CN101313073B - 发酵产生有机化合物 - Google Patents
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Abstract
发酵产生至少一种有机化合物的方法,所述有机化合物具有至少3个C原子或具有至少2个C原子和至少1个N原子,所述方法包括以下步骤:a1)碾磨淀粉原料,从而获得碾磨产物,所述碾磨产物包含淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分;a2)将碾磨产物悬浮在水性液体中并通过酶促液化水解碾磨产物中的淀粉部分,并且,如果合适,随后进行糖化作用,从而得到包含单糖或寡糖的第一种液体(1);和b)向发酵培养基中加入包含单糖或寡糖的液体(1)以及可代谢的单糖、二糖或寡糖或者以及组合物,所述组合物包含浓度为按重量计至少50%的可代谢的单糖、二糖或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体,所述发酵培养基包含在发酵条件下能够过量产生所述有机化合物的微生物。
Description
本发明涉及使用含糖的培养基培养微生物来发酵产生有机化合物,所述有机化合物具有至少3个C原子或具有至少两个C原子和至少一个N原子,所述培养基包含淀粉原料(feedstock)的至少部分非淀粉固体组分。
含糖的液体培养基是用于多种发酵过程的一种基本营养源;存在于培养基中的糖成分被使用的微生物代谢,得到有价值的有机产物。这样制备的微生物代谢产物(即有机化合物)的范围包括例如低分子量挥发性化合物如乙醇,非挥发性代谢产物如氨基酸、维生素和类胡萝卜素,以及多种其它物质。
根据多种过程的条件,这类通常已知的微生物发酵过程利用不同的碳原料。它们从经由甜菜和甘蔗糖蜜的纯净蔗糖扩展到已知的优质(high-test)糖蜜(转化的甘蔗糖蜜)到来自淀粉水解产生的葡萄糖。另外,乙酸和乙醇作为协同底物被提及,其能够以工业规模用于L-赖氨酸的生物技术生产(Pfefferle等,Biotechnological Manufacture of Lysine,Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,Vol.79(2003),59-112)。
根据上述的碳原料,建立了多种方法和步骤用于微生物代谢产物的基于糖的发酵生产。以L-赖氨酸为例,关于菌株开发、方法开发和工业生产的方法例如由Pfefferle等(上述引文中)描述。
用于微生物介导发酵生产微生物代谢产物的一种重要碳原料是淀粉。淀粉首先必须在前面的反应步骤中被液化和糖化,然后其可以作为发酵中的碳原料被利用。为此,通常从天然淀粉原料如马铃薯、木薯、谷物(例如小麦、玉米、大麦、黑麦、黑小麦或稻)中以预纯化的形式获得淀粉,随后将其用酶液化并糖化,随后其用于实际发酵中来产生目的代谢产物。
除了这类预纯化的淀粉原料的用途以外,还描述了未预处理的淀粉原料用于制备碳原料的用途,所述碳原料用于发酵产生微生物代谢产物。通常,最初通过磨碎将淀粉原料粉碎。然后将碾磨产物(millbase)进行液化和糖化。因为该碾磨产物除淀粉外天然地含有一系列非淀粉组分,所述非淀粉组分可不利地影响发酵,所以通常在发酵前去除这些组分。去除可以在磨碎后直接进行(WO 02/077252;JP 2001-072701;JP 56-169594;CN1218111)、在液化后进行(WO 02/077252;CN 1173541)或在糖化后进行(CN1266102;Beukema等:Production of fermentation syrups by enzymatichydrolysis of potatoes;potato saccharification to give culture medium(Conference Abstract),Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983),6;NL8302229)。然而,所有的变型涉及在发酵中使用基本纯的淀粉水解产物。
发酵产生有机化合物的新方法尤其包括在发酵前纯化淀粉原料,例如经液化和糖化的淀粉溶液的纯化(JP 57159500);或提供旨在使得可能从可再生资源制备发酵培养基的方法(EP 1205557)。
相反,未加工的淀粉原料已知被大规模地用于发酵生产生物乙醇。此处淀粉原料(通常为完整的谷粒)首先进行干磨,随后使用酶将淀粉原料的淀粉组分水解。此处水解可以分批进行(例如在搅拌容器中)或连续进行(例如在蒸汽加压锅(jet cooker)中)。合适过程的描述可例如见于″The AlcoholTextbook-A reference for the beverage,fuel and industrial alcoholindustries″,Jaques等(Ed.),Nottingham Univ.Press 1995,ISBN1-8977676-735,Chapter 2,pp.7 to 23,和McAloon等,″Determining thecost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks″,NREL/TP-580-28893,National Renewable Energy Laboratory,October2000中。
因为在生物乙醇的发酵生产中,价值产物通过蒸馏获得,所以使用来自干磨过程的非预纯化形式的淀粉原料不构成严重的问题。然而,当使用干磨法用于生产其它微生物代谢产物时,通过糖溶液被引入发酵中的固体流是有问题的,因为其不仅可对发酵具有例如关于氧转移速率或使用的微生物的需氧量(在该语境中参阅Mersmann,A.等:Selection and Design ofAerobic Bioreactors,Chem.Eng.Technol.13(1990),357-370)的不良作用,而且也可以可观地将随后的加工复杂化。
另外,作为引入固体的结果,甚至制备含淀粉的悬浮液时悬浮液的粘度可达到临界值,因为例如含有多于30%重量玉米粉的悬浮液在水中不再是可均相混溶的(Industrial Enzymology,第2版,T.Godfrey,S.West,1996)。这限制了传统步骤中的葡萄糖浓度。就生物酒精的发酵生产而言这不再有关,因为产物对用于发酵的酵母的毒性导致在任何情况下不能以有意义的方式转化更高的浓度。
用低糖浓度补充含糖的发酵培养基原则上在除乙醇外的有机代谢产物的发酵生产中是不利的,因为该步骤导致发酵液不成比例的稀释,并因而导致可达到的目的产物最终浓度被降低,当这些产物得自发酵培养基中时,这首先导致提高的成本和其次空间时间产率(space-time yield)降低。这些考虑是重要的,特别是在淀粉水解产物旨在被部分地添加至较低体积的次级发酵中用于生产其它化学品的情况下,所述淀粉水解产物被生产用于大体积生物乙醇生产并传统地具有按重量计最多约30%或33%的低糖或葡萄糖浓度。
由于这些困难和限制,干磨法因为已经被广泛用于生产生物乙醇而至今保留在发酵生产除乙醇以外的微生物代谢产物中,但不具有特别的经济学重要性。
迄今为止,仅描述了使用木薯作为淀粉原料,将干磨法概念和原则上与该方法有关而存在的优点应用于工业规模生产微生物代谢产物的尝试。因此,JP 2001/275693描述了用于发酵生产氨基酸的一种方法,其中在干燥状态下被磨碎的去皮木薯块茎被用作淀粉原料。为了进行该过程,必须将碾磨产物的颗粒尺寸调节至≤150μm。在用于该目的的过滤步骤中,在将获得的淀粉液化/糖化和随后发酵之前去除使用的一部分碾磨产物,所述部分包括不含淀粉的组分。在该过程中,获得中等的糖浓度。类似的过程描述于JP 2001/309751中,用于生产含氨基酸的饲料添加剂。
用于发酵的液体培养基中提高的糖浓度可以通过使用下述碾磨产物来达成,所述碾磨产物主要包含淀粉原料的固体的、非淀粉的组分,用于通过申请公司的WO 2005/116228(PCT/EP2005/005728)中所述方法糖化。令人惊奇的是,显示存在于淀粉原料中的固体的、非淀粉的组分不需要在发酵前被去除。使用在谷粒中选择淀粉原料的一种类似方法描述于申请公司的PCT/EP2006/066057(较早的专利申请DE 102005042541.0)中。在一些情况中,观察到微生物的受抑制的或延迟的增殖。
提供用于发酵产生有机化合物的另一方法是本发明的一个目的,所述方法不要求之前去除存在于淀粉原料中的非淀粉固体组分,至少不要求完全去除。另外,其特征在于容易操作所使用的培养基和它们在发酵过程中没有问题的用途。特别地,该过程将允许使用谷物作为淀粉原料。
令人惊奇地,现在已经发现现有技术中的上述问题可以如下来克服:首先通过碾磨制备第一种含糖的液体培养基(1),液化和糖化淀粉原料而不事先除去淀粉原料的非淀粉固体组分,并用该培养基与可代谢的单糖、二糖或寡糖一起或者与包含浓度为按重量计至少50%可代谢的单糖或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体的组合物一起提供发酵。
因此本发明提供了用于发酵产生至少一种有机化合物的方法,所述化合物具有至少3个C原子或具有至少2个C原子和至少1个N原子,所述方法包括以下步骤:
a1)碾磨淀粉原料从而获得碾磨产物,所述碾磨产物包含淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分;
a2)将碾磨产物悬浮在水性液体中并通过酶促液化水解碾磨产物中的淀粉部分并且,如果合适,随后糖化,从而得到包含单糖或寡糖的第一种液体(1);和
b)将包含单糖或寡糖的液体(1)与可代谢的单糖、二糖或寡糖一起或者包含浓度为按重量计至少50%可代谢的单糖、二糖或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体的组合物一起加入包含微生物的发酵培养基中,所述微生物能够在发酵条件下过量产生所述有机化合物。
使用通过酶促水解得到的包含单糖或寡糖的液体(1),导致所述有机化合物的发酵生产的成本显著降低。平行地加入浓缩形式的可代谢糖(即,可代谢的单糖、二糖或寡糖)额外避免了发酵液体的任何不希望的稀释。此外,由于根据本发明的方法,可以避免以较高碾磨产物浓度液化淀粉原料时可以产生的粘性问题。此外,以这种方式可以避免微生物增殖的问题。
当涉及包含单糖或寡糖的液体(1)时,术语“液体(1)”和“液体培养基(1)”将在这里和下文以同义使用。适合作为本发明方法的淀粉原料主要是干燥谷物或种子,其中淀粉在干燥状态达到按重量计至少40%,优选按重量计至少50%。它们在当前大规模生长的谷类植物中被发现,所述植物为如玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、稻、甜菜和马铃薯和多种高粱和黍(millet)物种,例如甜高粱(sorgo)和买罗高粱(milo)。淀粉原料优选选自谷类,特别优选是玉米、黑麦、黑小麦和小麦仁。原则上,根据本发明的方法也可以用类似的淀粉原料进行,所述淀粉原料例如多种含淀粉谷类或种子的混合物。
为了制备液体培养基(1),将所述淀粉原料在步骤a1)中碾磨,期间添加或不添加液体例如水,优选不添加液体。也可能将干磨与随后的湿磨步骤结合。
通常用于干磨的设备为锤磨机(hammer mill)、转子磨(rotor mill)或滚筒式磨(roller mill);适用于湿磨的是桨式混合机(paddle mixer)、搅拌式球磨机(agitated ball mill)、环流磨(circulation mill)、盘式磨(disk mill)、annular chamber mill、振动磨(oscillatory mill)或行星式磨(planetary mill)。原则上,其它磨也是合适的。湿磨法需要的液体量可以由技术人员在常规实验中确定。通常如下调节:干物质含量按重量计在从10%到20%的范围内。
碾磨得到了适用于随后方法步骤的颗粒尺寸。在本文语境中,已经证明当碾磨步骤(特别是干磨步骤)中、步骤a1)中获得的碾磨产物以按重量计从30%到100%、优选按重量计从40%到95%、特别优选按重量计50%到90%的量含有下述粉末颗粒(即微粒组分)时是有利的,所述粉末颗粒具有从100μm到630μm范围内的颗粒尺寸。优选获得的碾磨产物按重量计包含50%的粉末颗粒,所述粉末颗粒具有大于100μm的颗粒尺寸。通常按重量计至少95%的磨碎的粉末颗粒具有少于2mm的颗粒尺寸。在本文上下文中,借助于使用振动分析仪的筛选分析测量颗粒尺寸。通常,小的颗粒尺寸对于获得高产物产率是有利的。然而,过分小的颗粒尺寸可导致问题,特别是当碾磨产物在液化或加工期间被调成浆时(例如在发酵步骤后干燥固体时)由凝块形成/团聚引起的问题。
通常,粉末由出粉率(extraction rate)或粉末级别表征,它们彼此之间的关系是粉末级别特征随着提高的出粉率而提高。出粉率对应于以按重量计每100份使用的碾磨产物为基础获得的按重量计的粉末量。当在碾磨过程中最初用进一步的碾磨(即以提高的出粉率)获得纯净的、超细的粉末(例如来自谷物仁内部)时,粉末中的粗纤维和外壳含量提高,淀粉含量下降。因此出粉率也反映在已知的粉末级别中,其用作分级粉末(特别是谷粉)的特征,并以粉末的灰分含量(ash content)为基础(已知为灰分标尺(ashscale))。粉末级别或类型编号指出100g粉末固体焚烧后残余的以mg计的灰分(矿物)量。在谷粉的情况下,更高的类型编号表示更高的出粉率,因为谷物仁的核心包含按重量计约0.4%的灰分,而外壳包含按重量计约5%的灰分。因此在更低出粉率的情况下,谷粉主要由粉碎的胚乳(即谷物仁中的淀粉含量)组成;在更高出粉率的情况下,谷粉也包含粉碎的、含蛋白质的谷粒糊粉层;在粗粉的情况下,它们也包含胚(其含有蛋白质并含有脂肪)和种壳(其含有粗纤维和灰分)的组分。就本发明的目的而言,原则上优选具有高出粉率或高类型编号的粉末。如果使用谷类作为淀粉原料,优选将完整的仁与它们的壳一起碾磨并进一步加工,如果适当的话在机械去除胚和壳之后。
根据本发明,用于制备液体培养基(1)的碾磨产物对应于出粉率包含至少一部分、优选按重量计至少20%、尤其是按重量计至少50%、特别是按重量计至少90%和非常特别是按重量计至少99%的存在于碾碎的谷物仁中的非淀粉固体组分。根据碾磨产物的淀粉组分(从而根据液体培养基(1)中单糖、二糖或寡糖的量),碾磨产物中的非淀粉固体组分优选总计为按重量计至少10%、尤其是按重量计至少15%、例如按重量计从15%到75%,特别是按重量计在从20%到60%的范围内。
根据步骤a2)的碾磨产物的酶促水解可以通过技术人员已知的惯用方法进行,例如,按照″The Alcohol Textbook-A reference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries“,第2章,7到23页中描述的方法,其已经在开始时被引用。
为此,首先将碾磨产物与水性液体,例如,新鲜的水、再循环过程水(例如,来自随后的发酵),或者与这些液体的混合物混合,得到水性悬浮液。该程序通常也称作制浆(slurring)。
通常,以这样的方式选择碾磨产物和水性液体的量,使得水解得到水性液体培养基(1),其中总的单糖、二糖和/或寡糖浓度在100到750g/kg,优选150到700g/kg,尤其200到650g/kg的范围内。因此,通常以150到800g/kg、通常200到750g/kg,尤其250到700g/kg的量使用(基于悬浮液(浆液)的总重量)。
在本发明的优选实施方案中,以这样的方式选择碾磨产物和水性液体的量使得水解得到水性液体培养基(1),其中总的单糖、二糖和/或寡糖浓度为100到400g/kg,优选150到350g/kg,尤其200到300g/kg。因此,通常以150到550g/kg、通常200到500g/kg,尤其250到450g/kg的量使用(基于悬浮液(浆液)的总重量)。原则上,还可能使用更多量的碾磨产物以便实现更高的总的单糖、二糖和/或寡糖浓度,例如,高于400g/kg到700g/kg,尤其450到650g/kg或500g/kg到650g/kg的浓度。
对于碾磨产物的淀粉部分的酶促水解,通常,将碾磨产物在淀粉液化酶、通常α-淀粉酶的存在下液化。也可以使用在所述反应条件下有活性的其他酶和液化的稳定淀粉。
为了液化碾磨产物中存在的淀粉,原则上可能使用所有的液化酶,尤其是α-淀粉酶(酶类别EC 3.2.1.1),例如已经得自地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenformis)或Bacillus staerothermophilus的α-淀粉酶,特别是就生物乙醇生产的目的用于液化通过干磨法获得的材料的那些。适用于液化的α-淀粉酶也是可以商业获得的,例如来自Novozymes的名称Termamyl 120L L型下的;或来自Genencor的名称Spezyme下的α-淀粉酶。不同α-淀粉酶的组合也可以用于液化。
这得到了液体培养基,其包含来自碾磨产物的经液化的淀粉部分,通常为具有3到18个、尤其是6到12个单糖单元的寡糖,尤其葡萄糖单元,和所使用的碾磨产物的非淀粉组分,尤其是用于液化的碾磨产物的固体非淀粉组分。
淀粉液化酶和碾磨产物的量以下述方式有利地选择:胶凝过程中的粘度被足够降低,使得可能通过例如搅拌将悬浮液有效混合。胶凝过程中反应混合物的粘度优选不大于20Pas,特别优选不大于15Pas,非常特别优选不大于8Pas。通常,使用装备有M5测量系统和MVDIN设备的RotoVisko RV20型Haake粘度计,在50℃温度和200s-1的剪切率下测量粘度。
最初可向反应容器中引入或者在步骤a2)期间添加α-淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)。优选在步骤a2)开始时添加步骤a2)中需要的一部分α-淀粉酶,或该部分可以最初被引入反应器中。以使用的淀粉原料总量为基础,α-淀粉酶的总量通常在按重量计0.002%到3.0%的范围内,优选按重量计从0.01%到1.5%,特别优选按重量计从0.02%到0.5%。
液化可以在胶凝温度之上或之下进行。优选步骤a2)中的液化至少部分在使用的淀粉的胶凝温度或胶化温度之上进行(已知为煮过程)。所述淀粉所需的温度是技术人员已知的(参阅已经在开头引用的″The AlcoholTextbook-A reference for the beverage,fuel and industrial alcoholindustries″的第2章,第11页)或可以由他通过常规实验确定。通常,选择的温度在80℃和165℃之间、优选90℃和150℃之间的范围内,特别优选在从100℃到140℃的范围内,所述温度通常比胶凝温度高至少5K、尤其至少10K并特别优选至少20K,例如10到100K,尤其是20到80K。在这些温度下,淀粉的颗粒结构被破坏(凝胶),使得后者的酶降解成为可能。
对于最适有效的α-淀粉酶(或使用的淀粉液化酶)而言,步骤a2)优选至少有一段时间在所述液化酶的最适pH下进行,通常在弱酸范围内的pH下,优选4.0和7.0之间、特别5.0到6.5之间,pH调节通常在步骤a2)之前或开始时进行;优选在液化过程期间检查和适当的话再调节该pH。优选使用稀无机酸如H2SO4或H3PO4或稀水性碱性氢氧化物溶液如NaOH或KOH调节pH。
在步骤a2)中用于液化碾磨产物中淀粉部分的优选的实施方案中,至少部分的碾磨产物被连续或分批地添加进水性液体中。优选按重量计至少40%、尤其是按重量计至少50%、非常特别优选按重量计至少55%是在液化过程的进程期间但是在任何糖化发生之前向反应器中添加的。通常添加的量不超过按重量计90%、尤其是按重量计85%、特别优选按重量计80%。优选在该过程的进程中添加的碾磨产物部分是在液化阶段期间主要的条件下被补充进反应器中的。该添加可以以若干部分分批(即按部分)进行或者连续进行,优选所述部分在每种情况下总计占待液化的碾磨产物总量的按重量计不多于30%、特别优选按重量计不多于20%、例如按重量计1%到30%、尤其是按重量计2%到20%。该实施方案的本质方面是只有一些碾磨产物(优选按重量计不多于60%、尤其按重量计不多于50%、特别优选按重量计不多于45%的碾磨产物)在液化开始时存在于反应器中,而碾磨产物的剩余部分在液化阶段期间被添加。
液化也可以连续进行,例如在多步骤反应级联中。
在优选的实施方案中,根据本发明方法的步骤a2)如下进行:总计占碾磨产物总量按重量计不多于60%、优选按重量计不多于50%、特别优选按重量计不多于45%、例如按重量计10%到60%、尤其是按重量计15%到50%、特别优选按重量计20%到45%的部分最初被悬浮于水性液体中,并随后进行液化。
在优选的实施方案中,步骤a2)中一些碾磨产物的不连续的或连续的添加(尤其是按部分的添加)如下进行:液体培养基的粘度不多于20Pas、优选不多于15Pas、特别优选不多于8Pas。为了帮助控制粘度,在高于存在于碾磨产物中的淀粉的胶化温度之上的温度下,添加已添加的碾磨产物总量的按重量计至少25%、优选按重量计至少35%、特别优选按重量计至少50%被证明是有利的。另外,还可通过按部分地添加至少一种淀粉液化酶(优选α-淀粉酶)和/或至少一种糖化酶(优选葡糖淀粉酶)自身来影响调控粘度。
为了进行根据本发明的方法,可能将用于悬浮固体碾磨产物的水性液体在适度提高的温度下预热,例如在从40℃到60℃的范围内。然而,优选在室温下使用液体。
然后将至少一种淀粉液化酶(优选α-淀粉酶)添加进碾磨产物的悬浮液中。如果仅在液化阶段添加一些碾磨产物,则仅在开始时添加一些α-淀粉酶(例如以步骤a2)中使用的所有α-淀粉酶为基础按重量计10%到70%,尤其是按重量计20%到65%)是有利的。在该时间点添加的α-淀粉酶量取决于所述α-淀粉酶在所用的淀粉原料相关的反应条件下的活性,并一般在以使用的淀粉原料总重为基础按重量计从0.0004%到2.0%、优选按重量计从0.001%到1.0%、特别优选按重量计从0.02%到0.3%的范围内。或者,α-淀粉酶部分可以在制备悬浮液之前与使用的液体混合。
使用的α-淀粉酶部分的量通常在开始加热至用于液化的温度之前被添加至悬浮液中,尤其是在室温下或仅适度提高的温度下,例如在20℃到30℃的范围内。
然后加热这样制造的悬浮液,优选加热至高于使用的淀粉的胶凝温度的温度。通常,选择在80℃和165℃之间、优选90℃和150℃之间、特别优选100℃和140℃之间范围内的温度,该温度通常优选比胶凝温度(胶化温度)高至少5K、优选至少10K、特别优选至少20K、例如10到100K、尤其是20到80K。监测粘度的同时,向含淀粉的悬浮液中逐渐添加更多的淀粉原料部分,例如在各情况下以使用的所有碾磨产物为基础按重量计1%到30%、尤其是按重量计从2%到20%的部分。在该情况下优选将液化步骤进程中待添加的碾磨产物部分以至少2部分、优选至少4部分、特别优选至少6部分添加至反应混合物中。或者未用于制造悬浮液的碾磨产物部分可以在该实施方案的液化步骤期间连续添加。添加中应当有利地将温度维持高于淀粉的胶凝温度。
达到期望的温度后或适当时所有粉末已经被添加后,如果需要的话,通常将反应混合物在高于淀粉胶凝温度的温度设置下维持一段时间,例如10到60分钟或更久,即煮。然后,通常将反应混合物冷却至稍微更低的温度,但是优选高于胶凝温度,例如70℃到90℃。之后如果适当的话,添加另一部分α-淀粉酶,优选最大的部分。在该情况下,取决于在所用的α-淀粉酶反应条件下的活性,在该时间点添加的α-淀粉酶的量以使用的淀粉原料总量为基础优选按重量计从0.002%到2.0%、特别优选按重量计从0.01%到1.0%、非常特别优选按重量计从0.02%到0.4%。
为了将淀粉完全降解为糊精,将反应混合物维持在设定温度下,或适当时进一步加热,直到通过碘或适当时通过检测淀粉的另一测试的淀粉检测是阴性的或至少基本上是阴性的。如果适当的话,这时可以向反应混合物中添加一个或多个其它α-淀粉酶部分,例如以使用的淀粉原料总量为基础按重量计从0.001%到0.5%、优选按重量计从0.002%到0.2%的范围内。
或者,可能如下液化淀粉部分,首先通过引入蒸汽将包含碾磨产物的水性悬浮液加热至高于存在于淀粉原料中的淀粉或碾磨产物的胶化温度。通常悬浮液会被加热至比所述胶化温度高至少10K、尤其是至少20K、例如10到100K、尤其是20到80K的温度。尤其是将悬浮液加热至从90℃到150℃的范围内、特别是从100℃到140℃的范围内。
用于加热悬浮液的蒸汽通常是具有至少105℃、尤其是至少110℃、例如110℃到210℃温度的预热蒸汽。该蒸汽优选在超大气压(superatmospheric pressure)下被引入。因此,该蒸汽优选具有至少1.5巴、例如1.5巴到16巴、尤其是2巴到12巴的压强。
通常如下将蒸汽引入悬浮液中:优选以高速度将蒸汽在超大气压下引入悬浮液中,优选1到10或11巴、尤其是1.5到5巴的超大气压。引入蒸汽的结果是悬浮液被瞬间加热至高于90℃的温度,即高于胶化温度的温度。
用蒸汽加热优选在装有悬浮液的连续操作的设备中以特定的补料压强连续进行,所述补料压强是由悬浮液粘度、补料速率和设备的几何形状引起的,并在悬浮液负荷区中通过可调节的喷嘴在提高的压强下根据补料压强补充热蒸汽。在提高的压强下补充蒸汽表示不仅加热悬浮液,而且向体系中引入机械能,并且该机械能促进碾磨产物颗粒的进一步粉碎,导致特别均一的能量供应,并从而导致碾磨产物中颗粒状淀粉颗粒的特别均一的凝胶化。这些设备通常具有管状的几何形状。优选蒸汽沿管状设备的纵轴补充。通常,悬浮液以至少45°的角度或以直角提供。可调节区域喷嘴通常具有圆锥形的几何形状,该圆锥在蒸汽的流动方向逐渐变细。在该喷嘴中安置了针或安置于纵向可移动杆上的椎体(cone)。针或椎体与喷嘴的圆锥一起形成孔。通过纵向移动针或杆,可以以简单的方式调节孔的大小并从而调节喷嘴末端的横断面积,藉此可以以简单的方式控制提供蒸汽的速度。
这些设备通常也装备有混合管,在提供蒸汽后悬浮液被运入其中并在该管中离开设备。该混合管通常沿着蒸汽提供方向并与补料垂直设置。混合管和喷嘴一起通常形成孔,悬浮液通过该孔运输。作为该孔的结果,在运输过程中额外的剪切力作用于悬浮液并从而提高对悬浮液的机械能供应。混合管可以以可纵向移置的方式安置。移动混合管是调节孔的尺寸从而调节设备压差(drop of pressure)的简单途径。
现有技术中这类设备已知称作蒸汽加压锅,例如″The AlcoholTextbook″第2章(上述引文中)的图13中所示的设备是可商业获得的,例如来自Hydro Thermal Corp.Waukesha WI,USA的名称HYDROHEATER
当反应连续进行时,用蒸汽处理的悬浮液通常随后被转移进入“反应后区域”(after-reaction zone)中以继续淀粉组分的胶凝。通常,在反应后区域中主要为超大气压(通常是在2到8巴范围内的绝对压强)。反应后区域中的温度通常在90℃到150℃的范围内。该反应后区域中的滞留时间可以在1分钟到4小时的范围内,取决于悬浮液的温度。反应后区域通常具有管状或柱状的几何形状。在一个实施方案中,反应后区域具有垂直安置的柱的几何形状。此处悬浮液一旦离开蒸汽处理设备便被施加于柱的上部区域,并在下部区域离开。在本发明的另一实施方案中,反应后区域具有管状的几何形状。
悬浮液离开反应后区域后,压强通常被释放,并随后进行液化。压强的释放优选以闪蒸的形式进行,从而将悬浮液冷却至(优选)低于100℃、尤其是低于85℃的温度。通常,然后在独立的反应容器中将被这样崩解的淀粉液化。液化可以如上文所述进行。
在本发明优选的实施方案中,至少一些或所有的、通常至少50%、尤其是至少80%或者所有的淀粉液化酶在蒸汽加热过程之前被添加进水性液体中的碾磨产物悬浮液中。如此,当混合物被加热至高于胶化温度时,液化过程已经发生。用蒸汽加热和反应后阶段可以适当地进行。独立的反应容器中随后的液化步骤可以省略。然而,会优选进行这类液化步骤来完成淀粉到糊精的降解。
为了稳定使用的酶,如果适当的话可以例如使用CaCl2将Ca2+离子的浓度调节为酶特异的最佳值。合适的浓度值可以由技术人员在常规实验中确定。如果例如使用Termamyl作为α-淀粉酶,则将液体培养基中的Ca2+离子浓度调节至例如10到100ppm、优选20到80ppm和特别优选约30到70ppm是有利的,单位ppm是以重量为基础的并表示g/1000kg。
为了将淀粉完全降解为糊精,将反应混合物保持在设定温度下,直到通过碘或适当时通过检测淀粉的另一测试的淀粉检测是阴性的或至少基本上是阴性的。如果适当的话,这时可以向反应混合物中添加一个或多个其它α-淀粉酶部分,例如以使用的淀粉原料总量为基础按重量计从0.001%到0.5%、优选按重量计从0.002%到0.2%的范围内。
这得到水性淀粉水解产物,其包含来自碾磨产物的液化的淀粉部分,通常为糊精,和如果合适,其他寡糖和单糖或二糖,和碾磨产物的非淀粉成分,尤其用于液化的碾磨产物的固体的非淀粉组分。
淀粉液化结束后,可以将液体培养基中存在的糊精以本身已知的方式连续或者分批糖化,即分解成葡萄糖。液化的培养基在用于例如随后的发酵步骤前可以在特定糖化罐中完全糖化。
在本发明的第一个实施方案中,在随后的发酵前进行仅仅部分的糖化。例如,可以按照如下程序,其中将液体培养基中存在的一些糊精(例如,基于糊精的总重量(或者最初的淀粉)按重量计10到90%,尤其按重量计20到80%的范围)糖化并在发酵中使用所得的含糖液体培养基。可以在发酵培养基中原位实现进一步的糖化。此外,可以在发酵罐(原位)中直接进行糖化,免除了单独的糖化罐。
原位糖化(即,在发酵罐中部分或完全进行糖化)的优点首先是降低了投资支出;其次,葡萄糖的延迟释放可以(如果合适)允许在批次中最初导入较高的葡萄糖浓度而在使用的微生物中不发生抑制或代谢改变。例如,在大肠杆菌中,不适当的高葡萄糖浓度导致形成有机酸(乙酸),而酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)在这种情况下转向例如发酵,尽管在充氧的发酵罐中存在足够的氧(Crabtree效应)。通过控制葡糖淀粉酶浓度可以调节葡萄糖的延迟释放。这使得可能抑制上述效应,并且可以在最初导入更多的底物,使得所提供的进料流引起的稀释度可以被降低。
液化淀粉溶液中糊精(即,寡糖)的糖化酶促地进行,即借助至少一种糊精糖化酶。可以用于该目的的酶原则上是所有葡糖淀粉酶(酶类别EC 3.2.1.3),尤其从曲霉属得到的葡糖淀粉酶,特别是用于糖化通过与生物乙醇的生产有关的干磨法得到的物质的那些葡糖淀粉酶。适于糖化的葡糖淀粉酶也可以通过商业途径得到,如从Novozymes以名称Dextrozyme GA;或从Genencor以名称Optidex得到。也可以使用不同的葡糖淀粉酶的组合。
将至少一种糖化酶,尤其至少一种葡糖淀粉酶加入液化后得到的含有糊精的液体培养基中,所加入的葡糖淀粉酶的量基于所用的淀粉原料的总量为按重量计通常0.001到5.0%,优选按重量计0.005到3.0%,特别优选按重量计0.01到1.0%。
如果在发酵罐中进行糖化,那么通常将液化的淀粉溶液冷却到发酵温度,即,32到37℃,然后送入发酵罐中。在该情况中,将用于糖化的葡糖淀粉酶(或者至少一种糖化酶)直接加入发酵罐液体中。根据步骤a2)的液化淀粉的糖化现在与微生物对糖的代谢平行地发生。
如果糖化在糖化罐中发生,那么通常将液化的淀粉溶液冷却或升温到糖化酶的最适温度或者稍低的温度,例如到50至70℃,优选60至65℃,并随后用葡糖淀粉酶处理。
有利地的是在加入糖化酶,尤其葡糖淀粉酶之前,调节液体培养基的pH值到所用的葡糖淀粉酶的最佳活性范围内的值,优选3.5到6.0;特别优选4.0到5.5,非常特别优选4.0到5.0。然而,尤其当在发酵罐中直接进行糖化时,还可能调节pH到上述范围之外的值,例如,高于6.0到8.0的范围内。这例如在赖氨酸、泛酸和维生素B2的发酵生产中总体上是有利的,尽管在该pH范围内标准的葡糖淀粉酶具有有限的活性,或者由于将设置的发酵条件而是必要的。
在优选实施方案中,在特定糖化罐中进行糖化。为此,将液化的淀粉溶液升温到酶的最佳温度,或者稍低的温度,并且以上述方式调节pH到酶的最佳pH值。
加入糖化酶之后,优选将含有糊精的悬浮液保持设定的温度一段时间,例如,2到72小时或更长,如果需要,尤其5到48小时,在该时间内,糊精被糖化而得到单糖。本领域技术人员使用已知的方法,如HPLC、酶测定法或者葡萄糖试纸来监测糖化过程的进展。当单糖浓度基本上不再升高或者再次下降时,糖化已经结束。
因此,通常,将包含淀粉原料的至少一些或所有成分的碾磨产物用于制备含有糖的液体培养基(1)(即,不除去或不完全除去淀粉原料的非淀粉固体组分),所得的液体培养基(1)也含有淀粉原料的一些或所有非淀粉固体组分。这经常引起引入如来自谷类的一定量的肌醇六磷酸,所述量将不被忽视。为了避免这样产生的抑制效应,有利的是在步骤a2)中向液体培养基中加入至少一种肌醇六磷酸酶,然后将含有糖的液体培养基进行发酵步骤。
可以在液化或糖化之前、期间或者之后加入肌醇六磷酸酶,如果其对于各自的高温足够稳定的话。
可以使用任何肌醇六磷酸酶,只要在反应条件下它们的活性在每种情况下至多受到可忽略的影响。使用的肌醇六磷酸酶优选具有>50℃,特别优选>60℃的热稳定性(T50)。
肌醇六磷酸酶的量通常为1到10000单位/kg淀粉原料,尤其10到4000单位/kg淀粉原料。
为了增加总的糖产率,或者得到游离氨基酸,可以在含有糖的液体培养基的生产期间向反应混合物中额外加入其他酶,如支链淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶或蛋白酶。这些酶的加入对粘性具有积极作用,即降低粘性(例如,通过切割长链(也称作较长链)葡聚糖和/或(阿拉伯)木聚糖),并导致释放可代谢的葡糖苷和释放(残留的)淀粉。蛋白酶的使用具有类似的积极作用,还可能的是释放作为发酵的生长因子的氨基酸。
取决于是否已经进行了糖化,本文所述的步骤a1)和a2)的应用得到液体培养基,其包含糊精或单糖或二糖并且其具有上述范围内的总的单糖、二糖和/或寡糖浓度。
糖化后液体培养基(1)中存在的糖尤其是葡萄糖,也可能存在葡萄糖之外的其他单糖,如己糖和戊糖,例如,果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖和核糖。葡萄糖之外的单糖的量可以取决于使用的淀粉原料和其中存在的非淀粉成分,并且可以受到方法控制的影响,例如,通过加入纤维素酶分解纤维素成分。含有糖的液体培养基的单糖优选包含基于该含糖液体培养基中存在的糖的总量,按重量计至少60%,通常按重量计至少70%,尤其按重量计至少80%,特别按重量计至少85%的葡萄糖含量。基于该含糖液体培养基中存在的糖的总量,葡萄糖含量通常为按重量计75到99.9%,尤其按重量计80到99%,特别按重量计85到97%。如果没有进行糖化,那么培养基(1)中存在的单糖、二糖和寡糖中糊精的量基本上对应于葡萄糖的量。
如果没有进行糖化,那么可代谢的葡萄糖当量基本上以寡糖,尤其糊精存在。这些寡糖或糊精的主要成分通常是葡萄糖,还可能的是培养基包含少量由其他单糖单位组成的单糖和/或二糖和寡糖单位。在这种情况下,液体培养基(1)中的含糖成分,即单糖、二糖和寡糖通常包含按寡糖,尤其糊精的重量计至少60%,通常按重量计至少70%,尤其按重量计至少80%,特别按重量计至少90%,例如单糖和二糖达到按重量计小于40%,通常按重量计小于30%,尤其按重量计小于20%,特别按重量计小于10%。基于葡萄糖当量的总重量,以游离或结合形式存在的葡萄糖通常达到按培养基(1)的葡萄糖当量的重量计50到99%,尤其按重量计75到97%,特别按重量计80到95%。
根据本发明,使用液体培养基(1)和该液体培养基之外的可代谢的单糖、二糖和/或寡糖原料(下文中也称作糖原料)进行随后的发酵。用于该目的的单糖、二糖和/或寡糖可以原样使用或者以组合物的形式使用,该组合物包含可代谢的单糖、二糖和/或寡糖,其浓度基于培养基的总重量为按重量计至少50%,优选浓度为按重量计至少60%,并且与水性液体培养基(1)相比,该组合物基本上没有不溶于水的固体。
糖原料中存在的单糖、二糖或寡糖优选选自单糖,通常为己糖和/或戊糖,例如,葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖和核糖,特别选自葡萄糖、果糖和半乳糖,和二糖,如蔗糖、麦芽糖、乳糖,特别是蔗糖。还适宜的是单糖和二糖和具有高比例的掺入的葡萄糖组分的寡糖混合物,和这些混合物与单糖和/或二糖的混合物。
包含浓度为按重量计至少50%的单糖、二糖和/或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体的组合物的实例包含葡萄糖糖浆、蔗糖糖浆、浓汁、麦芽糖糖浆、糊精糖浆,以及来自糖生产的废品(糖蜜),尤其来自甜菜糖生产的糖蜜和来自甘蔗糖生产的糖蜜。
特别优选的是主要包含单糖和/或二糖,尤其葡萄糖和/或蔗糖的物质,和包含葡萄糖和/或蔗糖和高比例的掺入的葡萄糖组分的寡糖的混合物,如葡萄糖、蔗糖、葡萄糖糖浆、蔗糖糖浆、浓汁和糖蜜。
像液体培养基(1)一样,单糖、二糖和/或寡糖和包含它们的组合物不仅可以用于初步制备发酵培养基(分批相),而且可以用于在发酵期间喂饲(如果后者以补料分批或者半连续形式进行)。
通过加入液体培养基(1)向发酵中导入的单糖、二糖和/或寡糖的总量优选占导入发酵的单糖、二糖和寡糖总量的按重量计至少40%,尤其按重量计至少50%,特别优选按重量计至少60%,例如按重量计40到95%,尤其按重量计50到90%,特别按重量计60到90%。
可以将液体培养基(1)和单糖、二糖和/或寡糖,或者包含它们的组合物相互单独地或一起送入发酵。
在本发明优选的实施方案中,液体培养基(1)和单糖、二糖和/或寡糖,或者包含它们的组合物在送入发酵前相互混合。从而,当使用通常具有100到400g/kg低的总单糖、二糖和寡糖浓度的液体培养基时,步骤a1)和a2)后得到的含有糖的液体培养基(1)的总糖含量增加,优选增加至少50g/kg,尤其至少100g/kg,特别至少150g/kg,例如50到300g/kg,尤其100到250g/kg,特别120到200g/kg,达到基于总重量按重量计超过40%,优选按重量计至少45%,尤其按重量计至少50%,特别优选按重量计至少55%。
向液体培养基(1)加入这些糖原料后,所得的液体培养基基于总重量优选具有按重量计45到80%的范围内,优选具有按重量计50到75%或按重量计55到75%范围内的干物质含量。在该上下文中,有利的是例如通过调节温度控制液体培养基(1)的粘度,使得不超过最大值20Pas,特别优选15Pas,非常特别优选8Pas。
在本发明的优选实施方案中,将单糖和/或二糖以来自糖生产的包含葡萄糖或蔗糖的副产物的形式加入到第一种液体培养基(1)中。实例是在糖生产中从甘蔗糖或尤其甜菜糖产生的糖蜜。
根据本发明,将步骤a1)和a2)中制备的液体培养基(1)和与其不同的糖原料送入发酵,其中它们用于培养微生物。在发酵中,微生物产生微生物代谢产物。
可以以技术人员已知的常规方式进行发酵。为此,所希望的微生物将通常在通过本文所述的方法得到的液体培养基中培养。
可以以分批发酵或补料分批(包括补料分批与中间收获)进行发酵方法,优选补料分批方法。
例如,根据本发明方法得到的液体培养基(1)或常规的糖原料,即可代谢的单糖、二糖和/或寡糖或包含按重量计至少50%浓度的可代谢的单糖、二糖和/或寡糖并且通常没有不溶于水的固体的组合物或它们的混合物,可以接种所希望的微生物,如果合适,用水稀释并加入常规的培养基成分,如缓冲剂、营养盐、氮原料,如硫酸铵、尿素等等、包含氨基酸的复杂培养基成分,如酵母提取物、蛋白胨、CSL等等后,该微生物可以在发酵条件下增殖直到微生物浓度达到发酵所希望的稳定态。这里,液体培养基(1)中存在的糖被代谢并且形成所希望的代谢产物(也称作分批法或分批相)。
当进行补料分批方法时,将通过提供根据本发明的方法可以得到的另一液体培养基(1)和不同于液体培养基(1)的糖源,尤其通过提供将液体培养基(1)与不同于液体培养基(1)的糖原料混合得到的液体培养基继续发酵过程,并且微生物过量产生的代谢产物在发酵液中积累,代谢产物可能存在于所述微生物的细胞中和发酵培养基的水相中。
发酵将优选以补料分批法进行。为此,将按照这样的程序,其中首先使用含糖的液体培养基,如使用液体培养基(1)或者另一种糖原料进行增殖,直到发酵罐中达到希望的微生物浓度。之后,将液体培养基(1)与所述另一糖原料一起喂饲到发酵罐中,所述糖原料即可代谢的单糖、二糖和/或寡糖或者包含浓度为按重量计至少50%单糖、二糖和/或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体的培养基。这维持发酵过程,并且微生物过量产生的代谢产物在发酵液中积累(见上文)。喂饲的含糖液体培养基(1)和向分批培养基中最初导入并且包含微生物的其他糖原料的体积比通常为约1∶10到10∶1,优选约1∶5到5∶1,特别1∶1到5∶1。通过含糖液体培养基的喂饲速率可以控制发酵液中的糖含量。通常,将以这样的方式调节喂饲速率使得发酵液中的单糖含量为按重量计>0%到按重量计约5%,并且尤其不超过按重量计3%的值。
步骤a2)中得到的含糖液体培养基或者其与另一糖原料的混合物如果合适,可以在发酵前灭菌,所述微生物通常被热或者化学方法破坏。为此,通常将含糖液体培养基在高于80℃的温度加热。细胞的破坏或裂解可以在临发酵前发生。为此,将所有的含糖液体培养基进行裂解或破坏。这可以通过热、机械或者化学手段进行。
本发明尤其涉及产生有机的非挥发性化合物的方法,所述化合物具有至少3个C原子或者具有至少2个C原子和至少1个N原子。在该上下文中,将非挥发性有机化合物理解为指在不经历分解的情况下通过蒸馏不能从发酵液回收的那些化合物。通常,这些化合物具有高于水的沸点的沸点,在大气压下通常高于150℃,尤其高于200℃。通常,它们是在标准条件(298K,101.3kPa)下为固体的化合物。
然而,还可能在发酵中使用根据本发明的含糖液体培养基来生产非挥发性微生物代谢产物,其在大气压下具有低于水的沸点的熔点和/或油性稠度。
术语非挥发性微生物代谢产物尤其包括有机的单、二和三羧酸,其优选地具有3到10个碳原子,并且适当时附着有一个或多个(例如1、2、3或4个)羟基,例如酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羟基丙酸、延胡索酸、马来酸、2,5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、乌头酸和二氨基庚二酸、柠檬酸;产蛋白质的的和不产蛋白质的氨基酸,例如赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸;嘌呤和嘧啶碱基;核苷和核苷酸,例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷-5’-单磷酸(AMP);脂类;优选具有10到22个碳原子的饱和和不饱和的脂肪酸,例如γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸;优选具有3到8个碳原子的二元醇,例如丙二醇和丁二醇;具有3个或更多(例如3、4、5或6个)OH基团的多元醇(也称作具有高官能度的醇),例如甘油、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇;具有至少4个碳原子(例如4到22个碳原子)的长链(也称作较长链)醇,例如丁醇;糖类,例如透明质酸和海藻糖;芳香族化合物,例如芳香族胺、香草醛和靛蓝;维生素和维生素原,例如抗坏血酸、维生素B6、维生素B12和核黄素,辅因子和已知的营养药;蛋白质如酶,例如淀粉酶,果胶酶,酸性、杂合或中性的纤维素酶,酯酶如脂肪酶,胰腺酶,蛋白酶,木聚糖酶和氧化还原酶如漆酶、过氧化氢酶和过氧化物酶,葡聚糖酶,肌醇六磷酸酶;类胡萝卜素,例如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素和角黄素;优选具有3到10个碳原子和适当时1个或多个羟基基团的酮,例如丙酮和3-羟基丁酮;内酯,例如γ-丁内酯、环糊精、生物聚合物例如聚羟基乙酸酯、聚酯例如聚交酯、多糖、聚类异戊二烯、聚酰胺;和上述化合物的前体和衍生物。适合用作不挥发微生物代谢产物的其它化合物由Gutcho描述于Chemicals by Fermentation,Noyes Data Corporation(1973),ISBN:0818805086中。
术语“辅因子”包含正常酶活性发生所需的非蛋白质的化合物。这些化合物可以是有机的或无机的;优选本发明的辅因子分子是有机的。这类分子的实例是NAD和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP);这些辅因子的前体是烟酸。
术语“营养药”包含促进植物和动物、尤其是人健康的食品添加剂。这类分子的实例是维生素、抗氧化剂和某些脂类,例如多不饱合脂肪酸。
产生的代谢产物尤其选自酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个C原子的脂肪族单羧酸和二羧酸、具有3到10个C原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个C原子的酮、具有4到10个C原子的链烷醇和具有3到10个、尤其是3到8个C原子的链烷二醇(alkanediol)。
技术人员明白这样发酵产生的化合物在各情况下以使用的微生物产生的对映异构体形式获得(如果存在不同的对映异构体的话)。因此,在氨基酸的情况下通常获得各自的L-对映异构体。
发酵中使用的微生物以本身已知的方式取决于所述微生物代谢产物,如下文所详细描述的。它们可以是天然来源或经遗传修饰的。合适的微生物和发酵方法的实例为下文表A中给出的那些:
表A:
物质 | 微生物 | 参考文献 |
酒石酸 | 乳杆菌属(Lactobacill)I(例如德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)) | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
衣康酸 | 土曲霉(Aspergillusterreus)、解乌头酸曲霉(Aspergillusitaconicus) | Jakubowska,in Smith and Pateman(Eds.),Genetics and Physiology of Aspergillus,London:Academic Press 1977;Miall,inRose(Ed.),Economic Microbiology,Vol.2,pp.47-119,London:Academic Press 1978;US 3044941(1962). |
琥珀酸 | 放线杆菌属130Z、Anaerobiospirillumsucciniproducens,Actinobacillussuccinogenes,大肠杆菌 | Int.J.Syst.Bacteriol.26,498-504(1976);EP 249773(1987),Inventors:Lemme andDatta;US 5504004(1996),Inventors:Guettler,Jain and Soni;Arch.Microbiol.167,332-342(1997);Guettler MV,RumlerD,Jain MK.,Actinobacillus succinogenessp.nov.,a novel succinic-acid-producingstrain from the bovine rumen.Int J SystBacteriol.1999 Jan;49 Pt 1:207-16;US5723322,US5573931,US5521075,WO99/06532,US5869301,US5770435 |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
乌头酸 | 黑曲霉(Aspergillusniger)、温特曲霉(Aspergilluswentii) | Crit.Rev.Biotechnol.3,331-373(1986);Food Biotechnol.7,221-234(1993);10,13-27(1996).;Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995; |
苹果酸 | 曲霉(Aspergilli),例如黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉、米曲霉,棒杆菌属 | US 3063910 |
葡糖酸 | 曲霉,例如黑曲霉 | Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
丁酸 | 梭状芽孢杆菌(例如Clostridiumacetobutlyicum,酪酸梭状芽孢杆菌(C.butyricum)) | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995; |
乳酸 | 乳杆菌,例如德氏乳杆菌、L.leichmannii | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995; |
赖氨酸 | 谷氨酸棒杆菌 | Ikeda,M.:Amino Acid Production Process |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. | ||
谷氨酸 | 谷氨酸棒杆菌 | Ikeda,M.:Amino Acid Production Process(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
甲硫氨酸 | 谷氨酸棒杆菌 | Ikeda,M.:Amino Acid Production Process(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
苯丙氨酸 | 谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌 | Trends Biotechnol.3,64-68(1985);J.Ferment.Bioeng.70,253-260(1990). |
苏氨酸 | 大肠杆菌 | Ikeda,M.:Amino Acid Production Process(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35. |
天冬氨酸 | 大肠杆菌 | Ikeda,M.:Amino Acid Production Process(2003),Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79,1-35 and references cited therein,Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973) |
嘌呤和嘧啶碱基 | 枯草芽孢杆菌 | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) | 枯草芽孢杆菌 | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,Noyes |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
Data Corporation(1973), | ||
腺苷-5’-单磷酸(AMP) | 枯草芽孢杆菌 | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
γ-亚麻酸 | 毛霉、Mortiella、曲霉属 | Gill,I.,Rao,V.:Polyunsaturated fatty acids,part 1:occurence,biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
二高-γ-亚麻酸 | Mortiella、耳霉属(Conidiobolus)、水霉属(Saprolegniaspp.) | Gill,I.,Rao,V.:Polyunsaturated fatfy acids,part 1:occurence,biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
花生四烯酸 | Mortiella、Phytium spp. | Gill,I.,Rao,V.:Polyunsaturated fatfy acids,part 1:occurence,biological activities andapplications(1997).Trends in |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
Biotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). | ||
二十碳五烯酸 | Mortiella、Phytium spp.、Rhodopseudomonas、水霉属 | Gill,I.,Rao,V.:Polyunsaturated fatfy acids,part 1:occurence,biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
二十二碳六烯酸 | 破囊壶菌(Thraustochytrium)、虫霉属(Entomophthora spp.)、Rhodopseudomonas、水霉属 | Gill,I.,Rao,V.:Polyunsaturated fatty acids,part 1:occurence,biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10),401-409;Zhu,H.:Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University,31.10.2002(URN etd-1111102-205855). |
丙二醇 | 大肠杆菌 | DE 3924423,US 440379,WO 9635799,US5164309 |
丁二醇 | 产气肠杆菌(Enterobacter | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995; |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
aerogenes)、枯草芽孢杆菌、催产克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca) | Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973),H.G.SCHLEGEL and H.W.JANNASCH,1981;Afschar et al.:Mikrobielle Produktion von2,3-Butandiol[Microbial production of2,3-butane diol.CIT 64(6),2004,570-571 | |
丁醇 | 梭状芽孢杆菌属(例如醋酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumacetobutylicum)、丙酸梭菌) | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
甘油 | 酵母、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii) | Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
甘露醇 | 曲霉、假丝酵母(Candida)、Torulopsismannito-faciens | Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
阿拉伯糖醇 | 鲁酵母、蜂蜜酵母(S.mellis)、Sclerotiumglucanicum、奥 | Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
核黄素 | 枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii) | WO 01/011052,DE 19840709,WO 98/29539,EP 1186664;Fujioka,K.:Newbiotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.FragranceJournal(2003),31(3),44-48. |
维生素B6 | 热带根瘤菌(Rhizobiumtropici)、苜蓿根瘤菌(R.meliloti) | EP0765939 |
酶类 | 曲霉(Aspergilli)(例如黑曲霉、米曲霉、木霉属(Trichoderma)、大肠杆菌、汉逊酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia)(例如巴斯德毕赤酵母(Pichiapastorius))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如地衣芽孢杆菌 | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌)和许多其它 | ||
玉米黄素 | Dunaliellasalina | Jin et al(2003)Biotech.Bioeng.81:115-124 |
角黄素 | 短杆菌属(Brevibacterium) | Nelis et al(1991)J Appl Bacteriol70:181-191 |
番茄红素 | 三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、Candida utilis | WO 03/056028,EP 01/201762,WO01/12832,WO 00/77234,Miura et al(1998)Appl Environ Microbiol64:1226-1229 |
β-胡萝卜素 | 三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、Candida utilis | Kim S.,Seo W.,Park Y.,Enhancedproduction of beta-carotene from Blakesleatrispora with Span 20,BiotechnologyLetters,Vol 19,No 6,1997,561-562;Mantouridou F.,Roukas T.:Effect of theaeration rate and agitation speed onbeta-carotene production and morphologyof Blakeslea trispora in a stirred tankreactor:mathematical modelling,Biochemical Engineering Journal 10(2002),123-135;WO 93/20183;WO 98/03480,Miura et al(1998)Appl Environ Microbiol |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
64:1226-1229 | ||
虾青素 | Phaffiarhodozyma;Candida utilis | US 5,599,711;WO 91/02060,Miura et al(1998)Appl Environ Microbiol64:1226-1229 |
聚羟链烷酸,聚酯 | 大肠杆菌、广泛产碱菌(Alcaligeneslatus)和许多其它 | S.Y.Lee,Plastic Bacteria,Progress andprospects for polyhydroxyalkanoateproduction in bacteria,Tibtech,Vol.14,(1996),pp.431-438.,Steinbüchel,2003;Steinbüchel(Ed.),Biopolymers,1st ed.,2003,Wiley-VCH,Weinheim and referencescited therein |
多糖 | 肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、L.dextranicum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)和许多其它 | Rehm,H.-J.:Biotechnology,Weinheim,VCH,1980 and 1993-1995;Gutcho,Chemicals by Fermentation,NoyesData Corporation(1973), |
聚类异戊二 | 乳菇属 | Steinbüchel(Ed.),Biopolymers,1st ed., |
物质 | 微生物 | 参考文献 |
苏云金素(Thuringensin) | 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis) | Jian-Zhong Jong et al.:Fed-batch culture ofBacillus thuringiensis for thuringensinproduction in a tower type bioreactor.Biotechnology and Bioengineering 48(3)(2004),207-213. |
聚酮化合物 | 弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)、纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum) | Kirst:Fermentation-derived compounds asa source for new products.Pure & Appl.Chem.70(2),(1998),335-338;Zirkle et al.:Heterologous production of the antifungalpolyketide antibiotic soraphen A ofSorangium cellulosum So ce26 inStreptomyces lividans.Microbiology 150(8),(2004),2761-74. |
赤霉酸 | Gibberellafujikuroi | Hollmann et al.:Extractive fermentation ofGibberellic acid using Gibberella fujikuroi.CIT 7(1995),892-895. |
靛蓝 | 大肠杆菌JB102 | Berry,A.,Dodge,T.C.,Pepsin,M.,Weyler,W.:Application of metabolic engineering toimprove both the production and use ofbiotech indigo.Journal of IndustrialMicrobiology & Biotechnology 28(2002),127-133. |
在本发明优选的实施方案中,被产生的有机化合物选自任选地连接有羟基并具有3到10个碳原子的单羧酸、二羧酸和三羧酸、产蛋白质的和不产蛋白质的氨基酸、嘌呤碱基、嘧啶碱基;核苷、核苷酸、脂类;饱和和不饱和的脂肪酸;具有4到10个碳原子的二元醇、具有3个或更多羟基的多元醇、具有至少4个碳原子的长链醇、糖类、芳香族化合物、维生素、维生素原、辅因子、营养药、蛋白质、类胡萝卜素、具有3到10个碳原子的酮、内酯、生物聚合物和环糊精。
本发明第一个优选的实施方案涉及可以根据本发明获得的含糖液体培养基用于发酵产生酶的用途,所述酶是例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶或葡聚糖酶。
本发明第二个优选的实施方案涉及可以根据本发明获得的含糖液体培养基用于发酵产生氨基酸的用途,所述氨基酸是如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸。
本发明另一优选的实施方案涉及可以根据本发明获得的含糖液体培养基用于发酵产生维生素的用途,所述维生素是如泛酸和核黄素,及其前体和衍生物。
本发明的其他进一步优选的实施方案涉及根据本发明可以得到的含糖液体培养基在下列化合物的发酵生产中的用途:
-具有3到10个碳原子的单和二羧酸,尤其脂肪族单、二和三羧酸,例如丙酸、延胡索酸和琥珀酸;
-具有3到10个C原子的脂肪族羟基羧酸,例如乳酸;
-如上所述的长链链烷醇,尤其是具有4到10个C原子的链烷醇,例如丁醇;
-如上所述的二元醇,尤其是具有3到10个、尤其是3到8个C原子的链烷二醇,例如丙二醇;
-如上所述的酮,尤其是具有3到10个C原子的酮,例如丙酮;和
-如上所述的糖类,尤其是二糖,如海藻糖。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是聚羟链烷酸,例如聚-3-羟基丁酸和与其它有机羟基羧酸的共聚多酯,所述其它有机羟基羧酸例如3-羟基戊酸、4-羟基丁酸和描述于Steinbüchel(上文所述)中的其它有机羟基羧酸,包括例如长链(也称作较长链)的羟基羧酸,如3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十四烷酸及其混合物。为了进行发酵,可以使用已经例如在S.Y.Lee,Plastic Bacteria Progress and prospects forpolyhydroxyalkanoate production in bacteria,Tibtech,Vol.14,(1996),pp.431-438中描述用于其它碳原料的类似条件和步骤。
在优选的实施方案中,可用于发酵的微生物因此选自天然或重组的微生物,所述微生物过量产生至少一种以下的代谢产物:
-酶,例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶或葡聚糖酶;
-氨基酸,例如赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸;
-维生素,例如泛酸和核黄素;和它们的前体和/或衍生物;
-二糖,如海藻糖;
-具有3到10个碳原子的脂肪族单和二羧酸,例如丙酸、延胡索酸和琥珀酸;
-具有3到10个C原子的脂肪族羟基羧酸,例如乳酸;
-聚羟链烷酸,例如聚-3-羟基丁酸和3-羟基丁酸的共聚多酯;
-具有3到10个C原子的酮,例如丙酮;
-具有4到10个C原子的链烷醇,例如丁醇;和
-具有3到8个C原子的链烷二醇,例如丙二醇。
合适的微生物通常选自棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、阿舒囊霉属(Ashbya)、埃希氏菌属(Escherichia)、曲霉属(Aspergillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、放线杆菌属(Actinobacillus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、根霉属(Rhizopus)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium),尤其是选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillus niger)或广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、Anaerobiospirillum succiniproducens、Actinobacillus succinogenes、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrückii)、Lactobacillus leichmannii、阿拉伯糖丙酸杆菌(Propionibacterium arabinosum)、Propionibacterium schermanii、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)、蚁酸乙酸梭菌(Clostridium formicoaceticum)、醋酪酸梭状芽孢杆菌、少根根霉(Rhizopus arrhizus)和米根霉(Rhizopus oryzae)。
在优选的实施方案中,发酵中使用的微生物是棒杆菌属的菌株,尤其是谷氨酸棒杆菌的菌株。过量产生氨基酸,特别是赖氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸的尤其是棒杆菌属的菌株,特别是谷氨酸棒杆菌的菌株。
在另一优选的实施方案中,发酵中使用的微生物是埃希氏菌属,尤其是大肠杆菌。其尤其是过量产生氨基酸(特别是赖氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸)的埃希氏菌属菌株,特别是大肠杆菌。
在特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是赖氨酸。为了进行发酵,可以使用已经针对其它碳原料描述的类似条件和步骤,例如在上文所述的Pfefferle等和US 3,708,395中所描述。原则上,连续和不连续(分批或补料分批)的操作模式都是合适的,优选补料分批模式。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是甲硫氨酸。为了进行发酵,可使用针对其它碳原料描述的类似条件和步骤,例如WO 03/087386和WO 03/100072中所述。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是泛酸。为了进行发酵,可使用例如WO 01/021772中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是核黄素。为了进行发酵,可使用例如WO 01/011052、DE 19840709、WO98/29539、EP 1 186 664和Fujioka,K.:New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.Fragrance Journal(2003),31(3),44-48中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是延胡索酸。为了进行发酵,可使用例如Rhodes et al,Production of FumaricAcid in 20-L Fermentors,Applied Microbiology,1962,10(1),9-15中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是琥珀酸。为了进行发酵,可使用例如Int.J.Syst.Bacteriol.26,498-504(1976);EP 249773(1987),Lemme & Datta;US 5504004(1996),Guettler,Jain & Soni;Arch.Microbiol.167,332-342(1997);Guettler MV,RumlerD,Jain MK.,Actinobacillus succinogenes sp.nov.,a novelsuccinic-acid-producing strain from the bovine rumen.Int J Syst Bacteriol.1999 Jan;49 Pt 1:207-16;US 5,723,322,US 5,573,931、US 5,521,075、WO99/06532、US 5,869,301或US 5,770,435中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物是肌醇六磷酸酶。为了进行发酵,可使用例如WO 98/55599中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
发酵产生发酵液,所述发酵液除了所期望的微生物代谢产物外,主要含有发酵中产生的生物量、糖化的淀粉溶液的未代谢的组分,和尤其是淀粉原料的非淀粉固体组分,例如纤维和未利用的糖,以及未利用的缓冲液和营养盐。在本申请中,该液体培养基也称作发酵液,术语发酵液也包含(含糖)液体培养基,其中存在的糖仅进行部分或不完全的发酵转化,即其中发生可利用的糖(例如单糖和二糖)的部分或不完全的微生物代谢。
在分离或耗尽微生物代谢产物之前或去除发酵液的挥发性组分之前,可以以上述方式进行灭菌步骤。
本发明的特定实施方案涉及方法,该方法中至少一种微生物代谢产物被从发酵液中耗尽或分离。随后去除发酵液的大部分挥发性组分,得到固体或半固体蛋白质组合物。进行这类耗尽的更详细描述,以及获得的蛋白质组合物的更纤细描述是本申请公司的WO 2005/116228(PCT/EP2005/005728)的主题,其涉及进一步的细节。
从发酵液中分离或耗尽代谢产物,即具有至少3个C原子或至少2个C原子和至少1个N原子的有机化合物(下文中也称作价值产物)通常以下述方式进行:至少一种代谢产物被从发酵液中耗尽或分离,使得发酵液中该代谢产物的含量维持在按重量计不多于20%、尤其是按重量计不多于10%、特别是按重量计不多于5%、非常特别地按重量计不多于2.5%,每种情况下以剩余的发酵液总重为基础。
微生物代谢产物可以在一个或多个步骤中从发酵液中被分离或耗尽。该上下文中的一个关键步骤是从发酵液中去除固体组分。这可以在分离价值产物之前或之后进行。本领域常规使用的方法(其也包括用于粗清洁和精纯化价值产物的步骤和用于配制的步骤)是已知用于分离价值产物和用于去除固体的,即固液相分离(例如描述于Belter,P.A,Bioseparations:Downstream Processing for Biotechnology,John Wiley & Sons(1988),和Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,第五版CD-ROM上,Wiley-VCH)。
为了分离价值产物,随后可有利地进行一个步骤,其中首先例如借助于离心或过滤将固体组分从发酵液中去除,随后例如通过结晶、沉淀、吸附或蒸馏将价值产物从液相中分离。或者,价值产物也可以通过例如使用层析方法或萃取方法从发酵液中直接分离。必须提到的层析方法尤其是离子交换层析,其中价值产物可以在层析柱上选择性地被分离。在该情况下,例如通过倾析、蒸发和/或干燥有利地从剩余的发酵液中去除固体。
在挥发性或油性化合物的情况下,通常必须在加工期间、尤其在干燥期间监测最大温度。也可以通过将其配制在吸附剂上的假固体形式中有利地制备这些化合物。适用于该目的的吸附剂详细地描述于例如本申请公司的WO 2005/116228(PCT/EP2005/005728)中。可以有利地以这种方式制备的化合物的实例为γ-亚麻酸、二高-γ亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇和丙酮。就本发明的目的而言,假固体制剂中的这些化合物也被理解为固体形式的非挥发性微生物代谢产物。
另一特定实施方案涉及一种方法,其中发酵液的挥发性组分大部分或完全被去除,而之前不分离或耗尽非挥发性微生物代谢产物,并且如果适当的话,之前不去除至少一些固体组分,得到非挥发性微生物代谢产物的固体制剂。进行这类方法的更详细的描述可见于本申请公司的PCT/EP2006/066057(较早专利申请为DE 102005042541.0)。
“大部分”表示一旦挥发性组分被去除,固体或至少半固体的残余物如果适当的话可以通过添加固体被转化为固体产物。通常,这表示挥发性组分的去除低至按重量计不多于30%、通常按重量计不多于20%、尤其是按重量计不多于15%的残余水分含量。通常,发酵液的挥发性组分会有利地从发酵液中去除,低至按重量计0.2%到30%、优选按重量计1%到20%、特别优选按重量计2%到15%、非常特别优选按重量计5%到15%范围内的残余水分含量,其以干燥后测定的固体组分的总重为基础。可以通过技术人员熟悉的常规方法测定残余的水分含量,例如借助于热重量分析法(Hemminger等,Methoden der thermischen Analyse[Methods of thermalanalysis],Springer Verlag,Berlin,Heidelberg,1989)。
以固体形式从发酵液中获得不挥发代谢产物可以在一个、两个或更多步骤中,尤其是在一步或两步的操作中达成。通常,用于以固体形式获得代谢产物的至少一个步骤,尤其是最终步骤应包括干燥步骤。
在一步操作中,发酵液的挥发性组分会被去除,如果适当的话在前述初步去除之后,直到达到期望的残余水分含量。
在两步或多步操作中,应首先例如通过过滤(微量过滤、超滤)浓缩发酵液,或通过蒸发一部分挥发性组分热浓缩发酵液。在该步骤中被去除的挥发性组分的量通常总计为按重量计10%到80%、尤其是按重量计20%到70%,所述量以发酵液的挥发性组分的干重为基础。在一个或多个步骤随后的中,发酵液的残余的挥发性组分被去除,直到达到期望的残余水分含量。
根据该实施方案,挥发性组分基本上被从液体培养基中去除,不事先耗尽或事实上分离价值产物。因此,当去除发酵液的挥发性组分时,非挥发性代谢产物基本上不与液体培养基的挥发性组分一起被去除,而是与来自发酵液的至少一部分、通常大部分和尤其是所有的其它固体组分一起保留在得到的残余物中。然而,因此可能在去除发酵液的挥发性组分时与其一起去除一定量(优选小量)的期望的非挥发性微生物代谢产物,通常按重量计不多于20%、例如按重量计0.1%到20%,优选不多于10%、尤其按重量计不多于5%、特别优选按重量计不多于2.5%、非常特别优选按重量计不多于1%,所述用量以代谢产物的总干重为基础。在非常特别优选的实施方案中,期望的不挥发微生物代谢产物作为混合物中的固体,维持为按重量计至少90%、尤其是按重量计至少95%、特别是按重量计至少99%、非常特别是按重量计约100%,每种情况以代谢产物总干重为基础,所述混合物是与去除挥发性组分后获得的发酵培养基的固体组分部分的混合物,或者是与发酵培养基的所有固体组分的混合物。
如果期望的话,可以在去除挥发性组分前,例如借助于离心或过滤将一部分非淀粉固体组分从发酵液中分离,所述部分例如为按重量计5%到80%,尤其是按重量计30%到70%。如果适当的话应进行这类初步分离,从而去除粗固体颗粒,所述颗粒不包含或仅包含小量的非挥发性微生物代谢产物。该初步过滤可以使用技术人员已知的常规方法进行,例如使用粗筛、网、穿孔板(perforated orifice plates)等。如果适当的话,也可以在离心力分离器中分离粗固体颗粒。此处使用的仪器如倾析器、离心机、sedicanters和分离器也是技术人员已知的。以此种方式获得固体或半固体的(例如糊状的)残余物,所述残余物包含非挥发性代谢产物和淀粉原料的非挥发性、通常是固体的、非淀粉的组分或其至少一大部分,通常按重量计至少90%或所有的固体非淀粉组分。
与发酵的固体组分一起存在的干的代谢产物的特性可以通过添加配制辅料(如载体和包衣材料、粘合剂和其它添加剂),以本身已知的方式,特别是根据多种参数配制,所述参数如活性物质含量、颗粒尺寸、颗粒形状、成尘趋势、吸湿性、稳定性尤其是储存稳定性、颜色、气味、流动行为、团聚趋势、静电荷、对光和温度的敏感性、机械稳定性和再分散性。
常规使用的配制辅料包括例如粘合剂、载体材料、成粉/流动佐剂,另外有色素、杀生物剂、分散剂、消泡剂、粘度调节剂、酸、碱、抗氧化剂、酶稳定剂、酶抑制剂、吸附剂、脂肪、脂肪酸、油或这些的混合物。这类配方辅料有利地作为干燥助剂使用,尤其是使用例如喷雾干燥、流化床干燥和冷冻干燥的配制和干燥方法时。进一步的细节可见于PCT/EP2006/066057(较早申请DE 102005042541.0)。
上述添加剂和适当时其它添加剂(如包衣材料)的用量可显著变化,取决于所述代谢产物的特定要求和使用的添加剂的特征,并可以例如在按重量计0.1%到80%的范围内,尤其是按重量计从1%到30%的范围内,各情况下以完成配制形式的产物或物质混合物的总重为基础。
配制辅料的添加可以在加工发酵液(也称作产物配制或固体设计)之前、期间或之后进行,尤其是在干燥期间进行。在加工发酵液或代谢产物之前添加配制辅料可以是有利的,尤其是对促进要加工的物质或产物的可加工性是有利的。配制辅料可以添加至固体形式获得的代谢产物中,或添加至含有代谢产物的溶液或悬浮液中,例如在发酵完成后直接添加进发酵液中或在加工期间和最后的干燥步骤之前添加进获得的溶液或悬浮液中。
因此,例如辅料可以与微生物代谢产物的悬浮液混合;这类悬浮液也可以例如通过喷雾或混合应用于载体材料。在干燥期间添加配制辅料可以是重要的,例如当包含代谢产物的溶液或悬浮液被喷雾时。配制辅料的添加尤其是在干燥后进行,例如当对干燥的颗粒应用包衣/包衣层时。也可以在干燥后和任选的包衣步骤后对产物应用其它辅料。
从发酵液中去除挥发性组分以本身已知的方式、通过用于将固相从液相中分离的常规方法进行,所述方法包括过滤方法和蒸发液相的挥发性组分的方法。这类方法(其也可以包含用于粗清洁价值产物的步骤和配制步骤)描述于例如Belter,P.A,Bioseparations:Downstream Processing forBiotechnology,John Wiley & Sons(1988)和Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry,5th ed.on CD-ROM,Wiley-VCH中。发酵结束后产物配制或加工的范围内可以使用的、技术人员已知的方法、仪器、辅料和一般或特定的实施方案进一步描述于EP 1038 527、EP 0648 076、EP835613、EP 0219 276、EP 0394 022、EP 0547 422、EP 1088 486、WO98/55599、EP 0758 018和WO 92/12645中。
在该实施方案的一个变型中,非挥发性微生物代谢产物如果以溶解的形式存在于液相中,将例如通过结晶或沉淀从液相中转化进入固相中。此后,非挥发性固体组分(包括代谢产物)例如借助于离心、倾析或过滤被分离。油性代谢产物也可以以类似的方式被分离,所述油性发酵产物通过添加吸附剂(例如二氧化硅、硅胶、壤土、粘土和活性炭)被转化成为固体形式。
在该实施方案的第二个变型中,挥发性组分通过蒸发被去除。蒸发可以以本身已知的方式进行。用于蒸发挥发性组分的合适方法的实例是喷雾干燥、流化床干燥或流化床团聚、冷冻干燥、气流干燥器(pneumatic driers)和接触干燥器,以及挤压干燥。也可以进行上述方法与形状赋予方法(shape-imparting method,例如挤压、造粒(pelleting)或成球(prilling))的组合。在这些最后提到的方法中,优选部分或主要地使用含预干燥的代谢产物的物质混合物。
在优选的实施方案中,发酵液的挥发性组分的去除包括喷雾干燥方法或流化床干燥方法,包括流化床颗粒化。为此,如果适当的话在初步分离以去除粗固体颗粒(其仅包含小量的不挥发微生物代谢产物,如果有的话)后,将发酵液补料进一个或多个喷雾干燥或流化床干燥装置中。固体负荷的发酵液的运输或补料方便地借助于常规运输设备进行,所述设备用于含固体的液体,例如泵,如偏心单转子螺旋泵(例如来自于Delasco PCM)或高压泵(例如来自于LEWA Herbert Ott GmbH)。
发酵也可以以如下方式进行:
(i)将以总重为基础按重量计不多于50%、例如按重量计在5%到45%范围内的一部分从在步骤a2)中获得的液体培养基(1)或其与另一糖原料的混合物中去除,并将剩余部分(如果合适,与上文定义的另一糖原料一起)提供给用于产生第一种代谢产物(A)的发酵,例如固体形式的不挥发代谢产物(A)或挥发性代谢产物(A);和
(ii)如果适当的话,在先前去除了淀粉原料的所有或一些非淀粉固体组分之后,将该被去除的部分(如果合适,与如上文定义的另一糖原料一起)提供给用于产生第二种代谢产物(B)的发酵,所述第二种代谢产物与代谢产物(A)相同或不同。
如果(ii)的非淀粉固体组分被分离,则液体培养基剩余部分的固体含量总计为优选按重量计不多于50%、尤其是按重量计不多于30%、特别优选按重量计不多于10%、非常特别优选按重量计不多于5%。在这类情况下,尤其优选在用于产生第二种代谢产物(B)的发酵之前分离所有的固体。
该步骤使得可能在(ii)的独立发酵中使用下述微生物,所述微生物的某些最小需要(例如关于输氧率)必须被满足。用于(ii)的独立发酵中的合适微生物是例如芽孢杆菌物种,优选枯草芽孢杆菌。由这类微生物在独立发酵中产生的化合物尤其选自维生素、辅因子和营养药、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸、脂类、饱和和不饱和的脂肪酸、芳香族化合物、蛋白质、类胡萝卜素,特别是选自维生素、辅因子和营养药、蛋白质和类胡萝卜素,非常特别选自核黄素和泛酸钙。
该步骤的优选的实施方案涉及在两个独立的发酵中平行产生相同的代谢产物(A)和(B)。这是有利的,尤其是相同的代谢产物的不同应用具有不同的纯度要求时。因此,使用含固体的发酵液产生第一种代谢产物(A),例如要用作饲料添加剂的氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或谷氨酸);而使用(ii)的固体被耗尽的发酵液产生相同的第二种代谢产物(B),例如要用作食物添加剂的相同氨基酸。由于非淀粉固体组分的完全或部分去除,加工代谢产物时纯化的复杂性可以被降低,所述代谢产物的应用领域具有更高的纯度要求,例如作为食品添加剂。
在另一优选的实施方案中,该步骤可以例如如下进行。用于产生代谢产物A(例如氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸或苏氨酸)或柠檬酸或乙醇优选的大体积发酵例如根据WO 2005/116228(PCT/EP2005/005728)或PCT/EP2006/066057(较早申请DE 102005042541.0)、或根据已知的生物乙醇发酵生产的现有技术实现(见上文)。根据(i),去除在步骤a2)中获得的一些液体培养基(1)或除去其与所述另一糖原料的混合物。根据(i)被去除的部分可以通过常规方法根据(ii)完全或部分没有固体,所述常规方法例如离心或过滤,取决于发酵产生B的需要。以此种方式获得的液体培养基(1)(如果合适与上文定义的另一糖原料一起)根据(ii)被喂饲给用于产生代谢产物B的发酵中,所述液体培养基(1)任选全部或部分地没有固体。根据(ii)分离的固体流被有利地返回大体积发酵的含糖液体培养基的流中。
如果在大体积发酵中产生的微生物代谢产物(A)是乙醇,将其从液体培养基(1)回收。液体培养基(1)现在将具有乙醇(生物乙醇)的发酵产生中常规的糖浓度,例如按重量计从20%到30%的范围内。通常,步骤(1)中得到的含糖液体培养基(1)的剩余物在该程序中被提供给发酵以产生A(即,在该情况中为乙醇)。如果合适,在根据步骤(ii)除去固体后,将步骤(1)中除去的含糖液体培养基(1)的部分与另一糖原料一起提供给B的发酵生产。
在上述步骤的另一优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物B是核黄素。为了进行发酵,可以使用例如WO 01/011052、DE19840709、WO 98/29539、EP 1186664和Fujioka,K.:New biotechnologyfor riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin.FragranceJournal(2003),31(3),44-48中针对其他碳原料描述的类似条件和步骤。
为了进行该方法的变型,如上所述进行优选的大体积发酵用于产生代谢产物A,例如氨基酸如赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸,或柠檬酸或乙醇。根据(i),在步骤a2)中获得的含糖液体培养基的一些通过常规方法被去除并根据(ii)被完全或部分地没有固体,所述常规方法例如为离心或过滤。从中获得的几乎完全或部分地没有固体的含糖液体培养基根据(ii)在加入另一糖原料后被提供给用于产生代谢产物B的发酵中,所述代谢产物B在本情况下为核黄素。根据(ii)分离的固体流被有利地返回大体积发酵的含糖液体培养基的流中。
如此根据(ii)产生的含核黄素的发酵液可以例如通过DE 4037441、EP464582、EP 438767和DE 3819745中针对其他碳原料描述的类似条件和步骤加工。在细胞量裂解之后,将以结晶形式存在的核黄素被分离,优选通过倾析分离。分离固体的其他途径(例如过滤)也是可能的。此后优选借助于喷雾干燥器和流化床干燥器干燥核黄素。或者,可以通过例如EP1048668和EP 730034中描述的类似条件和使用类似步骤加工根据(ii)产生的含核黄素的发酵混合物。巴氏消毒后,离心发酵液并用无机酸处理剩余的含固体级分。通过离心将形成的核黄素从水性酸性培养基中去除、洗涤,如果适当的话随后干燥。
在该步骤的另一优选的实施方案中,由微生物在发酵中产生的代谢产物B为泛酸。为了进行发酵,可以使用例如WO 01/021772中针对其他碳原料描述的类似条件和步骤。
为了进行该步骤变型,可以随后进行如上针对核黄素所述的步骤。将已经根据i)进行初步纯化并优选基本不含固体的含糖液体培养基(1)或其与所述另一糖原料的混合物提供给用于产生泛酸的根据ii)的发酵中。此处,与含固体的液体培养基相比粘度被降低的事实是尤其有利的。独立的固体流优选被返回大体积发酵的含糖液体培养基的流中。
根据(ii)产生的含泛酸发酵液可以通过例如EP 1 050 219和WO01/83799中针对其他碳原料描述的类似条件和使用类似步骤加工。当所有的发酵液被巴氏消毒后,例如通过离心或过滤分离剩余的固体。在该固体分离步骤中得到的澄清流出液被部分蒸发,如果适当的话用氯化钙处理并干燥,尤其是喷雾干燥。
已经被分离的固体可以与平行的大体积发酵方法范围内各自期望的微生物代谢产物(A)一起获得。
干燥和/或配制步骤后,可以向产物制剂或蛋白质组合物中添加完整的或碾碎的谷物仁,优选玉米、小麦、大麦、粟、黑小麦和/或黑麦。
以下的实施例旨在阐述本发明的各方面,但是不应以任何方式被理解为限制。
实施例
I.碾磨淀粉原料
如下产生本文下文中使用的碾磨产物。使用转子磨将完整的玉米仁充分磨碎。使用不同的打浆机、碾磨途径或筛选元件,得到三种不同的精细程度。借助于实验室振动筛(振动分析仪:Retsch Vibrotronic VE1型,筛分时间5分钟,振幅:1.5mm)对碾磨产物进行的筛选分析得到表I中所列的结果。
表I
实验编号 | T 70/03 | T 71/03 | T 72/03 |
<2mm/% | 99.4 | 100 | 100 |
<0.8mm/% | 66 | 100 | 99 |
<0.63mm/% | 58.6 | 98.5 | 91 |
<0.315mm/% | 48.8 | 89 | 65 |
<0.1mm/% | 25 | 9.6 | |
<0.04mm/% | 8 | 3.2 | |
碾磨产物总量 | 20kg | 11.45kg | 13.75kg |
II.淀粉的酶促液化和淀粉糖化
II.1.糖化步骤中没有肌醇六磷酸酶
II.1a)淀粉的酶促液化
将320g干磨的玉米粉(T71/03)悬浮于480g水中并与310g氯化钠通过连续搅拌混合。在整个实验中持续搅拌。用H2SO4将pH调节至6.5并将混合物加热至35℃后,添加2.4g L型Termamyl 120L(Novozymes A/S)。在40分钟的进程中,将反应混合物加热至86.5℃的温度,如果必要的话用NaOH将pH再调节至上述值。在30分钟内,再添加400g干磨的玉米粉(T71/03),期间将温度提高到91℃。将反应混合物在该温度保持约100分钟。随后再添加2.4g的Termamyl 120L并将温度维持约100分钟。使用碘-淀粉反应在实验期间监测液化的进程。最终将温度提高到100℃并将反应混合物煮沸20分钟。在该时间点中,不再能够检测到淀粉。将反应器冷却至35℃。
II.1b)糖化
持续搅拌下将II.1a)中得到的反应混合物加热到61℃。在整个实验中持续搅拌。用H2SO4使pH达到4.3后,加入10.8g(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。保持温度约3小时,在该期间内用葡萄糖试纸(Boehringer的S-Glucotest)监测反应的进展。结果在下面的表II中列出。随后将反应混合物加热到80℃,然后冷却。这得到约1180g液体产物,密度为约1.2kg/l,通过红外干燥器测定的干物质含量达到按重量计约53.7%。用水洗涤后,得到按重量计约14%的干物质含量(没有水溶性成分)。如通过HPLC测定的反应混合物的葡萄糖含量达到380g/l(见表2,样品号7)。
表II
样品号 | 分钟(从葡糖淀粉酶的加入开始) | 上清液中的葡萄糖浓度[g/l] |
1 | 5 | 135 |
2 | 45 | 303 |
3 | 115 | 331 |
4 | 135 | 334 |
5 | 165 | 340 |
6 | 195 | 359 |
7 | 225 | 380 |
II.2.在糖化步骤中使用肌醇六磷酸酶
II.2a)淀粉液化
如II.1a)中所述将干磨的玉米粉样品液化。
II.2b)糖化
恒定搅拌下将II.2a)中得到的反应混合物加入到61℃。在整个反应期间持续搅拌。用H2SO4使pH达到4.3后,加入10.8g(9.15ml)Dextrozyme GA(Novozymes A/S)和70μl肌醇六磷酸酶(700单位肌醇六磷酸酶,NatuphytLiquid 10 000L,来自BASF AG)。保持温度约3小时,在该期间内用葡萄糖试纸(Boehringer的S-Glucotest)监测反应的进展。随后将反应混合物加热到80℃,然后冷却。通过红外干燥器得到产物并将其用水洗涤。通过HPLC测定反应混合物的葡萄糖含量。
II.3用于淀粉的酶促液化和糖化的其它方案
II.3a)玉米粉
向反应容器中引入360g去离子水。向醪液中添加1.54ml的CaCl2储存液(100g CaCl2×2H2O/l)至约70ppm Ca2+的终浓度。向水中缓慢加入240g玉米粉,持续搅拌。用按重量计50%强度的NaOH水溶液将pH调节至6.5后,加入4.0ml(=按重量计2%酶/干物质)的L型Termamyl 120L(Novozymes A/S)。然后将醪液(slurry)快速加热至85℃。在该过程中,持续监测并在适当时调节pH。
达到最终温度后,添加更多粉,最初添加50g粉。另外,向醪液中添加0.13ml的CaCl2储存液,从而将Ca2+浓度维持在70ppm。添加中将温度保持在恒定85℃。允许经过至少10分钟以确保在另一部分(50g粉和0.13ml的CaCl2储存液)之前完全反应。添加两部分后,添加1.67ml Termamyl;之后再添加两部分(每次50g粉和0.13ml的CaCl2储存液)。获得按重量计55%的干物质含量。添加后将温度提高到100℃,并将醪液煮沸10分钟。
取样并冷却至室温。用去离子水稀释样品(约1∶10)后,加入一滴浓鲁戈碘溶液(每升5g碘和10g碘化钾的混合物)。浓蓝色指出存在残余的淀粉;当所有的淀粉都被水解时观察到棕色。当测试指出存在一部分残余的淀粉时,将温度再次降低至85℃并保持恒定。再添加1.67ml的Termamyl直到碘-淀粉反应呈阴性。
对于随后的糖化反应,使混合物(对于淀粉测试为阴性)达到61℃。通过加入50%浓度的硫酸使pH达到4.3。在反应过程中,使pH保持在该值。温度保持在61℃。加入5.74ml(=1.5%重量的酶/干物质)Dextrozym GA(Novozymes A/S)以便将液化的淀粉转化为葡萄糖。允许反应进行1小时。为了失活酶,在85℃加热混合物。将热的混合物装入无菌容器中,将其冷却并在4℃保存。得到420g/l的最终葡萄糖浓度。
II.3b)黑麦粉(包括用纤维素酶/半纤维素酶预处理)
向反应容器中引入360g去离子水。向水中缓慢加入155g黑麦粉,持续搅拌。将温度维持在恒定50℃。用按重量计50%强度的NaOH水溶液将pH调节至5.5后,加入3.21ml(=按重量计2.5%酶/干物质)的ViscozymeL(Novozymes A/S)。30分钟后再添加粉,最初添加55g粉。再过30分钟后,再添加50g粉;30分钟后,再添加40g粉。最后的添加后30分钟,可以开始液化。
添加1.7ml的CaCl2储存液(100g CaCl2×2H2O/l)。用按重量计50%的NaOH水溶液将pH调节至6.5后,加入5.0ml(=按重量计2%酶/干物质)的L型Termamyl 120L(Novozymes A/S)。然后将醪液快速加热至85℃。在该过程中,持续监测并在适当时调节pH。
达到最终温度后,添加更多粉,最初添加60g粉。另外,向醪液中添加0.13ml的CaCl2储存液,从而将Ca2+浓度维持在70ppm。添加中将温度保持在恒定85℃。允许经过至少10分钟以确保在另一部分(40g粉和0.1ml的CaCl2储存液)之前完全反应。添加1.1ml的Termamyl;随后再添加一部分(40g粉和0.1ml的CaCl2储存液)。达到按重量计55%的干物质含量。添加后将温度提高到100℃,并将醪液煮沸10分钟。
取样并冷却至室温。用去离子水稀释样品(约1∶10)后,加入一滴浓鲁戈溶液(每升5g碘和10g碘化钾的混合物)。浓蓝色指出存在残余的淀粉;当所有的淀粉都被水解时观察到棕色。当测试指出存在一部分残余的淀粉时,将温度再次降低至85℃并保持恒定。再添加1.1ml的Termamyl直到碘-淀粉反应呈阴性。
对于随后的糖化反应,使混合物(对于淀粉测试为阴性)达到61℃。通过加入50%浓度的硫酸使pH达到4.3。在反应过程中,使pH保持在该值。
温度保持在61℃。加入5.74ml(=1.5%重量的酶/干物质)Dextrozym GA(Novozymes A/S)以便将液化的淀粉转化为葡萄糖。允许反应进行1小时。为了失活酶,在85℃加热混合物。将热的混合物装入无菌容器中,将其冷却并在4℃保存。得到370g/l的最终葡萄糖浓度。
II.3c)小麦粉(包括用木聚糖酶预处理)
将360g去离子水导入反应容器中。在55℃加热水,并用按重量计50%浓度的NaOH水溶液调节pH到6.0。调节温度和pH后,加入3.21ml(=2.5%按重量计酶/干物质)Shearzyme 500L(Novozymes A/S)。恒定搅拌下,155g小麦粉缓慢流入溶液中。温度和pH保持恒定。30分钟后,加入另一粉,55g粉为最初加入的。再过30分钟后,加入另一50g粉;30分钟后,加入另外的40g粉,最后加入后30分钟,可以开始液化。
如II.3b中所述的进行液化和糖化。得到400g/l最终葡萄糖浓度。
III.菌株ATCC13032lysCfbr
在下面的一些实施例中,使用改良的谷氨酸棒杆菌菌株,其在WO05/059144中以名称ATCC13032lysCfbr描述。
实施例1
在每种情况中,如下文1)中所述的制备玉米、小麦和黑麦粉水解产物。通过加入多种糖溶液(包含葡萄糖、粗糖、糖蜜)增加这些培养基的每一种中的总糖含量。在摇瓶实验中使用培养基,使用谷氨酸棒杆菌(ATCC13032lysCfbr)和芽孢杆菌PA824(在WO 02/061108中详细描述)作为碳原料。
1)粉水解产物的制备
a)玉米粉水解产物
将360g去离子水导入反应容器中。恒定搅拌下,155g玉米粉缓慢流入水中。
-液化
用按重量计50%浓度的NaOH水溶液将pH调节到5.8后,加入2.6ml(=按重量计2%的酶/干物质)Liquozyme SC(来自Novozymes A/S)。然后快速加热浆液至10℃并沸腾10分钟。在该过程中,不断监测pH并且,如果适宜,调节pH。
取样品并冷却到室温。用去离子水稀释样品(约1∶10)后,加入1滴浓鲁戈溶液(每升5g碘和10g碘化钾的混合物)。强烈的蓝色表明存在残留淀粉;当所有淀粉都被水解时,观察到褐色。
-糖化作用
对于随后的糖化反应,使淀粉测试为阴性的混合物达到61℃。通过加入50%浓度的硫酸使pH达到4.3。在反应过程中,pH保持在该值。温度保持在61℃。加入2.0ml(=按重量计的1.5%酶/干物质)的Dextrozym GA(Novozymes A/S)以便将液化的淀粉转化为葡萄糖。允许反应进行1小时。为了失活酶,在85℃加热混合物。将热混合物装入无菌容器中,将其冷却并在4℃保存。
b)小麦粉水解产物
-木聚糖酶预处理
将360g去离子水导入反应容器中。在55℃加热水,并用按重量计50%浓度的NaOH水溶液调节pH到6.0。调节温度和pH后,加入3.21ml(=2.5%按重量计酶/干物质)Shearzyme 500L(Novozymes A/S)。恒定搅拌下,155g小麦粉缓慢流入溶液中。温度和pH保持恒定。最后加入后30分钟,可以开始液化。
如1a)中所述的进行液化和糖化作用。
c)黑麦粉水解产物
用纤维素酶/半纤维素酶预处理
将360g去离子水导入反应容器中。恒定搅拌下,155g黑麦粉缓慢流入水中。温度和pH保持恒定在50℃。用按重量计50%浓度的硫酸使pH达到5.5后,加入3.21ml(=按重量计2.5%酶/干物质)Viscozyme L(Novozymes A/S)。最后加入后30分钟,可以开始液化。
如1a)中所述的进行液化和糖化作用。
2)接种物的制备
a)对于谷氨酸棒杆菌
将细胞在无菌CM+CaAc琼脂(组成:见表1;121℃下20分钟)上划线并在30℃过夜培育。随后从平板刮除细胞并重悬浮在盐水中。将装备两个挡板的250ml锥形瓶中25ml培养基(见表4)在每种情况下用一定量的所制备的细胞悬浮液接种使得在610nm下的光密度达到OD610值为0.5。
表1:CM+CaAc琼脂板的组成
浓度 | 成分 |
10.0g/l | D-葡萄糖 |
2.5g/l | NaCl |
2.0g/l | 尿素 |
5.0g/l | Bacto蛋白胨(Difco) |
5.0g/l | 酵母提取物(Difco) |
5.0g/l | 牛肉膏(Difco) |
20.0g/l | 酪蛋白氨基酸 |
20.0g/l | 琼脂 |
b)对于芽孢杆菌
将装备两个挡板的250ml锥形瓶中的42ml预培养培养基(见表2)在每种情况下用0.4ml冷冻的培养基接种并在湿润摇床中摇动(250rpm)下在43℃培养24小时。
表2:预培养培养基的组成
成分 | 浓度 |
麦芽糖 | 28.6g/l |
大豆粉 | 19.0g/l |
(NH4)2SO4 | 7.6g/l |
谷氨酸一钠 | 4.8g/l |
柠檬酸钠 | 0.95g/l |
FeSO4×7H2O | 9.5mg/l |
MnCl2×4H2O | 1.9mg/l |
ZnSO4×7H2O | 1.4mg/l |
CoCl2×6H2O | 1.9mg/l |
CuSO4×5H2O | 0.2mg/l |
Na2MoO4×2H2O | 0.7mg/l |
K2HPO4×3H2O | 15.2g/l |
KH2PO4 | 3.9g/l |
MgCl2×6H2O | 0.9g/l |
CaCl2×2H2O | 0.09g/l |
MOPS | 59.8g/l |
pH* | 7.2 |
*将用稀释的KOH水溶液调节
在装备两个挡板的250ml锥形瓶中的42ml主要培养基(见表6)中在每种情况下用1ml预培养物接种。
3)培养液的制备
a)对于谷氨酸棒杆菌
培养瓶培养基的组成在表4中列出。它应该具有最初的糖浓度60g/l。一半的糖来自水解产物(发酵培养基(1)),而另一半以糖溶液的形式加入。为此,制备水解产物和糖溶液的混合物并加入培养瓶培养基中。在对照培养基中使用对应量的葡萄糖溶液。
-用加入的糖制备粉水解产物
制备下面的溶液(见表3):
表3:用加入的糖制备粉水解产物
表4:培养瓶培养基
使用糖溶液的粉水解产物 | 500ml/l |
(NH4)2SO4 | 20g/l |
Urea | 5g/l |
KH2PO4 | 0.113g/l |
K2HPO4 | 0.138g/l |
ACES | 52g/l |
MOPS | 21g/l |
柠檬酸×H2O | 0.49g/l |
3,4-二羟基苯甲酸 | 3.08mg/l |
NaCl | 2.5g/l |
KCl | 1g/l |
MgSO4×7H2O | 0.3g/l |
FeSO4×7H2O | 25mg/l |
*用稀的NaOH水溶液调节
接种后,将烧瓶在湿润的摇床中摇动(200rpm)下在30℃培育3天。发酵结束后,通过HPLC测定赖氨酸含量。用Agilent 1100系列LC系统进行HPLC分析。借助于高压液相层析在Agilent 1100系列LC系统HPLC上测定氨基酸浓度。用邻苯二醛柱前衍生允许定量形成的氨基酸;使用Agilent Hypersil AA柱分离氨基酸混合物。
结果列于表5中。
表5:平均值
*基于总葡萄糖当量
b)对于芽孢杆菌
在表6中列出了培养瓶培养基的组成。它应该具有28.6g/l的最初葡萄糖浓度。一半的糖来自水解产物,而另一半以葡萄糖溶液的形式加入。在对照培养基中使用对应量的葡萄糖溶液。
表6:培养瓶培养基
FeSO4×7H2O | 9.5mg/l |
MnCl2×4H2O | 1.9mg/l |
ZnSO4×7H2O | 1.4mg/l |
CoCl2×6H2O | 1.9mg/l |
CuSO4×5H2O | 0.2mg/l |
Na2MoO4×2H2O | 0.7mg/l |
K2HPO4×3H2O | 15.2g/l |
KH2PO4 | 3.9g/l |
MgCl2×6H2O | 0.9g/l |
CaCl2×2H2O | 0.09g/l |
MOPS | 59.8g/l |
pH* | 7.2 |
*将用稀的NaOH溶液调节
接种后,将培养瓶在湿润摇床中摇动(250rpm)下在43℃培养24小时。发酵终止后,通过HPLC测定葡萄糖和泛酸含量。借助来自Bio-Rad的Aminex HPX-87H柱子测定葡萄糖。通过在Aqua C18柱(Phenomenex)上分离测定泛酸浓度。
结果在表7编辑。
表7:24小时后的平均值
Claims (16)
1.发酵产生至少一种有机化合物的方法,所述有机化合物具有至少3个C原子或所述有机化合物具有至少2个C原子和至少1个N原子,所述有机化合物选自酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂肪族单和二羧酸、具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个C原子的酮、具有4到10个C原子的链烷醇、具有3到10个C原子的链烷二醇,所述方法包括以下步骤:
a1)碾磨选自谷物仁的淀粉原料,从而获得碾磨产物,所述碾磨产物包含按重量计至少50%存在于碾碎的谷物仁中的非淀粉固体组分并且其中基于淀粉组分的重量,碾磨产物中的非淀粉固体组分总计为按重量计至少15%;
a2)将碾磨产物悬浮在水性液体中以获得悬浮液,其基于悬浮液的总重量含有200到500g/kg量的碾磨产物,并通过酶促液化水解碾磨产物中的淀粉部分,并且,随后进行糖化作用,从而得到包含单糖或寡糖的第一种液体(1)并且其中总的单糖和寡糖浓度为150到350g/kg;和
b)向发酵培养基中加入包含单糖或寡糖的液体(1)以及可代谢的单糖、二糖或寡糖或者以及组合物,所述组合物包含浓度为按重量计至少50%的可代谢的单糖、二糖或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体,所述发酵培养基包含在发酵条件下能够过量产生所述有机化合物的微生物,其中通过加入可代谢的单糖和/或寡糖或通过加入组合物使得所述第一种液体(1)中总的单糖和寡糖浓度增加至少50g/kg,所述组合物包含按重量计至少50%浓度的可代谢的单糖和/或寡糖并且基本上无不溶于水的固体,
其中用于发酵的微生物选自过量产生至少一种以下代谢产物的天然或重组的微生物:酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂肪族单和二羧酸、具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个C原子的酮、具有4到10个C原子的链烷醇、具有3到8个C原子的链烷二醇和聚羟链烷酸,
其中所述微生物选自棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、阿舒囊霉属(Ashbya)、埃希氏菌属(Escherichia)、曲霉属(Aspergillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、放线杆菌属(Actinobacillus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和根霉属(Rhizopus)。
2.根据权利要求1的方法,其中步骤a2)中所得液体(1)的总的单糖和寡糖浓度在200到300g/g的范围内。
3.根据权利要求1或2的方法,其中通过加入液体(1)导入发酵中的单糖和/或寡糖的量按重量计占导入发酵的单糖和寡糖总量的40到95%。
4.根据权利要求1的方法,其中液体(1)中总的单糖和寡糖浓度升高到450到600g/kg范围中的值。
5.根据权利要求1或2的方法,其中所用的包含可代谢的单糖或寡糖的组合物是糖生产的副产物,其包含葡萄糖和/或蔗糖,和糊精。
6.根据权利要求1或2的方法,其中所用的包含可代谢的单糖或寡糖的组合物是糖生产的副产物,其包含葡萄糖和/或蔗糖。
7.根据权利要求5的方法,其中所用的包含可代谢的单糖和/或寡糖的组合物是来自甜菜糖生产的糖蜜。
8.根据权利要求1或2的方法,其中在步骤a2)中,通过将步骤a1)中得到的碾磨产物的至少部分在水解条件下连续或者分批加入所述水性液体中将其水解。
9.根据权利要求1或2的方法,其中在步骤a2)中,通过将蒸汽导入碾磨产物的悬浮液中将该悬浮液加热到高于碾磨产物中存在的淀粉的胶化温度。
10.根据权利要求1的方法,其中用于发酵的微生物选自过量产生氨基酸的天然的或重组的微生物。
11.根据权利要求1的方法,其中所述微生物是棒杆菌属的菌株。
12.根据权利要求1的方法,其中用于发酵的微生物选自过量产生酶的天然的或重组微生物。
13.根据权利要求12的方法,其中所述微生物选自过量产生肌醇六磷酸酶的微生物。
14.根据权利要求1或2的方法,其中所述有机化合物被耗尽或从发酵液中分离,并且发酵液的挥发性组分随后被基本去除,获得固体或半固体的蛋白质组合物。
15.根据权利要求1或2的方法,其中发酵液的至少一些挥发性组分被去除,不事先分离或耗尽非挥发性的微生物代谢产物,并且不事先去除固体组分,获得非挥发性的微生物代谢产物的固体制剂。
16.根据权利要求1或2的方法,其中发酵液的至少一些挥发性组分被去除,不事先分离或耗尽非挥发性的微生物代谢产物,获得非挥发性的微生物代谢产物的固体制剂。
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