CN108467861B - 催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用 - Google Patents

催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质工程领域，涉及一种利用脂肪酸催化合成线性ɑ‑烯烃的生物催化剂OleT‑BM3R的序列、制备方法及其应用。生物催化剂OleT‑BM3R是将咸海鲜球菌（Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456）脂肪酸脱羧酶OleTJE与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)脂肪酸羟化酶CYP102A1(P450BM3)的还原酶结构域融合而得。本发明中提供的线性ɑ‑烯烃合成酶OleT‑BM3R利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧的方法具有的优点有：1）反应原料为可再生且易获得的脂肪酸，能够减少线性ɑ‑烯烃合成对石油工业的依赖；2）反应在环保的水溶液中、室温下进行、反应条件温和、低能耗；3）反应催化效率高、稳定性好、底物范围广、反应体系简单。因此在制备线性ɑ‑烯烃方面具有良好的应用前景。

Description

催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法 及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域，通过蛋白质工程改造使一种酶可以有效的利用各种羧酸合成相应的线性ɑ-烯烃，具体地，涉及一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用。
背景技术
线性ɑ-烯烃(linear ɑ-olefins,LAOs)是理想的下一代能源物质，并且是合成表面活性剂、润滑油、洗涤剂、添加剂以及聚合物重要的工业原料。因此，LAOs的应用具有广阔的市场前景。目前，LAOs主要是从传统石油工业产品乙烯聚合而成，通过这一方法获得的烯烃均为偶数个碳长，这导致奇数个碳长的烯烃价格异常昂贵。此外，随着日益减少的化石能源的储备，寻求可再生的途径生产烯烃变得尤为迫切。
以在自然界中具有丰富的储备且生物体本身能合成的脂肪酸(FAs)为原料通过脱羧作用合成LAOs是更为直接和便捷的方法。自然界中脂肪酸多以偶数碳为主，通过脱羧就能够直接获得奇数个碳长烯烃，从而填补聚乙烯工业在生产奇数个碳长烯烃的空白。目前已有的以脂肪酸为底物合成相应的LAOs的方法有利用过渡金属催化脱羧的化学合成法，其通常需要剧烈的反应条件，并且需要原位蒸馏保持产物的ɑ选择性，为了激活底物而加入的酸酐会产生多余的废弃物。显然，这种方法并不是一种绿色环保的方法。
2011年发现的咸海鲜球菌(Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456)脂肪酸脱羧酶OleTJE能够利用H2O2作为氧化剂和电子供体将饱和脂肪酸脱羧形成末端烯烃。这个仅有一个酶参与、利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧的反应是目前已知最为简单的合成LAOs的酶催化反应。其优点不仅包括脂肪酸原料的易获得性以及反应步骤的简洁性，相较于金属催化的化学合成方法，该反应的突出特点还在于：反应在环保的水溶液中进行、反应条件温和(室温)、低能耗等。但H2O2不稳定，易使OleTJE失活，而且所有依赖H2O2的脱羧反应系统普遍具有低催化效率和有限的底物范围。
OleTJE脱羧反应也可以与其他的氧化还原蛋白系统偶联，能够实现利用空气中的O2作为氧化剂，生物体中的辅酶NAD(P)H作为电子供体的脂肪酸的脱羧产末端烯烃反应。但是目前已知的耦联氧化还原蛋白的催化系统也都存在催化效率低，底物范围有限，以及复杂的反应体系导致的操作繁琐等问题，因而限制了它们的应用前景。
发明内容
为了降低线性ɑ-烯烃合成对石油工业的依赖，弥补现有工业方法无法生产奇数碳链长度线性ɑ-烯烃的缺陷，克服基于金属催化剂化学合成线性ɑ-烯烃方法高能耗、反应体系条件剧烈、产生不利于环境的废料等问题，以及解决现有酶反应体系产率低、底物范围窄、反应体系复杂等问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化效率高，底物范围广，反应体系更简洁的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R。
本发明的第二个目的是提供该脂肪酸脱羧酶的氨基酸序列和核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供制备该脂肪酸脱羧酶的方法。
本发明的第四个目的是提供脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R催化脂肪酸脱羧合成ɑ-烯烃的方法或脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R，其特征在于：将咸海鲜球菌(Jeotgalicoccus sp.ATCC 8456)脂肪酸脱羧酶OleTJE与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)脂肪酸羟化酶CYP102A1(P450BM3)的还原酶结构域融合得到生物催化剂OleT-BM3R，用于催化以脂肪酸为底物生成ɑ-烯烃的反应。
一种编码所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的氨基酸序列，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
一种编码所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种制备前述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的方法，包括如下步骤：
(1)构建表达脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的质粒：将上述SEQ ID NO:2的核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；
(2)将步骤(1)构建的表达脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的质粒转化到大肠杆菌中；
(3)脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的表达：将步骤(2)得到的菌种在LB液体培养基中过夜培养之后，加入TB液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
(4)含有脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤(3)中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
(5)脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的纯化：将步骤(4)的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合，然后于较低咪唑浓度下除去杂蛋白，最后用含有高浓度咪唑的缓冲液将目的蛋白洗脱；
(6)将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后冻干制成冻干粉，-20℃保存。
脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R的制备方法，具体步骤为：
OleT-BM3R的基因表达载体的构建：将全基因合成的OleT-BM3R片段，经限制性内切酶NdeI和XhoI依据说明书进行双酶切操作后，用T4连接酶连接到被NdeI和XhoI双酶切过的表达载体pET28a上；用连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞；从含有50μg/ml卡那霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养；从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定；
OleT-BM3R的制备：将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，将阳性克隆挑入5ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素LB液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素TB液体培养基，在37℃，摇床转速220rpm下进行扩培；待OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.1mM的IPTG诱导；在22℃，摇床转速220rpm下表达20h后，离心转速5000rpm离心10min收菌；舍弃上清培养基后，用50ml的buffer A(0.1M KPi，0.3M KCl，pH7.0)将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000rpm，离心45min，获得上清细胞裂解液；将上述细胞裂解液加入事先以buffer A(0.1M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0)预处理的20ml镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含10mM，35mM咪唑的buffer C(10mM或35mM咪唑，0.1M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0)除去杂蛋白，并用buffer B(0.1M KPi，0.3M KCl，250mM咪唑，pH7.0)将OleT-BM3R从柱上洗脱下来；OleT-BM3R的纯度由SDS-PAGE鉴定；将洗脱下的OleT-BM3R用buffer A4℃下过夜透析，以除去咪唑；最终将OleT-BM3R蛋白冻干制成冻干粉，-20℃下保存。
采用脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R催化合成线性ɑ-烯烃的基本方法：在反应容器中分别加入反应缓冲液,脂肪酸脱羧酶OleT-BM3R冻干粉，底物，过氧化氢酶，NADPH；室温下反应。在此基础上，可以利用大肠杆菌自身代谢的NADPH来推动反应，无需额外添加NADPH，具体为：在反应容器中分别加入OleT-BM3R的制备方法中步骤(4)获得的上清液，底物，过氧化氢酶；室温下反应。为降低NADPH的使用量，可以在以上两种反应的基础上，加入亚磷酸盐和亚磷酸脱氢酶形成NADPH的循环再生系统。
所述的底物为有机羧酸；所述的反应缓冲液成分为：0.1M KPi(磷酸钾)，0.3MKCl，pH7.0。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明中提供的线性ɑ-烯烃合成酶OleT-BM3R利用脂肪酸作为底物、一步实现脱羧其优点不仅包括脂肪酸原料的易获得性以及反应步骤的简洁性，相较于金属催化的化学合成方法，该反应的突出特点还在于：反应在环保的水溶液中进行、反应条件温和(室温)、低能耗等。融合了巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)脂肪酸羟化酶CYP102A1(P450BM3)的还原酶结构域使得该酶摆脱了对不稳定的、与生物体系不兼容的H2O2的依赖，且较已知酶催化脂肪酸合成ɑ-烯烃方法，具备了反应体系得到简化(不需要额外投入一定比例含有其他氧化还原蛋白的发酵液)、反应活性有所提高、反应底物范围宽(饱和脂肪酸C4-C20，以及末端带不同官能团的羧酸如：双键、苯环、环烷基、酮、醛、卤素、羟基、双羧酸等)等优点。该酶具有较好的的稳定性——在37℃水浴24h后几乎没有活性的损失。制成的冻干粉可以保存在-20℃数月后依然没有影响其催化活性。
同时该反应可以偶联如亚磷酸脱氢酶(PTDH)等的NADPH再生系统，以廉价的反应物(如亚磷酸钠)作为最终的电子来源为反应持续的提供NADPH，因此大大降低生产成本。并且OleT-BM3R/PTDH系统能在较少的催化剂用量(～0.02mol％)下，能够获得高达到2.51gL-1的产率以及209.2mg L-1h-1的体积产率，为目前已知酶催化产烃类效率最高的反应。同时含有该酶的发酵液在不加入NADPH的反应体系中就能直接催化脂肪酸脱羧，这不仅使得生产成本变得更低，更省略蛋白纯化的步骤使得劳动成本降低，提高生产效率。上述所有的特质说明了这个融合蛋白在生物能源和工业生产方面的应用价值。
附图说明
图1是OleT-BM3R的构建结构图和OleT-BM3R(冻干粉)耦合基于PTDH的NADPH循环系统利用O2催化羧酸脱羧形成烯烃的示意图；其中图1A为OleT-BM3R的构建结构图，OleT-BM3R由OleTJE(粉色)，P450BM3的FMN结合结构域(蓝绿色)，P450BM3的FAD/NADPH结合结构域(蓝色)组成，辅因子：血红素，FMN，FAD，NADP+的结构由棒状模型表示；图1B图示了OleT-BM3R(冻干粉)耦合基于PTDH的NADPH循环系统利用O2催化羧酸脱羧形成烯烃。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。
除非特定说明，以下所有的化合物和试剂都是从Sigma-Aldrich,EMD Millipore,Tokyo Chemical Industry，生工生物工程(上海)有限公司购买，纯度均>99％。
实施例1 OleT-BM3R的基因表达载体的构建
将全基因合成的OleT-BM3R片段(序列如SEQ ID NO：2所示，由苏州金唯智生物有限公司合成)，经限制性内切酶NdeI和XhoI(New England Biolabs公司)依据说明书进行双酶切操作后，用T4连接酶(New England Biolabs公司)连接到被NdeI和XhoI双酶切过的表达载体pET28a上。用连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞(天根生化科技有限公司)。从含有50μg/ml卡那霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养。从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒(天根生化科技有限公司)，依据说明书提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定(苏州金唯智生物有限公司)。
实施例2 OleT-BM3R的制备
(1)将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)(天根生化科技有限公司)中，将阳性克隆挑入5ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素LB液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素TB液体培养基，在37℃，摇床转速220rpm下进行扩培。待OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.1mM的IPTG诱导。在22℃，摇床转速220rpm下表达20h后，离心转速5000rpm离心10min收菌。舍弃上清培养基后，用50ml的buffer A(0.1M KPi磷酸钾，0.3MKCl，pH7.0)将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000rpm，离心45min，获得上清细胞裂解液；
(2)将上述细胞裂解液加入事先以buffer A预处理的20ml镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含10mM，35mM咪唑的buffer C(10mM或35mM咪唑，0.1M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0)除去杂蛋白，并用buffer B(0.1M KPi，0.3M KCl，250mM咪唑，pH7.0)将OleT-BM3R从柱上洗脱下来；OleT-BM3R的纯度由SDS-PAGE鉴定，一般纯度>98％。将洗脱下的OleT-BM3R用buffer A4℃下过夜透析，以除去咪唑。最终将OleT-BM3R蛋白冻干制成冻干粉，-20℃下保存。在此条件下保存的OleT-BM3R制品一年内无明显活性变化。
实施例3利用OleT-BM3R冻干粉联合基于PTDH的NADPH再生系统催化天然饱和脂肪酸合成相应ɑ-烯烃
反应体系：buffer A，OleT-BM3R(3μM)，脂肪酸(1mM)(脂肪酸C4-C11助溶剂：5％EtOH(v/v)，脂肪酸C12-C20助溶剂：5％EtOH(v/v)和1.5％Triton X-100(v/v))，过氧化氢酶(100U mL-1)，亚磷酸钠(10mM)，PTDH亚磷酸脱氢酶(2μM)，NADPH(200μM)，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。各天然脂肪酸脱羧合成烯烃的产率：C4：14％，C5：11％，C6：68％，C7：70％，C8：40％，C9：47％，C10:70％，C11：58％，C12：46％，C14：52％，C16：60％，C18：73％，C20：70％。
实施例4利用OleT-BM3R冻干粉联合基于PTDH的NADPH再生系统催化非天然脂肪酸合成相应ɑ-烯烃
反应体系：buffer A，OleT-BM3R(3μM)，脂肪酸(1mM)(助溶剂：5％EtOH(v/v))，过氧化氢酶(100U mL-1)，亚磷酸钠(10mM)，PTDH(2μM)，NADPH(200μM)，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。各非天然脂肪酸脱羧合成烯烃的产率：环己甲酸(cyclohexanecarboxylicacid)：30％，2-甲基己酸(2-methlyhexanoic acid)：30％，3-苯基丙酸(3-phenylpropionic acid)：78％，3-(4-氟苯基)丙酸(3-(4-Fluorophenyl)propionicacid)：44％，10-十一碳烯酸(10-undecenoic acid)：71％，10-羰基十一酸(10-oxoundecanoic acid)：48％，12-羟基十二酸(12-hydroxydodecanoic acid)：42％，11-溴十一酸(11-bromoundecanoic acid)：40％，15-醛基十五酸(15-oxopentadecanoic acid)：11％，十二烷二酸(dodecanedioic acid)：42％。
实施例5用OleT-BM3R冻干粉催化1g(3.52mmol)硬脂酸合成1-十七烯
反应体系：buffer A，OleT-BM3R(3μM)，硬脂酸(1g)，助溶剂5％EtOH(v/v)和1.5％Triton X-100(v/v)，过氧化氢酶(100U mL-1)，亚磷酸钠(50mM)，PTDH(2μM)，NADPH(200μM)，400ml体系，室温，摇床转速125rpm，反应20小时。反应结束后，产物用乙酸乙酯萃取，得到的有机相中加入无水硫酸镁除去多余的水后旋蒸浓缩。浓缩过的有机相通过硅胶柱层析方法(洗脱剂：正己烷)纯化后旋蒸，得到纯度>99％的1-十七烯503.6mg(产率：60％)。
实施例6利用OleT-BM3R冻干粉催化40mM硬脂酸合成1-十七烯
反应体系：buffer A，OleT-BM3R(9μM)，硬脂酸(40mM)，助溶剂5％EtOH(v/v)和1.5％Triton X-100(v/v)，过氧化氢酶(100U mL-1)，亚磷酸钠(50mM)，PTDH(2μM)，NADPH(200μM)，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。最后得到1-十七烯的产率为26％，2.51g L-1以及209.2mg L-1h-1的体积产率。
实施例7利用OleT-BM3R发酵液催化10mM硬脂酸合成1-十七烯
细胞裂解液的制备同实例2(1)。反应体系：含有OleT-BM3R的发酵液(5μM)，硬脂酸(10mM)，助溶剂5％EtOH(v/v)和1.5％Triton X-100(v/v)，过氧化氢酶(100U mL-1)，亚磷酸钠(50mM)，PTDH(2μM)，1ml体系，室温，摇床转速125rpm，反应12小时。最后得到1-十七烯的产率为53％，1.26g L-1以及105.0mg L-1h-1的体积产率。
以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 催化合成线性ɑ-烯烃生物催化剂OleT-BM3R的序列、制备方法及其应用
<130> xhx2018042701
<141> 2018-04-27
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1016
<212> PRT
<213> Jeotgalicoccus sp.
<400> 1
Met Ala Thr Leu Lys Arg Asp Lys Gly Leu Asp Asn Thr Leu Lys Val
1 5 10 15
Leu Lys Gln Gly Tyr Leu Tyr Thr Thr Asn Gln Arg Asn Arg Leu Asn
20 25 30
Thr Ser Val Phe Gln Thr Lys Ala Leu Gly Gly Lys Pro Phe Val Val
35 40 45
Val Thr Gly Lys Glu Gly Ala Glu Met Phe Tyr Asn Asn Asp Val Val
50 55 60
Gln Arg Glu Gly Met Leu Pro Lys Arg Ile Val Asn Thr Leu Phe Gly
65 70 75 80
Lys Gly Ala Ile His Thr Val Asp Gly Lys Lys His Val Asp Arg Lys
85 90 95
Ala Leu Phe Met Ser Leu Met Thr Glu Gly Asn Leu Asn Tyr Val Arg
100 105 110
Glu Leu Thr Arg Thr Leu Trp His Ala Asn Thr Gln Arg Met Glu Ser
115 120 125
Met Asp Glu Val Asn Ile Tyr Arg Glu Ser Ile Val Leu Leu Thr Lys
130 135 140
Val Gly Thr Arg Trp Ala Gly Val Gln Ala Pro Pro Glu Asp Ile Glu
145 150 155 160
Arg Ile Ala Thr Asp Met Asp Ile Met Ile Asp Ser Phe Arg Ala Leu
165 170 175
Gly Gly Ala Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Ser Lys Glu Ala Arg Arg Arg
180 185 190
Val Glu Asp Trp Leu Glu Glu Gln Ile Ile Glu Thr Arg Lys Gly Asn
195 200 205
Ile His Pro Pro Glu Gly Thr Ala Leu Tyr Glu Phe Ala His Trp Glu
210 215 220
Asp Tyr Leu Gly Asn Pro Met Asp Ser Arg Thr Cys Ala Ile Asp Leu
225 230 235 240
Met Asn Thr Phe Arg Pro Leu Ile Ala Ile Asn Arg Phe Val Ser Phe
245 250 255
Gly Leu His Ala Met Asn Glu Asn Pro Ile Thr Arg Glu Lys Ile Lys
260 265 270
Ser Glu Pro Asp Tyr Ala Tyr Lys Phe Ala Gln Glu Val Arg Arg Tyr
275 280 285
Tyr Pro Phe Val Pro Phe Leu Pro Gly Lys Ala Lys Val Asp Ile Asp
290 295 300
Phe Gln Gly Val Thr Ile Pro Ala Gly Val Gly Leu Ala Leu Asp Val
305 310 315 320
Tyr Gly Thr Thr His Asp Glu Ser Leu Trp Asp Asp Pro Asn Glu Phe
325 330 335
Arg Pro Glu Arg Phe Glu Thr Trp Asp Gly Ser Pro Phe Asp Leu Ile
340 345 350
Pro Gln Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Thr Asn His Arg Cys Ala Gly Glu
355 360 365
Trp Ile Thr Val Ile Ile Met Glu Glu Thr Met Lys Tyr Phe Ala Glu
370 375 380
Lys Ile Thr Tyr Asp Val Pro Glu Gln Asp Leu Glu Val Asp Leu Asn
385 390 395 400
Ser Ile Pro Gly Tyr Val Lys Ser Gly Phe Val Ile Lys Asn Val Arg
405 410 415
Glu Val Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr Glu
420 425 430
Gln Ser Ala Lys Lys Val Arg Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr
435 440 445
Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr
450 455 460
Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln
465 470 475 480
Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala
485 490 495
Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala
500 505 510
Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys
515 520 525
Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr
530 535 540
Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys
545 550 555 560
Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp
565 570 575
Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val
580 585 590
Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser
595 600 605
Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala
610 615 620
Lys Met His Gly Ala Phe Ser Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu
625 630 635 640
Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu
645 650 655
Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro
660 665 670
Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu
675 680 685
Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala
690 695 700
His Leu Pro Leu Ala Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr
705 710 715 720
Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala
725 730 735
Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu
740 745 750
Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met
755 760 765
Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu
770 775 780
Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser
785 790 795 800
Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val
805 810 815
Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala
820 825 830
Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe
835 840 845
Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr
850 855 860
Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly
865 870 875 880
Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly
885 890 895
Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu
900 905 910
Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu
915 920 925
His Thr Ala Phe Ser Arg Met Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln
930 935 940
His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln
945 950 955 960
Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro Ala
965 970 975
Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val Ser
980 985 990
Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg
995 1000 1005
Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly
1010 1015
<210> 2
<211> 3051
<212> DNA
<213> Jeotgalicoccus sp.
<400> 2
atggcaacac ttaagaggga taagggctta gataatactt tgaaagtatt aaagcaaggt 60
tatctttaca caacaaatca gagaaatcgt ctaaacacat cagttttcca aactaaagca 120
ctcggtggta aaccattcgt agttgtgact ggtaaggaag gcgctgaaat gttctacaac 180
aatgatgttg ttcaacgtga aggcatgtta ccaaaacgta tcgttaatac gctttttggt 240
aaaggtgcaa tccatacggt agatggtaaa aaacacgtag acagaaaagc attgttcatg 300
agcttgatga ctgaaggtaa cttgaattat gtacgagaat taacgcgtac attatggcat 360
gcgaacacac aacgtatgga aagtatggat gaggtaaata tttaccgtga atctatcgta 420
ctacttacaa aagtaggaac acgttgggca ggcgttcaag caccacctga agatatcgaa 480
agaatcgcaa cagacatgga catcatgatc gattcattta gagcacttgg tggtgccttt 540
aaaggttaca aggcatcaaa agaagcacgt cgtcgtgttg aagattggtt agaagaacaa 600
attattgaga ctcgtaaagg gaatattcat ccaccagaag gtacagcact ttacgaattt 660
gcacattggg aagactactt aggtaaccca atggactcaa gaacttgtgc gattgactta 720
atgaacacat tccgcccatt aatcgcaatc aacagattcg tttcattcgg tttacacgcg 780
atgaacgaaa acccaatcac acgtgaaaaa attaaatcag aacctgacta tgcatataaa 840
ttcgctcaag aagttcgtcg ttactatcca ttcgttccat tccttccagg taaagcgaaa 900
gtagacatcg acttccaagg cgttacaatt cctgcaggtg taggtcttgc attagatgtt 960
tatggtacaa cgcatgatga atcactttgg gacgatccaa atgaattccg cccagaaaga 1020
ttcgaaactt gggacggatc accatttgac cttattccac aaggtggtgg agattactgg 1080
acaaatcacc gttgtgcagg tgaatggatc acagtaatca tcatggaaga aacaatgaaa 1140
tactttgcag aaaaaataac ttatgatgtt ccagaacaag atttagaagt ggacttaaac 1200
agtatcccag gatacgttaa gagtggcttt gtaatcaaaa atgttcgcga agttaaaaaa 1260
attccgcttg gcggtattcc ttcacctagc actgaacagt ctgctaaaaa agtacgcaaa 1320
aaggcagaaa acgctcataa tacgccgctg cttgtgctat acggttcaaa tatgggaaca 1380
gctgaaggaa cggcgcgtga tttagcagat attgcaatga gcaaaggatt tgcaccgcag 1440
gtcgcaacgc ttgattcaca cgccggaaat cttccgcgcg aaggagctgt attaattgta 1500
acggcgtctt ataacggtca tccgcctgat aacgcaaagc aatttgtcga ctggttagac 1560
caagcgtctg ctgatgaagt aaaaggcgtt cgctactccg tatttggatg cggcgataaa 1620
aactgggcta ctacgtatca aaaagtgcct gcttttatcg atgaaacgct tgccgctaaa 1680
ggggcagaaa acatcgctga ccgcggtgaa gcagatgcaa gcgacgactt tgaaggcaca 1740
tatgaagaat ggcgtgaaca tatgtggagt gacgtagcag cctactttaa cctcgacatt 1800
gaaaacagtg aagataataa atctactctt tcacttcaat ttgtcgacag cgccgcggat 1860
atgccgcttg cgaaaatgca cggtgcgttt tcaacgaacg tcgtagcaag caaagaactt 1920
caacagccag gcagtgcacg aagcacgcga catcttgaaa ttgaacttcc aaaagaagct 1980
tcttatcaag aaggagatca tttaggtgtt attcctcgca actatgaagg aatagtaaac 2040
cgtgtaacag caaggttcgg cctagatgca tcacagcaaa tccgtctgga agcagaagaa 2100
gaaaaattag ctcatttgcc actcgctaaa acagtatccg tagaagagct tctgcaatac 2160
gtggagcttc aagatcctgt tacgcgcacg cagcttcgcg caatggctgc taaaacggtc 2220
tgcccgccgc ataaagtaga gcttgaagcc ttgcttgaaa agcaagccta caaagaacaa 2280
gtgctggcaa aacgtttaac aatgcttgaa ctgcttgaaa aatacccggc gtgtgaaatg 2340
aaattcagcg aatttatcgc ccttctgcca agcatacgcc cgcgctatta ctcgatttct 2400
tcatcacctc gtgtcgatga aaaacaagca agcatcacgg tcagcgttgt ctcaggagaa 2460
gcgtggagcg gatatggaga atataaagga attgcgtcga actatcttgc cgagctgcaa 2520
gaaggagata cgattacgtg ctttatttcc acaccgcagt cagaatttac gctgccaaaa 2580
gaccctgaaa cgccgcttat catggtcgga ccgggaacag gcgtcgcgcc gtttagaggc 2640
tttgtgcagg cgcgcaaaca gctaaaagaa caaggacagt cacttggaga agcacattta 2700
tacttcggct gccgttcacc tcatgaagac tatctgtatc aagaagagct tgaaaacgcc 2760
caaagcgaag gcatcattac gcttcatacc gctttttctc gcatgccaaa tcagccgaaa 2820
acatacgttc agcacgtaat ggaacaagac ggcaagaaat tgattgaact tcttgatcaa 2880
ggagcgcact tctatatttg cggagacgga agccaaatgg cacctgccgt tgaagcaacg 2940
cttatgaaaa gctatgctga cgttcaccaa gtgagtgaag cagacgctcg cttatggctg 3000
cagcagctag aagaaaaagg ccgatacgca aaagacgtgt gggctgggtg a 3051

Claims (8)

1.一种催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R，其特征在于：将咸海鲜球菌（Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456）脂肪酸脱羧酶OleTJE与巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）脂肪酸羟化酶CYP102A1（P450BM3）的还原酶结构域融合得到生物催化剂OleT-BM3R，用于催化以脂肪酸为底物生成ɑ-烯烃的反应；所述催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种编码权利要求1所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的多核苷酸，其特征在于：所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种制备权利要求1所述的催化合成线性ɑ-烯烃的生物催化剂OleT-BM3R的方法，包括如下步骤：
（1）构建表达OleT-BM3R的质粒：将SEQ ID NO:2的核苷酸序列经酶切重组到表达载体上；
（2）将步骤（1）构建的表达OleT-BM3R的质粒转化到大肠杆菌中；
（3）OleT-BM3R的表达：将步骤（2）得到的菌种在LB液体培养基中过夜培养之后，加入TB液体培养基中扩培，于对数期后期加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
（4）含有OleT-BM3R的细胞裂解液的制备：用缓冲液将步骤（3）中得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
（5）OleT-BM3R的纯化：将步骤（4）的上清液加入事先预处理的镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合，分别用含10 mM，35 mM咪唑的buffer C 除去杂蛋白，并用buffer B 将OleT-BM3R从柱上洗脱下来；buffer B为0.1 M KPi磷酸钾，0.3 M KCl，250 mM咪唑，pH7.0的缓冲液；buffer C为10 mM或35 mM咪唑，0.1 M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0的缓冲液；
（6）将洗脱下来的目的蛋白透析以除去咪唑，蛋白经浓缩后冻干制成冻干粉，-20℃保存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤为：
OleT-BM3R的基因表达载体的构建：将全基因合成的OleT-BM3R片段，经限制性内切酶NdeI和XhoI进行双酶切操作后，用T4连接酶连接到被NdeI和XhoI双酶切过的表达载体pET28a上；用连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞；从含有50 μg/ml卡那霉素的固体LB培养基平板上挑取转化成功的单克隆菌落，在含有同浓度卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃温度，摇床转速为220rpm的条件下过夜培养；从培养的菌液中用质粒小抽试剂盒提取重组质粒，并将提取的质粒送测序鉴定；
OleT-BM3R的制备：将测序成功的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta（DE3）中，将阳性克隆挑入5 ml 含有50 μg/ml卡那霉素和34 μg/ml氯霉素LB液体培养基中过夜培养后，将菌液以1:100的比例加入500 ml 含有50 μg/ml卡那霉素和34 μg/ml氯霉素TB液体培养基，在37℃，摇床转速220 rpm下进行扩培；待OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5 mM的血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和0.1 mM的IPTG诱导；在22℃，摇床转速220 rpm下表达20 h后，离心转速5000 rpm离心10 min收菌；舍弃上清培养基后，用50 ml的buffer A将菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，并于4℃，离心转速10000 rpm，离心45 min，获得上清细胞裂解液；将上述细胞裂解液加入事先以buffer A预处理的20 ml镍离子亲和柱，使带有His标签的目的蛋白与镍柱结合；随后，分别用含10 mM，35 mM咪唑的buffer C除去杂蛋白，并用buffer B将OleT-BM3R从柱上洗脱下来；OleT-BM3R的纯度由SDS-PAGE鉴定；将洗脱下的OleT-BM3R用bufferA4℃下过夜透析，以除去咪唑；最终将OleT-BM3R蛋白冻干制成冻干粉，-20℃下保存；其中buffer A为0.1 M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0的缓冲液；buffer B为0.1 M KPi磷酸钾，0.3 M KCl， 250 mM咪唑，pH7.0的缓冲液；buffer C为10 mM或35 mM咪唑，0.1 M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0的缓冲液。
5.采用权利要求1所述的OleT-BM3R催化合成线性ɑ-烯烃的方法，其特征在于：在反应容器中分别加入反应缓冲液, OleT-BM3R冻干粉，底物，过氧化氢酶，NADPH；室温下反应。
6.采用权利要求1所述的OleT-BM3R催化合成线性ɑ-烯烃的方法，其特征在于：利用大肠杆菌自身代谢的NADPH来推动反应，无需额外添加NADPH；在反应容器中分别加入权利要求3中步骤（4）所获得的上清液，底物，过氧化氢酶；室温下反应。
7.采用权利要求5或6所述的OleT-BM3R催化合成线性ɑ-烯烃的方法，其特征在于：加入亚磷酸盐和亚磷酸脱氢酶形成NADPH的循环再生系统，以降低NADPH的使用量。
8.权利要求5或6所述的催化合成线性ɑ-烯烃的方法，其特征在于：所述的底物为有机羧酸；所述的反应缓冲液成分为：0.1 M KPi磷酸钾，0.3M KCl，pH7.0。
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