns E-J:Clostridiumautoethanogenum,sp.nov.,an anaerobic bacterium that producesethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol1994,4:345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization ofnovel Clostridial Species.国际专利2008,WO2008/028055]。此外，它们都具有相同的主要系统发育性状，例如相同的pH范围（pH4-7.5，最佳起始pH为5.5-6）、依靠含CO气体的强的自养生长（有相似的生长速率），和相似的以乙醇和乙酸作为主要发酵终产物的代谢谱（在特定条件下形成的少量2,3-丁二醇和乳酸）。[Tanner RS,Miller LM,YangD:Clostridium ljungdahlii sp.nov.,an Acetogenic Species in ClostridialrRNA Homology Group I.Int J Syst Bacteriol1993,43:232-236；AbriniJ,Naveau H,Nyns E-J:Clostridium autoethanogenum,sp.nov.,ananaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide.Arch Microbiol1994,4:345-351；Huhnke RL,Lewis RS,Tanner RS:Isolation and Characterization of novel Clostridial Species.国际专利2008,WO2008/028055]。并且在所有3个种中都观察到吲哚生产。但是，所述种在多种糖（例如鼠李糖、阿拉伯糖）、酸（例如葡萄糖酸、柠檬酸）、氨基酸（例如精氨酸、组氨酸）或其他底物（例如甜菜碱、丁醇）的底物利用方面有差异。此外，发现所述种中的一些是特定维生素（例如硫胺素、生物素）营养缺陷型的，而其他种不是。

在一个实施方案中，所述亲代菌株使用CO作为其唯一的碳源和能源。

在一个实施方案中，所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA、CtfB、Adc、KivD、Adh和Adh2的一个或多个基因。在一个具体实施方案中，所述亲代微生物缺少编码Adh的基因。在另一个具体实施方案中，所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA、CtfB、Adc以及KivD的基因中的每一种。

本发明人鉴定了新的Adh蛋白。因此，本发明提供了具有SEQ_IDNO.1的氨基酸序列的醇脱氢酶（Adh），或其任一个的功能等价变体。在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh）的功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

另外，本发明提供了编码SEQ_ID NO.1的Adh的核酸，或其功能等价变体。考虑到本文提供的氨基酸序列和其中的遗传密码和简并性，本领域技术人员会容易地了解这样的核酸。但是，例如，编码SEQ_IDNO.1的Adh的核酸包括SEQ_ID NO.2、3或4的核酸，或其功能等价变体。在一个具体实施方案中，SEQ_ID NO.2、3或4的功能等价变体是与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核酸。

本发明还提供了能够与核酸SEQ_ID NO.2、3或4、与其任一个互补的核酸或其任一个的功能等价变体的至少一部分杂交的核酸。这种核酸优选地可在严格杂交条件下与SEQ_ID NO.2、3或4的核酸、与其任一个互补的核酸或其任一个的功能等价变体杂交。“严格杂交条件”意指核酸能够在标准杂交条件（例如Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA中记载的杂交条件）下与目标模板杂交。应理解，这种核酸的最小尺寸是能够在给定核酸和其被设计用于杂交的互补序列之间形成稳定杂交体的尺寸。因此，所述尺寸取决于所述核酸的组成和所述核酸与其互补序列之间的同源性百分比，以及所用的杂交条件（例如温度和盐浓度）。在一个实施方案中，所述核酸长度为至少个10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸或至少30个核苷酸。

本发明人还鉴定了许多新的可用作探针和引物的核酸，在下文实施例部分详细描述。例如SEQ_ID NO.5;SEQ_ID NO.6;SEQID NO.7;SEQ_ID NO.8;SEQ_ID NO.9;SEQ_ID NO.10;SEQ_ID NO.11;SEQ_ID NO.12;SEQ_ID NO.13;SEQ_ID NO.14;SEQ_ID NO.15;SEQ_ID NO.16;SEQ_ID NO.17;SEQ_ID NO.18;SEQ_ID NO.23;SEQ_ID NO.24;SEQ_ID NO.25;SEQ_ID NO.26;SEQ_ID NO.27;SEQ_IDNO.28;SEQID NO.29;SEQ_ID NO.30;SEQ_ID NO.31;SEQ_ID NO.32;SEQ_ID NO.33;SEQ_ID NO.64;SEQ_ID NO.65;SEQ_ID NO.66;SEQ_ID NO.67;SEQ_ID NO.68;SEQ_ID NO.69;SEQ_ID NO.70;SEQ_ID NO.71;SEQ_ID NO.85;SEQ_ID NO.86;SEQ_ID NO.87;SEQ_ID NO.88;SEQ_ID NO.89;SEQ_ID NO.90;SEQ_ID NO.91;SEQ_ID NO.92;SEQ_ID NO.93;SEQ_ID NO.94;SEQ_ID NO.96;SEQ_ID NO.97;SEQ_ID NO.99;SEq_ID NO.100.

本发明还提供了用于产生本发明的重组微生物的核酸和核酸构建体。

在一个实施方案中，所述核酸包含编码一种或多种所述酶的序列，其在微生物中表达时可使得所述微生物通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。在一个具体实施方案中，本发明提供了编码两种或多种酶的核酸，其在微生物中表达时可使得所述微生物通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。在一个实施方案中，本发明的核酸编码3、4、5或6种所述酶。

在一个具体实施方案中，所述酶选自乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh）、醇脱氢酶（Adh2），和其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）和醇脱氢酶（Adh）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸以任意顺序包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）和醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸序列，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）和α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）种的每一种的核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）的核酸，或其功能等价变体。

在一个实施方案中，本发明的核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）和醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

在另一个实施方案中，本发明的核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）和醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸，或其任意一种或多种的功能等价变体。

如本文别处所述，编码每种上述酶的示例性氨基酸序列和核酸序列在GenBank中提供（参见，具体地。下文表6和18中提供的实例）。但是，考虑到本文、GenBank和其他数据库中含有的信息和遗传密码，本领域技术人员会容易地理解编码所述酶或其功能等价变体的替代核酸序列。

在一个实施方案中，乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）具有Seq_ID No.42的序列或其功能等价变体。在一个实施方案中，乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）具有Seq_ID No.43的序列或其功能等价变体。在一个实施方案中，乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）具有Seq_ID No.44的序列或其功能等价变体。在一个实施方案中，乙酰乙酸脱羧酶（Adc）具有Seq_ID No.45的序列或其功能等价变体。在一个实施方案中，α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）具有Seq_ID No.73的序列或其功能等价变体。在一个实施方案中，醇脱氢酶（Adh）具有SEQ_ID NO38和SEQ_ID NO40的序列。在一个具体实施方案中，醇脱氢酶（Adh）具有SEQ_ID NO.1的序列或其功能等价变体。在一个具体实施方案中，所述醇脱氢酶（Adh）的功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一个实施方案中，醇脱氢酶（Adh2）具有SEQ_ID NO75的序列或其功能等价变体。

在一个实施方案中，所述编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）的核酸序列包含SEQ_ID NO.18，或是其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）的核酸序列包含SEQ_ID NO.19，或是其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）的核酸序列包含SEQ_ID NO.20，或是其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码乙酰乙酸脱羧酶（Adc）的核酸序列包含SEQ_ID NO.21，或是其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）的核酸序列包含SEQ_ID NO.72或76，或是其任一个的功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh2）的核酸序列包含SEQ_ID NO.74或77，或是其功能等价变体。在一个实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列包含Seq_ID No.39或SEQ_ID NO41，或是其任一个的功能等价变体。在一个具体实施方案中，所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4，或是其任一个的功能等价变体。在一个实施方案中，SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4的功能等价变体与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明的核酸还包含启动子。在一个实施方案中，所述启动子使得在其控制下的基因组成型表达。但是，也可使用诱导型启动子。本领域技术人员会容易地理解用于本发明的启动子。优选地，所述启动子可以在适当发酵条件下指导高水平的表达。在一个具体实施方案中使用Wood-Ljungdahl簇启动子。在另一个实施方案中，使用磷酸转乙酰酶/乙酸激酶启动子。在另一个实施方案中丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶启动子、Rnf复合体操纵子启动子或ATP合酶操纵子启动子。在一个具体的实施方案中，所述启动子来自于自产醇梭菌。在一个具体实施方案中，所述启动子具有SEQ_ID No.22、SEQ ID No79的序列，或是其任一个的功能等价变体。在其他实施方案中，所述启动子具有SEQ ID No.56、57、51、58、59、52、60、61、53、62或63的序列，或是其任一个的功能等价变体。

在转化亲代微生物时本发明的核酸可以保持在染色体外或者可以被改造为适于整合到所述微生物的基因组中。因此，本发明的核酸可以包括另外的核苷酸序列，所述另外的核苷酸序列被改造为适于帮助整合（例如可允许同源重组并靶向整合到宿主基因组的区域）或帮助染色体外构建体稳定表达和复制（例如复制起点、启动子和其他调节序列）。

在一个实施方案中，所述核酸为核酸构建体或载体。在一个具体实施方案中，所述核酸构建体或载体为表达构建体或载体，但是其他构建体和载体（例如用于克隆的那些）被本发明所涵盖。在一个具体实施方案中，所述表达构建体或载体为质粒。在一个具体实施方案中，所述表达质粒具有核苷酸序列SEQ_ID No.46、48、83、84、95、98或101。

应理解，除所述启动子以及如果需要的话，适于表达其他蛋白的另外的基因外，本发明的表达构建体/载体可含有任意数量的调节元件。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个启动子。在另一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括两个或多个启动子。在一个具体的实施方案中，对于每个要表达的基因所述表达构建体/载体均包括一个启动子。在一个实施方案中，所述表达构建体/载体包括一个或多个核糖体结合位点，优选对于每个要表达的基因均有一个核糖体结合位点。

本领域技术人员应理解，本文描述的核酸序列和构建体/载体序列可含有标准接头核苷酸，例如核糖体结合位点和/或限制性位点所需要的那些。这种接头序列不应被解释为是必需的，也不应限制所定义的序列。

核酸和核酸构建体（包括本发明的表达构建体/载体）可使用任意数量的本领域的标准技术构建。例如，可使用化学合成或重组技术。这类技术记载于例如Sambrook et al（Molecular Cloning:A laboratorymanual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989）。其他示例性技术记载于下文的实施例部分。实质上，所述个体基因和调节元件将被可操作地相互连接以使得可表达所述基因来形成所需的蛋白质。本领域普通技术人员会了解可用于本发明的适当载体。但是，举例来说，下述载体可能是适合的：pMTL80000载体、pIMP1、pJIR750和下文实施例部分所示例的质粒。

应该理解本发明的核酸可以是任何适合的形式，包括RNA、DNA或cDNA。

本发明还提供了含有任意一种或多种本文所述核酸的宿主生物，尤其是微生物，包括病毒、细菌和酵母。

可将所述一种或多种外源核酸以裸露核酸形式递送到亲代微生物或可将其用一种或多种可促进转化过程的试剂配制（例如脂质体缀合的核酸、其中含有所述核酸的有机体）。合适时，所述一种或多种核酸可以是DNA、RNA或其组合。可在某些实施方案中使用限制性抑制剂；参见，例如Murray,N.E.et al.(2000)Microbial.Molec.Biol.Rev.64,412.)。

可使用任意数量的本领域中已知用于产生重组微生物的技术由亲代微生物和一种或多种外源核酸制备本发明的微生物。仅举例来说，转化（包括转导或转染）可通过电穿孔、超声处理、聚乙二醇介导的转化、化学感受态或天然感受态或者接合（conjugation）来实现。适合的转化技术记载于例如Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T:MolecularCloning:A laboratory Manual,Cold Spring Harbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989。

在某些实施方案中，由于在要转化的微生物中存在具有活性的限制性系统，必须将要导入所述微生物的核酸甲基化。这可使用多种技术进行，所述技术包括下文描述的那些，其在下文实施例部分进一步示例说明。

举例来说，在一个实施方案中，通过包括如下步骤的方法产生本发明的重组微生物：

将(i)本文描述的表达构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体导入穿梭微生物；

表达所述甲基转移酶基因；

从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，

将所述一种或多种表达构建体/载体导入目标微生物。

在一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因是组成型表达的。在另一个实施方案中，步骤B的甲基转移酶基因的表达是诱导的。

所述穿梭微生物是可促进组成所述表达构建体/载体的核酸序列的甲基化的微生物，优选限制性酶阴性（restriction negative）的微生物。在具体实施方案中，所述穿梭微生物是限制性酶阴性的大肠杆菌、枯草杆菌（Bacillus subtillis）或乳酸乳球菌。

所述甲基化构建体/载体包含编码甲基转移酶的核酸序列。

一旦所述表达构建体/载体和甲基化构建体/载体被导入所述穿梭微生物，存在于所述甲基化构建体/载体上的甲基转移酶基因就被诱导。可通过任意适合的启动子系统进行诱导，但在本发明一个具体的实施方案中，所述甲基化构建体/载体包含诱导型lac启动子（优选地由SEQ_IDNO50编码）并且可通过加入乳糖或其类似物，更优选异丙基-β-D-硫代-半乳糖苷（IPTG）来诱导。其他适合的启动子包括ara、tet或T7系统。在本发明另一个实施方案中，所述甲基化构建体/载体启动子是组成型启动子。

在一个具体的实施方案中，所述甲基化构建体/载体具有对所述穿梭微生物类型特异性的复制起点，以使存在于所述甲基化构建体/载体上的任意基因均可在所述穿梭微生物中表达。优选地，所述表达构建体/载体具有对所述目标微生物类型特异性的复制起点，以使存在于所述表达构建体/载体上的任意基因均可在所述目标微生物中表达。

所述甲基转移酶的表达可导致存在于所述表达构建体/载体上的基因的甲基化。然后，可根据许多已知方法中的任一种将所述表达构建体/载体从所述穿梭微生物中分离。仅举例来说，可使用下文实施例部分描述的方法分离所述表达构建体/载体。

在一个具体的实施方案中，两种构建体/载体被共分离。

可使用任意数量的已知方法，将所述表达构建体/载体导入所述目标微生物。但是，举例来说，可使用下文实施例部分描述的方法。由于所述表达构建体/载体是甲基化的，存在于所述表达构建体/载体上的核酸序列可被纳入所述目标微生物并成功表达。

可以想到，可将甲基转移酶基因导入穿梭微生物并过表达。因此在一个实施方案中，可以使用已知方法收集所得的甲基转移酶并在体外用于甲基化表达质粒。然后，可将所述表达构建体/载体导入所述目标微生物用于表达。在另一个实施方案中，将甲基转移酶基因导入所述穿梭微生物的基因组，然后将所述表达构建体/载体导入所述穿梭微生物，从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体，然后将所述表达构建体/载体导入目标微生物。

可以想到，可将如上文所定义的表达构建体/载体和甲基化构建体/载体结合以提供一种目标组合物。这种组合物在绕过限制性屏障机制以产生本发明的重组微生物方面特别有用。

在一个具体实施方案中，所述表达构建体/载体并且/或者所述甲基化构建体/载体为质粒。

本领域普通技术人员会了解可用于产生本发明的微生物的许多适合的甲基转移酶。但是，可以使用例如枯草杆菌噬菌体ΦT1甲基转移酶和下文实施例中描述的甲基转移酶。在一个实施方案中，所述甲基转移酶具有SEQ_ID No.34的氨基酸序列，或者是其功能等价变体。考虑到所需甲基转移酶的序列和遗传密码，应容易地了解编码适合的甲基转移酶的核酸。在一个实施方案中，编码甲基转移酶的核酸如下文实施例所述（例如SEQ_ID NO35的核酸或者为其功能等价变体）。

可以使用任意数量的被改造为适于使甲基转移酶基因表达的构建体/载体，来产生所述甲基化构建体/载体。但是，举例来说，可使用下文实施例部分描述的质粒。在一个具体实施方案中，所述质粒具有SEQ_ID NO.49的序列。

本发明提供了一种用于通过微生物发酵产生一种或多种所需产物（丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体）的方法，所述方法包括使用本发明的重组微生物发酵含CO的底物。本发明的方法可用于减少来自工业过程的总的大气碳排放。

优选地，所述发酵包括使用本发明的重组微生物在生物反应器中厌氧发酵底物以产生所述一种或多种产物的步骤。

在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(a)将含CO的底物提供至含有一种或多种本发明微生物的培养物的生物反应器；和

(b)在所述生物反应器中厌氧发酵所述培养物以产生所述一种或多种产物。

在一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：

(b)通过含有一种或多种本发明微生物的培养物厌氧发酵含CO的气体以产生所述一种或多种产物。

在本发明的一个实施方案中，被所述微生物发酵的气态底物是含CO的气态底物。所述气态底物可以是作为工业过程副产物或者从某些其他来源（例如汽车废气）获得的含CO的废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品生产例如钢铁厂、有色金属产品生产、石油精炼过程、煤的气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭生产。在这些实施方案中，可在所述含CO的气体被排放到大气中之前使用任意方便的方法从所述工业过程中将其捕获。所述CO可以是合成气（含一氧化碳和氢气的气体）的组分。从工业过程产生的CO通常被燃烧掉来产生CO₂，因此本发明在减少CO₂温室气体排放和产生用作生物燃料的丁醇方面尤其有用。根据所含CO的述气态底物的组成，还可能需要对其进行处理，以在将其导入所述发酵之前除去任何不需要的杂质例如尘粒。例如，可使用已知的方法过滤或洗涤所述气态底物。

应理解，为使所述细菌生长并发生CO到所述一种或多种产物的转化，除所述含CO的底物气体外，需要将适合的液体营养培养基进料至所述生物反应器。所述底物和培养基可以以连续、分批或分批进料方式进料至所述生物反应器。营养培养基会含有足以允许所使用的微生物生长的维生素和矿物质。适合用于使用CO进行发酵以产生丁醇的厌氧培养基是本领域中已知的。例如，Biebel（2001）记载了适合的培养基。在本发明的一个实施方案中，所述培养基如下文实施例部分所述。

合乎需要地，所述发酵应在用于发生CO到所述一种或多种产物的发酵的合适条件下进行。应考虑的反应条件包括：压力、温度、气体流速、液体流速、培养基pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率（如果使用连续搅拌釜反应器的话）、接种物水平、确保所述液相中的CO不成为限制的最大气体底物浓度以及避免产物抑制的最大产物浓度。

此外，通常需要增加底物流中的CO浓度（或气态底物中的CO分压），从而提高CO作为底物时发酵反应的效率。在增加的压力下操作可显著增加CO从气相转移到液相的速率，在液相中CO可被所述微生物作为碳源摄取用于产生所述一种或多种产物。这继而意味着，当生物反应器保持在升高的压力而非大气压力下时，可减少保留时间（定义为生物反应器中的液体体积除以输入气体流速）。最佳反应条件将部分地取决于本发明所使用的具体微生物。但是，一般来说，优选所述发酵在高于环境压力的压力下进行。并且，因为给定的CO到所述一种或多种产物的转化率部分地是所述底物保留时间的函数，并且实现所需保留时间进而限定了生物反应器的所需体积，所以使用增压系统可大大地减少所需的生物反应器的体积，从而减少所述发酵设备的资金成本。依据美国专利no.5,593,886中给出的实例，反应器体积的减少与反应器操作压力的增加成线性比例，即在10个大气压下操作的生物反应器仅需要在1个大气压下操作的生物反应器体积的十分之一。

举例来说，已经描述了在升高的压力下进行气体到乙醇发酵的益处。例如，WO02/08438描述了在30psig和75psig压力下进行的气体到乙醇的发酵，获得的乙醇产率分别为150g/l/天和369g/l/天。但是，发现在大气压下使用相似的培养基和输入气体组成进行的示例性发酵产生1/20到1/10的乙醇/升/天。

还需要的是，含CO的气态底物的导入速率是这样的，即确保液相中的CO浓度不成为限制。这是因为CO受限的条件的结果可能是乙醇产物被所述培养物消耗。

用于进料至发酵反应的气流组成可对所述反应的效率和/或成本有显著影响。例如，O₂可降低厌氧发酵过程的效率。在发酵之前或之后的发酵过程各阶段中，对不需要或不必要的气体的处理会增加这些阶段的负担（例如，当在气体流进入生物反应器之前将气体流压缩时，不必要的能量可能被用于压缩发酵过程中不需要的气体）。因此，可能需要处理底物流（尤其是来自工业来源的底物流）以除去不需要的组分并增加需要的组分的浓度。

在某些实施方案中，将本发明的细菌培养物维持在水性培养基中。优选地，所述水性培养基是基本厌氧微生物生长培养基。合适的培养基是本领域中已知的，并且被记载于例如美国专利no.5,173,429和no.5,593,886以及WO02/08438中，如下文实例部分所述。

可通过本领域中已知的方法从发酵液中回收丙酮、异丙醇或含有丙酮和/或异丙醇和/或一种或多种其他产物的混合流，所述方法例如分馏或蒸发、渗透蒸发、气提以及萃取发酵（包括例如液-液萃取）。

在本发明某些优选实施方案中，可通过以下方式从所述发酵液中回收所述一种或多种产物：从所述生物反应器连续移出部分发酵液，从所述发酵液中分离微生物细胞（方便地通过过滤），并从所述发酵液中回收一种或多种产物。醇可通过例如蒸馏方便地回收。丙酮可通过例如蒸馏回收。所产生的任何酸可通过例如吸附到活性炭上来回收。还优选地将分离的微生物细胞返回至所述发酵生物反应器。优选地将已除去任何的醇和酸后剩余的无细胞渗透物返回至所述发酵生物反应器。可将另外的营养物（例如B族维生素）加入到所述无细胞渗透物中以在将其返回至所述生物反应器之前补充所述营养培养基。

同样地，如果如上所述调整所述发酵液的pH以增强乙酸到活性炭的吸附，那么应在将其返回至所述生物反应器之前将pH重新调整到与所述发酵生物反应器中发酵液类似的pH。

实施例：

现将参照如下非限制性实施例更详细地描述本发明。

微生物和生长条件

伍氏醋酸杆菌DSM1030、醋酸梭菌（Clostridium aceticum）DSM1496、自产醇梭菌DSM23693、食一氧化碳梭菌DSM15243和扬氏梭菌DSM13528来源自DSMZ（德国微生物菌种保藏中心，德国布伦瑞克，Inhoffenstraβe7B,38124（The German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstraβe7B,38124Braunschweig,Germany））。自产醇梭菌DSM23693是自产醇梭菌DSM10061的衍生株。

拉氏梭菌ATCC BAA-622来源自美国，VA20108，马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection,Manassas,VA20108,USA）。

丙酮丁醇梭菌ATCC824、拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593和拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052获自Prof.David Jones（奥塔戈大学，University of Otago），并且还可分别以登录号ATCC824/DSM792、DSM6423和ATCC51743从公共菌种保藏中心DSMZ和ATCC获得。

大肠杆菌DH5α-T1^R来自Invitrogen，Carlsbad，CA92008，USA，大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan和ABLE K来自Stratagene（SantaClara，CA95051-7201，USA）。大肠杆菌JW3350-2来自纽黑文，CT06520-8103，大肠杆菌遗传库存中心（The Coli Genetic Stock Center，CGSC）。

在需氧和厌氧条件下培养大肠杆菌，同时所有其他菌株用果糖（异养生长）或顶空中30psi含CO的钢铁厂气体（收集自New Zealand Steelsite in Glenbrook,NZ；组成：44%CO、32%N₂、22%CO₂、2%H₂）（自养生长）严格厌氧地培养在血清瓶中50ml体积液体培养基中。

使用标准厌氧技术[Hungate RE:A roll tube method for cultivationof strict anaerobes,in Norris JR and Ribbons DW(eds.),Methods inMicrobiology,vol.3B.Academic Press,New York,1969:117-132;WolfeRS:Microbial formation of methane.Adv Microb Physiol1971,6:107-146]根据表2-4中给出的配方制备培养基。对于固体培养基，加入了1.2%Bacto agar（BD，Frankton Lakes，NJ07417，USA）。

除了伍氏醋酸杆菌、醋酸梭菌和拉氏梭菌生长在30℃下以外，所有菌株生长在37℃下。

表2：PETC培养基（伍氏醋酸杆菌：pH8.2；醋酸梭菌，pH7.4；自产醇梭菌、食一氧化碳梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌，pH5.6）

表3：强化的梭菌培养基RCM（丙酮丁醇梭菌、拜季林斯基氏梭菌）

培养基组分	每1.0L培养基中浓度
		胰酶消化酪蛋白胨	5g
月示蛋白胨No.3	5g
		牛肉膏	10g
酵母提取物	3g
		葡萄糖	5g
NaCl	5g
		可溶性淀粉	1g
盐酸半胱氨酸	0.5g
		乙酸钠	3g

表4：Luria Bertani培养基LB（大肠杆菌）

培养基组分	每1.0L培养基中浓度
		胰蛋白胨	10g
酵母提取物	5g
		NaCl	10g

表5：SD-8基本培养基（大肠杆菌）

培养基组分	每1.0L培养基中浓度
		NH₄Cl	7g
Na₂HPO₄	7.5g
		K₂SO₄	0.85g
MgSO₄.7H₂O	0.17g
		KH₂PO₄	7.5g

微量金属溶液(见下文)	0.8ml
		酵母提取物	5g
葡萄糖	20g
		微量金属溶液	每100mL储液
MnSO₄.H₂O	1g
		FeSO₄.7H₂O	4g
CoCl₂.6H₂O	0.4g
		ZnSO₄.7H₂O	0.2g
CuCl₂.2H₂O	0.1g
		Na₂MoO₄.2H₂O	0.2g
Al₂(SO₄)₃	2.83g
		H₃BO₄	0.5g

使用自产醇梭菌DSM23693的发酵是在37℃下和1.5L生物反应器中进行并且如下所述用含CO的钢铁厂气体作为唯一能源和碳源。使用了每升含有：MgCl、CaCl₂（0.5mM）、KCl（2mM）、H₃PO₄（5mM）、Fe（100μM）、Ni、Zn（5μM）、Mn、B、W、Mo、Se（2μM）的确定成分培养基，并制备所述培养基用于培养物生长。将所述培养基转移至生物反应器并在121℃下高压灭菌45分钟。高压灭菌后，向所述培养基补加硫胺素、泛酸（0.05mg）、生物素（0.02mg）并用3mM盐酸半胱氨酸还原。为实现厌氧，通过0.2μm滤器用氮气吹扫反应器容器。在接种前，将所述气体切换为含CO的钢铁厂气体，连续进料至所述反应器。所述气流最初设定为80ml/min，在中期指数期增加至200ml/min，同时搅拌从200rpm增加至350rpm。将Na₂S以0.25ml/hr的量加入到所述生物反应器。一旦OD600达到0.5，将所述生物反应器切换到速率为1.0ml/min的连续模式（稀释速率0.96d^-1）。取培养基样品以测量生物质和代谢物并定期对流进和流出的气体进行的顶空分析。

代谢物分析

使用配备有RID（折光率检测器，在35℃运行）和Alltech IOA-2000有机酸柱（Organic acid column）（150×6.5mm，粒度5μm，保持在60℃）的Agilent1100Series HPLC系统进行丙酮、异丙醇和其他代谢物的HPLC分析。使用弱酸化水（0.005M H₂SO₄）作为流动相，流速为0.7ml/min。为除去蛋白质和其他细胞残余物，将400μl样品与100μl的2%(w/v)5-磺基水杨酸混合，并以14,000×g离心3min以分离沉淀的残余物。然后，将10μl上清注入HPLC中进行分析。

使用配备有Supelco PDMS1001cm纤维（fiber）、Alltech EC-1000（30m×0.25mm×0.25μm）柱和火焰离子化检测器（FID）的Agilent6890N顶空GC进行丙酮、异丙醇和其他代谢物的GC分析。将5ml样品转移到亨盖特（Hungate）管中，在水浴中加热到40℃并暴露于所述纤维，持续正好5分钟。将注射器保持在250℃，使用1ml/min的恒定流的氦气作为载气。转化炉程序为40℃持续5分钟，然后以10℃/min增加至200℃。然后将温度再以50℃/min的速率增加至220℃，然后保持该温度5分钟，再将温度以50℃/min的速率降低至40℃并最后保持1分钟。将FID保持在250℃，同时以40ml/min氢气、450ml/min空气和15ml/min氮气作为补气。

顶空分析

测量在具有两个安装的通道的Varian CP-4900微型GC上进行。通道1为在70℃、200kPa氩气下运行的10m分子筛（Mol-sieve）柱，回洗时间为4.2秒，通道2为在90℃、150kPa氦气下运行的10m PPQ柱，不进行回洗。两个通道的注射器温度都为70℃。运行时间设定为120秒，但是所有目的峰通常在100秒前洗脱。

对自产醇梭菌和扬氏梭菌进行遗传修饰用于使用梭菌途径进行丙酮生产

自产醇梭菌和扬氏梭菌天然不能产生丙酮，因此存在于其他梭菌种中的丙酮生物合成途径被导入所述两种生物（图4）。所述梭菌丙酮生物合成途径中的第一步从乙酰-CoA到乙酰乙酰-CoA是由乙酰-辅酶A乙酰转移酶或硫解酶催化。然后乙酰乙酰-CoA向丙酮的转化是由一组专门的酶乙酸/丁酸-乙酰乙酸CoA-转移酶复合物和乙酰乙酸脱羧酶催化，其存在于很少几种生物（例如丙酮丁醇梭菌和拜季林斯基氏梭菌）中（表6）。

表6：在丙酮和异丙醇形成中涉及的基因和酶的登录号。

然而编码所述各个酶的丙酮丁醇梭菌的基因被分为2个操纵子，拜季林斯基氏梭菌的基因形成一个共同的操纵子，本发明人相信这是有利的。将丙酮丁醇梭菌的编码硫解酶的基因与编码酶乙酸/丁酸-乙酰乙酸CoA转移酶亚基A、乙酸/丁酸-乙酰乙酸CoA转移酶亚基B以及乙酰乙酸脱羧酶的操纵子组装成一个受自产醇梭菌的天然强启动子控制的合成操纵子（图3）。使用该构建体对两种生物进行基因工程改造以用于丙酮生产。为形成重组菌株，使用了新的甲基转移酶将所述构建体甲基化，然后将其转化并表达在自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528中（在下文描述）。证明了基于不同的工业气流（钢铁厂废气、合成气）的丙酮生产。

具有梭菌丙酮途径基因的表达质粒的构建：

本发明使用了标准重组DNA和分子克隆技术[Sambrook J,FritschEF,Maniatis T:Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold SpringHarbour Labrotary Press,Cold Spring Harbour,1989;Ausubel FM,Brent R,Kingston RE,Moore DD,Seidman JG,Smith JA,Struhl K:Current protocols in molecular biology.John Wiley&Sons,Ltd.,Hoboken,1987]。丙酮生物合成基因的DNA序列示于表7。使用自产醇梭菌的Wood-Ljungdahl簇启动子（CO脱氢酶基因acsA的上游）用于表达靶基因（表7）。

表7：梭菌丙酮表达质粒使用的序列

使用Bertram和Dürre的改良方法（Conjugal transfer andexpression of streptococcal transposons in Clostridium acetobutylicum.ArchMicrobiol1989,151:551-557）分离了丙酮丁醇梭菌ATCC824、拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052和自产醇梭菌DSM10061的基因组DNA。收获100-ml过夜培养物（6,000×g，15min，4℃），将其用磷酸钾缓冲液（10mM，pH7.5）洗涤并悬浮于1.9ml STE缓冲液（50mM Tris-HCl，1mM EDTA，200mM蔗糖；pH8.0）中。加入300μl溶菌酶（约100,000U），将所得混合物在37℃孵育30min，然后加入280μl的10%（w/v）SDS溶液并且再孵育10min。通过加入240μl EDTA溶液（0.5M,pH8）、20μl Tris-HCl（1M,pH7.5）和10μl RNase A在室温消化RNA。然后，加入100μl蛋白酶K（0.5U）并在37℃进行蛋白酶解1-3h。最后，加入600μl高氯酸钠（5M），然后进行酚-氯仿提取和异丙醇沉淀。通过分光光度计测量法来检查DNA数量和质量。

通过使用iProof高保真DNA聚合酶（Bio-Rad Labratories，Hercules，CA94547，USA）和表8中的寡核苷酸的PCR来扩增丙酮生物合成基因和Wood-Ljungdahl簇启动子，所用程序如下：98℃初始变性30s，然后32个循环的变性（98℃，10s）、退火（50-62℃，30-120s）和延伸（72℃，45s），最后是延伸步骤（72℃，10min）。

表8：用于扩增丙酮生物合成基因和启动子区域的寡核苷酸

将扩增的Wood-Ljungdahl簇（P_WL）的573bp启动子区域使用NotI和NdeI限制性位点和菌株DH5α-T1^R克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85141（FJ797651.1；Nigel Minton,University of Nottingham,UK）[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modularsystem for Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78:79-85]中。所产生的质粒pMTL85147和所述硫解酶基因的1,194bp的PCR产物都用NdeI和EcoRI酶切。将连接物转化到大肠杆菌XL1-BlueMRF’Kan，得到质粒pMTL85147-thlA。随后，使用KpnI和BamHI以及大肠杆菌ABLE K将所扩增的拜季林斯基氏梭菌NCIMB8052的ctfA-ctfB-adc操纵子的2,177bp PCR片段克隆到该载体中，得到质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc。使用表9给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的插入片段完全测序，结果确认了所述丙酮生物合成基因和启动子区域不含突变（图5）。

表9：用于测序的寡核苷酸

具有梭菌丙酮途径基因的大肠杆菌中的丙酮产生：

为确认所构建质粒的功能，使用GC和HPLC从含有质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc的大肠杆菌ABLE K的5ml过夜培养物获得了代谢谱，确认了丙酮生产。

为进一步研究这点，用含有25μg/ml氯霉素的SD-8基本培养基和携带有质粒pMTL85147（阴性对照）或表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc的大肠杆菌XL-1Blue MRF’Kan以三个重复进行了详细的生长实验（图42）。虽然在阴性对照中没有观察到丙酮生产，但是对于所述携带丙酮质粒的菌株，测量到了75.05mg/L的平均最大丙酮产生，平均干生物质为1.44g/L。

具有梭菌丙酮途径基因的表达质粒的甲基化：

使用由自产醇梭菌、拉氏梭菌和扬氏梭菌的甲基转移酶基因设计的合成的杂交II型甲基转移酶基因（hybrid Type II methyltransferasegene,SEQ_ID NO35）在大肠杆菌中进行丙酮表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc的体内甲基化。合成所述甲基转移酶（SEQ_ID NO34）并将其在载体pGS20中与诱导型lac启动子融合（ATG:biosynthetics GmbH,Merzhausen,Germany）（图6；SEQ_IDNO49）。

可以将表达质粒和甲基化质粒都转化到限制性酶阴性的大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan的相同细胞中，这是可能的，因为它们有相容的Gram-(-)复制起点（表达质粒中高拷贝ColE1，甲基化质粒中低拷贝p15A）。通过加入1mM IPTG诱导体内甲基化，并使用QIAGENPlasmid Midi Kit（QIAGEN GmbH,Hilden,Germany）分离甲基化的质粒。将所得到的混合物用于自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528的转化实验，但是仅丰富（高拷贝）的表达质粒具有可允许在梭菌中复制的Gram-(+)复制起点（repL）。

在自产醇梭菌和扬氏梭菌中甲基化的丙酮表达质粒的转化：

为制备自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528的感受态细胞，将50ml培养物（以钢铁厂气体和果糖作为碳源的PETC培养基（表2）；37℃）继代培养到新鲜培养基，持续连续3天。使用这些细胞以0.05的OD_600nm接种含40mM DL-苏氨酸的50ml PETC培养基。当所述培养物的OD_600nm达到0.4时，将所述细胞转移到厌氧培养室中，并在4℃下以4,700×g收获。将所得培养物用冰冷的电穿孔缓冲液（270mM蔗糖、1mM MgCl2、7mM磷酸钠，pH7.4）洗涤2次，最后重悬于500μl体积的新鲜电穿孔缓冲液。将所得混合物转移到预冷的电穿孔杯（电极间隙为0.4cm）中，所述电穿孔杯中含有约1μg甲基化的质粒混合物。因为与自产醇梭菌相比，在扬氏梭菌的基因组中鉴定出了另外的I型限制性系统，所以将5μl I型限制性抑制剂（EPICENTREBiotechnologies,Madison,WI53713,USA）加入到所述质粒混合物，其使扬氏梭菌的转化效率增加2-10倍。将所述细胞与质粒和限制性抑制剂混合，并立即用Gene pulser Xcell electroporation system（Bio-RadLabratories,Hercules,CA94547,USA）进行冲击，其设置如下：2.5kV，600Ω和25μF。时间常数为3.7-5.1ms。为了再生，将所述培养物转移到5ml专用的可增强所述细胞的恢复的再生培养基中（表10），使用配备有管支架的Spectronic Helios Epsilon分光光度计（Thermo FisherScientific Inc.,Waltham MA02454,USA）在600nm波长下监测。一旦观察到生长（一次倍增）就收获所述细胞，并将其悬浮于200μl新鲜培养基中并铺板到含有15μg/ml甲砜霉素（溶于100%（v/v）二甲基呋喃（DMF）中）并且顶空中含有30psi钢铁厂气体的选择性PETC平板上。4-6天后可见50-200个克隆，用其接种含有15μg/ml甲砜霉素（在DMF中）且以果糖和30psi钢铁厂气体作为碳源的2ml PETC培养基。当出现生长时，将所述培养物放大到5ml PETC培养基，然后放大到50ml PETC培养基，其各自含有15μg/ml甲砜霉素（在DMF中）且在顶空中含有30psi钢铁厂气体作为唯一碳源。

表10：再生培养基

确认用具有梭菌丙酮途径基因的丙酮质粒对自产醇梭菌和扬氏梭菌的成功转化：

为验证所述DNA转化，使用Zyppy质粒小提试剂盒（ZymoResearch,Irvine,CA92614,USA）以10ml培养物体积进行质粒小量提取。所分离的质粒的质量因梭菌外切核酸酶活性而不足以用于限制性消化[Burchhardt G and Dürre P,Isolation and characterization ofDNase-deficient mutants of Clostridium acetobutylicum.Curr Microbiol1990,21:307-311]，所以用所分离的质粒作为模板使用引物ctf-adc-cbei-KpnI-F（Seq_ID no25）和ctf-adc-cbei-BamH1-R（SEQ_IDNO26）以确认所述质粒的存在情况（图7）。使用iNtRON MaximisePremix PCR试剂盒（Intron Bio Technologies）按如下条件进行PCR：94℃初始变性2分钟，然后35个循环的变性（94℃，20s）、退火（55℃，20s）和延伸（72℃，135s），最后是延伸步骤（72℃，5min）。

为确认克隆的同一性，使用上文给出的方案从自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528各自的50ml培养物分离了基因组DNA。使用寡核苷酸fD1（SEQ_ID NO36:CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和rP2（SEQ_ID NO37:CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT）[Weisberg WG,Barns SM,Pelletier BA and Lane DJ,16S ribosomal DNA amplification forphylogenetic study.J Bacteriol1990,173:697–703]以及iNtRONMaximise Premix PCR试剂盒（Intron Bio Technologies,SangdaewonJoongwon Seognam Kyunggi,Korea）针对16s rRNA基因进行PCR，条件如下：94℃初始变性2分钟，然后35个循环的变性（94℃，20s）、退火（55℃，20s）和延伸（72℃，60s），最后是延伸步骤（72℃，5min）。所获得的所有序列分别与自产醇梭菌（Y18178，GI:7271109）和扬氏梭菌（CP001666.1；GI:300433347）的16s rRNA基因（rrsA）具有>99.9%的同一性。

在自产醇梭菌和扬氏梭菌中用梭菌丙酮途径基因从CO和CO₂/H₂产生丙酮：

用转化的携带有质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528在250ml PETC培养基（表2；没有果糖和酵母提取物）进行生长实验，所述培养基在带有橡皮塞且在顶空中含有30psi钢铁厂气体（收集自New Zealand Steel site in Glenbrook,NZ；组成：44%CO、32%N₂、22%CO₂、2%H₂）作为唯一能源和碳源的1升Schott瓶中。使用HPLC和GC分析用两个菌株确认了丙酮生产。在Schott瓶中自产醇梭菌DSM23693（图8和10）和扬氏梭菌DSM13528（图9和10）在48小时后都达到了约0.3g/l（6.5mM）的丙酮浓度。使用适当条件，然后可将所产生的丙酮转化为异丙醇。还用自产醇梭菌DSM23693在血清瓶中的50ml PETC培养基（表2；没有果糖和酵母提取物）中证明了以30psi生物质合成气（Range FuelsInc.,Broomfield,CO；组成：29%CO、45%H₂、13%CH₄、12%CO₂、1%N₂）作为唯一能源和碳源时产生了153mg/ml的丙酮（图11）。

在自产醇梭菌中梭菌丙酮途径基因的异源表达：

进行qRT-PCR实验以确认导入的基因thlA、ctfA、ctfB和adc的成功表达导致自产醇梭菌和扬氏梭菌中产生丙酮。可成功检测到所有基因的信号（图52和53）。

通过离心（6,000×g,5min,4℃）收获含有质粒pMTL85147的自产醇梭菌和扬氏梭菌各自的50-ml培养物，将其在液氮中速冻并储存在-80℃直至进行RNA提取。使用PureLink^TMRNA Mini试剂盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）分离总RNA，并在100μL不含RNA酶的水中洗脱。DNA酶I（Roche Applied Science,Indianapolis,IN,USA）处理后，使用SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）进行反转录步骤。使用AgilentBioanalyzer2100（Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA）、QubitFluorometer荧光计（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）以及通过凝胶电泳检查RNA。对于每个引物对设置未反转录的对照。使用MyiQ SingleColour Detection System（Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA）以两个重复进行所有qRT-PCR反应，15μL总反应体积中含有25ngcDNA模板、67nM的每种引物（表17）和1×iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Labratories,Carlsbad,CA,USA）。反应条件是：95℃3min，然后40个循环（95℃15s，55℃15s和72℃30s）。为检测引物二聚化或其他扩增的假象，在完成qPCR后立即进行融解-曲线分析（以1℃/s从58℃到95℃，共38个循环）。为了进行归一化，每个cDNA样品包括两个看家基因（鸟苷酸激酶和甲酸四氢叶酸连接酶）。使用Relative Expression Software Tool

2008V2.0.7(38)进行相对基因表达的推导（Derivation）。跨越4个log单位的cDNA稀释系列被用于产生标准曲线，以及所得的扩增效率以计算mRNA浓度。

表17：用于qRT-PCR的寡核苷酸

通过自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌将丙酮转化为异丙醇：

丙酮还可通过醇脱氢酶的作用被进一步转化为异丙醇。但是，仅很少几种微生物（例如拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593）被记载可产生异丙醇，并且丙酮到异丙醇的转化酶在自然界中非常罕见。到目前为止仅鉴定并记载了来自拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593[Ismaiel AA,Zhu CX,Colby GD,Chen JS:Purification and characterization of aprimary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains ofClostridium beijerinckii.J Bacteriol1993,175:5097-5105]（SEQ_ID NO38-39）和布氏嗜热厌氧杆菌[Peretz M and Burstein Y:Amino acidsequence of alcohol dehydrogenase from the thermophilic bacteriumThermoanaerobium brockii.Biochemistry.1989,28:6549-6555]（SEQ_IDNO40-41）的两种仲醇脱氢酶。

因此，测试了一批微生物——产乙酸细菌、产生丙酮和异丙醇的梭菌和大肠杆菌——将丙酮转化为异丙醇的能力（图11）。

表11：向多种微生物的生长培养基中加入丙酮。

将所有培养物以0.1的OD_600nm接种到含有异养碳源和30psi钢铁厂气体的50ml适当培养基中至。使所述培养物倍增（OD_600nm=0.2），然后加入丙酮。在加入丙酮后立即取样并通过HPLC和GC进行分析，在生长结束时再次取样并通过HPLC和GC分析（其后测量光密度）。结果概括于表11中。空白培养基用作阴性对照。

如同所预期的，产生异丙醇的菌株拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593[George HA,Johnson JL,Moore WEC,Holdeman LV,Chen JS:Acetone,isopropanol,and butanol production by Clostridiumbeijerinckii(syn.Clostridium butylicum)and Clostridiumaurantibutyricum.Appl Environ Microbiol45:1160-1163]具有通过其醇脱氢酶的作用将外部加入的丙酮还原为异丙醇的能力。与产生丙酮的丙酮丁醇梭菌ATCC-824一样，缺少这种酶的拜季林斯基氏梭菌的另一种菌株NRCIMB8052不能将丙酮转化为异丙醇。这对于大肠杆菌也是一样的。

令人惊奇地，发现了形成梭菌rRNA同源组I内的一个亚群的三种一氧化碳营养型产乙酸细菌自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌也能将丙酮转化为异丙醇，但是所测试的所有其他产乙酸细菌不能利用丙酮（表11）。然后使用不同浓度测试了通过自产醇梭菌进行的不同量丙酮到异丙醇的转化。

表12：通过自产醇梭菌DSM23693的培养物进行的不同浓度丙酮到异丙醇的转化。

用自产醇梭菌DSM23693进行反应器研究以证明丙酮以高速率有效转化为异丙醇。将所述反应器按如上所述设置。一旦处于具有稳定的生物质和代谢物生产的连续模式，就将丙酮加入到所述生物反应器和进料培养基。将丙酮掺入到所述反应器至一定水平，然后通过连续进料获得丙酮。最初，加入1g/L丙酮，一旦代谢物浓度稳定，就将所述浓度增加至5g/L、15g/l，在第二实验中增加至20g/L。即使在20g/L的高浓度下，所述培养物将所有丙酮以高速率转化为异丙醇，证明所鉴定的伯醇：仲醇脱氢酶高度有效（图74）。

自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌中新的醇脱氢酶的鉴定：

为确认自产醇梭菌将丙酮转化为异丙醇是酶驱动的，用自产醇梭菌23693、拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593和食一氧化碳梭菌DSM15243的粗提取物根据Ismaiel et al[Ismaiel AA,Zhu CX,Colby GD,Chen JS:Purification and characterization of a primary-secondary alcoholdehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol1993,175:5097-5105]进行酶测定。粗提取物是通过对指数期后期（lateexponential）培养物进行超声处理和溶菌酶处理（100,000U/ml）获得。通过离心除去细胞碎片并使用还原剂相容的Pierce BCA蛋白质测定法（Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham MA02454,USA）确定蛋白质浓度。所述测定混合物（1ml）含有50mM Tris缓冲液（pH7.5）、1mM二硫苏糖醇（DTT）和0.2mM NAD(P)H。通过加入10mM的底物丙酮（来自在水中的10倍稀释液）起始所述反应，然后用Spectramax M2（Molecular Devices,Inc.,Sunnyvale,CA94089-1136,USA）在365nm波长下用分光光度计测量。用H₂O分别代替粗提取物和丙酮作为阴性对照。用拜季林斯基氏梭菌和自产醇梭菌的粗提取物和NADPH（用NADH没有检测到）可以检测到酶活性，但是用食一氧化碳梭菌DSM15243的粗提取物或H₂O没有检测到（NADPH和NADH都没有检测到）酶活性。这证明，自产醇梭菌将丙酮转化为异丙醇是酶驱动的，并且因为用NADH没有检测到活性，所以所述酶似乎是NADPH依赖性的。

通过测序和仔细分析，在所有三个菌株自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌中鉴定了新的醇脱氢酶基因/酶（图1；SEQ_ID NO.1-4）。发现所述氨基酸序列在所有三个种中是相同的，并且与拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593（87%）和布氏嗜热厌氧杆菌ATCC53556（76%）的伯醇-仲醇脱氢酶有一些同源性（表13）。与已很好描述过的拜季林斯基氏梭菌NRRL-B593的仲醇脱氢酶[Ismaiel AA,Zhu CX,Colby GD,Chen JS:Purification and characterization of a primary-secondary alcoholdehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol1993,175:5097-5105]相比，发现了总计49个氨基酸改变。所述蛋白质的催化中心的4个氨基酸是保守的，但是，催化结构域中的其他氨基酸并不是保守的（图1）。基序搜索预测了所述新的醇脱氢酶基因/酶是锌和NAD(P)H依赖性的。发现编码所述新醇脱氢酶的各个基因在所述3个种自产醇梭菌、扬氏梭菌和拉氏梭菌中是98%相同的，但是与拜季林斯基氏梭菌的基因仅82%相同，与布氏嗜热厌氧杆菌的基因72%相同（表14）。

表13：新的醇脱氢酶和已知仲醇脱氢酶的氨基酸序列比较

表14：新的醇脱氢酶和已知仲醇脱氢酶的核酸序列比较

自产醇梭菌的新的醇脱氢酶的表达研究

为了鉴定编码所述新的醇脱氢酶的基因在自产醇梭菌的正常发酵中是否具有活性，以及鉴定用于基因过表达的潜在启动子区域，进行了超过250个基因的qRT-PCR研究。

在整个生长过程（4天）中从如上所述的典型1.5升分批进料发酵运行中取样。通过离心（6,000×g，5min，4℃）收获所述样品，并将细胞片状沉淀物在液氮中速冻并储存在-80℃备用。通过将所述细胞片状沉淀物在冰上融化并将其悬浮于100μL溶菌酶溶液（50,000U溶菌酶，0.5μL10%SDS，10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA；pH8）而分离RNA。5min后，加入350μL裂解缓冲液（含10μL2-巯基乙醇）。使所得细胞悬浮物通过18-21口径针头5次而对其进行机械破坏。然后使用PureLink^TMRNA Mini试剂盒（Invitrogen,Carlsbad,CA92008,USA）分离RNA，并在100μL不含RNA酶的水中洗脱。经PCR和凝胶电泳检查RNA，用分光光度计定量，如果需要可用DNA酶I（Roche）处理。使用SuperScript III Reverse Transcriptase试剂盒（Invitrogen,Carlsbad,CA92008,USA）进行反转录步骤。在MyiQ Single ColourReal-Time PCR Detection System（Bio-Rad Labratories,Hercules,CA94547,USA）中进行RT-PCR反应，15μL反应体积中含有25ng cDNA模板、67nM的每种引物（表15）和1×iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad Labratories,Hercules,CA94547,USA）。鸟苷酸激酶（Gnk）和甲酸四氢叶酸连接酶（FoT4L）被用作看家基因，还包括无模板对照。所述反应条件是：95℃3min，然后40个循环（95℃15s，55℃15s和72℃30s）。qRT PCR完成后立即进行融解曲线分析（以1℃/s从58℃到95℃，共38个循环），以检测引物二聚化或其他扩增假象。如通过Biorad iQ52.0软件所计算的，基于减去PCR基线的曲线拟合法以阈值循环（C_t）值的形式计算所述表达水平的数据。使用RelativeExpression Software Tool

2008V2.0.7进一步分析原始C_t值。

表15：用于RT-PCR的寡核苷酸

qRT-PCR研究结果显示，所述新的醇脱氢酶的基因在整个生长过程中以相对恒定的水平表达并且仅在生长结束时停止（图2）。与选自所述代谢的每个部分的超过200个基因相比，所述醇脱氢酶基因属于排名前50的表达的基因。所分析的所有基因中的最高基因表达示出了Wood-Ljungdahl操纵子的基因，其mRNA水平是所述醇脱氢酶基因的10倍以上（图2）。因此相应的启动子（SEQ_ID NO22）区域对于过表达基因（例如丙酮生物合成酶的基因和醇脱氢酶基因）是理想的，但是在过表达所述微生物天然存在的醇脱氢酶的情况中，可能需要另外的遗传修饰以确保有足够的辅因子可用。这可以包括：例如（过）表达其他基因以增加NADPH池（例如转氢酶），消除竞争性的NADPH消耗反应，或进行蛋白质工程改造以改变对NADH的辅因子需求。所鉴定的可用于基因过表达的其他启动子区域包括F₁F_O-ATP酶操纵子的启动子区域（SEQ_ID NO51）、Rnf复合体操纵子（SEQ_ID NO52）和丙酮酸：铁氧还蛋白氧化还原酶（SEQ_ID NO53）。

通过具有含梭菌丙酮基因的表达质粒的自产醇梭菌和扬氏梭菌从CO和CO₂/H₂产生异丙醇

证明了，携带有丙酮表达质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528的重组菌株的250ml Schott瓶培养物可产生丙酮，但是没有检测到异丙醇（图8+9）。这可能是因为Schott瓶中给定的静态条件导致在生长结束时缺少还原力，其中所述顶空中的CO被耗尽并且不像分批发酵或持续发酵方法中一样持续地进料CO。还原当量（例如NAD(P)H或铁氧还蛋白）从CO产生，但是也被消耗用于乙醇生产，乙醇生产在指数期和停滞期早期中已经发生了。此时所产生的丙酮（作为异丙醇生产所需的前体）的浓度仍然相对较低。

因此，在生长48小时后用30psi新鲜的钢铁厂气体向两种培养物中再加入气体，并再接种。虽然生物质没有再增加许多，但是一些所产生的丙酮在24小时内被转化为异丙醇（表16）。

表16：通过自产醇梭菌DSM23693和扬氏梭菌DSM13528的培养物进行的丙酮到异丙醇的转化

在有恒定CO供应的发酵系统中，存在足够的还原力用于从CO或CO/H₂连续产生异丙醇，在使用携带丙酮表达质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc的自产醇梭菌DSM23693的各个发酵运行中产生了丙酮和异丙醇。

新的醇脱氢酶的克隆

将新的醇脱氢酶克隆到所述丙酮表达质粒中，使其受Wood-Ljungdahl启动子控制用于基因过表达，并测试了在大肠杆菌中的功能。

使用寡核苷酸SecAdh-SalI-F（SEQ_ID NO54:TATTTGTCGACTTAGGAGGTTCTATTATGAAAGG）和SecAdh-XhoI-R（SEQ_IDNO55:AAAACTCGAGACATTTTTTTAATGCGACAC）从分离的自产醇梭菌DSM10061染色体DNA扩增了醇脱氢酶。将1129bp PCR片段使用SalI和XhoI以及大肠杆菌XL-1Blue MRF’Kan克隆到质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc中。使用表9给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh（SEQ_ID NO48；图43）完全测序，结果确认了所述异丙醇生物合成基因和启动子区域不含突变（图41）。

用自产醇梭菌的新醇脱氢酶在大肠杆菌中产生异丙醇

为进一步测试自产醇梭菌的新的醇脱氢酶的功能，使用仅表达所述丙酮生物合成基因的大肠杆菌XL-1Blue MRF’Kan（携带有质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc）和表达所述丙酮生物合成基因+所述新醇脱氢酶的大肠杆菌XL-1Blue MRF’Kan（携带有质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc-adh）在100ml含有氯霉素的SD-8基本培养基中进行生长实验（图42）。

虽然用携带有所述丙酮质粒的菌株没有检测到异丙醇，但是用额外表达自产醇梭菌的新醇脱氢酶的菌株测量到了平均最大值为32.7mg/L的异丙醇。

可在自产醇梭菌中赋予新的针对丙酮或异丙醇的活性的乳酸乳球菌和酿酒酵母的基因的鉴定

除了梭菌丙酮和异丙醇途径，鉴定了两种酶——乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）和酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）（表18），所述两种酶可在自产醇梭菌中赋予针对丙酮和异丙醇生产的活性。还没有报告说这两种酶参与丙酮或异丙醇生产，或者对梭菌丙酮和异丙醇途径中的任一前体有催化功能。这些蛋白在大肠杆菌（Atsumi et al.,2008.Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higheralcohols as biofuels.Nature,451:86-90）或其他生物例如谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）（Blombach et al.,2011.Corynebacterium glutamicum tailored for efficient Isobutanolproduction.Appl.Environ.Microbiol.77:3300-10）或解纤维素梭菌（Clostridium cellulolyticum）（Higashide W.,et al.2011.MetabolicEngineering of Clostridium cellulolyticum for Production of Isobutanolfrom Cellulose.Appl.Environ.Microbiol.77:2727-33）中的异源表达导致从氨基酸前体产生支链高级醇例如异丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇，但是没有报告说产生丙酮和异丁醇（isobutanol）。但是在自产醇梭菌中，密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）单独表达，或密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）与酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）的组合表达，令人惊奇地导致了丙酮和异丙醇的产生。

表18：可在自产醇梭菌中赋予新的针对丙酮或异丙醇的活性的乳酸乳球菌和酿酒酵母的序列

具有乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）和酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）的表达质粒的构建

乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）和酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）（表18）是由ATG:Biosynthetics GmbH（Merzhausen,Germany）进行密码子优化，并且在两侧有NdeI和KpnI限制性位点用于进一步进行亚克隆。自产醇梭菌的磷酸转乙酰酶/乙酸激酶操纵子启动子被用于表达靶基因。所使用的所有DNA序列在表19给出。

表19：用于具有乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）和酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）的表达质粒的序列

使用引物Ppta-ack-NotI-F（Seq.ID.No.80:GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC）和Ppta-ack-NdeI-R（Seq.ID.No.81:TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC）扩增磷酸转乙酰酶-乙酸激酶操纵子的启动子区域（P_pta-ack）并使用NotI和NdeI限制性位点和菌株XL1-BlueMRF’Kan将其克隆到大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85141（FJ797651.1;Nigel Minton,University of Nottingham,UK）[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system forClostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78:79-85]。

随后使用FseI和PmeI限制性位点和菌株XL1-Blue MRF’Kan将得到的质粒pMTL85145中的抗生素抗性基因替换为来自pMTL82254（FJ797646.1;Nigel Minton,University of Nottingham,UK）[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system forClostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78:79-85]的红霉素抗性基因。

将得到的质粒pMTL85245（Seq.ID.No.80）和所述脱羧酶及醇脱氢酶（Adh2）基因簇的2746bp密码子优化产物都用NdeI和KpnI酶切。将连接物转化到大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan，得到质粒pMTL85245-kivd-adh2（Seq.ID.No.83；图63）。使用表20给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL85245-kivd-adh的插入片段完全测序，结果确定了基因和启动子区域不含突变。

使用引物对M13反向（Seq.ID.57:CAGGAAACAGCTATGAC）和Adh_seqR1（Seq.ID.85;Tab.16）单独扩增所述kivD基因。将KivD的2635bp PCR片段使用NdeI和EcoRI限制性位点和菌株大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan克隆到所述大肠杆菌-梭菌穿梭载体pMTL85245，得到质粒pMTL85245-kivd（Seq.ID No.84；图64）。使用表20给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL85245-kivd的插入片段完全测序，结果确定了所述丙酮生物合成基因不含突变。

表20：用于测序的寡核苷酸

在自产醇梭菌中表达密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）和酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）基因用于产生丙酮和异丙醇

按如上所述进行，将所构建的表达质粒pMTL85245-kivd-adh2和pMTL85245-kivd转化到大肠杆菌株JW3350-2并制备用于转化自产醇梭菌DSM23693。虽然在含有所述两种质粒的大肠杆菌中没有检测到丙酮和异丙醇（但是可检测到高级支链醇，例如文献所描述的异丁醇），但是在自产醇梭菌中可以检测到丙酮和异丙醇。在血清瓶实验中，对于两种表达质粒，从含CO的钢铁厂气体产生的最高异丙醇浓度都为0.050-0.064g/L（图65和66）。

用梭菌途径基因以及乳酸乳球菌的α-酮异戊酸脱羧酶（KivD）和酿酒酵母的醇脱氢酶（Adh2）的组合产生丙酮和异丙醇

不希望囿于任何具体理论，本发明人认为像梭菌乙酰乙酸脱羧酶一样，密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮酸脱羧酶Kivd具有将乙酰乙酸转化为丙酮的活性，同时像所鉴定的新伯醇：仲醇脱氢酶或来自拜季林斯基氏梭菌的伯醇：仲醇脱氢酶一样，密码子优化的酿酒酵母的醇脱氢酶Adh2具有将丙酮转化为异丙醇的活性。为检验该假设，在大肠杆菌和自产醇梭菌内产生并测试了梭菌丙酮/异丙醇途径基因以及乳酸乳球菌的α-酮酸脱羧酶Kivd和酿酒酵母的醇脱氢酶Adh2的几种组合，证明产生了丙酮和异丙醇。

具有不同基因组合的表达质粒的构建

基于所构建的表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc、pMTL85245-kivd-adh2和pMTL85245-kivd，构建了新的组合。

使用寡核苷酸P-thl-ctfAB_F2（Seq.ID.No.93:ATCTTCTGCAGGGCCGCAGATAGTCATAATAGTTCCAG）和P-thl-ctfAB_R2（Seq.ID.No.94:AGGGTGCGGCCGCGATTCATATATCCATAATCTTTAAGTTATC）从质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc扩增了3122bp P_WL-thlA-ctfAB片段。将所扩增的片段使用PstI和NotI限制性位点和菌株大肠杆菌XL1-BlueMRF’Kan克隆到质粒pMTL85245-kivd中，得到质粒pMTL85245-P_WL-thlA-ctfAB-kivd（Seq.ID.No.95；图67）。使用表9和20给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL85245-P_WL-thlA-ctfAB-kivd的插入片段完全测序，确认了所述质粒不含突变。

使用引物对adh_F（Seq.ID.No.96:ACGTTGGATCCAGGAGGAACAAAGATGAGTATACC）和P-kivd-adh_R（Seq.ID.No.97:AGCGTCCATGGCCTTATTTACTTGTATCTACAACATATC）从质粒pMTL85245-kivd-adh2扩增Adh2基因。将1084bp PCR片段使用BamHI和NcoI限制性位点和菌株大肠杆菌XL1-Blue MRF’Kan克隆到质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc，得到质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc-adh2（Seq.ID.No.98；图68）。将所得质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc-adh2和pMTL83151（FJ797647.1;NigelMinton,University of Nottingham,UK）[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular system for Clostridium shuttleplasmids.J Microbiol Methods.2009,78:79-85]的repL基因的1625bp片段都用FseI和AscI酶切。进行连接得到质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2。使用表9和20给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2的插入片段完全测序，结果确认了所述片段不含突变。

使用寡核苷酸P-kivd-adh_F（Seq.ID.No.99:ATATTGGATCCACAGCTATGACCGCGGCCGCAATATG）和P-kivd-adh_R（Seq.ID.No.100:AGCGTCCATGGCCnAMAC77GTATCTACAACATATC）从质粒pMTL85245-kivd-adh2扩增P_pta-ack-kivd-adh2的3266bp PCR片段，然后将其使用BamHI和NcoI限制性位点和菌株大肠杆菌XL1-BlueMRF’Kan克隆到质粒pMTL85147-thlA-ctfAB-adc，得到质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P_pta-ack-kivd-adh2（Seq.ID.101；图69）。将所得质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P_pta-ack-kivd-adh2和pMTL83151（FJ797647.1;Nigel Minton,University of Nottingham,UK）[Heap JT,Pennington OJ,Cartman ST,Minton NP.A modular systemfor Clostridium shuttle plasmids.J Microbiol Methods.2009,78:79-85]的repL基因的1625bp片段都用FseI和AscI酶切。进行连接得到质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P_pta-ack-kivd-adh2。使用表9给出的寡核苷酸将所得质粒pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P_pta-ack-kivd-adh2的插入片段完全测序，结果确认了所述质粒不含突变。

在自产醇梭菌中使用不同基因组合产生丙酮和异丙醇

使用根据自产醇梭菌、拉氏梭菌和扬氏梭菌的甲基转移酶基因设计的合成的杂交II型甲基转移酶基因（SEQ_ID NO35）在大肠杆菌中对新构建的表达质粒pMTL85147-thlA-ctfA-ctfB-adc、pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2和pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P_pta-ack-kivd-adh2进行体内甲基化，并转化到如上所述的自产醇梭菌DSM23693中。

使用以糖（大肠杆菌）或含CO的钢铁厂气体（自产醇梭菌）作为唯一底物的血清瓶实验在大肠杆菌和自产醇梭菌DSM23693中测试了所有质粒构建体。在所测试的所有组合中，当在自产醇梭菌中异源表达时测量到丙酮和异丙醇生产，而在大肠杆菌中仅有很少几种组合发生丙酮生产并且异丙醇生产需要醇脱氢酶基因（表21）。所呈现的结果显示，在大肠杆菌以及自产醇梭菌中，密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮酸脱羧酶Kivd能够代替所述梭菌乙酰乙酸脱羧酶并催化乙酰乙酸转化为丙酮（图4）。在自产醇梭菌中，在表达作为唯一异源基因的所述脱羧酶时甚至也发生了丙酮和异丙醇生产，这表明有CoA转移酶活性。图4示出了所提出的从CO形成丙酮和异丙醇的途径以及表21，图73给出了对在大肠杆菌和自产醇梭菌中测试的梭菌途径基因以及密码子优化的乳酸乳球菌的α-酮酸脱羧酶Kivd和酿酒酵母的醇脱氢酶Adh2基因的组合的概述。

用自产醇梭菌DSM23693和质粒pMTL85245-P_WL-thlA-ctfAB-kivd、pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-adh2和pMTL83147-thlA-ctfAB-adc-P_pta-ack-kivd-adh2从含CO的钢铁厂气体进行的丙酮和异丙醇生产分别在图70、71和72示出。

表21：由多种基因组合产生丙酮和异丙醇

在产乙酸菌中对丙酮和异丙醇的耐受性和乙酸的解毒作用

已知几种代谢物例如醇（乙醇和丁醇）或酸（乙酸和丁酸）在高浓度时对细菌是有毒性的，因此限制了它们的生物技术生产[Alsaker KV,Parades C,Papoutsakis ET:Metabolite stress and tolerance in theproduction of biofuels and chemicals-systems analysis of butanol,butyrate,and Acetate Stresses in the Anaerobe Clostridiumacetobutylicum.Biotechnol Bioeng,2009,105:1131-1147]。为观察丙酮和异丙醇是否对培养物有毒性作用，在血清瓶中的50ml PETC培养基（表2）中进行了生长实验，向自产醇梭菌DSM23693的正在生长的培养物中加入不同浓度的丙酮（图12）和异丙醇（图13）。在存在浓度高达5%的丙酮或异丙醇时，细胞生长是可见的（仅轻微抑制生长速率）。

在另一方面，已知高浓度的游离或未离解的乙酸由于对膜梯度的有害作用而对大多数厌氧细菌（包括产乙酸细菌）是有害的[Warnecke T,Gill RT:Organic acid toxicity,tolerance,and production in Escherichiacoli biorefining applications.Microb Cell Fact,2005,4:25；

M,Dürre P:Biochemical production of biobutanol,in Luque R,Campelo J,Clark JH(Eds.):Handbook of biofuel production-Processes andtechnologies,Woodhead Publishing,Camebridge,2010:221-257]。但是，产乙酸细菌需要产生乙酸以从底物水平磷酸化获得ATP[Drake HL,Küsel K,Matthies C:Acetogenic Prokaryotes.In Dworkin M,Falkow S,Rosenberg E,Schleifer KH,Stackebrandt E(eds.):The Prokaryotes,3^rdEdition,Volume2,Springer,New York,2006:354-420]，因此所有已知产乙酸种均产生乙酸[Drake HL,Küsel K,Matthies C:AcetogenicProkaryotes.In Dworkin M,Falkow S,Rosenberg E,Schleifer KH,Stackebrandt E(eds.):The Prokaryotes,3^rd Edition,Volume2,Springer,New York,2006:354-420]。乙酸向其他产物的转化（例如通过醛铁氧还蛋白氧化还原酶（AOR）转化为乙醇或者通过磷酸转乙酰酶/乙酸激酶（Pta/Ack）或AMP依赖的乙酰-CoA合酶（Acs）转化回乙酰-CoA）是不利的，因为这需要还原的铁氧还蛋白或ATP形式的能量[Wolfe AJ:The acetate switch.Microbiol Mol Biol Rev,2005,69:12-50]。本发明提供了在产乙酸细菌中乙酸解毒的新模式，其不需要能量。乙酸可通过由乙酰-辅酶A乙酰转移酶、乙酰乙酰-CoA：乙酸/丁酸辅酶A转移酶A、乙酰乙酰-CoA：乙酸/丁酸辅酶A转移酶B组成的乙酰乙酰-CoA：乙酸/丁酸辅酶A转移酶系统循环回到乙酰-CoA。该反应驱动乙酰乙酰-CoA转化为乙酰乙酸，然后乙酰乙酸可被脱羧成为丙酮并被还原为异丙醇（图4）。

本文已参照某些优选实施方案描述了本发明，以使得读者无需过多实验即可实施本发明。但是，本领域普通技术人员应容易地认识到，可将许多组分和参数作一定程度的变化或修改或者替换为已知的等价物，而不背离本发明范围。应理解，这样的修改和等价物如同单独提出一样被纳入本文。提供名称、标题等的目的是增强读者对本文的理解，而不应当被解读为是限制本发明的范围。

如果有的话，上文和下文引用的所有申请、专利和公开文本的全部公开内容均以引用方式纳入本文。但是，本说明书中对任何申请、专利和公开文本的引用不是也不应被理解为，承认或以任何形式暗示它们在世界上任何国家构成有效的现有技术或者形成公知常识的一部分。

在整个该说明书以及以下的任何权利要求中，除非上下文另有说明，词语“包含（comprise）”、“包括（comprising）”等应以与排除意义相反的包括意义来解释，也就是说，“包含但不限于”的意思。

Claims

1.一种能够通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的重组的一氧化碳营养型产乙酸微生物。

2.权利要求1的微生物，其中所述微生物被改造为适于表达以下一种或多种：

a.异丙醇生物合成途径中非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶；

b.丙酮生物合成途径中非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。

3.权利要求1的微生物，其中所述微生物被改造为适于过表达以下一种或多种：

a.异丙醇生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶；

b.丙酮生物合成途径中天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。

4.权利要求1-3中任一项的微生物，其中所述微生物适于：

a.表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的非天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶；和/或

b.过表达丙酮到异丙醇的转化中涉及的天然存在于衍生出所述重组微生物的亲代微生物中的一种或多种酶。

5.权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述亲代微生物能够发酵含CO的底物以产生丙酮而不能将丙酮转化为异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。

6.权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述亲代微生物能够将丙酮转化为异丙醇而不能够发酵含CO的底物以产生丙酮，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶。

7.权利要求1-4中任一项的微生物，其中所述亲代微生物不能发酵含CO的底物以产生丙酮和异丙醇，所述重组微生物被改造为适于表达丙酮生物合成途径中的一种或多种酶以及在丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶。

8.权利要求1-7中任一项的微生物，其中所述异丙醇和/或丙酮生物合成途径中的一种或多种酶选自：

乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）；

乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）；

乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）；

α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）；和，

它们中任意一种或多种的功能等价变体。

9.权利要求8的微生物，其中所述乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）来源自丙酮丁醇梭菌（C.acetobutylicum）。

10.权利要求8的微生物，其中所述酶乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc）来源自拜季林斯基氏梭菌（C.beijerinckii）。

11.权利要求8的微生物，其中所述α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）来源自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。

12.权利要求1-11中任一项的微生物，其中所述丙酮到异丙醇的转化中涉及的一种或多种酶选自：

醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）；

醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）；和，

其功能等价变体。

13.权利要求12的微生物，其中所述醇脱氢酶（Adh）来源自自产醇梭菌（C.autoethanogenum）、扬氏梭菌（C.ljungdahlii）和/或拉氏梭菌（C.ragsdalei）。

14.权利要求12的微生物，其中所述醇脱氢酶（Adh2）来源自酿酒酵母（S.cerevisiae）。

15.权利要求13的微生物，其中所述醇脱氢酶具有SEQ_ID NO.1的氨基酸序列，或者其为所述序列的功能等价变体。

16.权利要求15的微生物，其中所述功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

17.权利要求1-16中任一项的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸被改造为适于增加所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸的表达，并且所述亲代微生物中天然存在的一种或多种核酸编码所述丙酮生物合成途径和/或异丙醇生物合成途径中的一种或多种酶。

18.权利要求17的微生物，其中所述被改造为适于增加表达的一种或多种外源核酸为调节元件。

19.权利要求1-18中任一项的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码并被改造为适于表达所述丙酮生物合成途径和/或异丙醇生物合成途径中的一种或多种酶。

20.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码并被改造为适于表达至少两种所述酶。

21.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。

22.权利要求19-21中任一项的微生物，其中所述微生物包含一种或多种编码醇脱氢酶（Adh；EC1.1.1.2）的外源核酸，或其功能等价变体。

23.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。

24.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）和α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。

25.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）的一种或多种外源核酸或其功能等价变体。

26.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。

27.权利要求19的微生物，其中所述微生物包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA；E.C.2.3.1.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA；EC2.8.3.9）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB；EC2.8.3.9）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc；EC4.1.1.4）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD；EC4.1.1.74）和醇脱氢酶（Adh2；EC1.1.1.1）中的每一种；或者它们中任意一种或多种的功能等价变体。

28.权利要求22的微生物，其中所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸包含序列SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4，或其任一个的功能等价变体。

29.权利要求28的微生物，其中所述编码醇脱氢酶的核酸的功能等价物与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%的序列同一性。

30.权利要求20-29中任一项的微生物，其中所述外源核酸为具有SEQ_ID No.46、48、81、82、93、96或99的核苷酸序列的表达质粒。

31.权利要求1-30中任一项的微生物，其中所述亲代微生物选自一氧化碳营养型产乙酸细菌，其包含：自产醇梭菌、扬氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）、德氏梭菌（Clostridiumdrakei）、粪味梭菌（Clostridium scatologenes）、淤泥丁酸杆菌（Butyribacterium limosum）、甲基营养丁酸杆菌（Butyribacteriummethylotrophicum）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、巴氏嗜碱菌（Alkalibaculum bacchii）、Blautia producta、淤泥真杆菌（Eubacteriumlimosum）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、热自养穆尔氏菌（Moorella thermautotrophica）、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii）和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi）。

32.权利要求31的微生物，其中所述亲代微生物为自产醇梭菌或扬氏梭菌。

33.权利要求32的微生物，其中所述微生物为自产醇梭菌DSM23693或扬氏梭菌DSM13528（或ATCC55383）。

34.权利要求1-33中任一项的微生物，其中所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA、CtfB、Adc、KivD、Adh2和Adh的一种或多种基因。

35.权利要求34的微生物，其中所述亲代微生物缺少编码Adh的基因。

36.权利要求34的微生物，其中所述亲代微生物缺少编码ThlA、CtfA、CtfB、Adc和KivD的基因中的每一个。

37.一种醇脱氢酶（Adh），其具有SEQ_ID NO.1氨基酸序列，或其任一个的功能等价变体。

38.权利要求37的醇脱氢酶（Adh），其中所述功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%的序列同一性。

39.一种编码SEQ_ID NO.1的Adh的核酸或其功能等价变体。

40.一种具有选自SEQ_ID NO.2；SEQ_ID NO.3；SEQ_ID NO.4的序列的核酸，和其任一个的功能等价变体。

41.权利要求40的核酸，其中所述功能等价变体为与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%的序列同一性的核酸。

42.一种核酸，其能够与核酸SEQ_ID NO.2、3或4、与SEQ_ID NO.2、3或4的核酸互补的核酸或者其任一个的功能等价变体的至少一部分杂交。

43.一种选自如下序列的核酸：SEQ_ID NO.5;SEQ_ID NO.6;SEQ_ID NO.7;SEQ_ID NO.8;SEQ_ID NO.9;SEQ_ID NO.10;SEQ_ID NO.11;SEQ_ID NO.12;SEQ_ID NO.13;SEQ_ID NO.14;SEQ_ID NO.15;SEQ_ID NO.16;SEQ_ID NO.17;SEQ_ID NO.18;SEQ_IDNO.23;SEQ_ID NO.24;SEQ_ID NO.25;SEQ_ID NO.26;SEQ_ID NO.27;SEQ_ID NO.28;SEQ_ID NO.29；SEQ_ID NO.30;SEQ_ID NO.31;SEQ_ID NO.32；SEQ_ID NO.33;SEQ_ID NO.64;SEQ_ID NO.65;SEQ_ID NO.66;SEQ_ID NO.67;SEQ_ID NO.68;SEQ_ID NO.69;SEQ_IDNO.70;SEQ_ID NO.71；SEQ_ID NO.85;SEQ_ID NO.86;SEQ_ID NO.87;SEQ_ID NO.88;SEQ_IDNO.89；SEQ_ID NO.90；SEQ_ID NO.91;SEQ_ID NO.92;SEQ_ID NO.93；SEQ_ID NO.94;SEQ_IDNO.96;SEQ_ID NO.97;SEQ_ID NO.99；SEQ_ID NO.100。

44.编码一种或多种酶的核酸，其在微生物中表达时可使得所述微生物通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

45.权利要求44的核酸，其中所述核酸编码两种或多种酶，其在微生物中表达时可使得所述微生物通过发酵含CO的底物产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

46.权利要求45或46的核酸，其中所述酶选自乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh）、醇脱氢酶（Adh2），和它们中任意一种或多种的功能等价变体。

47.权利要求44-46中任一项的核酸，其中所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）和乙酰乙酸脱羧酶（Adc）中的每一种的核酸序列或其任意一种或多种的功能等价变体。

48.权利要求44-47中任一项的核酸，其中所述核酸包含编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列或其功能等价变体。

49.权利要求44-46中任一项的核酸，其中所述核酸以任意顺序包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸序列或其任意一种或多种的功能等价变体。

50.权利要求44-46中任一项的核酸，其中所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）中的每一种的核酸序列或其任意一种或多种的功能等价变体。

51.权利要求44-46中任一项的核酸，其中所述核酸包含编码α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）的核酸序列或其功能等价变体。

52.权利要求44-46中任一项的核酸，其中所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、醇脱氢酶（Adh2）中的每一个的核酸序列或其任意一种或多种的功能等价变体。

53.权利要求44-46中任一项的核酸，其中所述核酸以任意顺序包含编码乙酰-辅酶A乙酰转移酶（硫解酶；ThlA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶A（CoA转移酶；CtfA）、乙酰乙酰-CoA：乙酸辅酶A转移酶B（CoA转移酶；CtfB）、乙酰乙酸脱羧酶（Adc）、α-酮异戊酸脱羧酶（脱羧酶；KivD）、醇脱氢酶（Adh2）中的每一种的核酸序列或其任意一种或多种的功能等价变体。

54.权利要求47的核酸，其中所述核酸包含编码具有SEQ_ID NO.1的序列的醇脱氢酶（Adh）的核酸序列或其功能等价变体。

55.权利要求46-48中任一项的核酸，其中所述醇脱氢酶（Adh）的功能等价变体与SEQ_ID NO.1具有至少约88%的序列同一性。

56.权利要求46-48中任一项的核酸，其中所述编码醇脱氢酶（Adh）的核酸序列包含SEQ_ID NO.2、SEQ_ID NO.3或SEQ_ID NO.4，或是其任一个的功能等价变体。

57.权利要求56的核酸，其中所述功能等价变体与SEQ_ID NO.2、3或4具有至少约83%的序列同一性。

58.一种包含权利要求44-57中任一项的核酸的核酸构建体或载体。

59.权利要求58的构建体或载体，其中所述构建体或载体为表达构建体。

60.权利要求59的构建体或载体，其中所述构建体或载体具有SEQ_ID No.46、47、48、83、84、95、98或101的核苷酸序列。

61.一种宿主生物，其包含任意一种或多种权利要求44-57的核酸或权利要求58-60中任一项的载体或构建体。

62.一种组合物，其包含权利要求58-61中任一项的构建体或载体以及甲基化构建体或载体。

63.一种产生权利要求1-36中任一项的重组微生物的方法，包括：

a.将(i)权利要求59或60的构建体/载体和(ii)包含甲基转移酶基因的甲基化构建体/载体导入穿梭微生物；

b.表达所述甲基转移酶基因；

c.从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，

d.将至少所述表达构建体/载体导入目标微生物。

64.一种产生权利要求1-36中任一项的重组微生物的方法，包括：

a.通过甲基转移酶在体外甲基化权利要求59或60的表达构建体/载体；

b.将所述表达构建体/载体导入目标微生物。

65.一种产生权利要求1-36中任一项的重组微生物的方法，包括：

a.将甲基转移酶基因导入到穿梭微生物的基因组中；

b.将权利要求59或60的表达构建体/载体导入所述穿梭微生物；

c.从所述穿梭微生物分离一种或多种构建体/载体；和，

d.将至少所述表达构建体/载体导入目标微生物。

66.一种通过微生物发酵产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体的方法，所述方法包括使用权利要求1-36中任一项的重组微生物发酵含CO的底物。

67.权利要求66的方法，其中所述方法包括如下步骤：

(a)将含CO的底物提供至含有所述一种或多种微生物的培养物的生物反应器；和，

68.权利要求66的方法，其中所述方法包括如下步骤：

a.在由工业过程产生的含CO的气体释放到大气中之前，将所述气体捕获；

b.通过含有所述一种或多种微生物的培养物来厌氧发酵所述含CO的气体以产生丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体。

69.权利要求66-68中任一项的方法，其中所述含CO底物为含CO的气态底物。

70.权利要求69的方法，其中所述底物包含工业废气。

71.权利要求70的方法，其中所述气体为钢铁厂废气或合成气。

72.权利要求66-71中任一项的方法，其中所述底物包含至少约20体积%至约100体积%的CO。

73.权利要求66-72中任一项的方法，其中所述方法还包括回收丙酮、异丙醇并且/或者丙酮和/或异丙醇的前体中的一种或多种的步骤。

74.通过权利要求66-73中任一项的方法产生的丙酮、异丙醇以及丙酮和/或异丙醇的前体。

75.一种重组微生物，其能够产生丙酮并且包含一种或多种外源核酸，所述外源核酸编码被改造为适于将乙酰乙酸（acetoactate）转化为丙酮的一种或多种酶，其中所述重组微生物来源自能够产生乙酰乳酸而非丙酮的亲代微生物。

76.权利要求75的重组微生物，其中所述一种或多种酶包含KivD或其功能等价变体。

77.一种重组微生物，其能够产生丙酮并且包含一种或多种编码酶thlA、ctfA、ctfB和kivD中的每一种的外源核酸或其任意一种或多种的功能等价变体，其中所述重组微生物来源自不能产生乙酰乳酸、乙酰乙酰-CoA和丙酮的亲代微生物。

78.一种重组微生物，其能够产生丙酮并且包含一种或多种编码酶ctfA、ctfB和kivD中的每一种的外源核酸或其任意一种或多种的功能等价变体，其中所述重组微生物来源自不能产生乙酰乳酸和丙酮的亲代微生物。