CN106916762B

CN106916762B - 枝鞘藻及其应用

Info

Publication number: CN106916762B
Application number: CN201511001264.XA
Authority: CN
Inventors: 刘国祥; 胡强; 王宇; 胡征宇
Original assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd; Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd; Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2015-12-28
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2035-12-28
Also published as: CN106916762A

Abstract

本申请涉及微藻工业应用领域，具体而言，涉及枝鞘藻(Oedocladium sp.)及其应用。

Description

枝鞘藻及其应用

发明领域

发明背景

微藻细胞富含糖、蛋白质、脂肪、维生素、色素和生物活性物质、和微量元素等多种高附加值的物质，正在成为人类食品、医药、染料、精细化工领域的重要材料来源，具有广阔的应用前景。

在利用微藻进行工业生产的过程中，微藻生物质的收获、干燥及目标产物的分离均为高耗能过程。目前针对单细胞微藻的收获方式有沉淀和絮凝、气浮、过滤、离心、生物收获等，这些方式能耗巨大，影响了生产系统的经济性。缺乏易于收获的藻类是发展藻类工业应用所急需克服的障碍。

类胡萝卜素在单细胞绿藻中的合成已经有较多的研究，如雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)中虾青素的合成(Margalith,P.Z.,1999,Production ofketocarotenoids by microalgae.Appl.Microbiol.Biotechnol.51:431–438)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)中β-胡萝卜素的合成(DROKOVA IH,1961,The alga Dunaliellasalina as a source of fl-carotene,Ukr Bot Zh 18:110)。

发明内容

本发明涉及从自然环境中分离到的一种新的枝鞘藻。本发明还对所分离的枝鞘藻的培养条件进行了优化。本发明的枝鞘藻易于收获，适用于工业化生产，并且可用于生产类胡萝卜素，尤其是虾青素。

本发明提供了一种枝鞘藻(Oedocladium sp.)，其基因组中包含选自以下的特征序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9及其任意组合。在一具体实施方式中，本发明的枝鞘藻是以保藏号CGMCC No.11619保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枝鞘藻TB19。

本发明还提供了一种培养本发明的枝鞘藻的方法，其中在10-80μmol·m^-2·s^-1，优选40μmol·m^-2·s^-1的光照强度下，以及在15℃-33℃，优选28℃的温度下进行所述培养。在一些实施方式中，本发明的枝鞘藻可以使用BBM培养基进行培养。在一些实施方式中，所述培养可以在12h/12h、14h/10h或16h/8h的光暗周期下进行。在一些实施方式中，所述培养可以进行大约9-21天或21天以上，优选进行大约21天或以上。

本发明还涉及枝鞘藻在制备类胡萝卜素尤其是虾青素中的应用。

因此，本发明还提供了一种生产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：a)在适宜类胡萝卜素产生的条件下培养本发明的枝鞘藻；b)收获步骤a)所培养的枝鞘藻；和c)从步骤b)所收获的枝鞘藻中提取类胡萝卜素。在一些实施方式中，根据本发明的方法产生的类胡萝卜素是虾青素。在一些实施方式中，步骤a)的培养可以在10-80μmol·m^-2·s^-1，优选40μmol·m^-2·s^-1的光照强度下，以及在15℃-33℃，优选28℃的温度下进行。在一些实施方式中，步骤a)的培养使用BBM培养基进行。在一些实施方式中，步骤a)的培养可以在12h/12h、14h/10h或16h/8h的光暗周期下进行。在一些实施方式中，步骤a)的培养可以进行大约9-21天或21天以上，优选进行大约21天或以上。

本发明还涉及一种组合物，其包含本发明的枝鞘藻的细胞和/或本发明的枝鞘藻的提取物。在一些实施方式中，所述枝鞘藻的提取物包含类胡萝卜素，优选虾青素。本发明的组合物可以是药物组合物、食品组合物、营养补充剂或饲料。

附图说明

图1示出NCBI同源性检索的结果。A：基于SSU rDNA的检索相似度最高的比对结果，Query为TB19藻株，Sbjct为勃氏枝鞘藻(Oedocladium prescottii)；B：基于rbcL cpDNA的检索相似度最高的比对结果，Query为TB19藻株，Sbjct为Oedocladium carolinianum；C：基于ITS rDNA的检索相似度最高的比对结果，Query为TB19藻株，Sbjct为勃氏枝鞘藻(Oedocladium prescottii)。

图2示出系统进化分析的结果。A：基于ITS rDNA序列矩阵构建的鞘藻目最大似然树；B：基于SSU rDNA序列矩阵构建的鞘藻目最大似然树；C：基于rbcL cpDNA序列构建的鞘藻目最大似然树。灰色标记的为藻株TB19。

图3示出不同光照条件对枝鞘藻TB19藻株生长的影响。A：不同光照强度对TB19生物量(干重)的影响；B：不同光照强度下培养21天的最终收获生物量和生物量生产率。

图4示出不同光照条件对枝鞘藻色素含量的影响。A：不同光照强度对叶绿素含量的影响；B：不同光照强度对类胡萝卜素含量的影响。

图5示出不同温度条件对枝鞘藻TB19藻株生长的影响。

图6示出不同温度条件对枝鞘藻色素含量的影响。A：不同培养温度对叶绿素含量的影响；B：不同培养温度对类胡萝卜素含量的影响。

图7示出从枝鞘藻TB19细胞提取的色素的HPLC图谱。

具体实施方式

本发明人从自然环境中意外地分离到一株新的丝状绿藻，命名为TB19。形态学鉴定显示TB19具备枝鞘藻属物种(Oedocladium sp.)的特征。进一步使用SSU rDNA、ITS rDNA和rbcL cpDNA的分子生物学鉴定显示TB19与勃氏枝鞘藻(Oedocladium prescottii)及Oedocladium carolinianum最相似，证实其属于枝鞘藻属物种。

枝鞘藻是一种分枝丝状藻类，属于绿藻门(Chlorophyta)，鞘藻目(Oedogoniales)，鞘藻科(Oedogoniaceae)，枝鞘藻属(Oedocladium)。本发明的枝鞘藻具有分枝多、个体大等特点，因而易于收获，在工业上应用能降低生产能耗和运行成本。

因此，在第一方面，本发明提供了一种枝鞘藻(Oedocladium sp.)，其基因组中包含选自以下的特征序列：SEQ ID NO:7(SSU rDNA)、SEQ ID NO:8(ITS rDNA)、SEQ ID NO:9(rbcL cpDNA)及其任意组合。本发明的枝鞘藻含有类胡萝卜素，尤其是虾青素。因此，本发明的枝鞘藻可以用于生产类胡萝卜素，尤其是虾青素。

本发明所分离的枝鞘藻TB19以保藏号CGMCC No.11619于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。

本发明人还通过实验确定了用于培养本发明的枝鞘藻的合适的条件，例如光照强度、培养温度、培养基、光暗周期和培养时间等等。

从而，在第二个方面，本发明提供了一种培养本发明的枝鞘藻的方法。

在一个实施方式中，本发明的枝鞘藻在10-80μmol·m^-2·s^-1的光照强度下进行培养。优选地，本发明的枝鞘藻在40μmol·m^-2·s^-1的光照强度下进行培养。在40umol·m^-2·s^-1光强下，可以使得本发明的枝鞘藻实现较佳的营养生长，并且能耗较低。

在一些实施方式中本发明的枝鞘藻在15℃-33℃的温度下进行培养。优选地，本发明的枝鞘藻在28℃的温度下进行培养。在28℃下，可以使得本发明的枝鞘藻实现较佳的营养生长，并且能耗较低。

本发明的枝鞘藻可以使用本领域常用于培养藻类的培养基进行培养。在一些实施方式中，使用BG-11培养基。在另一些实施方式中，使用BBM培养基(配方见如下实施例2)。

在一些实施方式中，本发明的枝鞘藻在12h/12h的光暗周期下进行培养。在另一些实施方式中，本发明的枝鞘藻在14h/10h的光暗周期下进行培养。在另一些实施方式中，本发明的枝鞘藻在16h/8h的光暗周期下进行培养。

本发明的枝鞘藻可以在上述条件下长期培养，例如，可以培养大约3天、大约6天、大约9天、大约12天、大约15天、大约19天、大约21天或甚至21天以上，优选培养大约21天或以上。

通过对本发明的枝鞘藻的色素进行分析，本发明人出乎意料地发现本发明的枝鞘藻含有大量的类胡萝卜素。其中的类胡萝卜素主要是酮类类胡萝卜素，尤其是虾青素，并且主要以类胡萝卜素酯的形式存在。并且定量分析表明，本发明的枝鞘藻中的虾青素的含量可达1.6％或更高(干重百分比)。因此，出乎意料地，本发明的枝鞘藻可以用于工业上生产类胡萝卜素，尤其是虾青素。

因此，在第三个方面，本发明提供了本发明的枝鞘藻在制备类胡萝卜素中的应用，优选地，所述类胡萝卜素是虾青素。

相应地，本发明在第四个方面提供了一种生产类胡萝卜素的方法，其包括以下步骤：

a)在适宜类胡萝卜素产生的条件下培养本发明的枝鞘藻；

b)收获步骤a)所培养的枝鞘藻；和

c)从步骤b)所收获的枝鞘藻中提取类胡萝卜素。

在一些实施方式中，根据本发明的方法所产生的类胡萝卜素是虾青素。

在一些实施方式中，其中步骤a)中使用BBM培养基培养所述枝鞘藻。

在一些实施方式中，其中步骤a)中所述培养在10-80μmol·m^-2·s^-1，优选40μmol·m^-2·s^-1的光照强度下进行。

在一些实施方式中，其中步骤a)中所述培养在15℃-33℃，优选28℃的温度下进行。

在一些实施方式中，其中步骤a)中所述培养在12h/12h的光暗周期下进行。在另一些实施方式中，其中步骤a)中所述培养在14h/10h的光暗周期下进行。在另一些实施方式中，其中步骤a)中所述培养在16h/8h的光暗周期下进行。

在一些实施方式中，其中步骤a)中所述培养进行大约3天、大约6天、大约9天、大约12天、大约15天、大约19天、大约21天或甚至21天以上，优选进行大约21天或以上。

在一些实施方式中，步骤c)中用有机溶剂进行所述提取。在一些实施方式中，所述有机溶剂是丙酮。在另一些实施方式中，所述有机溶剂是甲醇:三氯甲烷溶液，优选1:3的甲醇:三氯甲烷溶液。

在第五方面，本发明还提供了一种组合物，其包含本发明的枝鞘藻的细胞和/或本发明枝鞘藻的提取物。

在一些实施方式中，所述枝鞘藻的提取物通过使用有机溶剂从本发明的枝鞘藻的细胞中提取。在一些实施方式中，所述有机溶剂是丙酮。在另一些实施方式中，所述有机溶剂是甲醇:三氯甲烷溶液，优选1:3的甲醇:三氯甲烷溶液。

在一些实施方式中，所述枝鞘藻的提取物包含类胡萝卜素，优选虾青素。

在一些实施方式中，本发明的组合物可以是药物组合物、食品组合物、营养补充剂或饲料。

实施例

实施例1：枝鞘藻藻株的分离、纯化及鉴定

1.1藻株的采集、分离及纯化：

使用镊子夹取带有土壤基质的藻标本，保存在封口袋中并带回实验室处理。体视镜下取藻标本观察；使用接种针挑取单根藻丝接种于半固体BG-11培养基(Rippka R,Deruelles J,Waterbury JB,Herdman M&Stanier RY(1979)Generic assignments,strainstories and properties of pure cultures of cyanobacteria.J Gen Microbiol 111:1–61)；置于20℃，40μmolm-2s-1，光暗周期为16:8的条件下培养；两周后体视镜下检测接种的藻丝生长情况，并挑取培养皿上长势良好的藻丝接种于新的半固体BG-11培养基上；重复此过程至实现单种培养。本发明中对所获得的单种藻株命名为TB19。

1.2所分离的藻株的形态学鉴定：

取样本体视镜下使用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0)清洗藻丝，后装片置于200和400倍显微镜下观察所分离的藻株的形态特征：植物体为分枝丝状体，无透明洋葱头状毛；构成枝鞘藻的藻丝可分为两类，由狭长细胞构成的假根状分枝和较粗短细胞构成的直立分枝；假根状藻丝多单侧分枝，直立枝藻丝分枝多不规则；藻丝细胞均为圆柱状，假根状枝细胞偶有不规则弯曲。藻丝顶端细胞均较钝圆，偶可见鞘藻类特有的环状顶冠；藻丝横隔处可见鞘藻类所特有的由细胞分裂而产生的环带。假根状枝细胞大小约为16.1(13.4-19.2)×61.9(45.5-85.1)μm，长宽比约为3.9(2.6-5.9)；直立枝藻丝细胞大小约为20.9(16.9-26.6)×29.6(17.5-42.1)μm，长宽比约为1.5(0.7-2.2)。色素体周生，环绕整个原生质体，具多个小的蛋白核。积累大量类胡萝卜素而呈现翠绿色至橘红色。未观察到繁殖结构。

在已知的丝状绿藻类群中，营养藻丝顶端具环状顶冠以及横隔处具透明环带的藻类为鞘藻目鞘藻科中的藻类，而在鞘藻科中，具有丝状分枝但不具透明洋葱头状毛结构且生境为气生的为枝鞘藻属中的种类。依据《中国淡水藻志-鞘藻目专志》记录及描述，本发明的TB19藻株的生境及形态特征完全符合枝鞘藻属的特征。

1.3所分离的藻株的分子鉴定：

体视镜下挑取已纯化培养且长势良好的TB19藻株的藻丝置于1.5mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.0)中，后加入0.3-0.5mL直径0.5mm的玻璃破碎珠。使用珠式研磨器(Model3110BX,Biospec Products,Bartlesville,Oklahoma,USA)破碎细胞壁；处理过后的细胞裂解液按照Axygen(Axygen Biotechnology,Hangzhou,China)植物全基因组试剂盒说明书操作提取TB19藻株的基因组DNA。使用如下表1所示引物扩增SSU rDNA、ITS rDNA及rbcLcpDNA：

表1.分子鉴定中使用的靶和扩增引物

50μL扩增体系如下：25μLPCR Mix，2μL总DNA模板，正反向引物各1μL，ddH₂O 1μL。扩增程序分别为：SSU rDNA，94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，循环32次，最后延伸5min；ITS rDNA，95℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸50s，循环32次，最后延伸3min；rbcL cpDNA，94℃预变性5min，94℃变性50s，52℃退火50s，72℃延伸60s，循环32次，最后延伸5min。PCR产物经琼脂糖电泳检测后测序。测序结果：SSUrDNA为1581bp(SEQ ID NO:7)、ITS rDNA为666bp(SEQ ID NO:8)、rbcL cpDNA为1321bp(SEQID NO:9)。所得序列在NCBI进行同源性检索。NCBI同源性检索中最相似序列比对结果示于图1。

其中SSUrDNA和ITS rDNA的比对结果显示TB19藻株与勃氏枝鞘藻(Oedocladiumprescottii)相似度最高；rbcL cpDNA的比对结果显示与Oedocladium carolinianum相似度最高。

选取SSU rDNA、ITS rDNA以及rbcL cpDNA检索结果中的部分其他物种的序列，与所分离的TB19藻株的序列一起使用Mafft7.2软件进行序列比对，比对后的结果经手工校正后使用RAxML7.2软件，采用GTRGAMMA模型进行最大似然分析。进化树构建过程中，靴值(bootstrap)重复设定为1000次。结果如图2所示。

依据SSU rDNA、ITS rDNA以及rbcL cpDNA所做的进化分析显示，所分离的TB19藻株与勃氏枝鞘藻(Oedocladium prescottii)具有最近的亲缘关系。结合形态学观察与系统进化分析，将本发明中分离到的TB19藻株归为枝鞘藻属。

该枝鞘藻TB19藻株以保藏号CGMCC No.11619于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。

实施例2：枝鞘藻TB19藻株培养工艺的优化

微藻生长取决于多种非生物因素。例如光照和生长温度是影响微藻生长的重要因素。本实施例中将枝鞘藻TB19在不同的光照强度和温度下进行培养，对其生物量生产率和色素含量等进行考察，优化了枝鞘藻TB19的培养条件。

枝鞘藻培养：

TB19的藻细胞经过多次接种，达到同步生长。之后将处于对数生长期的藻细胞接种于50mL三角瓶中的20mL BBM培养基(表2，NICHOLS,H.W.&H.C.BOLD:Trichosacinapolymorpha gen.et.sp.nov.J.Phycol.1:34～38,1965)，然后置于恒温光照培养箱中以12h/12h的光/暗周期在不同光照强度和温度下进行培养。

表2. BBM培养基配方

化学组成	含量
		NaNO<sub>3</sub>	250mg/L
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	75mg/L
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	75mg/L
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	25mg/L
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	175mg/L
NaCl	25mg/L
		维生素B<sub>1</sub>	1mg/L
生物素	0.25ug/L
		维生素B<sub>12</sub>	0.15ug/L
*PIV	1mL/L

*PIV(Trace mental solution)：

干重测量：

样品用预先称重的玻璃纤维膜(GF/C，1.2um；Whatman)过滤，然后用20mL0.5M的碳酸氢铵冲洗藻及过滤器上的盐。将带有藻细胞的膜放入105℃的烘箱中干燥过夜，然后称量。通过扣除膜本身重量计算收获的藻的生物量(DW)。

色素含量测定：

样品被过滤到预先称重的玻璃纤维膜上(GF/C，1.2um；Whatman)，将带有藻细胞的膜放入研钵中研磨一分钟，加入2mL提取液(100％丙酮)再研磨一分钟，3500g离心10min，收集上清液。重复提取直至色素被提取完全。将合并后的色素提取液3500g离心10min然后分析。

总色素含量计算公式(Lichtenthaler,1987)：

叶绿素a：Chl-a(μg/ml)＝11.75A₆₆₂-2.35A₆₄₅

叶绿素b：Chl-b(μg/ml)＝18.61A₆₄₅-3.96A₆₆₂

类胡萝卜素：Car(μg/ml)＝(1000A₄₇₀-2.27C_a-81.4C_b)/227

光照强度优化：

设置了4个光照强度条件：10μmol·m^-2·s^-1、40μmol·m^-2·s^-1、60μmol·m^-2·s^-1、80μmol·m^-2·s^-1。实验结果可见于图3和图4。综合考虑生物量生产率、色素含量以及生产成本等可以得出40umol·m^-2·s^-1光强对枝鞘藻TB19的营养生长是最适光强。

培养温度优化

设置了4个培养温度条件：15℃、22℃、28℃和33℃。实验结果可见于图4。综合考虑生物量、色素含量以及生产成本等可以得出28℃是枝鞘藻TB19营养生长的最适温度。

实施例3：枝鞘藻中类胡萝卜素的分析

从枝鞘藻TB19藻株中所提取的色素(提取方法见实施例2)用贝克曼UltrasphereC18反向色谱柱(5mm；150*4.6mm)在室温下分离。20μL样品被用于HPLC分析。洗脱液的流动相为A相(二氯甲烷：甲醇：乙腈：水，5.0:85.0:5.5:4.5，v/v)和B相(二氯甲烷：甲醇：乙腈：水，25.0:28.0:42.5:4.5，v/v)。类胡萝卜素的分离是通过下列程序：8分钟0％的B相；6分钟从0到100％的B相；40min100％的B相，流量1.0mL/min。色素显示在250到700nm的吸收色谱。实验结果见图5并总结于下表3：

表3枝鞘藻TB19藻株中色素的鉴定

峰编号	保留时间(min)	最大吸收波长(nm)	色素
				1	1.476804	259.2
2	1.645685	256.8
				3	2.496143	438.8 469.2
4	3.899123	446.1 474.0	叶黄素
				5	12.08166	469.2	叶绿素b
6	15.798	470.4	金盏花黄质
				7	16.849	455.8 475.2	金盏花黄质
8	17.26258	485.0	虾青素酯
				9	18.59238	477.7	虾青素酯
10	20.91339	480.1	虾青素酯
				11	22.20134	471.6
12	23.5996	477.7	虾青素酯
				13	24.21844	458.2 480.1
14	39.71394	480.1	虾青素酯

从上述结果可以看出，枝鞘藻TB19藻株中的类胡萝卜素主要是酮类类胡萝卜素，尤其是虾青素，并且主要以类胡萝卜素酯的形式存在。

实施例4：枝鞘藻中虾青素的定量分析

取一定量的枝鞘藻TB19在甲醇:三氯甲烷(1:3)溶液中充分研磨后在4℃离心。重复此步骤，直至残余物为灰白色。收集的溶液经氮吹浓缩干燥，并复溶。然后和虾青素标准样品一起进行HPLC。根据HPLC结果在标准曲线上计算出样品中的虾青素含量。

结果表明，TB19中虾青素的含量可达1.6％(W/DW，干重百分比)。枝鞘藻TB19藻株可用于生产类胡萝卜素，尤其是虾青素。

Claims

1.一种枝鞘藻Oedocladium sp.，其以保藏号CGMCC No.11619保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种培养权利要求1的枝鞘藻的方法，其中在10-80 μmol·m-2·s-1的光照强度下，以及在15℃-33℃的温度下进行所述培养。

3.权利要求2的方法，其中在40μmol·m-2·s-1的光照强度下进行所述培养。

4.权利要求2的方法，其中在28℃的温度下进行所述培养。

5.权利要求2的方法，其中使用BBM培养基进行所述培养。

6.权利要求2的方法，其中所述培养在12h/12h、14h/10h或16h/8h的光暗周期下进行。

7.权利要求2-6中任一项的方法，其中所述培养进行9-21天或21天以上。

8.权利要求1的枝鞘藻在制备类胡萝卜素中的应用。

9.权利要求8的应用，其中所述类胡萝卜素是虾青素。

10.一种生产类胡萝卜素的方法，包括以下步骤：

a) 培养权利要求1的枝鞘藻；

b) 收获步骤a)所培养的枝鞘藻；和

c) 从步骤b)所收获的枝鞘藻中提取类胡萝卜素。

11.权利要求10的方法，其中所述类胡萝卜素是虾青素。

12.权利要求10的方法，其中步骤a)中使用BBM培养基培养所述枝鞘藻。

13.权利要求10的方法，其中步骤a)中所述培养在10-80 μmol·m-2·s-1的光照强度下进行。

14.权利要求13的方法，其中步骤a)中所述培养在40μmol·m-2·s-1的光照强度下进行。

15.权利要求10的方法，其中步骤a)中所述培养在15℃-33℃的温度下进行。

16.权利要求10的方法，其中步骤a)中所述培养在28℃的温度下进行。

17.权利要求10-16中任一项的方法，其中步骤a)中所述培养在12h/12h、14h/10h或16h/8h的光暗周期下进行。

18.权利要求10-16中任一项的方法，其中步骤a)中所述培养进行9-21天或21天以上。

19.一种组合物，其包含权利要求1的枝鞘藻的细胞和/或提取自权利要求1的枝鞘藻的类胡萝卜素。

20.权利要求19的组合物，其中所述类胡萝卜素包含虾青素。

21.权利要求19-20中任一项的组合物，其是药物组合物、食品组合物、营养补充剂或饲料。