CN104372046A - 一种补料生产l-茶氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种补料生产L-茶氨酸的方法，属于生物技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了恒速补料和变速补料的工艺，可以提高L-茶氨酸在高浓度底物下的转化率，降低生产成本，技术方案为：采用来源于枯草芽胞杆菌来源的γ-GGTase生产L-茶氨酸；按照1:5到1:15的比例配制L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，设定温度30-45℃，调pH 9.0-11.0后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入γ-GGTase，每2小时补加一定量的底物，反应10-20小时，得到较高浓度的L-茶氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及一种补料生产L-茶氨酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
L-茶氨酸(L-The)，又称N-乙基-γ-谷氨酰胺(5-N-ethyl-γ-glutamine)或γ-谷氨酰-L-乙胺(γ-glutamyl-L-ethylamine)，由日本科学家于1949年首次从绿茶中分离得到，是茶叶中特有的游离氨基酸，也是茶叶的主要风味物质。K.Susaoka等首次将该酶从茶的籽根中成功分离，并证明其对L-The、乙胺及ATP具有较高的亲和性，但该酶稳定性差，在体外极易失活。
近年来，据越来越多的研究报道，L-茶氨酸具有镇静减压、提高认知、增强免疫力以及预防肿瘤等重要生理功能，同时作为食品添加剂广泛应用于饮料、糖果、饼干、冰激凌等产品中，起到改善食品风味和提高营养价值等作用。
L-The在医药领域已用于预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等方面；在保健食品中用于镇静放松、抗疲劳、提高学习记忆能力等方面；在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等，也有报道用L-The进行饮用水进化、除臭、抗腐蚀剂及抗酸化剂的例子。L-The在市场的需求日渐广泛，需求量也越来越大，因此开发低成本、大规模制备L-茶氨酸技术的要求日渐迫切。
L-The的制备方法主要有从绿茶中直接提取法、化学合成法和微生物酶法。
直接提取L-The的方法有传统的化学试剂沉淀法和随后发展起来的离子交换层析法。化学试剂沉淀法的主要采用热水浸泡茶叶而形成茶汤或冷乙醇提取获得提取液，加入碱式碳酸铜使L-The与之反应析出形成L-The-铜盐沉淀，使用稀硫酸溶解后通入H2S气体去除Cu2+后加入一定量Ba(OH)2沉淀液体中SO4 2-等杂质，得到较纯的L-The液体，最后对液体通过抽滤、浓缩、结晶、精制等步骤，获得高纯L-The粉末或晶体。离子交换法采用合适的溶液pH使目标氨基酸带上相应的电荷，并通过离子交换柱达到分离提取的目的。直接提取法生产L-The具有原料成本高、提取工序复杂、得率低等缺点，不能满足低成本、大规模制备高纯L-The的市场要求。
化学合成法主要分为三条合成路线：1.吡咯烷酮酸或焦谷氨酸法，利用乙胺和L-吡咯烷酮酸生成L-茶氨酸。N.Lichtenstein等于1942年在实验室中用乙胺和L-吡咯烷酮酸在水溶液中反应，合成L-The，但收率较低；后人尝试用L-吡咯烷酮酸和无水乙胺在低温下反应或营造惰性环境等，提高了L-The的收率；2.N-取代谷氨酸酯和乙胺水解反应产生N-取代茶氨酸；3.N-取代谷氨酸酐法，首先利用保护基保护L-谷氨酸中的α-氨基，然后进行分子内脱水形成环状谷氨酸酐，再与乙胺作用生产N-取代茶氨酸，最后去除保护基团得到L-The。化学合成法存在反应时间长、收率低等缺点，同时由于需要采用高压、惰性气体保护和保护基团等方式，增加生产成本。
微生物酶法合成L-The具有操作简单，构型专一，放大生产容易等优点，是降低生产成本，提高生产强度的有效途径，现已逐渐代替直接提取法和化学合成法，成为L-The大规模生产的主流方法。然而，现有的研究存在γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)的酶种开发较少，野生酶酶活较低，对L-The生产应用的效果有待提高，在高底物浓度下反应的研究较少等缺点，这些不足限制了其工业化应用进程。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产L-The的工艺，降低了L-The的生产成本。
为解决上述问题，本发明技术方案为：
采用来源于Bacillus subtilis的γ-GGT重组酶生产L-The：L-谷氨酰胺(L-Gln)和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH 9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入来源于枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)，中国典型微生物保藏中心，CCTCC AB 130001)GGTase，充分反应10-20小时，采用恒速和变速补料工艺提高L-The产量。
所述恒速补料方法为：L-Gln和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH 9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入GGTase，每2h补加一定量的底物，反应10-20小时生产L-The。
所述变速补料方法为：L-Gln和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH 9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入GGTase，每2h测定底物消耗量并补加底物至初始浓度，反应10-20小时生产L-The。
所述微生物发酵生产GGTase的方法为，在一定培养条件下，微生物发酵一定时间(Xingyi Chen,Lingqia Su,DanWu,Jing Wu.Application ofrecombinantBacillus subtilisγ-glutamyltranspeptidase to the production ofL-theanine[J].ProcessBiochemistry,2014,49:1429–1439)，得到含有GGTase的发酵液，发酵液经过粗过滤、精过滤、浓缩、干燥等全部工艺或部分工艺后得到GGTase粉沫或者粗酶液。
所述GGTase的最适反应温度为30℃-40℃，温度通过影响酶对底物的催化效率，从而影响酶的活力，温度过高或过低都会影响酶的作用效果。从降低生产成本考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适温度附近，这样大大降低加入的酶量，从而降低生产成本。
所述GGTase的最适pH范围为9.0-11.0，pH对GGTase活力的影响较大，从降低成本的角度考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适反应pH附近。
L-The的分析采用高效液相色谱。色谱条件：Waters 600HPLC色谱仪，Waters自动进样器，检测系统：Agilent 1200，色谱柱：Eclipse XDB-C185μm(4.6mm×150mm)；流动相A相为无水醋酸钠4.52g，加入1L去离子水，再加入225μL三乙胺，醋酸调节pH到7.2±0.05，后加入5mL四氢呋喃。B相为无水醋酸钠4.52g加去离子水定容为200mL，醋酸调节pH到7.2±0.05，再加400mL甲醇和400mL乙腈。流速0.8mL/min，柱温40℃。处理样品用10％(w/v)的三氯乙酸等体积稀释，室温放置1-2h，12000r·min-1离心10min,再用0.22μm水相针式滤器过滤后上机分析。
所述L-Gln与乙胺盐酸盐的配比可以为1:5到1:15之间。在L-Gln与乙胺盐酸盐合成L-The的反应中，L-Gln分子与乙胺分子的反应比例为1:1，而由于GGT受体活性位点的特异性较低，除乙胺外，水分子，L-Gln等均能结合在受体的活性中心，与乙胺形成竞争关系，而降低目标产物L-The的产量。因此，在实践过程中，往往需要使乙胺过量于L-Gln，来提高L-The产量。
本发明的技术原理如下：
采用GGTase转化法生产L-The时，底物浓度过高会导致L-The转化率下降，其原因主要是因为高浓度的底物L-Gln对GGTase具有抑制作用，因此考虑使用较低的初始底物浓度，通过补料策略将底物浓度维持在较低的条件下，反应速率快，提高了L-The的转化率。
本发明是根据GGTase以及产物L-The的特点生产L-The的工艺，相对于现有技术，具有以下优点：
1)提供一种高转化率、低成本的L-The的生产方法，填补了该技术领域内的空白，为L-The大规模的生物法生产奠定了基础；
2)酶反应的温度比较低，不需要进行大量的升温降温控制，低能耗，特别适合工业化生产；
3)采用恒速补料的工艺，定时补加底物，提高L-The的转化率，达到65％左右；
4)采用变速补料的工艺，定时补加消耗的底物量，提高L-The的转化率，达到75％左右；
5)本反应总的反应周期短，只需要10-20小时，适合工业化生产；
总体来讲，本发明具有生产成本低、原料转化率高、产品浓度高、工艺流程简单、生产周期短等诸多优点。
实施例1
底物配制：
L-Gln浓度为200mmol/L，按照1:10的比例加入乙胺盐酸盐，用缓冲液调pH到10.0。
酶法生产工艺：
底物溶液配制好后将温度调至37℃，按照每毫升反应液加入6单位的γ-GGTase，然后每反应2小时补加200mmol L-Gln，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应14小时；
所述L-The的分析采用高效液相色谱。色谱条件：Waters 600HPLC色谱仪，Waters自动进样器，检测系统：Agilent 1200，色谱柱：Eclipse XDB-C185μm(4.6mm×150mm)；流动相A相为无水醋酸钠4.52g，加入1L去离子水，再加入225μL三乙胺，醋酸调节pH到7.2±0.05，后加入5mL四氢呋喃。B相为无水醋酸钠4.52g加去离子水定容为200mL，醋酸调节pH到7.2±0.05，再加400mL甲醇和400mL乙腈。流速0.8mL/min，柱温40℃。处理样品用10％(w/v)的三氯乙酸等体积稀释，室温放置1-2h，12000r·min-1离心10min,再用0.22μm水相针式滤器过滤后上机分析。底物L-Gln总浓度为1000mmol/L，L-The总转化率可达56.2％。
实施例2
底物配制：
同实施例1
酶法生产工艺：
底物溶液配制好后将温度调至37℃，按照每毫升反应液加入6单位的γ-GGTase，然后每反应2小时补加150mmol L-Gln，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应14小时；
L-茶氨酸检测方法：
同实施例1
底物L-Gln总浓度为950mmol/L，L-The总转化率可达63.7％。
实施例3
底物配制：
同实施例1
酶法生产工艺：
底物溶液配制好后将温度调至37℃，按照每毫升反应液加入6单位的γ-GGTase，然后每反应2小时补加100mmol L-Gln，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应16小时；
L-茶氨酸检测方法：
同实施例1
底物L-Gln总浓度为900mmol/L，L-The总转化率可达67.8％。
实施例4
底物配制：
同实施例1
酶法生产工艺：
底物溶液配制好后将温度调至37℃，按照每毫升反应液加入6单位的γ-GGTase，然后每反应2小时测定L-Gln消耗量，并补加L-Gln至初始浓度，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应16小时；
L-The检测方法：
同实施例1
底物L-Gln总浓度为600mmol/L，L-The总转化率可达74.3％。
Claims (1)
1.一种补料生产L-茶氨酸的方法，属于生物技术技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了恒速补料和变速补料的工艺，降低了L-茶氨酸的生产成本，提高了转化率。技术方案为：采用来源于枯草芽胞杆菌来源的γ-GGTase生产L-茶氨酸；按照1:5到1:15的比例配制L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，设定温度30-45℃，调pH 9.0-11.0后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入γ-GGTase，每2小时补加底物100-200mmol，反应10-20小时，最终底物浓度为600-1000mmol/L，得到L-茶氨酸转化率达到60-80％。
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