CN101921712A - 发酵法生产虾青素和谷胱甘肽酵母菌种及其生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了发酵法生产虾青素和谷胱甘肽酵母菌种及其生产工艺，本项目通过综合的生物育种技术改造野生菌株，获得高产虾青素的红法夫酵母菌种，并利用遗传和工程控制手段强化了菌种副产物谷胱甘肽的生产特性。本发明发酵联产虾青素和谷胱甘肽的发酵培养基中碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度为25-40g/L；发酵培养基中氮源主要为玉米浆及少量无机氮源。通过发酵过程的优化和最佳提取技术的嵌合，实现两种产品的流畅的生产，综合生产效益比生产单独品种有很大程度的提高，克服了虾青素生产的经济性方面的制约。本发明对提高产品的附加值和减少环境污染都有着重要的示范意义。

Description

发酵法生产虾青素和谷胱甘肽酵母菌种及其生产工艺

技术领域：

本发明属于发酵领域，特别涉及酵母菌发酵生产代谢产物的菌种及工艺。

背景技术：

天然的虾青素存在于藻类和以藻类为食的鱼虾的组织中，其生理作用是抗氧化和保护色的作用。研究表明虾青素的抗氧化能力是维生素E的500倍是胡萝卜素的11倍以上，具有明显的抗氧化、消除活性的单线态氧的作用。可以广泛应用于人类保健等方面。

人工合成虾青素比较困难，且大多数为顺式结构，在体内也不能转化成天然的反式构型。

红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)可合成虾青素，红法夫酵母野生株系中虾青素积累量达细胞干重的0.05％左右，某些突变株系中最多可达0.3％，并且所合成的类胡萝卜素中虾青素是主要成分，因而是目前微生物发酵生产虾青素普遍采用的菌株。

彭峰2008年硕士论文题目为红发夫酵母发酵虾青素的研究，该文对红发夫酵母生长特性和发酵培养提取测定工艺进行了研究，同时也开展了耐高温菌种的诱变选育，确定了发酵培养条件，但诱变菌的虾青素产量很小。

谷胱甘肽是发现最早、功能最强和研究最深入的天然小分子肽之一。谷胱甘肽是存在于生物体内的重要肽类物质，有着重要的生理活性，通常是从动物肝脏和酵母中提取得到。由于特殊的酵母菌种在培养过程中会积累一定浓度的谷胱甘肽，所以酵母细胞就成了提取谷胱甘肽的主要来源。

现有技术中没有揭示联产虾青素和谷胱甘肽的高产菌株，尚无文章报道利用同一酵母菌种同时高效生产虾青素和谷胱甘肽的工艺；以及有效的从酵母中提取虾青素和谷胱甘肽的工艺。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一种生产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母菌种；提供一种红发夫酵母生产虾青素和谷胱甘肽的生产工艺。

本发明提供一种高产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌种，该酵母菌株已经于2010年4月29日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，(邮编100101)，保藏编号为CGMCC No 3788。

本发明的另一目的是提供一种利用上述高产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母生产虾青素和谷胱甘肽的方法，该方法包括：

上述高产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母在发酵培养基中进行发酵培养，获得酵母细胞；从上述酵母细胞中分离提取虾青素和谷胱甘肽。

本发明发酵联产虾青素和谷胱甘肽的方案中，发酵培养基中碳源为葡萄糖，葡萄糖的浓度为25-40g/L；

本发明发酵联产虾青素和谷胱甘肽的实施方案中，所述的发酵培养基中碳源为葡萄糖，氮源主要为玉米浆及少量无机氮源，如0.2-3.5g/L的玉米浆以及无机氮源，无机氮源可选择0.03-1g/L的硫酸铵和尿素；以及其他营养盐，如0.1-0.3g/L的KH₂PO_4，，0-0.2g/L的MgSO₄·7H₂O。

本发明发酵联产虾青素和谷胱甘肽的实施方案中，发酵培养条件如下：搅拌转速120-180rpm，温度15-26℃，溶氧0.5％以上；发酵时间56-102小时。

本发明发酵联产虾青素和谷胱甘肽的实施方案中，发酵过程中流加葡萄糖和氮源，发酵液中葡萄糖浓度控制在1.5％(质量体积比)及以下，流加氮源为玉米浆及少量无机氮源，呼吸商在0.8-1.5，发酵培养16小时后1次或多次降低发酵液中葡萄糖浓度到0.02-0.5g/L。

本发明从酵母细胞中分离提取虾青素和谷胱甘肽的工艺如下：

将发酵获得酵母发酵液离心洗涤后获得酵母细胞，热水浸提获得谷胱甘肽浸出液；谷胱甘肽浸出液经膜过滤除去大分子物质，减压浓缩后进行等点结晶或喷雾干燥制备粉末制剂；酵母细胞经干燥获得酵母粉，酒精萃取酵母粉，浓缩萃取液获得虾青素；

上述热水浸提操作中热水温度为80-100℃，浸提2-4次，每次浸提5-10分钟；

上述膜的截流分子量在500-1000Da之间；

上述酒精萃取工艺中，酵母粉与酒精的料液比为1∶7-12；所述酒精为85-100％的乙醇溶液。

有益效果：

酵母在较低发酵温度条件下积累的谷胱甘肽几乎全部是活性的还原型谷胱甘肽(GSH)，这也发挥了虾青素发酵过程最为人诟病的低温条件的优势，用增加的有益副产物来弥补降温能耗的花费。

本发明采用诱变选育的新菌种和科学工艺实现同一株菌种生产虾青素和谷胱甘肽的工艺思路，发明创造性的采用发酵稳定期降低葡萄糖浓度的饥饿培养方法有效提高了虾青素的产量，一举两得地同时开发出脂溶性的抗氧化剂和水溶性的抗氧化剂。使得细胞浓度达到了20克/升以上，虾青素含量为2500微克/克干细胞以上的成绩，单位体积虾青素产量达到了50毫克/升的国内先进的生产水平。酵母的谷胱甘肽的含量也达到了10000μg/g以上的水平，具有良好的综合利用价值。

完成了主要利用葡萄糖和玉米浆实现虾青素和谷胱甘肽这两种重要的活性抗氧化剂物质的10吨发酵规模的技术验证，发酵水平达到了国内先进水平，而多产品发酵和提取技术具备进行工业化实施的价值和条件。

提出并实现了利用中性醇溶液进行高效虾青素萃取的工艺路线，避免了酸化破壁对产品质量和用途造成的不良影响；试验表明，本发明的提取工艺使虾青素的提取率可以达到85％以上，谷胱甘肽的提取率达到90％以上。

成功实现高收率的虾青素和谷胱甘肽有效成分的提取，提高了生产的效益和产品的附加值。

具体实施方式：下面通过具体的实施方案叙述本发明中高产虾青素和谷胱甘肽红发夫酵母菌株的获得以及其发酵联产虾青素和谷胱甘肽的方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的培养剂组分、含量、培养条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

定向诱变技术选育高产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母：

采用来自日本微生物菌种保藏中心的红发夫酵母菌种JCM-9680菌株定向诱变产生高产虾青素和谷胱甘肽的菌株，本发明中定向诱变指将一定浓度的酵母细胞悬浮液用化学和物理诱变剂反复处理，包括采用100-200微克/毫升亚硝基胍在20-25℃处理20-40分钟，并用Co60辐射源进行辐照，总的辐照剂量为100Gy。

将辐照后的菌液稀释后涂布于含有0.1％的亚硫酸氢钠的YMPD平板上，于22℃培养箱中培养72小时后，挑取菌落颜色鲜艳且菌落较大者进行发酵试验。通过检测虾青素和谷胱甘肽含量，确定高产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母菌株。

筛选得到的酵母菌显微形态是典型的酵母形态，呈圆形或卵圆形。生长方式为单边簇生芽殖，在细胞中可以明显的观察到橙色的着色颗粒(液滴)，在固体培养基表面生长成鲜艳的橙色菌落。

将挑出的分离株经过一次液体试管转接后，转接到40毫升的摇管中，于22℃下进行摇管发酵，培养24-36小时后，离心分离酵母菌体进行虾青素和谷胱甘肽产量的测定。

选择出的酵母菌种发酵生产的虾青素含量和虾青素产率远远高于原始出发菌株。虾青素产量达到了2500μg/g以上，谷胱甘肽的含量也达到了10000μg/g的水平。

酵母菌株已经于2010年4月29日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，(邮编100101)，中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No3788。

红发夫酵母菌株发酵培养条件的优化：

将红发夫酵母菌株在三角瓶摇瓶发酵培养条件下研究培养基成分和条件；葡萄糖，蔗糖，麦芽糖为碳源，碳源浓度在25-40g/L，葡萄糖为优选碳源，浓度为25-40g/L；氮源包括玉米浆和少量无机氮源，无机盐包括镁、钾的磷酸盐和硫酸盐，微量元素如锰、铜、锌；以及维生素等。研究确定培养基组分及浓度，获得菌株发酵生产的培养基。

高产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母规模性发酵生产工艺如下，从斜面到摇瓶到种子罐到5吨或10吨发酵罐。发酵过程采用常规的自动化控制发酵罐进行发酵培养，自动控制系统对溶氧水平，温度、罐压、搅拌速度进行控制，实现菌体浓度和目的产物的有效积累。

培养基组分和发酵条件的选择是本领域技术人员通常根据实验结果和基本知识确定，本发明中优选的培养基和发酵条件如下：

YMPD：1％Yeast Extract(酵母膏)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose glucose(葡萄糖)，1％的麦芽糖，若制固体培养基，加入2％琼脂粉。

斜面培养基(g/L)：葡萄糖：10；酵母膏：3；蛋白胨：10；琼脂：20；麦芽汁：3；PH 5.0。

摇瓶培养基(g/L)：葡萄糖：30，酵母氮基：10，KH₂PO₄0.25，MgSO₄·7H₂O：0.1。

摇瓶培养条件：250ml三角瓶装量为25ml，22℃220r/min培养48小时。

发酵罐种子培养基(g/L)葡萄糖：30；酵母氮基：10；KH₂PO₄：0.25；MgSO₄·7H₂O：0.1。

发酵培养基(g/L)葡萄糖：30；玉米浆：3；硫酸铵：0.3；KH₂PO₄：0.25；MgSO₄·7H₂O：0.1。

10吨发酵罐培养条件：装液量60％，接种量为：10％，搅拌转速150rpm，温度18-23℃。罐压0.3mpa，溶解氧30％，发酵过程中流加葡萄糖和氮源，发酵液葡萄糖浓度控制在1.5％及以下，流加氮源为玉米浆及少量无机氮源。进入发酵生长的稳定期后1次或多次降低发酵液中葡萄糖浓度到0.02-0.5g/L。

细胞浓度达到20克/升以上，虾青素含量为2500微克/克干细胞，单位体积虾青素产量达到了50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量达到10000μg/g以上。

本发明从酵母细胞中分离提取虾青素和谷胱甘肽的工艺如下：

将发酵获得酵母发酵液离心洗涤后获得酵母细胞，热水浸提获得谷胱甘肽浸出液；谷胱甘肽浸出液经膜除去大分子物质，减压浓缩后进行等点结晶或喷雾干燥制备粉末制剂；酵母细胞经干燥获得酵母粉，酒精萃取酵母粉，浓缩萃取液获得虾青素；

上述热水浸提操作中热水温度为95℃，浸提3次，每次浸提10分钟；

上述酒精萃取工艺中，酵母粉与酒精的料液比为1∶10；所述酒精为85％的乙醇溶液。

本发明中虾青素的测定方法如下：

1.10ml发酵液3000r/min离心15min洗涤两次，去掉上清液。

2.用2.5ml的二甲基亚砜破壁，搅拌然后用3000r/min离心15min两次至沉淀物无色，上清液用丙酮萃取。

3.加蒸馏水洗涤丙酮萃取液至澄清透明，定容至25ml，测定波长在474nm时的吸光度。

细胞总虾青素质量浓度(μg/ml)＝(A*Va)/(E*Vf)

式中：A-光密度

Va-萃取液体积，ml

E-消光系数，为0.21

Vf-取样发酵液体积，ml

本发明中谷胱甘肽的含量测定方法如下：

A、半定量方法

B、HPLC定量测定方法

色谱柱：岛津Vp-ODS 4.6×250mm；

流动相：磷酸二氢钠和庚烷磺酸钠混合溶液(磷酸二氢钠3.0g，庚烷磺酸钠1.0g，加水

溶解并定容至500ml)∶乙腈＝96∶4(v∶v)，用磷酸调节pH为3.0。

检测器：岛津SPD-M20A型DAD检测器。

流速：1ml/min；柱温：45℃；进样量：20μl。

实施例1

将出发菌株JCM-9680红发夫酵母的平板分离单菌落培养物转接到含葡萄糖5％的YMPD液体培养基中，于22℃下培养18～24小时。取旺盛生长的培养物5毫升，于4000rpm下离心15分钟，倾倒掉上清液，用生理盐水洗涤沉淀细胞2～3次后，用50mM的pH7.0的磷酸缓冲溶液悬浮酵母沉淀，稀释至约10⁷细胞/毫升，备用。

向装有上液的试管中加入亚硝基胍丙酮溶液，使最终浓度达到200微克/毫升，混合均匀后在22℃下保温30分钟，离心，除去上清液，用相同的磷酸缓冲溶液洗涤2～3次，洗涤后的细胞悬液适当稀释后涂布于YMPD平板上，于22℃培养箱中培养72小时后，挑取菌落颜色鲜艳者进行发酵试验。试验采用的液体培养基的组成为：(g/L)葡萄糖：30；酵母膏：3；蛋白胨：10；麦芽汁：3；PH 5.0。在22℃下，250rpm的转速下摇瓶48小时，分析变异株同出发株的产物产量为：

菌株	虾青素含量(μg/g)	谷胱甘肽含量(μg/g)
			JCM-9680	430	750
变异株M-3	1888	1500

实施例2

将用50mM的pH7.0的磷酸缓冲溶液制备的含M-3菌种浓度为10⁷细胞/毫升的悬液分装在15毫升的无菌聚丙烯离心管中，在辐照室中接受Co60辐射源的辐照，总的辐照剂量为100Gy。将辐照后的菌液稀释后涂布于含有0.1％的亚硫酸氢钠的YMPD平板上，于22℃培养箱中培养72小时后，挑取菌落颜色鲜艳且菌落较大者进行发酵试验。试验采用的液体培养基的组成为：(g/L)葡萄糖：30；酵母膏：3；蛋白胨：10；麦芽汁：3；PH 5.0。在22℃下，250rpm的转速下摇瓶48小时，分析变异株同出发株的产物产量为：

菌株	虾青素含量(μg/g)	谷胱甘肽含量(μg/g)
			变异株M-3-3	1888	1500
变异株M-3-86	2020	9500

将变异株M-3-86进行多次传代试验，遗传性状稳定的单菌落纯培养物提交中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No 3788。

实施例3

在10升发酵罐中，培养基为6升，培养基的组成和比例(g/L)葡萄糖：30；玉米浆：3；硫酸铵：0.3；KH₂PO₄：0.25；MgSO₄·7H₂O：0.1。搅拌转速150rpm，温度22℃。控制溶解氧大于5％，发酵时间为56小时。细胞浓度达到4.5克/升，虾青素含量为2040μg/g干细胞，酵母的谷胱甘肽的含量达到8500μg/g干细胞。酵母为CGMCC No 3788。

实施例4

在10升发酵罐中，培养基为6升，培养基的组成和比例(g/L)葡萄糖：30；玉米浆：3；硫酸铵：0.3；KH₂PO₄：0.25；MgSO₄·7H₂O：0.1。搅拌转速150rpm，温度22℃。溶解氧大于0.5％，发酵过程中流加浓度为30％葡萄糖的和氮源，发酵液葡萄糖浓度控制在0.5～1.5％，流加氮源为0.5％玉米浆及0.2％无机氮源。酵母为CGMCC No 3788。

发酵时间96小时。细胞浓度达到20克/升以上，虾青素含量为1980μg/g干细胞，酵母的谷胱甘肽的含量达到12000μg/g干细胞。

实施例5

在10升发酵罐中，培养基为6升，培养基的组成和比例(g/L)葡萄糖：30；玉米浆：3；硫酸铵：0.3；KH₂PO₄：0.25；MgSO₄·7H₂O：0.1。搅拌转速150rpm，温度22℃。溶解氧大于0.5％，发酵过程中流加浓度为30％葡萄糖的和氮源，发酵液葡萄糖浓度控制在1.5％，流加氮源为0.5％玉米浆及0.2％无机氮源。

在发酵约50小时后，发酵液葡萄糖浓度可降到0.1g/L以下，此时开始流加，在8小时内使葡萄糖浓度提高到1％左右。其后通过流加速度调节重复控制葡萄糖浓度在低于0.1％的“饥饿”水平和1％左右的正常水平间摆动，直到发酵时间96小时发酵终止。此时细胞浓度达到20克/升以上，虾青素含量为2500μg/g干细胞，单位体积虾青素产量达到了50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量达到13000μg/g干细胞以上。酵母为CGMCC No 3788。

实施例6

在10吨发酵罐中，培养基为6吨，培养基的组成和比例(g/L)葡萄糖：30；玉米浆：3；硫酸铵：0.3；KH₂PO₄：0.25；MgSO₄·7H₂O：0.1。搅拌转速150rpm，温度22℃。溶解氧大于0.5％，发酵过程中流加葡萄糖和氮源，发酵液葡萄糖浓度控制在1.5％，流加氮源为0.5％玉米浆及0.2％无机氮源。

发酵50小时时逐渐降低发酵液葡萄糖浓度到0.1g/L，之后恢复葡萄糖浓度到正常水平。

发酵时间96小时。细胞浓度达到20克/升以上，虾青素含量为2500微克/克干细胞，

单位体积虾青素产量达到了50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量达到10000μg/g以上。

将发酵获得酵母发酵液离心洗涤后获得酵母细胞，热水浸提获得谷胱甘肽浸出液；谷胱甘肽浸出液经纳滤膜(分子量为500Da)除去大分子物质，减压浓缩后进行等点结晶或喷雾干燥制备谷胱甘肽粉末制剂；酵母细胞经干燥获得酵母粉，酒精萃取酵母粉，蒸馏浓缩萃取液获得虾青素；通过虾青素和谷胱甘肽检测方法确定产量。

上述热水浸提操作中热水温度为95℃，浸提3次，每次浸提10分钟；

上述酒精萃取工艺中，酵母粉与酒精的料液比为1∶10；所述酒精为95％的乙醇溶液。

实施例7基本方法同例1

在10吨发酵罐中，培养基为6吨，培养基葡萄糖浓度为4％，发酵过程中流加葡萄糖和氮源，发酵液葡萄糖浓度控制在1.4％，流加氮源为玉米浆及少量无机氮源。发酵温度21℃。

进入发酵生长43和59小时时阶段性降低发酵液葡萄糖浓度到0.5g/L。

发酵时间98小时。细胞浓度达到20克/升以上，虾青素含量为2550微克/克干细胞，

单位体积虾青素产量达到了50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量达到10000μg/g以上。

Claims (8)

1.一种生产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)，其保藏编号为CGMCCNo 3788。

2.一种如权利要求1所述的生产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母菌发酵生产虾青素和谷胱甘肽的方法，包括如下步骤：如权利要求1所述红发夫酵母在含葡萄糖的发酵培养基中进行发酵培养，获得酵母细胞；从上述酵母细胞中分离提取虾青素和谷胱甘肽。

3.根据权利要求2所述的红发夫酵母菌发酵生产虾青素和谷胱甘肽的方法，其特征在于所述发酵培养基中葡萄糖浓度为25-40g/L。

4.根据权利要求2或3所述红发夫酵母菌生产虾青素和谷胱甘肽的的方法，其特征在于所述发酵培养基还含有0.2-3.5％g/L玉米浆。

5.根据权利要求2或3所述的红发夫酵母菌生产虾青素和谷胱甘肽的方法，其特征在于所述发酵培养条件如下：搅拌转速120-180rpm，温度15-26℃，溶氧大于0.5％。

6.根据权利要求2或5所述的红发夫酵母菌生产虾青素和谷胱甘肽的方法，其特征在于所述发酵培养16小时后至少1次降低发酵液中葡萄糖浓度到0.02-0.5g/L。

7.根据权利要求5所述的红发夫酵母菌生产虾青素和谷胱甘肽的方法，其特征在于所述发酵过程中进入发酵生长的稳定期时1次或多次降低发酵液中葡萄糖浓度到0.1、0.02、或0.5g/L。

8.如权利要求1所述生产虾青素和谷胱甘肽的红发夫酵母菌在虾青素和谷胱甘肽生产中的应用。