CN115010779A - 一种多杀菌素的提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多杀菌素的提取纯化方法，涉及制药技术领域。该方法包括步骤：发酵液的预处理、浸提、反萃取、大孔树脂吸附层析、结晶、精制。本发明的优点在于多杀菌素提取工艺简单，产品质量好，收率高，适合大规模工业生产。使用本发明的方法最终获得的产品纯度达到95％以上，总收率达到80％以上。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，尤其涉及一种多杀菌素的提取纯化方法。
背景技术
多杀菌素(Spinosad)是一种具有高价值和复杂的化学结构的广谱生物杀虫剂，是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的胞内次级代谢产物。其主要活性成分是Spinosyn A和Spinosyn D，通常实用化产品是二者的混合物，故称其为Spinosad。
多杀菌素作为新型的大环内酯类抗生素，却和一般的大环内酯类抗生素不同，多杀菌素没有抑菌活性，却有杀虫活性。它具有破坏烟碱乙酰胆碱受体的独特作用模式，对鳞翅目幼虫以及一些双翅目、鞘翅目、胸腺翅目和膜翅目等害虫具有高水平的毒杀功效，但对其他昆虫只有有限的活性，对哺乳动物和其他野生动物表现出低毒性。因其具有高效、低毒、低残留、对昆虫天敌安全、自然分解快等优良特性，在防治农林害虫、储粮害虫、卫生害虫以及牲畜寄生虫上发挥重要作用，被认为是一种很有开发前景的绿色杀虫剂。
目前，关于多杀菌素的提取纯化方法主要是溶媒萃取法和大孔树脂吸附法。溶媒萃取主要是使目标化合物由一种溶剂转移到另外一种与原来溶剂不相溶的溶剂中，按照分溶定律达到萃取平衡，从而起到提取纯化的目的。该方法耗时较长，要经过多次萃取，需要大量的有机溶剂，且在萃取过程中容易出现乳化现象，增加工作难度，在大规模生产中，增加成本和能耗。大孔树脂吸附法主要是利用分子间作用力和氢键的作用，根据相似相溶原理来进行物质的吸附和洗脱来完成的。该方法操作简单，提高了提取效率，所用有机溶剂较少，大孔树脂可以反复使用，降低了生产成本。
相关技术公开了一种多杀菌素的提取工艺：将发酵液的pH调节至8.5-9.5，得到预处理的发酵液，将预处理后的发酵液过滤并收集滤饼，然后用甲醇-水溶液对得到的滤饼进行搅拌浸提，过滤得到浸提液，将得到的浸提液过强碱性阴离子树脂脱色并浓缩至无甲醇流出，得到脱色浓缩液，在得到的脱色浓缩液中加入非水溶性有机溶剂萃取，收集负载有机相，然后向得到的负载有机相中加入酸水反萃取，收集反萃取相，搅拌状态下，调节得到的反萃取相至pH为9.0-10.0，使多杀菌素以结晶形式沉淀出来，过滤，烘干，得到多杀菌素粉末。该发明所得到的产品纯度较高，但在整个过程工艺较为复杂，溶剂种类多，消耗量大，产品收率低，成本高，不利于工业化生产。
目前，国内现有多杀菌素的工业化生产存在溶媒使用量大，工艺复杂，成本较高，产品收率和纯度低等问题，因此，需要继续深入研究并优化多杀菌素的生产工艺，降低生产成本，提高产品质量，从而提高生产水平。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种多杀菌素的提取纯化方法，能够使得产品收率高的同时保证产品质量。
根据本发明提出的一种多杀菌素的提取纯化方法，包括如下步骤：
S1：预处理，将发酵液与助滤剂混合，压滤，收集菌渣；
S2：浸提，用有机溶剂对S1所述菌渣浸提，得到浸提液；
S3：反萃取，将酸水和S2所述浸提液混合，静置分层，得到酸水相；
S4：柱层析，使用径高比为1:2～3的大孔吸附树脂对S3所述酸水相进行柱层析，洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液；
S5：结晶，向S4所述合并后的洗脱液中加入结晶剂，得到结晶粉；
S6：精制，重结晶S5所述结晶粉，得到多杀菌素成品。
在本发明的一些实施方式中，S1中所述助滤剂为珍珠岩、硅藻土、纤维素中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述助滤剂与所述发酵液的质量体积比为(1～5)kg：100L。
进一步地，所述助滤剂与所述发酵液的质量体积比为(1～3)kg：100L。
在本发明的一些实施方式中，S1所述压滤为板框压滤、箱式压滤、隔膜压滤中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，S2所述有机溶剂选自甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯中的至少一种，优选为乙酸乙酯。
在本发明的一些实施方式中，S2所述有机溶剂与所述菌渣的用量比为(2～5)L：1kg。
进一步地，S2所述有机溶剂与所述菌渣的用量比为(2～3)L：1kg。
在本发明的一些实施方式中，S2所述浸提时间为1h～5h。
进一步地，S2所述浸提时间为3h～4h。
在本发明的一些实施方式中，S3所述酸水包括柠檬酸、草酸、酒石酸、乳酸中的至少一种的水溶液，优选为包括酒石酸的水溶液。
在本发明的一些实施方式中，S3所述酸水的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。
进一步地，S3所述酸水的浓度为0.1mol/L～0.2mol/L。
在本发明的一些实施方式中，S3所述酸水的体积与所述浸提液的体积比为1:2～5。
进一步地，S3所述酸水的体积与所述浸提液的体积比为1:3～4。
在本发明的一些优选的实施方式中，S3所述混合为搅拌混合，所述搅拌的时间为1h～3h，优选为1h～2h。
在本发明的一些优选的实施方式中，S3所述静置的时间为1h～5h，优选为1h～2h。
在本发明的一些优选的实施方式中，S3所述反萃取可操作1～3次。
在本发明的一些优选的实施方式中，S4所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂。
在本发明的一些优选的实施方式中，S4还包括将酸水相稀释配成上样液，所述稀释的比例为1:0.5～1.5。
在本发明的一些优选的实施方式中，S4所述洗脱的洗脱剂为60％～80％甲醇水溶液，优选为70％～75％甲醇水溶液。
在本发明的一些优选的实施方式中，S4所述洗脱的流速为1BV/h～3BV/h，优选为1.5BV/h～2BV/h。
在本发明的一些优选的实施方式中，S4所述洗脱剂的用量为5BV～6BV。
在本发明的一些优选的实施方式中，S4所述收集洗脱液具体为每0.1BV～0.2BV收集1个容器。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S4所述合并洗脱液的标准为经过HPLC检测的纯度大于85％，多杀菌素单位大于5000mg/L。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S5所述结晶剂选自双蒸水或纯化水。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S5所述结晶剂的加入量为所述洗脱液体积的0.4～0.5倍。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S5所述结晶的温度为5℃～10℃。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S6所述重结晶包括如下步骤：使用有机溶剂溶解结晶粉，加入结晶剂，降温，重结晶。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S6所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇中的至少一种，优选为乙醇。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S6所述有机溶剂与所述结晶粉的体积质量比为(9～11)L：1kg。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S6所述结晶剂的加入体积为所述有机溶剂体积的0.5～1.0倍，优选为0.7～0.9倍。
在本发明的一些更优选的实施方式中，S6所述重结晶的温度为5℃～10℃。
本发明的有益效果为：
1.本发明提取只需要经过浸提、反萃取，提高了多杀菌素的收率，减少了溶媒使用量，降低了成本，同时也提高了生产效率。
2.本发明采用大孔吸附树脂纯化多杀菌素，大孔树脂吸附量可达到每升树脂吸附70g～90g多杀菌素，洗脱溶剂使用量为5～6倍柱体积，也就是说，使用本发明的方法树脂吸附量高，洗脱集中，纯度较高，溶媒使用量少，适合大规模工业生产。
3.本发明采用在低温下向洗脱液中滴加纯化水的方式提纯多杀菌素结晶，得到的结晶粉纯度较高，颜色好，过程操作简便，产生的母液量少。
4.本发明对得到结晶粉进行精制，得到多杀菌素产品纯度达到95％以上，通过最优工艺方法得到的产品总收率达到80％以上。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例制备了一种多杀菌素，具体过程为：
(1)取效价为4200mg/L的多杀菌素发酵液20L，加入0.4kg珍珠岩，搅拌30min后，通过板框压滤，得到菌渣10kg；
(2)用20L乙酸乙酯浸提菌渣，温度为50℃，搅拌3.0h，过滤，用2L乙酸乙酯顶洗，得到21.5L浸提液(多杀菌素单位3853mg/L)。
(3)向浸提液中加入0.1mol/L的酒石酸6L进行反萃取，搅拌1h后静置，1h后进行分层，酸水收集在容器内，在有机相中加入1L酒石酸水重复进行反萃取，共得到7L酸水相(多杀菌素单位11581mg/L)。
(4)向酸水相中加入7L水，混合均匀后上样大孔吸附树脂，树脂型号XBJ-826，柱体积1L，树脂柱径高比1:2，流速1.5L/h。上样结束后用75％甲醇水溶液冲柱洗脱，流速1.5L/h，当纯度大于85％时，开始收集洗脱液，HPLC检测多杀菌素单位小于5000mg/L时停止收集。共收集合格洗脱液2L，含多杀菌素78g，纯度为91.3％。
(5)向合格洗脱液中边搅拌边滴加纯化水0.8L，缓慢降温至10℃，养晶时间为5h。真空抽滤，用0.5L纯化水顶洗，烘干，得到75.4g结晶粉，纯度为95.2％。
(6)用0.75L乙醇在50℃溶解结晶粉，过滤，在溶液中边搅拌边加入0.6L纯化水，缓慢降温至10℃，养晶时间为5h。真空抽滤，用0.2L纯化水顶洗，烘干，得到72.07g多杀菌素产品，纯度为98.3％，总收率为85.8％。
实施例2
本实施例制备了一种多杀菌素，具体过程为：
(1)取效价为4246mg/L的多杀菌素发酵液20L，加入0.6kg珍珠岩，搅拌30min后，通过板框压滤，得到菌渣12kg；
(2)用36L甲酸乙酯浸提菌渣，温度为50℃，搅拌4h，过滤，用2L甲酸乙酯顶洗，得到37.6L浸提液(多杀菌素单位2197mg/L)。
(3)向浸提液中加入0.2mol/L的柠檬酸8L进行反萃取，搅拌2h后静置，2h后进行分层，酸水收集在容器内，在有机相中加入1.5L柠檬酸水重复进行反萃取，共得到9.5L酸水相(多杀菌素单位8394mg/L)。
(4)向酸水相中加入6L水，混合均匀后上样大孔吸附树脂，树脂型号XBJ-826，柱体积1L，树脂柱径高比1:3，流速2L/h。上样结束后用70％甲醇水溶液冲柱洗脱，流速1.5L/h，当纯度大于85％时，开始收集，HPLC检测多杀菌素单位小于5000mg/L时停止收集。共收集合格洗脱液2L，含多杀菌素76.8g，纯度为89.1％。
(5)向合格洗脱液中边搅拌边滴加纯化水1L，缓慢降温至10℃，养晶时间为5h。真空抽滤，用0.5L纯化水顶洗，烘干，得到74g结晶粉，纯度为93.8％。
(6)用0.74L乙醇在50℃溶解结晶粉，过滤，在溶液中边搅拌边加入0.52mL纯化水，缓慢降温至10℃，养晶时间为5h。真空抽滤，用0.2L纯化水顶洗，烘干，得到70.46g多杀菌素产品，纯度为96.03％，总收率为83％。
实施例3
本实施例制备了一种多杀菌素，具体过程为：
(1)取效价为4515mg/L的多杀菌素发酵液20L，加入0.5kg珍珠岩，搅拌30min后，通过板框压滤，得到菌渣10.5kg；
(2)用24L乙酸丙酯浸提菌渣，温度为50℃，搅拌3h，过滤，用2L乙酸丙酯顶洗，得到25.6L浸提液(多杀菌素单位3440mg/L)。
(3)向浸提液中加入0.3mol/L的草酸7.0L进行反萃取，搅拌1h后静置，1h后进行分层，酸水收集在容器内，在有机相中加入1.5L酒石酸水重复进行反萃取，共得到8.5L酸水相(多杀菌素单位10065mg/L)。
(4)向酸水相中加入8.5L水，混合均匀后上样大孔吸附树脂，树脂型号XBJ-298，柱体积1L，树脂柱径高比1:2，流速1.5L/h。上样结束后用75％甲醇水溶液冲柱洗脱，流速1.5L/h，当纯度大于85％时，开始收集，HPLC检测多杀菌素单位小于5000mg/L时停止收集。共收集合格洗脱液2L，含多杀菌素82.3g，纯度为88.9％。
(5)向合格洗脱液中边搅拌边滴加纯化水1L，缓慢降温至10℃，养晶时间为5h。真空抽滤，用0.5L纯化水顶洗，烘干，得到79g结晶粉，纯度为92.6％。
(6)用0.79L乙醇在50℃溶解结晶粉，过滤，在溶液中边搅拌边加入0.395L纯化水，缓慢降温至10℃，养晶时间为5h。真空抽滤，用0.2L纯化水顶洗，烘干，得到75.2g多杀菌素产品，纯度为95.8％，总收率为83.3％。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种多杀菌素的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：预处理，将发酵液与助滤剂混合，压滤，收集菌渣；
S2：浸提，用有机溶剂对S1中所述菌渣浸提，得到浸提液；
S3：反萃取，将酸水和S2中所述浸提液混合，静置分层，得到酸水相；
S4：柱层析，使用径高比为1:(2～3)的大孔吸附树脂对S3中所述酸水相进行柱层析，洗脱，收集洗脱液，合并洗脱液；
S5：结晶，向S4中所述合并后的洗脱液中加入结晶剂，得到结晶粉；
S6：精制，重结晶S5中所述结晶粉，得到多杀菌素成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中所述洗脱采用浓度为60％～80％甲醇水溶液进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中所述洗脱的流速为1BV/h～3BV/h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中所述甲醇水溶液的用量为5BV～6BV。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S5中所述结晶剂选自双蒸水或纯化水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中所述助滤剂与所述发酵液的质量体积比为(1～5)kg：100L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中所述有机溶剂与所述菌渣的用量比为(2～5)L：1kg。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S5中所述结晶的温度与S6所述重结晶的温度为5℃～10℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述酸水的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3中所述酸水的体积与所述浸提液的体积比为1:2～5。
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