BR112015031263B1

BR112015031263B1 - Métodos para produzir uma biomassa de algas ou cultura de células de algas e pelo menos um composto lipídico

Info

Publication number: BR112015031263B1
Application number: BR112015031263-2A
Authority: BR
Inventors: Angela Lynne Riveroll; Raymond Surzycki; Michael Daniel Mcdougall; Nancy Mary Martin; Kylie MUIO; Hayley Michelle Mckenna
Original assignee: Solarvest Bioenergy Inc
Priority date: 2013-06-12
Filing date: 2014-06-12
Publication date: 2022-10-11
Also published as: CA2919676A1; BR112015031263A2; WO2014199220A1; CN105452442A; EP3030647A1; KR20230119731A; KR20210028279A; AU2014279815A1; JP7048209B2; JP2020185012A; JP2016523529A; AU2021200394A1; AU2014279815B2; US20160122706A1; HK1226096A1; EP3030647A4; KR20160019424A

Abstract

MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE CULTURAS E BIOMASSA DE CÉLULAS DE ALGAS, COMPOSTOS E COMPOSIÇÕES LIPÍDICAS E PRODUTOS RELACIONADOS. A presente invenção é dirigida a métodos de produção de biomassa das algas e culturas de células de algas e compostos lipídicos e composições dos mesmos, incluindo ácidos graxos, carotenoides e vitaminas solúveis em gordura. A presente invenção é ainda dirigida a métodos de preparo relacionados a produtos alimentícios e composições industriais e farmacêuticas. Em várias modalidades exemplificativas, os métodos compreendem cultivo de algas em um meio com base em suco, incluindo um meio que contém nitrogênio natural ou um meio que é isento de aditivos químicos e conservantes para produzir culturas de células de algas, biomassa de algas, compostos e composições lipídicas derivados de algas e produtos relacionados, todos os quais podem ser certificados como orgânicos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção é dirigida a métodos de produção de biomassa e culturas de células de algas e compostos lipídicos e composições dos mesmos, incluindo ácidos graxos, carotenoides e vitaminas solúveis em gordura. A presente invenção é ainda dirigida a métodos de preparo de produtos alimentícios relacionados e composições farmacêuticas e industriais. Em várias modalidades exemplificativas, os métodos compreendem o cultivo de algas em um meio com base em suco, incluindo um meio que é isento de aditivos químicos e conservantes, para produzir culturas de células de algas, biomassa de algas, compostos lipídicos e composições e produtos relacionados, todos podendo ser certificados como orgânicos.

ANTECEDENTES

[002]Algas (tanto micro- quanto macro-algas) são um grupo diverso de organismos que habitam a maioria dos ecossistemas da Terra. As algas são mais geralmente classificadas pelo pigmento. Algas verdes ou clorófitas contêm clorofila a e b. Algas vermelhas ou rodófitas contêm tanto clorofila a quanto ficobilinas. Algas marrons, conhecidas como cromófitas, contêm clorofila a e c, mas carece de clorofila b.

[003]Exemplos de espécies de algas usadas em aquicultura incluem: Nannochloropsis oculata (2-4 μm), Isochrysis galbana (5-7 μm), Schizochytrium sp., Tetraselmis chuii (7-10 μm), Chaetoceros gracilis (6-8 μm), Dunaliella tertiolecta (7-9 μm) e várias espécies de Chlorella (3-9 μm de diâmetro), Nitzschia e Chlamydomonas.

[004]As características químicas do ambiente aquático desempenham um papel importante na determinação das taxas de crescimento de algas e qualidade da biomassa. Em geral, a composição do meio usado para cultivar microalgas compartilha várias características em comum. Alguns nutrientes devem ser fornecidos em concentrações relativamente grandes. Estes nutrientes, conhecidos como macronutrientes, são carbono (C), nitrogênio (N), fósforo (P), sódio (Na), enxofre (S), potássio (K) e magnésio (Mg). Micronutrientes, os quais são necessários em menores concentrações, também devem ser fornecidos. Estes micronutrientes incluem manganês (Mn), zinco (Zn), cobre (Cu), molibdênio (Mo) e cobalto (Co), ferro (Fe), cloro (Cl), cálcio (Ca) e bório (Bo). Estes nutrientes são necessários para o crescimento das algas. A estequiometria molar dos macro e micronutrientes presentes no meio de cultura de algas é uma característica fundamental do meio e atenção deve ser dada a estas proporções quando de desenvolvimento ou aprimoramento de receitas de meios.

[005]Tal como acontece com todos os organismos vivos, uma fonte de carbono que as algas são capazes de assimilar deve ser fornecida ao meio de crescimento de algas sintético. O carbono fornecido na forma de dióxido de carbono é conhecido como carbono inorgânico. Este carbono é fixado pelo processo de fotossíntese. Algumas espécies de algas podem crescer exclusivamente sobre fontes de carbono inorgânico e este modo de crescimento é dito como crescimento fotoautotrófico. A maioria das espécies de algas podem assumir um modo de crescimento fotoautotrófico. Algumas algas podem também ter a capacidade de obter energia a partir de fontes de carbono orgânico, sem a necessidade de fotossíntese; este modo de crescimento é dito como um modo de crescimento heterotrófico. Outros algas podem utilizar simultaneamente a luz e dióxido de carbono, bem como fontes de carbono orgânico para crescimento e isto é dito como crescimento mixotrófico. No caso de modos de crescimento mixotrófico ou heterotrófico, as fontes de carbono para culturas de microalgas incluem glicose, dextrose, acetato e metanol (uma fonte de carbono reduzida).

[006]Fontes comuns de nitrogênio suplementadas a meios de crescimento de algas são nitrato (NO3), nitrito (NO2), amônio (NH4), ureia, aminoácidos (glutamato monossódico ou arginina), triptona, peptona, caseína, extrato de levedura não orgânico e água da maceração de milho.

[007]Fósforo, enxofre e magnésio são todos macronutrientes essenciais, a adição dos quais é necessária para o crescimento de algas. Sulfato (SO4) é a forma de enxofre que é geralmente adicionada a um meio de crescimento de algas sintético. Fosfato inorgânico (H2PO4 ou HPO4) é a forma de fósforo que é geralmente fornecida ao meio de cultura de algas; no entanto, também podem ser usadas formas de fosfato orgânico. O excesso de fosfato foi associado à proliferação de algas em água doce e ecossistemas marinhos.

[008]O ferro é um elemento chave que desempenha um papel importante no metabolismo celular e produção de energia na célula de alga. Em geral, as formas férrica e ferrosa de ferro são facilmente assimiladas por microalgas. As primeiras tentativas de suplementação de ferro resultaram, muitas vezes, na precipitação do ferro a partir da solução. Portanto, muitas receitas requerem que o ferro seja suspenso em um agente de quelação químico, usualmente ácido etilenodiaminotetracético sódico (EDTA). O EDTA realiza quelação de outros oligoelementos, tais como cobre, cobalto e cádmio.

[009]Outros elementos ditos como oligoelementos devem ser suplementados a meios de cultura de algas sintéticos. Cobre, manganês, molibdênio e zinco são metais normalmente incluídos em soluções de oligoelementos. Vanádio, boro e cobalto são, algumas vezes, incluídos em oligoelementos também. A suplementação com altas concentrações destes metais é tóxica e, portanto, é preciso ter cuidado para não adicioná-los em excesso. A adição de agentes de quelação químicos, tal como EDTA, a soluções contendo estes metais é, muitas vezes, empregada para evitar precipitação.

[010]Foi demonstrado que a adição de vitaminas pode alterar a composição de ácidos graxos de Schizochytrium e melhorar a produção de biomassa de outras espécies de algas. Portanto, muitas formulações de meio de crescimento sintético incluem vitaminas adicionadas.

[011]Uma aplicação comercial de algas é sua capacidade de produzir compostos lipídicos e lipofílicos comercialmente valiosos, tais como vários ácidos graxos e antioxidantes. Os ácidos graxos ômega-3, por exemplo, são nutrientes importantes para a saúde física e mental. Estes ácidos graxos essenciais sustentam a saúde do sistema cardiovascular, reprodutivo, imune e nervoso. Os ácidos graxos ômega-3 são altamente concentrados no cérebro e parecem ser importantes para o desenvolvimento cognitivo (cérebro-memória e desempenho) e função comportamental. Na verdade, crianças que não recebem ácidos graxos ômega-3 suficiente de suas mães durante a gestação estão em risco do desenvolvimento de condições de visão e nervosas.

[012]Traustroquitrídeos são microalgas que têm sido o foco de pesquisa e desenvolvimento significativo em relação à produção de ácidos graxos ômega-3. Traustroquitrídeos são conhecidos por sintetizar e acumular ácidos graxos poli- insaturados (PolyUnsaturated Fatty Acids - PUFA), tais como ácido docosa- hexaenoico (DocosaHexaenoic Acid - DHA; C22-6 n-3). A produção industrial de DHA por Traustroquitrídeos tem avançado consideravelmente nas últimas duas décadas. As características chave que levam à produção econômica de DHA a partir destas espécies de algas foi sua capacidade de crescer em meio de crescimento heterotrófico. As formulações de meio heterotrófico que incluíam glicose como fonte de carbono e MSG, água da maceração de milho ou extrato de levedura como uma fonte de nitrogênio produziram uma elevada concentração celular, taxas de crescimento rápidas e quantidades significativas de DHA quando cultivadas em vasos de fermentação. Além de carbono e nitrogênio, fosfato, sulfato, ferro, fósforo, sódio, enxofre, potássio, magnésio e oligoelementos são suplementados ao meio de cultura de algas sintético. Nos casos onde aditivos químicos mais complexos são usados, tais como água da maceração de milho e extrato de levedura, vitaminas e oligoelementos podem ser omitidos, uma vez que estes aditivos contêm quantidades adequadas destes nutrientes.

[013]Em geral, as receitas anteriormente descritas para meios de cultura heterotróficos usados para cultivar microalgas sempre contêm aditivos químicos. Os oligoelementos são também derivados de fontes químicas. Macro e micro nutrientes são, muitas vezes, quimicamente derivados. Água da maceração de milho é um subproduto industrial derivado da moagem de milho a úmido ao qual um composto químico, dióxido de enxofre gasoso, é muitas vezes injetado na maceração para facilitar o amaciamento da semente de milho. Fontes de nitrogênio, tais como amônio, nitrato, MSG, são todos produtos de processos industriais onde produtos químicos são necessários para sintetizar ou isolar o produto. Extrato de levedura não orgânico é produzido usando um meio de cultura que contém nutrientes derivados de produtos químicos. Outros compostos que têm sido propostos para produção industrial de Traustroquitrídeos são Gelysate, peptona, triptona, caseína, ureia, soro de leite ou farinha de glúten de milho, todos produtos de processos industriais onde produtos químicos são necessários para sintetizar ou isolar o produto. Tais meios não são adequados para produção de algas e composições derivadas de algas e compostos que são isentos de produtos químicos ou certificados como orgânicos.

[014]O US National Organic Program estabelece regras referentes às práticas orgânicas e rotulagem. Substâncias que são permitidas e não permitidas são enunciadas e adicionadas à Lista Nacional. A lista inclui substâncias sinteticamente derivadas, tais como DHA e EPA. Substâncias que não são permitidas sob as diretrizes NOP são levedura não orgânica e produtos derivados de levedura não orgânica, sulfato sinteticamente derivado e oligoelementos sinteticamente derivados, para citar alguns. Até 5% de uma substância não orgânica foi autorizada sob a lei atual dado que 1) o USDA estabelece que elas conferem um benefício para a saúde e 2) uma alternativa orgânica não está disponível. A comercialização e venda de produtos orgânicos que contêm DHA sinteticamente derivado foi autorizada. A indústria de DHA de algas tem sustentado que um processo para produção orgânica de DHA de algas não pode ser desenvolvido. Como um resultado, a adição de óleo de algas não orgânico à fórmulas infantis indicadas como orgânicas e outros alimentos permanece controversa.

[015]Consequentemente, há uma necessidade da produção em escala comercial de algas e seus componentes constituintes que são isentos de aditivos e conservantes químicos, incluindo aqueles que são certificados como orgânicos, para uso em produtos para a indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética.

SUMÁRIO

[016]São fornecidos métodos para produção de culturas de algas, biomassa, compostos lipídicos e composições lipídicas e produtos relacionados.

[017]Em uma modalidade ilustrativa, é fornecido um método para produção de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas compreendendo o cultivo de algas em um meio de cultura e coleta da biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[018]Em outra modalidade ilustrativa, o meio pode ser suplementado com uma fonte de sal. Em outra modalidade ilustrativa, a fonte de sal pode ser água do mar. Em outra modalidade, a água do mar pode ter uma salinidade na faixa de cerca de 10 ppt a cerca de 35 ppt.

[019]Em outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades mencionadas acima pode ser suplementado com um açúcar. Em outra modalidade, o açúcar pode ser dextrose ou frutose. Em outra modalidade, o açúcar pode ser certificado como orgânico.

[020]Em outra modalidade ilustrativa, o meio pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio, um açúcar e uma fonte de sal. Em outra modalidade ilustrativa, o meio pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio e um açúcar. Em ainda uma outra modalidade ilustrativa, o meio pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio e uma fonte de sal.

[021]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método para produção de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas compreendendo o cultivo de algas em um meio de cultura e coleta da biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio consiste em suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, um açúcar, uma fonte de sal, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[022]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método para produção de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas compreendendo o cultivo de algas em um meio de cultura e coleta da biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio consiste em suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, um açúcar, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[023]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método para produção de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas compreendendo o cultivo de algas em um meio de cultura e coleta da biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio consiste em suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de sal, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[024]Em outras modalidades ilustrativas, o açúcar de qualquer uma das modalidades dos quatro parágrafos precedentes pode ser dextrose ou frutose. Em outra modalidade ilustrativa, o açúcar pode ser certificado como orgânico. Em outra modalidade ilustrativa, a fonte de sal de qualquer uma das modalidades dos quatro parágrafos precedentes pode ser água do mar. Em outra modalidade, a água do mar pode ter uma salinidade na faixa de cerca de 10 ppt a cerca de 35 ppt.

[025]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos compreendendo o cultivo de algas em um meio e extração do composto ou composição a partir das algas, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[026]Em outra modalidade ilustrativa, o meio da modalidade do parágrafo precedente pode ser suplementado com uma fonte de sal. Em outra modalidade ilustrativa, a fonte de sal pode ser água do mar. Em outra modalidade, a água do mar pode ter uma salinidade na faixa de cerca de 10 ppt a cerca de 35 ppt.

[027]Em outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades dos dois parágrafos precedentes pode ser suplementado com um açúcar. Em outra modalidade, o açúcar pode ser dextrose ou frutose. Em outra modalidade, o açúcar pode ser certificado como orgânico.

[028]Em outra modalidade ilustrativa, o meio pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio, um açúcar e uma fonte esterilizada de sal. Em ainda outra modalidade ilustrativa, o meio pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio e um açúcar. Em outra modalidade ilustrativa, o meio pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio e uma fonte de sal.

[029]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos compreendendo o cultivo de algas em um meio e extração do composto ou composição a partir das algas, em que o meio consiste em suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio, nitrogênio, uma fonte de sal e um açúcar, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[030]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos compreendendo o cultivo de algas em um meio e extração do composto ou composição a partir das algas, em que o meio consiste em suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio, nitrogênio e uma fonte de sal, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[031]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos compreendendo o cultivo de algas em um meio e extração do composto ou composição a partir das algas, em que o meio consiste em suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio, nitrogênio e um açúcar, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[032]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o açúcar de qualquer uma das modalidades dos quatro parágrafos precedentes pode ser dextrose ou frutose. Em outra modalidade ilustrativa, o açúcar pode ser certificado como orgânico. Em outra modalidade ilustrativa, a fonte de sal de qualquer uma das modalidades dos quatro parágrafos precedentes pode ser água do mar. Em outra modalidade, a água do mar pode ter uma salinidade na faixa de cerca de 10 ppt a cerca de 35 ppt.

[033]Em várias modalidades ilustrativas, o composto de qualquer uma das modalidades acima pode ser um ácido graxo, um carotenoide ou uma vitamina solúvel em gordura. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo pode ser um ácido graxo poli-insaturado. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser selecionado do grupo que consiste em DHA, EPA, DPA e ácido pinolênico. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser DHA. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser EPA. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser ácido pinolênico. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser DPA. Em outra modalidade ilustrativa, o carotenoide pode ser beta-caroteno.

[034]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um produto alimentício, cosmético, composição industrial ou composição farmacêutica para um ser humano ou um animal compreendendo as etapas de: cultivo de algas em um meio de cultura e coleta de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural; coleta de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio; e preparo do produto alimentício, composição industrial ou composição farmacêutica.

[035]Em uma outra modalidade ilustrativa, o método do parágrafo precedente pode compreender ainda extração de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos a partir da biomassa de algas ou cultura de células de algas e preparo do produto alimentício, composição industrial ou composição farmacêutica. Em outra modalidade ilustrativa, o composto lipídico pode ser um ácido graxo, carotenoide ou vitamina solúvel em gordura. Em outra modalidade, o ácido graxo pode ser um ácido graxo poli-insaturado. Em outra modalidade, o ácido graxo poli- insaturado pode ser selecionado do grupo que consiste em DHA, DPA, EPA e ácido pinolênico. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser DHA. Em uma outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser EPA. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser ácido pinolênico. Em outra modalidade ilustrativa, o carotenoide pode ser beta-caroteno.

[036]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades dos dois parágrafos precedentes acima pode ser suplementado com uma fonte de sal. Em outra modalidade, a fonte de sal pode ser água do mar. Em outra modalidade, a água do mar pode ter uma salinidade de na faixa de cerca de 10 ppt a cerca de 35 ppt.

[037]Em outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades dos três parágrafos precedentes acima pode ser suplementado com um açúcar. Em outra modalidade, o açúcar pode ser dextrose ou frutose. Em outra modalidade, o açúcar pode ser certificado como orgânico. Em outra modalidade, o meio pode ser suplementado com dextrose e extrato de levedura certificado como orgânico.

[038]Em outras modalidades ilustrativas, o preparado de qualquer uma das modalidades dos quatro parágrafos precedentes acima é aquele de um produto alimentício. Em outra modalidade ilustrativa, o produto alimentício é um suplemento nutricional.

[039]Em várias modalidades ilustrativas, as algas de qualquer uma das modalidades acima pode pertencer a um gênero selecionado do grupo que consiste em Thraustochytrium, Chlamydomonas, Nannochloropsis, Nitzchia e Aurantiochytrium (anteriormente Schizochytrium). Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Aurantiochytrium. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Nannochloropsis. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Chlamydomonas. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Nitzschia.

[040]Em várias modalidades ilustrativas, o crescimento das algas de qualquer uma das modalidades acima pode ser hereterotrófico ou mixotrófico.

[041]Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades acima pode ser selecionado do grupo que consiste em suco de tomate, suco de beterraba, suco de cenoura, suco de coco e suco de maçã. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser suco de beterraba. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser suco de tomate. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser suco de cenoura. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser melaço de beterraba. Em outra modalidade ilustrativa, o suco de qualquer uma das modalidades é hidrolisado com invertase não-GMO. Em outra modalidade ilustrativa, o suco de qualquer uma das modalidades aqui é suco de beterraba ou melaço de beterraba certificado como orgânico e o suco é hidrolisado com invertase não-GMO.

[042]Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades acima pode ter uma concentração percentual no meio de cerca de 5% a cerca de 70%. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ter uma concentração percentual no meio de cerca de 10% a cerca de 50%. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ter uma concentração percentual no meio selecionada do grupo que consiste em cerca de 10%, cerca de 25% e cerca de 50%.

[043]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades acima pode ser fermentado.

[044]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades acima pode ser pasteurizado.

[045]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades acima pode ser certificado como orgânico. Em outra modalidade ilustrativa, o suco de beterraba é melaço certificado como orgânico. Em outra modalidade ilustrativa, o melaço de beterraba certificado como orgânico é hidrolisado com invertase não-GMO.

[046]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades acima pode ter um pH na faixa de cerca de 3 a cerca de 9.

[047]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades acima pode ser isento de aditivos químicos e conservantes.

[048]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades acima pode ser suplementado com extrato de levedura certificado como orgânico.

[049]Em outras modalidades ilustrativas, a biomassa de algas, cultura de células de algas, compostos ou composição lipídica, produto alimentício ou suplemento nutricional de qualquer uma das modalidades mencionadas acima pode ser certificado como orgânico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[050]As Figuras 1 (a) - (c) são gráficos de linhas que mostram o crescimento de S. limacinum (Aurantiochytrium limacinumin) em meios contendo suco e água do mar sem ajuste de pH.

[051]As Figuras 2 (a) - (c) são gráficos de linhas que mostram o crescimento de S. limacinum em meios contendo suco e água do mar com pH ajustado para 6,8.

[052]As Figuras 3 (a) - (c) são gráficos de linhas que mostram o crescimento de S. limacinum em meios contendo suco e água do mar com pH ajustado para 6,8 e suplementado com dextrose.

[053]A Figura 4 é um gráfico de barras que mostra o rendimento de DHA a partir de uma cultura de S. limacinum cultivada em meios contendo suco e água do mar e suplementado com dextrose (mg/ml de meio de cultura).

[054]A Figura 5 é um gráfico de barras que mostra o rendimento de EPA a partir de uma cultura de S. limacinum cultivada em meios contendo suco e água do mar e suplementado com dextrose (mg/ml de meio de cultura).

[055]A Figura 6 é um gráfico de barras que mostra o DPA extraído de uma cultura de S. limacinum cultivada em meios contendo suco e água do mar e suplementado com dextrose (mg/ml de meio de cultura).

[056]A Figura 7 é um gráfico de linhas que mostra o crescimento de N. oculata em meios contendo suco de beterraba (com ou sem suplementação de fonte de carbono) e meio F/2 (células/ml de meio de cultura).

[057]A Figura 8 é um gráfico de linhas que mostra o crescimento de S. limacinum em meio com base em melaço de beterraba (células/ml de meio de cultura).

[058]A Figura 9 é um gráfico de Pareto que mostra o teor de DHA da biomassa de S. limacinum cultivada em meio com base em suco de beterraba suplementado com dextrose e/ou extrato de levedura.

[059]As Figuras 10 (a) - (b) são gráficos de linhas que mostram a atividade de remoção de radicais (%) de biomassa de algas suspensa em várias matrizes, incluindo sucos.

[060]As Figuras 11 (a) - (b) são gráficos de linhas e gráficos que mostram a concentração de DHA (mg/g de peso seco) contida na biomassa de algas suspensa em várias matrizes, incluindo suco.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[061]Os inventores descobriram um meio de custo eficaz para a produção de algas naturalmente usando um meio derivado de suco de frutas e/ou vegetais como uma fonte de nitrogênio e como uma fonte de macronutrientes, micronutrientes e vitaminas. Este meio, quando pasteurizado ou de outro modo esterilizado para preservar a qualidade de nutrientes e reduzir a biocarga natural, constitui um meio completo e adequado para o crescimento de algas e contém nitrogênio natural e fatores de crescimento naturais que podem ser usados para obter biomassa de algas em alta concentração. Em uma modalidade, o meio pode ser suplementado com uma fonte de carbono, tal como frutose, etanol, glicerina ou dextrose para aumentar a produção de produtos desejáveis, tais como ácidos graxos ômega-3 e outros compostos e composições lipídicas. Em outra modalidade, o meio de qualquer uma das modalidades aqui pode ser suplementado com dextrose. Em outra modalidade, os suplementos de suco e carbono selecionados podem ser certificados como orgânicos e produzidos sem aditivos químicos e conservantes, de modo que a biomassa de algas, cultura de células de algas e/ou extratos lipídicos das algas e produtos relacionados resultantes também possam ser certificados como orgânicos. Em outra modalidade, o meio de qualquer uma das modalidades aqui pode ser suplementado com dextrose e extrato de levedura certificado como orgânico. Em outra modalidade, o meio de qualquer uma das modalidades aqui pode ser suplementado com extrato de levedura certificado como orgânico. Em outra modalidade, diferentes tipos de sucos de frutas e/ou vegetais podem ser combinados para se obter uma formulação ideal para produção de extratos lipídicos de interesse, tais como ácidos graxos ômega-3 ou carotenoides. Em outra modalidade, o suco pode ser fermentado para liberar nutrientes essenciais e ajustar os valores de pH para melhorar o crescimento. Em algumas modalidades, a seleção do suco pode melhorar o perfil de ácidos graxos e a percentagem de DHA dos óleos totais das algas. Em algumas modalidades, os antioxidantes naturais nos sucos podem melhorar a estabilidade do ácido graxo e reduzir a taxa de oxidação de ácidos graxos. Por exemplo, o beta- caroteno no suco de cenoura pode ser extraído diretamente no óleo. O beta-caroteno pode atuar como um estabilizante natural para o óleo. Em uma modalidade, o suco de qualquer uma das modalidades aqui melhora a estabilidade de ácidos graxos, os ácidos graxos podem ser DHA e o suco pode ser suco de beterraba, melaço de beterraba certificado como orgânico, suco de cenoura ou suco de mirtilo. Em outra modalidade, o suco de qualquer uma das modalidades aqui reduz a taxa de oxidação de ácidos graxos, os ácidos graxos podem ser DHA e o suco pode ser suco de beterraba, melaço de beterraba certificado como orgânico, suco de cenoura ou suco de mirtilo.

[062]São fornecidos aqui métodos para produção de biomassa e culturas de algas e compostos e composições lipídicas, bem como produtos relacionados.

[063]Em uma modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas compreendendo o cultivo de algas em um meio de cultura e coleta da biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[064]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de reduzir a taxa de oxidação de um composto ou composição lipídica compreendendo suspensão do composto ou composição lipídica em um meio, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais. Em outra modalidade ilustrativa, o meio é esterilizado ou pasteurizado. Em outra modalidade ilustrativa, o suco é selecionado do grupo que consiste em suco de beterraba, suco de cenoura e suco de mirtilo. Em outra modalidade, o suco é suco de beterraba. Em outra modalidade, o composto lipídico é DHA. Em outra modalidade, o suco é certificado como orgânico. Em outra modalidade ilustrativa, o composto ou composição lipídica é produzida por meio de qualquer um dos métodos ilustrados aqui. Em outra modalidade ilustrativa, o composto ou composição lipídica é derivado de algas.

[065]Conforme usado aqui, "biomassa de algas" inclui células de algas e fragmentos de células e seus componentes constituintes.

[066]Conforme definido aqui, uma "fonte de oxigênio" se refere a qualquer fonte de oxigênio capaz de ser assimilada por algas. Em várias modalidades ilustrativas, a fonte de oxigênio de qualquer uma das modalidades aqui pode ser selecionada do grupo que consiste em ar filtrado, oxigenação por agitação ou uma corrente de oxigênio filtrada.

[067]Conforme definido aqui, "nitrogênio natural " é um ou mais dos seguintes: (i) qualquer átomo de nitrogênio ou fonte de nitrogênio que ocorre naturalmente em suco; e (ii) qualquer nitrogênio ou fonte de nitrogênio que é usada para suplementar meios de algas de modo a fornecer nitrogênio às algas e que seja certificado como orgânico e/ou seja isento de aditivos químicos e conservantes. Nitrogênio natural se distingue de qualquer fonte de nitrogênio que não é certificada como orgânica ou que é um aditivo químico ou conservante, tal como extrato de levedura não orgânico, cloreto de amônio, casitona, peptona, triptona, polipeptona, água da maceração de milho, sólidos da maceração de milho, acetato de amônio e nitrato de sódio.

[068]Em várias modalidades ilustrativas, o nitrogênio natural de qualquer modalidade aqui pode ser nitrogênio e compostos que contêm nitrogênio, todos os quais ocorrem naturalmente em suco. Em outras modalidades ilustrativas, o nitrogênio natural de quaisquer modalidades aqui pode ser nitrogênio e compostos contendo nitrogênio os quais ocorrem naturalmente em suco, bem como qualquer suplemento de nitrogênio para meios de algas que seja certificado como orgânico. Em outra modalidade ilustrativa, o nitrogênio natural é extrato de levedura certificado como orgânico.

[069]Em várias modalidades ilustrativas, as algas de qualquer uma das modalidades aqui são cultivadas em quantidades e/ou densidades de biomassa tais suficientes para produção em escala comercial ou industrial.

[070]Em várias modalidades ilustrativas, o meio descrito aqui pode ser suplementado com uma fonte de sal.

[071]Conforme usado aqui, uma "fonte de sal" se refere a qualquer sal, ou combinações dos mesmos, que seja capaz de ser metabolizado por algas.

[072]Em várias modalidades ilustrativas, a fonte de sal de qualquer uma das modalidades aqui pode ser selecionada do grupo que consiste em sal marinho artificial, água do mar natural ou sal marinho natural. Em várias modalidades ilustrativas, a fonte de sal pode ser água do mar. Em outra modalidade ilustrativa, a água do mar pode ter uma salinidade na faixa de cerca de 0,5 ppt a cerca de 35 ppt, cerca de 0,5 a cerca de 25 ppt, cerca de 0,5 a cerca de 20 ppt, cerca de 0,5 a cerca de 15 ppt, cerca de 5 a cerca de 15 ppt, cerca de 5 a cerca de 20 ppt, cerca de 5 a cerca de 25 ppt, cerca de 10 a cerca de 20 ppt, e cerca de 5 a cerca de 35 ppt. Em outra modalidade ilustrativa, a água do mar pode ter uma salinidade selecionada do grupo que consiste em cerca de 0,5 ppt, cerca de 1,0 ppt, cerca de 2,0 ppt, cerca de 3,0 ppt, cerca de 4,0 ppt, cerca de 5,0 ppt, cerca de 7,0 ppt, cerca de 10 ppt, cerca de 12 ppt, cerca de 15 ppt, cerca de 20 ppt, cerca de 25 ppt, cerca de 30 ppt e cerca de 35 ppt. Em outra modalidade, a água do mar pode ter uma salinidade de cerca de 10 ppt, 10,7 PPT, 12 ppt, 12,7 ppt, ppt 15, ou 15,7 ppt.

[073]Em várias modalidades ilustrativas, o meio descrito aqui pode ser suplementado com um açúcar.

[074]Conforme usado aqui, um "açúcar" se refere a qualquer um ou mais carboidratos, quer simples ou complexos, que é uma fonte de nutrição para as algas. Um "açúcar" também inclui dextrose, etanol e glicerina vegetal certificada como orgânica.

[075]Em várias modalidades ilustrativas, o açúcar de qualquer uma das modalidades aqui pode ser etanol, frutose, glicose, sacarose ou dextrose ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade ilustrativa, o açúcar pode ser certificado como orgânico. Em outra modalidade, o açúcar pode estar presente no meio em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 20%, cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 8%, ou cerca de 5% a cerca de 10%. Em outra modalidade, o açúcar pode estar presente no meio em uma concentração de cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9 %, cerca de 10%, cerca de 12%, cerca de 15%.

[076]Em várias modalidades ilustrativas, o meio descrito aqui pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio, um açúcar e uma fonte de sal. Em várias modalidades ilustrativas, o meio descrito aqui pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio e um açúcar. Em várias modalidades ilustrativas, o meio descrito aqui pode consistir no suco, a fonte de oxigênio, o nitrogênio e uma fonte de sal.

[077]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos compreendendo o cultivo de algas em um meio e extração do composto ou composição a partir das algas, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural.

[078]Conforme usado aqui, um "composto lipídico" se refere a qualquer gordura, óleo ou outro composto lipídico que dissolve em gorduras, óleos, lipídios e solventes não polares, tais como hexano ou tolueno. Em várias modalidades ilustrativas, o composto lipídico de qualquer uma das modalidades aqui pode ser um ácido graxo, um carotenoide ou uma vitamina solúvel em gordura.

[079]Conforme usado aqui, um "ácido graxo" se refere a uma molécula compreendida de um resíduo de ácido carboxílico ligado a uma cadeia de carbono. Esta cadeia de carbono pode variar de curta (6 carbonos) a muito longa (mais do que 20 átomos de carbono) e pode ser saturada ou insaturada. Em várias modalidades ilustrativas, o composto lipídico de qualquer uma das modalidades aqui pode ser um ácido graxo. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo pode ser ácido coniférico. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo pode ser um ácido graxo insaturado ou poli-insaturado. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo insaturado pode ser um ácido graxo ômega. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo ômega pode ser selecionado do grupo que consistem em ácidos graxos ômega-3, ácidos graxos ômega-6, ácidos graxos ômega-7 e ácidos graxos ômega-9. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo ômega pode ser um ácido graxo ômega-3. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo ômega pode ser um ácido graxo ômega-7. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo pode ser um ácido graxo poli-insaturado. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser selecionado do grupo que consiste em ácido docosa-hexaenoico (DocosaHexaenoic Acid - DHA), ácido eicosapentaenoico (EicosaPentaenoic Acid - EPA), ácido docosapentaenoico (DocosaPentaenoic Acid - DPA) e ácido pinolênico. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser DHA. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser EPA. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser ácido pinolênico. Em outra modalidade ilustrativa, o ácido graxo poli-insaturado pode ser DPA.

[080]Conforme usado aqui, um "carotenoide" se refere a pigmentos solúveis em gordura da família tetraterpenoide. Em várias modalidades ilustrativas, o carotenoide de qualquer uma das modalidades aqui pode ser um carotenoide selecionado do grupo que consiste em beta-caroteno, astaxantina e licopeno. Em outra modalidade ilustrativa, o carotenoide pode ser astaxantina. Em outra modalidade ilustrativa, o carotenoide pode ser beta-caroteno. Em outra modalidade ilustrativa, o carotenoide pode ser licopeno. Em outra modalidade ilustrativa, o carotenoide pode ter atividade antioxidante.

[081]Conforme usado aqui, uma "vitamina solúvel em gordura" se refere a uma vitamina, ou seja, uma substância, que é essencial em pequenas doses para o metabolismo normal do corpo que é dispersa e armazenada em gordura. Em várias modalidades ilustrativas, a vitamina solúvel em gordura de qualquer uma das modalidades aqui pode ser uma vitamina selecionada do grupo que consiste em retinal (Vitamina A), ergocalciferol (Vitamina D2), colecalciferol (Vitamina D3), alfa- tocoferol (Vitamina E), filoquinona (Vitamina K) e ubiquinol (coenzima Q). Em outra modalidade ilustrativa, a vitamina solúvel em gordura pode ser Vitamina A. Em outra modalidade ilustrativa, a vitamina solúvel em gordura pode ser Vitamina E.

[082]Em outra modalidade ilustrativa, é fornecido um método de produção de um produto alimentício, cosmético, composição industrial ou composição farmacêutica para um ser humano ou um animal compreendendo as etapas de: cultivo de algas em um meio de cultura e coleta de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, uma fonte de oxigênio e nitrogênio, em que o meio é esterilizado e em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural; coleta de uma biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio; e preparo do produto alimentício, cosmético, composição industrial ou composição farmacêutica.

[083]Em outra modalidade ilustrativa, o método pode ainda compreender extração de um ou mais compostos lipídicos ou composições dos mesmos a partir da biomassa de algas ou cultura de células de algas e preparo do produto alimentício, cosmético, composição industrial ou composição farmacêutica.

[084]Em outra modalidade ilustrativa, o método pode ainda compreender preparo de um produto alimentício. Conforme usado aqui, um "produto alimentício" se refere a qualquer alimento para consumo humano ou animal e inclui tanto composições sólidas quanto líquidas. Um produto alimentício pode ser um aditivo para alimentos para seres humanos ou animais. Produtos alimentícios incluem, porém sem limitações, alimentos comuns; produtos líquidos, incluindo leite, bebidas, bebidas terapêuticas, bebidas em pó e bebidas nutricionais; alimentos funcionais; suplementos nutricionais; nutracêuticos; fórmulas infantis, incluindo fórmulas para lactentes prematuros; alimentos para bebês; alimentos para as mulheres grávidas ou amamentando; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; e rações para animais.

[085]De acordo com outras modalidades ilustrativas, o produto alimentício de qualquer uma das modalidades aqui é um suplemento nutricional. Conforme definido aqui, um "suplemento nutricional" é qualquer preparado (quer na forma de cápsulas, gel, líquido ou em pó) destinado a suplementar a dieta e fornecer nutrientes, tais como vitaminas, minerais, fibra, ácidos graxos ou aminoácidos que podem estar ausentes ou podem não ser consumidos em quantidades suficientes na dieta de uma pessoa. Exemplos não limitativos de um suplemento nutricional incluem suplementos de vitaminas, suplementos de ácidos graxos poli-insaturados, suplementos de ácidos graxos ômega-3, ácidos graxos ômega-7, suplementos contendo DHA e/ou EPA e suplementos nutricionais que contêm algas ou derivados de algas.

[086]Em um exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém uma ou mais vitaminas solúveis em gordura. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém células de algas ou biomassa de algas. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém ácidos graxos ômega-3. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém ácidos graxos ômega-7. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém ácidos graxos poli-insaturados. Em um outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém ácidos graxos poli- insaturados selecionados do grupo que consiste em DHA, DPA, EPA e ácido pinolênico. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém DHA e EPA. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém DHA. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém EPA. Em vários exemplos ilustrativos, o suplemento nutricional de qualquer uma das modalidades aqui pode ser certificado como orgânico. Em outro exemplo ilustrativo, o suplemento nutricional contém antioxidantes.

[087]Um "animal" significa qualquer organismo não humano pertencente ao reino Animalia e inclui, sem limitação, animais aquáticos e animais terrestres. O termo "rações para animais" ou "ração animal" se refere a qualquer alimento destinado a animais não humanos, quer para peixes; peixes comerciais; peixes ornamentais; larvas de peixes; bivalves; moluscos; crustáceos; marisco; camarão; camarão larval; artemia; rotíferos; camarão de água salgada; filtradores; anfíbios; répteis; mamíferos; animais domésticos; animais de fazenda; animais de zoológico; animais esportivos; animais de criação; animais de corrida; animais de exposição; animais de linhagem; animais raros ou ameaçados; animais de companhia; animais de estimação, tais como cães, gatos, porcos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos ou cavalos; primatas, tais como macacos (por exemplo, cebus, rhesus, African green, patas, cynomolgus e cercopithecus), macacos, orangotangos, gibões, babuínos e chimpanzés; canídeos, tais como cães e lobos; felinos, tais como gatos, leões e tigres; equídeos, tais como cavalos, burros e zebras; animais alimentícios, tais como vacas, gado, porcos e ovelhas; ungulados, tais como veados e girafas; roedores, tais como camundongos, ratos, hâmsters e porcos-da-índia; e assim por diante. Uma ração animal inclui, porém sem limitações, uma ração para aquicultura, uma ração para animais domésticos, incluindo rações para animais de estimação, uma ração para animal de zoológico, uma ração para animal de trabalho, uma ração para gado ou uma combinação das mesmas.

[088]Em algumas modalidades ilustrativas, o produto alimentício é um alimento médico. Conforme usado aqui, um "alimento médico" é um alimento que está em uma composição a ser consumida ou administrada externamente sob a supervisão de um médico e que se destina ao tratamento dietético específico de uma doença para a qual requisitos nutricionais distintos, com base em princípios científicos reconhecidos, são estabelecidos por avaliação médica.

[089]Conforme definido aqui, um "cosmético" inclui, porém sem limitações, emulsões, cremes, loções, máscaras, sabões, xampus, lavagens, cremes faciais, condicionadores, maquiagens, agentes de banho e líquidos de dispersão. Agentes cosméticos podem ser medicinais ou não medicinais.

[090]Conforme definido aqui, uma "composição farmacêutica" inclui, porém sem limitações, uma composição anti-inflamatória, um fármaco para o tratamento de doença cardíaca coronária, um fármaco para o tratamento de arteriosclerose, um agente quimioterapêutico, um excipiente ativo, um fármaco para osteoporose, um antidepressivo, um anticonvulsivo, um fármaco anti-Helicobacter pylori, um fármaco para o tratamento de doenças neurodegenerativas, um fármaco para o tratamento de doença degenerativa do fígado, um antibiótico, uma composição para redução do colesterol e uma composição para redução de triglicerídeos.

[091]Em outras modalidades ilustrativas, as algas de qualquer uma das modalidades aqui que podem ser usadas incluem Clorófitas, tais como Charoides (por exemplo, Charoides, Lamprothamnium, Nitellopsis e Nitella), Zynematales (por exemplo, Zygnema, Closterium e Netrium), Codials (por exemplo, Codium fragile, Helimida opunta e Caulerpa), Bryopsis plumosa (por exemplo, Bryopsis, Pseudobryopsis, Bryopsidella, Derbesis e Pedobesia), Acetabularia Ryukyuensis (por exemplo, Acetabularia Ryukyuensis, Halicoryne wrightii, Neomeris annulata, Cymopolia van bossei, Bornettella ovalis e Acetabularia calyculus), Siphonocladales (por exemplo, Valoniaceae e Boodleaceae), Cladophora (por exemplo, Anadyomene writii, Cladophora, Cladophora sauteri e Chaetomorpha), Ulva (por exemplo, Ulva e Fnteromorpha), Ulotrichales (por exemplo, Acrosiphoniaceae, Collinsiellaceae, Monostromaceae e Chlorocystidaceae), Prasiola, Chlorella, Chlorococcales (por exemplo, Pediastrum e Hydrodictyon), Aurantiochytrium (por exemplo, Aurantiochytrium limacinum), Nannochloropsis (por exemplo, Nannochloropsis oculata), Nitzchia, Chlamydomonas (por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii) e Volvocales (por exemplo, Chlamydomonus, Pandorina, Pleodorina e Volvox).

[092]Em outra modalidade ilustrativa, as algas podem pertencer a um gênero selecionado do grupo que consiste em Thraustochytrium, Chlamydomonas, Nitzchia, Nannochloropsis e Aurantiochytrium. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Aurantiochytrium. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Nannochloropsis. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Chlamydomonas. Em outra modalidade ilustrativa, o gênero pode ser Nitzschia.

[093]Em outra modalidade ilustrativa, as algas de qualquer uma das modalidades aqui não são um organismo geneticamente modificado (isto é, um organismo não geneticamente modificado ou não-GMO) ou um organismo transgênico ou são, de outro modo, isentas de material genético que tenha sido alterado usando engenharia genética.

[094]Em várias modalidades ilustrativas, o crescimento das algas de qualquer uma das modalidades aqui pode ser hereterotrófico ou mixotrófico.

[095]Em várias modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades aqui pode ser usado tanto para inocular quanto para cultura de algas. Em uma modalidade ilustrativa, as células de algas são inoculados primeiro em um meio de qualquer uma das modalidades aqui e, subsequentemente, o inóculo é transferido para um volume maior do mesmo meio, de modo que o inóculo constitua uma determinada percentagem (por exemplo, 10%) do volume total do meio de cultura final.

[096]Conforme usado aqui, "suco" se refere ao líquido aquoso expresso ou extraído de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais. Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui contém todos os compostos (incluindo açúcares, nitrogênio e outras vitaminas, minerais e macronutrientes que ocorrem naturalmente) que ocorrem naturalmente no suco e tal suco não foi processado ou modificado de modo para remover qualquer um de tais compostos.

[097]Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ser um suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais selecionado do grupo que consiste em acerolas, maçãs, alperces, bananas, amoras, mirtilo, Boysenberries, melões, cerejas, coco, goiabas, oxicocos, groselhas, tâmaras, framboesas, bagas de sabugueiro, figos, groselhas, uvas, toranjas, guanabanas, goiabas, kiwis, limões, limas, amoras, melões, mangas, nectarinas, laranjas, mamões, maracujá, pêssegos, peras, abacaxi, ameixas, romã, ameixas, marmelo, framboesas, ruibarbo, morangos, tangerinas, tomates, melancias, beterraba, pimentão, brócolis, repolho, cenoura, aipo, pepino, erva-doce, couve, pastinaca, abóboras, chicória, batata-doce, rabanete, tomatillo, nabo, inhame e abobrinha.

[098]Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser um suco selecionado do grupo que consiste em suco de tomate, suco de beterraba, suco de cenoura, suco de coco e suco de maçã. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser um suco selecionado do grupo que consiste em suco de tomate, suco de beterraba, suco de cenoura e suco de maçã. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser um suco selecionado do grupo que consiste em suco de tomate, suco de beterraba e suco de cenoura. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser suco de beterraba. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser suco de tomate. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser suco de cenoura. Em outras modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui é melaço de beterraba. Em outra modalidade ilustrativa, o melaço de beterraba é certificado como orgânico.

[099]Em outras modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ser hidrolisado com uma ou mais enzimas capazes de quebrar os açúcares no suco. Em uma modalidade ilustrativa, a enzima é invertase não-GMO. Em outra modalidade ilustrativa, o suco que é hidrolisado com invertase não-GMO é melaço de beterraba, melaço de beterraba certificado como orgânico ou suco de beterraba.

[0100]Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 20 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 40 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 100 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 200 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 300 mg de nitrogênio/L. Em várias outras modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 334 mg de nitrogênio/L. Em várias outras modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 350 mg de nitrogênio/L. Em várias outras modalidades, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 400 mg de nitrogênio/L. Em várias outras modalidades, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 550 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 600 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 700 mg de nitrogênio/L. Em várias outras modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 732 mg de nitrogênio/L. Em várias modalidades ilustrativas, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser maior ou igual a 800 mg de nitrogênio/L.

[0101]Em várias outras modalidades, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode estar na faixa de cerca de 10 mg de nitrogênio/L a cerca de 1700 mg de nitrogênio/L. Em outra modalidade, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode estar na faixa de cerca de 20 mg de nitrogênio/L a cerca de 900 mg de nitrogênio/L. Em outra modalidade, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode estar na faixa de cerca de 30 mg de nitrogênio/L a cerca de 850 mg de nitrogênio/L. Em outra modalidade, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode estar na faixa de cerca de 35 mg de nitrogênio/L a cerca de 820 mg de nitrogênio/L.

[0102]Em outra modalidade, a quantidade total de nitrogênio biodisponível no suco pode ser selecionada do grupo que consiste em cerca de: 10 mg de nitrogênio/L, 20 mg de nitrogênio/L, 30 mg de nitrogênio/L, 40 mg de nitrogênio/L, 50 mg nitrogênio/L, 80 mg de nitrogênio/L, 90 mg de nitrogênio/L, 100 mg de nitrogênio/L, 110 mg de nitrogênio/L, 118 mg de nitrogênio/L, 120 mg de nitrogênio/L, 130 mg de nitrogênio/L, 140 mg de nitrogênio/G, 150 mg de nitrogênio/L, 200 mg de nitrogênio/L, 250 mg de nitrogênio/L, 300 mg de nitrogênio/L, 310 mg de nitrogênio/L, 320 mg de nitrogênio/L, 330 mg de nitrogênio/L, 334 mg de nitrogênio/L, 340 mg de nitrogênio/L, 350 mg de nitrogênio/L, 400 mg de nitrogênio/L, 450 mg de nitrogênio/L, 500 mg de nitrogênio/L, 550 mg de nitrogênio/L, 600 mg de nitrogênio/L, 650 mg de nitrogênio/L, 700 mg nitrogênio/L, 710 mg de nitrogênio/L, 720 mg de nitrogênio/L, 730 mg de nitrogênio/L, 732 mg de nitrogênio/L, 740 mg de nitrogênio/L, 750 mg de nitrogênio/L, 800 mg de nitrogênio/L, 810 mg de nitrogênio/G, 813 mg de nitrogênio/L, 820 mg de nitrogênio/L, 830 mg de nitrogênio/L, 850 mg de nitrogênio/L, 900 mg de nitrogênio/L, 950 mg de nitrogênio/L, de 1000 mg de nitrogênio/L, 1,500 mg de nitrogênio/L e 1700 mg de nitrogênio/L.

[0103]Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ter uma concentração percentual no meio, concentração percentual a qual está na faixa de cerca de 5% a cerca de 100%. Em outra modalidade ilustrativa, a concentração percentual do suco no meio pode ser uma concentração percentual selecionada do grupo que consiste em cerca de: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40 %, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90% e 100%. Em outra modalidade ilustrativa, a concentração percentual do suco no meio pode ser uma concentração percentual na faixa de cerca de 5% a cerca de 70%. Em outra modalidade ilustrativa, a concentração percentual do suco no meio pode ser uma concentração percentual na faixa de cerca de 10% a cerca de 50%. Em outra modalidade ilustrativa, a concentração percentual do suco no meio pode ser uma concentração percentual selecionada do grupo que consiste em 10%, 25% e 50%.

[0104]Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ser fermentado. Em várias modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ser esterilizado por meio de esterilização a vapor ou pasteurização. Em outra modalidade ilustrativa, o suco pode ser esterilizado por meio de pasteurização.

[0105]Em outras modalidades ilustrativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ser certificado como orgânico.

[0106]Em outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades aqui pode ter um pH selecionado do grupo que consiste em cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8 e cerca de 9. Em outra modalidade ilustrativa, o meio de qualquer uma das modalidades acima pode ter um pH na faixa de cerca de 3 a cerca de 8, cerca de 3 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 7, cerca de 5 a cerca de 8, cerca de 6 a cerca de 7, ou cerca de 6 até cerca de 8, ou cerca de 8 a cerca de 9. Em outra modalidade ilustrativa, o meio pode ter um pH de cerca de 5,2, cerca de 5,5, cerca de 5,8, cerca de 6,2, cerca de 6,5, cerca de 6,8, cerca de 7,2, cerca de 7,5, cerca de 7,8, ou cerca de 8,0, ou cerca de 9,0.

[0107]Em outras modalidades ilustrativas, o meio de qualquer uma das modalidades aqui pode ser isento de aditivos químicos e conservantes.

[0108]Conforme usado aqui, um "aditivo químico" ou "conservante químico "se refere a qualquer substância que não uma substância certificada como orgânica que: (i) não é encontrada na natureza ou que é uma substância que ocorre naturalmente sintetizada ou extraída por meio de processos químicos ou industriais e (ii) que é adicionada, direta ou indiretamente, a um meio, cultura ou biomassa de algas ou a qualquer componente ou constituinte dos mesmos de modo a preservar, tratar ou melhorar os mesmos de alguma forma ou como um subproduto de um processo industrial. Exemplos não limitativos de um aditivo químico ou conservante incluem ácido etilenodiaminotetracético (Ethylene Diamine Tetra acetic Acetic) e outros agentes de quelação químicos, glutamato monossódico (MSG), água da maceração de milho, sólidos da maceração de milho, extrato de levedura não orgânico, acetato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de sódio, Gelysate, peptona, triptona, casitona, caseína, ureia, soro de leite, farinha de glúten de milho, sulfato sinteticamente derivado e oligoelementos, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, água do mar artificial e enzimas isoladas usando processos sintéticos (exemplos não limitativos de tais enzimas incluem alfa-amilase, glucoamilase e frutofuranosidase, e enzimas que têm sido isoladas a partir de organismos geneticamente modificados).

[0109]Conforme usado aqui, uma enzima "não-GMO" tal como, por exemplo, invertase não-GMO, é uma enzima que não foi isolada a partir de um organismo geneticamente modificado.

[0110]Conforme usado aqui, um meio ou outra substância que é "isenta de aditivos e conservantes químicos" inclui um meio ou substância que não tenha sido produzida ou processada usando aditivos químicos e/ou conservantes ou um meio ou substância à qual nenhum aditivo químico ou conservante foi adicionado para sua fabricação, crescimento, isolamento, estabilização ou extração. Tal meio pode incluir, por exemplo, invertase não-GMO ou açúcares que foram hidrolisados com invertase não-GMO.

[0111]Em outras modalidades ilustrativas, a cultura de células de algas, biomassa de algas, compostos lipídicos ou composições de acordo com qualquer uma das modalidades aqui podem ser certificados como orgânicos.

[0112]Conforme usado aqui, "certificado como orgânico" se refere à certificação ou rotulagem de um produto ou substância como orgânica por qualquer governo ou organismo aprovado pelo governo ou entidade tendo autoridade em sua jurisdição para emitir tal rótulo ou certificação. Exemplos não limitativos são certificados emitidos sob a autoridade do Departamento de Agricultura dos EUA (US Department of Agriculture) que certifica que um produto ou substância é "orgânica", "95% orgânica" ou "100% orgânica". Conforme usado aqui, "não orgânico" se refere a qualquer substância ou produto que não é certificado como orgânico.

[0113]O meio das modalidades mencionadas acima pode ser preparado usando métodos conhecidos na técnica. Qualquer suco, conforme este termo é usado aqui, pode ser empregado para preparar o meio. Sucos de frutas e vegetais contêm uma variedade de diferentes açúcares, vitaminas, fitonutrientes, fito-hormônios, pigmentos, ácidos minerais e aminoácidos. Portanto, sucos de frutas e vegetais contêm todos os componentes constitutivos normalmente encontrados em meio de cultura de algas sintético.

[0114]Em uma modalidade exemplificativa, suco de tomate é usado. O suco de tomate é adequado para a produção econômica em larga escala de compostos, composições e produtos de algas e assim por diante porque ele é relativamente barato. Estas características do suco de tomate suco tornam este suco uma escolha exemplificativa para o cultivo isento de produtos químicos de microalgas. Em outra modalidade exemplificativa, suco de tomate certificado como orgânico pode ser usado para preparar o meio. A biomassa de algas resultante cumpriria as normas NOP (orgânica).

[0115]Em outra modalidade exemplificativa, suco de beterraba naturalmente fermentado pode ser usado para preparar o meio.

[0116]O suco de qualquer uma das modalidades descritas aqui pode ser preparado, por exemplo, extraindo suco de uma ou mais frutas ou legumes. O suco resultante é esterilizada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica os quais são descritos em Rupasinghe e Yu (2012), o qual é aqui incorporado por referência na íntegra.

[0117]Conforme definido aqui, "esterilização", "esterilizado" ou "estéril" se refere a um processo que reduz ou elimina a biocarga para um nível onde ela não pode competir com as algas pelo crescimento. Exemplos não limitativos incluem pasteurização, alta pressão hidrostática, esterilização a vapor e campo elétrico de pulso e outros métodos conhecidos na técnica e descritos em Rupasinghe e Yu (2012).

[0118]Em várias modalidades exemplificativas, o suco de qualquer uma das modalidades aqui pode ser pasteurizado em uma temperatura selecionada do grupo que consiste em cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, cerca de 80 °C, cerca de 85 °C, cerca de 90 °C, cerca de 95 °C e cerca de 100 °C.

[0119]Em uma modalidade exemplificativa, o suco pasteurizado pode ser usado diretamente na formulação dos meios. Em outra modalidade exemplificativa, o suco pode ser pré-fermentado naturalmente usando, por exemplo, uma bactéria produtora de ácido láctico ou uma levedura e, então, pasteurizado para reduzir a biocarga. As leveduras ou bactérias são adicionadas ao suco e seladas em recipientes para iniciar a fermentação. A fermentação do suco é rigidamente controlada para evitar subprodutos indesejáveis ou tóxicos e a deterioração. A qualidade do produto final é determinada pela composição específica da fruta usada no meio de fermentação e as características da levedura ou cepa bacteriana selecionada para fermentar o suco. Em uma modalidade exemplificativa, a fermentação é realizada em suco minimamente processado sem outros fatores de crescimento, fertilizantes, reagentes químicos ou nutrientes adicionados exogenamente. Em outra modalidade exemplificativa, o meio é suplementado com um açúcar esterilizado e/ou fonte de sal esterilizada para promover o crescimento de algas.

[0120]Uma fonte de oxigênio é também adicionada ao meio. Em uma modalidade exemplificativa, o meio pode ser misturado com água potável ozonizada ou água do mar esterilizada por UV. A ozonização e esterilização por UV podem ser realizadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, os quais são descritos, por exemplo, em Kelley (1961) e Restaino et al. (1995), os quais são aqui incorporados por referência na íntegra.

[0121]A esterilização do meio pode ser obtida por meio de métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade ilustrativa, os componentes individuais do meio, tais como suco, açúcar e uma fonte de sal, podem primeiro ser esterilizados individualmente de acordo com uma ou mais dos métodos de esterilização conhecidos na técnica e descritos em Rupasinghe e Yu (2012) e, então, combinados sob condições estéreis para produzir um meio estéril. Em outra modalidade ilustrativa, os componentes não esterilizados individuais do meio, tais como suco, açúcar e uma fonte de sal, podem primeiro ser combinados e o meio resultante pode, então, ser esterilizado de acordo com um ou mais dos métodos conhecidos na técnica e descritos em Rupasinghe e Yu (2012).

[0122]Este meio contendo suco basal pode, então, ser usado para o cultivo de algas. As algas podem ser cultivadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade exemplificativa, as algas são cultivadas em um vaso de fermentação estéril para se obter a biomassa ou cultura de células. Durante fermentação, a cultura de algas é aerada para promover a respiração mitocondrial.

[0123]As culturas de células de algas ou biomassa de algas resultante pode, então, ser coletada e conservada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo Shelef et al. (1984), o qual é aqui incorporado na íntegra).

[0124]Em outra modalidade exemplificativa, as algas resultantes pode ser usadas para coletar composições e compostos lipídicos. Os métodos pelos quais tais compostos e composições podem ser extraídos a partir de algas são bem conhecidos na técnica. Em algumas modalidades ilustrativas, são usados métodos para remover os compostos e composições lipídicas da biomassa de algas úmida (uma pasta de algas ou cultura que tem mais do que 10% de umidade) ou biomassa de algas seca (uma pasta ou cultura de algas que tem mais do que 10% de umidade). Métodos não limitativos podem ser mecânicos, químicos, supercríticos ou fisiológicos.

[0125]Em uma modalidade exemplificativa, solventes químicos podem ser usados para extrair os compostos e composições lipídicas. Solventes químicos são baratos, voláteis (para pronta remoção posterior), isentos de impurezas tóxicas ou reativos (para evitar reação com os lipídios), capazes de formar um sistema bifásico com água (para remover substâncias não lipídicas) e ser pobres extratores de componentes indesejáveis (por exemplo, proteína proteolipídica e pequenas moléculas). Tais solventes facilitam a extração de compostos lipídicos ao quebrar as ligações entre os lipídios e outros componentes celulares não lipídicos sem degradar os lipídios. Em uma modalidade exemplificativa, os compostos e as composições lipídicas podem ser separados da biomassa de algas lavando repetidamente as células de algas com um solvente orgânico. Solventes orgânicos não limitativos incluem hexano, etanol ou metanol.

[0126]De acordo com outras modalidades exemplificativas, os compostos e as composições lipídicas podem ser extraídos das algas por meio de extração com fluido supercrítico, o qual envolve o uso de fluidos supercríticos como um solvente para extrair compostos lipídicos. Um exemplo não limitativo de um solvente usado para extração supercrítica é dióxido de carbono, o qual tem uma temperatura e pressão críticas moderadas (31,3 °C, 72,9 atm.). Quando elevado acima de sua temperatura e pressão críticas, o CO2 pode adquirir as propriedades de diluição de um líquido, ao mesmo tempo em que se mantém as propriedades de transporte de um gás. Compostos lipídicos são extraídos neste fluido supercrítico. Retorno do superfluido para a pressão atmosférica permite que o solvente assuma a sua forma de vapor, de modo que nenhum resíduo permanece no composto lipídico. Na extração com fluido supercrítico/CO2, o CO2 é liquefeito sob pressão e aquecido até o ponto em que ele tem as propriedades de um líquido e um gás. Este gás liquefeito, então, atua como o solvente de extração do óleo. Este processo pode ter vantagens em relação a extrações com solvente, incluindo uma menor degradação térmica do óleo ou seus componentes (aparência mais leve), óleos isentos de solventes e óleos seletivamente enriquecidos por alguns componentes. Em extração com fluido supercrítico é possível extrair cerca de 100% dos lipídios. Extração supercrítica é um processo caro quando comparado com a extração com solvente convencional. Se o produto é de alto valor e baixo volume, extração supercrítica pode ser justificada. Métodos com CO2 supercrítico também têm a vantagem de não utilizar produtos químicos sintéticos para extrair o óleo da biomassa de algas. Os lipídios resultantes podem ser considerados isentos de aditivos químicos quando um meio com base em suco, conforme descrito aqui, é usado para sua produção.

[0127]Em outra modalidade exemplificativa, os compostos e as composições lipídicas podem ser extraídos por meio de extração mecânica de óleo, a qual envolve alterar fisicamente a membrana das algas para liberar compostos e composições lipídicas. Exemplos não limitativos de extração mecânica de óleo incluem prensagem, trituração, homogeneização e extração assistida por ultra-som (cavitação).

[0128]Em outra modalidade exemplificativa, os compostos e as composições lipídicas podem ser extraídos por meio de extração de óleo fisiológica, a qual envolve alterar a integridade fisiológica das células de algas. Exemplos não limitativos incluem degradação enzimática da membrana celular e choque osmótico, métodos que destroem a membrana da parede celular para liberar compostos lipídicos. Choque osmótico envolve reduzir rapidamente a pressão osmótica do meio de cultura para induzir à lise da parede celular.

[0129]Em outra modalidade ilustrativa, a extração pode ser realizada usando extração assistida por ultrassom. Extração ultrassônica pode acelerar processos de extração. Usando um reator de ultrassom, ondas ultrassônicas são usadas para criar bolhas de cavitação em um material solvente. Quando estas bolhas entram em colapso próximo das paredes celulares, isto cria ondas de choque e jatos de líquidos que fazem com que as paredes celulares se rompam e liberem seu conteúdo. Sonoquímica é um dos processos mais eficientes para a indução de moléculas com energia. Sonoquímica usa irradiação ultrassônica para formar cavitação acústica: a formação, crescimento e colapso implosivo de bolhas em um líquido. Cavitação acústica produz condições locais de 5000K e 1000 atm. Durante o processo de cavitação, as taxas de aquecimento e resfriamento excedem a 10e9 K/Hz, onde ocorrem correntes de jato de líquido de 400 km/h.

[0130]Ruptura mecânica, extração com solvente e extração com fluidos supercríticos requerem que a biomassa de algas seja primeiro seca em baixa umidade percentual, <10%, antes do processamento. Outros métodos, tais como ruptura celular enzimática e osmótica, podem não requerer de uma etapa de pré-secagem.

[0131]Em uma modalidade exemplificativa, a biomassa de algas é seca por congelamento, seguido por extração com solventes de compostos e composições lipídicas. O processo de congelamento consiste em congelar o material. Em um laboratório, isto é frequentemente realizado ao colocar o material em um frasco de liofilização e rotação do frasco em um banho, denominado um congelador de envoltório, o qual é esfriado por refrigeração mecânica, gelo seco e metanol, ou em nitrogênio líquido. Em uma escala maior, o congelamento é, em geral, usando um liofilizador comercial. Nesta etapa, é importante esfriar o material abaixo de seu ponto eutético, a menor temperatura na qual as fases sólida e líquida do material podem coexistir. Isso garante que sublimação, em vez de fusão, ocorrerá nas etapas seguintes. Os cristais maiores são mais fáceis de liofilizar. Para produzir cristais maiores, o produto deve ser congelado lentamente ou pode sofrer ciclos de temperatura para cima e para baixo. Este processo é denominado recozimento. No entanto, no caso de produtos alimentícios, ou objetos com células anteriormente vivas, grandes cristais de gelo romperão as paredes celulares. Conforme descoberto por Clarence Birdseye, quando o alimento é congelado a -40 °C a -45 °C ou menos, então, ele tem um gosto melhor. Geralmente, as temperaturas de congelamento estão entre -50 °C e -80 °C. As algas secas por congelamento são, então, submetidas progressivamente a solventes mais polares para fracionar completamente os lipídios presentes.

[0132]Em outra modalidade, extração com água subcrítica pode ser usada com um solvente de suco de fruta para estabilizar os PUFAs durante o processo de extração.

EXEMPLO 1 TEOR DE NITROGÊNIO DE SUCOS

[0133]Nitrogênio total biodisponível, incluindo nitrogênio de amina primária (incluindo L-arginina e ácido glutâmico), ureia e amônia foram medidos usando os kits bioquímicos K-PANOPA, K-Large e K-Glut (Megazyme, Irlanda). Cinco sucos foram testados: suco de beterraba fermentado certificado como orgânico, suco de tomate, suco de cenoura certificado como orgânico, suco de maçã certificado como orgânico e água de coco. Cada suco foi pasteurizado, diluído para a concentração de 10% (vol/vol) e, então, testado. Os valores reportados são ajustados para 100% de suco. TABELA 1

[0134]Os sucos pasteurizados testados contêm diferentes perfis de nitrogênio. Suco de beterraba, suco de tomate e suco de cenoura tiveram o maior teor de nitrogênio biodisponível total. Suco de maçã e água de coco tinham o menor teor de nitrogênio biodisponível.

EXEMPLO 2 CRESCIMENTO DE S. LIMACINUM EM MEIO COM SUCO CONTENDO ÁGUA DO MAR SEM AJUSTE DE PH

[0135]S. limacinum foi propagado nos meios com suco sem nenhum ajuste de pH. Um total de quinze (15) meios (usados tanto para inocular quanto cultivar as algas) foram preparados, tendo as seguintes concentrações dos respectivos sucos: (1) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 10%; (2) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 25%; (3) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 50%; (4) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 10%; (5) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 25%; (6) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 50%; (7) suco de tomate na concentração de 10%; (8) suco de tomate na concentração de 25%; (9) suco de tomate na concentração de 50%; (10) água de coco na concentração de 10%; (11) água de coco na concentração de 25%; (12) água de coco na concentração de 50%; (13) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 10%; (14) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 25%; e (15) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 50%. Cada meio continha adicionalmente água do mar tendo uma salinidade de 12,7 ppt. Os meios foram esterilizados por meio de pasteurização. TABELA 2: pH inicial do meio com suco

TABELA 3: Parâmetros de crescimento máximo para S. limacinum em meios com suco sem nenhum ajuste de pH

[0136]Os resultados são apresentados na Figura 1. Quando o pH dos sucos não foi ajustado, os meios contendo suco de tomate, beterraba e cenoura, respectivamente, renderam uma maior biomassa quando comparado com meios que contêm maçã e água de coco, respectivamente. Além disso, as algas cultivadas em um meio com base em suco de tomate atingiram a densidade máxima após 22 horas, enquanto que as algas cultivadas em um meio com base em água de coco levaram mais tempo, 137 horas, para atingir a densidade máxima.

EXEMPLO 3 CRESCIMENTO DE S. LIMACINUM EM MEIO COM SUCO CONTENDO ÁGUA DO MAR E COM PH AJUSTADO PARA 6,8

[0137]S. limacinum foi propagada em meio com suco com pH ajustado para 6,8. Um total de quinze (15) meios (usados tanto para inocular quanto cultivar as algas) foram preparados, tendo as seguintes concentrações dos respectivos sucos: (1) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 10%; (2) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 25%; (3) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 50%; (4) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 10%; (5) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 25%; (6) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 50%; (7) suco de tomate na concentração de 10%; (8) suco de tomate na concentração de 25%; (9) suco de tomate na concentração de 50%; (10) água de coco na concentração de 10%; (11) água de coco na concentração de 25%; (12) água de coco na concentração de 50%; (13) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 10%; (14) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 25%; e (15) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 50%. Cada meio continha adicionalmente água do mar suficiente para obter uma salinidade de 12,7 ppt. Os meios foram esterilizados por meio de pasteurização. TABELA 3: Parâmetros de crescimento máximo para meios com suco para S.limacinum com pH ajustac o para 6,8

[0138]Os resultados são apresentados na Figura 2. Em um pH de 6,8, meios contendo suco de tomate na concentração de 50% e suco de beterraba na concentração de 25%, respectivamente, renderam a maior biomassa de algas. A taxa de crescimento celular foi a mais rápido em meio com base em suco de tomate: levou 22 horas para atingir a densidade máxima. Suco de tomate continha o maior teor de ácido glutâmico natural, o que pode ter contribuído para a taxa de crescimento mais rápida. Meios com base em água de coco e suco de maçã renderam a menor biomassa. Foi reportado que o pH pode afetar a taxa de dissociação de ácido glutâmico, assim, influenciando a biodisponibilidade de nitrogênio, especialmente quando na forma de ácido glutâmico (Ault, A. (2004) "The Monosodium Glutamate Story: The Commercial Production of MSG and Other Animo Acids", Journal of Chemical Education). Em maior pH, o ácido glutâmico está mais biodisponível, de modo que a biomassa é aumentada para cada formulação de meio, especialmente aqueles com concentrações mais elevadas de ácido glutâmico, tais como meios com base em suco de tomate e beterraba.

EXEMPLO 4 CRESCIMENTO DE S. LIMACINUM EM MEIOS COM SUCO SUPLEMENTADOS COM DEXTROSE

[0139]S. limacinum foi propagada em meios suplementados com suco de dextrose. Um total de cinco (5) meios (usados tanto para inocular quanto cultura das algas) foram preparados, tendo as seguintes concentrações dos respectivos sucos: (1) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 25%; (2) suco de tomate na concentração de 50%; (3) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 50%; (4) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 50%; e (5) água coco na concentração de 50%. Cada meio foi suplementado com dextrose em uma concentração de 6%. Os meios foram esterilizados por meio de pasteurização. TABELA 4: Parâmetros de crescimento máximo de S. limacinum cultivado em meio suplementado com dextrose

[0140]Os resultados são apresentados na Figura 3. Células de S. limacinum cultivadas em meios contendo suco de tomate, beterraba e cenoura em concentrações de 50%, 25% e 50%, respectivamente, obtiveram a maior biomassa, 9,0 E+07, 9,83 E+07 e 6,88 E+07, respectivamente. Em contraste, as células de algas cultivadas em meios que contêm água de coco e suco de maçã, respectivamente, obtiveram a menor biomassa, 4,23 E+07 e 4,28 E+06, respectivamente. S. limacinum cultivada em meio contendo 50% de suco de tomate suplementado com dextrose atingiu a densidade máxima mais rapidamente, após 50 horas de crescimento.

EXEMPLO 5 RENDIMENTO DE DHA A PARTIR DE CULTURA DE S. LIMACINUM CRESCIDA EM MEIOS COM SUCO

[0141]S. limacinum foi cultivada em vários meios contendo suco. Um total de quinze (15) meios (usadas para inocular tanto o algas e cultura) foram preparadas, tendo as seguintes respectivas concentrações de suco de: (1) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 10%; (2) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 25%); (3) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 50%; (4) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 10%; (5) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 25%; (6) suco de maçã certificado como orgânico na concentração 50%; (7) suco de tomate na concentração de 10%; (8) suco de tomate na concentração de 25%; (9) suco de tomate na concentração de 50%; (10) água de coco na concentração de 10%; (11) água de coco na concentração de 25%; (12) água de coco na concentração de 50%; (13) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 10%; (14) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 25%; e (15) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 50%. Cada meio continha adicionalmente água do mar com uma salinidade de 12,7 ppt e foi suplementado com dextrose certificado como orgânico na concentração de 6%. Os meios foram esterilizados por meio de pasteurização.

[0142]As células de algas foram secas por filtração sob vácuo e as amostras foram transesterificadas in situ. O DHA foi quantificado por meio de cromatografia gasosa através de comparação com padrões internos e externos. TABELA 5: Rendimento máxima de DHA para meios com base em suco (tendo uma concentração de suco de 50%)

[0143]Os resultados são apresentados na Figura 4. O rendimento de DHA por ml de meio foi mais elevado para os meios suplementados com de dextrose certificada como orgânica contendo a concentração de 50% de suco de tomate e a concentração de 50% de suco de beterraba, 5,0 mg de DHA/L de meio com suco e 4,4 mg de DHA/L meio com suco, respectivamente.

EXEMPLO 6 RENDIMENTO DE EPA A PARTIR DE CULTURA DE S. LIMACINUM CRESCIDA EM MEIOS COM SUCO

[0144]S. limacinum foi cultivada em vários meios contendo suco. Um total de quinze (15) meios (usados tanto para inocular quanto cultivar as algas) foram preparados tendo as seguintes concentrações dos respectivos sucos: (1) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 10%; (2) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 25%; (3) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 50%; (4) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 10%; (5) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 25%; (6) suco de maçã certificado como orgânico na concentração de 50%; (7) suco de tomate na concentração de 10%; (8) suco de tomate na concentração de 25%; (9) suco de tomate na concentração de 50%; (10) água de coco na concentração de 10%; (11) água de coco na concentração de 25%; (12) água de coco na concentração de 50%; (13) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 10%; (14) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 25%; e (15) suco de cenoura certificado como orgânico na concentração de 50%. Cada meio continha adicionalmente água do mar com uma salinidade de 12,7 ppt e foi suplementado com dextrose certificada como orgânica na concentração de 6%. Os meios foram esterilizados por meio de pasteurização.

[0145]As células de algas foram secas por filtração sob vácuo e as amostras foram transesterificadas in situ. EPA foi quantificado por meio de cromatografia gasosa através de comparação com padrões internos e externos. TABELA 5: Rendimento máximo de EPA para meios com base em suco (com uma concentração de suco de 50%)

[0146]Os resultados são apresentados na Figura 5. O rendimento de EPA por ml de meio foi mais elevado para os meios suplementados com de dextrose certificada como orgânica contendo uma concentração de suco de tomate de 50% e uma concentração de suco de beterraba de 50%, respectivamente.

EXEMPLO 7 RENDIMENTO DE DPA A PARTIR DE CULTURA DE S. LIMACINUM CRESCIDA EM MEIOS COM SUCO

[0147]S. limacinum foi cultivada em vários meios contendo suco. Um total de quinze (15) meios (usados tanto para inocular quanto cultivar as algas) foram preparados tendo as seguintes concentrações dos respectivos suco: (1) suco de beterraba certificado como orgânico na concentração de 10%; (2) certificado suco de beterraba orgânico a concentração de 25%; (3) certificada suco de beterraba orgânico a concentração de 50%; (4) certificado suco de maçã orgânico em uma concentração de 10%; (5) certificada suco de maçã orgânico a uma concentração de 25%; (6) certificada suco de maçã orgânico na concentração de 50%; (7) suco de tomate com uma concentração de 10%; (8) de suco de tomate com uma concentração de 25%; (9) suco de tomate com uma concentração de 50%; (10) água de coco na concentração de 10%; (11) água de coco na concentração de 25%; (12) água de coco na concentração de 50%; (13) certificada suco de cenoura orgânica em uma concentração de 10%; (14) certificada suco de cenoura orgânica na concentração de 25%; e (15) certificada suco de cenoura orgânica na concentração de 50%. Cada meio continha adicionalmente água do mar com uma salinidade de 12,7 ppt e foi suplementado com dextrose certificado orgânico a uma concentração de 6%. Os meios foram esterilizados pela pasteurização.

[0148]As células de algas foram secas por filtração sob vácuo e as amostras foram transesterificadas in situ. DPA foi quantificado por meio de cromatografia gasosa através de comparação com padrões internos e externos.

[0149]Os resultados são apresentados na Figura 6. O rendimento de DPA por ml de meio foi mais elevado para os meios suplementados com dextrose certificada como orgânica contendo uma concentração de suco de tomate de 50% e uma concentração de suco de beterraba de 50%, respectivamente. TABELA 6: Rendimento máximo de DPA para cad a tipo de suco

EXEMPLO 8 CRESCIMENTO DE NANNOCHLOROPSIS OCULATA EM MEIO COM SUCO DE BETERRABA

[0150]N. oculata foi propagado nos meios suco de beterraba. 1 x 106 células de N. oculata foram inoculadas e cultivadas em cada um dos seguintes meios: (1) meio F/2 (médio comercial sintético padrão); (2) suco de beterraba fermentado natural (pH ajustado para 7,6; salinidade ajustada para 25 ppt com água do mar); (3) suco de beterraba fermentado natural (pH ajustado para 7,6; salinidade ajustada para 25 ppt com água do mar) suplementado com dextrose a 30 mM; e (4) suco de beterraba natural fermentado (pH ajustado para 7,6; salinidade ajustada para 25 ppt com água do mar) suplementado com etanol a 30 mM. Os meios com suco de beterraba foram esterilizados por meio de pasteurização. As células foram incubadas a 22 °C com agitação a 160 rpm durante 5 dias. TABELA 7: Parâmetros de crescimento máximo para N. oculata cultivada em meios com suco de beterraba

[0151]Os resultados são apresentados na Figura 7. Células de N. oculata cultivadas em meio com suco de beterraba produziram maior biomassa quando comparado com células de N. oculata cultivadas em meio comercial F/2.

EXEMPLO 9 CRESCIMENTO DE S. LIMACINUM EM MEIOS COM MELAÇO DE BETERRABA

[0152]S. limacinum foi propagada em meio com melaço de beterraba. 1 x 106 células de S. limacinum foram inoculadas e cultivadas em cada um dos seguintes meios: (1) suco de beterraba fermentado enriquecido com 6% de dextrose ("BJ"); (2) melaço de beterraba certificado como orgânico a 8,4%, suplementado com 6% de dextrose ("BM"); e (3) melaço de beterraba certificado como orgânico a 8,4% hidrolisado com enzima invertase ("BM-H"). Os meios foram esterilizados por meio de filtração ou pasteurização. Formulações de suco de beterraba e melaço de beterraba foram ajustadas para assegurar um teor igual de nitrogênio. As células foram incubadas a 22 °C com agitação a 200 rpm durante 5 dias.

[0153]Os resultados são apresentados na Figura 8. Meios com melaço de beterraba certificado como orgânico podem suportar o crescimento de S. limacinum. Todos os meios com beterraba continham nitrogênio suficiente para suportar o crescimento S. limacinum; no entanto, o crescimento de S. limacinum em meio com melaço de beterraba suplementado com 6% de dextrose (BM) foi parcialmente inibido. Uma vez que o melaço de beterraba já tem um alto teor de açúcar, o açúcar adicional pode ter inibido o crescimento de S. limacinum. S. limacinum não é capaz de usar sacarose, um componente principal do melaço de beterraba; portanto, a hidrólise de sacarose foi investigada de modo que a sacarose no melaço de beterraba fosse convertida em frutose e glicose. Frutose e glicose são formas biodisponíveis de açúcar para o metabolismo de S. limacinum. Neste caso, os meios com melaço de beterraba hidrolisado (BM-H) não requeriam suplementação com dextrose. O meio com melaço de beterraba hidrolisado (BM-H) suportou o crescimento de S. limacinum em um nível similar quando comparado com meio com suco de beterraba naturalmente fermentado suplementado com 6% de dextrose (BJ). Uma vez que o suco de beterraba também contém sacarose, ele pode ser opcionalmente hidrolisado para suportar o crescimento de S. limacinum.

EXEMPLO 10 HIDRÓLISE DE SUCO DE BETERRABA E MELAÇO DE BETERRABA PARA PRODUZIR DEXTROSE E FRUTOSE

[0154]Soluções contendo 10% de melaço de beterraba, 20% de melaço de beterraba e 100% de suco de beterraba (pasteurizado (95 °C), pH de 3,7), respectivamente, foram ajustadas para um pH de 4,5 usando ácidos orgânicos de grau alimentício e tratadas com invertase de levedura de padeiro (Sigma Chemical Co.) sob condições estéreis. Um kit K-SUFRG (Megazyme, Irlanda) foi usado para analisar as soluções para determinar as concentrações de sacarose, frutose e glicose em cada formulação antes e após tratamento com enzima. As amostras foram inoculadas com os padrões de glicose, frutose e sacarose. As soluções foram incubadas a 55 °C durante 24 horas. Os resultados são apresentados na Tabela 8. TABELA 8: Hidrólise de suco de beterraba e melaço de beterraba para produzir glicose e fructose

[0155]Descobriu-se que a eficiência de hidrólise em 10% de solução de melaço de beterraba, 20% de solução de melaço de beterraba e 100% de suco de beterraba era de 77%, 78% e 87%, respectivamente.

EXEMPLO 11 RENDIMENTO DE DHA A PARTIR DE CULTURA DE S. LIMACINUM CRESCIDA EM MEIO COM MELAÇO DE BETERRABA

[0156]S. Limacinum foi propagada em meio com melaço de beterraba. 1 x 106 células de S. Limacinum foram inoculadas e cultivadas em cada um dos seguintes meios: (1) meio basal comercial (3% de dextrose, 1% de extrato de levedura e água do mar); (2) suco de beterraba fermentado enriquecido com 6% de dextrose; (3) 8,4% de melaço de beterraba suplementado com 6% de dextrose; e (4) 8,4% de melaço de beterraba hidrolisado com enzima invertase. Os meios foram esterilizados por meio de filtração ou pasteurização. Formulações de suco de beterraba e melaço de beterraba foram ajustadas para assegurar teor igual de nitrogênio. As células foram incubadas a 22 °C com agitação a 200 rpm durante 5 dias. Um volume de cultura contendo um número equivalente de células (2 x 108 células) foi coletado para cada meio após 120 horas de crescimento. As amostras de cultura foram liofilizadas e teor de DHA foi determinado através de cromatografia gasosa usando métodos convencionais.

[0157]Os resultados são apresentados na Tabela 9. TABELA 9: Rendimento máximo de DHA para meios com base em melaço

[0158]O meio com melaço hidrolisado com invertase pode suportar o crescimento de S. limacinum e rendimentos mais elevados de DHA por mL de meio quando comparado com o meio basal comercial. EXEMPLO 12 RENDIMENTO DE DHA RENDIMENTO A PARTIR. CULTURA DE S. LIMACINUM CRESCIDA EM MEIO COM SUCO DE BETERRABA SUPLEMENTADO COM DEXTROSE E EXTRATO DE LEVEDURA

TABELA 10: Impacto da suplementação com extrato de levedura e suplementação com açúcar combinadas sobre o crescimento de S. limacinum em meio com suco de beterraba pasteurizado

[0159]*1 (60% de suco de beterraba pasteurizado {BJ}, 2% de dextrose {D}, 0,1% de extrato de levedura {YE}), 2 (60% BJ, 2% D, 1% YE), 3 (60% BJ, 4 D%, 0,55% YE), 4 (60% BJ, 6% D, 0,1% YE), 5 (60% BJ, 6% D, 1% YE) TABELA 11: Impacto da suplementação com extrato de levedura e suplementação com açúcar combinadas sobre o rendimento de DHA em S. limacinum em meio com suco de beterraba pasteurizado

[0160]*1 (60% de suco de beterraba pasteurizado {BJ}, 2% de dextrose {D}, 0,1% de extrato de levedura {YE}), 2 (60% BJ, 2% D, 1% YE), 3 (60% BJ, 4 D%, 0,55% YE), 4 (60% BJ, 6% D, 0,1% YE), 5 (60% BJ, 6% D, 1% YE)

[0161]O design experimental estatístico foi usado para avaliar o impacto de múltiplas variáveis sobre a biomassa de S. limacinum e a produção de DHA em meio com suco de beterraba pasteurizado. Neste estudo, o efeito combinado da adição de extrato de levedura (uma fonte de vitaminas) e açúcar (necessário para produção de ácido graxo ômega-3) foi avaliado. Para examinar estas duas variáveis quanto ao seu impacto combinado sobre a produção de DHA e biomassa de S. limacinum, um design fatorial fracional de 2 fatores e 3 níveis foi implementado. Uma vez que designs fatoriais de dois níveis se tornam rapidamente muito grandes para aplicação prática à medida que o número de variáveis aumenta, um design fracional foi selecionado. Para estimar os erros experimentais, quatro pontos centrais, nos quais os fatores foram definidos em seu ponto médio, foram incluídos.

[0162]Este design (Tabela 12) foi gerado pelos princípios de RSM usando o software comercial, Design Expert Modde 9.0 (Stat-Ease Inc.; Mineápolis, MN). Para apoiar este design, três concentrações de extrato de levedura, 0,1%, 0,55% e 1% (Fator 1, X1) foram avaliadas. Além disso, foram avaliadas três concentrações de açúcar, 2%, 4% e 6% de dextrose (Fator 2, X2). As respostas que foram monitoradas foram a biomassa (CFU/mL, Y1) e o teor de DHA (mg de DHA/2 x 108 células, Y2). Com base nos valores experimentais (Y1, Y2) os coeficientes modelo foram calculados, a partir dos quais foram estimados os efeitos da variável ou grau de influência de variáveis em cada resposta usando um diagrama de Pareto. A falta de ajuste para os três modelos foi estatisticamente determinada também. TABELA 12: Configuração de design fatorial fracionai dos valores experimentais reais e codificados para o crescimento de S. limacinum em meios com suco de beterraba suplementados com extrato de levedura e dextrose

[0163]O teor de DHA (mg de DHA/2 x 108 células, Y2) foi monitorada em 48, 72 e 96 horas de crescimento celular (Tabela 11). Descobriu-se que os valores obtidos no ponto de tempo de 96 horas eram mais significativos para a produção de DHA. Consequentemente, os dados experimentais obtidos em 96 h foram adicionalmente avaliados usando a metodologia de superfície de resposta. Com base em análise ANOVA, o modelo de F-valor (DHA) de 113,47 implica que o modelo é significativo. A falta de um valor de ajuste de 0,3184 também implica que a falta de ajuste em relação ao erro puro não foi significativa. Além disso, o "Pred R-Squared" de 0,87 era razoável de acordo com o "Adj R-Squared" de 0,98. Com base em análise de variância, o valor de probabilidade para cada termo individual no modelo foi obtido e, como um resultado, observou-se que ambos os fatores, incluindo a concentração de dextrose (Prob > F, <0,0001) e a concentração de extrato de levedura (Prob > M, 0,0027), afetaram significativamente o teor de DHA das células. O estilo Pareto | efeito | gráfico (Figura 9) exibe uma representação gráfica destas estimativas ordenadas, da maior para a menor. Conforme mostrado na Figura 9, o teor de DHA é positivamente afetado tanto pela adição de extrato de levedura quanto dextrose. O fator mais importante é a concentração de dextrose, com uma contribuição de 84,01%, em oposição a um contribuição de 12,85% da concentração de extrato de levedura.

[0164]Isto é esperado, uma vez que é provável que a cadeia de carbono da dextrose seja requerida como um bloco de construção para a produção de DHA.

[0165]Uma vez que as células estão na fase estacionária muito tardia em 96 horas, foi decidido que o ponto de dados de 72 horas era mais relevante para avaliar o impacto dos dois fatores sobre a biomassa. Com base na análise de variância para o modelo ajustado para a Biomassa (CFU/mL, Y1) de dados, o modelo de F-valor de 18,0 implica que o modelo é significativo. A falta de um valor de ajuste de 0,7975 também implica que a falta de ajuste em relação ao erro puro não foi significativa. O "Pred R-Squared" de 0,85 foi razoável de acordo com o "Adj R-Squared" de 0,88. Com base em análise ANOVA e no gráfico de estilo Pareto, observou-se que a biomassa foi significativamente afetada negativamente pela concentração de dextrose (43,72% de contribuição). O extrato de levedura não teve um efeito significativo sobre a biomassa (2,47% de contribuição). No entanto, a interação da concentração de dextrose e extrato de levedura mostrou um efeito negativo significativo sobre a biomassa (46,91% de contribuição). Isto é esperado, uma vez que é reportado que a elevada concentração de açúcar pode inibir o crescimento de S. limacinum.

[0166]A correlação entre o DHA sintetizado pelas células e a biomassa foi também investigada. Observou-se uma correlação negativa de mais de 0,85%. Para resumir os resultados observados, o suco de beterraba natural pode ser suplementado com extrato de levedura e dextrose para aumentar significativamente o rendimento de DHA em S. limacinum. A concentração dextrose tem o maior impacto positivo sobre o teor de DHA por célula e um impacto negativo sobre a biomassa celular nas concentrações testadas.

EXEMPLO 13 TEOR DE NITROGÊNIO DE MELAÇO DE BETERRABA E OUTROS SUCOS

[0167]O nitrogênio total biodisponível incluindo nitrogênio de amina primária (incluindo L-arginina e ácido glutâmico), ureia e amônia foram medidos usando os kits bioquímicos K-PANOPA, K-Large e K-Glut (Megazyme, Irlanda). Melaço de beterraba foi testado. A amostra foi diluída para a concentração de 10% (vol/vol) e, então, testada. Os valores reportados são ajustados para o suco a 100%. Os resultados estão resumidos na Tabela 13. TABELA 13: Concentração de nitrogênio em melaço de beterraba

[0168]Melaço de beterraba tem uma elevada concentração de nitrogênio total biodisponível de > 2990 mg de nitrogênio/L.

EXEMPLO 14 CULTIVO DE ALGAS EM MEIOS COM BASE EM SUCO MELHORA A ESTABILIDADE DE ÁCIDOS GRAXOS

[0169]S. limacinum foi inoculada em um meio com base em suco de tomate. Volumes iguais de cultura foram centrifugados e o meio foi decantado. Os pellets de algas resultantes foram suspensos individualmente em cada um de suco de beterraba, suco de cenoura, suco de mirtilo ou água na proporção de 9:1. Uma amostra de 0,8 g de cada uma das misturas foi testada para determinar a concentração inicial de DHA. Amostras adicionais de ~0,8 g foram separadas em alíquotas, seladas em tubos de 1,5 ml e, então, aquecidas a 60 °C durante até seis dias. Os níveis de DHA foram quantificados por meio de cromatografia gasosa de FAMEs. Os resultados estão resumidos na Tabela 14. TABELA 14: Sucos podem proteger DHA da oxidação em biomassa de S. limacinum ou pasta de algas

[0170]Observou-se que o DHA contido nas amostras de algas em suspensão em água foi oxidado em um grau maior (~73,3% do teor inicial de DHA foram oxidados) quando comparado com o DHA contido nas amostras de algas em suspensão em vários sucos após 6 dias. Suco de beterraba demonstrou o maior efeito protetor e apenas 11,59% das moléculas de DHA iniciais foram oxidados após incubação a 60 °C durante 6 dias. Sucos são ricos em antioxidantes e estes bioativos podem ter contribuído para a estabilidade de DHA nas amostras de algas.

EXEMPLO 15 ESTABILIZAÇÃO DE ALGAS EM MEIOS COM BASE EM SUCO

[0171]S. limacinum foi inoculada em um meio basal. Volumes iguais de cultura foram centrifugados e o meio foi decantado. Os pellets de algas resultantes foram homogeneizados com água em uma proporção de 1:1 e individualmente suspensos nas seguintes misturas em uma proporção de 1:1: (i) suco de cenoura; (ii) suco de beterraba; (iii) suco de beterraba + extrato de chá verde; (iv) suco de mirtilo; (v) água; (vi) água + 6% de sacarose (sem luz); ou (vii) água + 6% de sacarose + extrato de chá verde. Extrato de chá verde foi adicionado como uma fonte de galato (EGCG), o qual é um flavonoide de polifenol antioxidante. A água e suco de beterraba enriquecido com extrato de chá verde continham 1000 ppm de EGCG. Amostras de ~0,1 g foram separadas em alíquotas, seladas em tubos de 1,5 mL para determinação do teor de DHA a cada 3 dias durante um período de 9 dias. As amostras foram mantidas a 60 °C. Amostras de ~1 g adicionais foram separadas em alíquotas, seladas em tubos de 1,5 ml para determinação da atividade antioxidante das misturas a cada três dias durante um período de 12 dias. As amostras foram mantidas a 60 °C. Os níveis de DHA foram quantificados por meio de cromatografia gasosa de FAMEs, enquanto que o teor de antioxidantes das misturas foi determinado através do método de análise de DPPH (Sigma-Aldrich), em que a atividade de remoção de radicais é apresentada em percentagem. Os resultados estão resumidos nas Figuras 10 (a) - (b) e Figuras 11 (a) - (b).

[0172]Embora a pasta de algas tenha uma atividade antioxidante intrínseca, a adição de sucos ricos em antioxidantes naturais e/ou a adição de um antioxidante natural, tal como extrato de chá verde, prolongou a estabilidade DHA sob condições aceleradas. Conforme ilustrado na Figura 10 (a), a atividade antioxidante das misturas de creme de algas com suco de beterraba, suco de beterraba + extrato de chá verde e suco de mirtilo experimentou uma diminuição menor sob condições de temperatura aceleradas ao longo de um período de 12 dias. A redução percentual observada na atividade antioxidante das misturas de suco de beterraba, suco de beterraba + extrato de chá verde e suco de mirtilo foi de apenas 12,6, 6,8 e 3,1%, respectivamente. A redução percentual observada na mistura de creme de algas e suco de cenoura foi maior (56,74%) quando comparado com os outros sucos, no entanto, quando se observa o teor de DHA das amostras na Figura 11 (a), no dia 9, um nível significativo de perda de DHA em virtude de oxidação não foi observado, o que mostra que os antioxidantes restantes no suco de cenoura ainda eram capazes de evitar a oxidação. Por outro lado, as amostras de controle que continham creme de algas e água ou água contendo 6% de sacarose demonstraram um elevado nível de perda de DHA em virtude de oxidação. Descobriu-se que a redução percentual no nível de DHA, conforme ilustrado na Figura 11 (b) no dia 9 nas amostras de controle com água, era de 92,60%. Este efeito pode ser devido ao fato de que o nível de antioxidantes naturais na pasta de algas apenas não pode estabilizar o DHA sob condições aceleradas e também realça o efeito protetor dos sucos sobre a estabilidade de DHA. Conforme apresentado na Figura 10 (b), a atividade antioxidante das amostras de controle contendo creme de algas e água ou água contendo sacarose diminuiu para 77,07 e 75,83%. Sucos de frutas mostram atividade antioxidante superior quando comparado com extrato de chá verde apenas em uma base de creme de algas (perda de 74,9%); no entanto, quando tanto extrato de chá verde quanto suco de beterraba foram adicionados ao creme de algas, a atividade antioxidante da mistura se mostrou mais estável (perda de 6,8%) ao longo de 12 dias.

EXEMPLO 16 CREME DE ALGAS E SUCOS DE FRUTAS CONTÊM ANTIOXIDANTES NATURAIS

[0173]S. limacinum foi inoculada em meio basal. Volumes iguais de cultura foram centrifugados e o meio foi decantado. Os pellets de algas resultantes foram homogeneizados com água em uma proporção de 1:1 e individualmente suspensos nas seguintes misturas em uma proporção de 1:1: (i) suco de cenoura; (ii) suco de beterraba; (iii) suco de mirtilo; (iv) água. Amostras de 1 g foram testadas quanto à atividade antioxidante usando o método de análise de DPPH (Sigma-Aldrich), em que a atividade de remoção de radicais é apresentada em percentagem. Estes resultados estão resumidos na Tabela 15. TABELA 15

[0174]O creme de algas creme demonstrou uma atividade de remoção de radicais de 44,12% e a adição de sucos aumentou a atividade antioxidante da formulação de creme de algas em até 95,62% no suco de beterraba. Suco de mirtilo e suco de cenoura aumentaram a atividade % de remoção de radicais para 93,60 e 54,54, respectivamente.

[0175]Embora diversas modalidades da invenção tenham sido descritas aqui, muitas adaptações e modificações podem ser feitas dentro do âmbito da invenção de acordo com o conhecimento geral comum daqueles versados na técnica. Tais modificações incluem a substituição de equivalentes conhecidos para qualquer aspecto da invenção de modo a conseguir o mesmo resultado substancialmente da mesma maneira. Faixas numéricas são inclusivas dos números que definem a faixa. No relatório descritivo, a palavra "compreende" é usada como um termo aberto, substancialmente equivalente à frase "incluindo, porém sem limitações" e a palavra "compreende" tem um significado correspondente. A citação de referências aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que tais referências são o estado da técnica da presente invenção. A invenção inclui todas as modalidades e variações substancialmente conforme descrito aqui antes e com referência aos exemplos e desenhos.

Referências

[0176]Restaino, L., Frampton, E.W., Hemphill, J.B. e Palnikar, R. (1995) "Efficacy of ozonated water against various food-related microorganisms", App. Environ. Microbiol. 61: 3471 - 3475.

[0177]Kelley, C.B. (1961) "Disinfection of sea water by ultraviolet radiation", American Journal of Public Health 51: 1670-1680.

[0178]H.P. Vasantha Rupasinghe e Li Juan Yu (2012) "Emerging preservation methods for fruit juices and beverages, Food Additive, Prof. Yehia El-Samragy (Ed.), ISBN: 978-953-51-0067-6, InTech, disponível em: http://www.intechopen.com/books/food-additive/emerging-preservation-methods-3- for-fruit-juices-and-beverages.

[0179]Shelef, G., Sukenik, A., Green, M., 1984. Microalgae Harvesting and Processing: A Literature Review. Subcontract Report, N° XK-3-03031-01. U.S. Department of Energy).

Claims

1. Método para produzir uma biomassa de algas ou cultura de células de algas, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de cultivar algas em um meio de cultura para obter a biomassa de algas ou cultura de células de algas, em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, e uma fonte de oxigênio; em que o suco é líquido aquoso expresso ou extraído da uma ou mais frutas ou vegetais ou quaisquer combinações de frutas e vegetais; em que o meio é esterilizado; em que o meio compreende nitrogênio, em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural; em que o nitrogênio natural é qualquer nitrogênio ou fonte de nitrogênio que ocorre naturalmente no, e está contido no, suco; em que o meio é livre de conservantes químicos, em que os conservantes químicos são ácido etilenodiaminotetracético; em que o meio não é suplementado com aditivos químicos, em que os aditivos químicos são uma ou mais substâncias que não são encontradas na natureza ou que são uma substância de ocorrência natural sintetizada ou extraída por processos químicos ou industriais e que é adicionada ao meio de algas como um suplemento, em que os aditivos químicos são extrato de levedura, amônio, nitrato, glutamato monossódico ou ureia; e em que a biomassa de algas ou a cultura de células de algas é formulada em um produto alimentício, cosmético, composição industrial ou composição farmacêutica para um ser humano ou um animal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de colheita da biomassa de algas ou cultura de células de algas a partir do meio.

3. Método para produzir pelo menos um composto lipídico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar alga compreendendo o pelo menos um lipídio em um meio de cultura; em que o meio compreende suco de uma ou mais frutas ou vegetais ou qualquer combinação de frutas e vegetais, e uma fonte de oxigênio; em que o suco é líquido aquoso expresso ou extraído da ou mais frutas ou vegetais ou quaisquer combinações de frutas e vegetais; em que o meio é esterilizado; em que o meio compreende nitrogênio, em que o nitrogênio no meio consiste em nitrogênio natural; em que o nitrogênio natural é: (i) qualquer nitrogênio ou fonte de nitrogênio que ocorre naturalmente no, e está contido no, suco; em que o meio é livre de conservantes químicos, em que os conservantes químicos são ácido etilenodiaminotetracético; em que o meio não é suplementado com aditivos químicos, em que os aditivos químicos são uma ou mais substâncias que não são encontradas na natureza ou que são uma substância de ocorrência natural sintetizada ou extraída por processos químicos ou industriais e que é adicionada ao meio de algas como um suplemento, em que os aditivos químicos são extrato de levedura, amônio, nitrato, glutamato monossódico ou ureia; e coletar o pelo menos um composto lipídico. em que o composto lipídico é formulado em um produto alimentício, cosmético, composição industrial ou composição farmacêutica para um ser humano ou um animal.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de colheita da alga a partir do meio e coleta do pelo menos um composto lipídico a partir da alga colheitada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de coleta do pelo menos um composto lipídico a partir da alga colheitada compreende extração do pelo menos um composto lipídico a partir da alga colheitada.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a biomassa de algas, cultura de células de algas ou o pelo menos um composto lipídico é formulado em um produto alimentício, cosmético ou composição farmacêutica para um humano ou animal.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o pelo menos um composto lipídico, biomassa de algas ou cultura de célula de algas é formulado em um produto alimentício.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto lipídico é um ácido graxo poli- insaturado selecionado a partir do grupo consistindo em ácido docosahexaenóico, ácido docosapentaenóico, ácido eicosapentaenóico e ácido pinolênico.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto lipídico é um carotenoide ou vitamina solúvel em gordura.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o carotenoide é betacaroteno.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio é suplementado com uma fonte de sal, açúcar, extrato de levedura ou qualquer combinação dos mesmos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte de sal é água do mar.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o açúcar é dextrose ou frutose.

14. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto alimentício é um suplemento nutricional.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a alga pertence a um gênero selecionado a partir do grupo consistindo em Thraustochytrium, Chlamydomonas, Nitzchia, Nannochloropsis e Aurantiochytrium.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o suco é selecionado a partir do grupo consistindo em suco de tomate, suco de beterraba, suco de cenoura, suco de maçã, suco de mirtilo, melaço de beterraba e suco de coco.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o suco é fermentado, pasteurizado, hidrolisado por invertase, ou qualquer combinação dos mesmos.