CN114410478B - 一种利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，通过在发酵过程中使用载氧剂，提高菌体对氧气的利用效率，使人工培养的中国被毛孢菌体得率、虫草素、腺苷等物质的产量更高，同时减少发酵成本，减少废水废气的排放。上述的载氧剂包括：正十二烷、正十六烷、全氟十氢萘、橄榄油等物质，具有、用量少、方便获取、可回收重复利用、菌体不吸收利用等优点。最终菌体得率为最高可达30.7％，腺苷产量为2.92mg/g，比耗氧速率(QO2)、摄氧率(R)均有明显的提高，空气氧临界浓度下降明显、耗电量明显减少，大幅降低了水电的使用，发酵周期更短，效率更高，提高了发酵法生产中国被毛孢的产品竞争力。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种中国被毛孢的发酵培养方法，是一种中国被毛孢高效氧传递的液态发酵的方法，本方法利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率。
背景技术
中药冬虫夏草为真菌界(Fungi)麦角菌科(Clvaieipiacteae)冬虫夏草属(Cordyceps)的冬虫夏草菌(C.sinensis(Berk.)Sacc.)，多见于山地阴坡及半阴坡的高原草甸和高寒灌丛植被中，尤其多见于积雪、排水性良好的高寒草甸，主要分布在我国的西藏、青海、甘肃、四川、云南等地。冬虫夏草由于其特殊的生长方式和独特的生长环境以及其重要的药用价值，成为了我国的一种稀有的名贵中药材。近年来，经研究发现，人工发酵冬虫夏草无性型得到的菌丝体与天然冬虫夏草化学组成及药理学作用基本一致，可用来代替天然冬虫夏草生产虫草制品，弥补自然资源的短缺。
考虑到天然冬虫夏草的稀缺性与高昂的价格，人工发酵获得冬虫夏草具有更高的性价比，但传统的人工冬虫夏草发酵方法常使用机械搅拌式发酵罐与气升式发酵罐，当设备高功率运转时，一般可以满足中国被毛孢发酵过程所需的溶氧需求，但由于中国被毛孢发酵的特殊性，即要保证菌丝体的完整性的同时，还需要保证菌体发酵所需的氧气供应，机械搅拌式发酵罐常常无法同时满足这两个条件，当转速过高时，高速旋转带来的机械剪切力不可避免的导致菌丝体大量损伤，转速不够又会导致溶氧不足，单纯的提高通气量容易导致大量起泡，罐压增大；气升式发酵罐与机械搅拌式发酵罐情况不同，当通风量较大时，不容易损伤菌丝体，但极易使得菌丝体“抱团”，导致后续分离提取困难，菌体得率降低，产品质量下降。因此迫切需要优化中国被毛孢的发酵供氧方案，使得发酵得以更加高效有序的进行，达到提高产品质量与产量，节约发酵成本等目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种中国被毛孢高效氧传递的液态发酵培养方法，旨在解决传统中国被毛孢发酵时氧传质效率与产品质量不可兼得的问题，提供一种高效有序的，产品质量高的利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
一种利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，包括以下步骤：
1)将固体培养基上的中国被毛孢菌丝体接入一级种子摇瓶，160rpm，20℃培养24-28h；也可根据振荡培养箱振荡幅度、摇瓶挡板大小适当调整转速与培养时间；
2)将步骤1)获得的一级种子液全部接入种子罐中进行种子液培养，20℃培养16-22h，获得二级种子液。
3)将步骤2)中获得的二级种子液接入发酵罐内，18-22℃发酵培养48-52h，同时在发酵中后期开始流加载氧剂，流加至发酵结束。优选发酵培养20℃。
上述一级种子摇瓶培养体积要远小于二级种子罐培养体积(体积比为3-5％)，此时将一级种子液全部接入二级种子罐后菌体可以迅速进入对数生长期，加快种子培养的速度，减少成本。培养温度不得低于一级种子的培养温度，但不宜超过22℃。
载氧剂添加时间与流加速度需要根据菌体长势而定，通常是成正比的，并且根据菌体长势确定是否继续进行发酵，若菌体长势停止，菌体量稳定，则终止发酵。
作为优化，其添加方式为在发酵中后期(16-52h)流加进入发酵罐，且随着菌体量的增加，逐步提高流加速度；所述的载氧剂添加时间按照溶氧电极检测溶氧确定(溶氧小于30％)或根据发酵时间16-18h进行流加，不同载氧剂流加速率按照流加总量除以流加时间确定。
作为优化，所述的一级种子摇瓶培养基为：葡萄糖2％、奶粉0.5％、大米粉1％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.2％、甜菜碱0.1％、氯化胆碱0.1％，消泡剂0.04％，调节pH值6.2。
作为优化，所述的种子罐培养基为：葡萄糖2％、奶粉0.5％、大米粉1％、麸皮1.4％、酵母粉0.3％、磷酸二氢钾0.4％、七水硫酸镁0.2％、甜菜碱0.1％、氯化胆碱0.1％、钴胺素0.0025％，消泡剂0.03％，调节pH值6.2。
作为优化，所述的发酵培养基为：葡萄糖1.5％、小米粉1.2％、蛋白胨0.2％、麸皮1.2％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.03％、甜菜碱0.1％、氯化胆碱0.1％、钴胺素0.002％，调节pH值6.2，这里的消泡剂添加量需要根据发酵实际情况而定。
载氧剂本质为高级烷烃或者脂类，本身有一定的消泡效果。
作为优化，种子液接种量为20％，在发酵培养基中的初糖耗尽后，流加80％的葡萄糖溶液使发酵过程中发酵液内葡萄糖浓度维持在0.3-1％，使用SBA生物传感仪检测罐内葡萄糖浓度。
优选的，所述的载氧剂包括：正十二烷、正十六烷、全氟十氢萘、橄榄油中的一种或多种，当然还可以使用其他的氧气载体。
作为优化，所述的正十二烷添加量为10-20％，优选为15％；所述的正十六烷添加量为10-30％，优选的为20％；所述的全氟十氢萘添加量为10-30％，优选的为20％；所述的橄榄油添加量为5-15％，优选的为10％。
特别说明，所述的培养基均已经经过灭菌处理(121℃，20min)，本发明所述的“％”除特殊说明外，均为质量百分含量。
与现有技术比较本发明的有益效果：
1、载氧剂的使用大幅降低了溶氧对生物反应设备的依赖性，减少了设备的能量损耗，降低了工业成本。
2、减少了废水废气的排放，氧传递效率变高时，对无菌空气的要求量降低，尾气排放变少；设备发热减轻，节约了冷却用水。
3、传统发酵时常需要通入氢气减轻发酵液溶氧对菌体细胞的过度氧化，减少超氧过氧自由基对菌体的损伤，减缓菌体衰老，载氧剂使得发酵液中游离的氧气变少，抑制了上述情况的发生，因此节约了氢气的使用。
4、缩短了发酵周期，间接提高了设备利用率，提高了发酵效率。
5、提高了产品质量，使用载氧剂使得菌体得率与腺苷含量得到较为明显的提升。
6、所采用的载氧剂在发酵体系中无法溶解，可以均匀的将菌体包裹，起到氧气传递作用的同时起到润滑作用，保护菌丝体不受到机械搅拌导致的损伤。
7、本发明筛选得到的载氧剂都是与发酵体系不相容的物质，可回收利用，极大的降低了成本，同时本发明涉及的载氧剂对菌体均无毒副作用，具有发酵环境有益性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
以下实施例采用的中国被毛孢菌株为冬虫夏草(Cordyceps sinensis)，已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.20759；该菌种为公司自有菌种。
实施例1
本部分实施例旨在说明本发明中中国被毛孢的发酵工艺流程。
首先进行种子摇瓶培养获得一级种子液。具体为：将固体培养基上的中国被毛孢菌丝体使用接种环、刀片等工具划下，在无菌环境下接入一级种子摇瓶进行摇床振荡培养，摇床转速为160rpm，培养温度为20℃，培养时间为24-28h，最终获得一级种子液。
接着进行种子罐培养获得二级种子液。具体为：将一级种子液全部接入种子罐中进行种子液培养，20℃培养16-22h，获得二级种子液。一级种子摇瓶培养体积要远小于二级种子罐培养体积(体积比为3-5％)，此时将一级种子液全部接入二级种子罐后菌体可以迅速进入对数生长期，加快种子培养的速度，减少成本。培养温度不得低于一级种子的培养温度，但不宜超过22℃。
最后进行发酵罐发酵培养，将二级种子液接入发酵罐内，接种量为20％(体积比)。发酵温度以20℃为宜，发酵培养48-52h根据菌体实际长势确定是否继续进行发酵，若菌体长势停止，菌体量稳定，则终止发酵，发酵期间(16-52h)流加载氧剂，载氧剂添加时间按照溶氧电极检测溶氧确定(溶氧小于30％)或根据发酵时间16-18h进行流加，不同载氧剂流加速率按照流加总量除以流加时间确定。
发酵结束后可通过静置、分液漏斗、离心等手段达到回收利用载氧剂的效果。
上述步骤中所述的一级种子摇瓶培养基为：葡萄糖2％、奶粉0.5％、大米粉1％、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.2％、甜菜碱0.1％、氯化胆碱0.1％，消泡剂0.04％，调节pH值6.2。
所述的种子罐培养基为：葡萄糖2％、奶粉0.5％、大米粉1％、麸皮1.4％、酵母粉0.3％、磷酸二氢钾0.4％、七水硫酸镁0.2％、甜菜碱0.1％、氯化胆碱0.1％、钴胺素0.0025％，消泡剂0.03％，调节pH值6.2。
所述的发酵培养基为：葡萄糖1.5％、小米粉1.2％、蛋白胨0.2％、麸皮1.2％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.03％、甜菜碱0.1％、氯化胆碱0.1％、钴胺素0.002％，调节pH值6.2。
种子液接种量为15-20％，在发酵培养基中的初糖耗尽后，流加80％的葡萄糖溶液使发酵过程中发酵液内葡萄糖浓度维持在0.3-1％，使用SBA生物传感仪检测罐内葡萄糖浓度。
实施例2
本部分实施例旨在说明在不添加任何载氧剂时中国被毛孢的发酵情况。
特别的是指使用实施例1中的发酵操作方法，摇瓶培养基、种子罐培养基与发酵培养基均同实施例1，发酵温度为20℃，接种量为20％，罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5％。不同的是，不添加任何载氧剂。
以发酵周期、菌体得率、腺苷含量、比耗氧速率(QO2)、摄氧率(R)、空气氧临界浓度、耗电量为指标，结果如表1所示：
特别说明，以上所提及的指标概念如下：
比耗氧速率(呼吸强度)(QO2)：是指单位重量的干菌体每小时消耗的氧量，单位为mmol(O2)/[g(干菌体)h]。
摄氧率(R)：单位时间内单位体积培养液中微生物摄取氧的量，记作rO2(mmol/L.h)，特别的，R＝QO2*X，X:菌体干重，单位g/L。
空气氧临界浓度(C临界(％))：在微生物发酵过程中，当溶解氧浓度较低时，呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加，当溶解氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增加而变化，此时的溶解氧浓度称为呼吸临界氧浓度(Respiratory critical oxygenconcentration)。但在微生物发酵时如果认定矫正溶氧100％点时，为饱和空气浓度，那么又会衍生出空气氧临界浓度，即以发酵液中空气氧溶解量对应上述概念，常以％表示。
耗电量：指进行一次发酵所使用的电量，由于设备老化程度与运营方式不同，设备规模与型号不同，因此并没有一个准确的初度衡量，因此本研究将将未使用载氧剂的试验批次耗电量设为1(实际耗电41KW.h)，作为对照组使用。
表1未添加载氧剂时中国被毛孢的发酵结果
实施例3
本部分实施例旨在说明在添加正十二烷作为载氧剂时中国被毛孢的发酵情况。
特别的是指使用实施例1中的发酵操作方法，摇瓶培养基、种子罐培养基与发酵培养基均同实施例1，发酵温度为20℃，接种量为20％，罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5％。不同的是，在发酵中期(16h)开始流加正十二烷，流加至发酵结束。
以发酵周期、菌体得率、腺苷含量、比耗氧速率(QO2)、摄氧率(R)、空气氧临界浓度、耗电量、载氧剂回收率、载氧剂循环次数为指标，结果如表2所示：
特别说明，载氧剂回收率是指载氧剂回收的量，由于载氧剂与发酵体系互不相溶，因此可以回收循环使用。载氧剂循环次数是指载氧剂可以回收再利用的次数，牵扯到发酵的成本。
表2正十二烷作载氧剂对中国被毛孢发酵的影响
由表可知，正十二烷的添加一定程度上提高了菌体得率与腺苷含量，大幅度提高了比耗氧速率与摄氧率，降低了空气氧临界浓度，降低了耗电量，回收率与循环次数也使其在工业上应用有了可行性，综合分析可知，占发酵料液15％的添加量为最适添加量。
实施例4
本部分实施例旨在说明在添加正十六烷作为载氧剂时中国被毛孢的发酵情况。
特别的是指使用实施例1中的发酵操作方法，摇瓶培养基、种子罐培养基与发酵培养基均同实施例1，发酵温度为20℃，接种量为20％，罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5％。不同的是，在发酵中期(16h)开始流加正十六烷，流加至发酵结束。
以发酵周期、菌体得率、腺苷含量、比耗氧速率(QO2)、摄氧率(R)、空气氧临界浓度、耗电量、载氧剂回收率、载氧剂循环次数为指标，结果如表3所示：
表3正十六烷作载氧剂对中国被毛孢发酵的影响
由表可知，正十六烷的添加对发酵的影响与正十二烷类似，但在对比耗氧速率与摄氧率的提升上更有优势，可循数按次数达到了5次，回收率也略高于正十二烷，但是添加量比正十二烷多。
实施例5
本部分实施例旨在说明在添加全氟十氢萘作为载氧剂时中国被毛孢的发酵情况。
特别的是指使用实施例1中的发酵操作方法，摇瓶培养基、种子罐培养基与发酵培养基均同实施例1，发酵温度为20℃，接种量为20％，罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5％。不同的是在发酵中期(16h)开始流加全氟十氢萘，流加至发酵结束。
以发酵周期、菌体得率、腺苷含量、比耗氧速率(QO2)、摄氧率(R)、空气氧临界浓度、耗电量、载氧剂回收率、载氧剂循环次数为指标，结果如表4所示：
表4全氟十氢萘作载氧剂对中国被毛孢发酵的影响
由表可知，全氟十氢萘的添加使得菌体得率、比耗氧速率与摄氧率大幅度提高，空气临界氧浓度大幅度下降，耗电量下降明显，极大的提高了发酵效率。但全氟十氢萘的回收率较低，相对来讲循环次数较少，而且价格高昂，综合分析占发酵料液20％的添加量最为合理。
实施例6
本部分实施例旨在说明在添加橄榄油作为载氧剂时中国被毛孢的发酵情况。
特别的是指使用实施例1中的发酵操作方法，摇瓶培养基、种子罐培养基与发酵培养基均同实施例1，发酵温度为20℃，接种量为20％，罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5％。不同的是，在发酵中期(16h)开始流加橄榄油，流加至发酵结束。
以发酵周期、菌体得率、腺苷含量、比耗氧速率(QO2)、摄氧率(R)、空气氧临界浓度、耗电量、载氧剂回收率、载氧剂循环次数为指标，结果如表4所示：
表4橄榄油作载氧剂对中国被毛孢发酵的影响
由表可知，橄榄油的添加使得菌体得率、比耗氧速率与摄氧率均有少量提升，空气临界氧浓度下降明显，优点是价格便宜，方便获取。
综合来讲，本发明提供的载氧剂均可以对发酵做出积极影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，其特征在于包括以下步骤：1）将固体培养基上的中国被毛孢菌丝体接入一级种子摇瓶，160rpm，20℃培养24-28 h；2）将步骤1）获得的一级种子液全部接入种子罐中进行种子液培养，20℃培养16-22 h，获得二级种子液；3）将步骤2）中获得的二级种子液接入发酵罐内，18-22℃发酵培养48-52 h，同时在发酵中后期开始流加载氧剂，流加至发酵结束；所述的载氧剂为正十二烷、正十六烷、全氟十氢萘或橄榄油中的一种，所述的正十二烷添加量为10-20%，正十六烷添加量为10-30%，全氟十氢萘添加量为10-30%，橄榄油添加量为5-15%；所述的发酵中后期为发酵16-52 h；在发酵培养基中的初糖耗尽后，流加80%的葡萄糖溶液使发酵过程中发酵液内葡萄糖浓度维持在0.3-1%。
2.根据权利要求1所述的利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，其特征在于，所述的正十二烷添加量为15%；所述的正十六烷添加量为20%；所述的全氟十氢萘添加量为20%；所述的橄榄油添加量为10%。
3.根据权利要求1所述的利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，其特征在于，二级种子液接种量为20%。
4.根据权利要求1所述的利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，其特征在于，所述的一级种子摇瓶培养基为：葡萄糖2％、奶粉0.5％、大米粉1%、麸皮1.5％、磷酸二氢钾0.3％、七水硫酸镁0.2％、甜菜碱0.1%、氯化胆碱0.1%，消泡剂0.04％，调节pH值6.2。
5.根据权利要求1所述的利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，其特征在于，所述的种子罐培养基为：葡萄糖2％、奶粉0.5％、大米粉1%、麸皮1.4％、酵母粉0.3%、磷酸二氢钾 0.4％、七水硫酸镁0.2％、甜菜碱0.1%、氯化胆碱0.1%、钴胺素0.0025%，消泡剂0.03％，调节pH值6.2。
6.根据权利要求1所述的利用载氧剂提高中国被毛孢发酵效率的方法，其特征在于，发酵培养基为：葡萄糖1.5％、小米粉1.2％、蛋白胨0.2％、麸皮1.2％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁0.3％、消泡剂0.03％、甜菜碱0.1%、氯化胆碱0.1%、钴胺素0.002%，调节pH值6.2。
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