CN113444659A - 一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌，属于微生物技术领域。本发明高产多杀菌素的刺糖多孢菌为保藏编号为CCTCC NO：M 2021307的刺糖多孢菌(Saccharopolysporasp inosa)WHU1107，该菌株经过诱变后得到，其在装有25mL发酵培养基的培养瓶中经发酵培养后多杀菌素的产量高达4g/L以上，远高于现有已报道菌株，可用于生产多杀菌素。本发明为多杀菌素的产业化生产提供了新的材料。

Description

一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌。

背景技术

多杀菌素类化合物(spinosyns)是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)进行有氧发酵后获得的一种次级代谢产物，是一种新型的绿色广谱生物杀虫剂，属于大环内酯类抗生素。多杀菌素独特的杀虫机理表现出生物农药的安全性和化学农药的快速性，并且由于多杀菌素的易降解性，对环境、农作物和哺乳动物无害，没有致癌、致畸、致突变或神经毒性，因此曾三次获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。目前，多杀菌素仍由刺糖多孢菌通过有氧发酵进行生产。尽管有多个专利报道通过改良培养基或发酵罐的控制方法来提升多杀菌素的产量，但由于菌种本身发酵产量不佳，因此通过发酵优化也很难实现规模化生产，因此我国至今尚未实现该品种的产业化。目前，急需产量较高的菌株以促进多杀菌素的推广及应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素产量低的问题，提供一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其为刺糖多孢菌WHU1107菌株，该菌株已于2021年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，分类命名为Saccharopolyspora spinosa WHU1107，保藏编号为CCTCC NO：M 2021307。

所述的刺糖多孢菌WHU1107菌株发酵生产多杀菌素的产量远高于现有已报道菌株，其可用于生产多杀菌素。

一种生产多杀菌素的方法，包括以下步骤：将刺糖多孢菌WHU1107菌株接种到发酵培养基中，通过发酵得到含多杀菌素的发酵物。

进一步地，所述的发酵培养基的配方为：每100mL水中加入8g的葡萄糖、2g的棉籽饼粉、1g的蛋白粉、0.5g的酵母粉、0.4g的柠檬酸三钠、0.2g的磷酸氢二钾、0.3g的碳酸钙、0.2g的硫酸铵、5g的菜籽油，pH 7.0。

进一步地，所述的发酵的条件为：250rpm、28℃、湿度60％。

上述多杀菌素包括多杀菌素A(Spinosyns A)和多杀菌素D(Spinosyns D)，其化学式为：

本发明的优点和有益效果：本发明的刺糖多孢菌WHU1107菌株经过诱变后得到，在装有25mL发酵培养基的培养瓶中，WHU1107经发酵培养后多杀菌素的摇瓶产量高达4g/L以上。本发明为多杀菌素的产业化生产提供了新的材料。

附图说明

图1是LC-MS检测刺糖多孢菌WHU1107菌株发酵液成分的结果图。

图2是HPLC测定刺糖多孢菌WHU1107菌株发酵液中多杀菌素含量的结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1、多杀菌素菌株分离

2017年7月从多个地区采集土壤样品，将其进行放线菌分离，分离方法为：将土壤用无菌水分装成0.1g/mL，用无菌水将土壤进行悬浮后加入10颗玻璃珠，然后将其按照递减10倍进行逐级稀释，每个浓度涂布10块分离培养基。其中分离培养基的基础配方为：在1L的蒸馏水中加入5g的葡萄糖、3g的酵母提取物、10g的酶解酪蛋白(N-Z amine type A)，混合充分溶解后用NaOH调节pH为7.0；按照200mL分装，每瓶加入琼脂4g；115℃灭菌30min。灭菌完成后冷却至65℃左右，加入萘啶酮酸至终浓度25μg/mL以抑制革兰氏阴性菌生长、制霉菌素至终浓度50μg/mL以抑制真菌生长。最终能长出的菌落中，挑选菌落形态为有孢子产生的链霉菌样本进行保种，共收集78株菌。

每5株菌进行混合发酵，发酵方法如下：

(1)相关培养基

种子培养基：每100mL蒸馏水中加入1g的葡萄糖、1g的酵母提取物、0.2g的N-Zamine typeA、2.5g的棉籽饼粉、2g的玉米淀粉、0.2g的七水硫酸镁、0.1g的硫酸铵，混合充分溶解后用NaOH调节pH为7.0；种子培养每瓶分装25mL种子培养基；121℃灭菌30min。

发酵培养基：每100mL蒸馏水中加入8g的葡萄糖、2g的棉籽饼粉、1g的蛋白粉(海豚牌)、0.5g的酵母粉、0.4g的柠檬酸三钠、0.2g的磷酸氢二钾、0.3g的碳酸钙、0.2g的硫酸铵、5g的菜籽油；混合充分溶解后用NaOH调节pH为7.0；121℃灭菌30min；发酵培养每瓶分装25mL发酵培养基；注：碳酸钙分装到每瓶。

(2)发酵方法

将每个分离菌株挑取单菌落划菌于另一新平板生长，待生长到适合状态，划取1cm*1cm左右大小的菌块于种子培养基中，5株分离菌株接种于一个培养瓶(共16瓶)，250rpm、28℃、60％的湿度下培养一级种子96h后镜检观察一级种子是否染菌、以及种子的生长状态，未染菌且生长状态良好则按1％的转接量转接二级种子；二级种子培养条件同一级种子，培养到60h的时候进行二级种子镜检并观察种子是否染菌，若正常则进行发酵的转接，按5％的转接量转接到装有发酵培养基的培养瓶中，每瓶菌做三个平行；发酵培养条件为：250rpm、28℃、湿度60％的条件下培养12天。

参考文献(Gao-Yi,Tan,Kunhua,et al.Heterologous Biosynthesis ofSpinosad:An Omics-Guided Large Polyketide Synthase Gene ClusterReconstitution in Streptomyces[J].Acs Synth Biol,2017.)中的检测方法，分析发酵液中是否含有多杀菌素。发现在第1瓶和第7瓶中有多杀菌素产生，将第1瓶和第7瓶的共10株菌按照上述方法进行逐一发酵，最终发现3株可以产生多杀菌素的菌株，其产量分别为51.2mg/L、253mg/L和336mg/L，分别命名为WHU1100、WHU1101和WHU1102。

2、菌株诱变

将WHU1102的菌株斜面用生理盐水制备成孢子悬液，脱脂棉过滤后调整孢子浓度为10^-6～10^-7个/mL，取单孢子悬液10mL于无菌的直径9cm平皿内，在距15W紫外灯20cm处照射30s，然后按照递减10倍进行逐级稀释涂板。

将每20株菌分为一组，按照上述方法进行发酵筛选，共筛选约3000株菌，将其中产量最高的1组，共20株选为初步筛选菌株。将这20株菌株进行混合再按照上述方法进行第二轮诱变，同样筛选约3000株，选多杀菌素产量最高的一组20株为待筛选菌株(分别命名为WHU1103-WHU1122)。

将这20株菌株按照上述方法进行逐一发酵，其中最高产量的菌株为WHU1107，参考文献(Gao-Yi,Tan,Kunhua,et al.Heterologous Biosynthesis of Spinosad:An Omics-Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution in Streptomyces[J].Acs Synth Biol,2017.)中的检测方法，利用LC-MS检测发酵物的成分，结果(图1)显示，在发酵液中能检测到多杀菌素A和多杀菌素D；随后用HPLC(图2)分析，多杀菌素A和多杀菌素D的产量总和约为4.1g/L，其中A组分约占95％，D组分约占5％。

3、菌株WHU1107的鉴定

对菌株WHU1107进行鉴定，菌株WHU1107的16s rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，与GENBANK ACCESSION NR_024839.1的序列相似性最高，相似性为99％。根据以上结果，菌株WHU1107属于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。

4、菌株WHU1107的保藏

菌株WHU1107，属于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)，已于2021年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021307。

5、菌株WHU1107和其他刺糖多孢菌菌株产量比较

前人文献或专利报道的经过诱变等方法获得的多杀高产菌株摇瓶产量约为1-2g/L，远低于本发明WHU1107菌株4g/L的产量。按照上述发酵方法检测市场上可购买到的刺糖多孢菌野生型菌株NRRL18395产多杀菌素的情况，其产量为78.7mg/L，其中A组分约占84％，D组分约在16％，也远低于WHU1107菌株4g/L的产量。这些结果说明WHU1107的产量高达4g/L是其自身高产多杀菌素的表现，其可作为多杀菌素高产的工业化菌株进行开发。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1518

<212> DNA

<213> Saccharopolyspora spinosa

<400> 1

aaaggaggtg atccagccgc accttccggt acggctacct tgttacgact tcgtcccaat 60

cgccagtccc accttcgacc actcccccca caagggttgg gccatgggct tcgggtgtta 120

ccgactttca tgacgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcagca 180

atgctgatct gcgattacta gcgactccga cttcacgagg tcgagttgca gaccccgatc 240

cgaactgaga ccggctttaa gggattcgct ccacctcacg atatcgccac cctctgtacc 300

agccattgta gcatgtgtga agccctgggc ataaggggca tgatgacttg acgtcatccc 360

caccttcctc cgagttgacc ccggcagtcc cccacgagtc cccggcataa cccgctggca 420

acatagggca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 480

acgacagcca tgcaccacct gtacaccaac cacaagggaa accccatctc tggagctgtc 540

tagtgcatgt caaacccagg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cacatgctcc 600

gccgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca 660

ggcggggcgc ttaatgcgtt agctacggca cggaaacagt ggaacccatc cccacaccta 720

gcgcccaacg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt 780

tcgctcctca gcgtcagtat cggcccagag acccgccttc gccaccggtg ttcctcctga 840

tatctgcgca tttcaccgct acaccaggaa ttccagtctc ccctaccgaa ctcaagtctg 900

cccgtatcga ccgcaagccc acagttaagc tgcaggtttt cacggccgac gcgacaaacc 960

gcctacgagc tctttacgcc caataaatcc ggacaacgct cgcacctacg tagtaccgcg 1020

gctgctggca cgtagttagc cggtgcttct tctacaccta ccgtcacccg aaggcttcgt 1080

cgatgtcgaa agaggtttac aacccgaagg ccgtcatccc ccacgcggcg ttgctgcgtc 1140

aggctttcgc ccattgcgca agattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1200

tctcagtccc agtgtggccg gtcaccctct caggccggct acccgtcgtc gccttggtag 1260

gccatcaccc caccaacaag ctgataggcc gcggactcat cctgcaccgc cagaactttc 1320

cacacaccac catgcgataa tgtgtcatat ccggtattag accccgtttc caaggcttat 1380

cccagagtgc agggcagatt acccacgtgt tactcacccg ttcgccactc atccacaccc 1440

gaagatgctt cagcgttcga cttgcatgtg ttaagcacgc cgccagcgtt cgtcctgagc 1500

caggatcaaa ctctccaa 1518

Claims (8)

1.一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：为保藏编号为CCTCC NO：M 2021307的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)WHU1107。

2.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌，其特征在于：所述的多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。

3.权利要求1所述的刺糖多孢菌在生产多杀菌素中的应用。

4.根据权利要求3所述的的应用，其特征在于：所述的多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。

5.一种生产多杀菌素的方法，其特征在于：包括以下步骤：将权利要求1所述的刺糖多孢菌接种到发酵培养基中，通过发酵得到含多杀菌素的发酵物。

6.根据权利要求5所述的生产多杀菌素的方法，其特征在于：所述的发酵培养基的配方为：每100mL水中加入8g的葡萄糖、2g的棉籽饼粉、1g的蛋白粉、0.5g的酵母粉、0.4g的柠檬酸三钠、0.2g的磷酸氢二钾、0.3g的碳酸钙、0.2g的硫酸铵、5g的菜籽油，pH 7.0。

7.根据权利要求5所述的生产多杀菌素的方法，其特征在于：所述的发酵的条件为：250rpm、28℃、湿度60％。

8.根据权利要求5-7任一项所述的生产多杀菌素的方法，其特征在于：所述的多杀菌素包括多杀菌素A和多杀菌素D。

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