CN102911894B - 降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法和在防治植物黄萎病上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有防治植物黄萎病功能的内生菌的获得方法及其应用，属于生物技术领域。所述的降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法，是把从植物体内分离得到的植物内生细菌的菌体与大丽轮枝菌毒素混合培养，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定混合培养后的蛋白条带与原毒素的蛋白条带进行比较，混合培养体系缺少了26KD蛋白条带的为目的菌株。该方法目标明确，机理清楚。解决了生物防治土传病害中的生防微生物受土壤环境影响大，效果不稳定的缺点。本发明利用大丽轮枝菌的致病特点和植物内生细菌在植物体内传导的特性，直接针对引起植物病害的黄萎病菌毒素筛选降解毒素的内生细菌以达到有效防治植物黄萎病的目的。

Description

降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法和在防治植物黄萎病上的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及植物内生细菌通过降解大丽轮枝菌毒素的方法来有效防治植物黄萎病的危害。

背景技术

大丽轮枝菌可引起植物黄萎病，该病是一种危害性极大的维管束系统病害，该病特征：感病植物叶片变黄，久旱遇雨，叶片骤然萎蔫，故称“黄萎病”。大丽轮枝菌寄主范围广泛，其寄主植物多达660种。其中农作物184种，观赏植物323种，杂草153种。在农作物中对棉花、马铃薯、茄子、番茄、辣椒等都具有侵染性，且能够相互转染。而禾木科作物比如水稻、麦类、玉米等以及某些杂草则侵害很少。近年来，黄萎病在我国主产农作物区相继造成严重危害，黄萎病已成为严重影响我国农作物高产稳产的主要障碍，尤以落叶型黄萎病为严重。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)归属于淡色菌科丛梗孢轮枝菌属，具有独特的形态学特征。通过显微镜观察，该菌分生孢子梗细，数量少且透明，分生孢子较小，一般为3-6×1.5-2.0μm，富含黑色微菌核。大丽轮枝菌以微菌核和孢子形态存在土壤中，条件适宜微菌核和孢子萌发产生侵染器官，从植物根部侵入进入植物体内，部分菌体形成单细胞形态在植物根茎叶的筛管中传导和增殖，并分泌毒素，刺激植物细胞增生，堵塞筛管，引起植物萎蔫。

大丽轮枝菌属土传性非专性寄生菌，在温度25-28℃，相对湿度在80％以上，此病容易发生流行。棉花定植后1个月左右开始，地上部位出现病症，一直到收获结束时持续发病。最初，下部叶片局部萎蔫，叶边上卷。之后，病部由黄白色转为黄色，叶片边缘变色较多，以小叶脉为中心呈楔形。接下来，变色部位逐渐扩大，整片小叶变黄，慢慢褐变枯死。病害加重时，上部叶片也依次发病枯死，并导致下部叶片慢性枯萎，剖检病株叶柄和整，可见导管部有黄褐变。

生物防治被认为是最具有发展潜力的重要防治方法，而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。吴献忠（植物病理学报,1996,26(3):281-282）采用等电点聚焦技术分析棉花黄萎病菌纤维素酶同工酶，分析表明电泳谱带为8条的均为落叶型菌系。将我国棉花黄萎病菌划分为3个生理型，即落叶型黄萎菌株致病力最强，占15.7%；叶枯型菌株为中等致病力，占54.2%；黄斑型菌株属弱致病力，占30.1%。王慧萍等（南京师范大学报,2005,28(2):83-85）筛选了一株抗茄子黄萎病的芽孢杆菌F53，改良后的该菌株发酵条件对黄萎病菌具有很好的抑菌活性。雷白时（安徽农业科学,2009,37(2):672-674）从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株，复筛得到强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株。李术娜（中国农学通报,2009,25(15):26-30）考察了拮抗细菌2-70在棉花体内的定殖试验，结果表明该菌不仅能在灭菌土和非灭菌土中定殖，而且五个月后仍能保持较高的抑菌活性。

关于黄萎病菌的致病机制，病原菌在植株体内产生毒素作用的结果。在病原菌侵染寄主，即由粘附接触→入侵→繁殖扩展→显症，在这个病理学过程中，病原菌毒素所扮演的主导作用受到越来越多的研究支持。章元寿（真菌学报,1991,10(3):169-181）等越来越多的研究表明，大丽轮枝菌分泌的毒素是导致黄萎病的关键因素，其致萎作用可能是能够凝固植物细胞原生质体，破坏原生质膜的半透性，扰乱棉株的水分平衡，导致植株体内脱落酸含量增加，使棉株体内膨压改变，从而引起萎蔫症状。在液体培养基中，黄萎病菌分泌毒素，这种毒素可诱发与黄萎病菌类似的致病症状Pegg et al（Nature,1965,208:1228-1229）。经研究表明，大丽轮枝菌产生的毒素是一种糖蛋白复合体(protein-lipopoly-saccharide complex,PLPC)，其中的蛋白质成分是致萎的活性部分。Nachmias（Physiol.Plant Pathology，1985,26:43-55）在感病的马铃薯中用PLPC的抗血清检测到了致病抗原毒蛋白的存在，而健康的马铃薯中未能检出。这充分证明PLPC具有内源致病作用，直接参与了病原菌的致病过程。Chu et al（The PlantJournal,1999,9(41):972-976）报道得到一个26kDa的糖蛋白，它能诱导产生植保素并能使植物萎蔫。由于研究者的研究方法和手段不同，分离到的许多种毒素蛋白。章元寿等（植物病理学报,1991,21(1):49-52）通过纤维素柱层析和琼脂糖凝胶层析，得到一个具有致萎活性的峰蛋白，并发现致病力强的菌株毒素所含的蛋白质和多糖的量高于致病力弱的菌株毒素。吕金殿等（中国农业科学,1995,28(2):58-65）用亲和层析法分离纯化毒蛋白，分析显示，它是一种糖蛋白，其蛋白质和糖的含量分别是8.53%和14.7%。。陈旭升等（江苏农业学报,2000,16:10-14）对3个典型黄萎病菌分泌毒蛋白进行层析分离，皆得到两个致萎蛋白峰，分子量平均值的范围分别在20kDa和96kDa。傅正擎等（江苏农业学报，1999,15(4):211～215）将从棉株体内分离获得的内生菌Ala、73a接入棉花黄萎病菌菌株JC1B(落叶型)、BP2(非落叶型)的Czapek培养液中,培养不同时间后提取粗毒素,结果表明:对BP2产毒素抑制最强的为Ala菌体,抑制率达51.97%;对JC1B产毒素能力抑制最强的是73a菌体,抑制率为72.60%；液体培养的黄萎病菌加入内生菌或代谢物后,其黄萎病菌毒素粗提液对棉苗致萎度下降。查阅国内和国外发表的文章，仅查到关于大丽轮枝菌毒素的研究，未查到对毒素降解的研究报道；对于植物内生细菌与大丽轮枝菌的研究，仅查到内生细菌加入离体培养的大丽轮枝菌中能够抑制毒素蛋白的产生，未查到内生细菌与毒素蛋白共同作用，把毒素蛋白降解或者转化成其他蛋白的研究报道。

关于应用微生物的功能防治植物黄萎病的公开专利资料：201210021045.8公开了一株棉花内生真菌在棉花黄萎病防治中的应用；201210099459.2公开了大丽轮枝菌弱毒株的应用；这两个专利是关于真菌的应用。200810183075.2和20081083072.9公开了地衣芽孢杆菌的应用；200810183071.4是枯草芽孢杆菌的应用；200910192921.1是铜绿芽孢杆菌的应用；201110197653.x是固氮菌的应用；这五个专利的细菌分离自植物根际，即根际细菌的应用。有关植物内生细菌的专利仅查到200510020328.0中的内生细菌诱导马铃薯抗病；201110082094.8中的内生细菌防治松树枯梢病；201210049875.1中的内生细菌防治水稻稻瘟病；201110377736.7分离的内生细菌作为土壤修复剂；201110352670.6的内生细菌生产防治小麦纹枯病的农药。公开的资料中未查询通过离体筛选降解毒蛋白的植物内生细菌的方法和应用植物内生细菌在植物体内通过降解黄萎病菌毒素的方法来防治黄萎病的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法和在防治植物黄萎病上的应用。

本发明的研究人员通过对大丽轮枝菌毒素蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定证明大丽轮枝菌的发酵液经100℃水浴1h，6层滤纸布氏漏斗真空抽滤，弃菌丝体，滤液8000r/min离心10min，取上清液依次经0.45μm和0.22μm微孔滤膜真空抽滤得到的毒素液中含有8个蛋白条带，分子量分别为40kD、38kD、35kD、33kD、30kD、26kD、24kD和16kD。毒素与减毒细菌混合培养后，发现失去致萎活性的培养体系中均缺少了一个26KD的蛋白条带。应用此方法进一步筛选新分离的菌株，进一步证实能降解毒素蛋白条带的菌株均能有效预防大丽轮枝菌毒素对棉苗的致萎作用。

本发明所述的降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法，是把从植物体内分离得到的植物内生细菌的菌体与大丽轮枝菌毒素混合培养，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定混合培养后的蛋白条带与原毒素的蛋白条带进行比较，混合培养体系缺少了26KD蛋白条带的为目的菌株。

所述植物内生细菌是分离自各种植株体内，分离方法是常规的表面消毒法，植物内生性的测定是采用无菌苗接种再分离的方法。

所述大丽轮枝菌毒素是将大丽轮枝菌发酵液100℃水浴1h，6层滤纸布氏漏斗真空抽滤，弃菌丝体，滤液8000r/min离心10min，取上清液依次经0.45μm和0.22μm微孔滤膜真空抽滤，此滤液为毒素液。

本发明还公开了由上述所获得的降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌菌株的应用，是将所述获得的目的菌株接种到植物体内能在植物体内传导和繁殖；在植物体内与侵入的大丽轮枝菌菌体密切接触，能有效的降解大丽轮枝菌侵染植物后产生的毒素蛋白，使植物不表现致萎症状，确保植物正常生长，减轻和阻止黄萎病菌对各种植物的危害。

本发明具体的实现方式如下：

1.大丽轮枝菌发酵培养

将斜面保存的大丽轮枝菌病菌接种于l00mL Czapek培养基(g/L：NaNO₃ 3.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl 0.5，K₂HPO₄1.0，FeSO₄·7H₂O 0.01g，蔗糖30，pH 7.2），在25℃黑暗条件下120r/min振荡培养25d。

3.大丽轮枝菌毒素液制备

将上述培养的发酵液100℃水浴1h，6层滤纸布氏漏斗真空抽滤，弃菌丝体，滤液8000r/min离心10min，取上清液依次经0.45μm和0.22μm微孔滤膜真空抽滤，此滤液为粗毒素液即VD液。

4.毒素液蛋白含量的测定

蛋白质标准曲线制作：分别吸取标准蛋白溶液（mL）：0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，分别加pH 7.0的0.2mol/L PB溶液至1mL，然后加入G-250试剂5mL，充分振荡，在5-20min内用分光光度计测定595nm处吸光度。以蛋白质含量为横坐标，A₅₉₅的值为纵坐标绘制标准曲线。

蛋白含量的测定：取毒素溶液0.5mL加pH 7.0的0.2mol/L PB溶液至1mL，然后加G-250试剂5mL，充分振荡，在5-20min内于595nm处测定光密度A，与标准曲线对照，得出粗蛋白含量达到25-35μg/ml的浓度时为合格毒素溶液。

5.植物内生细菌的分离和菌悬液的制备

从不同种植地采集棉花植株，其根、茎、叶分别用自来水冲洗晾干后，各称取1-2g，1%次NaClO浸泡5min，无菌水冲洗5次，再用0.1%升汞表面消毒，叶片1min，根、茎3min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干。将叶片放入无菌组织匀浆器内，根和茎部放入无菌研钵中，每样品加5-10mL无菌水碾碎，依次用无菌水稀释至10^-4，静止15min后，各取200μl涂平板，每处理重复3次。取最后一次冲洗的无菌水200μL涂平板，验证消毒是否彻底。28℃黑暗培养3-7d，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法纯化后保存。

用接种针在平板上蘸取一环筛选到的内生细菌，接种到装有30mL NB（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml）培养液的250mL三角瓶中，在28℃摇床上150r/min振荡培养48h。发酵液8000r/min离心5min，留菌体，用无菌水冲洗3遍以出去NB培养基中成分，无菌水稀释菌体至10⁸cfu/mL，即稀释液OD₆₀₀＝0.5±0.02时为制备的菌悬液。

6.分离的细菌内生性的测定

棉花种子经清水浸泡30min，用0.1﹪升汞处理15min，用无菌蒸馏水洗5次，再于1﹪的NaClO中浸泡5min后，再于无菌蒸馏水洗5次，用无菌镊子将种子插入土壤浸液培养基中，25+1℃暗培养48h，再置光照培养箱中培养，直到小苗长出新叶。将菌悬液以伤根法穿刺接种无菌苗，0.5ml/株，每菌处理15-20株。7-10d后用上述方法分离内生细菌，内生性优良的菌株植物体内含有菌体10⁵cfu/g以上。

7.毒素和菌体混合培养体系中蛋白硫酸铵沉淀和透析

（1）毒素蛋白的硫酸铵沉淀

将菌悬液和毒素按照1：1～2：1的体积比例混合建立培养体系和毒素溶液100℃水浴1h以杀死菌体和杂蛋白，取上清8000r/min离心5min，再取上清经0.22μm细菌滤膜真空抽滤。以90%的硫酸铵沉淀毒素蛋白。将固体硫酸铵放入60℃烘箱除潮，称取66.2g/100mL的硫酸铵并将其磨成粉末。把含毒素液的烧杯放在磁力搅拌器上，缓慢均匀的向毒素液加入硫酸铵粉末，完全溶解后，该烧放杯4℃冰箱中静置过夜。

（2）毒素蛋白透析

透析袋前处理：将透析袋剪成10cm-20cm长的小段，放在2%（w/v）NaHCO3和1mMEDTA溶液中煮沸10min，用蒸馏水彻底清洗透析袋，然后再在1mM EDTA溶液中煮沸10min，冷却后，存放于4℃，确保透析袋始终浸在溶液中，使用前用蒸馏水装满透析袋再排出以清洗内壁，取出时带手套。

将（1）静置的蛋白4℃12000r/min离心20min，弃上清液，向沉淀中加入适量的5mMpH 7.0的磷酸钠盐缓冲液，振荡摇匀，转移到3.5kD透析袋中，封口。在5mM pH 7.0的磷酸钠盐缓冲液中透析，每隔6h更换一次磷酸钠盐缓冲液，每次800mL，共更换5-6次以透析完全。透析后的蛋白液以5mL/管的量装入50mL的离心管中，放置-80℃冰箱过夜，次日经MAXI dry lyo真空浓缩冻干系统浓缩成蛋白干粉，备用。

8.聚丙烯酰胺凝胶电泳测定

样品前处理：取0.1g干粉溶于500μL双蒸水中，12000r/min离心1min去杂质，上清为SDS-PAGE电泳的蛋白样品。

制备5%的浓缩胶和13%的分离胶的不连续聚丙烯酰胺凝胶，取10μL样品与10μL样品处理液混合，100℃金属浴水处理2min，12000r/min离心30s，弃沉淀混匀后点样10μL到胶孔中，Marker分子量为10kD-200kD。跑胶：浓缩胶电压为75V，待样品进入分离胶后升高电压至140V，待溴酚蓝指示剂离凝胶底端约1cm处停止电泳仪，剥下凝胶，在染色液中染色1h，再在脱色液中脱色2-3h，观察条带位置。制胶方法及电泳注意事项等参考（陈钧辉等.生物化学实验[M].北京：科学出版社，2003，110-114）。

9.蛋白胶电泳条带的分析

毒素溶液中含有的蛋白分子量分别为40kD、38kD、35kD、33kD、30kD、26kD、24kD和16kD。混合培养体系中如果缺少26kD的蛋白条带，说明该菌株具有减毒活性。

10.盆栽棉苗的验证

将供试棉籽浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的杂菌，用无菌水冲洗5次，置25℃培养箱内催芽。棉籽冒白尖后播种在装有无菌土的花盆中，温室中培育，待其长至3-4叶期时接种内生细菌，接种第2d开始浇灌VD毒素10mL，连续浇灌至40d；调查植株生长状况，拔出小苗测其干重、鲜重和株高，根据株高和干重的数值确定内生细菌的减毒效果。

附图说明

图1植物内生细菌DP10的16S rDNA系统发育树。

图2是SDS-PAGE检测共培养后三株内生细菌对大丽轮枝菌毒素蛋白的减毒作用。

具体实施方式

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：植物内生细菌的分离和内生性测定

（1）菌种的分离：从不同种植地采集棉花、番茄、草莓、黄瓜等植株，其根、茎、叶分别用自来水冲洗晾干后，各称取1-2g，1%次NaClO浸泡5min，无菌水冲洗5次，再用0.1%升汞表面消毒，叶片1min，根、茎3min，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干。将叶片放入无菌组织匀浆器内，根和茎部称重放入无菌研钵中碾碎，取1g样品加9mL无菌水为10^-1，依次用无菌水稀释至10^-5，静止15min后，各取200μl涂平板，每处理重复3次。取最后一次冲洗的无菌水200μL涂平板，验证消毒是否彻底。28℃黑暗培养3-7d，根据菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法纯化后保存。

（2）内生性的测定：棉花种子经清水浸泡30min，用0.1﹪升汞处理15min，用无菌蒸馏水洗5次，再于1﹪的NaClO中浸泡5min后，再于无菌蒸馏水洗5次，用无菌镊子将种子插入土壤浸液培养基中，25+1℃暗培养48h，再置光照培养箱中培养，直到小苗长出新叶。将菌悬液以伤根法穿刺接种无菌苗，0.5ml/株，每菌处理15-20株。7-10d后用（1）分离内生细菌的方法分离植株体内的内生细菌，记录每个稀释溶液平板中的细菌的菌落数量，按照公式计算出每克新鲜植株体积内分离出的细菌菌落数量。计算公式是：每克植物组织内含的菌落数=同一稀释度重复的菌落平均数×稀释倍数×5。判断内生性优良的菌株是该菌株在植物体内含有菌体10⁵cfu/g以上。

经（1）和（2）共分离了56株内生细菌，经（2）测定有17株内生细菌在棉花体内定殖数量达到10⁵cfu/g以上，这些菌株分别命名为XJL12、XJL12、XJL15、W1、Y11、CCM3、CCM7、CCM9、DP1、DP8、DP10、DP12、DP14、H1、SZ2、SZ5、XG32，用于下述实验。

实施例二：植物内生细菌的鉴定

实施例一分离的植物内生细菌菌株以DP10为例：DP10划线接种于NA培养基上，在28℃条件下培养24h，先在1.5mL离心管中加入30μL无菌水，用接种针挑取少量菌体于水中制成悬液，煮沸10min，迅速冰浴5min，4℃12000r/min离心5min，上清液作为PCR模板。

反应体系(50μL):10×PCR buffer(5μL)、dNTP mixture(10mmol/L)1μL、MgCl2(25mmol/L)4μL、引物P0(5μmol/L)1μL、引物P5(5μmol/L)1μL、Taq DNApolymerase(5U/L)0.5μL、5μL上清液作为Template模板、加入ddH₂O 32.5μL至终体积50μL。

设计16SrDNA引物：正向引物：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’（SEQ ID NO.1）

                 反向引物：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’（SEQ ID NO.2）

均由上海生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应程序：95°C预变性5min；94°C变性40s；46℃退火40s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃冷却10min，4℃至恒定。

PCR结束后，取3-4μL跑琼脂糖凝胶电泳，观察条带的大小及纯度。制备50mL浓度为1%的琼脂糖凝胶，用100V电压跑胶，结束后在割胶仪上割取目的荧光条带，按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒上的方法回收PCR产物，并用琼脂糖凝胶电泳法检测回收条带的纯度。扩增后PCR产物由上海生工生物技术有限公司测序。从GenBank中调取待测菌所在种、属、科、目各几株菌株的16SrDNA序列用于系统发育学分析，所有菌株的16SrDNA的全序列用ClustalX（1.8）软件包排序，选择大肠杆菌（Escherichia coli）为外群，用MEGA version5软件包中的Kimura2-Parameter Distance模型计算进化距离，用Neighbor-Joining法构建系统发育树，1000次随机取样，计算自引导值（Bootstrap）以评估系统发生树的置信度。植物内生细菌DP10的16SrDNA序列如SEQ ID NO.3所示。

上海生工生物工程有限公司测得DP10的16S rDNA部分序列，长度为1.5kb左右，将序列检测后提交GenBank，登录号分别为HQ718411。在NCBI数据库上进行Blast比对，发现DP10与B.subtilis的寻找序列同源性达到99%以上的菌株。，随机调取数据库中已鉴定的芽孢杆菌种属及其上行科目菌株的16SrDNA序列构建系统发育树，如图1。根据测定结果DP10鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

实施例三：大丽轮枝菌毒素VD液和植物内生细菌菌悬液的制备

所使用的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)可以是公开的标准菌株如中国农业微生物保藏中心ACCC36120、ACCC36129、ACCC36217、ACCC36211，也可以如实施例四分离得到。

将大丽轮枝菌发酵液100℃水浴1h，6层滤纸布氏漏斗真空抽滤，弃菌丝体，滤液8000r/min离心10min，取上清液依次经0.45μm和0.22μm微孔滤膜真空抽滤，此滤液为粗毒素液即VD液。

用接种针蘸取一环活化的内生细菌菌株（SZ5、CCM9和DP10菌株），接种到装有30mLNB培养液的250mL三角瓶中，在28℃摇床上150r/min振荡培养48h。发酵液8000r/min离心5min，留菌体，用无菌水冲洗3遍以出去NB培养基中成分，无菌水稀释菌体至10⁸cfu/mL，即稀释液OD₆₀₀＝0.5±0.02。该菌悬液备用。

实施例四：大丽轮枝菌的分离和产毒素测定

采集田间发生黄萎病的病株，取5-10cm的茎，在实验室内用自来水冲净，再用无菌水反复冲洗数遍，用灭菌的刀剖开后用无菌水洗下茎部筛管中的孢子配制成孢子悬浮液，用移液枪吸取0.5mL注入PDA平板培养基涂布均匀。于28℃倒置培养24-72h，期间用倒置显微镜检测孢子萌发情况，当大部分孢子已萌发，但芽管尚未分枝时，挑单孢移至PDA固体培养基上，28℃培养5-10d，获得单孢菌株。

致病力鉴定：采用无底营养钵培育棉苗，经单孢分离的黄萎菌接入察氏液体培养基，于28℃恒温培养10d，培养好的发酵液经纱布过滤后孢子浓度为2.0×10⁷个/mL，注射法接种到中棉所45棉花小苗上。接种一片真叶平展期的棉花苗，于接种3周后植株普遍发病时调查致病型，选取与对照相比使棉苗植株萎蔫快，落叶多的菌株，保存备用。

产毒素测定：将供试棉籽（中棉所45）浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的杂菌，用无菌水冲洗5次，置25℃培养箱内催芽，每天冲洗种子和容器，待棉种露白时备用。分别取分离的棉花黄萎病菌的发酵液，选择发芽一致的棉种放于铺有无菌滤纸的培养皿中，每皿加入发酵液4ml，以清水处理棉花种芽为参照，每处理3个重复，25℃黑暗培养，每天观察1-2次，记录下胚轴的长度及根的变化情况。与清水对照相比使棉芽的根变褐最快的菌株是产毒素最快的菌株。

实施例五：毒素和菌体混合培养体系的建立

（1）混合培养比例的确定

将实施例三制备大丽轮枝菌毒素液与分离的植物内生细菌菌悬液以3:1，2:1，1:1，1:2，1:3的比例混合，总体积为100mL，于28℃、150r/min摇床上培养48h。发酵液100℃水浴1h以杀死发酵液里的菌体和杂蛋白，取上清8000r/min离心5min，再取上清经0.22μm细菌滤膜真空抽滤，取上清10mL装于灭过菌的青霉素瓶中，将用灭菌土培养的二叶期棉苗放入其中，每瓶3株棉苗，每处理3瓶，每天观察1-2次棉苗生长状况，连续观察5d，检测抽滤液的活性，棉花幼苗生长状况与清水对照相同为最佳比例。如表5.1显示内生细菌DP10菌株，C1组VD液和菌悬液比例为2:1达到完全减毒，是该菌共培养的最佳比例，此时毒素蛋白含量为27.39μg/mL，DP10的菌悬液浓度3.3×10⁷cfu/mL；CCM9菌株，C1组VD液和菌悬液比例为1:1达到完全减毒，为该菌共培养的最佳比例，此时毒素蛋白含量为20.98μg/mL，CCM9的菌悬液浓度5.0×10⁷cfu/mL；SZ5菌株，C1组VD液和菌悬液比例为1:1达到完全减毒，为该菌共培养的最佳比例，此时毒素蛋白含量为20.98μg/mL，SZ5的菌悬液浓度5.0×10⁷cfu/mL。

表5.1三株内生细菌与大丽轮枝菌毒素混合培养体系比较

注：A1：菌液+清水；B1：毒素+清水；“+”表示完全减毒，“+/－”表示部分减毒，“－”表示减毒失败。

(2)混合培养的最佳时间测定

按照上述方法制备10⁸cfu/mL内生细菌菌悬液，将毒素按照(1)确定的最佳比例进行混合。如表2，在28℃、150r/min摇床上分别培养24h、36h、48h、60h、72h。发酵液100℃水浴1h以杀死发酵液里的菌体和杂蛋白，取上清8000r/min离心5min，再取上清经0.22μm细菌滤膜真空抽滤，取上清10mL装于灭过菌的青霉素瓶中，将用灭菌土培养的二叶期棉苗放入其中，每瓶3株棉苗，每处理3瓶，每天观察1-2次棉苗生长状况，连续观察5d，检测抽滤液的活性，幼苗生长状况与清水对照相同为最佳时间。

采用（1）确定的最佳比例共培养毒素和内生细菌，DP10菌株比例为2:1，CCM9菌株比例为1:1，SZ5菌株比例为1:1。连续观察3d棉花幼苗，表5.2，48h为DP10的最佳共培养时间，60h是CCM9和SZ5的最佳共培养时间。

表5.2三株内生细菌与大丽轮枝菌毒素混合培养体系的培养时间

注：A1：菌液+清水；B1：毒素+清水；“+”表示完全减毒，“+/－”表示部分减毒，“－”表示减毒失败。

(3)混合培养减毒效果验证

检测混合培养后发酵液的活性，设置以下处理：A1：无菌水；B1：VD液+无菌水；C1：VD液+细菌菌悬液；D1：无菌水+细菌菌悬液；E1：Czapek+细菌菌悬液。其中细菌菌悬液浓度为1×108cfu/mL，以枯草芽孢杆菌（来源中国普通微生物保藏中心CGMCC1.1468）为对照，共培养比例和发酵时间根据(1)和(2)确定，150r/min振荡培养。

将上述各处理100℃水浴1h以杀死菌体和杂蛋白，0.22μm细菌滤膜真空抽滤取上清，每处理取10mL装于灭过菌的青霉素瓶中，将用灭菌土培养的二叶期棉苗放入其中，每瓶3株棉苗，每处理3瓶，每天观察1-2次棉苗生长状况，连续观察5d。调查幼苗萎蔫程度，棉苗生长同清水对照的植物内生细菌菌株为降解毒素菌株。

综合以上实验，最终确定内生细菌和毒素共培养的最佳比例和时间，以标准菌株枯草芽孢杆菌与毒素的比例为1:1为对照，共培养时间为60h。VD液导致棉花幼苗茎部干瘪，叶子干枯萎缩致萎；与枯草芽孢杆菌CGMCC1.1468共培养的代谢物可使棉花幼苗茎部失水，叶子失水皱缩；SZ5、DP10和CCM9与毒素共培养后可消除毒素的致萎活性，达到完全减毒。可知，三株内生细菌对毒素有较好的减毒作用，而菌株枯草芽孢杆菌CGMCC1.1468不存在这种作用。

实施例六：聚丙烯酰胺凝胶电泳测定内生细菌对毒素蛋白的降解活性

1.VD毒素和内生细菌共培养

植物内生细菌菌株DP10、CCM9和SZ5菌悬液与VD毒素按照实施例四确定的最佳比例28℃共培养150r/min摇床上分别培养60h。取发酵液分别在100℃水浴1h以杀死发酵液里的菌体和杂蛋白，取上清8000r/min离心5min，再取上清经0.22μm细菌滤膜真空抽滤。所得各溶液备用。

2.毒素蛋白硫酸铵沉淀和透析

（1）硫酸铵沉淀

用90%的硫酸铵沉淀毒素蛋白。将固体硫酸铵放入60℃烘箱除潮，称取66.2g/100mL的硫酸铵并将其磨成粉末。把含VD液的烧杯放在磁力搅拌器上，缓慢均匀的向VD液和三株菌混合培养的溶液加入硫酸铵粉末，完全溶解后，该烧放杯4℃冰箱中静置过夜。

（2）毒素蛋白透析

透析袋前处理：将透析袋剪成10cm-20cm长的小段，放在2%（w/v）NaHCO₃和1mMEDTA溶液中煮沸10min，用蒸馏水彻底清洗透析袋，然后再在1mM EDTA溶液中煮沸10min，冷却后，存放于4℃，确保透析袋始终浸在溶液中，使用前用蒸馏水装满透析袋再排出以清洗内壁，取出时带手套。

将（1）静置的蛋白4℃12000r/min离心20min，弃上清液，向沉淀中加入适量的5mMpH 7.0的磷酸钠盐缓冲液，振荡摇匀，转移到3.5kD透析袋中，封口。在5mM pH 7.0的磷酸钠盐缓冲液中透析，每隔6h更换一次PB，每次800mL，共更换5-6次以透析完全。透析后的蛋白液以5mL/管的量装入50mL的离心管中，放置-80℃冰箱过夜，次日经MAXI drylyo真空浓缩冻干系统浓缩成蛋白干粉，备用。

（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳

样品前处理：取0.1g干粉溶于500μL双蒸水中，12000r/min离心1min去杂质，上清为SDS-PAGE电泳的蛋白样品。

制备5%的浓缩胶和13%的分离胶的不连续聚丙烯酰胺凝胶，取10μL样品与10μL样品处理液混合，100℃金属浴水处理2min，12000r/min离心30s，弃沉淀混匀后点样10μL到胶孔中，Marker分子量为10kD-200kD。跑胶：浓缩胶电压为75V，待样品进入分离胶后升高电压至140V，待溴酚蓝指示剂离凝胶底端约1cm处停止电泳仪，剥下凝胶，在染色液中染色1h，再在脱色液中脱色2-3h，观察条带位置。制胶方法及电泳注意事项等参考生物化学实验指导教材等，制胶比例见下表6。

表6SDS-PAGE各组分

三株细菌（SZ5、CCM9和DP10菌株）与毒素混合培养后的条带如图2所示。VD液毒素共包括8条蛋白质条带，分子量分别为40kD、38kD、35kD、33kD、30kD、26kD、24kD和16kD。其中与SZ5共培养出现了7条蛋白质条带，分别约为40kD、38kD、35kD、32kD、29kD、24kD和16kD；与CCM9共培养为5条蛋白质条带，分别约为40kD、38kD、35kD、29kD和16kD；与DP10共培养也为5条蛋白质条带，分别约为40kD、38kD、35kD、32kD和16kD。VD毒素与不同的活性内生细菌共培养后的蛋白质条带出现了明显的变化，变化表现在：SZ5与VD毒素共培养体系中缺失了26kD。CCM9菌株共培养后的蛋白质条带缺少了33kD、26kD和24kD三条。DP10是三株菌对原毒素蛋白质影响最大的，40kD的蛋白质的量明显减少，还缺失了30kD、26kD和24kD蛋白质条带。混合培养体系中如果缺少26kD的蛋白条带，说明该菌株具有减毒活性。

实施例七：降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的筛选

将实施例一获得的植物内生细菌菌株XJL12、XJL12、XJL15、W1、Y11、CCM3、CCM7、CCM9、DP1、DP8、DP10、DP12、DP14、H1、SZ2、SZ5、XG32，按照实施例三的方法制备VD毒素和菌悬液，按照实施例六的方法把每个菌株与VD毒素建立培养体系，置28℃150r/min摇床上分别培养60h。培养后的溶液一部分进行处理，处理方法和聚丙烯酰胺凝胶的方法同实施例六。另一部分采用种芽法测定活性菌株的减毒效果，实验方法是将供试棉籽浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的杂菌，用无菌水冲洗5次，置25℃培养箱内催芽。选择露白一致的棉花种芽播于铺有无菌滤纸的培养皿中，加入混合培养溶液，同时加入纯菌悬液、纯毒素和清水为对照。每平皿5粒棉花种芽，每处理3个重复，于25℃培养箱中黑暗培养，每天观察1-2次，记录下胚轴的长度及根的萎蔫情况，获得结果见表7，原毒素蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳中的8个条带40kD、38kD、35kD、33kD、30kD、26kD、24kD和16kD与细菌混合后缺少26KD的条带的菌株对大丽轮枝菌具有减毒作用。

表7植物内生细菌对大丽轮枝菌减毒菌株的筛选结果

注：“++++”为完全减毒，种芽生长健壮；“—”为不能减毒，种芽的根尖变褐。

实施例八：内生细菌接种盆栽棉苗对毒素的减毒效果

将供试棉籽浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的杂菌，用无菌水冲洗5次，置25℃培养箱内催芽。棉籽冒白尖后播种在装有无菌土的花盆中，温室中培育，待其长至3-4叶期。把内生细菌用伤根法接种棉苗，接种每隔2d每盆幼苗浇灌10mL毒素，连续浇灌至40d。设浇清水为对照。调查棉株的各项指标，调查结果是接种筛选的内生细菌又浇灌毒素的棉株组的株高、鲜重和干重与接种内生细菌又浇清水对照组的数值在生物统计学上无显著。说明体外筛选的植物内生细菌对大丽轮枝菌毒素具有减毒作用。

调查棉株的各项指标，详见表8。棉株株高数据表明，菌株SZ5处理组株高为29.67cm，优于毒素组65.75%，减毒效果最好，达到完全减毒，其次为菌株DP10优于毒素组59.22%，达到完全减毒，CCM9优于毒素组41.51%，为部分减毒。

表8盆栽棉苗接种内生细菌对大丽轮枝菌毒素的抑制效果

注：表中数据为三次重复的平均值±标准差。数据后字母表示在P≤0.05水平上差异显著。

实施例九：种芽法测定活性菌株的减毒效果

将筛选的植物内生细菌转接斜面培养48h，加入10mL无菌水振荡混匀，制成菌悬液备用。将供试棉籽浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的杂菌，用无菌水冲洗5次，置25℃培养箱内催芽。选择露白一致的棉花种芽播于铺有无菌滤纸的培养皿中，加入活性菌与毒素的混合培养溶液，同时加入纯菌悬液、纯毒素和清水为对照。每平皿5粒棉花种芽，每处理3个重复，于25℃培养箱中黑暗培养，每天观察1-2次，记录下胚轴的长度及根的萎蔫情况。减毒效果稳定的菌株作用棉花种芽后的下胚轴伸长显著或者与清水对照相同，观察种芽生长的状况是种芽生长旺盛，须根丰富。

表9内生细菌的对大丽轮枝菌的抑菌效果和对棉花种芽减毒作用结果

注：表中数据为三次重复的平均值±标准差，数据后字母表示在P≤0.05水平上差异显著。

“+”表示完全减毒，“+/－”表示部分减毒，“－”表示减毒失败。

表9显示：减毒效果最稳定的菌株有XJL12、CCM9、DP10和SZ5，即作用后棉花种芽的下胚轴长度最显著。减毒作用最好是CCM9，下胚轴长为5.10cm，并却有促生作用，其次为SZ5、DP10和XJL12，下胚轴长度分别为4.97cm、4.90cm和4.87cm。

实施例十：大丽轮枝菌发酵生产毒素蛋白与致萎活性的关系

将供试棉籽浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的杂菌，用无菌水冲洗5次，置25℃培养箱内催芽，待其露白时，选择均匀一致的棉种播入装有无菌土的花盆中，花盆大小为13cm×11cm(直径×高)，于温室培育。

VD液稀释至原液的2×，4×，10×，20×，每稀释度取10mL置灭过菌的青霉素瓶中，将用灭菌土培养的二叶期棉苗放入其中，每瓶内3株苗，每处理3瓶。每天观察1-2次，连续观察5d，记录每株棉苗致萎时间，计算出最小毒素致萎量。制定幼苗检测毒素致萎实验的等级，调查VD液对幼苗萎蔫程度，将毒素致萎活性分为4个等级：0．茎部挺直，叶子平展，生长状况无菌水对照组相同；1．茎部挺直，叶子失水下垂；2．茎部失水，叶子失水皱缩；3．茎部干瘪，叶子干枯萎缩。结果不同发酵时间毒素蛋白的含量和相应发酵时间导致的棉花种芽致萎等级，发酵19d的VD液蛋白含量达到41.95μg/mL时，致萎等级为2；22d和25d的蛋白含量维持在较高的水平，此时致萎等级亦为2。可得知，毒素蛋白含量和致萎等级有一定的相关性，即毒素中蛋白含量多，该毒素造成的致萎危害也随之增加。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京师范大学

 

<120>  降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法和在防治植物黄萎病上

       的应用

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gagagtttga tcctggctca g                                               21

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctacggctac cttgttacga                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  1462

<212>  DNA

<213>  枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

 

<400>  3

accgctgtac cgcgtgcctt attcattgca agtcgagcgg acagattggg aagcttgctc     60

 

cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat    120

 

aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa    180

 

aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt    240

 

aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga    300

 

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga    360

 

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg    420

 

ttagggaaga acaagtaccg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct aaccagaaag    480

 

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa    540

 

ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc    600

 

aaccggggag ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc    660

 

acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct    720

 

ggtctgtaac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg    780

 

tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc    840

 

agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa    900

 

ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac    960

 

cttaccaggt cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag   1020

 

agtgacaggt ggtgcatgat tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg   1080

 

caacgagcgc aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg   1140

 

ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg   1200

 

ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa   1260

 

tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa   1320

 

tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc   1380

 

gcccgtcaca ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc   1440

 

agccgccgaa ggtgacagat at                                            1462

 

 

Claims (4)

1.一种降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的获得方法，是把从植物体内分离得到的植物内生细菌的菌体与大丽轮枝菌毒素混合培养，应用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定混合培养后的蛋白条带与原毒素的蛋白条带进行比较，混合培养体系缺少了26KD蛋白条带的为目的菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物内生细菌是分离自各种植株体内，分离方法是常规的表面消毒法，植物内生性的测定是采用无菌苗接种再分离的方法。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述大丽轮枝菌毒素是将大丽轮枝菌发酵液100 ℃水浴1 h，6层滤纸布氏漏斗真空抽滤，弃菌丝体，滤液8000 r/min离心10 min，取上清液依次经 0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜真空抽滤，此滤液为毒素液。

4.由权利要求1所述方法获得的降解大丽轮枝菌毒素蛋白的植物内生细菌的应用，是将所述获得的目的菌株接种到植物体内能在植物体内传导和繁殖。

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