CN107208119A

CN107208119A - 用于富集具有dha并且具有arg和glu氨基酸的破囊壶菌属的微藻的生物质的方法

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Publication number: CN107208119A
Application number: CN201680007337.2A
Authority: CN
Inventors: 伯纳德·考利尔
Original assignee: Rogate Brothers
Current assignee: Rogate Brothers; Roquette Freres SA
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: JP2018508199A; WO2016120558A1; EP3250699B1; KR102534491B1; CA2974598C; AU2016211105B2; CN107208119B; CA2974598A1; AU2016211105A1; NZ733432A; JP6715252B2; FR3031984A1; KR20170105022A; EP3250699A1; FR3031984B1; LT3250699T; US20180002657A1; ES2718771T3

Abstract

本发明涉及一种用于富集具有DHA并且具有精氨酸和谷氨酸氨基酸的破囊壶菌属的微藻的生物质的方法，其特征在于，该方法包括旨在限制该微藻的生长速率，而同时维持发酵培养基中的氮源或连续地将氮源引入到发酵培养基内的步骤。

Description

用于富集具有DHA并且具有ARG和GLU氨基酸的破囊壶菌属的微藻的生物质的方法

本发明涉及一种用于富集具有二十二碳六烯酸(DHA)并且具有精氨酸和谷氨酸氨基酸的破囊壶菌属(Thraustochytrium)，更具体地是裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)或红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)的微藻的生物质的新颖发酵方法，并且还涉及一种用于生产从这种微藻生物质中提取的油的方法。

脂质的技术领域

脂质与蛋白质和碳水化合物一起构成了大量营养元素的三个主要家族。

在脂质中，甘油三酸酯和磷脂尤其突出：

-甘油三酸脂(也称为三酰甘油酯或三酸甘油酯或TAG)是这样的甘油酯，其中甘油的三个羟基被脂肪酸酯化。它们是植物油与动物脂肪的主要成分。

甘油三酸脂代表了被人类摄取的大约95％的饮食脂肪。在生物体内，它们主要存在于脂肪组织中并构成能量存储的主要形式。

-磷脂是两亲的脂质，也就是说，由极性的(亲水的)“头部”和两个脂肪族的(疏水的)“尾部”组成的脂质。

磷脂是结构性脂质，因为它们是细胞膜的成分，它们尤其为细胞膜提供流动性。

甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸组成，这些脂肪酸都是由饮食提供，并且对于它们中的一些，是由生物合成的。

生物化学分类(基于脂肪酸分子中包含的双键数量)区分饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)。

从生理学角度，区分为以下内容：

-必需脂肪酸，人体成长和正常运行所必需的，但我们身体不能够产生；

-“条件性”必需脂肪酸，其对于细胞正常生长和生理功能是必要的，但如果通过饮食提供的话，其可以从它们的前体中产生。因此，如果它们必需的前体不存在，它们是绝对必需的；

-非必需脂肪酸。

所有必需脂肪酸和“条件性”必需脂肪酸构成了必需脂肪酸。

其他脂肪酸称为非必需的。

非必需脂肪酸尤其包括：

-ω3脂肪酸家族的二十碳五烯酸(EPA)，

-油酸，我们饮食中的主要单不饱和脂肪酸，和棕榈油酸，

-饱和脂肪酸，例如月桂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。

更具体地说，多不饱和脂肪酸是根据第一双键的位置(从最终甲基官能开始)归类的。

因此，在命名中，对于ω“x”或“nx”，“x”对应于第一不饱和的位置。

区分必需脂肪酸的两个主要家族：ω6脂肪酸(或n-6PUFA)，其前体和主要代表是亚油酸(LA)，以及ω3脂肪酸(或n-3PUFA)，其前体是α-亚麻酸(ALA)。

生物学上感兴趣的大部分多不饱和脂肪酸属于ω6家族(花生四烯酸或ARA)或ω3家族(二十碳五烯酸或EPA，二十二碳六烯酸或DHA)。

此外，在命名中，构成链的碳的数目也被定义：从而EPA被描述为C20:5并且DHA被描述为C22:6。

因此“5”和“6”对应于碳链的不饱和数目，该碳链分别由EPA和DHA呈现。

ω3脂肪酸家族的DHA是生物知道如何从α-亚麻酸合成的或通过消耗富含油脂的鱼(金枪鱼、鲑鱼、鲱鱼等)提供的一种脂肪酸。

DHA在膜的结构中以及在脑和视网膜的发育和功能中发挥重要作用。

鱼油主要用作ω3脂肪酸例如DHA和EPA的来源，但ω3脂肪酸也发现于微藻油中，其中它们是作为混合物或分开地进行提取，如在这种情况下，例如这些油来源于某些选择的株系，例如裂殖壶菌属的那些，其仅包含痕量的EPA，但包含高DHA含量。

肽和氨基酸的技术领域

在许多领域中，肽和氨基酸被常规地开发为功能剂或食品补充剂。

在供给感兴趣的氨基酸的背景下，具有富含精氨酸和谷氨酸的可用肽来源事实上可能是有利的。

精氨酸是在动物界中具有许多功能的一种氨基酸。

精氨酸可被降解并且因此可充当用于吸收它的细胞的能量、碳以及氮的来源。

在不同的动物(包括哺乳动物)中，精氨酸被分解成鸟氨酸和尿素。后者是可以被消除(经由在尿液中排泄)以便调节存在于动物生物体细胞中的含氮化合物量的一种含氮分子。

精氨酸允许经由NO合成酶合成一氧化氮(NO)，从而参与动脉的血管舒张，这降低血管的硬度、增加血流量并且因此改善血管的功能。

含有精氨酸的食品补充剂被推荐用于促进心脏、血管功能的健康，用于预防“血小板聚集”(形成血凝块的风险)并且用于降低动脉压。

精氨酸在伤口愈合中的参与是与它在脯氨酸形成中的作用相关的，脯氨酸是胶原合成中的另一种重要的氨基酸。

最后，精氨酸是特别地由运动人士常用的能量饮料中的一种组分。

至于谷氨酸，它不仅是用于蛋白质合成的基本模块之一，而且是中枢神经系统(脑+脊柱)中最普遍的兴奋性神经递质，并且是γ-氨基丁酸能神经元中的一种GABA前体。

在代码E620下，谷氨酸用作食物中的一种增味剂。它被添加到食物制品中以便增强它们的味道。

除了谷氨酸，食品法典委员会(Codex Alimentarius)还将它的钠盐(E621)、钾盐(E622)、钙盐(E623)、铵盐(E624)以及镁盐(E625)公认为增味剂。

谷氨酸(或它的盐)经常存在于现成膳食(汤、调味汁、薯片以及现成菜肴)中。它还常用于亚洲烹饪。

它目前常用于结合开胃酒中的调味品(培根风味、乳酪风味)。这使得增强培根、乳酪等风味成为可能。很少发现一种不含任何风味的开胃酒。

它还在某些药物胶囊中被发现，但不是出于它的味道功能。

最后，它是烹饪助剂(浓缩固体汤料、沙司基料、调味汁等)的主要组分。

通过微藻的脂质、特别是脂肪酸的生产

常规地在发酵罐中培养裂殖壶菌属的微藻(异养条件：在黑暗中并且在碳源存在下)。

应注意，这些微藻的有益利用一般需要控制发酵条件。

因此，为了实现这一结果，已经大大发展了用于使得有可能获得高细胞密度(HCD)的发酵的第一方法，以便获得脂质的最大产量和生产率。

这些HCD培养的目标是在尽可能最短的时间段内，获得所需脂质的最高可能浓度。

然而，对于本领域专家而言，很快变得清楚的是，例如，当希望使微藻产生大的脂质储存时，有必要使这些微藻经历限制它们的生长的营养压力。

因此，在发酵方法中常规地分开了生长与生产。

例如，为了促进多不饱和脂肪酸(在这种情况下是二十二碳六烯酸或DHA)的累积，专利申请WO 01/54510推荐从多不饱和脂肪酸的生产解离细胞生长。

更具体地说，要求了一种用于生产微生物脂质的方法，该方法包括以下步骤，这些步骤包括：

(a)进行培养基的发酵，该培养基包括微生物、碳源和限制性营养源，并且确保足以维持在所述发酵培养基中至少大约4％的饱和的溶解氧含量的条件，以便增加生物质；

(b)然后提供足以维持在所述发酵培养基中大约小于或等于1％的饱和的溶解氧含量的条件，并且提供足以允许所述微生物产生所述脂质的条件；

(c)并且收集所述微生物脂质，其中至少大约15％的所述微生物脂质由多不饱和脂质组成；

并且其中在发酵过程中，获得至少大约100g/l的生物质密度。

在微藻裂殖壶菌属(株系ATCC 20888)中，因此更具体地说在碳源和氮源存在下，但是不限制氧的情况下进行第一生长阶段，以便促进产生高细胞密度，然后在第二阶段，停止氮的供应，并且逐渐减慢氧的供应(溶解氧压力或pO₂的管理从10％至4％，然后至0.5％)，以便胁迫微藻，减慢其生长并且触发感兴趣的脂肪酸的产生。

在微藻寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)中，以低葡萄糖浓度(约5g/l)并且因此以低生长速率来获得更高DHA含量(江(Jiang)和陈(Chen)，2000，生物化学工艺(Process Biochem.)，35(10)，1205-1209)。

因此，在产物形成与高细胞生长无关的情形中，传授了控制细胞生长速率是明智的。

总的来说，本领域技术人员选择通过控制发酵条件(温度、pH等)，或通过营养组分至发酵培养基的调节的进料(称为“分批补料”的半连续条件)，来控制微藻的生长。

如果他们选择在异养条件下通过碳源供应来控制微藻生长，那么本领域技术人员一般选择根据所产生的代谢物(例如，DHA型的多不饱和脂肪酸)来调整给予微藻(寇氏隐甲藻、纤细裸藻(Euglena gracilis)等)的碳源(纯葡萄糖、乙酸盐、乙醇等)。

温度还可以是关键参数。例如，已报道，在一些微藻物种中的多不饱和脂肪酸合成，例如极微小球藻(Chlorella minutissima)的EPA合成，在低于所述微藻的最佳生长所需温度的温度下被促进。

为了优化甘油三酸酯的生产，本领域技术人员还通过作用于发酵培养基的营养环境来优化朝向油产生的碳流。

因此，已知当存在碳的充足供应但是在氮缺乏的条件下时，油积累。

因此，此处C/N比率是决定因素，并且已接受最佳结果是在葡萄糖含量不是限制因素时通过直接作用于氮含量来获得。

因此，为了优化油生产，对于本领域技术人员至关重要的是通过移动它朝向不利于蛋白质生产的油生产，来控制碳流；当将微藻放置在氮缺乏培养基中时，碳流被再分配并且积累为脂质储存物质。

通过微藻生产蛋白质

如以上详细地解释的，为了优化甘油三酸酯的生产，本领域技术人员通过作用于发酵培养基的营养环境来优化朝向油生产的碳流。

在小球藻类型的微藻中进行的研究中，已经注意到氮缺乏影响细胞生长，从而导致与微藻的正常生长速率相比生长速率减少了30％(Xiong等人，植物生理学(PlantPhysiology)，2010，154，第1001-1011页)。

为了解释这个结果，事实上熊等人在上文所提到的文章中证实如果将小球藻生物质分为5种主要组分，特别是碳水化合物、脂质、蛋白质、DNA和RNA(占其固体的85％)，那么C/N比率对DNA、RNA或碳水化合物含量无影响，但是对蛋白质和脂质含量变得最重要。

因此，以低C/N比率培养的小球藻细胞含有25.8％的蛋白质和25.23％的脂质，而高C/N比率使得合成53.8％的脂质和10.5％的蛋白质成为可能。

因此，为了优化蛋白质生产，对于本领域技术人员至关重要的是通过移动它朝向不利于脂质生产的蛋白质生产，来控制碳流；当将微藻放置在没有氮缺乏的培养基中时，碳流被再分配并且积累为蛋白质储存物质。

根据这个传授内容，为了产生富含蛋白质并且因此富含构成它们的氨基酸的生物质，本领域技术人员因此导致相反通过促进低C/N比率来使发酵条件工作，并且因此：

-供应大量的氮源至发酵培养基，同时保持将转化为蛋白质的碳源进料恒定，并且

-刺激微藻生长。

发明内容

本发明涉及一种用于生产破囊壶菌属的微藻的生物质的方法，其中该脂质部分富含DHA，并且其中相对于总氨基酸，精氨酸和谷氨酸氨基酸的含量是高的。

该方法基于该微藻的生长速率的控制，施加该控制以将其减少至其最小值，而同时维持发酵培养基中的氮源或连续地将氮源引入到发酵培养基内。

该结果可以例如通过减少或耗尽该发酵培养基中的微量元素或通过限制O₂转移来获得。

在根据本发明的方法的一个优先的实施例中，因此选择通过限制氧供应来限制微藻的生长速率。

为了本发明的目的，通过在微藻的实际生长速率(μ)相对于其最佳生长速率(μ_最大)之间的比率来评估生长速率的限制，其中“μ”是每g生物质并且每小时(也就是说(h^-1))所形成的生物质的以g表示的生长速度。

更具体地说，本发明的方法是一种用于富集具有DHA并且具有精氨酸和谷氨酸氨基酸的破囊壶菌属的微藻的生物质的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，该步骤包括一旦这些微藻的生长速率的比率μ/μ_最大的值变成小于0.2，就维持发酵培养基中的氮源或将氮源加入到发酵培养基内。

优选地，该微藻属于裂殖壶菌属或是红树林裂殖壶菌。

更确切地说，该微藻可以是选自株系CNCM I-4469和CNCM I-4702的株系，其分别在2011年4月14日和2012年11月22日存放在巴斯德研究所的法国微生物培养物国家保藏中心(French National Collection of Microorganism Cultures)。

任选地，该方法还可以包括收获生物质，任选地从这种生物质制备细胞提取物或裂解物，然后任选地提取富含DHA并且富含精氨酸和谷氨酸氨基酸的粗制油。

根据本发明所述的方法的特征可以在于获得的生物质包含：

-按总脂肪酸的重量计至少45％的DHA；以及

-相对于总氨基酸，按重量计至少10％的精氨酸和至少25％的谷氨酸，优选地相对于总氨基酸，按重量计至少15％的精氨酸和至少40％的谷氨酸。

发明的详细说明

在本发明背景下，申请人公司已经选择通过提出进行发酵的新颖的方式来探索用于优化DHA和精氨酸和谷氨酸氨基酸的生产的原路径。

因此，申请人公司已经发现，这违背了关于该主题的技术预想，可能的是通过发酵生产微藻生物质：

-富含脂质(按生物质的干重量计超过25％、优选地至少30％)，其中主要脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)，并且

-富含精氨酸和谷氨酸氨基酸(按总氨基酸的重量计超过35％、优选地至少55％)，

如现有技术中描述的，其中不必要的是使C/N比率(消耗的碳与消耗的氮，摩尔/摩尔)最大化。

因此，申请人公司已经发现，可能的是甚至当生长速率μ/μ_最大小于0.2时，通过贯穿该发酵维持(其对于脂质生产不是常规的)氮进料，改变通过发酵生产的生物质的脂质和氨基酸组成。

确实，申请人公司已经理解，当μ/μ_最大比率变成小于0.2时，遵循除了含氮或碳基底物之外的营养底物的限制，可能的是使代谢产物移动朝向精氨酸和谷氨酸氨基酸的生产，而同时保留了相当大的DHA生产。

在一个实施例中，使得有可能减少生长速度的限制可以是氧供应(OTR，氧转移率)的限制。

特别地，在该发酵阶段的OTR优选地是从30mmol/l/h至35mmol/l/h。

该生长限制还可以通过耗尽微量元素或矿物质(优选地选自磷酸盐、镁或钾)来诱发。

更具体地说，申请人公司已经发现，必要的是优先地以氨水形式(例如用于pH调节中)供应氮，或者必要的是维持氮供应，直到培养结束，前提是μ小于μ_最大的20％。

在一个优选的实施例中，通过调节pH来加入初始氮供应，因此通过调节pH的初始氮供应补偿消耗的氮。这使得有可能在培养结束时获得小于20、例如在10与15之间、并且优选地大约15的C/N比率(消耗的碳与消耗的氮，摩尔/摩尔)。

待用于本发明的方法的株系属于破囊壶菌属，更具体地说是红树林裂殖壶菌或裂殖壶菌属。这类株系是本领域技术人员所已知的。

在其研究过程中，申请人公司已经鉴定了产生DHA的极感兴趣的若干微藻株系。申请人公司尤其对已经鉴定的两种株系相当特别感兴趣。

第一种株系是裂殖壶菌属的株系，在2011年4月14日在法国存放在巴斯德研究所的法国微生物培养物国家保藏中心(CNCM)(法国多科特路科斯(Docteur Roux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex 15)中编号I-4469下，并且还在中国存放在中国武汉(430072)的武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION，CCTCC)中编号M 209118下。这种株系主要产生DHA并且在较低程度上产生棕榈酸和棕榈油酸。它由编码18S RNA的基因的部分测序来表征(SEQ ID No 1)：

这使得有可能将其鉴定为裂殖壶菌属类型的株系。在本申请中这种株系随后将被表示为“CNCM I-4469”。

此外，第二种株系是红树林裂殖壶菌的株系。它产生相对相等比例的DHA和棕榈酸。它由申请人公司在2012年11月22日在法国存放在巴斯德研究所的法国微生物培养物国家保藏中心(CNCM)(多科特路科斯(Docteur Roux)25街，75724巴黎(PARIS)Cedex 15)中编号CNCM I-4702下。它由编码18S rRNA的基因的测列来表征(SEQ ID No 2)：

这使得有可能将其鉴定为红树林裂殖壶菌类型的株系。在本申请中这种株系随后将被表示为“CNCM I-4702”。

此外，在异养培养条件下进行根据本发明所述的发酵方法。适用于考虑的微藻而且也适用于培养基的这些条件是本领域技术人员熟知的。

微藻生长必需的碳源优选是葡萄糖。

优选地，葡萄糖供应是使得将在该发酵期间的葡萄糖浓度维持在20g/l或更多的浓度下。在发酵结束时，该葡萄糖浓度是至少5g/l。

氮源可以是酵母提取物、尿素、谷氨酸钠、硫酸铵、经pH调节的氨水，单独地或组合地使用。

总的来讲，培养步骤包括预培养步骤(为了使株系复苏)，然后是适当的培养或发酵步骤。后一步骤对应于感兴趣的脂质，特别是DHA的生产步骤。

优选地，将该发酵期间的pH在5与7之间(优选地大约6)的pH下调节。

优选地，该发酵期间的温度是26℃-30℃，优选地大约28℃。

发酵时间优选地是至少50小时、优选地在65小时与90小时之间、甚至更优选地在70小时与85小时之间。

根据本发明的发酵方法使得有可能获得(或以这样一种方式进行以便获得)包含按总脂肪酸的重量计至少45％的DHA的生物质。此外，该方法保证了相对于该生物质按重量计至少25％的脂质含量。因此，该生物质确实富含DHA。

此外，根据本发明的发酵方法使得有可能获得(或以这样一种方式进行以便获得)包含相对于该生物质按重量计至少40％的蛋白质生物质。此外，相对于总氨基酸，谷氨酸的比例是至少25％。精氨酸比例是至少10％。

对于CNCM I-4702株系，用根据本发明的发酵方法获得的结果是包含按总脂肪酸的重量计大约47％的DHA的生物质，该生物质具有相对于该生物质按重量计大约35％的脂质含量、以及大约53％的蛋白质，该蛋白质具有大约40％的谷氨酸与大约16％的精氨酸的比例。

对于CNCM I-4469株系，用根据本发明的发酵方法获得的结果是包含按总脂肪酸的重量计大约52％的DHA的生物质，该生物质具有相对于该生物质按重量计大约26％的脂质含量、以及大约43％的蛋白质，该蛋白质具有大约26％的谷氨酸与大约10％的精氨酸的比例。

当提及重量百分比时，应理解为是按干重量计。

除了生物质，本发明还涉及从这种生物质制备的细胞提取物或裂解物。特别地，这种提取物或裂解物是从发酵后回收的生物质制备的。这种提取物或裂解物富含DHA并且富含精氨酸和谷氨酸氨基酸。

可以以不同方式(包括机械的、化学的和酶的方式)将细胞破裂，以提取脂质内容物。

随后可以从细胞裂解物中提取油。

因此，用于生产感兴趣的脂质(优选是DHA，以及精氨酸和谷氨酸氨基酸)的方法包括根据本发明所述的发酵方法，收获生物质，制备细胞提取物或裂解物，并且提取粗制油，该粗制油包括感兴趣的脂质，优选是DHA以及任选地精氨酸和谷氨酸氨基酸。

术语“大约”旨在意指+或-10％的所述值、优选+或-5％的所述值的值。

从以下实例将更清楚地理解本发明，所述实例旨在是说明性的，并且是非限制性的。

实例

实例1：用于培养CNCM I-4702株系的条件

该方案包括在对于红树林裂殖壶菌CNCM I-4702株系的0.1g/l生物质下，预培养用于发酵罐的接种。

预培养

在28℃下，在500ml带挡板的锥形瓶中，预培养(100ml的培养基)持续24h。

该培养基的所有组分通过过滤灭菌。

表I

培养

分三份将培养基灭菌。

刚好在T₀之前，将葡萄糖与KH₂PO₄一起加入灭菌。

在发酵罐中，将剩余的盐与0.75ml/l的Clearol FBA 3107一起灭菌。通过过滤将微量元素和维生素灭菌。

T₀时的体积代表75％的最终体积。在T₀时使用氨水调节pH，然后仍用氨水调节为6。

表II

从T₀以恒定速率(待根据计算调节)开始连续供应葡萄糖(浓度：500g/l)的分批补料，以便浓度不低于20g/l。最后，在停止发酵时，葡萄糖将被耗尽而不下降低于5g/l。

该培养在28℃下进行并且持续从70小时至85小时，具有20mmol至30mmol的O₂/l/h的固定且恒定的OTR(氧吸收速率)。

母液

实施两种发酵条件：

-作为对照：“标准”条件，其中使C/N比率(消耗的碳与消耗的氮)最大化，以便通过中断氮供应而不是碳基底物的供应基本上产生脂质，这没有限制O₂。因此这些条件是氮缺乏的。

当一种或多种盐被耗尽时，氮供应的抑制发生。那么实际生长是不可能的或非常有限的：细胞增殖速率下降有利于存在的细胞的脂质富集。细胞的整体质量增加，但是细胞数目变化很小，因为生长速率下降。

-根据本发明：使得有可能通过以下方式生产富含DHA的脂质与富含精氨酸和谷氨酸的氨基酸的条件：通过限制O₂转移限制生长速度，使得μ迅速地下降至μ/μ_最大<0.2，而同时维持供应葡萄糖和氮，优先地通过用氨水调节pH。

图1呈现了作为培养结束时计算的C/N的函数的氨基酸之中精氨酸与谷氨酸的比例的变化。

看起来该方法促进精氨酸和谷氨酸氨基酸的产生，前提是C/N比小于15(#μ/μ_最大<0.2)。

下表III反映了对于CNCM I-4702株系，根据“常规”操作条件以及根据本发明的操作条件生产的生物质的脂肪酸和氨基酸组成。

表III

相对于这些氨基酸的总和的谷氨酸比例乘以3.75，并且相对于这些氨基酸的总和的精氨酸比例乘以2.75。

该脂质组合物减少，但这些脂肪酸的DHA含量几乎乘以2。

实例2：用于培养CNCM I-4469株系的条件

用于培养这种微藻的条件与实例1的条件相同(除了在预培养中选择的接种物的水平是约5g/l的裂殖壶菌属之外)。

根据“常规地”和根据本发明实施的两种培养条件。

下表IV反映了根据“常规”操作条件以及根据本发明的操作条件生产的生物质的脂肪酸和氨基酸组成。

表IV

对于该裂殖壶菌属株系，效果相同但较小。此外，还注意到这些氨基酸中的脯氨酸的比例增加了75％。

精氨酸和谷氨酸氨基酸含量分别增加了60％和75％，而蛋白质含量加倍。

脂肪酸的DHA含量增加了23％。

序列表

<110> 罗盖特兄弟公司

<120> 用于富集具有DHA并且具有ARG和GLU氨基酸的破囊壶菌属的微藻的生物质的方法

<130> B1954PC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 479

<212> DNA

<213> Schizochytrium sp

<400> 1

gagggtttta cattgctctc attccaatag caagacgcga agcgccccgc attgatattt 60

ctcgtcacta cctcgtggag tccacattgg gtaatttacg cgcctgctgc cttccttgga 120

tgtggtagcc gtctctcagg ctccctctcc ggagtcgagc cctaactccc cgtcacccgt 180

tatagtcacc gtaggccaat accctaccgt cgacaactga tggggcagaa actcaaacga 240

ttcatcgctc cgaaaagcga tctgctcaat tatcatgact caccaagaga gttggcttag 300

acctaataag tgcggccctc cccgaaagtc gggcccgtac agcacgtatt aattccagaa 360

ttactgcagg tatccgtata aaggaactac cgaagggatt ataactgata taatgagccg 420

ttcgcagttt cacagtataa ttcgcttata cttacacatg catggcttag tctttgaga 479

<210> 2

<211> 454

<212> DNA

<213> Schizochytrium mangrovei

<400> 2

ggttttacat tgctctcatt ccgatagcaa aacgcataca cgcttcgcat cgatatttct 60

cgtcctacct cgtggagtcc acagtgggta atttacgcgc ctgctgctat ccttggatat 120

ggtagccgtc tctcaggctc cctctccgga gtcgagccct aactctccgt cacccgttat 180

agtcaccgta gtccaataca ctaccgtcga caactgatgg ggcagaaact caaacgattc 240

atcgaccaaa awagtcaatc tgctcaatta tcatgattca ccaataaaat cggcttcaat 300

ctaataagtg cagccccata cagggctctt acagcatgta ttatttccag aattactgca 360

ggtatccata taaaagaaac taccgaagaa attattactg atataatgag ccgttcgcag 420

tctcacagta caatcgctta tacttacaca gcag 454

Claims

1.一种用于富集具有二十二碳六烯酸(DHA)并且具有精氨酸和谷氨酸氨基酸的破囊壶菌(Thraustochytrium)属的微藻的生物质的方法，其特征在于，该方法包括旨在限制该微藻的生长速率，而同时只要该微藻的生长速率的比率μ/μ_最大的值变成小于0.2，维持发酵培养基中的氮源或连续地将氮源引入到发酵培养基内的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该微藻属于裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)属或红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)属。

3.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，该微藻是选自株系CNCM I-4469和CNCM I-4702的株系，这些株系分别在2011年4月14日和2012年11月22日存放在巴斯德研究所的法国微生物培养物国家保藏中心。

4.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过减少或耗尽该发酵培养基中的微量元素或通过限制O₂转移、优选地通过限制O₂转移获得该微藻的生长速率的限制。

5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括收获该生物质，任选地从这种生物质制备细胞提取物或裂解物，然后任选地提取富含DHA的粗制油。

6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，获得的生物质包含按总脂肪酸的重量计至少45％的DHA。

7.如以上权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，获得的生物质包含按生物质的重量计以N.6.25表示的至少40％的蛋白质(g/g)，该蛋白质包括相对于总氨基酸按重量计至少10％的精氨酸和至少25％的谷氨酸。