CN106866451A - 一种l‑茶氨酸硒螯合物及制备方法和含该螯合物的含片及制备方法 - Google Patents

一种l‑茶氨酸硒螯合物及制备方法和含该螯合物的含片及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种L‑茶氨酸硒螯合物及制备方法和含该螯合物的含片及制备方法,生产成本较低,不受资源限制,环境污染小,可大量生产且产品比较安全。L‑茶氨酸硒螯合物的制备方法,以L‑茶氨酸和硒盐为原料,以pH值为7‑10的缓冲液为反应介质构成反应体系,在70‑90℃下混合,反应完全后将反应液分离纯化,获得L‑茶氨酸硒螯合物;L‑茶氨酸与硒盐溶液质量比为(3‑1):1;L‑茶氨酸由枯草芽孢杆菌发酵所产的γ‑谷氨酰转肽酶,以L‑谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物发酵制备得到。采用微生物酶法制备L‑茶氨酸,在此基础上,采用水体系合成法螯合硒离子和L‑茶氨酸,生产成本低,环境安全性高,资源消耗少,能够进行大量安全生产。

Description

一种L-茶氨酸硒螯合物及制备方法和含该螯合物的含片及制 备方法
技术领域
本发明涉及螯合物及其含片的制备方法,具体为一种L-茶氨酸硒螯合物及制备方法和含该螯合物的含片及制备方法。
背景技术
硒是生物体内必需的营养元素之一。人体缺硒会造成重要器官的功能失调,导致许多严重疾病的发生。硒可以清除体内自由基,抗衰老;加入损伤心肌的修复,预防和治疗肝、肾、哮喘、妊娠高血压等病;对铅、镉、汞、砷、铊等重金属有拮抗作用,可减轻上述化学物质对人体的危害;有“抗癌之王”的美称,能明显抑制肿瘤扩展;维护白血球活性,是一种免疫效用增强剂。因此,坚持适量补硒,是增强人体健康、防备疾病、延年益寿的有效办法。目前市场上补硒保健品主要分为无机硒(亚硒酸钠)、有机硒(硒酵母)、纳米硒。上海四通纳米技术港有限公司出产的“硒旺胶囊”是目前市场上唯一通过国家认定,获卫生部批准的“纳米硒”产品,比传统无机硒(亚硒酸钠)、有机硒(硒酵母)的生物活性高5-7倍,同时又它具有无机硒、有机硒没有的低毒性,但生产成本高,难以在市场上推广。硒酵母在体内转化率非常低,不能满足补硒人群的硒需求而且气味比较大。
茶氨酸(L-Theanine)是茶叶中含量最高的游离氨基酸,约占游离氨基酸总量的50%以上,占茶叶干重的1%-2%。茶氨酸为白色针状体,易溶于水。具有甜味和鲜爽味,是茶叶的滋味的组分。茶氨酸含量约为新茶的1~2%左右,其含量随发酵过程减少。茶氨酸本身还具有许多生理功能:(1)能影响脑内神经传达物质的变化,增强记忆力;(2)有镇静作用,可预防神经失调症、失眠症、经期综合症等;(3)能保护神经细胞,可用于对脑栓塞、脑出血、脑中风、脑缺血以及老年痴呆等疾病的防治;(4)有降血压作用;(5)能增强抗癌药物的疗效;(6)能抑制癌细胞的漫润;(7)能提高免疫力。1964年,日本批准了L-茶氨酸为食品添加剂使用,而美国FDA也在1985年给予了L-茶氨酸GRAS的分类,意味着可以自由地用于各种食品中。茶氨酸在中国研究进展比较慢,直到2014年7月18日,卫计委终于批准了它作为新食品原料。
早在六七十年代就已经发现氨基酸和小肽具有促进钙、铁、锌等金属离子吸收的作用,而且氨基酸和肽的金属复合体的生物学利用率比无机盐高,且无毒副作用。因此,开发兼具茶氨酸多种生理功能和微量元素高生物学利用率的的多肽螯合硒保健品具有重要意义。无论是单一氨基酸还是用蛋白质水解得到的复合氨基酸,当其与金属离子螯合时,螯合工艺大致相同,主要有:水体系合成法、微波固相法、室温固相法及电解合成法。水体系合成法工艺周期长,螯合反应温度和pH较难控制,易被废液污染,但产率较高。此工艺是氨基酸螯合微肥生产较为理想的选择。微波固相法合成操作简便省时,制得产品纯度较高,但易产生副产物且在微波下易焦糊,很难大规模生产。室温固相法主要用于纳米材料的合成,对螯合原料纯度要求较高。电解合成法昂贵又费时。目前国内外研究较多的是谷氨酸硒、蛋氨酸硒等,而对于L-茶氨酸与硒离子的螯合物几乎没有相关报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明提供一种L-茶氨酸硒螯合物及制备方法和含该螯合物的含片及制备方法,生产成本较低,不受资源限制,环境污染小,可大量生产且产品比较安全。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种L-茶氨酸硒螯合物的制备方法,以L-茶氨酸和硒盐为原料,以pH值为7-10的缓冲液为反应介质构成反应体系,在70-90℃下混合,反应完全后将反应液分离纯化,获得L-茶氨酸硒螯合物;所述L-茶氨酸与硒盐溶液质量比为(3-1):1;所述的L-茶氨酸由枯草芽孢杆菌发酵所产的γ-谷氨酰转肽酶,以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物发酵制备得到。
优选的,所述L-茶氨酸硒螯合物具体制备步骤如下:
步骤1,合成L-茶氨酸原料液;
步骤2,将L-茶氨酸原料液脱色过滤后,滤液备用;
步骤3,在滤液中加入滤液质量浓度为35%的硒盐水溶液;用氢氧化钠调节至pH值为7-10,氮气吹扫,于70-90℃下进行2h螯合反应;
步骤4,螯合反应结束后,自然冷却至室温,进行纯化;将所得螯合液浓缩至原体积1/3-1/6,加入5-8倍体积浓度95%乙醇水溶液,沉淀静置8-15h,除去上清液,将沉淀用95%的乙醇洗涤抽滤多次,取滤饼干燥后得到L-茶氨酸硒螯合物。
进一步,所述的步骤1的具体步骤如下,
1.1将枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上,在37℃下静置培养16h进行一次活化后,再转接到液体培养基上进行二次活化;将经两次活化好的枯草芽孢杆菌二级种子液按体积分数3%接种量转接于30mL发酵培养液中,置于恒温培养箱中37℃振荡培养12-16h;
1.2收集振荡培养的发酵液离心后得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液;采用分光光度计测定酶活,选取酶活0.01U/mL-0.2U/mL的粗酶液备用,进行催化反应;
1.3分别加入粗酶液质量10%的L-谷氨酰胺和粗酶液质量10%的乙胺盐酸盐溶液进行催化反应,L-谷氨酰胺的浓度为15-50mmol/L,乙胺盐酸盐的浓度为20-80mmol/L;用乙胺水调节催化反应体系至pH值为10,37℃静置培养5-8h,合成L-茶氨酸,得到L-茶氨酸原料液。
再进一步,步骤2中,加入L-茶氨酸原料液重量2%的活性炭进行吸附脱色,反应过程温度为60-80℃,反应时间为3-8min。
优选的,所述硒盐为亚硒酸钠。
一种由本发明所述的方法制备得到的L-茶氨酸硒螯合物。
一种含L-茶氨酸硒螯合物的含片制备方法,按质量份数计,取粉末状的L-茶氨酸硒螯合物20-35%,β-环糊精5-20%,葡萄糖5-20%,蔗糖2-10%,柠檬酸1-3%,麦芽糊精5-20%,混合后按质量比例加入1%的硬脂酸镁,压片装袋,即得含L-茶氨酸硒螯合物的含片。
一种由本发明所述的方法制备得到含L-茶氨酸硒螯合物的含片。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明采用微生物酶法制备L-茶氨酸,在此基础上,采用水体系合成法螯合硒离子和L-茶氨酸,生产成本低,环境安全性高,资源消耗少,能够进行大量安全生产。L-茶氨酸被评为“最值得开发的食品新材料”,其特有的生理功能与硒离子补血功能相结合,不但能提高彼此的生物利用率,还能获得清香茶风味,在食品行业具有广泛应用前景。将L-茶氨酸硒螯合物制成含片,既有显著的茶叶特色又能作为提供营养的休闲食品。本发明制备的L-茶氨酸硒螯合物结合牢固,如图1所示,在胃中不会析出硒离子,不会造成胃肠刺激。
本发明所述的含L-茶氨酸硒螯合物的含片既有茶氨酸所含的茶香味和鲜爽味,且含硒量高,吸收快,毒副作用低。L-茶氨酸与硒离子螯合物可以通过改善机体免疫系统来提高免疫功能,增强对疾病的抵抗能力。
进一步的,本发明通过乙醇纯化析出结晶,得到产品纯度较好,含量可到90%以上,回收率为90%-93%,晶体质地均匀,色泽纯净,质量上佳。
附图说明
图1为本发明实例中所述L-茶氨酸和L-茶氨酸硒螯合物由紫外扫描仪U-1800得到的吸收光谱曲线。
图中:a为L-茶氨酸的吸收光谱曲线,b为L-茶氨酸硒螯合物的吸收光谱曲线。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
一种含L-茶氨酸硒螯合物的含片制备方法,包括如下步骤:
第一:取4℃下斜面保存的枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上,37℃静置培养16h,再转接到3mL液体培养基上进行活化。将活化2次的枯草芽孢杆菌二级种子液按3%体积分数接种量转接于30mL发酵培养液中,置于恒温培养箱中37℃振荡培养,隔夜培养12h。
第二:收集发酵液于8000rpm离心25min,得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。采用分光光度计测定酶活。选取酶活0.01U/mL的粗酶液20mL备用进行催化反应。
第三:分别加入粗酶液重量10%的L-谷氨酰胺(浓度15mmol/L)和乙胺盐酸盐(浓度20mmol/L)溶液进行催化反应,用乙胺水调节反应体系至pH10,37℃静置培养5h,合成L-茶氨酸,得到L-茶氨酸原料液。
第四:将原料液过滤,除去杂质。加入原料液重量2%的活性炭搅拌,进行吸附脱色,反应过程温度为60℃,反应时间为3min。脱色后再次过滤,滤液备用。
第五:加入质量浓度为35%的硒盐溶液,加入量为茶氨酸溶液质量的1/3,用氢氧化钠调节至pH7,氮气吹扫,于70℃下反应2h进行螯合反应。采用双硫腙显色法初步判断螯合物质量及稳定性。所述硒盐为亚硒酸钠。
第六:螯合反应结束后,自然冷却。将反应液在4000rpm下离心20min,将所得螯合液浓缩至原体积1/3,加入5倍体积浓度95%乙醇水溶液,沉淀静置8h,去除上清液,用等体积95%乙醇水溶液洗涤2-3次,真空冷冻干燥。即获得L-茶氨酸硒螯合物。真空冷冻干燥温度为5℃-40℃,本具体实施例优选5℃。
第七:依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末20%,β-环糊精5%,葡萄糖5%,蔗糖2%,柠檬酸1%,麦芽糊精5%,混合后按质量比例加入1%的硬脂酸镁,压片装袋,即得L-茶氨酸硒含片。
实施例2
一种含L-茶氨酸硒螯合物的含片制备方法,包括如下步骤:
第一:取4℃下斜面保存的枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上,37℃静置培养16h,再转接到3mL液体培养基上进行活化。将活化2次的枯草芽孢杆菌二级种子液按3%体积分数接种量转接于30mL发酵培养液中,置于恒温培养箱中37℃振荡培养,隔夜培养14h。
第二:收集发酵液于8000rpm离心25min,得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。采用分光光度计测定酶活。选取酶活0.15U/mL的粗酶液20mL备用进行催化反应。
第三:分别加入粗酶液重量10%的L-谷氨酰胺(浓度20mmol/L)和乙胺盐酸盐(浓度40mmol/L)溶液进行催化反应,用乙胺水调节反应体系至pH10,37℃静置培养7h,合成L-茶氨酸,得到L-茶氨酸原料液。
第四:将原料液过滤,除去杂质。加入原料液重量2%的活性炭搅拌,进行吸附脱色,反应过程温度为70℃,反应时间为6min。脱色后再次过滤,滤液备用。
第五:加入质量浓度为35%的硒盐溶液,加入量为茶氨酸溶液质量的2/3,用氢氧化钠调节至pH8,氮气吹扫,于80℃下反应2h进行螯合反应。采用双硫腙显色法初步判断螯合物质量及稳定性。所述硒盐为亚硒酸钠。
第六:螯合反应结束后,自然冷却。将反应液在4000rpm下离心40min,将所得螯合液浓缩至原体积1/5,加入6倍体积浓度95%乙醇水溶液,沉淀静置12h,去除上清液,用等体积95%乙醇水溶液洗涤2-3次,20℃下真空冷冻干燥。即获得L-茶氨酸硒螯合物。
第七:依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末28%,β-环糊精15%,葡萄糖15%,蔗糖7%,柠檬酸2%,麦芽糊精15%,混合后按质量比例加入1%的硬脂酸镁,压片装袋,即得L-茶氨酸硒含片。
实施例3
一种富含L-茶氨酸硒螯合物的含片制备方法,包括如下步骤:
第一:取4℃下斜面保存的枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上,37℃静置培养16h,再转接到3mL液体培养基上进行活化。将活化2次的枯草芽孢杆菌二级种子液按3%体积分数接种量转接于30mL发酵培养液中,置于恒温培养箱中37℃振荡培养,隔夜培养16h。
第二:收集发酵液于8000rpm离心25min,得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。采用分光光度计测定酶活。选取酶活0.2U/mL的粗酶液20mL备用进行催化反应。
第三:分别加入粗酶液重量10%的L-谷氨酰胺(浓度50mmol/L)和乙胺盐酸盐(浓度80mmol/L)溶液进行催化反应,用乙胺水调节反应体系至pH10,37℃静置培养8h,合成L-茶氨酸,得到L-茶氨酸原料液。
第四:将原料液过滤,除去杂质。加入原料液重量2%的活性炭搅拌,进行吸附脱色,反应过程温度为80℃,反应时间为8min。脱色后再次过滤,滤液备用。
第五:加入质量浓度为35%的硒盐溶液,加入量为茶氨酸溶液质量的100%,用氢氧化钠调节至pH10,氮气吹扫,于90℃下反应2h进行螯合反应。采用双硫腙显色法初步判断螯合物质量及稳定性。所述硒盐为亚硒酸钠。
第六:螯合反应结束后,自然冷却。将反应液在4000rpm下离心60min,将所得螯合液浓缩至原体积1/6,加入8倍体积浓度95%乙醇水溶液,沉淀静置15h,去除上清液,用等体积95%乙醇水溶液洗涤2-3次,40℃下真空冷冻干燥。即获得L-茶氨酸硒螯合物。
第七:依次加入L-茶氨酸硒螯合物粉末35%,β-环糊精20%,葡萄糖20%,蔗糖10%,柠檬酸3%,麦芽糊精20%,混合后按质量比例加入1%的硬脂酸镁,压片装袋,即得L-茶氨酸硒含片。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只作为阐明本发明各方面的单个例子,本发明范围还包括功能等同的方法和组分。本领域技术人员在没有脱离权利要求限定范围的前提下,仍然可以对本发明做出各种改进和变换,所做的改进和变换仍然属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种L-茶氨酸硒螯合物的制备方法,其特征在于,以L-茶氨酸和硒盐为原料,以pH值为7-10的缓冲液为反应介质构成反应体系,在70-90℃下混合,反应完全后将反应液分离纯化,获得L-茶氨酸硒螯合物;
所述L-茶氨酸与硒盐溶液质量比为(3-1):1;所述的L-茶氨酸由枯草芽孢杆菌发酵所产的γ-谷氨酰转肽酶,以L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐为底物发酵制备得到。
2.根据权利要求1所述的一种L-茶氨酸硒螯合物的制备方法,其特征在于,所述L-茶氨酸硒螯合物具体制备步骤如下:
步骤1,合成L-茶氨酸原料液;
步骤2,将L-茶氨酸原料液脱色过滤后,滤液备用;
步骤3,在滤液中加入滤液质量浓度为35%的硒盐水溶液;用氢氧化钠调节至pH值为7-10,氮气吹扫,于70-90℃下进行2h螯合反应;
步骤4,螯合反应结束后,自然冷却至室温,进行纯化;将所得螯合液浓缩至原体积1/3-1/6,加入5-8倍体积浓度95%乙醇水溶液,沉淀静置8-15h,除去上清液,将沉淀用95%的乙醇洗涤抽滤多次,取滤饼干燥后得到L-茶氨酸硒螯合物。
3.根据权利要求2所述的一种L-茶氨酸硒螯合物的制备方法,其特征在于,所述的步骤1的具体步骤如下,
1.1将枯草芽孢杆菌接种在平板培养基上,在37℃下静置培养16h进行一次活化后,再转接到液体培养基上进行二次活化;将经两次活化好的枯草芽孢杆菌二级种子液按体积分数3%接种量转接于30mL发酵培养液中,置于恒温培养箱中37℃振荡培养12-16h;
1.2收集振荡培养的发酵液离心后得γ-谷氨酰转肽酶粗酶液;采用分光光度计测定酶活,选取酶活0.01U/mL-0.2U/mL的粗酶液备用,进行催化反应;
1.3分别加入粗酶液质量10%的L-谷氨酰胺和粗酶液质量10%的乙胺盐酸盐溶液进行催化反应,L-谷氨酰胺的浓度为15-50mmol/L,乙胺盐酸盐的浓度为20-80mmol/L;用乙胺水调节催化反应体系至pH值为10,37℃静置培养5-8h,合成L-茶氨酸,得到L-茶氨酸原料液。
4.根据权利要求3所述的一种L-茶氨酸硒螯合物的制备方法,其特征在于,步骤2中,加入L-茶氨酸原料液重量2%的活性炭进行吸附脱色,反应过程温度为60-80℃,反应时间为3-8min。
5.根据权利要求1所述的一种L-茶氨酸硒螯合物的制备方法,其特征在于,所述硒盐为亚硒酸钠。
6.一种由权利要求1-5任意一项所述的方法制备得到的L-茶氨酸硒螯合物。
7.一种含L-茶氨酸硒螯合物的含片制备方法,其特征在于,按质量份数计,取粉末状的L-茶氨酸硒螯合物20-35%,β-环糊精5-20%,葡萄糖5-20%,蔗糖2-10%,柠檬酸1-3%,麦芽糊精5-20%,混合后按质量比例加入1%的硬脂酸镁,压片装袋,即得含L-茶氨酸硒螯合物的含片。
8.一种由权利要求7所述的方法制备得到含L-茶氨酸硒螯合物的含片。
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