CN110791434B

CN110791434B - 一种评价转基因植物对其内生微生物影响的方法

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Publication number: CN110791434B
Application number: CN201911100447.5A
Authority: CN
Inventors: 曹伟平; 杜立新; 宋健; 郭庆港; 鹿秀云
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2019-11-12
Filing date: 2019-11-12
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2039-11-12
Also published as: CN110791434A

Abstract

本发明提供了一种评价转基因植物对其内生微生物影响的方法。其中，分离植物内生微生物的方法包括如下步骤：1)采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；2)从所述消毒植株上获取待分离所述内生菌的部位组织；3)向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；4)对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析。本发明的方法可用于评价转基因植物对其内生微生物的影响，特别是用于评价转基因植物例如转基因棉花在苗期对其内生微生物的影响。

Description

一种评价转基因植物对其内生微生物影响的方法

技术领域

本发明提供了一种分离植物内生微生物的方法，特别是其在评价转基因植物对内生微生物影响中的应用。

背景技术

1996年至2016年间，转基因作物在全球的种植面积为181.5亿公顷(ISAAA，2017年)。转基因作物在很大程度上成功地缓解了许多重大农业挑战，为世界各地的种植者带来了诸多好处。尽管转基因作物给农业生产带来了具有巨大经济效益，转基因作物仍在生物安全和生态兼容性方面存在着争议，包括它们对植物内生微生物的影响。

土壤中的一些微生物群落通过植物根际可能会进入植物的根、茎及叶片，成为内生微生物。植物内生细菌能够在健康植物组织和器官内定殖生活，但对植物不造成实质性的伤害，与植物形成互相约束、互惠互利的关系，在促进植物生长和防治植物病害方面发挥着重要作用，大多数高等植物中普遍存在内生细菌。例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)通过分泌各种代谢产物，促进植物生长，并控制植物疾病。枯草芽孢杆菌B-916成功地控制了江苏省水稻稻曲病和纹枯病。

植物内生细菌能与植物形成长期的合作关系，这从一定层面上可以说明内生细菌在植物中占据稳定的生态位，容易定殖植物体内的各个组织内部。但随着转基因植物的使用增加时，植株内外源物质的产生是否直接或间接地影响内生菌产生拮抗物质从而削弱其生防作用有待商榷，因此有必要进行研究以确定转基因植物是否会影响到植物内生微生物的生物量。

在转基因棉花环境安全性评价方面，环境微生物评价一直是一个研究热点，由于微生物种类多、数量大、个体小、繁殖快，且对于环境因素的改变极其敏感，能够很好地指示生态环境的细微变化，是一种理想的监测转基因作物对生态环境影响的指标。然而文献报道的接入内生菌实验中，所用内生菌浓度影响了含菌量的检测，同时现有技术中的植物内生可培养细菌的分离方法通常采用清洗-剪切分段-分段消毒-组织捣碎-组织液涂布培养，在较长的消毒过程中消毒液很容易通过截断面浸入植物组织内从而导致部分内生细菌的死亡；或者通过二次剪切将植物片段边缘过度消毒部分去除，同时采用榨汁机在预冷条件下打碎植物组织，虽然在一定程度上避免了内生细菌源的减少，但适合提取较大量的植物组织，不适用于植物样品量较少的植株内生细菌的测定。

因此，为了对转基因棉的生物安全性需要进行较长时间的跟踪监测，有必要开发出一种有效地检测棉花内生细菌动态生长的研究方法，以评价转基因棉对内生微生物的影响。

发明内容

本发明之一提供了一种分离植物内生微生物的方法，其包括如下步骤：

1)采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株(包括根系)浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；

2)从所述消毒植株上获取待分离所述内生菌的部位组织；

3)向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；

4)对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析。

在一个具体实施方式中，在步骤1)中，所述消毒液为酸化的氯化汞水溶液。

在一个具体实施方式中，在步骤1)之前还包括如下步骤：

I)将所述植物的种子用内生指示菌浸泡之后播种于土壤中，出苗，使所述植物生长到目标大小(可以根据具体实验要求来确定所述植物的大小或所述植物的生长天数，这根据本领域技术常规可以确定，例如，可以为本发明实施例中的所述植物的子叶完全展开后的第1、7、14、21、28和35天中的至少一个阶段)，得到目标大小的所述植物。

或者，在一个具体实施方式中，在步骤1)之前的步骤I)替换为：

II)将所述植物的种子播种于土壤中，出苗后，用所述内生指示菌灌根(例如在所述植物的子叶完全展开后用所述内生指示菌灌根)，使所述植物生长到目标大小(可以根据具体实验要求来确定所述植物的大小或所述植物的生长天数，这根据本领域技术常规可以确定，例如，可以为本发明实施例中的灌根后的第1、7、14、21、28和35天中的至少一个阶段)，得到目标大小的所述植物。

在一个具体实施方式中，所述内生指示菌的浓度为1×10⁹至1×10¹⁰cfu/mL。

在一个具体实施方式中，所述内生指示菌含有荧光蛋白标记基因和/或抗生素标记基因。

在一个具体实施方式中，在播种之前，将所述土壤灭菌。

在一个具体实施方式中，在所述种子用所述内生指示菌浸泡之前，将所述种子先后浸泡入第二消毒液和第三消毒液中做消毒处理。

在一个具体实施方式中，所述第一消毒液和所述第二消毒液独立地为酸化的氯化汞水溶液，所述第三消毒液为乙醇消毒液。

在一个具体实施方式中，所述第三消毒液为75％(v/v)的乙醇消毒液。

在一个具体实施方式中，所述酸化的氯化汞水溶液中的氯化汞的质量浓度为0.05％至 0.2％，其中，所述酸化的氯化汞水溶液经盐酸酸化，以36wt％的盐酸的体积计，所述盐酸 (即36wt％的盐酸)在所述酸化的氯化汞水溶液中的体积浓度为20‰至30‰。例如，所述酸化的氯化汞水溶液中的氯化汞的质量浓度为0.1wt％；所述盐酸在所述酸化的氯化汞水溶液中的体积浓度为25‰(即1L酸化的氯化汞水溶液中含有25mL的36wt％的盐酸)。

在一个具体实施方式中，在步骤1)，将所述植物的整株植株从土中移出，用无菌水冲去根部的附着土，将所述整株植株浸入所述消毒液中，8-12分钟之后将所述整株植株从消毒液中取出，接着用无菌水冲淋，从而得到所述消毒植株。

在一个具体实施方式中，以所述缓冲液的总质量计作100％，所述烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的含量为0.5％至1.5％；所述缓冲液的pH值为7.2至7.6。

在一个具体实施方式中，所述缓冲液为PBS缓冲液。

在一个具体实施方式中，在步骤3)中，向放有所述组织的容器中加入所述缓冲液之后在研磨之前加入液氮预冷。

在一个具体实施方式中，所述容器为组织研磨器。

在一个具体实施方式中，研磨时间为5至10分钟。

在一个具体实施方式中，在步骤4)中，将所述组织研磨液系列稀释之后，将各梯度的稀释液涂布于固体微生物培养基中培养。

在一个具体实施方式中，所述后续分析包括所述微生物的菌落计数和/或所述微生物的种类鉴定。

在一个具体实施方式中，所述植物为棉花、玉米和小麦中的至少一种。

本发明之二提供了本发明之一中任意一项所述的方法在评价转基因植物对其内生微生物影响中的应用。

在一个具体实施方式中，本发明之一中任意一项所述的方法在评价转基因植物在苗期对其内生微生物影响中的应用。

本发明的有益效果：

1、植物种子浸种及灌根处理的内生指示菌浓度为用1×10⁹至1×10¹⁰cfu/mL，可以保证内生指示菌一定时间内在植物植株的不同组织具有可检测到的含菌量。

2、植株采用整株消毒，无菌水充分淋洗后再进行组织分段，最大限度的保留了更多的内生菌源。

3、组织研磨液采用含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的PBS缓冲液对内生菌的富集效果明显。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明实施例仅为示例性的说明，该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

转基因植物对植物内生菌尤其是有益内生菌的影响是评价转基因植物环境安全性的一项重要内容。在评价转基因植物对其内生菌影响之前，首先应该确立一种方便可行的分离植物内生菌的方法，特别是能最大限度反应内生菌真实定植情况的植物内生菌分离方法尤为重要。使用所确立的最大限度反应所述分离的内生菌的真实定植情况的方法，才能更为客观真实地反应转基因植物对其内生菌影响。

内生指示菌B916-gfp由中国农业科学院植物保护研究所提供，其同时具有绿色荧光特性(含有gfp标记基因)和氯霉素抗性(含有氯霉素抗性标记基因)。

实施例1

指示内生细菌不同浓度浸泡棉花种子处理

1、土壤灭菌

称取1000g自然风干壤土置于可高温高压灭菌的PE袋中，于高压灭菌锅(LDZX-40BI，上海申安)内，在温度为121℃、压力为0.105MPa下湿热灭菌3次，每次灭菌3h，每间隔24h灭菌1次。

2、内生指示菌培养

将内生指示菌B916-gfp在含有5μg/mL氯霉素的LB平板培养基上进行活化，待长出单菌落后接到含有5μg/mL氯霉素的200mL/500mL的LB液体培养基中，30℃，200rpm摇床培养至芽孢形成，10000rpm离心浓缩。

3、种子消毒

棉花种子首先用0.1wt％酸化HgCl₂水溶液(1L水溶液中含25mL 36wt％盐酸)表面消毒 5min，然后用75％(v/v)乙醇消毒5min，将表面消毒后的棉花种子用无菌双蒸馏水冲洗4 次。随机选择处理的10粒种子放置在LB琼脂平板培养基上，28℃下孵育48h，以检测种子表面消毒情况，从而保证棉花种子表面无菌。

4、内生细菌菌液浸泡种子

将步骤3中的种子用无菌蒸馏水浸泡20小时，滤去蒸馏水后分别将种子置于无菌水配置的1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、1×10¹⁰CFU/ml的B916-gfp菌液中，菌液浸没种子即可，在摇床28℃、120rpm振荡浸泡4小时。之后将每处理棉花种子转移到塑料盆中(所选塑料盒上口直径17.5cm，下口直径10cm，深度16cm，放步骤1中灭菌土1200g，用无菌水浇透)，每个塑料盆中均匀摆放4粒棉花种子，种子上覆无菌土1.5cm厚，最后上覆无菌保鲜膜。在棉花种子发芽长出子叶后去除保鲜膜，待子叶完全展开后，在第1、7、14、21、28和35天后采集幼苗。同时设定未用B916-gfp菌液浸泡的种子为对照。每处理重复5次。

5、内生指示菌在棉株内的定殖检测方法

(1)植株消毒

在每个取样时期，小心地将棉花植株从塑料盆中移出，用无菌水冲去根部附着土，将整棵植株浸入装有0.1wt％酸化的HgCl₂水溶液(1L水溶液中含25mL 36wt％盐酸)的大玻璃管中，10分钟后将植株用无菌水冲淋5次。叶片样品取自棉株顶部，茎部取植株上部、中部和下部各一段，根部同时选取主根和次生根。

(2)组织研磨

分别取步骤1中各组织样品500mg，在无菌条件下用无菌剪将各组织尽量剪碎，分别装入2ml无菌研磨管内，加入含有1％(v/v)烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的PBS缓冲液(pH 7.4)1ml后，放入5粒直径为2mm大小的灭菌磁珠，研磨之前在快速组织研磨器(型号Tissue-prp-03)空腔中加入少量液氮用以预冷，振动频率设置为3000次/分钟，研磨5分钟，研磨彻底后将匀浆液用含有1％(v/v)烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯(v/v)的PBS缓冲液(pH 7.4)补充到2mL，震荡混匀后，得到组织研磨液。

(3)菌落计数

步骤2中的组织研磨液静置5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍、100倍和1000倍，移液器吸取100μL至添加5μg/ml氯霉素的LB琼脂平板上，并均匀涂布，30℃下培养120小时。在紫外光下(366nm)计数绿色荧光菌落数量，计算含菌量，结果见表1。

表1不同浓度的B916-gfp菌液浸泡棉花种子后所生长的不同棉花组织含菌量(×10³cfu/g)

注：“/”表示没有分离到B916-gfp。

结果表明，采用5×10⁹、1×10¹⁰孢子/mL的内生细菌B916-gfp浸泡的种子，在棉花苗期初期的茎部可分离到B916-gfp，在调查期间，随着棉苗的生长，在棉株根、茎、叶组织中均可分离到较多数量的内生菌，所分离到的内生菌的含量明显高于较低浓度菌液处理种子发育的棉株。

实施例2

不同浓度指示内生细菌浇灌棉株

土壤灭菌、内生细菌培养以及种子消毒处理等同实施例1。

不同之处在于：

将步骤3中的种子用无菌蒸馏水浸泡24小时后，在育苗盘上用灭菌蛭石育苗，待棉花种子发芽，生长至子叶完全展开后，将其移至塑料盆中(所选塑料盒同步骤1))，塑料盒中放灭菌干土1200g，在土表层分别浇灌浓度为1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、 1×10¹⁰孢子/mL B916-gfp菌液150mL，使得土壤充分浸透，之后采用无菌水浇水管理。在灌根接种后第1、7、14、21、28和35天采集幼苗测定不同组织中B916-gfp的活菌量，结果见表2。

表2不同浓度的B916-gfp菌液灌根棉株后不同组织的含菌量(×10³cfu/g)

注：“/”表示没有分离到B916-gfp。

结果表明，应用不同浓度的内生指示菌菌液对作物进行灌根处理，内生指示菌在作物不同组织内的定殖能力存在明显差异，较高浓度的菌液处理，在棉株不同组织内均可分离到内生指示菌，浓度为5×10⁹、1×10¹⁰孢子/mL B916-gfp灌根处理的棉株，灌根1天后即可在根茎叶各组织内分离到B916-gfp，内生指示菌含量明显高于低浓度内生指示菌灌根处理的棉株内生菌含量。

实施例3

棉花组织不同消毒方法的对比

选取实施例1中处理第7天的棉株，采用三种不同的消毒方法比较不同组织所测含菌量的差异。

方法3.1：同实施例1，即整株消毒。

方法3.2：流水整株植株清洗-剪切分段-分段消毒-组织捣碎-组织液涂布培养，所使用的消毒液和其他操作同实施例1。

方法3.3：流水整株植株清洗-剪切分段-分段消毒-剪去片段边缘-组织捣碎-组织液涂布培养，所使用的消毒液和其他操作同实施例1。

结果见表3。

表3棉花组织不同消毒方法含菌量比较(×10³cfu/g)

注：“/”表示没有分离到B916-gfp。

结果表明，与方法3.2和方法3.3相比，方法3.1的消毒方法，在一定程度上提高了内生菌源的含菌量，最大限度的保留了更多的内生菌源，说明方法3.1的整株消毒策略更优。

实施例4

不同组织研磨液对内生指示菌富集效果的影响

选取实施例1中处理第7天的棉株，采用三种不同的研磨液来研磨各组织，以比较不同组织研磨液对所测含菌量的影响。

方法4.1：0.9wt％生理盐水，其他操作同实施例1。

方法4.2：PBS(pH7.4)缓冲液，其他操作同实施例1。

方法4.3：同实施例1，即使用的缓冲液为含有1wt％烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯 (v/v)的PBS缓冲液(pH 7.4)。

方法4.4：使用的缓冲液为含有0.5wt％烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯(v/v)的PBS 缓冲液(pH 7.2)，其他操作同实施例1。

方法4.5：使用的缓冲液为含有1.5wt％烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯(v/v)的PBS 缓冲液(pH 7.6)，其他操作同实施例1。

结果见表4。

表4棉花组织不同消毒方法含菌量比较(×10³cfu/g)

结果表明，方法4.3至方法4.5的缓冲液与方法4.1的生理盐水或方法4.2的PBS缓冲液相比，其富集到的内生指示菌含量明显增加，可以明显降低组织匀浆后的沉淀过程中造成的内生指示菌流失，说明含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的PBS缓冲液更优；进一步地，烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯含量在1wt％，缓冲液pH在7.4时最优。

实施例5

指示内生指示菌在不同作物上的灌根处理

比较棉花、小麦和玉米在苗期浇灌浓度为5×10⁷、5×10⁸、5×10⁹cfu/mL的B916-gfp菌液后，棉花、玉米和小麦不同组织内B916-gfp的含菌量。

土壤灭菌、内生指示菌培养以及种子消毒处理等同实施例1。

在步骤3中处理棉籽时，仍需用无菌水浸泡棉花种子24小时。不同之处在于：

1)玉米种子和小麦种子无需浸泡；

2)将各种子转移到塑料盆中(所选塑料盒上口直径17.5cm，下口直径10cm，深度16cm，放步骤1中灭菌土1200g，用无菌水浇透)，种子上覆无菌土1.5cm厚，棉籽和玉米种子在每个塑料盆中均为均匀摆放4粒，小麦种子在每个塑料盆中摆放8粒，最后上覆无菌保鲜膜。各种子发芽出土后去除保鲜膜，待子叶完全展开，土壤稍干后在土表层分别浇灌浓度为5×10⁷、5×10⁸、5×10⁹cfu/mL B916-gfp菌液150mL，使得土壤充分浸透，之后采用无菌水浇水管理。

灌根接种后1天、7天采集幼苗测定不同组织中B916-gfp的活菌量(方法同实施例1)。结果见表5。

表5B916-gfp在不同作物上的灌根处理含菌量比较(×10³cfu/g)

注：“/”表示没有分离到B916-gfp。

结果表明，与5×10⁷、5×10⁸孢子/mL灌根处理相比，采用5×10⁹孢子/mL的内生指示菌灌根处理，处理1天、7天后在不同植株的根、茎、叶中均可分离到指示内生指示菌。说明此种方法也可以用于分离其他作物的内生指示菌。

综上，采用整株消毒以及使用含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的PBS缓冲液作为研磨缓冲液可以最大限度的检测到棉株不同组织的指示内生指示菌。

虽然本发明已经参照具体实施方式进行了描述，但是本领域的技术人员应该理解在没有脱离本发明的真正的精神和范围的情况下，可以进行的各种改变。此外，可以对本发明的主体、精神和范围进行多种改变以适应特定的情形、材料、材料组合物和方法。所有的这些改变均包括在本发明的权利要求的范围内。

Claims

1.一种分离植物内生微生物的方法，其包括如下步骤：

1）采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；所述第一消毒液为酸化的氯化汞水溶液；

2）从所述消毒植株上获取待分离内生菌的部位组织；

3）向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；所述缓冲液为PBS缓冲液；以所述缓冲液的总质量计作100%，所述烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的含量为0.5%至1.5%；所述缓冲液的pH值为7.2至7.6；

4）对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析；

在步骤1）之前还包括如下步骤：

I）将所述植物的种子用内生指示菌浸泡之后播种于土壤中，出苗，使所述植物生长到目标大小，得到目标大小的所述植物；所述内生指示菌含有荧光蛋白标记基因和/或抗生素标记基因；所述内生指示菌的浓度为1×10⁹至1×10¹⁰cfu/mL；

在步骤1）之前的步骤I）替换为：

II）将所述植物的种子播种于土壤中，出苗后用所述内生指示菌灌根，使所述植物生长到目标大小，得到目标大小的所述植物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在播种之前，将所述土壤灭菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述种子用所述内生指示菌浸泡之前，将所述种子先后浸泡入第二消毒液和第三消毒液中做消毒处理。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二消毒液为酸化的氯化汞水溶液，所述第三消毒液为乙醇消毒液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第三消毒液为75%v/v的乙醇消毒液。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸化的氯化汞水溶液中的氯化汞的质量浓度为0.05%至0.2%，其中，所述酸化的氯化汞水溶液经盐酸酸化，以36wt%的盐酸的体积计，所述盐酸在所述酸化的氯化汞水溶液中的体积浓度为20‰至30‰。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1），将所述植物的整株植株从土中移出，用无菌水冲去根部的附着土，将所述整株植株浸入所述第一消毒液中，8-12分钟之后将所述整株植株从消毒液中取出，接着用无菌水冲淋，从而得到所述消毒植株。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，向放有所述组织的容器中加入所述缓冲液之后在研磨之前加入液氮预冷。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述容器为组织研磨器。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，研磨时间为5至10分钟。

11.根据权利要求1至10中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤4）中，将所述组织研磨液系列稀释之后，将各梯度的稀释液涂布于固体微生物培养基中培养。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述后续分析包括所述微生物的菌落计数和/或所述微生物的种类鉴定。

13.根据权利要求1至10中任意一项所述的方法，其特征在于，所述植物为棉花、玉米和小麦中的至少一种。

14.根据权利要求1至10中任意一项所述的方法在评价转基因植物对其内生微生物影响中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述应用为评价转基因植物在苗期对其内生微生物影响中的应用。