WO2023102629A2

WO2023102629A2 - Enzima quimérica e processo para a produção de alcenos terminais

Info

Publication number: WO2023102629A2
Application number: PCT/BR2022/050482
Authority: WO
Inventors: Leticia Maria ZANPHORLIN MURAKAMI; Wesley CARDOSO GENEROSO; Gabriela FELIX PERSINOTI
Original assignee: Cnpem - Centro Nacional De Pesquisa Em Energia E Materiais
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2022-12-06
Publication date: 2023-06-15
Also published as: WO2023102629A3

Abstract

A presente invenção se refere a uma enzima quimérica construída para a produção de alcenos terminais a partir de ácidos graxos, de maneira que o cofator necessário para a reação é produzido in situ a partir de resíduo industrial, favorecendo a economia circular. Além disso, a presente invenção trata do processo de produção de alcenos terminais empregando dita enzima quimérica. Esta invenção pertence ao campo da biotecnologia industrial e encontra aplicação na indústria de biocombustíveis e químicos renováveis.

Description

ENZIMA QUIMÉRICA E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ALCENOS TERMINAIS

CAMPO DA DESCRIÇÃO

[0001] A presente invenção trata-se de uma enzima quimérica construída para a produção de alcenos terminais a partir de ácidos graxos, bem como do processo para a produção de ditos alcenos empregando-se a referida enzima. A presente invenção pertence ao campo de biotecnologia industrial e tem aplicação na indústria de biocombustíveis e químicos renováveis.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E ESTADO DA TÉCNICA

[0002] Alcenos terminais, ou alfa olefinas, são compostos químicos que podem ser sintetizados a partir de ácidos graxos de origem renovável. Estas moléculas compõem uma relevante plataforma para a produção industrial de polímeros, fertilizantes, lubrificantes, surfactantes, biocombustíveis e outros compostos atualmente obtidos por rotas petroquímicas, e o tamanho do mercado para elas está projetado em USD 13.464 milhões para 2022.

[0003] Diante da relevância destes compostos para a indústria química e de biocombustíveis, esforços no desenvolvimento de processos de produção de alcenos terminais vem sendo empregados. Dentre as tecnologias existentes atualmente para produção destas moléculas a partir de ácidos graxos, a rota química é uma das possibilidades, mas esta é dependente de alta temperatura, de alta pressão e de catálise por metais pesados, os quais são prejudiciais ao meio ambiente. Alternativamente, a conversão dos ácidos graxos em alcenos terminais pode ser realizada por rota biotecnológica, empregando-se condições mais brandas e sustentáveis. Esta rota torna-se especialmente interessante diante da discussão sobre a necessidade de desenvolvimento econômico responsável, associada à preservação ambiental. Almeja-se que processos realizados de forma ambientalmente sustentável, com o emprego de materiais e insumos oriundos de fontes renováveis ou que façam uso de resíduos de outros processos, se tomem cada vez mais presentes no cenário mundial, contribuindo para a concretização do conceito de economia circular. [0004] Desta forma, no âmbito da rota biotecnológica para a produção de alcenos terminais, a literatura científica reporta que a enzima descarboxilase/ peroxigenase denominada OleTJE, pertencente à família 152 da superclasse P450, apresenta uma propriedade única de remoção do oxigênio de ácidos graxos de cadeia longa (C12-C20), gerando 1-alceno como produto. No entanto, trata-se de uma enzima bastante instável, de difícil produção e que necessita de altas concentrações de sais (NaCI ou KCI) para reação de descarboxilação, o que traz gargalos para seu uso industrial.

[0005] Assim como OleTJE, existem enzimas oriundas de microrganismos como Kokuria rhizophila, Corynebacterium efficiens, Bacillus subtilis, Jeotgalicoccus sp., Staphylococcus massi lien sis, Alicyclobacillus acidocaldarius e outras espécies, também com capacidade reportada de realizar a conversão de ácidos graxos a alcenos terminais. Contudo, um ponto a se levar em consideração é o de que, em geral, a rota enzimática de descarboxilação de ácidos graxos é dependente de peróxido de hidrogênio como cofator. A adição de peróxidos ao meio reacional em escala industrial impõe um custo e a necessidade de um mecanismo de injeção automática em tempos pré-determinados.

[0006] Uma possível forma de contorno da necessidade de adição de peróxido de hidrogênio ao longo do processo é a sua geração in situ para consumo durante a reação de conversão. Neste sentido, CN 107201356 (QINGDAO INSTITUTE OF BIOENERGY & BIOPROCESS TECHNOLOGY CAS BOEING INVESTMENT) apresenta, como solução, a adição de um sistema ferredoxina - ferredoxina redutase para dar suporte à atividade da enzima OleTJE. Similarmente, CN112111477 (YANGZHOU UNIVERSITY) propõe o uso de um sistema glicose - glicose oxidase para a geração de peróxido de hidrogênio, de forma branda e controlada, para dar suporte a uma enzima engenheirada (P450BS) na conversão de ácidos graxos a alcenos. Proposta parecida também pode ser encontrada em EP1940348 (DUPONT NUTRITION BIOSCIENCES), que apresenta uma composição compreendendo um sistema de enzimas acopladas na qual oxidorredutases geram peróxido de hidrogênio a partir de açúcares do meio reacional para consumo de uma enzima descarboxilase.

[0007] Nota-se que, apesar de proporcionarem uma alternativa à adição direta e controlada de peróxido de hidrogênio ao processo, as soluções existentes no estado da técnica impõem um aumento no número de reagentes necessários para a realização da conversão e demandam controle para que ambas as enzimas (geradora de peróxido e descarboxilase) estejam ativas nas condições de reação. É sempre interessante e preferível que um processo possua poucas etapas, facilidade de controle e de operação. Outro ponto a se observar é o de que o acoplamento de um sistema de geração de peróxido in situ necessita de um substrato próprio para que esta reação aconteça. Como descrito, as soluções propostas no estado da técnica empregam ferredoxina ou glicose/açúcares como substratos, mas uma possibilidade de tornar o processo de geração de peróxido in situ ainda mais sustentável, aderente ao conceito de economia circular, seria a de se realizar esta reação a partir de rejeitos de outros processos.

[0008] Dentro deste contexto, um rejeito de extrema relevância no cenário atual é o glicerol. Só na produção de bicombustíveis, estima-se que, a cada 1000 quilos de produto como bioetanol e biodiesel, são gerados 100 quilos de glicerol. É importante frisar que outras indústrias importantes, como a oleoquímica, por exemplo, também geram glicerol como um resíduo de processo. O volume de glicerol atualmente gerado é maior do que a capacidade que o mercado consegue absorver. Com isto, este rejeito possui um baixo valor agregado e como agravante, o glicerol não aproveitado tem a queima como destino: além dos problemas ambientais inerentes à queima de compostos em geral, a queima parcial do glicerol gera acroleína, uma molécula com potencial cancerígeno. A conversão de glicerol por processos biotecnológicos em produtos de maior valor agregado é uma alternativa relevante para a redução destes problemas. [0009] Diante destas informações, observam-se lacunas a serem preenchidas e melhoradas, visando tornar a rota biotecnológica de conversão de ácidos graxos a alcenos terminais ainda mais prática e industrialmente atrativa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Como forma de solucionar os gargalos apresentados, a presente invenção trata-se, em um primeiro aspecto, de uma enzima quimérica construída para a produção de alcenos terminais a partir de ácidos graxos. A enzima quimérica da presente invenção trata-se da junção de uma enzima descarboxilase, que realiza a conversão de ácidos graxos a alcenos terminais, com uma enzima geradora de peróxido, cofator da reação, por meio de uma sequência de ligação (“linker”). A principal vantagem da enzima quimérica da presente invenção está no fato de ela possuir ambas as funções necessárias para a reação em um único produto, trazendo economia e facilidade para o processo. Ainda, a enzima da presente invenção é capaz de produzir peróxido de hidrogênio in situ a partir do glicerol, o que favorece uma indústria mais sustentável, dentro do conceito de economia circular, por destinar parte do que seria desintegrado por queima para uma aplicação de maior valor agregado. Além disso, a enzima quimérica da presente invenção não necessita de meios saturados de sais para realizar a conversão de ácidos graxos a alcenos.

[0011] É válido ressaltar que nem toda enzima com alguma similaridade à proposta neste invento será passível de aplicação em um processo industrial por não possuir estabilidade na forma solúvel, característica fundamental e apresentada pela enzima quimérica da presente invenção. Ainda, a junção de duas ou mais sequências pode resultar em um produto não funcional ou com desempenho aquém das expectativas.

[0012] Neste sentido, perante o mencionado, a presente invenção trata-se, em um segundo aspecto, de um processo de produção de alcenos a partir de ácidos graxos empregando a enzima quimérica de que trata este invento. Como vantagem, o processo da presente invenção apresenta um desempenho similar ao do processo convencional, que envolve a enzima descarboxilase isolada e a adição direta de peróxido de hidrogênio ao meio, a partir de baixas concentrações da enzima do presente invento, o que reforça que as sequências reivindicadas adiante são funcionais e apresentam um avanço em relação ao estado da técnica. Além disso, o processo fornece um destino alternativo à queima do glicerol, utilizando-o para a produção de compostos de alto valor agregado e reduzindo os impactos ambientais causados pelo manejo atual deste resíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] A Figura 1 apresenta graficamente a porcentagem de conversão do ácido mirístico (C 14:0) ao seu alceno terminal correspondente (1 -trideceno) por meio da enzima quimérica da presente invenção, utilizando a referida enzima com sequência de ligação flexível (SEQ ID NO: 3) a 1 pM, ácido mirístico a 0,5 mM e concentrações entre 0,5 e 10 % de glicerol no meio reacional (tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5). A reação foi conduzida a 37 °C com agitação lenta (300 rpm) por 30 min. Comparativamente, apresenta-se o resultado da conversão obtida por meio da enzima descarboxilase (SEQ ID NO: 1 ) na presença de peróxido de hidrogênio adicionado ao meio (1 mM).

[0014] A Figura 2 apresenta graficamente a porcentagem de conversão do ácido mirístico (C 14:0) ao seu alceno terminal correspondente (1 -trideceno) por meio da enzima quimérica da presente invenção, utilizando a referida enzima com sequência de ligação rígida (SEQ ID NO: 4) a 1 pM, ácido mirístico a 0,5 mM e concentrações entre 0,5 e 10 % de glicerol no meio reacional (tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5). A reação foi conduzida a 37 °C com agitação lenta (300 rpm) por 30 min. Comparativamente, apresenta-se o resultado da conversão obtida por meio da enzima descarboxilase (SEQ ID NO: 1 ) na presença de peróxido de hidrogênio adicionado ao meio (1 mM).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0015] Conforme anteriormente dito, a presente invenção trata-se de uma enzima quimérica construída para a produção de alcenos terminais a partir de ácidos graxos, bem como do processo para a produção de ditos alcenos empregando- se a referida enzima. A partir deste ponto, detalham-se os aspectos da presente invenção.

[0016] A enzima quimérica para a produção de alcenos terminais do presente invento é caracterizada, primeiramente, pelo fato de que ela realiza a conversão de ácidos graxos utilizando o glicerol como substrato para a produção de peróxido de hidrogênio in situ.

[0017] A enzima quimérica para a produção de alcenos terminais do presente invento é caracterizada por compreender a enzima descarboxilase SEQ ID NO: 1 unida em sua porção terminal ao início da enzima alditol oxidase SEQ ID NO: 2, enzima geradora de peróxido de hidrogênio, por meio de uma sequência de ligação (“linker”). Dita sequência de ligação é preferencialmente selecionada dentre o grupo que compreende SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

[0018] Desta forma, é um objeto da presente invenção uma enzima quimérica para a produção de alcenos terminais caracterizada por possuir SEQ ID NO: 5, que se trata da enzima descarboxilase SEQ ID NO: 1 , unida em sua porção terminal à sequência de ligação SEQ ID NO: 3, por sua vez unida à porção inicial da enzima alditol oxidase SEQ ID NO: 2.

[0019] Também é um objeto da presente invenção uma enzima quimérica para a produção de alcenos terminais caracterizada por possuir SEQ ID NO: 6, que se trata da enzima descarboxilase SEQ ID NO: 1 , unida em sua porção terminal à sequência de ligação SEQ ID NO: 4, por sua vez unida à porção inicial da enzima alditol oxidase SEQ ID NO: 2.

[0020] A enzima quimérica do presente invento possui aplicação na conversão de ácidos graxos a alcenos. Desta forma, também é um objeto da presente invenção um processo para a produção de alcenos terminais.

[0021] O processo da presente invenção é caracterizado por compreender as etapas de: a) Contatar enzima quimérica a um ácido graxo na presença de glicerol, formando um meio reacional; b) Manter o meio reacional sob aquecimento e agitação por um intervalo de tempo; e, c) Recolher o produto.

[0022] Na etapa a), a enzima quimérica a ser empregada trata-se da descarboxilase SEQ ID NO: 1 unida em sua porção terminal ao início da alditol oxidase SEQ ID NO: 2 por meio de uma sequência de ligação. Dita sequência de ligação é preferencialmente selecionada dentre o grupo que compreende SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. Mais especificamente, a enzima quimérica a ser empregada na etapa a) pode ser selecionada dentre o grupo que compreende SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

[0023] O ácido graxo pode ser selecionado dentre o grupo que compreende o ácido cáprico (C10:0), o ácido láurico (C12:0), o ácido mirístico (C14:0), o ácido palmítico (C16:0), o ácido esteárico (C18:0), o ácido oleico (C18:1 ) ou combinações entre estes.

[0024] Além disso, a razão preferencial entre enzima quimérica e ácido graxo no meio é de 1 ,0 pMol L’¹ de enzima para 0,5 mMol L¹ de ácido graxo. O glicerol pode estar em concentrações preferencialmente entre 0,5 e 10 % no meio reacional.

[0025] Na etapa b), o meio reacional deve ser aquecido a uma temperatura entre 30 e 40 °C, preferencialmente a 37 °C.

[0026] A agitação imposta ao meio reacional nesta etapa do processo deve ser branda, até 500 rpm, preferencialmente 300 rpm.

[0027] O pH do meio reacional deve ser mantido entre 7,0 e 8,0, preferencialmente 7,5.

[0028] Por fim, o meio reacional deve ser mantido nas condições dispostas por, preferencialmente, um tempo de 30 minutos.

[0029] Na etapa c), o produto recolhido pode ser, opcionalmente, purificado. Para tal etapa, podem ser empregadas quaisquer técnicas de separação e purificação conhecidas por um técnico do assunto.

[0030] Adiante, a título de embasamento, porém sem se restringir a eles, apresentam-se exemplos de concretização da presente invenção.

EXEMPLO 1 : Procedimento de expressão das enzimas quiméricas [0031] A região codificadora das enzimas da presente invenção (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8) foram clonadas individualmente em vetores de expressão pET28a, com cauda 6xHisTag para facilitar purificação dos produtos. Os vetores recombinantes foram transformados em E. coli BL21 , e a expressão de cada uma das enzimas quiméricas foi conduzida em meio “Terrific Broth” (TB). Para expressão, as bactérias transformadas foram crescidas em 1 L de meio TB, a 30 °C, contendo os antibióticos adequados. Ao atingir um valor de densidade ótica igual a 1 , a temperatura do meio foi reduzida para 18 °C e a indução da expressão das enzimas da presente invenção foi iniciada com 0,2 mMol L’¹ de IPTG, 20 pMol L’¹ de hemina e 100 pMol L’¹ de 5-aminolevulinato. Após 24h de indução, as células foram isoladas e utilizadas para purificação das enzimas quiméricas. A purificação foi conduzida em resina de níquel, com tampão fosfato de sódio 25 mMol L’¹(pH 7.5) e NaCI 500 mMol L¹. As enzimas quiméricas foram recuperadas em um gradiente de imidazol, de 0-500 mMol L’¹. Ambas as construções resultaram na produção de enzimas quiméricas solúveis e funcionais (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6).

EXEMPLO 2: Ensaio de produção de alcenos terminais com as enzimas quiméricas

[0032] Reações de conversão do ácido mirístico ao seu alceno terminal correspondente (1-trideceno) foram realizadas com as enzimas quiméricas separadamente, empregando-se um volume final de 1 mL. Em todos os casos, compôs-se o meio reacional com a enzima quimérica a testar, na concentração de 1 pMol L’¹, o ácido graxo, na concentração de 0,5 mMol L’¹, e tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,5. Concentrações distintas de glicerol (0,5, 1 , 5 ou 10 %) foram adicionadas à cada reação para avaliação da taxa de conversão (%) de ácido miristico em 1-trideceno. Todas as reações foram conduzidas a 37 °C, com agitação branda (300 rpm), por 30 min.

[0033] Para comparação, uma reação com o processo tradicional de conversão de ácidos graxos a alcenos foi realizada empregando-se as mesmas condições processuais, porém substituindo-se as enzimas quiméricas pela descarboxilase SEQ ID NO: 1 e o glicerol por peróxido de hidrogênio na concentração de 1 mM (final).

[0034] Como resultado, a condição tradicional permitiu com que se atingisse uma conversão do ácido mirístico a 1-trideceno em tomo de 55 %. Conforme pode-se observar na Figura 1 , os ensaios realizados com a enzima quimérica SEQ ID NO: 5 da presente invenção apresentaram uma porcentagem de conversão entre 40 e 50 %, sendo o resultado maior atingido com uma concentração de 10 % de glicerol. Já na Figura 2, onde se apresentam os resultados de performance da enzima quimérica SEQ ID NO: 6, percebe-se uma conversão entre 40 e 55 %, atingindo-se estes níveis já a partir de 5 % de glicerol no meio reacional.

[0035] Desta maneira, observa-se que a presente invenção toma capaz a geração de peróxido no meio reacional a partir do glicerol. Em detrimento de se realizar a adição de peróxido de hidrogênio ao meio, a adição de glicerol traz uma nova perspectiva para a destinação deste resíduo industrial de uma maneira eficaz, a partir de uma enzima quimérica única, sem a necessidade de emprego de dois sistemas enzimáticos distintos para a realização da reação de conversão.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Enzima quimérica para a produção de alcenos terminais caracterizada por compreender a enzima descarboxilase SEQ ID NO: 1 unida em sua porção terminal ao início da enzima alditol oxidase SEQ ID NO: 2 por meio de uma sequência de ligação.

2. Enzima quimérica, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de a sequência de ligação ser selecionada dentre o grupo que compreende SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

3. Enzima quimérica, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por possuir SEQ ID NO: 5.

4. Enzima quimérica, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por possuir SEQ ID NO: 6.

5. Processo para a produção de alcenos terminais caracterizado por compreender as etapas de: a) Contatar enzima quimérica a um ácido graxo na presença de glicerol, formando um meio reacional; b) Manter o meio reacional sob aquecimento e agitação por um intervalo de tempo, e c) Recolher o produto.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a enzima quimérica é a descarboxilase SEQ ID NO: 1 unida em sua porção terminal ao início da alditol oxidase SEQ ID NO: 2 por meio de uma sequência de ligação.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a sequência de ligação ser selecionada dentre o grupo que compreende SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada dentre o grupo que compreende SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é selecionado dentre o grupo que compreende o ácido cáprico (C10:0), o ácido láurico (C12:0), o ácido mirístico (C14:0), o ácido palmítico (C16:0), o ácido esteárico (C18:0), o ácido oleico (C18:1) ou combinações entre estes.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a razão preferencial entre enzima quimérica e ácido graxo no meio é de, 1 ,0 pMol L’¹ de enzima para 0,5 mMol ¹ de ácido graxo.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a concentração de glicerol no meio é, preferencialmente, entre 0,5 e 10 %.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio reacional deve ser aquecido a uma temperatura entre 30 e 40 °C, preferencialmente a 37 °C.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que agitação imposta ao meio é de até 500 rpm, preferencialmente 300 rpm.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o pH do meio reacional é mantido entre 7,0 e 8,0, preferencialmente 7,5.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o tempo é de, preferencialmente, 30 minutos.