CN1259299A - 饼粕分离脱壳脱毒生产蛋白质饲料 - Google Patents

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Abstract

本发明是属于微生物发酵的方法。特别是涉及一种饼粕经粉碎、筛分、风选,再与经培养的产朊假丝酵母、鲁氏酵母、黑曲霉、米曲霉、康化木霉、绿色木霉多种菌种共同作用产生蛋白质水解酶、糖化酶、纤维素酶等多种酶,使有毒的饼粕成为无毒的饼粕,从而利用其代替鱼粉制取复合饲料的方法。采用本方法生产的饼粕具有原料来源广泛,生产成本低,脱壳脱毒效果好,蛋白质含量高,制备工艺简单等优点。

Description

饼粕分离脱壳脱毒生产蛋白质饲料
本发明是属于微生物发酵的方法。特别是涉及一种利用多种菌种共同作用产生蛋白质水解酶、糖化酶、纤维素酶等多种酶，使有毒的饼粕成为无毒的饼粕，从而利用其代替鱼粉制取复合饲料的方法。
蓖麻饼粕、葵花粕、棉籽粕、菜籽粕等均含有优质的蛋白，但由于其成份中都含有较多的皮壳、纤维素及毒素(蓖麻碱、毒蛋白、凝集毒、变应原等)，所以在实际应用上有很多不便。据国内外的文献报道，对蓖麻饼粕、葵花粕、棉籽粕、菜籽粕等的皮壳、纤维素的脱壳、脱毒方法均采用高温(134度)、高压(2个大气压、30分钟)的方法进行或者使用膨化技术，采用此种方法有许多不足，如工艺过程复杂、生产成本高、周期长等缺点。
我国有着丰富的蓖麻资源，每年有大量的蓖麻饼废弃，该饼中含蛋白质30％左右，白白废弃掉着实可惜；而另一方面渔业资源相对缺乏，有时为了满足生产动物饲料的需要，还需大量进口，如何利用现有资源替代紧张的渔业资源也是我们面临的课题与难题。
我国生产饲料酵母的厂家过去多采用以玉米黄粉为原料，每吨成本约需2300元，用固体发酵法生产饲料酵母，每吨销价高达2000-2200元，因此，我们的厂家面对成本过高、市场竞争不利的局面而多数陷入困境。
本发明的目的在于采用生物工程的方法，选择适宜的酵母菌、糖化菌及发酵条件使有毒的蛋白质资源变为无毒的蛋白质资源，并且同时达到脱壳的目的。
本发明的目的是这样实现的：蓖麻饼粕经粉碎机粉碎后，用40目-60目振荡筛分离，再次筛分并用风选方法得蛋白质含量50％以上的产品，然后与酒糟(1∶0.5-1)混合，加水(1∶10)，常规灭菌，并控制pH值为4.5-5.0，保持温度35±1℃，在发酵罐中与经逐级培养放大的酵母菌、糖化菌作用，接种量3-5％，加适量营养盐(尿素、MgSO4、K2HPO4)，采用工厂流加方法发酵培养16-20小时，经干燥、过滤、粉碎后便得本发明产品。
酵母菌及糖化菌的培养采用常规的种子培养方法，即原菌活化、从一级到五级种子的培养。
本发明所述及的菌种为：产朊假丝酵母(Candida utilis)、鲁氏酵母(Sacch yauxii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzat)、康化木霉(Trichodenua koningii)、绿色木霉(Trichoderma uiride)。
本发明的关键在于选择适宜的菌种及发酵条件，以下分别叙述。
菌种选育：
我们从中科院生物研究所(本发明所采用的菌种均来自此单位向社会公开提供的菌种)索取的38株酵母菌进行筛选，经分纯及发酵性能试验，再从中选出10株酵母菌在自然环境下，试验其对蓖麻饼的适应性，最后确定产朊假丝酶母(Candida utilis实验编号：J3-20)为最适宜菌种。如下表：
                          酵母菌筛选试验
菌种名称 学名                  发酵性能试验
  OD值 残糖Brix 得率％(W/v)   蛋白质
  啤酒酵母   S.cerevisial   0.48     1     44     48
  混合酵母   0.52     1     47     51
  药用酵母   S.cerevisial   0.71     0     50     55
  产朊圆酵母   T.utllis   0.62     1     48     53
  产朊假丝酵母   C.utilis   0.74     0     51     58
  饲料酵母   Caddida utilis   0.81     0     50     65
根据酵母对蓖麻饼适宜的生长情况和生产实际的需求，我们选择饲料酵母(所选菌种为产朊假丝酵母，Candida utilis)做为主要供试菌株，该菌株对蓖麻饼的适应能力较强，能利用五碳、六碳糖，以尿素硫铵等为氮源，其培养基质可不加其它生长因子，菌种生长旺盛，抑制杂菌的能力较强，有一定的脱毒作用，是较为理想的实验菌种。
发酵条件试验：
为了利用蓖麻饼中的淀粉、纤维素等碳源及进一步加强脱毒效果，我们选用了四种菌配合发酵(以蓖麻饼粕为培养基)，采用正交设计实验确定配合菌条件，种龄(菌种培养时间)、发酵周期等几项最佳工艺参数。具体见表：
条件1——J3-20(产朊丝酵母Candida utilis)；
条件2——J3-20+J5-16(绿色木霉     Trichoderma uiride)；
条件3——J3-20+J5-16+J5-7(黑曲霉 Aspergillus niger)；
条件4——J3-20+J5-16+J5-7+J5-28(产朊圆酵母 Trichoderma uellis)；
A(种子培养时间)hr  B(发酵时间)hr C(菌种配合条件)   得率％(W/V)   蛋白质％
  1     12     18     1     47     41
2 12 20 2 46 41
    3     12     22     3     50     43
    4     12     24     4     51     45
    5     14     18     2     51     42
    6     14     20     3     52     44
    7     14     22     4     56     47
    8     14     24     1     55     46
    9     16     18     3     56     63
    10     16     20     4     59     60
    11     16     22     1     54     59
    12     16     24     2     58     65
    13     18     18     4     53     61
    14     18     20     1     50     60
    15     18     22     2     54     62
    16     18     24     3     54     66
由上表可以看出，产品中的蛋白质含量随发酵时间(B)的延长而增长，菌种配比情况以条件3为最佳。最佳组合结果为：
得率方面：A3B4C4(种龄16hr，发酵时间24hr，菌种配合为条件4)；
蛋白质含量方面：A4B4C3(种龄18hr，发酵时间24hr，菌种配合为条件3)；
综合考虑：A3B4C3(种龄16hr，发酵时间24hr，菌种配合为条件3)。
为验证此结果，又进行追加试验，结果如下：
组号 发酵OD值  PH值  残糖  得率％  蛋白质％
A3B4C4  0.66  3.5  1  54.87  61.19
A4B4C3 0.59 3.0 1 54.82 63.79
A3B4C3  0.63  3.0  1  54.99  66.21
追加实验结果表明：从生产成本、生产周期、糖的利用率等方面考虑A4B4C3和A3B4C4的结果相差不大，A3B4C3为最佳组合。
与此同时，我们还进行了毒理实验，菌种配合如下：
1.J3-20             不灭菌接种
2.J3-20             灭菌接种
3.J3-20+J5-16      灭菌接种
4.J3-20+J5-16+J5-7        灭菌接种
5.J3-20+J5-12+J5-7+J5-28 灭菌接种(J5-12：鲁氏酵母Sacch Yauxii)
6.J3-20+J5-12+J5-28       灭菌接种
样品外观：样品经过干燥后呈棕褐色小颗粒状，分为I、II、III、IV、V、VI等批号。
试验样品制作方法：取各批号样品称重后(相等重量)加10倍重量水溶解后，常规灭菌，将所得的无菌溶液作为“原液”，尔后再将各原液加水稀释成5倍、25倍等三个不同稀释浓度溶液为试验样品。
试验方法：
小鼠：瑞士小鼠、健康、体重为14克上下，雌雄不限；
分组：按菌种配合条件，将小鼠分为6个试验组，每组小鼠9只；尔后再将各组分为原液、5倍稀释液、25倍稀释液三个亚组，每亚组小鼠3只，设对照组。
样品注射剂量及途径：
样品液0.5毫升，腹腔注射；
观察项目：
1、实验前称量小鼠体重(克)；观察小鼠注射试验样品后体重增、减数，注射试验后第4日分别称量各组小鼠体重数，统计学分析处理；
2、小鼠生活状况：观察小鼠于实验后是否健康、活泼、毛皮光泽，体重增加等，有无毒副反应等状况。
样品批号  小鼠只数   样品剂量  试验前小鼠体重(g)         试验后第四日
体重(g) 平均体重增长(g/只)
I   333   原液5倍25    403844   505261   3.334.665.66
II   333   原液5倍25倍    424539   506162   2.665.337.66
III  333   原液5倍25倍  454243  536161  2.666.336.00
IV 333 原液5倍25倍 424343 565459.5 4.663.665.50
V  333   原液5倍25倍  464443  5455555  2.663.834.00
VI  333   原液5倍25倍  424138  465053  1.333.005.00
对照  3   蒸馏水  42  50  2.66
试验结果表明：原液(样品与水1∶10溶液)与对照组比较无多大差异；I、II、III、IV、V、VI各组小鼠均健存无一死亡。未见有毒、副反应表现。
一次性给试验样品量0.5ml/只，试验结果表明其原倍稀释液及对照组无什么差异，而其5倍、25倍稀释液注射的各组小鼠体重明显增加，尤以I、II、III、IV批号样品溶液注射的小鼠体重增加为大。
另外还做试验如下：
食物：蓖麻饼制取酵母，酵母粉过100目筛，于实验前制成40％及30％浓度混悬液，置4度冰箱保存，备用；
动物：昆明种小白鼠，体重18-22克，雌雄各半；
方法与结果：
1、小鼠20只，饥饿16小时，给小鼠灌胃40％蓖麻饼制取酵母，按30ml/kg(相当12g/kg)观察7日，小鼠饮食、活动均正常，无毒性反应，无死亡，因蓖麻饼制取酵母配制已达最大浓度，灌胃体积限制，未能测出LD50(半致死量)。
2、小鼠20只，饥饿16小时，给小鼠灌胃30％蓖麻饼制取酵母30ml/kg，24小时内灌胃4次，每次间隔4小时以上，总剂量为36g/kg，观察7日，小鼠饮食、活动均无异常、无毒性反应、无死亡。
3、小鼠20只，给小鼠灌胃30％蓖麻饼制取酵母30ml/kg(相当9g/kg)，每日一次，连续灌胃一周，小鼠饮食、活动均无异常、无毒性反应、无死亡。
上述实验结果表明，蓖麻饼制取酵母毒性很低，适于用作动物饲料。
稳定试验：
1、菌种：J3-20、J5-16、J5-7
2、接种量为10％(以蓖麻饼为培养基)
3、种龄16小时培养24小时
根据最佳工艺培养条件(即A3B4C3)，进行了十批次的稳定试验，其结果列入下表：
 批次   种子OD   发酵OD   PH值   残糖Bx   得率％   蛋白质％
 1   0.43   0.60   2.7   1   53   67
 2   0.42   0.63   3.0   1   51   64
 3   0.44   0.67   2.9   0   54   65
4 0.38 0.64 3.1 1 59 65
 5   0.39   0.71   3.0   0   50   63
 6   0.41   0.68   3.6   1   52   62
 7   0.37   0.64   3.5   1   53   64
 8   0.44   0.66   3.3   0   55   65
 9   0.45   0.69   3.4   1   51   67
 10   0.40   0.70   2.9   1   56   63
 平均   0.41   0.67   3.1   1   53.4   64.6
从生产周期及生产成本及以上试验结果出发，并根据酵母菌对蓖麻饼适宜的生长情况和生产实际需求，考虑到酵母菌除有很强的发酵能力外，还能使发酵物产生酯的香味；曲霉菌是很好的糖化菌；木霉能产生多种纤维素酶，能很好的分解纤维素，因此产用多菌种联合进行发酵，这样发酵的效果比原来单菌种常规发酵的发酵力、糖化力和纤维素分解力都强。最后确定本发明所选菌种为产朊假丝酵母(Candida utilis)、鲁氏酵母(Sacch yauxii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzat)、康化木霉(Trichodenua koningii)、绿色木霉(Trichoderma uiride)。多菌种联合发酵，菌种生长旺盛，抑制杂菌能力强，有脱毒作用，且产生香气，是理想的实验菌种。多菌种发酵实验结果见下表(蓖麻饼培养基)：
  OD值   残糖Brix   粗纤维％   蛋白质％
常规发酵    0.48     1     8.7     48
多菌种发酵    0.60     0     3.6     65
最后我们确定适宜的菌种为产朊假丝酵母(Candida utilis)、鲁氏酵母(Sacch yauxii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzat)、康化木霉(Trichodenua koningii)、绿色木霉(Trichoderma uiride)，发酵时间为16-18小时，设计实际生产的工艺流程如附图1。
主要设备：
名称 规格 用途
罗氏鼓风机 40m3/分钟 通风
6个试管 原菌活化
2个三角瓶 500ml 一级种子培养
20个三角瓶 1000ml 二级种子培养
种子罐 0.25m3 培养三级种子
种子罐 1.0m3 培养四级种子
种子罐 2.0m3 培养五级种子
发酵罐 20m3 发酵培养
板框过滤器 明流式 过滤
干燥机 干燥
粉碎机 粉碎
设备的选择不是唯一的，尤其是种子培养器皿(包括试管及三角瓶等)、种子罐和发酵罐。只要完成本发明的任务，且采用本发明所公开的菌种实例和发酵条件，都属于本发明公开的范围。选择设备只要能完成饼粕的粉碎、筛分、风选、种子的培养、发酵即可。
具体工艺过程如下：
1、蓖麻饼处理：蓖麻饼用粉碎机粉碎后过40-60目筛，这样可脱壳70％，之后筛下料再用粉碎机粉碎过40-60目筛，过二遍筛后脱壳率可达80％，再经鼓风机风选一遍，这样风选后脱壳可达90％，所得料含蛋白质50％以上；
2、风选后与酒糟混合(1∶0.5-1))，加水(1∶10)，调pH值为4.5-5.0，常规灭菌(1.05kg/cm2、121.3℃、20分钟)后使用；
3、菌种的培养：菌种(菌种总量确定，各菌种相互间比例没有要求)逐级常规扩大培养为五级种子；首先进行原菌活化，在6个试管中分别装入1/5体积的麦芽汁琼脂培养基，常规灭菌，摆斜面后冷却分别接入原菌(勾一白金耳)，29±1℃培养48小时；一级和二级种子培养用麦芽汁液体培养基，装液量30-45％，常规灭菌，接菌量3-5％，控制温度29±1℃，一级种子通风振荡培养24hr，二级种子通风振荡培养14hr；三级到五级种子培养的培养基选用黄粉∶水＝1∶10，均再加适量营养盐(尿素、MgSO4、K2HPO4等)，常规灭菌，三级种子培养10小时，四级种子培养10小时，五级种子培养10小时，容器装液量均为40-60％，接菌量都为3-5％，控制温度29±1℃，均通风培养；
4、发酵培养：采用工厂流加方法，在发酵罐中加入筛后风选的蓖麻饼与酒糟的混合物(即步骤2后的产品)，控制装液量为罐体积的40-60％，再加适量营养盐，pH值控制在4.5-5.0，接入3-5％的五级种子，温度为35±1℃，通风发酵培养16-18小时；
5、制备：经过发酵培养的酵母液经板框过滤器过滤后用干燥机干燥、粉碎、包装。
此方法生产的饼粕饲料与常规饲料相比优点是很多的：首先它的蛋白质含量可达60％以上，这和它与同价值的常规饲料相比要高出20％的蛋白质；其次蓖麻饼粕中含有促生长因子，这样用它作饲料对猪、鸡的生长速度有着十分明显的促进作用，比用常规饲料喂的猪、鸡能多增重10％-15％，经济效益是可佳的。另外用此法生产的饲料比常规方法生产的饲料气味好，适口性强，能促进动物食欲。
产品分析：
1、常规分析：
其中含水分：(7.94％)；灰分：(3.83％)；脂肪：(2.99％)；蛋白质：(62.5％)；总糖：(7.30％)。
2、维生素分析(共七种)：
用岛津910薄层层析扫描仪测定维生素含量：维生素A(8.60mg/100g)；维生素E(0.36mg/100g)；维生素B1(0.66mg/100g)；维生素B2(0.14mg/100g)；维生素Vc(0.48mg/100g)；维生素Vpp(3.70mg/100g)；维生素VD(1.10mg/100g)。
3、氨基酸分析：(日立835-50型氨基酸自动分析仪)
名称 百分比含量  各种氨基酸占氨基酸总量的百分比
天门冬氨酸 5.77  11.65
苏氨酸 2.52  5.06
丝氨酸 1.54  3.06
谷氨酸 7.56  15.32
甘氨酸 2.91  5.55
丙氨酸 2.96  5.65
胱氨酸 0.47  0.90
缬氨酸 3.30  6.25
蛋氨酸 0.98  1.95
异壳氨酸 2.64  5.30
亮氨酸 4.05  7.90
酪氨酸 1.77  3.45
苯丙氨酸 2.24  4.40
赖氨酸 4.15  8.50
组氨酸 1.16  2.25
精氯酸 2.80  5.50
脯氨酸 3.38  6.75
总量 50.20
我们还在鸡场做如下试验：采用本发明的蓖麻酵母代替原鸡饲料配方中的鱼粉(等量替代)进行试验，结果表明无论是鸡体重增重方面，还是产蛋率方面均无异常现象发生。同时此种方法的生产成本及销价仅为采用玉米黄粉为原料生产饲料酵母或固体发酵法生产饲料酵母成本的1/2左右。
综上所述，采用本方法制取的蓖麻饼粕饲料具有原料来源广泛、生产工艺简单、生产成本低，脱毒、脱壳效果明显，蛋白质含量高，产品收率高，动物食用后增重快等优点。
实施例：
1、0.86吨的蓖麻粕用粉碎机粉碎后过40目筛得0.68吨料，再用粉碎机粉碎过40目筛，可得0.65吨料，再经鼓风机风选一遍得0.6吨料(40m3/分钟)，含蛋白57％；
2、风选后与0.6吨酒糟混合，都加入20m3发酵罐中，加入12吨水，加适量营养盐(尿素0.012吨、1000gMgSO4、4000gK2HPO4)，控制pH值4.7，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却后接入0.6吨五级种子，温度35℃，通风发酵培养18小时；
3、经过发酵培养18小时的酵母液经板框过滤器过滤后用干燥机干燥、粉碎、包装，得成品1.1吨；
4、种子培养过程如下：
(1)原菌活化(斜面种子培养)：取6支试管，每支试管都装入1/5体积的麦芽汁琼脂培养基，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，摆斜面，冷却，再将6种原菌勾一白金耳，分别接至斜面上，每个试管接一种菌，29℃恒温培养48小时；
(2)一级种子培养：取2个500ml三角瓶，每个三角瓶装入180ml麦芽汁液体培养基，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却，每个三角瓶内再接入半试管每种原菌的斜面种子，置往复式摇床，于29℃通风振荡培养24小时；
(3)二级种子培养：取20个1000ml三角瓶，每个三角瓶装入360ml麦芽汁液体培养基，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却，每个三角瓶接入18ml一级种子，置往复式摇床，于29℃通风振荡培养14小时；
(4)三级种子培养：将0.015吨黄粉加入0.25m3发酵罐中，加入0.15吨水，加入0.00015吨尿素，12.5gMgSO4，50gK2HPO4，控制pH＝5，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却，加入0.0075吨二级种子，于30℃通风培养10小时；
(5)四级种子培养：将0.06吨黄粉加入1m3发酵罐中，加入0.6吨水，加入0.0006吨尿素，50gMgSO4，200gK2HPO4，控制pH＝5，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却，加入0.03吨三级种子，于30℃通风培养10小时；
(6)五级种子培养：将0.11吨黄粉加入2m3发酵罐中，再加入1.1吨水，加入0.0012吨尿素，100gMgSO4，400gK2HPO4，控制pH＝4.5，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却，加入0.06吨四级种子，于30℃通风培养10小时。

Claims (1)

1、一种蓖麻饼粕脱毒脱壳生产蛋白饲料的方法，其步骤如下：
(1)蓖麻饼脱壳处理：蓖麻饼用粉碎机粉碎机粉碎后过40-60目筛，之后筛下料再用粉碎机粉碎过40-60目筛，再经鼓风机风选一遍；
(2)蓖麻饼经粉碎、筛分、风选后与酒糟按1∶0.5-1的比例混合，再按1∶10的比例加入水，控制pH值为4.5-5.0，1.05kg/cm2、121.3℃条件下灭菌20分钟，冷却；
(3)菌种培养：
原菌活化：在6只试管中分别装入1/5体积的麦芽汁琼脂培养基，常规灭菌，摆斜面后冷却，将6种原菌即产朊假丝酵母(Candida utilis)、鲁氏酵母(Sacch yauxii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzat)、康化木霉(Trichodenua koningii)、绿色木霉(Trichodermauiride)分别勾一白金耳，各自接至斜面上，控制温度29±1℃，培养48hr；
一级种子培养：用2只500ml三角瓶，每只瓶中装入30-45％的麦芽汁液体培养基，常规灭菌，每只三角瓶中分别接入6种活化后的原菌共3-5％，控制温度29±1℃，通风振荡培养24hr；
二级种子培养：用麦芽汁液体培养基，用20只1000ml三角瓶，每只瓶中培养基占30-45％，常规灭菌后每只三角瓶接入3-5％的一级种子，保持温度29±1℃，通风振荡培养14hr；
三级种子培养：培养基选用黄粉∶水＝1∶10，用0.25m3的种子罐，装液量40-60％，再加适量营养盐，控制pH值4.5-5.0，常规灭菌，接入3-5％的二级种子，保持温度29±1℃，通风培养10小时；
四级种子培养：培养基选用黄粉∶水＝1∶10，用1m3的种子罐，装液量40-60％，再加适量营养盐，控制pH值4.5-5.0，常规灭菌，接入3-5％的三级种子，保持温度29±1℃，通风培养10小时；
五级种子培养：培养基选用黄粉∶水＝1∶10，用2m3的种子罐，装液量40-60％，再加适量营养盐，控制pH值4.5-5.0，常规灭菌，接入3-5％的四级种子，保持温度29±1℃，通风培养10小时；
(4)发酵培养：采用工厂流加方法，在发酵罐中加入步骤(2)后的产品，控制装液量为罐体积的40-60％，加适量营养盐，接入3-5％的五级种子，控制pH值4.5-5.0，保持温度为35±1℃，通风发酵培养16-18小时；
(5)制备：经过发酵培养的酵母液经板框过滤器过滤后用干燥机干燥、粉碎、包装便得本发明的产品。
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