CN109929004A - 一种高纯度多杀菌素的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种高纯度多杀菌素的提取方法，包括以下步骤1.硅藻土混均发酵液，NaOH调pH11.5；2.压滤收集菌体，85%溶剂溶解HCL调pH3.5；3.压滤，水稀释溶剂溶度60%，树脂吸附；4.75%溶剂将树脂吸附的多糖蛋白等杂质洗脱，用90%溶剂将树脂中吸附的多杀菌素解析，真空浓缩；5.NaOH调pH=11，使多杀菌素沉淀，过滤，用稀碱液洗涤多杀菌素1~3次，真空干燥，得90%以上粗品；6.用水溶解粗品磷酸调pH至5.0上柱洗脱，收98%多杀菌素，真空脱除溶剂，高碳醇萃取多杀菌素有机相；7.有机相加水反向萃取多杀菌素，反萃取相旋蒸，浓缩物置冻干机干燥得98%多杀菌素。本发明产品纯度高，满足特殊用途研究。

Description

一种高纯度多杀菌素的提取方法

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中提取精制抗生素的方法，特别是涉及一种高纯度多杀菌素的提取方法。

背景技术

多杀菌素(spinosad，spinosyns)又名刺糖菌素、多杀霉素，是自土壤样品中分离的放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯类抗生素，分子结构中含有一个二十二元内酯环、一个鼠李糖及一个福乐糖胺，在水中溶解度很小，易溶于醇类、酯类等多种极性、非极性有机溶剂。经有氧发酵后刺糖多孢菌发酵液中主要含有多杀菌素A(85~90%)、D(10~15%)两种杀虫活性成分，同时还会含有少量B、C、E、F、H、J、K、L等多种结构类似组分。多杀菌素对磷翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、缨翅目(Thysanoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)等多种农业害虫均有很强的毒杀作用，其选择毒性远高于其他常用的化学农药、生物农药，显著高于DDT、氯氰菊酯和阿维菌素，而对哺乳类、鱼类、两栖类等的毒性极低，具有毒力高、杀虫谱广、非靶标毒性低、对环境安全等优点，已广泛应用于棉花、茶叶、蔬菜等多种农作物及果树害虫防治。目前，含多杀菌素的农药产品由美国陶氏农业科学公司生产。我国有48%悬浮液(商品名：Tracer，催杀)和2.5%悬浮液(商品名：Success，菜喜)两种产品销售，分别应用于小菜蛾和棉铃虫等害虫的防治。

多杀菌素的杀虫作用机制新颖独特。研究表明，其主要是作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAchR)和γ-氨基丁酸受体(gamma-aminobutyric acid receptor, GABAR)，导致虫体神经细胞超活化以及非功能性的肌肉收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，迄今没有发现与其他杀虫剂有交叉抗性。

作为一种高效绿色生物农药，多杀菌素的应用前景非常广阔。但是，关于多杀菌素制备工艺的研究，尚没有形成高效、高得率的工业生产技术，在多杀菌素提取制备、纯化方法等方面的研究也极少。美国专利U.S.P 5227295公开了一种从刺糖多孢菌发酵液中分离多杀菌素（文中称为A83543）的方法：向发酵液中加入等体积的丙酮并充分浸取，过滤后，滤液用NaOH溶液调pH至13，然后上HP-20ss吸附树脂，以甲醇:乙腈＝1:1(含0.1%乙酸钠)溶液0%~95%梯度洗脱多杀菌素A和D组分，利用HPLC进行跟踪检测，并分段收集洗脱液，将多杀菌素洗脱液浓缩后将其用石油醚稀释，稀释液上硅胶层析柱，用石油醚和甲醇梯度洗脱，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液，分别得到多杀菌素A和D的洗脱液。

中国专利CN 101560231公开了一种大孔树脂吸附提取工艺：低于50%丙酮含量的预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱YPR-II吸附，五倍柱体积的去离子水洗去水溶性杂质，然后分别用20、10、1倍柱体积的浓度为40%、60%、80%，pH分别为7.0、9.0、7.0的丙酮水溶液洗脱吸附柱，最后用100%丙酮进行洗脱，合并洗脱效价较高的收集单元，进一步精制得到了多杀菌素粗制品，提取总收率达到70.1%，产品纯度为97%。另据国内文献报道，胡西洲等和王琨等也分别对大孔树脂吸附提取工艺进行了初步的研究：胡西洲等选择XAD-4大孔树脂作为吸附材料提取多杀菌素，pH=11，流速1/6 (L/min)，2 %氯化钠条件下，采用丙酮梯度解吸，总收率达到64.7%；王琨等用DM 11树脂吸附提取多杀菌素，最佳吸附pH 9.5，上柱流速6BV/h，丙酮解吸流速1.5BV/h，回收率较高，达到85.8%。

上述树脂吸附提取法都需要梯度洗脱，虽也有较好的效果，如纯度较高，但是，需要的溶剂量大，解吸附困难、处理量偏小、对设备要求高、工序多、耗时长、成本较高等缺陷，难以适应大规模工业化生产的要求。目前，现有技术中，还没有一种收率高、纯度好，且成本低、操作简便、便于工业化生产的多杀菌素提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种收率高，产品纯度好，且制造成本低，操作简便，便于工业化生产的从刺糖多孢菌发酵液中提取多杀菌素工艺。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：其包括以下步骤：包括以下步骤：（1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入1%硅藻土混均，用3~5 mol/L的氢氧化钠溶液调节发酵液pH=11.5，然后将发酵液加热升温至45°C，保温并以450r/min速度搅拌处理12小时；（2）用板框压滤机进行压滤，进行固液分离，收集菌丝体，收集菌丝体用90%极性有机溶剂进行充分溶解并用HCL溶液调节pH值至3.5搅拌运行，浸泡抽提菌丝体中的多杀菌素；用板框压滤机进行压滤，再次进行固液分离，收集浸提清液；（3）用纯水稀释收集浸提清液至有机溶剂溶度至60%，通过大孔吸附树脂进行产物吸附，用65%-75%%的极性有机溶剂将大孔树脂中吸附的多糖蛋白等杂质进行梯度洗脱，用90%的极性有机溶剂将大孔树脂中吸附的多杀菌素产物进行解析，45°C条件下真空浓缩，挥发除去极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；（4）用NaOH溶液调节pH值=11，搅拌1小时静置12小时使多杀菌素沉淀，过滤，用PH=10的稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1~3次，在45°C下真空干燥24小时，即得到90%以上多杀菌素粉剂粗品；（5）用多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1极性溶剂与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上层析柱进行等度洗脱，分部收集98%以上多杀菌素纯品，用旋转蒸发器在45°C真空下脱除洗脱剂中的极性溶剂，用低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载多杀菌素有机相，萃取条件为：萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:1~5，温度20~45°C，pH=5.0~7.0，萃取时间5~10min；萃取完成分层后，收集负载有机相；（6）将负载有机相中加入纯水进行反向萃取，反萃取条件为：负载有机相与纯水体积比=1~5:1，纯水PH=6.0~6.5，温度20~30°C，反萃取时间5~8 min，反萃取级数为1~5；反萃取分层完成后收集反萃取相；将含有多杀菌素收集的反萃取相进行45°C真空旋蒸，脱除多余水分，形成多杀菌素晶体。将脱除多余水分的多杀菌素晶体物放置-86°C冻干机进行冷冻干燥即得到99%以上包含多杀菌素A与多杀菌素D的高纯多杀菌素结晶粉剂。

所述第（2）步，所述极性溶剂是选自甲醇、丙酮、乙醇、乙腈中的一种或二种以上，优选丙酮。所述固液分离技术可为公知固液分离方法如板框过滤、离心过滤、重力离心等方法中的任何一种。

所述第（5）步，所述低介电常数萃取溶媒是选自乙酸丁酯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、正己烷、石油醚、甲苯、二甲苯中的一种，优选乙酸丁酯；所述第（6）步高碳醇萃取溶媒是选自正辛醇、异辛醇、仲辛醇中的一种，优选正辛醇。本发明采用萃取与反萃取相结合的技术路线，所需设备发展相对成熟，很容易实现工业化生产。

本发明工艺树脂层析分离纯化工艺，提取收率相当高，达85%，纯度多杀菌素A达93%，多杀菌素D达5%，其他同系物能控制在2%以下。本发明工序少，操作简单，周期短，劳动强度低，成本低，提取的产品质量好，易于放大至工业化生产。

附图说明

图1为多杀菌素纯品HPLC检测图谱；

具体实施方法

下面结合实施例对本发明作进一步说明。但本发明的保护范围不能认为仅局限于下述具体实施方式。在不脱离本发明基本构思的前提下，所属领域的技术人员据此作出的简单推演或同等替换方案，均属于本发明的保护范围。以下描述的各实施例所述发酵液均指含多杀菌素的刺糖多孢菌发酵液。

实施例1

（1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入1%硅藻土混均，用5 mol/L的氢氧化钠溶液调节发酵液pH=11.5，然后将发酵液加热升温至45°C，保温并以450r/min速度搅拌处理12小时；（2）将发酵罐降温至30°C，用板框压滤机将发酵液压滤，进行固液分离，收集不溶物菌丝体，收集菌丝体用90%丙酮溶剂进行充分溶解并用HCL溶液调节pH值至3.5搅拌运行，抽提菌丝体中的多杀菌素；用板框压滤机进行压滤，再次进行固液分离，收集浸提清液；（3）用纯水稀释收集浸提清液至丙酮溶度在60%，通过100*1000mm层析柱用大孔吸附树脂进行多杀菌素吸附，用65%-75%%的丙酮将大孔树脂中吸附的多糖蛋白等系列杂质进行梯度洗脱脱除，用90%的丙酮将大孔树脂中吸附的多杀菌素产物进行解析，解析液在45°C条件下真空浓缩，挥发除去丙酮，得到多杀菌素浓缩液；（4）用NaOH溶液调节pH值=11并搅拌1小时然后静置12小时使多杀菌素沉淀，过滤，用PH=10的稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤2次，在45°C下真空干燥24小时，即得到90%以上多杀菌素粉剂粗品；

（5）用90%多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1丙酮与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上100*1000mm层析柱进行等度洗脱，分部收集98%以上多杀菌素纯品，用旋转蒸发器在45°C真空下脱除丙酮，用乙酸丁酯进行萃取，得到负载多杀菌素乙酸丁酯相，萃取条件为：乙酸丁酯溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:3，温度35°C，pH=7，萃取时间10min；萃取完成分层后，收集乙酸丁酯相；（6）将乙酸丁酯相中加入纯水进行反向萃取，反萃取条件为：乙酸丁酯相与纯水体积比=1:1，纯水PH=6.0，温度30°C，反萃取时间8 min，反萃取级数为2；反萃取分层完成后收集水相；将含有多杀菌素收集的水相进行45°C真空旋蒸，脱除多余水分，形成结晶。将脱除多余水分的多杀菌素晶体放置-86°C冻干机进行冷冻干燥即得到HPLC（高效液相色谱）纯度98%以上高包含多杀菌素A与多杀菌素D的高纯多杀菌素结晶粉剂，提纯总收率达82.5%。

表1-1为多杀菌素图谱检测数据

表1-1

Claims (5)

1.一种高纯度多杀菌素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）发酵液预处理：发酵结束后放罐前，加入1%硅藻土混均，用3~5 mol/L的氢氧化钠溶液调节发酵液pH=11.5，然后将发酵液加热升温至45°C，保温并以450r/min速度搅拌处理12小时；（2）用板框压滤机进行压滤，进行固液分离，收集菌丝体，收集菌丝体用90%极性有机溶剂进行充分溶解并用HCL溶液调节pH值至3.5搅拌运行，浸泡抽提菌丝体中的多杀菌素；用板框压滤机进行压滤，再次进行固液分离，收集浸提清液；（3）用纯水稀释收集浸提清液至有机溶剂溶度至60%，通过大孔吸附树脂进行产物吸附，用65%-75%%的极性有机溶剂将大孔树脂中吸附的多糖蛋白等杂质进行梯度洗脱，用90%的极性有机溶剂将大孔树脂中吸附的多杀菌素产物进行解析，45°C条件下真空浓缩，挥发除去极性溶剂，得到多杀菌素浓缩液；（4）用NaOH溶液调节pH值=11，搅拌1小时静置12小时使多杀菌素沉淀，过滤，用PH=10的稀碱液将多杀菌素沉淀洗涤1~3次，在45°C下真空干燥24小时，即得到90%以上多杀菌素粉剂粗品；（5)用多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1极性溶剂与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上层析柱进行等度洗脱，分部收集98%以上多杀菌素纯品，用旋转蒸发器在45°C真空下脱除洗脱剂中的极性溶剂，用低介电常数或高碳醇萃取溶媒进行萃取，得到负载多杀菌素有机相，萃取条件为：萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:1~5，温度20~45°C，pH=5.0~7.0，萃取时间5~10min；萃取完成分层后，收集负载有机相；（6）将负载有机相中加入纯水进行反向萃取，反萃取条件为：负载有机相与纯水体积比=1~5:1，纯水PH=6.0~6.5，温度20~30°C，反萃取时间5~8 min，反萃取级数为1~5；反萃取分层完成后收集反萃取相；将含有多杀菌素收集的反萃取相进行45°C真空旋蒸，脱除多余水分，形成油膏状。

2.将脱除多余水分的多杀菌素油膏浓缩物放置-86°C冻干机进行冷冻干燥即得到99%以上高纯多杀菌素粉剂。

3.根据权利要求1所述的第（2），（3），（4），（5）步中，所述极性溶剂为丙酮；第（3）步中，所述大孔吸附树脂为HZ-818；第（5）步中，所述层析柱为高径比10，柱的体积为上样1g多杀菌素设计柱体积为200ml第（5）步中，所述层析柱洗脱剂为丙酮：水：磷酸，体积比为649:350：1；第（5）步中，所述低介电常数萃取溶媒为乙酸丁酯；所述高碳醇萃取溶媒为正辛醇；

根据权利要求1所述的收集菌丝体用90%极性有机溶剂进行充分溶解多杀菌素的工艺，其特征在于，所述第（2）步，发酵菌丝体与极性有机溶剂体积比=1:1.5，浸泡温度为30~35°C，搅拌时间8小时。

4.根据权利要求1或2所述的用多杀菌素粉剂粗品重量2倍1：1极性溶剂与纯水的混合剂溶解多杀菌素粉剂粗品并用3~5 mol/L的磷酸溶液调节pH值至5.0上层析柱进行等度洗脱工艺，其特征在于，所述第（4）步，层析柱洗脱剂为丙酮：水：磷酸，体积比为649:350：1，柱温为常温25~30°C，洗脱剂总量为层析柱体积的4~6倍，层析速率为4BV/h；

5.据权利要求1所述的第6步萃取溶媒与多杀菌素浓缩液体积比=1:3，萃取温度30°C，萃取pH=6.5，萃取时间8 min。