CN1628177A - 一种通过发酵Xanthophyllomyces dendrorhous筛选菌株生产虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了(i)获得X.dendrorhous的高产虾青素菌株，及(ii)在改良发酵条件下使用上述菌株的方法。用于筛选菌株的方法基于：(i)抗类固醇合成抑制剂，抗呼吸抑制剂及抗诱导产生自由基的化合物，(ii)在固体培养基上的菌落颜色强度及类胡萝卜素产量，(iii)在暗处虾青素产量，(iv)在升高温度下虾青素产量，及(v)用葡萄糖之外的碳源时虾青素的产量。这些方法可有效筛选虾青素产量比亲本株高且其他类胡萝卜素累积少的X.dendrorhous突变株。在液体培养基中培养X.dendrorhous有可能获得可直接用于人和动物营养的生物量。

Description

一种通过发酵Xanthophyllomyces dendrorhous筛选菌株生产虾青素的方法
发明领域
本发明描述了(i)筛选Xanthophyllomyces dendrorhous虾青素高产菌株及(ii)在改良的发酵条件下使用上述菌株的方法。
现有技术
类胡萝卜素本质上是一种类异戊二烯色素，由特定的细菌，真菌和光合生物合成。由于它们益于健康的作用及具有吸引力的色彩，因此类胡萝卜素作为色料和食品添加剂具有很高的商业价值。类胡萝卜素是由8-10个异戊二烯单元(C5)形成的具有40或50个碳原子的多烯化合物。它们在在400-500nm之间具有最大吸收，这赋予它们介于黄色和红色之间的特征颜色。具有未被取代的烃链的类胡萝卜素(番茄红素，β-胡萝卜素)称为胡萝卜素。氧化衍生物称为叶黄素。后者包括醇(黄体素和玉米黄质)，环氧化物(紫黄质)，酯(球形烯)，酮(equinenone，角黄素，虾青素)和酸(红酵母红素)。类胡萝卜素结构中存在的生色团基团作为光保护试剂和抗氧化剂具有重要的生物功能。类胡萝卜素保护脆弱的组织抵抗单态氧及自由基的作用。在这方面，虾青素——3-羟基-3’，4’-双脱氢-β，ψ-胡萝卜素-4-酮(HDCO)的生物合成中间体作为自由基诱捕起重要作用，而且赋予非常令人愉悦的微红色着色。类胡萝卜素执行多种生物功能，特别是它们可作为抗癌试剂，免疫系统增效剂，防止中枢神经系统退行性疾病(阿兹海默氏症，与视觉相关的疾病等)的试剂，抗炎症试剂，抗胁迫试剂，光保护试剂等。虾青素是一种酮基类胡萝卜素(叶黄素)，在自然界广泛分布，其分子中具有11个共轭双键。虾青素由细菌(Agrobacteriumaurantiacum，海洋迪茨氏菌(Rhodococcus maris)等)，真菌(X.dendrorhous)，藻类(雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))及高等植物产生。一般来说，所有植物的绿色部分均含有被叶绿素掩盖的虾青素，它与其他类胡萝卜素一起使植物表现出典型的秋天颜色。而且发现它在夏侧金盏花(Adonis aestivalis)的花，鸟(火烈鸟(flamingo)，红鹮(scarlet ibis))，鱼(鲑鱼科)和海洋无脊椎动物(虾，螃蟹，龙虾等)中也存在，并在这些生物的防御和存活中起到重要作用。
通过微生物的生物合成来生产类胡萝卜素是一个化学过程和生物方法间竞争的典型例子。其中，生物技术方法表现出以下优势，即它们可以简单的方式获得结构更复杂的类胡萝卜素及仅存在于自然界中的构象异构体。与化学合成竞争的生产虾青素的工业化生物技术方法是基于使用藻类雨生红球藻及酵母X.dendrorhous。用雨生红球藻进行工业化生产虾青素涉及需要广阔的海域用于它的培养，而且存在污染及难以控制特定的环境因素的问题。因此，当1976年首次报道X.dendrorhous(Phaff H.F.等.1972.Proc.IV IFS：Ferment.Technol.Today 759-774)，并表明它具有产生虾青素和其他类胡萝卜素的能力(Johnson等.1978.Appl.Environ.Microbiol.35：1155-1159)，以及它在鲑鱼科，鸟蛋等染色中的功效时，该酵母很快引起工业上越来越多的兴趣。
富含虾青素的X.dendrorhous生物量可用作食品添加剂，用于对鲑鱼肉进行着色。由于鲑鱼的食物包括含有虾青素的微生物和甲壳动物，因此它们在自然环境中获得典型的颜色。最初生长在隔离环境中的鱼由于在其食物中缺乏虾青素，因此其身体和皮肤均为乳白色。虾青素及其赋予的色彩和味道在鱼类的繁殖和一般发育过程中起到重要作用。目前，由于从甲壳动物的壳中提取虾青素在经济上无利可图，因此多数虾青素是通过化学合成获得的。然而，由于越来越多的消费者对化学添加剂和合成产物的敏感性，因此使用X.dendrorhous和雨生红球藻作为虾青素的天然来源逐渐增加。
虾青素的生物合成途径(参见方案1)已在多种生物，例如X.dendrorhous，噬夏饱欧文氏菌(Erwinia uredovora)和Agrobacteriumaurantiacum(Ducrey Sanpietro L.M.1998.Yeast 14：1007-1016；Misawa N.等.1995.J.Bacteriol.177：6575-6584；Fraser P.D.等.1997.J.Biol.Chem.272：6128-6135)中有所描述。至少需要五种酶参与该生物合成：(i)八氢番茄红素合成酶，它将两分子焦磷酸牛儿酯连接，产生八氢番茄红素，(ii)八氢番茄红素脱氢酶，它在八氢番茄红素分子中引入四个双键，合成番茄红素，(iii)番茄红素环化酶，它以番茄红素为底物，在β-胡萝卜素分子的两个末端位置形成环，(iv)β-胡萝卜素酮酶，位于在β-胡萝卜素分子的两个末端位置的每个环中引入一个酮基，及(v)β-胡萝卜素羟化酶，它对位于β-胡萝卜素分子每个末端的每个环进行羟化作用。最后两种酶参与一系列虾青素前体(equinenon，角黄素，phoenicoxanthin，β-隐黄素，玉米黄素，金盏花黄素(adonixanthin))的生物合成(方案1)。已在多种生物，例如噬夏饱欧文氏菌，A.aurantiacum，阿拉伯芥(Arabidopsis)等中鉴定了β-胡萝卜素酮酶和β-胡萝卜素羟化酶(及其编码基因)，而且在所有情况下已经描述了存在两种不同的蛋白。然而，已经描述了在X.dendrorhous中单独存在一种称为虾青素合成酶的酶，其催化β-胡萝卜素转变为虾青素(Tatsuo H.等.2000.EP1035206)。
Figure A0380328100071
方案1.在X.dendrorhous中虾青素简化的生物合成途径
在X.dendrorhous中生产虾青素的日益增长的商业兴趣已经促进了对该微生物分子分型技术的应用(Adrio J.L.等.1995.Curr.Genet.27：447-450)。这样，可能对在改良程序中筛选到的菌株之间建立差异。另外，这些技术可用于控制获得的生物量的质量，因为它们使得在发酵过程中确定菌株的遗传稳定性及存在的其它微生物污染成为可能。
DNA探针可用于分析具有合适探针但不能被生化方法简单区分的微生物。DNA扩增由于其灵敏度及速度，是一种用于直接检测的方法。在多种情况下，扩增的DNA片段仅通过用溴化乙啶染色琼脂糖胶进行检测。基于DNA电泳的分子分型技术包括以下几种：RFLP(限制性片段长度多态性)，核糖分型(ribotyping)(用rRNA探针进行杂交)，PFGE(脉冲电场凝胶电泳)，OFAGE(正交电场凝胶电泳)，FIGE(倒转电场凝胶电泳)，CHEF(闭合均质电场(Clamped Homogeneous Electrical Field))等。另一方面，几种基于DNA扩增的分子分型方法为：PCR(聚合酶链式反应)，PCR-RFLP，REP(重复性基因外回文的)，ERIC(肠杆菌重复基因间共有序列)，RAPD(随机扩增多态性DNA)等。RFLP电泳技术已被广泛用于检测多种生物DNA之间的变异。但是，PCR技术的发明意味着这类方法例如RAPD为电泳技术提供了快速有效的替代方法。此外，RAPD的优势在于它不需要使用放射性同位素及需要更少量的DNA进行分析。该技术基于使用短的寡核苷酸作为引物。所述寡核苷酸可与作为模板的基因组DNA的不同区域结合，使其可对特定的DNA序列进行扩增。RAPD中所用的引物具有任意序列，通常其G+C含量高于50％。而且不存在重复的反向内部序列。扩增的DNA片段的理论数目依赖于引物长度及作为模板的基因组大小。扩增基于以下概率：(i)引物在基因组中找到互补的DNA序列，(ii)所述序列位于相反的链上，(iii)它出现在反义序列及(iv)位于可被PCR扩增的距离上。多态性的出现可能是由于引物结合序列的改变(例如点突变)，其防止引物与模板DNA的正确结合。另外，这些多态性可能是由DNA序列的改变造成的(例如，插入和反转)，其改变了扩增片段的大小，由于它们产生过远的引物结合位点而防止了DNA的扩增，导致删除了引物结合位点等。
本发明中所用的筛选菌株的方法基于：(i)抗类固醇合成的抑制剂，抗呼吸的抑制剂和抗诱导产生自由基的化合物，(ii)固体培养基上的菌落颜色强度和类胡萝卜素的产生，(iii)黑暗中产生虾青素，(iv)在升高温度的条件下产生虾青素，及(v)用葡萄糖之外的碳源产生虾青素。这些方法可有效筛选X.dendrorhous突变体。另外，本发明中所述的筛选菌株和发酵的方法可获得高产虾青素，而对其他类胡萝卜素的积累水平较低。在液体培养基中培养X.dendrorhous，由于含有类胡萝卜素，蛋白质，碳水化合物，维生素，脂肪酸和其他营养物质，可获得有营养的，促进健康的生物量。所述生物量可直接用于人和动物的食品中。
发明详述
本发明描述了多种使用酵母X.dendrorhous获得高产虾青素的方法。本发明包括(i)设计获得和筛选高产虾青素的X.dendrorhous突变体的方法，及(ii)开发改良的发酵条件。本研究针对获得具有更高浓度虾青素的X.dendrorhous菌株。这是基于使用传统的突变和筛选技术，并对原材料和发酵条件进行优化。虾青素的浓度表示为(i)ppm(每克干生物量的纯虾青素的微克数)或(ii)相对于干生物量纯虾青素的百分比。尽管野生型X.dendrorhous菌株产生100到200ppm虾青素，但本发明描述的方法至少可产生5000ppm虾青素。X.dendrorhous在生物技术生产虾青素方面具有非常大的工业重要性。实际上，所述方法与目前工业上所用的合成方法具有竞争性。
为了获得虾青素高产菌株，首先开发了一种用诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)，N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(NTG)及紫外线辐射(UVA)诱变X.dendrorhous菌株的方法。从在液体培养基R4-062-7中的X.dendrorhous培养物中获得待诱变的细胞混悬液。用EMS的诱变方法为在20℃和100rpm下，将108细胞/ml在6％EMS溶液的0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.0中温育40-80分钟。用NTG的诱变方法为在20℃和100rpm下，将108细胞/ml在250μg/ml NTG溶液的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0中温育60-120分钟。用UVA的诱变方法为用254nm的灯对悬浮在生理盐水中的107细胞/ml悬浮液在20℃及40rpm下照射5-10分钟。在使用的这三种诱变方法中，均将诱变细胞在YEPD液体培养基中，17-20℃和100rpm下培养10小时，以促进其恢复。然后，接种含有YEPDA固体培养基的培养皿，并在17℃培养4天以获得分离的克隆。
用于筛选高产虾青素的X.dendrorhous菌株的策略如下：(i)抗类固醇合成的抑制剂，抗呼吸的抑制剂及抗诱导产生自由基的化合物，(ii)在固体培养基上的菌落颜色强度及产生类胡萝卜素，(iii)黑暗中产生虾青素，(iv)在升高温度的条件下产生虾青素，及(v)用葡萄糖之外的碳源产生虾青素。为了筛选高产虾青素的突变株，将诱变细胞在YEPDA培养基中培养，所述培养基中补加以下试剂(i)改变细胞氧化还原势的化合物，例如四甲基对苯醌或过氧化氢，或(ii)类固醇合成抑制剂，特别是β-紫罗兰酮，咪唑，二乙胺，2-甲基咪唑，制霉菌素及二苯胺。
随后，在固体培养基上根据产量筛选突变株。所述的筛选过程第一步首先分离那些比亲本株颜色更深红色的菌落，然后使用评估在固体培养基上生长的生物量的类胡萝卜素含量的方法。通过筛选吸收值比亲本株VKPM Y-2476高的突变株，有可能筛选到虾青素高产菌株AST-A1及AST-A2(方案2)。在黑暗中产生虾青素的突变株根据当在黑暗中在固体培养基上培养时的类胡萝卜素含量进行筛选。这样筛选到菌株AST-A3，AST-A4，AST-A5，AST-A6及AST-A7(方案2)。在升高温度条件下产生虾青素的突变株根据其在高于正常温度(17-20℃)的温度下的生长能力和产虾青素的能力进行筛选。这样筛选到菌株AST-A8，AST-A9及AST-A10(方案2)，它们可在24℃生长并产生虾青素。可利用除葡萄糖之外的其他碳源产生虾青素的X.dendrorhous菌株根据其以蔗糖为唯一碳源时的生长能力和产生虾青素的能力进行筛选。这样筛选到菌株AST-A11(方案2)，它在以蔗糖为碳源时表现出比亲本株更强的产生虾青素的能力。
为了得到有所区别的特征，对筛选的菌株进行各种遗传分析。在这方面，检测X.dendrorhous菌株染色体外元件的存在。另外，已确定(i)所述的染色体外元件(质粒)由线性构型的双链DNA组成，及(ii)虾青素高产菌株具有不同于低产菌株所显示的染色体外元件的图谱。而且利用RAPD技术另外验证了虾青素高产菌株与低产菌株之间的差异。
在烧瓶中发酵筛选的菌株，以测定液体培养基中虾青素的产量。基于此目的，培养烧瓶中的接种物然后进行烧瓶发酵。发酵完成后(大约7天)，利用旋涡振荡裂解X.dendrorhous，用有机溶剂(例如丙酮)萃取产生的类胡萝卜素，并通过HPLC测定虾青素的浓度及纯度。获得的产量在150至200mg/l之间变动。向培养基中加入以下物质：(i)释放自由基的试剂，例如四甲基对苯醌，(ii)作为胡萝卜素形成作用诱导剂的化合物，例如视黄醛(retinal)或三孢酸，或(iii)碳氢链前体，例如谷氨酸盐(glutamate)，提高虾青素的产量，当使用视黄醛时，产量至少达到225mg/l，使用三孢酸时，产量为200mg/l，使用谷氨酸盐时，产量为180mg/l。另外，(i)开发了增加虾青素的特定产量的培养基，及(ii)已确定白光和紫外光均可提高虾青素产量，6小时紫外光/暗处交替循环可获得最好结果。
将在烧瓶中筛选的菌株在中间试验发酵罐中培养，以测定虾青素产量。发酵条件包括在复合培养基上最初培养微生物，以可能获得高水平生物量和最大产量。在最初的培养阶段之后是以最小生长和最大产量为特征的生产阶段。另外，可通过以下方法提高虾青素的产量：(I)向培养基中加入具有氧化能力的物质(例如浓度为25-50μM的四甲基对苯醌)，它诱导胞内形成自由基。在发酵的前24小时可发挥作用的添加才是真正有效。这些化合物降低生长(15-25％)并提高虾青素的产量(10-20％)。因此，生物量特定产量的整个增长可在30-60％的范围内变动，在烧瓶中发酵6-7天虾青素的产量至少可达到215mg/l。(II)在发酵的高级阶段降低易吸收的碳源(例如葡萄糖)的添加，并以利用更慢的碳源(例如乙醇，丙三醇等)来部分替代，这可维持最小的生长，但足以维持高产的生物量。(III)在生产阶段用高强度光(例如高于250lux)照射培养物。(IV)改变pH和温度以达到产率高于生长的条件。在温度约17℃及pH值接近3时，生长缓慢而产量增加。这些变量的综合作用有可能提高虾青素的产量并获得增高水平的生物量。这表明每单位发酵体积可得到更高的产量，从工业生产角度来看，这是最重要的生产目标。
在含有碳源，氮源，无机盐和维生素(例如硫胺素，生物素，泛酸钙等)的培养基中进行发酵的过程。富含碳水化合物的营养物质可作为碳源，例如糊精，淀粉，葡萄糖，蔗糖，果糖或在这些糖类中的一些富含的蔬菜粉。以下物质可用作氮源：(i)有机化合物，例如酵母提取物，棉籽粉(Pharmamedia)，玉米浆(corn steep)，大豆粉，蛋白胨，酪蛋白等。或(ii)无机化合物，例如硫酸铵，磷酸二铵等。可加入到培养基中的无机盐包括一价阳离子(钠，钾，铵等)或二价阳离子(钙，镁等)的磷酸盐，硫酸盐或盐酸盐。另外，可向培养基中加入某些痕量元素，例如Cu，I，Fe，Mn，Mo，Zn等。营养物质的比例根据微生物的生长需要和产量而定。除了使用能够在24℃产生虾青素的突变株之外，发酵在温度17-22℃进行浸没式需养培养。在最初几个小时，允许培养基的pH值任意变动，然后通过加入碱将pH值控制在3.0-5.0的范围内。pH控制的起始点依赖于生长情况，通常在发酵前24小时内开始。该过程以基于获得碳源和氮源，通风大于1v/v/m(体积/体积/分钟)及搅拌速度确保最初生长阶段完成后溶氧水平高于50％的高水平起始生长为特征。通过加入碳源(一般为葡萄糖)来维持X.dendrorhous的生长，从而获得具有高特定产量的最大浓度的生物量。该目标的实现可使相对于以前已开发的技术得到每发酵罐体积更高产量。
通过以上所描述的策略，可获得具有高于70g/l生物量的发酵培养基，而且产量至少为400mg/l，这表明每生物量单位的虾青素产量高于5000ppm。所获得的生物量来自于X.dendrorhous新型菌株，可以通过分子分型方法将其与同种的其它菌株进行区分。除了筛选虾青素高产菌株，也对发酵技术进行优化以使工业上获得更大的收益。尽管事实上已经报道具有高虾青素含量的X.dendrorhous生物量的产量，但是在这些情形中该酵母在培养基中的生长非常受限(5-30g/l)。这表明为了获得大产量的类胡萝卜素而必须加工的培养基体积是非常大的。我们的结果提供了一种新的发酵方法，它不仅可以得到高产量的类胡萝卜素，而且在发酵培养基中的酵母浓度为50-100g/l。这些结果对工业生产效益和降低生产成本具有重要优势。
方案2.利用突变和筛选的方法获自X.dendrorhous VKPM Y-989的X.dendrorhous菌株的种系发生。
通过离心或过滤从培养基中分离生物量，干燥后，在鲑鱼中进行一系列生物利用度的检测。为了此目的，将所述的干生物量加入到鲑鱼的饲料中，然后将该混合物对大量鲑鱼喂食两个月。最后，检测10个所述的鲑鱼组织中虾青素和类胡萝卜素的存在。获得的结果(3.5μg/g虾青素及6.8μg/g类胡萝卜素)表明X.dendrorhous生物量能够对鲑鱼赋予鲑鱼颜色的色素的能力。
根据布达佩斯条约保藏微生物
根据布达佩斯条约的规定，已将X.dendrorhous菌株保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，Dorozhny Proezd 1，Moscow 113545(俄罗斯)，保藏号和日期如下：VKPM Y-989于13/03/1989，VKPM Y-2240于20/12/1996，VKPM Y-2259于31/01/1997，VKPM Y-2262于10/06/1997，VKPM Y-2278于06/08/1997，VKPM Y-2279于31/10/1997，VKPM Y-2410于30/10/1998，VKPM Y-2447于22/09/1999及VKPM Y-2476于06/03/2000。
以下实施例详细而无限定地描述本发明。
实施例1
X.dendrorhous的诱变策略
首先开发了一种X.dendrorhous菌株的诱变方法，对以下方面进行分析：(i)不同类型的诱变剂，(ii)诱变剂浓度，(iii)细胞浓度，(iv)温育pH及(v)处理时间。通过该方法，选择以下试剂作为诱变剂：甲磺酸乙酯(EMS)，N-甲基-N’-硝基-亚硝基胍(NTG)和紫外辐射(UVA)。
通过500ml烧瓶中向液体培养物中接种25ml R4-062-7培养基，并在17-20℃及250rpm培养24小时，从而获得待诱变的细胞悬浮液。R4-062-7培养基具有以下组成：6.2g/l酵母提取物，5.5g/l棉籽粉，70g/l葡萄糖，2g/l KH2PO4，0.4g/l K2HPO4，1.5g/l MgSO4·7H2O，2g/l (NH4)2SO4，0.2g/lNaCl，0.2g/l CaCl2，50μg/l生物素，500μg/l硫胺素及2mg/l泛酸钙，最终pH为5.8-6.0。悬浮液中的细胞浓度约为108个细胞/ml。细胞用生理盐水洗涤两次后，3000rpm，10℃离心3分钟。然后将其浓度调整为2×108个细胞/ml。
EMS诱变方法包括将108个细胞/ml的6％EMS的0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.0中于20℃，100rpm温育40-80分钟，使致死率达到90-99％。NTG诱变方法包括将含有250μg/ml NTG的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0的108个细胞/ml的溶液于20℃，100rpm温育60-120分钟，使致死率达到90-99％。诱变细胞用盐溶液洗涤三次，3000rpm，10℃离心3分钟，然后在液体培养基中进行培养，以促进其恢复。为了此目的，将其重悬在10ml YEPD培养基中，并在250ml烧瓶中17-20℃，100rpm培养10小时。YEPD培养基的组成如下：20g/l细菌蛋白胨，10g/l酵母提取物及20g/l葡萄糖，最终pH为6.0。
UVA诱变方法包括用250nm的灯在20℃，40rpm对悬浮在盐溶液中的107个细胞/ml的溶液照射5-10分钟，使致死率达到90-99％。诱变的细胞在暗处放置30分钟，然后在液体培养基中进行培养以使其恢复。为了此目的，将它们重悬在10ml YEPD中，并在250ml烧瓶中于暗处，17-20℃，100rpm培养10小时。
突变细胞接种到含有YEPDA固体培养基的培养皿上，并在17℃培养4天以获得分离的菌落。YEPDA培养基组成如下：20g/l细菌蛋白胨，10g/l酵母提取物，20g/l葡萄糖和20g/l琼脂，最终pH为6.0。接种的平皿17℃培养4天以获得分离的菌落。
实施例2
根据固体培养基上类胡萝卜素产率筛选虾青素高产的X.dendrorhous菌株的策略
将获自实施例1中所述的诱变细胞的克隆直接接种到YEPDA培养基或已加入以下物质的YEPDA培养基上：(i)改变细胞的氧化还原势的化合物或(ii)类固醇合成抑制剂。在(i)类的化合物中，特别使用的是四甲基对苯醌(100μM)及过氧化氢(5mg/l)，而在(ii)类化合物中，特别使用的是以下物质：β-紫罗酮(50μl/l)，咪唑(5mM)，二乙胺(10μM)，二甲基咪唑(5mM)，制霉菌素(1mg/l)及二苯胺(100μM)。
产自上述培养物的克隆以约3cm2划线形式再次接种到YEPDA培养基上，并在17-20℃光照培养4天。在菌株筛选程序的第一阶段可能会分离到大量表现出比亲本株更深红色的克隆。随后，亲本株的深红色阻碍根据颜色进行的直接筛选，开发了一种检测固体培养基上生长的生物量的类胡萝卜素的方法。该方法包括从每个划线中除去0.8cm2的生物量，将其重悬在1ml二甲亚砜中。用旋涡振荡仪振荡2分钟，然后在室温下，12000rpm离心5分钟提取类胡萝卜素。通过测定上清液在474nm处的吸收值估测类胡萝卜素的产量。筛选吸收值比VKPM Y-2476亲本株高的菌株，从而能够得到虾青素高产突变株AST-A1和AST-A2。
实施例3
筛选在暗处高产虾青素的X.dendrorhous菌株的策略
该方法包括在无光时估测突变株的生长能力及产生虾青素的能力。为了此目的，用诱变细胞悬浮液接种一系列YEPDA平皿，并在22℃，无光情况下培养4天。共筛选到103个颜色更深，生长更好的克隆。将这些克隆以约3cm2划线形式再次接种到YEPDA上，并在无光下，22℃培养4天。用相当于0.8cm2的每个划线的生物量接种含有10ml R4-062-7培养基的50ml烧瓶，并在无光下，20℃，250rpm培养72小时。从这些培养物中筛选到5个高产类胡萝卜素的突变株(AST-A3，AST-A4，AST-A5，AST-A6及AST-A7)，并在暗处和光照下对其发酵情况进行检测，观察到在暗处虾青素产量是亲本株VKPM Y-2476的2倍，而在光照下则与亲本株相当。
实施例4
在升高的温度条件下筛选高产虾青素的X.dendrorhous菌株的策略
该方法包括分析突变株在高于X.dendrorhous正常温度(17-20℃)的温度下的生长能力和产虾青素的能力。该程序分两步进行：首先为22℃，然后为24℃。为了此目的，将来源于VKPM Y-2476菌株并通过NTG诱变的细胞悬浮液接种到YEPDA平皿上，暗处，22℃培养6天。在该条件下，VKPM Y-2476亲本株不能生长。通过该方法，根据在22℃的生长能力分离到100个克隆。将这些克隆以约3cm2划线形式再次接种到YEPDA上，并在光照下，22℃培养4天。然后在固体培养基上估测类胡萝卜素的产量，共筛选到10个菌株，它们在液体培养基中于20℃和22℃进行发酵。最后，预筛选到4个菌株。
将4个预筛选到的菌株的细胞悬液合并，并如实施例1所述用NTG进行诱变，将诱变细胞接种到YEPDA上，并在无光下，23.5℃培养6天。通过该方法筛选到200个克隆，将这些克隆以约3cm2划线形式再次接种到YEPDA上，并在光照下，24℃培养4天。然后，在固体培养基上估测类胡萝卜素的产量，共筛选到6个菌株。当这6个菌株在液体培养基中于24℃分析其虾青素含量时，筛选到它们中的3个菌株，命名为AST-A8，AST-A9及AST-A10。
实施例5
用除葡萄糖之外的碳源能够产生虾青素的X.dendrorhous菌株的筛选策略
将获自实施例1所述的诱变细胞的克隆直接接种到已添加葡萄糖(20g/l)或蔗糖(20g/l)的YEPDA培养基上。来源于上述培养物的克隆以约3cm2划线形式再次接种到YEPDA-葡萄糖或YEPDA-蔗糖培养基上，并在光照下于17-20℃培养4天。然后如实施例2所述，在每个划线对应于0.8cm2生物量中估测类胡萝卜素，筛选其吸收值比VKPM Y-2476亲本株高的划线。通过这种方法，筛选到AST-A11，该菌株以葡萄糖或蔗糖为碳源时的虾青素产量比VKPM Y-2476更高。
实施例6
一系列具有不同虾青素产率的X.dendrorhous菌株的遗传分析
6.1.X.dendrorhous染色体外元件特征
为了比较各种X.dendrorhous野生型菌株与虾青素高产菌株，在0.8％琼脂糖凝胶上对其核酸进行分析。共对4个野生型菌株进行分析：CECT1690(也命名为ATCC 24202或CBS 5905)，CECT 11028(也命名为ATCC24203或CBS5908)，CBS 6938和ATCC 24229。作为其对应部分，对以下高产菌株进行分析：VKPM Y-989，VKPM Y-2240，VKPM Y-2259，VKPMY-2279，VKPM Y-2410和VKPM Y-2476。上述菌株的总DNA纯化后，用RNase处理，并通过电泳进行分析。结果如图1所示。可以看到，高产菌株的染色体外核酸图谱与野生型菌株的不同。菌株X.dendrorhous ATCC24229的图谱与高产菌株最为接近。
已在多种X.dendrorhous菌株中描述了染色体外遗传元件的存在；它们主要是双链RNAs(dsRNA’s)，而且已发现在某些菌株中被包裹在病毒样的颗粒(VLP)中(Castillo A.和Cifuentes V.1994.Curr.Genet.26：364-368；Pfeiffer，H.等.(1996).Curr.Genet.30：294-297)。为了检测高产菌株的染色体外元件是否是dsRNA分子，用RNase A(350ng/ml)在两个不同的盐浓度下对它们进行处理：0.01xSSC和2xSSC。另外，制备了一个不用RNase A在0.01xSSC溶液中处理的对照样品。所述样品在37℃温育30分钟，然后在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳分析。如图2所示，用RNase A温育后，没有染色体外元件发生降解，因此推断所述核酸不是dsRNA分子。
为了检测所述染色体外元件的本质，用如下各种核酸修饰酶处理X.dendrorhous Y-2410的总DNA样品：RNase A，RNase H，核酸酶S1，DNaseI和限制性内切酶BamHI。结果如图3所示。用RNase A消化验证了以前的结果。但是，(i)泳道9中的染色体外元件和总DNA均完全消失(DNaseI处理)及(ii)对限制性内切酶BamHI消化的敏感性(泳道10)的结果表明它们是DNA分子。
然后，在菌株X.dendrorhous CBS 6938和X.dendrorhous Y-2410中测定了染色体外元件的构型。为了此目的，通过在1％琼脂糖凝胶上双向电泳对样品总DNA进行分析。如图4所示，两种菌株的染色体外元件的模式在凝胶的二维方向上是相同的，即对应其大小的DNA片段迁移。这表明在X.dendrorhous中检测到的DNA分子具有线性构型。从这些结果得出结论被分析菌株的染色体外元件是由双链DNA形成的线性质粒。
6.2.通RAPD技术检测一系列X.dendrorhous菌株的遗传多态性
本目标是通过PCR随机扩增它们的DNA，检测不同X.dendrorhous菌株的遗传多样性的存在。该技术称为RAPD(随机扩增多态DNA)。多态性是由于存在(i)引物结合序列的改变(例如点突变)，(ii)DNA序列的改变(例如插入和倒置)，从而使片段大小发生改变，(iii)改变扩增DNA片段大小的插入，(iv)引物结合位点的消失，等等而进行检测。本研究包括6.1部分所述的4个野生型菌株和6个高产菌株。用于分析的引物是以前所述(Williams J.G.等.1990.Nucleic Acids Res.18：6531-6535)的引物5’-CATGTGTGGCGGGCA-3’，其以前已用于X.dendrorhous中(Meyer P.S.等.1994.Biotechnol.Tech.8：1-6)。总DNA于96℃加热5分钟进行变性，然后在GeneAmp PCR System 2400(Perkin Elmer)中进行终体积为50μl的PCR反应。在如下条件下进行35个循环扩增：30℃1分钟进行成环反应，72℃2分钟进行扩增反应及92℃1分钟进行变性反应。在最后一个循环中，扩增时间为72℃延伸10分钟，然后在4℃冷却。通过本技术扩增的DNA片段进行1％琼脂糖电泳，结果如图5所示。可以看到，虾青素高产菌株产生相同的图谱，而X.dendrorhous菌株ATCC 24229(它与6.1部分分析的高产菌株最接近)的扩增图谱与高产菌株不同。从该实验得出结论，虾青素高产菌株在遗传上不同于所有被分析的野生型菌株。
实施例7
通过X.dendrorhous的烧瓶发酵生产虾青素的方法
首先，接种含R3-02-5培养基的斜面，在17-20℃培养5天。R3-02-5培养基组成如下：细菌蛋白胨6.5g/l，酵母提取物2g/l，KH2PO4 0.4g/l，K2HPO4 1.3g/l，MgSO4·7H2O 1.3g/l，(NH4)2SO4 1.3g/l，NaCl 0.1g/l，CaCl2 0.1g/l，葡萄糖50g/l，琼脂20g/l，H3BO3 500μg/l，CuSO4 40μg/l，KI 100μg/l，FeCl3 200μg/l，MnSO4H2O 400μg/l，Na2MoO4·2H2O 200μg/l，ZnSO4·7H2O 400μg/l，pH6.0。微生物已生长后，将每个斜面重悬在3ml盐溶液中，该悬浮液用于以每瓶1.5ml悬浮细胞的比例接种含25mlR4-062-7培养基的500ml烧瓶。并在17-20℃，250rpm培养接种物48小时。
接种物用于以每瓶2.5ml的比例接种含25ml R4-20培养基的500ml烧瓶(3个缺口)。R4-20培养基组成如下：酵母提取物6.2g/l，棉籽粉5.5g/l，KH2PO4 2g/l，K2HPO4 0.4g/l，MgSO4·7H2O 1.5g/l，(NH4)2SO4 2g/l，NaCl 0.2g/l，CaCl2 0.2g/l，CaCO3 1.6g/l，葡萄糖200g/l，生物素50μg/l，硫胺素500μg/l，泛酸钙2mg/l，pH5.8-6.0。将这些烧瓶在光照下17-20℃培养5-7天。在该条件下VKPM Y-2476菌株的虾青素产率约为150mg/l及4000ppm，生物量为37g/l。
实施例8
通过改良培养基提高虾青素产量
为了提高虾青素产量，检验向培养基中添加各种化合物：(i)释放自由基的试剂，如四甲基对苯醌(25-50μM)，(ii)在其他产类胡萝卜素的微生物中作为胡萝卜素形成作用(carotenogenesis)诱导剂的化合物，例如视黄醛(35μM)和三孢酸(50-100μg/ml)，(iii)作为碳氢链前体的分子，例如用谷氨酸盐(5.5mg/ml)代替棉籽粉。如实施例7所述进行发酵，结果如图6所示。在最好条件下获得的虾青素产量为225mg/l及5000ppm，生物量为45g/l。可以看到，相对于原始培养基R4-20所有这些化合物均可使产量提高。
实施例9
开发增加虾青素特定产量的培养基
为了提高虾青素特定产量(每g生物量虾青素的mg数)，使用Weuster-Botz D.开发的基于遗传法则的GALOP软件(Institut fürBiotechnologie，Forschungszentrum Jülich GmbH，Jülich，德国)开发一种培养基。该设计是基于保持培养基中某些组分(KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，CaCl2及CaCO3)的浓度恒定，而分析其他组分(葡萄糖，甘油，蛋白胨，固体玉米浆(corn steep solid)(CSS)，硫酸铵及大豆油)的可变浓度。使用GALOP软件，设计了7种培养基，它们的组分相同，但浓度是变化的。表I所示的是在第四代分析的培养基组成。
表I
 培养基   葡萄糖50％(ml) 甘油50％(μl)   蛋白胨10％(ml)   CSS10％(ml) (NH4)2SO410％(ul)  大豆油(ml)  盐25x(ml)   水(ml)
  P   10.0   5   1.5   1.4   500   0.1   3   8.50
  1   9.9   2621   1.6   1.4   572   0.1   3   8.50
  2   6.7   1987   1.5   1.4   1746   1.6   3   7.06
  3   10.0   5   1.5   0.2   762   0.1   3   9.43
  4   6.9   325   1.9   1.7   117   0.1   3   10.96
  5   10.0   639   1.5   0.4   1778   0.1   3   7.58
  6   9.9   4683   1.9   0.2   508   0.1   3   4.76
每升25x盐溶液包括：50g KH2PO4，10g K2HPO4，37.5gMgSO4·7H2O，5g NaCl，5g CaCl2和40g CaCO3。图7所示的是对其组成进行连续4代优化后用这些培养基获得的特定产量的结果。可以看到，我们成功地开发了一种可提高X.dendrorhous菌株Y-2410虾青素特定产量从2096ppm(μg/g)(培养基P)到4490ppm(培养基5)而没有降低绝对产量(mg/l)的培养基。
实施例10
通过照射培养物提高虾青素产量
为了开发提高虾青素产量的方法，当改变使用的光照的波长时在烧瓶中发酵Y-2476菌株。为了此目的，如实施例7所述进行了一系列发酵。烧瓶在17-20℃有光或无光下培养6天。另外，检测了不同类型的光线：白光，蓝光，绿光，黄光和紫外光。获得的结果如图8A所示。可以看到，相对于在黑暗中进行发酵，白光和紫外光产生最显著增加的产量。
另外，对持续光照或6，12或24小时光照/黑暗循环条件在烧瓶发酵中的菌株Y-2476的虾青素产量进行比较。均用白光和紫外光进行这些循环。结果如图8B所示。可以看到，6小时的紫外光/黑暗循环对产量的提高最显著。
实施例11
在10升发酵罐中发酵X.dendrorhous生产虾青素的方法
烧瓶的接种体(具有200ml R4-062-7培养基的2l烧瓶，实施例1)以来自每瓶一支斜面的细胞进行接种，并在250rpm具有轨道激发(orbitalagitation)的光照下20℃培养48小时。通过该方法，培养基得到7％生物量(以沉淀细胞体积，PCV表示)，pH约为3。然后，用具有0.4％(v/v)接种物的R4-10-3P培养基接种用于营养生长的中间发酵罐。每升R4-10-3P培养基组成如下：酵母提取物6.2g，棉籽粉5.5g，葡萄糖100g，KH2PO42g，K2HPO4 0.4g，MgSO4·7H2O 1.5g，PO4H(NH4)2 5g，NaCl 0.2g，CaCl2·2H2O 0.4g及硫胺素0.5mg，终pH为5.8-6.0。营养阶段是在20℃培养48小时，充分搅拌以维持至少50％溶氧(DO2)，通风为1.5vvm(体积/体积/分钟)，并用浓度为12.5％的氨水控制pH为4.5。营养阶段获得的生长达到30-35％生物量(以PCV表示)。在具有R4-10培养基的硼硅酸盐玻璃发酵罐中进行生产阶段。相对于接种后体积(9升)其组成如下：酵母提取物6.2g/l，棉籽粉5.5g/l，KH2PO4 2g/l，K2HPO4 0.4g/l，MgSO4·7H2O 1.5g/l，(NH4)2HPO4 5g/l，NaCl 0.2g/l，CaCl2·2H2O 0.2g/l，微量元素溶液2ml/l及聚丙二醇2025 0.9g/l，用NaOH调节pH为5.4。微量元素溶液组成如下：硼酸1mg，钼酸钠二水合物0.4mg，硫酸锌七水合物0.8mg，氯化铁七水合物0.4mg，硫酸铜五水合物0.8mg，碘化钾0.2mg，硫酸锰四水合物0.8mg。将培养基体积调整为6升，灭菌后，添加1.05升葡萄糖糖浆(使接种后葡萄糖浓度为100g/l)和1ml/l维生素溶液(生物素0.1g/l，硫胺素1g/l及泛酸钙4g/l)。用2升营养阶段培养物接种发酵罐，并调整至下述营养阶段培养条件：(I)通风：1.5vvm。(II)搅拌：700rpm，直至18小时，然后增加到1200rpm以维持DO2＞50％。(III)压力：0kg/cm2。(IV)温度：20℃，直至72小时，然后为17℃。(V)pH：用12.5％氨水控制底线为4.5，直至72小时，然后降低底线到3.0。(VI)DO2：通过搅拌控制底线为50％。(VII)光照：将6个荧光管安装在发酵罐上表面，总功率为80瓦。
进行下述添加：(I)根据以下添加时间表的50％葡萄糖溶液(以每小时每升纯葡萄糖克数表示)：0-25小时为0，26-51小时为2.5，52-116小时为2.3及117-212小时为1.6。添加的50％葡萄糖的总消耗为6.47升。(II)无水乙醇：开始72小时每隔24小时0.5％。总消耗为270ml。(III)消泡剂：聚丙二醇(PPG)，总消耗为200ml。(IV)用于控制pH的12.5％氨水，总消耗为464ml。
另外，为了维持工作体积为10升，需要进行部分收获。部分收获的总体积为2.6升，而发酵罐的终体积为8.5升。在212小时终止发酵，生物量为32％(以PCV表示)，其相当于84g/l(以干重表示)。通过HPLC测定的虾青素浓度为425mg/l，从而干生物量中虾青素浓度超过5000ppm。累积的类胡萝卜素总浓度为623mg/l(7416ppm)。发酵进展如图9所示。
实施例12
在800升发酵罐中发酵X.dendrorhous生产虾青素的方法
在2000ml锥形瓶中以每瓶200-400ml比例制备接种物培养基(R4-062-7，实施例1)。灭菌后，将它们接种X.dendrorhous，然后在20℃，250rpm培养48小时。将接种物无菌条件下以0.4％(v/v)比例转移到含有R4-10-2培养基用于营养生长的中间发酵罐中，每升培养基组成如下：酵母提取物6.2g，Pharmamedia 5.5g，葡萄糖糖浆(70％w/w)143g(单独灭菌)，固体玉米浆24g，磷酸二氢钾2g，磷酸一氢钾0.4g，硫酸镁七水合物1.5g，磷酸二铵5g，氯化钠0.2g，氯化钙二水合物0.4g，消泡剂0.1g，盐酸硫胺素1mg，硼酸1mg，钼酸钠水合物0.4mg，硫酸锌七水合物0.8mg，氯化铁七水合物0.4mg，硫酸铜五水合物0.8mg，碘化钾0.2mg，硫酸锰四水合物0.8mg。其最初pH为5.6。营养阶段在17℃培养54小时，通风为1.5v/v/m及头压为1个大气压，直到pH低于3.5。然后在R4-10-2培养基中进行第二个生长阶段，直到生物量达到30-35％(以PCV表示)。含有R4-10-2培养基的生产发酵罐(800升容量)用20％营养培养物接种。
在下述温度程序下进行发酵：19℃16小时，18℃16到60小时及17℃至结束。搅拌在150和275rpm之间变动，通风为1.5v/v/m，头压维持在0.5atm。用25％氨水控制pH，高于4.5保持24小时，高于3.5保持24-60小时，高于3.0至结束。溶氧维持在高于50％的范围，必要时增加搅拌速率。在发酵过程中，根据以下程序补加葡萄糖(以kg/m3/小时表示)：0-24小时为0，24-48小时为4.41，48-70小时为3.77，70-94小时为2.08，94-184小时为2.60。
另外，必要时进行以下操作：(i)添加消泡剂，及(ii)为了维持发酵罐的体积约为总容量75％，进行部分收获。通过浸没在包含6个54瓦荧光管(总量为324W)的培养物中的1米长硼硅酸盐管光照培养物。发酵持续184小时，结束时获得的虾青素产量为400mg/l，生物量为90g/l(以干重表示)，这表明虾青素在干生物量中的浓度高于4400ppm。
添加50μM四甲基对苯醌可提高约15-20％虾青素产量。
实施例13
回收富含虾青素生物量的X.dendrorhous及分析在鲑鱼中生物利用度的方法
如在上面实施例中所述的纯培养物中发酵的酵母X.dendrorhous从发酵罐中转移到冷冻容器中，将其保存直至通过离心或过滤进行回收。培养基的初浓度通过离心或过滤单元而被持续进行，产生浓缩的培养基。为了在加工生物量的过程中保护虾青素，在某些情况下，向浓缩的生物量中加入抗氧化剂乙氧基喹。然后，通过传统方法对浓缩的生物量进行干燥，在这种条件下，大部分细胞在加工过程中没有被破坏。最后，将干燥的生物量贮存在避光，避氧和避潮条件下。
干生物量与渔场所用的饲料制品进行混合，在该条件下，混合物中虾青素浓度为75ppm。然后混合物挤压成圆柱或丸粒状形式，并对大量鲑鱼喂食2个月。然后随机选取10条鲑鱼，杀死它们，并确定其肌肉组织中虾青素和类胡萝卜素的含量。此外，对另外10条没有喂食上述丸粒的对照鲑鱼分析虾青素和类胡萝卜素的含量。获得的平均值如下表所示：
喂食干生物量的鲑鱼  未喂食干生物量的对照鲑鱼
虾青素(μg/g) 3.5  0.0
类胡萝卜素(μg/g) 6.8  0.1
生物利用度测试结果表明，存在于X.dendrorhous干生物量中的虾青素和其他类胡萝卜素转移到鲑鱼组织中，使它们具有吸引人的鲑鱼颜色。
附图详述
图1.琼脂糖凝胶照片，所示的是具有不同虾青素产量的各种X.dendrorhous菌株的总DNA。泳道1：DNA分子量标准，其条带具有如下以碱基对表示的大小：23 130，9416，6557，4361，2322，2027，1353，1078，872，603和300。泳道2：X.dendrorhous CECT1690(也命名为ATCC24202或CBS5905)。泳道3：X.dendrorhous CECT11028(也命名为ATCC24203或CBS5908)。泳道4：X.dendrorhous CBS6938。泳道5：X.dendrorhousATCC24229。泳道6：X.dendrorhous Y-989。泳道7：X.dendrorhous Y-2240。泳道8：X.dendrorhous Y-2259。泳道9：X.dendrorhous Y-2279。泳道10：X.dendrorhous Y2410。泳道11：X.dendrorhous Y-2476。总DNA(大小大于23kb)如图的上方所示，染色体外元件在其下方(大小在2.3到9kb之间)。
图2.琼脂糖凝胶照片，所示的是在三种不同条件下各种X.dendrorhous菌株的总DNA：(A)对照(0.01xSSC，未用RNase A处理)。(B)用350ng/ml RNAse A在0.01xSSC中进行处理。(C)用350ng/mlRNAse A在2xSSC中进行处理。泳道1-3：X.dendrorhous CECT1690(也命名为ATCC24202或CBS5905)。泳道4-6：X.dendrorhous CECT11028(也命名为ATCC24203或CBS5908)。泳道7-9：X.dendrorhous CBS6938，泳道10-12：X.dendrorhous ATCC24229。泳道13-15：X.dendrorhous Y--989。泳道16-18：X.dendrorhous Y-2240。泳道19-21：X.dendrorhousY-2410。泳道22-24：X.dendrorhous Y2476。泳道25：DNA分子量标准，其条带具有如下以碱基对表示的大小：23 130，9416，6557，4361，2322和2027。
图3.琼脂糖凝胶照片，所示的是用各种核酸修饰酶处理的X.dendrorhous Y-2410总DNA。泳道1：DNA分子量标准，其条带具有如下以碱基对表示的大小：23 130，9416，6557，4361，2322，2027，1353和1078。泳道2：未处理的对照DNA。泳道3：用RNase A在2xSSC中处理。泳道4：用RNase A在1xSSC中处理。泳道5：用RNase A在0.02xSSC中处理。泳道6：用RNase A在0.01xSSC中处理。泳道7：用RNase H进行处理。泳道8：用核酸酶S1进行处理。泳道9：用DNase I进行处理。泳道10：用限制性内切酶BamHI进行消化。
图4.左边：菌株X.dendrorhous CBS6938(泳道1)和X.dendrorhousY-2410(泳道2)的琼脂糖凝胶电泳照片。中间：对应于X.dendrorhous CBS6938泳道1的双向电泳。右边：对应于X.dendrorhous Y-2410泳道2的双向电泳。
图5.琼脂糖凝胶照片，所示的是通过RAPD(随机扩增多态DNA)技术扩增的各种X.dendrorhous菌株的DNA。泳道1和12：DNA分子量标准，其条带具有如下以碱基对表示的大小：1353，1078，872，603和300。泳道2：X.dendrorhous CECT1690(也命名为ATCC24202或CBS5905)。泳道3：X.dendrorhous CECT11028(也命名为ATCC24203或CBS5908)。泳道4：X.dendrorhous CBS6938。泳道5：X.dendrorhous ATCC24229。泳道6：X.dendrorhous Y-989。泳道7：X.dendrorhous Y-2240。泳道8：X.dendrorhous Y-2259。泳道9：X.dendrorhous Y-2279。泳道10：X.dendrorhous Y-2410。泳道11：X.dendrorhous Y-2476。
图6.向发酵培养基中添加以下化合物，烧瓶发酵菌株X.dendrorhousY-2476的虾青素产量(纵坐标)：四甲基对苯醌-D-，视黄醛-R-，三孢酸-AT-或谷氨酸盐-GT-。产量以相对于标准条件-P-(100％)的百分比表示。
图7.在通过基于遗传法则的GALOP程序设计的7种不同培养基中来自X.dendrorhous Y-2410的特定虾青素产量。命名为P，1，2，3，4，5和6的培养基显示在横坐标上。纵坐标为以ppm(μg/g)表示的特定产量的值。
图8.烧瓶发酵菌株X.dendrorhous Y-2476的虾青素产量。(A)用不同类型的光照射培养物：暗处-O-，白光-B-，蓝光-A，绿光-V-，黄光-AM-及紫外光-UV-；(B)用白光或紫外光的不同循环照射培养基：持续白光-BP-；持续UVA -UVAP-；白光24小时-B24h-；UVA 24h-；白光12小时-B12h-；UVA 12h；UVA 6h。产量以相对于标准条件(100％)的百分比表示。
图9.在10升发酵罐中发酵菌株X.dendrorhous Y-2476的虾青素产量变化。纵坐标(左)：PCV(％)■，DO2(％)7—及葡萄糖(g/l)◆。纵坐标(右)：虾青素HPLC(mg/l)·，类胡萝卜素(mg/l)▲，横坐标：时间，小时。

Claims (26)

1.一种通过发酵生产虾青素的方法，其特征在于培养在说明书方案2中所示的X.dendrorhous菌株或其突变株或在烧瓶中发酵6-7天至少能产生4000ppm虾青素的转化衍生株。
2.权利要求1的发酵方法，其特征在于在工业发酵中发酵7-9天，虾青素产量至少达到5000ppm。
3.权利要求1和2的发酵方法，其特征在于在发酵过程中加入四甲基对苯醌。
4.权利要求3的发酵方法，其特征在于加入的四甲基对苯醌浓度为25-50μM。
5.权利要求1和2的发酵方法，其特征在于在发酵过程中加入视黄醛。
6.权利要求5的发酵方法，其特征在于加入的视黄醛浓度为35μM。
7.权利要求1和2发酵方法，其特征在于在发酵过程中加入三孢酸。
8.权利要求7的发酵方法，其特征在于加入的三孢酸浓度为50-100μg/ml。
9.权利要求1和2的发酵方法，其特征在于在发酵过程中加入谷氨酸盐。
10.权利要求9的发酵方法，其特征在于加入的谷氨酸盐浓度为5.5mg/ml。
11.权利要求1和2的发酵方法，其特征在于在发酵过程中使用说明书表I中描述的培养基5。
12.权利要求11的发酵方法，其特征在于在烧瓶中发酵6-7天，产生4490ppm的虾青素。
13.权利要求1到12的发酵方法，其特征在于在发酵过程中照射发酵培养基。
14.权利要求13的发酵方法，其特征在于所用照射源是白光。
15.权利要求13的发酵方法，其特征在于所用照射源是紫外光。
16.权利要求13到15的发酵方法，其特征在于在发酵开始至结束进行照射，优选地从40至200小时。
17.权利要求16的发酵方法，其特征在于使用6小时光照/黑暗循环。
18.权利要求1到17任一项的发酵方法，其特征在于：
(a)接种X.dendrorhous的接种物，
(b)在20℃培养X.dendrorhous接种物48小时，
(c)用约0.4％(v/v)接种物相接种X.dendrorhous的原代培养物相，
(d)在17-20℃培养X.dendrorhous原代培养物相48-54小时，
(e)每个发酵罐接种以20％(v/v)X.dendrorhous原代培养物相，
(f)在18-20℃培养60-72小时和在17℃另外培养5-7天进行发酵。
19.权利要求18的发酵方法，其特征在于在7-9天产生至少425mg/l虾青素。
20.权利要求18和19的发酵方法，其特征在于产生的生物量浓度至少为每升发酵培养基50克细胞干重。
21.权利要求20的发酵方法，其特征在于产生的生物量浓度至少为每升发酵培养基80克细胞干重。
22.权利要求18到21的发酵方法，其特征在于在发酵7-9天每克细胞干重产生至少5000μg虾青素。
23.通过权利要求1到22所述的发酵方法获得的具有营养和着色价值的X.dendrorhous生物量在人和动物食品中的应用。
24.权利要求23的生物量，其特征在于它包括：
a)浓度至少为5000μg/g的虾青素；
b)浓度至少为7400μg/g的总类胡萝卜素；
c)浓度至少为15％的蛋白质，及
d)浓度至少为15％的碳水化合物。
25.用于动物食品的化合物，其由权利要求23和24的生物量组成或包含权利要求23和24的生物量。
26.用于人食品的化合物，其由权利要求23和24的生物量组成或包含权利要求23和24的生物量。
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