KR101294339B1 - 고농도, 고수율, 고순도의 ｄ형 젖산을 생산하는 락토바실러스 코리니포미스 변이주 및 그의 용도 - Google Patents

고농도, 고수율, 고순도의 ｄ형 젖산을 생산하는 락토바실러스 코리니포미스 변이주 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내당성 및 내산성이 향상된 락토바실러스 코리니포미스 변이주, 그 생산방법 및 이를 이용한 젖산 생산방법에 관한 것으로, 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상되고, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L 및 젖산 20 g/L 내지 150 g/L을 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내며, 92-99.5%의 젖산 생산수율을 가지고, D형 젖산에 대하여 98-99.9%의 광학적 순도를 나타내는 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) 변이주를 제공한다. 본 발명은 내당성 및 내산성을 향상시킨 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 통해 기질인 당과 생산물인 젖산에 의한 젖산균 생육 저해 현상을 개선하여 친환경적인 생물공학적 방법을 이용하면서도 야생형에 비하여 D 형 젖산을 고수율로 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 값비싼 효모추출물 대신에 옥수수를 처리한 후 발생하는 폐기물인 값싼 옥수수침지가루 및 옥수수침지액을 유기질소원으로 사용하여 원가를 절감할 수 있는 젖산 제조방법을 제공할 수 있다.

Description

고농도, 고수율, 고순도의 Ｄ형 젖산을 생산하는 락토바실러스 코리니포미스 변이주 및 그의 용도 {Mutants of Lactobacillus coryniformis Producing D-Lactic Acid with High Concentration, High Yield, and High Purity and Their Uses}
본 발명은 고농도, 고수율, 고순도의 D형 젖산을 생산하는 내당성 및 내산성이 향상된 락토바실러 스 코리니포미스 변이주, 그 생산방법 및 이를 이용한 젖산 생산방법에 관한 것이다.
젖산(Lactic acid)은 자연적으로 광범위하게 존재하는 유기산으로서 거울이성질체 관계인 D형 젖산 및 L형 젖산이 존재하며, 일반적으로 생물체에는 동시에 혼재하고 동물성 식품이 식물성 식품 대비 젖산 함량이 높다. 또한 젖산은 요구르트, 버터, 치즈, 김치, 된장 및 간장 등의 발효식품 또는 전통 절임식품 등을 비롯한 많은 식품들에 존재하며 섭취되어 왔다. 일반적으로 젖산은 식품 보존제, 향미제, 산미제, pH 조정제, 흡습제, 세정제, 투석액, 용매, 빈혈치료제, 여드름치료제 및 생분해성 플라스틱(바이오플라스틱) 중 하나인 폴리젖산(Polylactic acid, PLA)의 원료 등의 다양한 용도로 식품, 화장품, 의약품, 화학약품, 금속, 전자, 직물, 염색, 페인트 및 피혁 공업 등 여러 산업 분야에 널리 사용되고 있어 그 중요성이 증가되고 있다.
최근 수요가 증가되는 분야인 생분해성 플라스틱 중 하나인 폴리젖산은 광학적 순도가 높은 D형 젖산 및 L형 젖산으로 생산 할 경우 용융점과 강도가 높아진다. 이러한 특징으로 인해 폴리젖산의 원료로 사용되는 젖산의 경우 광학적순도가 중요하다.
이처럼 산업적으로 매우 유용한 물질인 젖산을 생산하는 방법에는 석유화학적 합성법과 당을 기질로한 미생물발효공정에 위한 생물공학적 발효법이 있다. 석유화학적 합성법은 원유에서 유래한 에틸렌의 산화로 얻은 아세트알데히드를 시안화수소 첨가반응을 통해 락토니트릴(lactonitrile)로 만든 후, 증류 및 정제하여 산 가수분해로 젖산을 생산하는 공정이다. 생물공학적 발효법은 포도당, 전분 또는 당밀 등의 탄수화물을 기질로 하여 미생물을 이용한 발효공정을 통해 젖산을 생산하는 공정이다. 전자인 석유화학적 합성법은 후자인 생물공학적 발효법에 비해 간편하게 젖산을 생산할 수 있다는 장점이 있지만, D형 젖산 50% 및 L형 젖산 50%로 구성된 라세믹 혼합물로서 그 혼합물 조성비를 조절할 수 없는 비활성인 DL형 젖산이 생산되며, 이 혼합물을 원료로 폴리젖산을 생산할 경우 상당히 용융점이 낮은 무정형의 고분자가 되어 사용 용도에 제한이 많다는 단점이 있다. 이에 비해 생물공학적 발효법은 미생물에 따라서 D형 젖산과 L형 젖산을 선택적으로 생산할 수 있다는 장점이있다. 예를 들면, 락토바실러스 불가리쿠스 ( Lactobacillus bulgaricus ), 락토바실러스 코리니포미스, 류코노스톡 메센테로이데스 등의 미생물은 D형 젖산을 주로 생산하며, 락토바실러스 파라카제이, 엔테로코커스 피칼리스 등의 미생물은 L형 젖산을 주로 생산하는 것으로 알려져 있다. 더불어 석유화학에너지 고갈로 해마다 요동을 치는 국제유가와 환경오염으로 인한 지구온난화와 같은 이상기후 등을 극복하고자 최근 환경 친화적 노력이 세계적으로 추진되고 있는 점도 생물공학적 발효법이 선호되는 이유이다. 하지만 기질인 당과 생산물인 젖산에 의한 미생물 생육 저해 현상으로 인한 생산성 감소는 해결되어야 할 과제이다.
젖산을 고효율로 생산하기 위한 기술적 개발은 오랫동안 꾸준히 이루어져 왔다. 젖산을 고효율로 생산하는 것과 관련된 기술에는 내당성과 내산성을 향상시킨 엔테로코커스 에스피 . 알케이와이1 KCTC 8890P를 이용한 젖산 생산 방법(대한민국 특허출원공개공보 제2001-0008380호), 된장에서 분리한 락토바실러스 에스피 . 알케이와이2 KCTC 10353BP를 이용한 젖산 생산 방법(대한민국 특허 제0453758호), 김치에서 분리한 락토바실러스 파라카제이 KCCM10542를 이용한 젖산 생산 방법(대한민국 특허 제0517065호), 자연계에서 분리한 락토바실러스 카제이 서브스페시스 람노서스 KCTC 0084BP를 이용한 젖산 생산 방법(대한민국 특허 제 0113816호) 및 자연으로부터 얻어지는 오탄당, 육탄당으로부터 젖산을 고효율로 생산하는 유기체를 신규 분리하여 산업적으로 이용하기 위한 방법(미국특허US7098009호)이 제시된 바 있다. 또한, 젖산 생산에 있어서 원가부담을 줄이기 위해 저렴한 바이오매스를 이용한 발효 방법에 대한 기술에는 타피오카 전분(대한민국 특허출원공개공보 제 2005-0010986호), 밀기울(대한민국 특허 제 0454597호), 쌀겨(대한민국 특허 제 0490953호) 및 목질계 당화액(대한민국 특허출원공개공보 제 2003-0008187호) 등이 제시된 바 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 탄수화물로부터 D형 젖산을 생물공학적으로 고농도, 고수율, 고순도로 제조하는 젖산 생산균주를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 락토바실러스 코리니포미스 균주에 적합한 변이제 예컨대, MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 내당성 및 내산성이 향상된 변이주를 제조하고, 이를 이용하는 경우에는 높은 수율로 젖산을 제조할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 내당성, 내산성 및 젖산 생산능이 향상된 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) 변이주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 내당성, 내산성 및 젖산 생산능이 향상된 락토바실러스 코리니포미스 변이주의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 포함하는 젖산 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 젖산 제조 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상되고, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L 및 젖산 20 g/L 내지 150 g/L을 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내며, 92-99.5%의 젖산 생산수율을 가지고, D형 젖산에 대하여 98-99.9%의 광학적 순도를 나타내는 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) 변이주를 제공한다.
본 발명자들은 탄수화물로부터 D형 젖산을 생물공학적으로 고농도, 고수율, 고순도로 제조하는 젖산 생산균주를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 락토바실러스 코리니포미스 균주에 적합한 변이제 예컨대, MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 내당성 및 내산성이 향상된 변이주를 제조하고, 이를 이용하는 경우에는 높은 수율로 젖산을 제조함으로써, 본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주가 상술한 목적을 모두 달성할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주는 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상된 특성을 나타낸다. 보다 상세하게는, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L의 높은 당 농도에서 지속된 생육을 나타내며, 젖산 20 g/L 내지 150 g/L의 높은 산 농도에서 지속된 생육을 나타낸다.
본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 언급하면서 사용되는 용어 “내당성”은 당업계의 통상적인 진탕배양(예컨대, 50 ㎖ 배양 플라스크 이용)에서 배양하는 경우 포도당 80 g/L 내지 150 g/L의 농도, 바람직하게는 포도당 100g/L 내지 130 g/L의 농도, 보다 바람직하게는 포도당 110 g/L 내지 120 g/L의 농도에서 지속된 생육을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다. 당업계의 통상적인 발효기(예컨대, 교반기 및 자동 pH 조절기 장착된 5 L 발효기)에서 배양하는 경우 용어 “내당성”은 포도당 80 g/L 내지 150 g/L의 농도, 바람직하게는 포도당 100 g/L 내지 130 g/L의 농도, 보다 바람직하게는 포도당 110 g/L 내지 120 g/L의 농도에서 지속된 생육을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다.
본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 언급하면서 사용되는 용어 “내산성”은 당업계의 통상적인 진탕배양(예컨대, 50mL 배양 플라스크 이용)에서 배양하는 경우 초기 배양 배지에 함유된 젖산 20 g/L 내지 150 g/L, 바람직하게는 젖산 20 g/L 내지 130 g/L, 보다 바람직하게는 젖산 20 g/L 내지 120 g/L, 보다 바람직하게는 젖산 110g/L의 농도에서 지속된 생육을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다. 당업계의 통상적인 발효기(예컨대, 교반기 및 자동 pH 조절기 장착된 5 L 발효기)에서 배양하는 경우 용어 “내산성”은 젖산 20 g/L 내지 150 g/L, 바람직하게는 젖산 20 g/L 내지 130 g/L, 보다 바람직하게는 젖산 20 g/L 내지 120 g/L, 보다 더 바람직하게는 젖산 110 g/L 내지 120 g/L의 농도에서 지속된 생육을 나타내는 배양학적 특성을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “광학적 순도”는 이성질체의 혼합물을 구성하는 샘플 의 선광 중 관찰되는 단일 순수 이성질체의 선광 비율을 말한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주는 산업적으로 유용한 D 형 젖산 생산수율은 97-99.5%이다. 분자 모양이 거울 대칭이 되는 분자(D 형 및 L 형)를 광학 이성질체라고 하며, 결정구조가 선광을 가지는 경우, 서로 다른 선광을 보인다.
본 명세서에서 용어 “지속된 생육”은 고농도의 포도당 또는 젖산에 의해 미생물이 사멸되지 않고 생장의 중단 없이 계속적인 증식을 하는 배양학적 특성을 의미한다. 보다 상세하게는, 상기 용어는 젖산균의 통상적인 배양에 있어서 포도당 농도(예를 들어, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L) 또는 젖산 농도(예를 들어, 젖산 80 g/L 내지 150 g/L)에서 젖산균이 나타내는 생장곡선에서 정지기(stationary phase) 최초 시점으로부터 사멸기(death phase) 최초 시점 사이의 시간, 즉 정지기의 시간(a period of time)과 비교하여, 상기 내당성 또는 내산성의 포도당 농도 및 젖산 농도에서의 배양에서 정지기의 시간이 50-100%, 바람직하게는 80-100%되는 것을 의미한다.
본 발명에서 젖산 생산수율은 탄소원 및 에너지원으로 사용된 포도당에 대한 젖산 생산량(중량/중량) 비율을 의미한다.
본 발명에서 “젖산 생산수율이 증가된”은 야생형 보다 젖산 생산수율이 높은 것을 의미하며, 바람직하게는 93%이상, 보다 바람직하게는 94%이상, 보다 더 바람직하게는 96%이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 97%이상, 가장 바람직하게는 99.5%이상 젖산 수율이 증가된 것을 의미한다.
본 발명의 변이주를 제조하기 위해 이용되는 모균주는 락토바실러스 코리니포미스 균주라면 제한 없이 이용이 가능하나 D형 젖산 생산비율이 높은 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535 균주를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535 균주로부터 변이된 내당성 및 내산성이 향상된 351 주의 변이주 중 야생형과 비교하여 젖산 생산 수율이 향상된 DSLA 119 주를 선별하였다.
상기 락토바실러스 코리니포미스 DSLA 119을 기탁기관 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2011년 07월 19일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC 11986BP를 부여받았다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 내당성, 내산성 및 젖산 생산능이 향상된 락토바실러스 코리니포미스 변이주의 제조 방법을 제공한다:
(a) 락토바실러스 코리니포미스 균주를 포도당 및 젖산이 함유된 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배지에 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 첨가하여 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 제조하는 단계.
본 발명에서 상기 단계 (a)에서의 배지는 락토바실러스 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 포함하나, 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지이며, 가장 바람직하게는 MRS 브로스 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 단계 (b)는 MNNG를 배지에 첨가하여 락토바실러스 코리니포미스 균주를 변이시키는 공정을 포함한다. 구체적으로, 본 발명에서 배지에 첨가하는 MNNG의 농도는 200 ㎍/㎖ 내지 600 ㎍/㎖인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 300 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖이고, 가장 바람직하게는 350 ㎍/㎖ 내지 450 ㎍/㎖이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 MNNG로 변이 처리된 균주 배지로부터 내당성 및 내산성을 가지며 젖산 생산수율이 증가된 균주를 선별하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 모균주에 돌연변이를 일으키기 위하여 공지의 방법을 이용하여(예컨대 락토바실러스 코리니포미스 모균주에 돌연변이 유발원인 MNNG를 처리) 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 제조할 수 있다.
보다 바람직하게는 본 발명 락토바실러스 코리니포미스 변이주는 모균주인 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535 균주에 돌연변이 유발원인 MNNG를 처리하고 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상되고, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L 및 젖산 20 g/L 내지 150 g/L을 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내며, 92% 내지 97%의 젖산 생산수율을 가지는 균주를 선별한 것을 말한다.
본 발명에서 사용한 변이주를 제조하는 물질인 MNNG는 인간세포 및 그 외 동물세포에 대하여 발암을 일으키는 물질일 뿐만 아니라 박테리아에 대하여 DNA를 손상시켜 돌연변이를 일으키는 물질로 알려져 있다(Pleven, C. et al, Glioblastomas and chemical mutagenesis in biology laboratories. Report of 3 deaths in the same institute(Fr.). Arch . Mal . Prof., 44: 411-418(1983); Martin, M.S. et al, Susceptibility of inbred rats to gastric and duodenal carcinomas induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine. J. natl Cancer Inst., 53:837-840(1974);IARC Monographs, Suppl. 6:394-398(1987)).
상기 MNNG의 화학 구조는 하기 화학식 1에 나타내었다.
화학식 1
Figure 112011062421168-pat00001
바람직하게는, 상기 락토바실러스 코리니포미스 변이주는 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상되고, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L 및 젖산 20 g/L 내지 150 g/L을 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내며, 92-99.5%의 젖산 생산수율을 가지고, D형 젖산에 대하여 98-99.9%의 광학적 순도를 나타낸다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 포함하는 젖산 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 젖산 제조 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배지에서 젖산을 회수하는 단계.
상기 탄소원 및 에너지원은 포도당이고 상기 질소원은 효모추출물, 효모농축액, 비프추출물, 옥수수침지가루, 옥수수침지액, 참치추출물, 펩톤, 구연산암모늄, 인산암모늄, 암모니아수로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 혼합물인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 질소원은 제조원가 절감차원에서 옥수수침지가루 또는 옥수수침지액 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 내당성 및 내산성을 향상시킨 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 통해 기질인 당과 생산물인 젖산에 의한 젖산균 생육 저해 현상을 개선하여 친환경적인 생물공학적 방법을 이용하면서도 야생형에 비하여 D 형 젖산을 고수율로 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
(b) 본 발명은 내당성, 내산성 및 젖산 생산능이 향상된 락토바실러스 코리니포미스 변이주의 제조 방법을 제공 할 수 있다.
(b) 본 발명은 값비싼 효모추출물 대신에 옥수수를 처리한 후 발생하는 폐기물인 값싼 옥수수침지가루 및 옥수수침지액을 유기질소원으로 사용하여 원가를 절감할 수 있는 젖산 제조방법을 제공할 수 있다.
도 1은 탄수화물(Carbobydrate)로부터 젖산(Lactic acid)의 생산 과정을 나타낸다.
도 2는 포도당 150 g/L, 효모추출물 15 g/L 및 옥수수침지액 30 g/L가 함유된 배양 배지에서 모균주인 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) KCTC 3535와 이를 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 내당성과 내산성을 향상시킨 락토바실러스 코리니포미스 변이주인 DSLA 119(기탁번호 KCTC 11986BP), DSLA 417, DSLA 501을 5L 발효기에서 배양한 결과로, 배양시간에 따른 균주의 성장, 포도당소비 및 젖산 생산 곡선을 나타내는 그래프이다. KCTC 3535 배양 배지의 세포농도와 젖산은 ◆로, 포도당은 ◇로 제시하였으며, DSLA 119 배양 배지의 세포농도와 젖산은 ■로, 포도당은 □로, DSLA 417 배양 배지의 세포농도와 젖산은●로, 포도당은 ○로, DSLA 501 배양 배지의 세포농도와 젖산은 ▲로, 포도당은 △로 제시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특징 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: 내당성 및 내산성을 향상시킨 변이주의 분리 및 선별
본 발명의 발효공정은 일반적회분식 발효와 동일한 방법으로 수행하였다. 공정의 배지는 아래 표 1과 같다.
구분 성분 농도(%) 환산(g/L) 액량
(㎖, 2 L 기준)
A 포도당 8.0-15.0 80.0-150.0 1300-1400
MgSO4H2O 0.02 0.2
B 옥수수침지액 0.0-6.0 0.0-60.0 300
효모추출물 1.5-2.5 15.0-25.0
소디움아세테이트
(Sodium-acetate)		 0.1 1.0
C MnSO4H2O 0.006 0.06 100
FeSO4H2O 0.003 0.03
D K2HPO4 0.07 0.7 100
KH2PO4 0.05 0.5
E 종배양 5.0-10.0 100-200
표 1과 같은 배지성분 A, B, C 및 D를 각각 다른 용기에 조제하여 121℃에서 20분 동안 가압 살균처리 후 혼합하여 사용하였다.
본 실시예에서는 내당성 및 내산성을 향상시킨 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) 변이주를 얻기 위하여, MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리를 위한 균주 배양액 준비 과정 및 MNNG 처리를 한 균주의 배양 과정에서 포도당 및 젖산이 함유된 배지를 사용함으로써 균주가 내당성과 내산성을 유지하도록 하였다.
MNNG 처리를 위한 균주 배양액을 준비하기 위해서 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 배양 배지 100 ㎖에 글리세롤 냉동보관 균주 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535를 0.3 ㎖ 접종하여 30℃, 200 rpm으로 15시간 동안 배양하였다.
이 배양액 10 ㎖을 취한 후, TM 완충액(50 mM Tris-HCl, 2.5 mM MgCl2 pH 7.0)을 이용하여 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하여 수세하는 과정을 시행하였다. 수세된 균주는 동일한 부피의 TM 완충액으로 현탁하였다. 균주가 포함된 현탁액은 5 ㎖로 나누어 400 ㎍/㎖ 농도의 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, Fluka chemie AG, 스위스)를 첨가한 후, 30℃, 200 rpm에서 15분 동안 처리하였다. 마지막으로 식염수를 이용하여 잔존하는 MNNG를 제거한 후, 포도당 0-300 g/L, 젖산 0-80 g/L가 포함된 MRS 평판배지에 MNNG를 처리한 균주를 일정 수준, 예를 들어, 10-4-10-6로 희석하여 도말하였다. 균주가 도말된 평판배지를 30℃의 인큐베이터(Incubator)에서 인큐베이션 시켰으며, 인큐베이션 시킨 후 2-5일째에 포도당 200 g/L, 젖산 30 g/L가 포함된 MRS 평판배지에서 먼저 자란 콜로니를 중심으로 락토바실러스 파라카제이 KCTC 3535 변이주를 351주 선별하였다.
실시예 2: 플라스크 상에서 변이주의 젖산 생산성 확인 배양
MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 선별한 351주의 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535 변이주를 플라스크 상에서 젖산 생산성 확인 배양을 실시하였다. 본 공정의 배지는 아래 표 2와 같다.
구분 성분 농도(%) 환산(g/L)
A 포도당 5.0 50.0
MgSO4H2O 0.02 0.2
B 효모농축액 2.0 20.0
소디움아세테이트 0.1 1.0
K2HPO4 0.07 0.7
KH2PO4 0.05 0.5
C MnSO4H2O 0.006 0.06
FeSO4H2O 0.003 0.03
D CaCO3 8.0 80.0
NaOH로 배지의 pH를 6.5로 조정함.
표 2 과 같은 배지성분 A, B, C 및 D를 각각 다른 용기에 조제하여 121℃에서 20분 동안 가압 살균처리 후 혼합하여 사용하였다.
본 실시예에서는 MRS 5 ㎖에 선별된 균주 351주를 접종하여 30℃, 200 rpm으로 15시간 동안 배양한 전배양액을 준비하였다. 전배양액 3 ㎖을 표 2의 플라스크배양 배지 27 ㎖가 첨가된 50 ㎖ 플라스크에 접종하여 30℃, 200 rpm으로 50시간 동안 배양함으로써 변이주의 젖산 생산성을 비교하였다.
본 실시예의 내당성과 내산성을 향상시킨 변이주의 플라스크 상에서 생산성 결과는 표 3과 같다.
균주(콜로니 번호) pH OD(610nm) 젖산(g/L)* 당(g/L) Yp/s(g/L)
119 4.57 18.62 4.83 0.06 97.77
324 4.58 19.12 4.78 0.11 97.75
417 4.57 18.11 4.60 0.16 95.04
501 4.50 20.64 4.80 0.03 96.58
KCTC 3535 4.53 21.65 4.40 0.37 95.03
본 실시예의 결과를 통하여, 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535 변이주 40주 중 4주를 선별하였다. OD는 610 ㎚에서의 광학밀도(optical density)를 나타낸다.
실시예 3: 5 L 발효기 상에서 변이주의 젖산 생산성 확인 배양
본 발명의 발효공정은 일반적 회분식 발효와 동일한 방법으로 수행하였다(포도당 140 g/L, 효모추출물 15 g/L, 옥수수침지액 30 g/L). 본 공정의 배지는 표 1 및 표 4와 같다.
성분 농도(%) 환산(g/L)
효모농축액 2.0 20.0
포도당 5.0 50.0
소디움아세테이트 0.3 3.0
MgSO4H2O 0.01 0.1
MnSO4H2O 0.01 0.1
K2HPO4 1.0 10.0
NaOH로 배지의 pH를 6.5로 조정함.
표 4와 같은 배지성분을 조제하여 121℃에서 20분 동안 가압 살균처리 후 사용하였다.
본 실시예에서는 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 처리하여 얻은 내당성 및 내산성을 향상시킨 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535 변이주 351주 중 플라스크 상에서 비교적 우수한 젖산 생산성을 보인 균주 4주를 5 L 발효기 상에서 모균주인 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535와 비교하여 그 우수성을 확인하는 실험을 수행하였다. 특히 값비싼 효모추출물 대신에 옥수수를 처리한 후 발생하는 폐기물인 값싼 옥수수침지분말 또는 옥수수침지액을 유기질소원으로 대체한 배지를 사용하여 젖산 생산성을 비교하였다.
본 실시예에서는 표 4의 전배양배지 100 ㎖에 글리세롤 냉동보관 균주를 접종하여 30℃, 200 rpm으로 15시간 동안 배양하였다. 이 배양액을 화염무균 공정에 의해 가압살균 처리된 5 L 발효기에 첨가한 포도당 140 g/L, 효모추출물 15 g/L, 옥수수침지액 30 g/L이 포함된 표 1의 발효배양 배지 2 L에 접종하여 발효를 진행하였다. 발효 중 온도는 30℃, 교반 속도는 200 rpm, pH는 암모니아수를 사용하여 6.0으로 유지하였다. 배양 중 8시간별로 샘플을 채취하여 균주의 성장, 포도당 소비 및 젖산 생산 정도를 분석하였다. 포도당 140 g/L, 효모추출물 15 g/L 및 옥수수침지액 30 g/L을 함유한 발효배지로부터 젖산 생산성을 비교한 결과는 표 5 및 도 2와 같으며, 락토바실러스 코리니포미스 KCTC 3535에서 유래한 83번째 콜로니인 락토바실러스 코리니포미스 DSLA 119(기탁번호 KCTC 11986BP)를 선별하였다.
내당성과 내산성을 향상시킨 변이주의 발효기 상(포도당 140 g/L, 효모추출물 15 g/L 및 옥수수침지액 30 g/L)에서 생산성 결과인 표 5 및 표 6에서의 수율은 탄소원및 에너지원으로 사용된 포도당의 초기함량에 대비한 최종적으로 생산된 젖산의 함량 비율을 의미한다.
균주
(L. coryniformis)		 젖산 (g/L) 수율
(%)		 생산성
(g/L/h)		 광학적 순도
(D형 젖산, %)
KCTC 3535 126.3 90.2 1.5 96.5
DSLA 119 134.2 95.9 2.0 98.5
DSLA 417 131.5 93.9 1.6 98.2
DSLA 501 126.7 90.5 1.7 98.0
실시예 4: 5 L 발효기 상에서 변이주의 젖산 생산성 확인 배양
본 실시예에서는 포도당 140 g/L, 효모추출물 25 g/L가 포함된 표 1의 발효기배양 배지를 사용하였으며, 그 외 실험방법, 배지, 균주는 ‘실시예 3’과 동일하다. 포도당 140 g/L 및 효모추출물 25 g/L를 함유한 발효배지로부터 젖산 생산성을 비교한 결과는 표 6과 같다.
균주
(L. coryniformis)		 젖산 (g/L) 수율
(%)		 생산성
(g/L/h)		 광학적 순도
(D형 젖산, %)
KCTC 3535 131.7 94.1 2.0 97.9
DSLA 119 136.3 97.4 2.6 99.5
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11986BP 20110719

Claims (6)

  1. 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상되고, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L 및 젖산 20 g/L 내지 150 g/L을 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내며, 92-99.5%의 젖산 생산수율을 가지고, D형 젖산에 대하여 98-99.9%의 광학적 순도를 나타내는 락토바실러스 코리니포미스(Lactobacillus coryniformis) DSLA 119(기탁번호 KCTC 11986BP) 변이주.
  2. 삭제
  3. 다음의 단계를 포함하는 내당성, 내산성 및 젖산 생산능이 향상된 락토바실러스 코리니포미스 변이주의 제조 방법:
    (a) 락토바실러스 코리니포미스 균주를 포도당 및 젖산이 함유된 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배지에 MNNG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 첨가하여 락토바실러스 코리니포미스 변이주를 제조하는 단계.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 락토바실러스 코리니포미스 변이주는 야생형과 비교하여 내당성 및 내산성이 향상되고, 포도당 80 g/L 내지 150 g/L 및 젖산 20 g/L 내지 150 g/L을 포함하는 배지에서 지속된 생육을 나타내며, 92-99.5%의 젖산 생산수율을 가지고, D형 젖산에 대하여 98-99.9%의 광학적 순도를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 상기 제 1 항의 락토바실러스 코리니포미스 DSLA 119(기탁번호 KCTC 11986BP) 변이주를 포함하는 젖산 생산용 조성물.
  6. 다음의 단계를 포함하는 젖산 제조 방법:
    (a) 상기 제 1 항의 락토바실러스 코리니포미스 DSLA 119(기탁번호 KCTC 11986BP) 변이주를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배지에서 젖산을 회수하는 단계.
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