CN102051386A - 间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，是将新鲜培养基经过滤除菌后送入发酵罐，并向发酵罐接入高密度种子液，控制好所用菌种的有机酸发酵生产条件，当发酵进行至发酵液中残糖量较少时，排出部分或全部发酵液至过滤装置处理，同时补充新鲜的无菌培养基到发酵罐，截留的菌体细胞浓缩液送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的清液用于提取有机酸；仅当有机酸生产率明显下降时，过滤装置截留的菌体细胞浓缩液才不再送回发酵罐，重新向发酵罐补充新的高密度种子液和新鲜的无菌发酵培养基，进行新一轮有机酸的间歇式回流细胞高生产率发酵生产。本发明方法有机酸发酵生产过程中始终保持高生物量和高生产率，具有很好的工业应用价值。
Description
技术领域：
本发明属于生物过程工程领域，具体涉及间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法。
背景技术：
有机酸是指一些具有酸性的有机化合物，最常见的有机酸是羧酸，是有机合成、工农业生产和医药的工业原料。目前，有机酸中的乳酸和各种氨基酸的应用越来越广泛，如乳酸是一种用途很广的有机酸，可用于酿造、医药、皮革、卷烟、化工、食品、印染等各方面，市场需求量很大，特别是作为新型可生物降解高分子新材料——聚乳酸(PLA)的主要生产原料，具有较大的潜在市场需求。氨基酸在医药、食品、化工以及有关生物研究领域中用途广泛，市场需求量不断增加。目前，利用玉米、大米和小麦等淀粉质的农产品原料，以及木薯、黄姜等非粮原料，发酵生产有机酸是经济有效的方法。用于有机酸发酵生产的微生物有细菌、放线菌和真菌，其中细菌种类多、转化率高、发酵周期短，在工业生产上应用较多。目前有机酸的发酵生产主要采取单批发酵方式，发酵周期较长，生产率较低，导致有机酸能耗较大，生产成本较高。细胞再利用技术在植物细胞培养生产生物药物和利用真菌细胞发酵生产乳酸上已有报道。如崔亨均等通过重复利用细胞的方法大幅度提高紫杉醇的产量(通过分批或半连续培养大量生产紫杉醇的方法，申请号01144877.6)，姜绍通等反复利用米根霉菌球体实现多批次生产L-乳酸，大幅度缩短了发酵时间(米根霉菌球体单罐半连续高强度发酵高光学纯度L-乳酸新工艺方法，申请号200710131513.6)。但以上专利对发酵过程细胞再次利用的控制方法阐述不多，并且目前尚未发现高效利用细菌和基因工程酵母细胞高生产率发酵生产有机酸的报道。
发明内容：
为解决有机酸发酵生产发酵周期长、生产率不高的突出问题，本发明通过间歇式回流细胞和即时补充新鲜培养基的方法，使发酵过程保持高生物量，达到高生产率生产有机酸的目的。实现本发明的技术方案是：
间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、灭菌：对用于有机酸发酵生产的种子罐、发酵罐、缓冲储罐、过滤装置及其连接管道进行蒸汽或杀菌剂灭菌；
步骤二、制备无菌的种子培养基：用经过灭菌的过滤装置对种子培养基进行过滤，得到无菌的种子培养基清液，将该种子培养基清液送入种子罐；
步骤三、制备高密度的种子液：根据所要生产的有机酸选择用于有机酸发酵生产的菌种，将所选的菌种接入已装有种子培养基清液的种子罐中，当菌种培养8～60h进入其生长曲线的对数生长期时，将得到的种子培养液用无菌的过滤装置过滤浓缩，使过滤装置截留的种子浓缩液中生物量的干重达到2～30g/L，此种子浓缩液即为高密度种子液；
步骤四、制备无菌的发酵培养基：将用于有机酸发酵生产的发酵培养基通过无菌的过滤装置过滤后，得到无菌的发酵培养基清液，将该发酵培养基清液的一部分送入发酵罐，另一部分存放于无菌的缓冲储罐中备用；
步骤五、间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：将步骤三所制备的高密度种子液接种到发酵罐内，在有利于所选菌种合成有机酸的发酵条件下进行培养，采用加入碱性中和剂控制pH的方法来解除发酵产酸导致的有机酸反馈抑制，发酵过程中监测发酵罐中发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度降至1.1～10g/L时，同时进行以下(1)和(2)的操作：
(1)将发酵液从发酵罐内排出，在发酵液排出的过程中监测发酵罐中发酵液体积的变化，当发酵罐中的发酵液排出了其总体积的30～100％时停止排放，随即向发酵罐中补充新鲜的无菌的发酵培养基清液，补充的新鲜发酵培养基体积不大于排出的发酵液体积，于是，发酵罐中的糖浓度大于发酵液刚从发酵罐内排出时的浓度；
(2)将排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，将被过滤装置截留的菌体细胞浓缩液再送回到发酵罐作为生产菌继续使用；
当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率没有出现下降时，再次同时进行以上(1)和(2)的操作；
当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且不超过10％时，随即向发酵罐内补充用前述步骤三所述方法制备的高密度种子液，并再次同时进行以上(1)和(2)的操作；
当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且超过10％时，将发酵罐中的发酵液全部排出，排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回到发酵罐，而是废弃不用，至此即完成一轮完整的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程；
步骤六、新一轮间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：监测整个生产系统是否出现染菌，当出现染菌时重复上述步骤一至五，继续新一轮的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程；当没有出现染菌时，重复上述步骤二至五，继续新一轮的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程。
本发明方法中用于种子培养基和发酵培养基过滤的过滤装置是微滤装置，其膜孔径不超过0.22μm。
本发明方法中用于发酵液过滤的过滤装置可以是微滤装置，其膜孔径不超过0.22μm；本发明方法中用于发酵液过滤的过滤装置也可以是超滤装置，其膜截留分子量为1000道尔顿。
本发明方法中的种子培养基为有机酸发酵生产上常用的种子活化液体培养基，其碳源浓度相当于葡萄糖浓度为10-50g/l；本发明方法中的发酵培养基为有机酸发酵生产上常用的液体培养基。
本发明方法中用于有机酸发酵生产的菌种是能产有机酸的细菌。本发明方法中用于有机酸发酵生产的能产有机酸的菌种是德氏乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌、黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌等。
本发明方法中所用的碱性中和剂为氨气、20％(w/w)以上的氨水、5mol/l以上的氢氧化钠溶液、5mol/l以上的氢氧化钾溶液、5mol/l以上的碳酸钠溶液或5mol/l以上的碳酸氢钠溶液。
与现有技术相比，本发明方法具有明显优势：接种高密度种子液，可以使培养基中的生物量较大，使细胞快速繁殖和高速率产酸，并且将高活性菌体细胞回流至发酵罐继续作为生产菌使用，可以实现间歇式连续生产，能有效节约洗罐和灭菌时间，省去了传统单批发酵方式必需经过的延迟期，使细胞生长保持在指数期，从而可以将有机酸生产率提高60％以上，具有较好工业生产应用价值。
附图说明
图1为间歇式回流细胞法和单批法发酵生产乳酸发酵液中乳酸浓度随时间变化的规律。
具体实施方式
实施例所用的测量方法如下：
(1)乳酸的定量测定方法：采用高效液相色谱法，单位为g/L(HPLC)(H.Oh，Y.J.Wee，J.S.Yun，S.H.Han，S.W.Jung，H.W.Ryu，2005.Lactic acid production from agricultural resources as cheap raw materials.Bioresour.Technol.96，1492-1498.)。
①仪器：安捷伦1200色谱仪(Agilent Co.，America)，离子交换柱Aminex HPX-87H(300x 7.8mm，Bio-Rad，Hercules，Calif.)。
②流动相：0.01mol/L H2SO4，流速0.5mL/min。
③柱温和波长：测量波长210nm，测量柱温35℃。
(2)精氨酸的定量测定：氨基酸自动分析仪法，单位为g/L。
(3)色氨酸的定量测定：荧光分光光度法，单位为g/L。
(4)还原糖的定量测定方法：采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)，单位为g/L(Miller，G.L.，1959.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.Anal.Chem.31，426-429.)。
(5)各种技术指标的计算方法：有机酸的生产率(g/Lh)指有机酸的浓度(g/L)与生产时间(h)的比值；糖转化率(％)指假设糖理论转化率为100％时，实际生产的目标有机酸的浓度(g/L)与培养基中所用糖浓度(g/L)的比值。
实施例1
乳酸的发酵生产
设备：100L种子罐一套、100L发酵罐一套，处理能力100L/h的种子培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)、处理能力100L/h的发酵培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)，处理能力100L/h的发酵液微滤装置一套(膜孔径0.22μm)、100L的培养基缓冲储罐一套、发酵液缓冲储罐一套，泵五台。
菌种：德氏乳酸杆菌(L.delbrueckii HG 07)。
种子培养基(g/L)：玉米糖化液调整还原糖浓度到50，加麸皮水解过滤液10、酵母粉3、牛肉膏3，混匀，用10mol/L的NaOH溶液调pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：玉米糖化液调整还原糖浓度到100，加麸皮水解过滤液20、酵母粉5、牛肉膏5，混匀，用10mol/L的NaOH调pH 7.0。
种子液的制备：将德氏乳酸杆菌(L.delbrueckii HG 07)接种于装有无菌种子培养基的种子罐，流加10mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，37℃恒温培养8h，培养基即为种子液。
高密度种子液的制备：将德氏乳酸杆菌(L.delbrueckii HG 07)接种于装有无菌发酵培养基的种子罐，流加10mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，37℃恒温培养8h，培养基用微滤装置处理，截留的菌体浓缩液(干重约12g/L)1L，即为高密度种子液。
单批法发酵生产乳酸：先对微滤、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入种子液1L，控制适合于德氏乳酸杆菌(L.delbrueckii HG07)培养条件(流加10mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，45℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为1.1g/L时，直接排放出发酵液，用于提取乳酸。
间歇式回流细胞法发酵生产乳酸：先对微滤、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入高密度种子液，控制适合于德氏乳酸杆菌(L.delbrueckii HG 07)培养条件(流加10mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，45℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为1.1g/L时，直接排放出发酵液，当发酵罐中发酵液排放完时停止排放，随即向发酵罐内补充新鲜的无菌培养基清液，排出的发酵液进行微滤处理，截留细胞浓缩液20L送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的发酵清液用于提取乳酸；上述过程循环第15次时，乳酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降5％，于是第16次循环时向发酵罐内补充新鲜的高密度种子液1L，继续发酵生产；上述过程循环第20次时，乳酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降15％，于是将发酵罐内的发酵液全部排放出来，并用微滤装置过滤，滤液用于提取乳酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回发酵罐。
发酵生产结果：间歇式回流细胞法发酵生产乳酸乳酸浓度达到83.5g/L，糖转化率为94.5％，生产率达到6.95g/Lh，比单批发酵生产乳酸的生产率(1.74g/Lh)提高75％。间歇式回流细胞法和单批法发酵生产乳酸发酵液中乳酸浓度随时间的变化规律见图1。
实施例2
乳酸的发酵生产
设备：100L种子罐一套、100L发酵罐一套，处理能力100L/h的种子培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)、处理能力100L/h的发酵培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)，处理能力100L/h的发酵液超滤装置一套(截留分子量1000道尔顿)、100L的培养基缓冲储罐一套、发酵液缓冲储罐一套，泵五台。
菌种：鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus HG 08)。
种子培养基(g/L)：大米糖化液调整还原糖浓度到10，加麸皮水解过滤液3、酵母粉1、牛肉膏1，混匀，用8mol/L的KOH溶液调pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：大米糖化液调整还原糖浓度到100，加麸皮水解过滤液20、酵母粉5、牛肉膏5，混匀，用8mol/L的KOH调pH 7.0。
种子液的制备：将鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus HG 08)接种于装有无菌种子培养基的种子罐，流加8mol/L的KOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，37℃恒温培养24h，培养基即为种子液。
高密度种子液的制备：将鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus HG 08)接种于装有无菌发酵培养基的种子罐，流加8mol/L的KOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，37℃恒温培养24h，培养基用超滤装置处理，截留的菌体浓缩液(干重约2g/L)1L，即为高密度种子液。
单批法发酵生产乳酸：先对微滤、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入种子液1L，控制适合于鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus HG 08)培养条件(流加8mol/L的KOH溶液调pH 6.3，搅拌转速150rpm，42℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为5g/L时，直接排放出发酵液，用于提取乳酸。
间歇式回流细胞法发酵生产乳酸：先对微滤、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入高密度种子液，控制适合于鼠李糖乳酸杆菌(L.rhamnosus HG 08)培养条件(流加8mol/L的KOH溶液调pH 6.3，搅拌转速150rpm，42℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为5g/L时，直接排放出发酵液，当发酵罐中发酵液排放完30％时停止排放，随即向发酵罐内补充新鲜的无菌培养基清液，排出的发酵液进行超滤处理，截留细胞浓缩液20L送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的发酵清液用于提取乳酸；上述过程循环第16次时，乳酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降7％，于是第17次循环时向发酵罐内补充新鲜的高密度种子液1L，继续发酵生产；上述过程循环第21次时，乳酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降18％，于是将发酵罐内的发酵液全部排放出来，并用超滤装置过滤，滤液用于提取乳酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回发酵罐。
发酵生产结果：间歇式回流细胞法发酵生产乳酸乳酸浓度达到84g/L，糖转化率为94％，生产率达到7.12g/Lh，比单批法发酵生产乳酸的生产率(1.76g/Lh)提高75.2％。
实施例3
乳酸的发酵生产
设备：100L种子罐一套、100L发酵罐一套，处理能力100L/h的种子培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)、处理能力100L/h的发酵培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)，处理能力100L/h的发酵液微滤装置一套(膜孔径0.22μm)、100L的培养基缓冲储罐一套、发酵液缓冲储罐一套，泵五台。
菌种：干酪乳酸杆菌(L.casei LZD12)。
种子培养基(g/L)：玉米糖化液调整还原糖浓度到50，加麸皮水解过滤液10、酵母粉3、牛肉膏3，混匀，用10mol/L的NaOH溶液调pH 7.0。
发酵培养基(g/L)：玉米糖化液调整还原糖浓度到100，加麸皮水解过滤液20、酵母粉5、牛肉膏5，混匀，用10mol/L的NaOH调pH 7.0。
种子液的制备：将干酪乳酸杆菌(L.casei LZD12)接种于装有无菌种子培养基的种子罐，流加10mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，37℃恒温培养8h，培养基即为种子液。
高密度种子液的制备：将干酪乳酸杆菌(L.casei LZD12)接种于装有无菌发酵培养基的种子罐，流加10mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，37℃恒温培养8h，培养基用微滤装置处理，截留的菌体浓缩液(干重约15g/L)1L，即为高密度种子液。
单批法发酵生产乳酸：先对微滤、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入种子液1L，控制适合于干酪乳酸杆菌(L.casei LZD12)培养条件(流加25-28％的氨水调pH 6.5，搅拌转速150rpm，45℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为10g/L时，直接排放出发酵液，用于提取乳酸。
间歇式回流细胞法发酵生产乳酸：先对微滤、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入高密度种子液，控制适合于干酪乳酸杆菌(L.casei LZD12)培养条件(流加25-28％的氨水调pH 6.5，搅拌转速150rpm，45℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为10g/L时，直接排放出发酵液，当发酵罐中发酵液排放完70％时停止排放，随即向发酵罐内补充新鲜的无菌培养基清液，排出的发酵液进行微滤处理，截留细胞浓缩液20L送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的发酵清液用于提取乳酸；上述过程循环第18次时，乳酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降3％，于是第19次循环时向发酵罐内补充新鲜的高密度种子液1L，继续发酵生产；上述过程循环第21次时，乳酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降20％，于是将发酵罐内的发酵液全部排放出来，并用微滤装置过滤，滤液用于提取乳酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回发酵罐。
发酵生产结果：间歇式回流细胞法发酵生产乳酸乳酸浓度达到84.5g/L，糖转化率为95.5％，生产率达到7.21g/Lh，比单批法发酵生产乳酸的生产率(1.67g/Lh)提高76.8％。
实施例4
精氨酸的发酵生产
设备：100L种子罐一套、100L发酵罐一套，处理能力100L/h的种子培养基微滤装置一套、处理能力100L/h的发酵培养基微滤装置一套(膜孔径0.10μm)，处理能力100L/h的发酵液微滤装置一套(膜孔径0.10μm)、100L的培养基缓冲储罐一套、发酵液缓冲储罐一套，泵五台。
菌种：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum.HGLZD 101)。
种子培养基(g/L)：玉米水解液调还原糖含量50，(NH4)2SO45，玉米浆10，KH2PO4 0.1，MgSO4·7H2O 0.02，生物素30μg/L，8mol/L NaOH溶液调PH 7.0。
发酵培养基(g/L)：玉米水解液调还原糖含量150，(NH4)2SO4 10，玉米浆20，KH2PO4 0.2，MgSO4·7H2O 0.05，生物索60μg/L，8mol/L NaOH溶液调PH 7.0。
种子液的制备：将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum.HGLZD 101)接种于装有无菌种子培养基的种子罐，流加8mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，32℃恒温培养28h，培养基即为种子液。
高密度种子液的制备：将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum.HGLZD 101)接种装有无菌种子培养基的种子罐，流加8mol/L的NaOH溶液调pH 6.5，搅拌转速150rpm，32℃恒温培养28h，发酵液用微滤装置处理，截留的菌体浓缩液(干重30g/L)1L，作即为高密度菌种溶液。
单批法发酵生产精氨酸：先对微滤、种子罐、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入种子液1L，控制适合于黄色短杆菌(Brevibacterium flavum.HGLZD 101)的培养条件(通入氨气调pH 6.5，通空气量1.2L/min，搅拌转速200rpm，32℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为10g/L时，直接排放出发酵液。
间歇式回流细胞法发酵生产精氨酸：先对微滤、种子罐、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入高密度种子液，控制适合于黄色短杆菌(Brevibacterium flavum.HGLZD 101)的培养条件(通入氨气调pH 6.5，通空气量1.2L/min，搅拌转速200rpm，32℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为6.3g/L时，直接排放出发酵液，当发酵罐中发酵液排放完时停止排放，随即向发酵罐内补充新鲜的无菌培养基清液，排出的发酵液进行微滤处理，截留细胞浓缩液20L送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的发酵清液用于提取精氨酸；上述过程循环第12次时，精氨酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降6％，于是第13次循环时向发酵罐内补充新鲜的高密度种子液1L，继续发酵生产；上述过程循环第17次时，精氨酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降12％，于是将发酵罐内的发酵液全部排放出来，并用微滤装置过滤，滤液用于提取精氨酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回发酵罐。
发酵生产结果：间歇式回流细胞法发酵生产精氨酸浓度63.3g/L，糖转化率42.2％，生产率3.74g/Lh，比单批法发酵生产精氨酸的生产率(1.12g/Lh)提高70.10％。
实施例5
色氨酸的发酵生产
设备：100L种子罐一套、100L发酵罐一套，处理能力100L/h的种子培养基微滤装置一套、处理能力100L/h的发酵培养基微滤装置一套(膜孔径0.22μm)，处理能力100L/h的发酵液微滤装置一套(膜孔径0.22μm)、100L的培养基缓冲储罐一套、发酵液缓冲储罐一套，泵五台。
菌种：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum HGlzd 115)。
种子培养基(g/L)：大米糖化液含还原糖40，(NH4)2SO4 10，酵母粉3，玉米浆7，麸皮水解液5，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.2，8mol/L NaOH溶液调pH 6.8。
发酵培养基(g/L)：大米糖化液含还原糖120，(NH4)2SO4 30，酵母粉10，玉米浆20，麸皮水解液15，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，8mol/L NaOH溶液调pH 6.8。
种子液的制备：将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum HGlzd 115)接种于装有无菌种子培养基的种子罐，流加5mol/L的NaCO3溶液调pH 6.8，通空气量1.5L/min，搅拌转速300rpm，32℃恒温培养60h，取1L培养基作为种子液备用。
高密度种子液的制备：将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum HGlzd115)接种装有无菌种子培养基的种子罐，流加5mol/L的NaCO3溶液调pH 6.8，通空气量1.5L/min，搅拌转速300rpm，32℃恒温培养60h，发酵液用微滤装置处理，截留的菌体浓缩液(干重30g/L)1L，即为高密度种子液。
单批法发酵生产色氨酸：先对微滤、种子罐、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入种子液，控制适合于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum HGlzd 115)的培养条件(流加5mol/L的NaCO3溶液调pH 6.8，通空气量1.5L/min，搅拌转速200rpm，32℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为10g/L时，直接排放出发酵液。
间歇式回流细胞法发酵生产色氨酸：先对微滤、种子罐、发酵罐、缓冲储罐和泵及其连接的闭路输液管道高温蒸汽灭菌，新鲜的发酵培养基经微滤变成无菌清液后送入100L发酵罐，向发酵罐内接入高密度种子液，在适合于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum HGlzd 115)的培养条件(流加6mol/LNaCO3溶液调pH 6.8，通气量1.5L/min，搅拌转速200rpm，32℃恒温)进行发酵生产，发酵进行至发酵液中残糖量为6.3g/L时，直接排放出发酵液，当发酵罐中发酵液排放完时停止排放，随即向发酵罐内补充新鲜的无菌培养基清液，排出的发酵液进行微滤处理，截留细胞浓缩液20L送回发酵罐作生产菌继续使用，滤出的发酵清液用于提取色氨酸；上述过程循环第12次时，色氨酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降6％，于是第13次循环时向发酵罐内补充新鲜的高密度种子液1L，继续发酵生产；上述过程循环第17次时，色氨酸的生产率与第一次排放发酵液之前相比下降12％，于是将发酵罐内的发酵液全部排放出来，并用微滤装置过滤，滤液用于提取色氨酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回发酵罐。
发酵生产结果：间歇式回流细胞法发酵生产生产色氨酸浓度7.1g/L，糖转化率0.06％，生产率0.5g/Lh，比单批法发酵生产色氨酸的生产率(0.11g/Lh)提高78％。
Claims (8)
1.间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、灭菌：对用于有机酸发酵生产的种子罐、发酵罐、缓冲储罐、过滤装置及其连接管道进行蒸汽或杀菌剂灭菌；
步骤二、制备无菌的种子培养基：用经过灭菌的过滤装置对种子培养基进行过滤，得到无菌的种子培养基清液，将该种子培养基清液送入种子罐；
步骤三、制备高密度的种子液：根据所要生产的有机酸选择用于有机酸发酵生产的菌种，将所选的菌种接入已装有种子培养基清液的种子罐中，当菌种培养8～60h进入其生长曲线的对数生长期时，将得到的种子培养液用无菌的过滤装置过滤浓缩，使过滤装置截留的种子浓缩液中生物量的干重达到2～30g/L，此种子浓缩液即为高密度种子液；
步骤四、制备无菌的发酵培养基：将用于有机酸发酵生产的发酵培养基通过无菌的过滤装置过滤后，得到无菌的发酵培养基清液，将该发酵培养基清液的一部分送入发酵罐，另一部分存放于无菌的缓冲储罐中备用；
步骤五、间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：将步骤三所制备的高密度种子液接种到发酵罐内，在有利于所选菌种合成有机酸的发酵条件下进行培养，采用加入碱性中和剂控制pH的方法来解除发酵产酸导致的有机酸反馈抑制，发酵过程中监测发酵罐中发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度降至1.1～10g/L时，同时进行以下(1)和(2)的操作：
(1)将发酵液从发酵罐内排出，在发酵液排出的过程中监测发酵罐中发酵液体积的变化，当发酵罐中的发酵液排出了其总体积的30～100％时停止排放，随即向发酵罐中补充新鲜的无菌的发酵培养基清液，补充的新鲜发酵培养基体积不大于排出的发酵液体积，于是，发酵罐中的糖浓度大于发酵液刚从发酵罐内排出时的浓度；
(2)将排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，将被过滤装置截留的菌体细胞浓缩液再送回到发酵罐作为生产菌继续使用；
当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率没有出现下降时，再次同时进行以上(1)和(2)的操作；
当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且不超过10％时，随即向发酵罐内补充用前述步骤三所述方法制备的高密度种子液，并再次同时进行以上(1)和(2)的操作；
当发酵罐中的残糖浓度再次降至第一次排出发酵液时的残糖浓度范围，且与第一次排出发酵液前相比，有机酸生产率出现下降且超过10％时，将发酵罐中的发酵液全部排出，排出的发酵液送入无菌的过滤装置过滤，滤出的发酵清液用于提取有机酸，截留的菌体细胞浓缩液不再送回到发酵罐，而是废弃不用，至此即完成一轮完整的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程；
步骤六、新一轮间歇式回流细胞法发酵生产有机酸：监测整个生产系统是否出现染菌，当出现染菌时重复上述步骤一至五，继续新一轮的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程；当没有出现染菌时，重复上述步骤二至五，继续新一轮的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸过程。
2.根据权利要求1所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，所述的用于种子培养基和发酵培养基过滤的过滤装置是微滤装置，其膜孔径不超过0.22μm；
3.根据权利要求1所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，所述的用于发酵液过滤的过滤装置是微滤装置，其膜孔径不超过0.22μm；
4.根据权利要求1所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，所述的用于发酵液过滤的过滤装置是超滤装置，其膜截留分子量为1000道尔顿。
5.根据权利要求1所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，种子培养基为有机酸发酵生产上常用的种子活化液体培养基，其碳源浓度相当于葡萄糖浓度为10-50g/l；发酵培养基为有机酸发酵生产上常用的液体培养基。
6.根据权利要求1所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，用于有机酸发酵生产的菌种是能产有机酸的细菌。
7.根据权利要求6所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，所述的能产有机酸的细菌是德氏乳酸杆菌、鼠李糖乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、瑞士乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌、黄色短杆菌或谷氨酸棒杆菌。
8.根据权利要求1所述的间歇式回流细胞高生产率发酵生产有机酸的方法，其特征在于，所用的碱性中和剂为氨气、20％(w/w)以上的氨水、5mol/l以上的氢氧化钠溶液、5mol/l以上的氢氧化钾溶液、5mol/l以上的碳酸钠溶液或5mol/l以上的碳酸氢钠溶液。
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