TW200804602A - Fermentative production of organic compounds - Google Patents

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200804602 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 纟發明有關-種具有至少3個c原子或具有至少2個〇原 子及至少1個N原子之有機化合物之發酵生產，係使用用以 培養微生物之含糖培養基，其包括澱粉進料之至少部份的 非澱粉質構成份。 【先前技術】 上含糖液體培養基為多數發酵製程之主要營養物，存在於 • 該培養基中之糖成份被所用的微生物所代謝，獲得有價值 之有機產物。因此所製備之微生物代謝物範圍，即有機化 合物包括例如低分子量揮發性化合物如乙醇、非揮發性代 謝物如胺基酸、維生素及類胡蘿蔔素，以及多種其他物 質。 視各種製程條件而異，不同之碳進料被利用於一般已知 之微生物發酵製程。其由甜菜及甘蔗糖蜜以至稱為高試驗 糖蜜（逆轉甘蔗糖蜜）之純蔗糖擴大至來自澱粉水解物之葡 _ 萄糖。再者，據述乙酸及乙醇可作為辅受質，其用於以工 業規模藉生物技術生產L-離胺酸（pfefferie et al.， Biotechnological Manufacture of Lysine，Advances in

Biochemical Engineering/Biotechnology，Vol· 79 (2003)， 59-112)。 基於前述之各種碳進料，已建立用於微生物代謝之糖基 發酵製法之各種方法及程序。以L-離胺酸為例，例如 Pfefferle等人（上述引用文獻）描述有關菌株發展、製程發 116419.doc 200804602 展及工業製造。 用於微生物代謝之微生物調控發酵製法之重要碳進料為 澱粉。後者在可作為發酵的糖進料之前，於前置反應中， 須先經液化及糖化。為了此目的，通常自天然澱粉進料如 馬鈴薯、木薯、榖類例如小麥、玉米、大麥、裸麥、小黑 '麥或稻米以預先純化型態獲得，且隨後經酵素性液化及糖 ‘ 化，隨後利用於確實的發酵操作以產生所需之代謝物。 除了使用此預先純化之澱粉進料以外，使用非預先處理 • 之澱粉進料用於製備供發酵製造微生物代謝物之碳進料亦 已被描述。典型上，澱粉進料最初藉研磨磨碎。研磨基料 接著進行液化及糖化。由於此研磨基料除了含澱粉以外， 自然包括一系列之非澱粉質構成份，其可能對發酵有不良 影響，因此該等構成份一般在發酵前移除。該移除可在研 磨後直接進行（WO 02/077252; JP 2001-072701; JP 56-169594; CN 1218111)，液化後（WO 02/077252; CN 1173541) 或隨後糖化（CN 1266102; Beukema 等人：Production of w fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potato saccharification to give culture medium (Conference Abstract)，Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983)，6; NL8302229)。然而，所有變化方式皆涉及在發酵操作中使 ^ 用實質上純的澱粉水解物。 發酵製造有機化合物之新穎方法尤其包括發酵前之澱粉 進料的純化，例如液化及糖化澱粉溶液之純化（JP 57159500)，或提供使得自再生來源製造發酵培養基成為 116419.doc 200804602 可能之方法（EP 1205557)。 相反地，未加工之澱粉進料已知已應用在大規模發酵製 造生物酒精。此處，澱粉進料（一般為全穀物粒）首先進行 乾燥研磨，且隨後將該澱粉進料之澱粉構成份使用酵素水 解。此處，該水解可批次進行，例如於攪拌容器中或例如 於喷射烹煮器中連續進行。適宜方法的描述可見於例如 lfThe Alcohol Textbook-A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries”，Jaques 等人（編輯），

Nottingham Univ. Press 1995， ISBN 1-8977676-73 5, Chapter 2，pp· 7 to 23 及 McAloon 等人之"Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks”，NREL/TP-580-28893，National Renewable Energy Laboratory，October 2000 o 由於生物酒精的發酵製造中，有價值的產物係藉蒸餾獲 得，因此使用得自乾研磨製程之非預先純化型態之澱粉進 料不會構成嚴重問題。然而，當使用該研磨方法製造其他 微生物代謝物時，經由糖溶液導入該發酵操作之固體液流 會產生問題，因為其不僅對發酵（例如氧轉換率或所用微 生物之氧需求）有不利作用（，亦可能使後續操作變得相當 複雜（就此内容，參考Mersmann，A· et al·: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990)，357-370) 〇 再者，導入固體之結果，為甚至在製備含澱粉 < 懸浮液 之時懸浮液之黏度即已達到臨界值，以致於例如含大於30 116419.doc 200804602 重量％玉米粉之懸浮液即 P已不再此均勻地於水中混溶 σ—i Enzymology，2nd Ed，T g。㈣，s ㈣ 1996)。此點限制了傳統製程中葡萄糖之濃度。 製造生物酒精而言，此點不再有 又一男… 所用的酵素具有毒性，故無論如 醇 較高之濃度產生轉化。 合理之方式使

在酒精以外之有機代謝物發酵製造中，於發酵作用中以 低糖濃度以含糖料基在理論上較，因為此程序導 致發酵液體之不均句稀釋且結果，相關產物可達到之最炊 濃度減小’當料產物係自發酵料基巾獲料，复首先 導致成本增加，其次導致空間-時間產率降低。該等考量 在澱粉水解物欲部分饋人較低容積之次要發酵操作以製造 其他化學品之情況下尤其重要(該澱粉水解物係於大容量 製造生物酒精所製造，且傳統上具有低糖或至多約30或33 重量％之葡萄糖濃度)。 由於該等困難及限制，已廣泛用於製造生物酒精之乾研 磨方法在#酵製it酒精以外之微生㈣謝物中一直不具特 別的經濟重要性。 迄今，有關將乾研磨理論及理論上此方法中既有的優點 應用至工業規模製造微生物代謝物之各種嘗試之描述僅涵 蓋使用木薯作為澱粉進料。例如，Jp 2〇〇1/275693描述一 種發酵製造胺基酸之方法，其中使用已以乾燥狀態被研磨 之剝皮木薯塊莖作為澱粉進料。為了進行此方法，必須調 整研磨基料之顆粒大小至$15〇 μιη。在此目的中所用之過 116419.doc 200804602 濾步驟中’在所得澱粉經液化/糖化之前，將包括含有非 漏又粉貝構成份之一部分研磨基料移除且隨後發酵。此方法 中，獲得適度糖濃度。類似方法描述於jp 2001/ 309751， 係用以製造含胺基酸之進料添加物。 為了在發酵作用所用之液體培養基中增加糖濃度，可使 用用於糖化作用之大體上含有澱粉進料之固體、非澱粉質 構成份之研磨基料，藉本案申請人之WO 2〇〇5/116228 (PCT/EP2005/005728)中所述方法而達成。意外地，已顯 現出在澱粉進料中所存在之固體、非澱粉質構成份在發酵 前不須被移除。使用自榖類榖粒中選擇之澱粉進料之類似 方法描述於本案申請人之PCT/EP2〇〇6/066057 (早期專利申 睛案DE 102005042541.0)。有些例中，觀察到微生物之受 抑制或延遲增殖。 本發明之一目的係提供發酵生產有機化合物之另一方 法，其不需要（至少不完全需要）事先移除澱粉進料中存在 之非澱粉質構成份。再者，此法應能簡單處理所用的培養 基及可毫無問題地使用於發酵方法中。尤其，此方法應允 許使用榖類作為澱粉進料。 意外地，現已發現先前技術之上述問題可藉由下列方法 而克服：研磨、液化及糖化澱粉進料製備第一含糖液體培 養基（1) ’無須事先移除澱粉進料之非澱粉質固體構成份， 並可使此培養基與可代謝之單…二_或募糖一起或與包括 濃度至少50重量％且實質上不含不溶於水之固體之可代謝 之單-或养糖之組成物一起供應至發酵中。 116419.doc -10 - 200804602 【發明内容】 本發明提供一種發酵生產具有至少3個〇原子或具有至少 2個C原子及至少一個^^原子之至少一種有機化合物之方 法，其包括下列步驟： al)研磨澱粉進料，因而獲得包括該澱粉進料之至少部分 該非澱粉質固體構成份之研磨基料， a2)使該研磨基料懸浮於水性液體中且藉酵素液化作用使 研磨基料t之澱粉部分水解，且若適宜，隨後進行糖 化作用，因而獲得包括單-或寡糖之第一液體（丨）；及 b)使包括單-或募糖之第一液體（1)與可代謝之單_、二_ 或养糖一起或與包括濃度至少5〇重量❶/❶之單*、二-或 寡糖且基本上不含不溶於水的固體之組合物一起添加 至包括微生物之發酵培養基中，該微生物可在發酵條 件下過量產生該有機化合物。 使用包括有已藉酵素水解獲得之單_或寡糖之液體（1)可 導致發酵製造有機化合物之成本顯著降低。以濃縮態平行 添加可代謝糖（即可代謝之單_、二_或寡糖）更可避免任何 不期望之發酵液稀釋。再者，在澱粉進料以較高研磨基料 濃度液化時所可能產生之黏度問題可因本發明方法而避免 之。再者’此方法可避免微生物增殖所產生的問題。 此處及後文中，名詞，，液體（1)"及”液體培養基（1)”係交互 使用，表示包括單-或寡糖之液體（1)。 適合作為本發明方法之澱粉進料者主要為乾榖物或種 子’其中在所需狀態下澱粉含量為至少4〇重量D/。且較好至 116419.doc 11 200804602 少50重量％。此可見於目前大規模生長之許多榖類植物如 玉米、小麥、燕麥、大麥、裸麥、小黑麥、稻米、甜菜及 馬鈴薯及各種蜀黍屬及稗粟物種例如蘆粟及稗粟中。澱粉 進料較好選自榖類，尤其較好為玉米、裸麥、小黑麥及小 麥仁。理論上，本發明之方法亦可以類似澱粉進料進行， 例如各種含殿粉之穀類或種子之混合物。 爲了製備液體培養基（1)，相關之澱粉進料於步驟al) 中，不添加或添加液體例如水之情況下研磨，較好未添加

液體之下進行研磨。亦可能組合任何乾研磨及隨後之濕研 磨步驟。 /、t上了用於乾研磨之裝置為錘磨研磨機、轉子研磨機 或輥研磨機·’適用於濕研磨之裝置為紡錘混合機、攪動之 球研磨機、循環研磨機、盤式研磨機、環室研磨機、擺振 式研磨機或行星式研磨機。理論上，其他研磨機亦適用。 濕研磨所需之液體量可藉熟知此項技術者於例行實驗中加 以決定。一般調整方式為乾燥物含量在10至重量％之範 圍。 研磨使得顆粒適用於隨後方法步驟中。就此而言，已證 明當研磨步驟（尤其是乾研磨步驟，步驟al))中獲得之研磨 基料具有粉狀顆粒’亦即粒徑在⑽至㈣_範圍之微粒 篁在30至1⑽重量％，較好4()至95重量％且最好跑9〇重量 /〇之微粒構成A時較有利。較好’所得之研磨基料包括^ 重量％之具有粒徑大於 得粉狀顆粒具有小於2 100 μιη。通常，至少95重量％之所 mm之粒徑。就此而言，該粒徑係使 116419.doc -12- 200804602 用振動刀析儀藉過篩分析而測量。理論上，小粒徑對於以 局產率獲得產品而言較有利。然而，粒徑過小可能導致問 題，尤其是當研磨基料在液化期間予以聚料化或加工例如 發酵步驟後之固體乾燥期間，會有由於結塊形成/凝聚而 產生問題。 般’粉狀物係以萃取率或粉末等級加以特徵描述，其 彼此修正成粉狀物等級特性隨萃取率增加而增加。萃取率 對，於基於所㈣、⑽重量份研磨基料所獲得之粉狀物 重篁之ϊ。然@，研磨方法期fa，，最先獲得例如得自榖類 胚仁内邛之純的超微細粉狀物，而隨著進一步研磨，亦即 隨者卒取率增加，粉狀物中粗纖維量及外皮含量增加且澱 籾3里減j/。因此萃取率亦反映於粉狀物等級，其用作為 刀類米刀狀物之數字，$其是穀類粉狀物，I其基於粉狀物 Μ份含量（稱為灰份等級粉狀物等級或類別數值表示 當100克粉狀固體焚燒時留下之灰份（礦物）毫克數。在榖類 粉狀物之例中，較高類型數字意指較高萃取率，因為該榖 類胚仁之核心包括約0.4重量％灰份，同時該外皮包括約5 重量。/。灰份之故。在較低萃取率之情況下，該榖類粉狀物 Τ此主要由粉碎之胚乳所構成，亦即榖類胚仁之澱粉含 篁，該榖類粉狀物亦包括榖類顆粒之經粉碎之含蛋白質糊 粉層；在粗麥片粉之例t，#亦包括含蛋白質及含脂肪之 胚芽及種子外皮之構成份，#包括粗纖維及灰份。就本發 明目的而言，具有高萃取率或高類別數值之粉狀物理論上 較佳。若利用㈣作為殿粉進难斗，則較好完整胚仁與其外 116419.doc -13- 200804602 皮一起研磨及加工，若適當，在事先機械移除胚芽及外皮 之後進行。 依據本發明，用以製備液體培養基（1)之研磨基料含有 至少些許，較好至少20重量❶/。，尤其至少5〇重量％，特別 是至少90重量％且最特別是至少99重量％之非澱粉質之固 體構成份’其存在於經研磨之榖類胚仁中，相當於萃取 率。基於研磨基料之澱粉質構成份（且因此基於液體培養 基（1)中之單-、二-或寡糖之量），研磨基料中非殿粉質固 • 體構成份的量較好至少10重量％且尤其是至少15重量〇/〇， 例如自15至75重量％且特別是在2〇至60重量％之範圍。 依據步驟a2)之研磨基料之酵素水解可藉熟習本技藝者 已知之慣用方法，例如依循開頭引述之”醇類教科書-飲 料、燃料及工業用醇類工業參考（The Aicohol Textbook-A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries)”，第2章，7至η頁所述之方法進行。 因此’先使研磨基料與水性液體例如新鮮的水、循環製 _ 程水例如來自後續之發酵之製程水或與此等液體之混合物 此合，形成水性懸浮液。此程序通常亦稱為漿料化。 因此，以使得水解可獲得其中單_、二_及/或募糖總濃度 在100至750 g/kg，較好在150至7〇〇 g/kg，且最好在2〇〇至 650 g/kg之水性液體培養基之方式選擇研磨基料及水性液 體之量。據此，研磨基料用量以懸浮液（漿料）總重為準， 通常為15〇至800 g/kg，經常為200至75〇 g/kg，且最好為 250至 700 g/kg 〇 116419.doc -14- 200804602 依本發明較佳具體例，研磨基料及水性液體之量係依下 列方式選擇··水解後可獲得其中單…二_及/或寡糖總濃度 在100至400 g/kg，較好在150至35〇 g/kg且最好在2〇〇至3〇〇 g/kg之間之水性培養基（丨）。據此，研磨基料之用量以懸浮 液（漿料）總重為準，通常為150至55〇 g/kg，經常為2〇〇至 5〇〇 g/kg，且隶好為250至45G g/kg之間。理論上，亦可能 使用更大量之研磨基料以達到較高之單一二_及/或寡糖總 濃度，例如高於400 g/kg至700 g/kg，尤其是45〇至65〇 g/kg或 500 g/kg至 650 g/kg之濃度。 就研磨基料之澱粉部份之酵素水解而言，研磨基料因此 通常會先在澱粉-液化酵素（通常為α _澱粉酶）存在下液 化。亦可使用在反應條件下具活性之其他酵素且亦可利用 液化穩定澱粉。 為使研磨基料中存在之澱粉液化，理論上可能使用所有 液化酵素，尤其是心澱粉酶（酵素類Ec 3211)，例如獲自 地衣型芽孢;f干鲕（❿⑻心"c/zen/orm/s)或嗜熱脂肪芽孢桿 菌（Bacillus staerothermophilus)之 a _激粉酶，尤矣良就 ^ 物酒精生產目的而言，為經由乾燥_研磨法獲得之液化物 質所用者。液化作用適用之α-澱粉酶亦為可商業獲得，例 如購自N〇V〇zymes之商品名Termamyl 12〇 L，L型；或購自 G'enencor之商品名Spezyme。對液化作用而言亦可使用不 同α-殿粉酶之組合。 此可獲得液體培養基，其包括來自研磨基料之液化澱粉 部份（一般為募糖，通常具有3至18個，尤其是6至12個單 116419.doc -15- 200804602 單元’尤其是葡萄糖單元）以及所用研磨基料之非澱粉 成份’尤其是液化所用研磨基料之固態、非殺粉質構成 份。 澱粉-液化酵素及研磨基料之量較好依膠凝製程期間之 黏度可充分降低，使得可能可藉由例如藉由攪拌使懸浮液 有效混合之方式加以選擇。反應混合物在膠凝製程期間之 黏度較好不超過20 Pas，尤其是不超過15 Pas，且最好不 超過8 Pas。通常，黏度係使用配備有M5測量系統及 MVDIN設備之Haake Viskosimeter type Roto Visko ， 在5〇°C之溫度及200V1之剪切速率下測量。 α-澱粉酶（或所用之澱粉-液化酵素）可一開始即導入反應 槽中或者於步驟a2)之期間添加。較好，步驟a2)中所需之 部份α-殿粉酶在步驟a2)開始時添加，或先將該部分導入反 應槽中。α-澱粉酶之總量以所用澱粉原料總量為準，通常 在0.002至3.0重量％之間，較好在001至1 5重量％之間且 最好在0.02至〇·5重量％之間。 液化作用可在高於或低於膠凝溫度之下進行。較好，步 驟a2)之液化至少部分在高於膠凝溫度或高於所用澱粉之 糊化溫度進行（已知為烹調製程）。有關澱粉所需溫度為熟 悉本技藝者已知（參見"The Alcohol Textbook-A reference for the beverage，fuel and industrial alcohol industries，，（已 於開頭提出），第2章，第11頁），或可由熟悉本技藝者以例 行實驗決定。通常，選用之溫度在8〇至l65〇c之間，較好 在90至150 C之間且最好在1〇〇至i4〇°c之間，通常溫度為 116419.doc •16- 200804602 比膠凝溫度高至少5 κ，+ Κ尤其至少10 Κ，且最好至少20 ’例如Η^100Κ’尤其是2〇至町。在此等溫度下，澱 i顆粒狀、、.。構會被破壞（膠凝），使得隨後酵素降解成為 可能。 就最適效率的α_澱㈣（或使狀殿粉液化酵素）而言， 步驟a2)較好在對液化酵素最適之ρΗ下進行至少些許時 段，通常在弱酸範圍之ρΗ下，較好在4〇至7〇，尤立是在 5.0至㈠下’ ρΗ之調整經常使在步驟叫開始之前或開始時 進仃’車又好經檢查且若適宜於液化製程期間調整該pH。 PH較好使用稀無機酸如邮〇4或卿4,或稀驗性氯氧化 物溶液如NaOH或KOH調整。 對於步驟a2)中使研磨基料中之澱粉部分液化之較佳具 體例，較好將至少某些研磨基料持續或分批加於水性液體 中車乂好至v 4〇重置0/〇，尤其至少5〇重量％且最好至少 55重量％係在液化製程期間但在任何糖化作用發生之前添 加於反應槽中。經常，添加量不超過9〇重量％，尤其^重 量％且最好8〇重量％。較好，製程過程中添加之研磨基料 部分係在液化相期間廣泛性條件下饋入反應器中。該添加 可分批進行’亦即逐次、分數次進行，其量在各情況下較 好不超過欲液化之研磨基料總量之3〇重量％ ’最好不超過 20重量％ ’例如1至30重量％ ’且最好為2至2〇重量％，或 者持續饋入。該具體例之基本方面為僅部份研磨基料，較 好不超過60重量。/。，尤其不超過5〇重量％，且最好不超過 45重量〇/〇之研磨基料在液化一開始即存在於反應器中，而 116419.doc -17- 200804602 其餘研磨基料係在液化相之過程中添加。 液化亦可持續進行，例如以多步驟反應系列進行。 較佳具體例中，本發明方法之步驟a2)可依下列方式進 行以研磨基料之總量為準先使一部份其量不超過⑹重量 %，較好不超過50重量％且最好不超過45重量％，例如1〇 至60重里/❾尤其疋15至50重量％，且最好2〇至45重量％ 懸浮於水性液體中，且接著進行液化。

較例中’於步驟a2)中不連續或連續添加，尤其 是逐次添加部份研磨基㈣錢液體培養基之減不超過 20 Pas較好不超過15 pas，且最好不超過8以§之方式進 行。為助於控難度，經證實較好在溫度高於研磨基料中 存在之澱粉膠凝溫度下添加所添加之研磨基料總量之至少 25重量％，較好至/j> 3 +田 夕5重置/❶，且最好至少5〇重量％。再 者，黏度之控制可逸而、夭a s 1 而添加至少一種澱粉_液化酵素，較 好為α-澱粉酶及/或至少一瀚 ^ 種糖化酵素，較好為葡萄糖酶而 進行，本身為逐次添加。 為進行本發明之方法，可力态 > 』在適度提鬲溫度下例如在4〇至 60°C之範圍將固態研廢其极縣& ^ ^基㈣㈣用之水性液體預熱。然 而較好利用室溫的液體。 接者’將至少一種^殿始、、右儿热φ 杨_液化酵素，較好為ex-澱粉酶添 加於該研磨基料之料液中。若液化相期間僅添加部份研 磨基料則車又好在開始僅添加部份α·殿粉酶，例如以步 驟a2)中所用所有α-殿粉酶為車糸 啤馮早為10至70重量。/。，尤其是20 至6 5重量％。此時即日丰、太^ β PBflk㈣粉酶量取決於與有關所 116419.doc -18- 200804602 且以所用 ，較好自 用澱粉原料在反應條件下之相關α-澱粉酶活性， 總澱粉總量為準通常在0 0004至2 〇重量％之間 o.oomo重量％，且最好自G _G 3重量％。或者，可在 製備懸浮液之前使α _澱粉酶部分與所用液體。 使用之α I粉酶量或部份較好在加熱至已開始液化所 用之溫度之前添加於懸浮液中，尤其是在室溫下或僅適度 地提咼溫度之下添加，例如在20至30。〇之間。 接著較好在高於所用殿粉之膠凝溫度之 懸浮液加熱。通常，選擇溫度在嶋i阶之=此t 90至15(TC之間且最好在刚至14(rc之間，該溫度較好 膠凝溫度（糊化溫度）高至少5 κ，尤其是1〇 κ，且最好至 2〇 Κ’例如10至100 κ，尤其是2〇至8〇 κ。在追蹤粘度

同時將另—部份之澱粉原料，例如以所用所有研磨基料為 準，各情況下為1至30重量％，且最好為2至2〇重量％緩慢 添加於含澱粉之懸浮液中。較好在液化過程中將部份欲添 加之研磨基料分至少2份，較好至少4份且最好至少6份添 加於反應混合物中。或者，在此具體例中之液化步驟過程 中可持績添加未被用以製造此懸浮液之部份研磨基料。添 力d間，度較好應維持在高於澱粉之膠凝溫度。 達所需溫度之後，或若適宜，在所有粉狀物添加後，通 常使反應混合物維持一段時間，例如1〇至6〇分鐘或更長， 若需要溫度可設定在高於澱粉之膠凝溫度，亦即經烹煮。 接著，通常使反應混合物冷卻至稍低之溫度，但較好高於 膠凝溫度，例如70至9(TC ^隨後，若適宜，則添加另一部 H64l9.doc -19- 200804602 刀α歲粉酶，較好為最大之部分。此例中，此時即時添 加之α-澱粉酶量取決於反應條件下所用α_澱粉酶之活性， 以所用澱粉原料之總量為準較好為〇〇〇2至2.〇重量％，更 好為0.01至1.0重量％，且最好為〇 〇2至〇 4重量％。 為使澱粉完全降解成葡聚糖，因此使反應混合物維持在 設定之溫度下，或若適宜則進一步加熱，直到以碘偵測澱 粉或若適宜之其他偵測澱粉之試驗為陰性或至少基本上為 陰性為止。若適宜，可於此時將一或更多額外心殿粉酶部 份’例如以所用澱粉原料之總量為準為〇 〇〇1至〇 5重量 %，且較好為0.002至〇.2重量％添加於反應混合物中。 或者，可藉由導入水蒸氣先將包括研磨基料之水性懸浮 液加熱至温度高於澱粉原料或研磨基料中存在之澱粉之糊 化溫度，使澱粉部分液化。通常，懸浮液會在高於相關糊 化溫度至少10 Κ，尤其是至少20 κ，例如1〇至1〇〇 κ，尤 其是20至80 Κ之溫度下加熱。尤其是將懸浮液加熱至卯至 150°C，最好100至140°C之溫度。 將懸浮液加熱所用之水蒸氣通常為溫度至少i 〇5 〇c，尤 其是至少110°C，例如110至210°C之超加熱水蒸汽。水蒸 氣較好在超大氣壓之壓力下導入懸浮液中。據此，水蒸氣 之壓力較好至少為1.5巴，例如1.5至16巴，尤其是2至12 巴。 通常’水蒸氣係在超大氣壓之壓力，較好在1至1〇或11 巴，最好在1.5至5巴之超大氣壓之壓力下，且較好在高速 下導入懸浮液中。導入水蒸氣之結果為使懸浮液立即加熱 116419.doc -20- 200804602 至高於m：之溫度，亦即高於糊化溫度之溫度。 以水蒸氣加錄好錢續操作裝置進行，其係在懸浮液 之黏度冑入速率及裝置之幾何形狀造成之特定饋入壓力 下持、’只庄入懸/于液，且經由可調整噴嘴，在以饋入之壓力 為準升冋£力之下於懸序液之注入區中注入熱的水蒸氣。 在升高壓力下饋入水蒸汽意指不僅懸浮液被加熱，而且於 系先中‘入機械月b，且該機械能會促使研磨基料顆粒進一 乂私碎弓I起特別均勻之能量供給，且因此造成研磨基料 :之粒狀澱粉顆粒特別均句之糊化。此等裝置通常為管狀 形狀。水蒸氣較好延著管狀裝置之縱軸饋入。通常， =浮液以至少45。角或以直角供給。可調整喷嘴之形狀通 吊為，著水蒸氣流動方向逐漸縮小之圓錐型。該喷嘴中配 置沿者可縱向移動禪之，丨H斗 干之大針或囫錐體。尖針或圓錐體與尖 !之圓錐體一起形成隙縫。經由軸向錯置尖針或桿，可以 「:之方式°周整隙缝大小及因此形成之噴嘴終端處之剖面 區域’因此可以簡單之方式控制水蒸氣供給之速度。 基lb等裝ΐ通常亦配備有混合管，於其中輸送有已供給水 :::心子液並使懸洋液離開該裝置。該混合管通常沿著 二：氣供給且與饋入物垂直之方向排列。混合管與噴嘴通 :一起形成間隙’懸浮液通過該間隙輸送。因此間隙之莊 f ’在懸浮液傳送過程t將額外之剪力加於其上，且因: ^加對懸浮液施加之機械能。混合管可依縱向移動之方式 列°混合管之移動為調整間隙大小簡易: 降低裝置之壓力。 Λ且因此 H6419.doc -21 - 200804602 該裝置在先前技藝已知稱之為噴射烹煮器，例如"The

Alcohol Textbook”，Chapter 2，上述引用文，Figure 13所 示且購自美國 Waukesha WI，Hydro Thermal Corp·之稱為 HYDROHEATER®之裝置， 當反應持續進行時，以水蒸氣處理之懸浮液通常隨後被 送到後反應區，以便使澱粉成份持續膠凝。通常，後反應 區中普遍為超大氣壓，一般為在2至8巴間之絕對壓力。後 反應區中之溫度通常在90至15(rc之間。該後反應區中之 駐留時間可在1分鐘至4小時之間，視懸浮液之温度而定。 後反應區通常為管狀或管柱體。一具體例中，後反應區之 形狀為垂直排列之管柱體。此處，一旦離開該水蒸氣處理 裝置，懸浮液於施加於管柱體之上面區域中，且於下面區 域中抽取出來。本發明另一具體例中，後反應區之形狀為 管狀。 當懸浮液離開後反應區後，通常壓力會被釋放，且接著 進行液化。壓力釋放較好依快速蒸發形式進行，以使懸浮 液冷卻至較好低於1001，尤其低於851之溫度。通常， 在另一反應槽中使因此崩解之澱粉液化。該液化可如上述 般進行。 ； 依本發明較佳具體例，在水蒸氣加熱製程之前將至少部 份或所有，通常至少50%’尤其至少80%或者所有澱粉液 化酵素添加於含研磨基料之水性液體中。依此方式，在混 合物加熱至高於糊化溫度之溫度時已發生液化製程。若適 宜，進行水蒸氣加熱及後反應期。可省略另一反應槽中之 116419.doc -22· 200804602 後績液化步驟。妙品 ά W而’較好進行該液化步驟使澱粉完全降 解成葡聚糖。 f使所用之酵素安定，可在適當下使用例如CaCl2將 ^離子之濃度調整至酵素特異之最佳值。適用之濃度值 可由热μ本技藝者依慣用之實驗測定。例如若使用 Termamyl作為α_澱粉酶，則較好將液體培養基中之以2+ /辰度凋正至例如1〇至1〇〇 ppm，較好2〇至沖瓜，且最 子、勺30至70 ppm，單位ppm係以重量為準，且意指以⑺⑽ • kg。 為使澱粉完全降解成葡聚糖，使反應混合物維持在設定 之溫度下，直到以碘偵測澱粉或若適宜以其他偵測澱粉之 試驗為陰性或至少基本上為陰性為止。若適宜，可於此時 將一或更多額外之α_澱粉酶部份，例如以所用澱粉原料之 總量為準為0·001至〇·5重量％，且較好為〇观至〇 2重量％ 添加於反應混合物中。 此可獲得殿粉水解物水溶液，其包括來自研磨基料之液 響㈣粉部份，通常為葡聚糖及若適宜之其他募糖及單_或 二糖，及研磨基料之非澱粉成份，尤其是液化所用研磨基 料之固態、非澱粉成份。 殿粉液化結束後，液體培養基中存在之葡聚糖可經糖 化，亦即依本身已知之方式持續或分抵碎裂成為葡萄糖。 該液化培養基可在用於例如後續發酵步驟之前於特定糖化 槽中完全糖化。 本發明第-具體例中’在後續發酵之前僅進行—部份糖 116419.doc -23- 200804602 化作用。例如，可依循其中液體培養基中存在之部分葡聚 糖’例如以葡聚糖總重（或最初澱粉）為準為10至9〇重量 % ’尤其是20至80重量％被糖化之程序，且於發酵中使用 所得含糖之液體培養基。接著可在發酵培養基中就地進行 進一步之糖化作用。再者，糖化作用可於發酵槽中直接進 行（就地）’省略掉另一糖化作用槽。 就地糖化作用亦即在發酵槽中進行部份或完全糖化作用 之優點首先為減低投資成本，第二為若適宜，可延遲葡萄 糖釋出，使得以分批最初導入較高之葡萄糖濃度，而不使 所用微生物發生抑制作用或代謝改變。例如大腸桿菌（E. coli)中’過度高的葡萄糖濃度會導致形成有機酸（乙酸 孤）’但此f月況下’釀酒酵母（仏會 切換成發酵’儘管在通風之發酵槽中含有足夠之氧亦然 (Crabtree作用）。延遲釋出葡萄糖可經由控制葡萄糖酶濃 度而調整。此使得可能壓制上述作用，且最初可導入更多 文質’因此可降低因供給之饋入物流造成之稀釋。 液化殿粉溶液中葡聚糖（亦即寡糖）之糖化作用係藉酵素 性進行，亦即在至少一種葡聚糖化酵素之協助下進行。就 該目的而言可使用冬酵素原則上為所有葡萄糖酶（酵素種 類EC 3.2.1.3)，尤其是得自麴菌之葡萄糖酶， 尤其是使經由乾燥研磨法配合生物酒精生產製備所得之物 質糖化所用者。適用於糖化作用之葡萄糖酶亦為商業獲 仔例如講自Novozymes之品名Dextrozyme GA ;或講自 Genencor之品名0ptidex。亦可使用不同葡萄糖酶之組合。 116419.doc -24- 200804602 種糖化酵素’尤其是至少一種葡萄糖酶係以所用 澱粉^料總量為準通常為請重量％，較好〇 〇〇5至 里/〇，且最好001至1〇重量％之量添加於液化後所得 之含葡聚糖之液體培養基中。 ,、右於發酵槽中進行糖化作用，則通常使液化殿粉溶液冷 部至叙酵溫度，亦即32至37°c，接著饋入發酵槽中。此情 況下，可於發酵液中直接添加用於糖化作用之葡萄糖酶 (或至少一種糖化酵素）。依據步驟a2)之液化澱粉之糖化作 用此時與微生物使糖代謝之作用平行進行。 若發酵槽中發生糖化作用，則該液化澱粉溶液一般冷卻 至或至糖化酵素最適溫度或略低於該溫度，例如5〇至70 C，較好60至65°C，且隨後以葡萄糖酶處理。 在添加糖化酵素尤其是葡萄糖酶之前較好將液體培養基 之pH值调整至所用葡萄糖酶之最佳活化範圍之值，較好在 3·5至6.0之間，更好在4·〇至5 5之間，且最好在4〇至5〇之 間。然而’尤其是在發酵槽中直接進行糖化作用時，亦可 能將pH值調整至上述範圍以外之值，例如大於6〇至8〇之 間。此可能在整體上較佳，例如在離胺酸、泛酸酯及維他 命I之發酵生產中，儘管標準葡萄糖酶在該ρΉ範圍之有限 活性或因欲設定之發酵條件結果之需要。 較佳具體例中，糖化作用係在特定糖化槽中進行。結 果’使该液化殿粉溶液升溫至對酵素而言為最佳之溫度或 稍低之溫度，且依上述方式將pH調整至對酵素而言為最佳 之值。 I16419.doc -25- 200804602 添加糖化酵夸你 ，、後，較好使含葡聚糖之懸浮液維持在 定之溫度一段眸M / 才牡尸I又 又夺間，例如自2至72小時或更長，且若需要 将別疋自5至48 ,ί η士 、夺，此期間葡聚糖會糖化獲得單·。 糖化製私之過程可由熟悉本技藝者使用已知之 : hplc ^ ^ ^ ^ ^ 刀析或》萄糖試驗條片而監控。該糖化作用 在單醣/辰度灵質上不再上升或再度下降時結束。

因為’通常使用含殿粉原料之至少部份或所有構成份之 研磨基料製備含糖之液體培養基⑴(亦即未移除或完全未 移除Μ原料之非殿粉f @態成份），所得液體培養基⑴ :含：：：原料之部分或所有非澱粉質固態成份。輯 ‘入一疋1例如來自穀類之植酸分解酶，該量並不被期 望。為避免因此造成之抑制作用，較好於步驟U)中將至 少一種植酸分解酶添加於液體培養基中，接著使含糖之液 體培養基進行發酵步驟。 若對於個別之高溫足夠穩定，則植酸分解酶亦可在液化 或糖化作用之前、期間或之後添加。 任何植酸分解酶均可使用，只要在各情況下其活性在反 應條件下不超過最低限度之作用即可。所用植酸分解酶之 熱女疋性（T50)較好>50°C，且最好>6〇°C。植酸分解酶之 量通常為1至10000單位/公斤澱粉原料，且最好為1〇至 4000單位/公斤澱粉原料。 為增加總體糖產量或獲得游離胺基酸，在含糖液體培養 基生產期間可將其他酵素例如支鏈澱粉酶、纖維素酶、半 纖維素酶、葡萄酶、木糖酶、葡萄糖苷酶或蛋白酶額外添 116419.doc -26- 200804602 加於反應混合物中此等酵素之添加對於黏度可能有正面 作用’亦即降低黏纟（例如經由使長鍵（亦稱為較長之鍵）葡 萄聚糖及/或（阿拉伯糖（arabin。）·）木聚糖（xyianes))，且使 可代謝之葡㈣釋出且使（殘留）之澱粉释出。使用蛋白酶 具有類似之正面作用’另外可釋出可作為發酵成長因子之 胺基酸。 依是否已進行糖化作用而定，進行本文所述之步驟叫 及吻可獲得含葡聚糖-或單_或二糖之液體培養基且具有上 述範圍内之總單-、二-及/或募糖濃度。 糖化作用後存在於液體培養基⑴中之糖尤其為葡萄 糖’且亦可能含有其他單畴如葡萄糖以外之六碳糖及五碳 糖，例如果糖、甘露糖、束受丨她 平礼糖、山梨糖、木糖、阿拉伯 糖及核糖。葡萄糖以外之單醣量取決於所用之澱粉原料及 其中所含之非《構成份，且可受製程控制影響，例如添 加纖維素酶破壞纖維素構成份。含糖液體培養基之單糖，

=含糖液體培養基中存在之總糖量為準，較好含至少的重 量％ ’曰經常至少70重量％ ’尤其至少8〇重量％且最好至少 重里％之葡萄糖含$。葡萄糖含量以含糖液體培養基中 存在之總糖量為準，通常在75至99 9重量％，尤其是⑽至 的重量。/。’且最好85至97重量％之間。若未進行糖化作 用’則培養基⑴中存在之單·、二及寡糖中之葡聚糖量基 本上相當於葡萄糖之量。 若未進行糖化作用，則可代謝之葡萄糖均等物基本上會 以养聚糖之形式’尤其是葡聚糖之形式存在。此等寡糖或 116419.doc -27- 200804602 葡聚糖之主要構成份通常為葡萄糖，對於培養基而言亦可 能含小量單-及/或由其他單糖單元組成之二糖及募糖。該 情況中，液體培養基（1)中之含糖成份，亦即單_、二及寡 糖以總葡萄糖均等物之量為準通f含至少6G重量^經常 至少70重量％，尤其至少8〇重量％，最好至少9〇重量％之 寡糖，尤其是葡聚糖，亦即單_及二糖之量少於仙重量％， 經常少於30重量％ ’尤其少於2〇重量％，且最好少於㈣ 量。/。。以游離或結合形式存在之葡萄糖之量，卩葡萄糖均 等，為準’通常為50至99重量％之間，尤其為75· 里。。且最好80至95重量％之培養基⑴中之葡萄糖均 物。 依據本發明’使用液體培養基⑴及除液體培養基以外 :可代謝單、二·及/或寡糖之原料（此後亦稱為糖原料）兩 者進行後續發酵°針對該目的使用之單·、二·及/或募糖可 就此形式使用’或可以培養基之總量為準包括可代謝之 早_、广及/或募糖濃度為至少5〇重量％，較好濃度至少為 6 〇重置％之i且合物游4、、么> 、 v式進行，且與水性液體培養基0)相 反，其基本上不含不溶於水之固體。 （）相 糖原料中存在之單…二-或寡糖較好選自單糖類，通常 為六礙糖及/或五碳糖’例如葡萄糖、果糖、甘露糖、； 乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖及核 ::::糖及半乳糖，™糖、麥芽糖、乳:為： 其疋庶糖。亦適用去炎留k α ^ 用者為早糖及二糖之混合物，及且 例併入有葡萄糖成份之募糖，及此等與單糖及二：之 116419.doc -28- 200804602 混合物。 包括可新謝之單_、二-及/或寡糖濃度至少50重量％且基 本上不含不溶於水之固體之組合物實例包括葡萄糖漿、蔗 糖糖漿，濃稠果汁、麥芽糖漿、葡聚糖漿，以及自糖生產 所產生之廢料（糖蜜），尤其是甜菜糠生產所產生之糖蜜及 甘庶糖生產所產生之糖蜜。 最佳者為主要包括單-及/或二糖，尤其是葡萄糖及/或蔗 糖之物質，以及包括葡萄糖及/或蔗糖，及具有高比例併 • 人有糖成份如葡萄糖、蔗糖、葡萄糖漿、蔗糖糖漿、濃稠 果汁及糖蜜之募聚糖之混合物。 如同液體培養基（1)，單_、二_及/或寡糖，及包括此等 之組合物不只可於最初製備發酵培養基（批次相）中使用， 且若後者係以分批饋入或半連續式饋入形式進行，則亦可 於發酵期間饋入。 經由添加液體培養基（1)導入發酵中之單_、二_及/戋寡 糖總量較好成為導入發酵中之單-、二_及寡糖總量之至少 40重量％，尤其至少5〇重量％，最好至少6〇重量％，例如 40至95重量。/〇，尤其50至90重量％，且最好6〇至95重量 % 〇 液體培養基（1)及單-、二-及/或寡糖，或包括此等之級 合物可彼此分開或者一起饋入發酵中。 本發明較佳具體例中，液體培養基（丨）及單_、二_及/嘎 募糖’或包括此等之組合物係在饋入發酵之前彼此混合。 因此， 當使用通常具有100至400 g/kg之單_、 二_及寡糖低 116419.doc -29- 200804602 總濃度之液體培養基時，步驟al)及a2)後所得之含糖液體 培養基（1)之糖總含量增加，較好增加至少5〇 g/kg，尤其 增加至少100 g/kg，最好增加至少150 g/kg，例如增加5〇至 300 g/kg，尤其是100至250 g/kg，且最好12〇至2〇〇⑽代 量增加，增加至以總量為準超過4〇重量％，較好至少竹重 ΐ %，尤其至少50重量％，且最好至少55重量％。 將此等糖原料添加於液體培養基（1)之後，所得液體培 養基之乾-物質含量以總重為準較好為45至8〇重量％，且最 ⑩ 好為50至75重量％，或55至75重量％。本文中，較好經由 凋整溫度控制液體培養基（1)之黏度，使得最大值不超過 Pas，更好為15 Pas，且最好為8 pas。 +本發明較佳具體例中，係得自糖生產之含葡萄糖·或含 蔗糖副產物之形式將單-及/或二糖添加於第一液體培養基 ()中實f列為由甘嚴糖或尤其是甜菜糖之糖生產中所產生 之糖蜜。 _ 依據本發明，係將步驟al)及a2)中製備之液體培養基 及與其不同之糖原料饋入發酵中，且於其中進行微生物培 養。發酵中會因微生物而產生細菌代謝物。 毛酵可依熟悉本技藝者已知之慣用方式進行。因此，通 窄於以本文所述方法製備之液體培養基中培養所需微生 物。 發酵方法可分批進行或者以逐批饋入之方式（包含配合 收取中間物分批饋入）進行，較佳者為分批饋入之製程。 例如，以本發明方法所得之液體培養基（1)或習知糖原 116419.doc 200804602 料’亦即可代謝之單_、二_及/或寡糖，或包括濃度至少為 50重量％且基本上通常不含不溶於水之固體之可代謝單一、 二-及/或寡糖之組合物，或其混合物均可以所需微生物接 種’且若適宜隨後以水稀釋且添加慣用之培養基構成份如 緩衝液、營養鹽、氮原料如硫酸銨、尿素等，複合營養培 養基構成份，包括胺基酸如酵母提取物、蛋白腺、CSL 等’且此微生物可在發酵條件下倍增直至微生物濃度達到 發酵所需之固定狀態。此處，液體培養基中存在之糖經 代謝且形成所需之代謝物（亦稱為批式製程或批式期）。 虽進行批次饋入製程時’接著將經由供給可藉本發明方 法獲得之其他液體培養基（1)及除液體培養基（1)以外之糖 源，尤其是經由供給藉使液體培養基（1)與除液體培養基 (1)以外之糖原料混合製備之液體培養基，及以發酵液中累 積之微生物過度產出之代謝物而持續該發酵製程，代謝物 亦可能存在於微生物之細胞中及發酵培養基之水相中。 發酵較好以批次饋入製程進行。就此而言，程序通常會 依循使用含糖液體培養基例如使用液體培養基（〗）或另一種 糖原料先使微生物倍增，直到達到發酵槽中所需之微生物 /辰度為止。隨後，再將液體培養基與其他糖原料，亦即 可代謝之單-、二-及/或寡糖或包括可代謝之單_、二-及/或 寡糖浪度至少為50重量％且基本上不含不溶於水之固體之 培養基饋入發酵槽中。此維持發酵製程，且微生物過度產 之代物於發酵液中累積（參見前述）。饋入之含糖液體 培養基（1)與其他糖原料對最初導入且含微生物之批次培養 116419.doc -31- 200804602 基之體積比通常約為1:1〇至10:1，且較好約1:5至51，且 最好在1:1至5 :1之間。發酵液體中之糖含量尤其可經由包 括糖之液體培養基之饋入速率加以控制。通常，饋入速率 可以發酵液中之單糖含量在>〇重量％至約5重量％之間，且 袁好不超過3重量％之值之方式調整。 步驟a2)中所得之包括糖之液體培養基或其與其他糖原 料之混合物若適宜可在發酵之前先經殺菌，微生物通常因 熱或化學方法而被破壞。基於此理由，通常使包括糖之液 ⑩ 體培養基在超過80°C之温度下加熱。細胞破壞或溶胞可在 發酵之前立即發生。結果，使所有包括糖之液體培養基先 進行溶胞或破壞。此可經由熱、機械或化學方法進行。 本發明尤其關於具有至少3個C原子或具有至少2個C原 子及至少1個N原子之有機非揮發性化合物之生產製程。本 文中’非揮發性有機化合物經了解意指無法在不經歷下自 發酵液體蒸餾回收之化合物。通常，此等化合物之沸點在 _ 大氣壓力下高於水之沸點，經常高於150°C，尤其是高於 200 C。通常’其為在標準條件（298 K，101.3 kPa)下為固 態之化合物。 然而’亦可在非揮發性微生物代謝物生產之發酵中使用 本發明之包括糖之液體培養基，該等代謝物在大氣壓力下 之溶點低於水之沸點及/或具有油性黏度。 名詞非揮發性微生物代謝物尤其包括具有3至丨〇個碳原 子’且若適宜具有一或多個，例如1、2、3或4個經基附接 於其上之有機單-、二-及三羧酸，例如酒石酸、衣康酸、 H6419.doc -32- 200804602 琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羥基丙酸、富馬酸、馬來酸、 2,5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙搭酸、葡萄糖酸、烏頭酸及 一胺基壬二酸、榉棣酸；蛋白及非蛋白胺基酸例如離胺 酸、穀胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、天門冬胺酸、色胺酸 及蘇胺酸；嘌呤及嘧啶鹼；核苷及核苷酸，例如菸鹼醯胺 腺嘌呤二核苷酸（NDA)及腺苷_5，_單磷酸鹽（AMp);脂質； 較好具有1〇至22個碳原子之飽和及不飽和脂肪酸，例如 T _亞麻油酸、二均-γ-亞麻油酸、花生四烯酸、二十碳五 烯酸、及二十二碳六烯酸；較好具有3至8個碳原子之二元 醇’例如丙二醇及琥珀醇；具有3或多個，例如3、4、各或 6個ΟΗ基之多元醇’例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、木 糖醇及阿拉伯糖醇；具有至少4個碳原子，例如似個碳 原子之長鏈（亦稱為較長鏈）醇，例如丁醇；碳水化合物例 如玻尿酸及海蕩糖；芳族化合物例如芳族胺、香草醛及靛 藍；維他命及維他命原例如抗壞血酸、維他㈣、維他命 Βΐ2及核黃素、辅因子及已知為營養辅助品者；蛋白質例 如酵素如澱粉酶、果酸酶、豸、混合或天然之纖維素酶、 1旨：如脂f酶、腾腺酶、蛋白酶、木糖酶及氧化還原酶如 二、過乳化氫及過氧化物酶、葡萄聚糖酶、植酸酶、類 ^素、例如莊紅素、β-萌蘿菌素、瑕青素、玉米黃素 =整黃質；具有細至10個碳原子及若適宜之i或多個 =之:類，例如丙酮及乙偶因（aeetGin);内醋例如丫·丁 m 物聚口物例如聚羥基乙酸酯、聚酯例如 ㈣Μ二婦、聚酿胺；及前驅物及上 116419.doc • 33 - 200804602 述化合物之衍生物。適合作為非揮發性微生物代謝物之其 他化合物描述於Gutcho之發酵化孥品（Chemicals by

Fermentation), Noyes Data Corporation( 1973), ISBN: 0818805086 中。 名詞’’輔因子”包括對於正常酵素活性發生為必要之非蛋 白值化合物。此等化合物可為有機或無機，較好本發明之 辅因子分子為有機者。該等分子之實例為NAD及菸鹼醯胺 腺苦二核普磷酸鹽（Nadp);此等輔因子之前驅物為於 酸。 名詞"營養辅助品，，包括可促進植物及動物，尤其是人類 健康之食物添加劑。該等分子實例為維他命、抗氧化劑及 某些脂質，例如多不飽和脂肪酸。 產生之代謝物尤其選自酵素、胺基酸、維他命、二糖、 具有3至10個C原子之脂肪族單_及二羧酸類，具有3至1〇個 C原子之脂族羥基羧酸類，具有3至1(H@C原子之酮類，具 有4至10個C原子之烷醇類，及具有3至1〇個(：原子尤其是3 至8C原子之烧二醇類。 熟悉本技藝者可了解因此發酵產生之化合物在各情況下 係藉由所用微生物產生之對映體形式（若存在不同之對映 體）而獲得。因此，通常在胺基酸之情況下係、獲得個別之 L-對映體。 發酵中所用之微生物依本身已知之方式取決於相關微生 物代謝物’如後文詳述。其可為天然、源或經基因改良。適 且之被生物及發酵製程實例列於下表A中： 116419.doc -34 - 200804602 【實施方式】 表A :

物質 微生物 參考文獻 酒石酸 乳桿菌 (Lactobacilli)，例如 德氏乳桿菌 (Lactobacillus delbrueckii)) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH，1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), 衣康酸 土生曲徽 (Aspergillus terreus)、衣康酸曲 黴(Aspergillus itaconicus) Jakubowska, in Smith and Pateman (Eds.), Genetics and Physiology of Aspergillus, London: Academic Press 1977; Miall, in Rose (Ed.)? Economic Microbiology, Vol· 2, pp. 47-119, London: Academic Press 1978; US 3044941 (1962). 琥珀酸 放線桿菌屬BOZ (Actinobacillus sp. 13QZ)，琥珀酸厭氧 螺菌 (Anaerobiospirillum succiniproducens)， 琥珀酸放線桿菌 (Actinobacillus succinogenes, E. coli) Int· J· Syst Bacteriol. 26, 498-504 (1976); EP 249773 (1987)，Inventors: Le mme and Datta; US 5504004 (1996), Inventors: Guettler, Jain and Soni; Arch. Microbiol. 167, 332-342 (1997); Guettler MV, Rumler D，Jain MK” Actinobacillus succinogenes sp. nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan; 49 Pt 1:207-16; US5723322, US5573931, US5521075, WO99/06532, US5869301，US5770435 羥基丙酸 德氏乳桿菌 (Lactobacillus delbrtickii)，莱氏乳 桿菌(L· leichmarmii )氣菊糠 芽孢乳桿菌 {Sporolactobacillus inulinus) ROMPP Online Version 2.2 116419.doc -35- 200804602

物質 微生物 參考文獻 丙酸 丙酸桿菌 (Propionibacterium) ，例如阿拉伯糖丙酸 桿菌 (R arabinosum)，謝 氏丙酸桿菌 (P. schermanii),費 氏丙酸桿菌 (P. freudenreichii), 梭狀丙酸桿菌 (Clostridium propionicum), Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 二胺基壬二 酸 麩胺酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH5 1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), 檸檬酸 黑趨菌(Aspergillus niger)，溫特曲黴 (Aspergillus wentii) Crit. Rev. Biotechnol. 3, 331-373 (1986); Food BiotechnoL 7,221-234 (1993); 10, 13-27 (1996). 烏頭酸 黑趨菌(Aspergillus niger),溫特曲黴 (Aspergillus wentii) Crit. Rev. Biotechnol. 3, 331-373 (1986); Food Biotechnol· 7, 221-234 (1993); 10， 13-27 (1996).; Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 and 1993-1995; 蘋果酸 曲黴菌(Aspergilli)， 例如黃曲黴 (Aspergillus flavus)， 黑曲黴(A· niger)， 米趨菌(A. oryzae)， 棒桿菌 (Corynebacterium) US 3063910 葡糠酸 曲黴菌(Aspergilli)， 例如黑曲黴 (A. niger) Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), 116419.doc -36· 200804602

物質 微生物 參考文獻 丁酸 梭狀芽孢桿菌 (Clostridium)(例如 丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)，丁 酸梭菌 (C. butyricum)) (ehm，Biotechnology, Weinheim， VCH? 1980 and 1993-1995; 乳酸 乳桿菌例如德氏乳 桿菌(L· delbriickii)， 萊氏乳桿菌 (L· leichmannii), ilehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH，1980 and 1993-1995; 離胺酸 糙胺酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79,1-35. 麩胺酸 麩胺酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79, 1-35· 蛋胺酸 麵胺酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79,1-35. 苯基丙胺酸 麵胺酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)，大腸桿 菌(Exoli) Trends BiotechnoL 3, 64-68 (1985); J· Ferment Bioeng. 70, 253-260 (1990). 蘇胺酸 大腸桿菌(E.coli) Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79,1-35· 天門冬胺酸 大腸桿菌(E.coli) Ikeda, M.: Amino Acid Production Process (2003), Adv. Biochem. Engin/Biotechnol 79,1-35 and references cited therein， Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973) 嗓呤及13密唆 驗 枯草桿菌(Bacillus subtilis) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH，1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), | 116419.doc -37- 200804602

物質 ^ 菸鹼胺腺嗓 呤二核苷酸 (NAD) 微生物 ---- 枯草桿菌(Bacillus subtilis) 參考文獻 Rehm，H,J·: Biotechnology，Weinheim， VCH，1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 腺苷-5’’-單 磷酸鹽 (AMP) 枯草桿菌(Bacillus subtilis) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation， Noyes Data Corporation (1973)， 7 -亞麻油酸 曲黴(Mucor)，莫拉 氏菌(Mortiella)，趨 Μ M (Aspergillus SPP). Gill，I·，Rao, V··· Polyunsaturated fatty acids，part 1: occurence，biological activities and applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10), 401-409; Zhu5 H.: Utilization of Rice Brain by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Lousiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). 二均亞 麻油酸 莫拉氏菌 (Mortiella)，耳黴菌 (Conidiobolus),水 黴菌(Saprolegnia spp〇 Gill，I” Rao, V·: Polyunsaturated fatty acids，part 1: occurence，biological activities and applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10), 401-409; Zhu, H.: Utilization of Rice Brain by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Lousiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). 花生四稀酸 莫拉氏菌 (Mortiella)，植物菌 ^(Phytium spp.) Gill，I·，Rao, V·: Polyunsaturated fatty acids，part 1: occurence，biological activities and applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10)5 401-409; Zhu5 H.: Utilization of Rice Brain by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Lousiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). 116419.doc 38- 200804602 物質 微生物 參考文獻 二十碳五烯 酸 莫拉氏菌 (Mortiella)，植物菌 屬(Phytium spp·，) 光合菌 | [Rhodopseudomonas )，腐敗希瓦菌屬 (Shewanella spp.) Gill, I., Rao, V.: Polyunsaturated fatty acids, part 1: occurence, biological activities and applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10)5 401-409; Zhu, H. : Utilization of Rice Brain by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Lousiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). 二十二碳六 烯酸 破囊壺菌 (Thraustochytrium), 蟲黴菌屬 (Entomophthora spp·)，凫合菌 I [Rhodopseudomonas )，腐致希瓦菌屬 (Shewanella spp.) Gill，I·，Rao, V·: Polyunsaturated fatty acids, part 1: occurence, biological activities and applications (1997). Trends in Biotechnology 15 (10)? 401-409; Zhu, H.: Utilization of Rice Brain by Pythium irregulare for Lipid Production. Master Thesis Lousiana State University, 31.10.2002 (URN etd-1111102-205855). 丙二醇 大腸桿菌(E.coli) DE 3924423, US 440379, WO 9635799， US 5164309 琥珀醇 產氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes),枯草桿 菌(Bacillus subtilis)， 產酸克雷伯士菌 (Klebsiella oxytoca) Rehm，H，J·: Biotechnology，Weinheim, VCH，1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， H.G. SCHLEGEL and H.W. JANNASCH, 1981; Afschar et al.: Mikrobielle Produktion von 2.3- Butandiol [Microbial production of 2.3- butane diol. CIT 64 (6), 2004, 570-571 丁醇 梭狀芽孢桿菌 (Clostridium)(如丙 酮丁酸梭菌 (Clostridium acetobuytlicum)，丙 酸梭菌（C. propionicum)) Rehm? H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 甘油 酵母(Yeast),鹵氏 酵母菌 (Saccharomyces rouxii) Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 116419.doc -39- 200804602

微生物 參考文獻 甘露糖醇 曲黴菌(Aspergillus Candida)，球擬酵母 菌(Torulopsis mannitofaciens) Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 阿拉伯糖醇 鹵氏酵母菌 (Saccharomyces rouxii), S. mellis, Sclerotium gluccmicum，Pichia ohmeri Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 木糖醇 釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) Gutcho, Chemicals by Fermentation， Noyes Data Corporation (1973), 玻尿酸 鏈球菌 (Streptococcus spp.) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 and 1993-1995; 海藻糖 短桿菌 (Brevibacterium), 棒桿菌 (Corynebacterium), 微桿菌 (Microbacterium)， 節桿菌屬 (Arthrobacter spp.)5 Pleurotus genus， Filobasidium floriforme JP 05099974, JP 06311891，FR 2671099， EP 0555540, JP 3053791，Miyazaki，J.-L， Miyagawa，K,I·，Sugiyama，Y·: Trehalose Accumulation by Basidiomycotinous Yeast, Filobasidium floriforme. Journal of Fermentation and Bioengineering 81, (1996) 4,315-319· 抗壞企酸 產黑葡萄桿菌 (Gluconobacter melanogenes) ROMPP Online Version 2.2 維他命Βΐ2 初油酸菌 (Propioni bacterium 外^)，脫氧假單胞 菌(Pseudomonas denitrificans) Chem. Ber. 1994, 923-927; ROMPP Online Version 2.2 116419.doc -40- 200804602

物質 微生物 參考文獻 核黃素 枯草桿菌(Bacillus subtilis)絲、狀子嚢 議(Ashbya gossypii) WO 01/011052, DE 19840709， WO 98/29539, EP 1186664; Fujioka，K.: 核黃素(維他命B2)之新穎生物技術及核 黃素之特性，Fragrance Journal (2003)， 31(3)，44-48· 維他命b6 熱帶根瘤菌 (Rhizobium tropici), 目蓿根瘤菌(n 9 meliloti) EP0765939 酵素 曲徽菌(Aspergilli) (例如黑曲黴 (Aspergillus niger), 米曲黴（A. oryzae»， 木黴菌 (Trichoderma), 乂 腸桿菌(E.coli)，藻 遜酵母(Hans enula) 或畢氏酵母菌 (Pichia)(例如帕斯 德畢氏酵母菌 (Pichia Pastorius))，桿菌 (Bcicillus)(例如地 衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)，枯草 芽孢桿菌 (B· subtilis))及許多 其他菌 Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH，1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 玉米黃素 杜氏鹽藻 (Dunaliella salina) Jin et al (2003) Biotech.Bioeng. 81:115-124 斑警黃質 短桿菌 (Brevibacterium) Nelis et al (1991) J Appl Bacteriol 70:181-191 蘇紅素 三孢布拉黴 (Blakeslea trispora), 釀酒酵母(Candida utilis) WO 03/056028, EP 01/201762, WO 01/12832, WO 00/77234， Miura et al (1998) Appl Environ Microbiol 64:1226-1229 1164I9.doc -41- 200804602

物質 微生物 參考文獻 β-葫蘿蔔素 三孢布拉黴 (Blakeslea trispora), 釀酒酵母(Candida utilis) Kim S” Seo W.，Park Y·，Enhanced production of beta-carotene from Blakeslea trispora with Span 205 Biotechnology Letters，Vol 19, No 6, 1997, 561-562; Mantouridou F.5 Roukas T.: Effect of the aeration rate and agitation speed on beta-carotene production and morphology of Blakeslea trispora in a stirred tank reactor: mathematical modelling, Biochemical Engineering Journal 10 (2002), 123-135; WO 93/20183; WO 98/03480, Miura et al (1998) Appl Environ Microbiol 64:1226-1229 蝦青素 酵母菌(Phaffia rhodozyma);釀酒 酵母(Candida utilis) US 5,599,711; WO 91/02060， Miura et al (1998) Appl Environ Microbiol 64:1226-1229 多羥基-烷酸 聚酯 大腸桿菌 (Escherchia coli), 產驗桿藏 (Alcaligenes ，及許多其他 菌 S. Y. Lee, Plastic Bacteria, Progress and Prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria，Tibtech，Vol· 14， (1996)，pp· 431-438” Steinbiichel，2003; Steinbtichel (Ed·)，Biopolymers，1st ed” 2003, Wiley-VCH, Weinheim and references cited therein 多醣 腸膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)，聚 糖明串珠菌(L· dextranicum)野菜黃 單胞桿菌 、 (Xanthomonas campestris)及許多 其他菌 Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH，1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973)， 類聚異戊二 浠 乳—菌(Lactarius sp).，躐傘菌 (Hygrophorus sp·), 野生皇M(Russula . sp)· Steinbiichel (Ed.), Biopolymers, 1st ed., 2003, Wiley-VCH5 Weinheim and references cited therein 116419.doc -42- 200804602

物質 微生物 ^^ 參考文獻 丙酮 梭狀芽孢桿菌 (Clostridium)(例如 丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)y 酸梭菌(C propionicum)) Rehm, H.-J.: Biotechnology, Weinheim, VCH, 1980 and 1993-1995; Gutcho, Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), 乙偶因 產氣腸桿菌 (Enterobacter aerogenes)，丙_丁 醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，乳 酸球菌(Lactococcus lactis) Lengeler，J.W·，Drews，G·，Schlegel，H.G.: Eds., Biology of the Procaryotes, Thieme, Stuttgart (1999), p. 307; ROMPP Online-Edition 香草酸 鏈臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)，澱粉乳桿 菌屬(Amycolatopsis Ψ·) Priefert, H·，Rabenhorst，J·，Seinbtichel，A· Biotechnological production of vanillin. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, 296-314 (2001) Thurmgensin 蘇雲金芽孢桿菌 (Bacillus thuringiensis) Jian-Zhong Jong et al.: Fed-batch culture of Bacillus thuringiensis for thuringensin production in a tower type bioreactor. Biotechnology and Bioengineering 48 (3) (2004), 207-213. 聚肽 弗氏鏈黴菌 (Streptomyces fradiae)，—維堆囊 菌（Sorangium cellulosum) Kirst: Fermentation-derived compounds as a source for new products. Pure & Appl. Chem· 70 (2)，（1998)，335-338; Zirkle et al.: Heterologous production of the antifungal polyketide antibiotic soraphen A of Sorangium cellulosum So ce26 in Streptomyces lividans. Microbiology 150 (8)，(2004)，2761-74. 赤黴酸 藤倉赤黴菌 (Gibber ella fujikuroi) Hollmann et al.: Extractive fermentation of Gibberellic acid using Gibberella fujikuroi. CIT 7(1995), 892-895. 116419.doc -43- 200804602 物質 ^ 微生物 τ~—--- 參考文獻 靛監 埃希氏大腸桿菌 (Escherichia coli) JB102 Berry，A” Dodge，T.C·，Pepsin，M·，Weyler， W.: Application of metabolic engineering to improve both the production and use of biotech indigo. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 28 (2002)， 127-133. 本發明較佳具體例中，已製造之有機化合物係選自視情 況有鲮基附接於其上且具有3至10個C原子之單-、二-及三 羧酸，其中有蛋白質及非蛋白質胺基酸、嘌呤鹼、嘧啶 鹼 '核苷、核苷酸、脂質；飽和及不飽和脂肪酸；具有4 至10個C原子之二元醇、具有3或多個羥基之多元醇、具有 至少4個C原子之長鏈醇、碳水化合物、芳族化合物、維他 命、維生素原、辅因子、營養輔助品、蛋白質、類葫蘿蔔 素、具有3至10個C原子之酮類、内酯、生物聚合物及環糊 精。 本發明第一較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括 糖之液體培養基用於酵素如植酸酶、木糠酶或葡聚糖酶之 發酵生產中之用途。 本發明第二較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括 糖之液體培養基用於胺基酸如離胺酸、蛋胺酸、蘇胺酸之 發酵生產之用途。 本發明其他較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括 糖之液體培養基用於維他命如泛酸及核黃素、及前驅物與 衍生物之發酵生產之用途。 本發明其他較隹具體例係關於可依據本發明獲得之包括 116419.doc -44- 200804602 糖之液體培養基用於下列之發酵生產之用途： 具有3至10個C原子之早·、二·及三敌酸，尤盆是於巧 單-及二羧酸，如丙酸、富馬酸及琥珀酸； -具有3至10個C原子之脂質羥基羧酸，如乳酸； -如上述之長鏈烷醇，尤其是具有4至1(H@C原子之烷醇如 丁醇； -上述之二元醇，尤其是具有3至1〇個，特別是3至8個匸原 子之烧二醇。如丙二醇； -上述之酮，尤其是具有3至1(H^C原子之嗣，如丙_ ;及 -上述之碳水化合物，尤其是二糖如海藻糖。 其他特佳具體例中，以微生物發酵生產之代謝物為多經 烷酸酯如聚_3_羥基丁酸酯及與其它有機羥基羧酸之共聚 醋’該其它有機經基緩酸如3-經基戊酸、4-經基丁酸及 Steinbiichel (上述引用文）中所述之其他者，包含例如長鏈 (亦稱為較長鏈）之經基叛酸如3 -經基辛酸、3 -經基癸酸及 3 - Μ基十四烧酸，及此等之混合物。為進行此發酵，可使 用已就其他碳進料所描述之類似條件及程序，例如 S.Y. Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhy droxyalkanoate production in bacteria，Tibtech, Vol. 14, (1996)，pp· 431-438。 較佳具體例中，發酵所用之微生物因此俵選自過度生產 出下列代謝物之至少一種之天然或重組微生物·· -酵素如植酸酶、木糖酶或葡聚糖酶； -胺基酸如離胺酸、蘇胺酸或蛋胺酸； 116419.doc -45- 200804602 -維他命如泛酸及核黃素；及其前驅物及/或衍生物； -二糖類如海藻糠； -具有3至10個C原子之脂族單-及二羧酸，如丙酸、富馬 酸及琥始酸； -具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸，如乳酸； -聚羥基烷酸酯如聚-3-羥基丁酸酯及3-羥基丁酸之共聚 酯； -具有3至10個C原子之酮如丙酮；

-具有4至10個C原子之烷醇如丁醇；及具有3至8個C原子 之烷二醇如丙二醇。 適宜之微生物通常選自下列菌屬··棒桿菌 {Corynebacterium) v ® {Bacillus) (Ashbya) ' 埃 希氏菌（五、曲黴菌、產驗菌 (Alcaligenes、、放線桿菌、厭氧螺菌 、乳桿菌、丙酸桿菌 (Propionibacterium)、根黴菌(Rhizopus)及梭菌 {Clostridium) » 尤其是葡萄棒桿菌 、枯草桿菌以）、絲狀子囊菌 gwvp/i)、埃希氏大腸桿菌（心a//)、黑 麴菌或協腹產驗菌/aiw)、 琥 ί白酸厭氧螺菌succiniproducens)、琥 ί白酸放線桿菌、德氏乳桿菌 {Lactobacillus c/e/6n^cA:z7)、賴氏乳桿菌 leichmannii)、阿拉伯糖丙酸桿菌 116419.doc -46· 200804602 arabinosum)、希氏丙酸桿菌所 schermanii)、塞氏丙酸桿菌 freudenreichii)、丙缴後壤（Clostridium propionicum)、鴨 米卡梭菌/brm/coacei/cwm)、丙酮丁 醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)、鬚根黴菌(Rhizopus arr/z/zw)及米根黴菌（Λ/π·2：ο/7ΐ^ oryzae)之菌株。 較佳具體例中，發酵中所用之微生物為棒桿菌 (Corynebacterium)屬，尤其是葡萄棒桿菌 (Corynebacterium g/wiam/cwm)之菌株。尤其，棒桿菌屬之 菌株，特別是葡萄棒桿菌，其過度產生胺基酸，尤其是離 胺酸、蛋胺酸或穀胺酸。 另一較佳具體例中，發酵中使用之微生物為埃希氏菌 (五屬之菌株，尤其是埃希氏大腸桿菌 (五co/ί)菌株。尤其，其為埃希氏菌（五 屬之菌株，尤其是埃希氏大腸桿菌（凡菌 株，其可過度產出胺基酸，尤其是離胺酸、蛋胺酸或蘇胺 酸。 最佳具體例中，發酵中微生物所產生之代謝物為離胺 酸。為進行發酵，可使用已就其他碳進料所敘述之類似條 件及程序，例如述於Pfefferle等人（上述引用文）及 US 3,708,395。原則上，連續及不連續（批式或批次饋入） 操作模式均適用，但較佳者為批次饋入。 又最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為蛋 胺酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料所敘述之類似條 116419.doc -47- 200804602 件及程序，例如WO 03/087386及WO 03/100072中所述 者。 另一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為 泛酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料敘述之類似條件 及程序，例如WO 01/021772中所述者。 另一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為 核黃素。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條 件及程序，例如 WO 01/011052、DE 19840709、 WO 98/29539、EP 1 186 664及 Fujioka，K.:核黃素（維他命 B2)之新穎生物技術及該核黃素之特性，Fragrance Journal (2003)，31(3)，44-48 中所述者。 又另一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物 為富馬酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似 條件及程序，例如Rhodes等人之”於20升發酵槽中製造富 馬酸’’，Applied Microbiology，1962，10 (1)，9-15 中所述 者。 又一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為 琥珀酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條 件及程序，例如 Int. J. Syst· Bacteriol. 26，498-504 (1976);頒與Lemme 及 Datta 之 EP 249773 (1987);頒予 Guettler，Jain 及 Soni 之 US 5,504,004 (1996) ； Arch.

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Syst Bacteriol. 1999 Jan;49 Pt 1:207-16; US 5,723,322, US 5,573,931, US 5,521,075, WO99/06532, US 5,869,301 ^US 5,770,435中所述者。 另一最佳具體例，發酵中之微生物所產生之代謝物為植 酉义酶為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條件 及程序，例如WO 98/5 5 599中所述者。 發酵會產生發酵液，該發酵液除所需之微生物代謝物以 外，基本上包括發酵期間產生之生物量，糖化澱粉溶液之 非代谢構成伤，且尤其是澱粉原料之非澱粉質固態成份如 纖維及未利用之糖’以及未使用之緩衝液及營養鹽。依本 申明案，忒液體培養基亦稱為發酵液，名詞發酵液亦涵蓋 (包括糖m體培養基，其中存在之糖僅進行部份或不完全 之發酵轉化，亦即已發生可利用之糖（例如單_及二糖）之部 分或不完全之微生物代謝作用。 分離或消耗微生物代謝物之前或移除發酵液之揮發性構 成伤之如’可依上述方式進行殺菌步驟。 本發明之特定具體例係關於自發酵液消耗或分離至少一 種微生物代謝物之方法。隨後移除發酵液之大部分揮發性 構成份，獲得固態或半固態蛋白質組成物。進行該製程及 所得蛋白質組成物之更詳細敘述為本申請公司之 WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728)之主題，其提及相 關之細節。 自發酵液分離或消耗之代謝物，亦即具有至少3個(：原子 或具有至少2個C原子及至少一個\原子之有機化合物（此後 116419.doc -49- 200804602 亦稱為有價值產物）通常係以自發酵液消耗或分離至少一 種代謝物，使發酵液中之該代謝物含量總計不超過20重量 %，尤其不超過10重量％，更好不超過5重量％，且最好不 超過2.5重量％之方式進行，各情況均以留下之發酵液總重 為準。

微生物代謝物可依一或多步驟自發酵液分離或消耗。本 文中之基本步驟係自發酵液移除固態成份。此可在分離有 "(貝值產物之刖或之後進行。亦包括針對有價值產物之粗略 /月洗及精細純化之步驟以及其調配之本技藝中習知使用之 方法對分離有價值產物及移除固體（例如固-液相分離）兩者 均為已知（例如述於Belter，P.A，Bioseparations··生物技術 之下游加工（D〇Wnstream Processing f〇r Bi〇teehn〇l〇gy)，

John Wiley & Sons (1988)，及 Ullmann’s之工業化學手冊 (Ullmarm’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，第五版 於 CD-ROM上，Wiley-VCH)。 為分離有價值產物，宜依循之程序為先經由例如離心 過遽自發酵液移除固態構成份，接著經由例如結晶、 澱、吸附或蒸餾自液相分離有價值產物。或者，亦可經 例如使用層析法或萃取法直接自發酵液分離有價值產物 須特別提及之層析法為離子交換層析，其中有價值產物 ㈣析m選擇性分^此例中’自留下之發酵液移 固體較好經由例如傾析、蒸發及/或乾燥進行。 在揮發性或油狀化合物之情沉下，a 間之最大、”…广 常需要監控加工: 度，尤其疋乾燥期間。此等化合物較好亦經 116419.doc • 50 - 200804602 在吸附劑上調配成擬·固體而製備。適用於此目的之吸附 劑詳述於例如本申請公司之wo 2005/116228 (PCT/ EP2〇〇5/〇〇5728)中。可有利的以該方式製備之化合物實例 為γ-亞麻油酸、二均-γ-亞麻油酸、花生四烯酸、二十碳五 烯酸及二十二碳六烯酸，以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇 及丙酮。擬固體調配物中之此等化合物就本發明之目的而 言亦了解為固態非揮發性微生物代謝物。 另一特定具體例係關於其中實質上或完全移除發酵液之 揮發性構成份，而未事先分離或消耗非揮發性微生物代謝 物，且若適宜，未事先移除部份固態構成份，產生非揮發 性被生物代謝物之固態調配物。進行該製程之更詳細敘述 見於本申請公司之PCT/EP2006/066057 (早期專利申請案 DE 102005042541.0)中。 實枭上"意指一旦移除揮發性構成份後，留下固態或至 少半固悲殘留物，其若適宜可經由添加固體轉化成固態產 物。通常，此意指移除揮發性構成份至殘留之含水量不超 過30重量％，經常不超過2〇重量％，且尤其不超過^重量 /〇通韦，發酵液之揮發性構成份宜自發酵液移除至殘留 之含水量為經乾燥後所測定之固成份總重為準之〇 2至3〇 重量％之間，較好為1至20重量％，尤其好為2至15重量 %，且最好為5至15重量％。殘留之含水量可經由熟悉本技 藝者藉熟悉之習知方法測定，例如藉由熱比重計測定 (Hemminger 等人，熱分析法（Meth〇deii der thermischen

Analyse), Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1989) 〇 116419.doc 200804602 自發酵液獲得固態非揮發性代謝 以一 ^ ^ t ^ 一或多步驟 進仃，尤其是以一-或二-步驟程序進行。通當， 態代謝物而言，至少一步驟，尤1 〆又侍固 步驟。 ％尤其疋取後步驟會包含乾燥 一步驟程序巾，發料之揮發性構成份若適宜可在前述 預先移除之後移除，直到達到所需殘留含水量為止。 二·或多步驟程序中，熱濃縮發酵液將先經過滤（微過 ^、超過渡）濃縮’或經由使部份揮發性構成份基發而濃 縮。此步射移除之揮發性構成份量，以發酵液之揮發性 構成份之無水物為準，通常為1G請重量％且最好為2〇至 70重量H多道後續步驟中，係移除發酵液之剩餘揮 發性構成份，直到達到所需之殘留含水量為止。 依據此具體例，揮發性構成份實f上自被體培養基移除 而未經事先消耗或確實分離有價值產⑯。因A，當移除發 酵液之揮發性構成料，非揮發性代謝物基本上不隨同液 體培養基之揮發性構成份一起移@，但會與I酵液之至少 部份’經常與其大部分，尤其是與全部其它固態成份一起 留在所得殘留物中。據此’然而’當移除此等成份時，亦 可能與發酵液之揮發性構成份一起移除_較好小量_的所需 非揮發性微生物代謝物’且以代謝物之總無水物為準，通 常不超過20重量％，例如〇.1至2〇重量％，較好不超過1〇， 尤其是不超過5重量％，更好不超過2.5重量％，且最好不 超過1重量％。特佳具體例中，所需非揮發性微生物代謝 物留下之量，以代謝物總乾重為準，至少為9〇重量％，特 116419.doc •52- 200804602 別是至少95重量％，《其是99重量％，且最好約⑽重量 。/❶，該非揮發性微生物代謝物為含有已移除揮發性構成份 後獲得之發酵培養基之固體成份之部分或含發酵培養基之 所有固態構成份之混合物固體。 、若需要’可在移除揮發性構成份之前，經由例如離心或 過濾自發酵液分離部分（例如5至8〇重量％，尤其是別至 重量％)非澱粉質固態成份。若適宜，將進行該預先分離以 移除不包括或僅包括小量非揮發性微生物代謝物之粗固態 顆粒。該預先過濾可使用熟悉本技藝者已知之習知方法， 例如使用粗篩網、網狀物、穿孔板等進行。若適宜，亦可 以離心力分離器分離粗的固體顆粒。此處所用之設備如傾 析器、離心機、沉降機及分離器亦為熟悉本技藝者已知。 此方式中，可獲得包括澱粉原料之非揮發性代謝物及非揮 發性、通常為固態之非澱粉質構成份，或至少其大部份、 經常至少90重量％或所有固態非澱粉質構成份之固態或半 固態（例如糊料）殘留物。 與發酵之固態成份一起存在之無水代謝物性質可依本身 已知方式，經由添加調配助劑如載劑及塗覆物質、黏合劑 或其他添加劑而調配，尤其是針對各種參數如活性物質含 篁、粒徑、顆粒形狀、形成粉塵傾向、吸濕性、安定性尤 其是儲存安定性、顏色、氣味、流動行為、凝聚傾向、靜 電荷、對光之敏感性及溫度敏感性、機械安定性及再分散 性加以調配。 1知使用之調配助劑包含例如黏合劑、載劑物質、粉化/ 116419.doc -53- 200804602 流動佐劑、其他之調色顏料、殺菌劑、分散劑、消泡劑’、 黏度凋節劑、酸、鹼、抗氧化劑、酵素安定劑、酵素抑制 劑、吸附劑、脂肪、脂肪酸、油或此等之混合物。該等調 配助劑可有利的用做乾燥助劑，特別是當使用調配及乾燥 方法時，如噴霧乾燥、流動床乾燥及冷凍乾燥時。其他細 節 I 見PCT/EP2006/066057 (早期申請案de 10200504254L0) 中0 上述添加劑及若適宜之其他添加劑如塗覆物質之量可依 _ 相關代"射物特疋之需求及所用添加劑之性質大幅度變化， 且可在例如0.1至80重量％，尤其是1至3〇重量％之間變 化，各情況均以其最終調配之形式中之產物或物質混合物 之總重為準。 調配助劑之添加可在收取發酵液（亦稱為產物調配或固 體設計）之前、期間或之後進行，尤其是在乾燥期間。較 好在收取發酵液或代謝物之前添加發酵助劑可能較有利， _ 纟其Μ善欲收取物質或產物之加玉性。調配助劑可添加 mu態獲得之代謝物中或包括該代謝物之溶液或懸浮液 中，例如在發酵完成後直接加於發酵液中，或收取期間及 最終乾燥步驟之前添加於所得溶液或懸浮液中。 因此，例如此等助劑可與微生物代謝物之懸浮液預混 合；該懸浮液亦可經由例如噴佈於其載體物質上或與其= 合而施加於載劑物質。乾燥期間調配助劑之添加在當喷： 包括該代謝物之溶液或懸浮液時相當重要。添加調配助劑 最好是在乾燥之後進行，例如當施加塗料/塗覆層於經乾 116419.doc -54- 200804602 燥顆粒時。其他佐劑可在乾燥之後及視需要的塗覆步驟之 後添加於產物中。

自發酵液移除揮發性構成份係依本身已知方式，經由自 液相分離固體之慣用方法進行，包含過濾法及使液相之揮 發性構成份揮發之方法。亦可能涵蓋粗略清洗有價值產物 之步驟及調配步驟之該方法敘述於例如Belter，P_ A，生物 分離：生物技術之下游加工（Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology), John Wiley & Sons (1988) 5 及 Ullmann’s 之工業化學手冊（Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)，第五版於 CD-ROM 上，Wiley-VCH。可用於產物調配物之範圍中或發酵結束後之收取之 熟悉本技藝者已知之方法、設備、助劑及通用或特定具體 例進一步敘述於EP 1038 527、EP 0648 076、EP 83 5613、 EP 0219 276、EP 0394 022、EP 0547 422、EP 1088 486、 WO 98/55599、EP 0758 018及 WO 92/12645 中。 此具體例之第一種變化，當非揮發性微生物代謝物以溶 解態存在於液相時，係經由例如結晶或沉澱自液相轉成固 相。隨後，經由例如離心、傾析或過濾分離非揮發性固態 構成份（包含代謝物）。亦可以類似方式分離油狀代謝物， 相關之該油狀發酵產物可經由添加吸附劑例如氧化矽、矽 膠、肥土、黏土及活性碳轉化成固態。 該具體例之第二種變化中，係經由蒸發移除揮發性構成 份。該蒸發可依本身已知方式進行。使揮發性構成份揮發 之適宜方法為喷霧乾燥、流體床乾燥或流體床凝聚、冷凍 116419.doc -55- 200804602 乾燥、空氣乾燥機及接觸乾燥機，及押出乾燥。亦可進行 上述方法與成形方法如押出、造粒或噴射造粒法之組合。 此等後述方法中，較好使用部分或大部分預先乾燥之:括 代謝物之物質混合物。 。較佳具體例中，移除發酵液之揮發性構成份包含喷霧乾 燥法或流體床乾燥法，包含流體床造粒法。為此，係將^ 發酵液（若適宜可預先分離以移除僅包括小量任何非揮: 性微生物代謝物之粗固態顆粒(若有的話)之後)饋入一或多 個喷霧乾燥或流化床乾燥裝置中。負載有固體之發酵液之 輸送或饋人係藉由包括固體之液體之㈣輸送裝置之方 式，例如泵浦如偏心單旋轉翼螺旋系浦（例#得自Delasco PCM)或高壓系浦（如得自LEWA Herbe讀t如紐）方便地 進行。 發酵液可依下列方式進行： ⑴自步驟a2)中獲得之液體培養基⑴或其與其他糖進料 之混合物移除以總重為準不超過50重量％之部份，例 如5至45重篁％，且剩餘者，若適宜與上述定義之盆 他糖進料-起供應至發酵作用中，該發酵係用以生產 弟-種代謝物⑷’例如固態非揮發性代謝物㈧或揮 發性代謝物（A);及 ()已被移除之为，右適宜係在先前已移除殿粉進料之 所有或部分非澱粉質固態成份之後，若適宜可與上述 定義之其他糖進料-起加於發酵作用中，該發酵係用 以生產與代謝物⑷相同或不同之第二種代謝物⑻。 116419.doc -56 - 200804602 若分離（ϋ)之非澱粉質固態構成份，則液體培養基剩餘 部份之固體含量較好不超過50重量％，更好不超過3〇重量 %，最妤不超過10重量％，且最好不超過5重量％。該情況 下，最好在用以生產第二種代謝物（B)之發酵前使所有固 體分離。

此程序使得在（ii)之個別發酵中使用微生物成為可能， 而該微生物須符合某些最小要件例如關於氧輸送速率。於 (ii)之個別發酵中使用之適宜微生物為例如芽孢桿菌屬， 較好為枯草桿菌（仏•"似μ如…）。此個別發酵中藉該微 生物所生產之化合物尤其選自維他命、辅因子及營養輔助 品、嗓吟《咬驗、核苦及斜酸、㈣、，飽和及不飽和 脂肪酸、芳族化合物、蛋白質、類葫蘿蔔素、尤其是選自 維他命、辅因子及營養辅助品、蛋白質及類葫蘿蔔素者， 且最特別者為選自核黃素及泛酸鈣者。 此程序之較佳具體例係關於於二個個別發酵中平行生產 相同之代謝物（Α)及（Β)。此尤其對於具有不同純度需求之 相同代謝物之不同應用有利。據此，第一種代謝物㈧， =如欲作為進料添加劑之胺基酸例如離胺酸、蛋胺酸、蘇 胺酸或榖胺酸係使用含固體之發酵液生產，且相同之第二 種代謝物（Β)例如欲作為食品添加劑用之相同胺基酸係使 用⑻之固體經消耗之發酵液生產。由於完全或部份移除 非殿粉質固體成份，當收取其應用領域具有高純度需求例 如食品添加劑之代謝物時，可降低其純化複雜性。 又較佳具體财，此程序可如下列般進行。用以生產代 116419.doc -57- 200804602 謝物A例如胺基酸如離胺酸、蛋胺酸、縠胺酸或蘇胺酸、 生產檸檬酸或乙醇之較佳大容積發酵係依據例如述於 WO 2005/116228 (PCT/EP2005/005728)或 PCT/EP2006/

066057 (早期專利申請案DE 102005042541.0)之方法進 行’或依據生物酒精發酵生產之已知先前技藝（見上述）進 行。依據（i)，移除步驟a2)中獲得之部份液體培養基（1)， 或移除其與其他糖進料之混合物。依據⑴移除之部分可經 由慣用方法例如離心或過濾（取決於生產B之發酵需求）， 在（ii)中完全或部份不含該固體。依此方式獲得之液體培 養基（1)(其視情況完全或部分不含固體）係依據（ii)饋入生 產代謝物B之發酵中，且若適宜可與上述定義之其他糖進 料一起添加。依據（ii)中分離之固體流較好回到此大容積 發酵之含糖液體培養基流中。 若大容積發酵生產之微生物代謝物（A)為乙醇，則自液 體培養基⑴回收。液體培養基⑴此時之糖含量應在乙醇 之發酵生產（生物酒精）中可用者，例如通常在2〇至3〇重量 %之間。通常’步驟⑴中剩下之含糖液體培養基⑴係在此 程序中供給至生產A之發酵中（亦即在本狀況下為乙醇）。 已經於步驟⑴巾移除之部份含糖液體培養基⑴與其他糖 進料-起供給至B之發㈣產中，若適宜，則在依據步驟 (Π)移除固體之後。 上述私序之另-較佳具體例中，此發酵中以微生物生產 之代謝物B為核黃^為進行該發酵，可使用已對其他碳 進料敘述之類似條件及程序，例如w〇咖觀、 116419.doc -58- 200804602 DE 19840709、WO 98/29539、EP 1186664及 Fujioka，Κ.: 核黃素（維他命B2)之新穎生物技術及核黃素之特性（New biotechnology for riboflavin (vitamin B2) and character of this riboflavin)· Fragrance Journal (2003)，31(3)，44-48。 為進行該製程之其他變化法，就生產代謝物A例如胺基 酸如離胺酸、榖胺酸、蘇胺酸或蛋胺酸、生產檸檬酸或乙 醇而言，係如上述般進行較佳之大容積發酵。依據（i)，移 除步驟a2)中獲得之部份含糖液體培養基，且依據（ii)經由 慣用方法例如離心或過濾使完全或部分不含固體。基本上 完全或部分不含固體之由其獲得之含糖液體培養基，在該 核黃素之例中，係在添加額外之糖進料之後，依據（ii)饋 入生產代謝物B之發酵中。依據（ii)分離之固體流較好回到 大容積發酵之含糖液體培養基流中。 依據（ii)因而產生之含核黃素發酵液可經由對其他碳進 料所敘描述之類似條件及程序而獲取，例如DE 4037441、 EP 464 582、EP 438767及DE 3819745。細胞體溶胞後，較 好經由傾析分離以結晶態存在之核黃素。亦可能有其他分 離固體之方式例如過濾。隨後，較好藉由喷霧乾燥機及流 體床乾燥機使核黃素乾燥。或者，依據（ii)生產之含核黃 素發酵混合物可在類似條件下及使用如EP 1048668及 EP 730034中所述類似程序加工。經加熱殺菌後，使發酵 液雞心，且以無機酸處理剩餘之含固體部分。藉過濾自酸 性水溶液培養基移除所形成之核黃素，若適宜則經洗滌且 接著乾燥。 116419.doc -59- 200804602 此程序之其他較佳具體财，發酵巾由微生物生產之代 谢物B為泛酸。為進行發酵’可使用如對其他碳進料所描 述如WO 01/021772所述之類似條件及程序。 為進行此製程變化方法，可依循上述針對核黃素所述之 程序。已依據（U)進行預先純化且較好實質上不含固體之 含糖液體培養基⑴，或其與其他糖進料之混合物饋入依據 (Π)之用以生產泛酸之發酵中。此時，最好使黏度比含固 體之液體培養基降低。分離之關流較好回到大容積發酵 之含糖液體培養基流中。 依據（U)生產之含泛酸發酵液可在類似條件下且使用已 對其他碳進料敘述之類似程序下收取，如Ερι 〇5〇219及 WO 01/83799所述。所有發酵液經加熱殺菌後，以例如離 心或過濾移除剩餘固體。使該固體分離步驟中獲得之澄清 液部分蒸發，若適宜則以氯化鈣處理且經乾燥，尤其是= 霧乾燥。 ' 已分離之固體可與平行之大容積發酵製程之範圍内之個 別所需微生物代謝物（A)—起獲得。 乾燥及/或調配步驟後，可將全部或經研磨之榖類胚 仁’較好為玉米、小麥、大麥、小米、小黑麥及/或裸麥 添加於產物調配物或蛋白質組成物中。 下列實例將說明本發明之各目的，但須了解並非用以限 制本發明。 實例 I·研磨澱粉進料 116419.doc -60 - 200804602 以下所用之研磨基料係如下列般製造。使用旋轉研磨機 徹底研磨全部玉米胚仁。使用不同攪拌器、研磨方式及篩 網元件，獲得三種不同程度之細度。以實驗室震動篩網 (振動分析器：Retsch Vibrotronic type VE1 ;過篩時間5分 鐘’振幅.1 · 5 mm)過師分析研磨基料，獲得表I中所列之 結果。

表I 實驗編號 T 70/03 T 71/03 T 72/03 <2 mm/% 99.4 100 100 <0.8 mm/% 66 100 99 < 0.63 mm/% 58.6 98.5 91 < 0.315 mm/% 48.8 89 65 <0.1 mm/% 25 9.6 <0.04 mm/% 8 3.2 研磨基料總計 20 kg 11.45 kg 13.75 kg II.酵素性殿粉液化作用及澱粉糖化作用 II.1糖化步驟中未使用植酸酶 ILla)酵素性澱粉液化作用 將320克乾燥研磨之玉米榖粉（T71/03)懸浮於480克水中 且藉連續攪拌與3 10毫克氯化鈣預混合。整個實驗中持續 攪拌。以H2S〇4使pH達6.5且混合物已經加熱至35°C後，添 加 2.4 克之 Termamyl 120L，L型（Novozymes A/S)。40 分鐘 期間，使反應混合物加熱至86.5 °C之溫度，若需要再以 NaOH調整pH至上述值。在30分鐘内，添加額外400克乾燥 研磨之玉米胚仁（T71/03)，製程期間之溫度上升至91°C。 使反應混合物維持在該温度下約100分鐘。接著添加額外 2·4克丁61：11^111711201^，且使混合物維持在該溫度下約1〇〇 116419.doc -61- 200804602 分鐘。實驗期間使用碘_澱粉反應追蹤液化作用之進展。 溫度最後上升至100°C且反應混合物再維持20分鐘。此時 不再偵測到澱粉。反應器冷卻至35°C。 II· lb)糖化作用

在固定攪拌下使II.la)中獲得之反應混合物加熱至61 °C。整個實驗過程中持續攪拌。以H2S04使pH達4.3後，添 加 10.8 克（9· 15^#)2DextrozymeGA(NovozymesA/S)。 溫度維持約3小時，期間以葡萄糖試驗條片（Boehringer之 S-Glucotest)追蹤反應進展。結果列於下列II中。接著使反 應混合物加熱至80°C接著冷卻。此獲得約1180克之液態產 物，密度約1.2kg/l，且以紅外線乾燥機測定之無水物含量 計約為53.7重量％。以水洗滌後獲得約14重量％之無水物 含量（無水可溶成份）。反應混合物之葡萄糖含量以HPLC測 定計為38〇g/l(見表II，樣品編號7)。

表II 樣品編號. min (自葡萄糖酵添加 後計時） 上層液之葡萄糖濃度[g/1] 1 5 135 2 45 303 3 115 331 4 135 334 5 165 340 6 195 359 7 225 380 II.2糖化作用步驟中使用植酸酶 II.2a)澱粉液化作用 如II.1 a)中所述般使乾燥研磨之玉米榖粉樣品液化。 I16419.doc -62- 200804602 II.2b)糖化作用 在固定攪拌下使II.2a)中獲得之反應混合物加熱至61 °C。整個實驗過程中持續攪拌。以h2s〇4使pH達4.3後，添 加 10.8 克（9.15¾ 升）之 Dextrozyme GA (Novozymes A/S)及 7〇 μΐ植酸酶（700單位之植酸酶，購自BASF AG之Natuphyt Liquid 10 000L)。溫度維持約3小時，期間以葡萄糠試驗 條片（Boehdnger之S-Glucotest)追蹤反應進展。隨後使反應 混合物加熱至80°C接著冷卻。反應混合物之葡萄糖含量以 HPLC測定。 Π.3澱粉之酵素性液化作用及醣化作用之另一種方法 II.3a)玉米榖粉 將360克去離子水加於反應槽中。將154毫升之(^(：12原 料溶液（100克CaCl2 X 2H20/1)加於漿料中，使最終濃度約 為70 ppm Ca2+。在固定攪拌下將240克玉米榖粉緩慢添加 於水中。使用50重量％濃度之NaOH水溶液將pH調整為6.5 後’添加4.0毫升（=2重量％酵素/無水物）之Termamyl 120 L type L (Novozymes A/S)。接著使漿料快速加熱至85°C。該 製程過程中需要持續追蹤，且若適宜，則調整pH。 達最終溫度後，添加額外榖粉，最先添加50克榖粉。另 外，於漿料中添加0·13毫升CaCl2原料溶液，使Ca2+濃度保 持在70 ppm。添加期間，使溫度維持在85°C。至少使之維 持10分鐘以確保反應完全，接著添加額外部分（50克榖粉 及0.13毫升CaCl2原料溶液）。添加二部份後，添加1.67毫 升Termamyl，隨後添加另外二部份（各情況下，添加50克 116419.doc •63- 200804602 榖勃及0_13霉升CaCh原料溶液）。無水物含量達到55重量 %。添加後，使溫度上升至100。(：，且使聚料彿騰1〇分 鐘。 取出樣U口且冷卻至室溫。樣品以去離子水（約u 〇)稀釋 後，添加一滴濃Lugol’s溶液（每升5克碘及1〇克碘化鉀之混 口物）。鮮豔藍色顯示存在殘留澱粉，當所有澱粉水解後 發現變成棕色。當試驗顯示存在一部份殘留澱粉時，再度 使溫度降至85。(：，且維持恆溫。再添加167毫升之 • Termamyl直到碘-澱粉反應呈現陰性為止。 就後續之糖化作用反應而言，使對澱粉試驗呈陰性之混 合物達61 C。藉由添加50。/。濃度之硫酸使1)11為4 3。反應 過程中使pH保持在該值。溫度維持在61〇c。添加5·74毫升 (一 1·5 重 f % 酵素 / 無水物）之 Dextr〇zym GA (N〇v〇zymes A/S)，使液化澱粉轉化成葡萄糖。使反應進行一小時。為 使酵素不活化，因此使混合物在85它下加熱。將熱的混合 _ 物充填於經殺菌之容器中，經冷卻再儲存於4°C下。獲得 420gA之最終葡萄糖濃度。 II.3b)裸麥榖粉（包含以纖維素酶/半纖維素酶預處理） 將360克去離子水加於反應槽中。在固定授拌下將155克 裸麥榖粉緩慢添加於水中。温度保持在固定5〇〇c下。使用 50重量％濃度之Na0H水溶液將1>11調整為55後，添加3.21 宅升（一2·5 重 1 % 酵素 / 無水物）之 viscozyme L (Novozymes A/S)。30分鐘後，添加額外榖粉，先添加55克榖粉。再3〇 分鐘後，添加另外50克榖粉；再30分鐘後，再添加40克榖 116419.doc -64- 200804602 粉。最後一次添加30分鐘後，開始進行液化。

添加1 ·7毫升CaCl2原料溶液（100克CaCl2 X 2H20/1)。使 用50重量％Na0H水溶液將pH調整為6.5後，添加5·〇毫升 (-2重量％酵素/無水物）之Termamyi 12〇 [ type L (Novozymes A/S)。接著使漿料快速加熱至μ。〇。該製程 過程中持續追蹤PH，且若適宜則調整pH。 達到最終溫度後’添加額外榖粉，先添加6〇克榖粉。另 外’於漿料中添加0.13毫升CaCb原料溶液以維持Ca2+濃度 在7〇 ppm。添加期間，使溫度維持在固定之85〇c。至少使 之維持10分鐘以確保反應完全，接著添加額外部分（4〇克 榖粉及0·1毫升CaCU原料溶液）。添加ι·ι毫升Termamyl， 隨後添加另外一部份（4〇克榖粉及〇1毫升CaCl2原料溶 液）。無水物含量達到55重量％。添加後，使溫度上升至 l〇〇°C，且使漿料沸騰10分鐘。 取出樣品且冷卻至室溫。樣品以去離子水（約1:1〇)稀釋 後，添加一滴濃Lugol，s溶液（每升5克碘及1〇克碘化鉀之混 合物）。鮮豔藍色顯示存在殘留澱粉，當所有澱粉水解後 發現變成棕色。當試驗顯示存在一部份殘留澱粉時，再度 使溫度下降至85 I，且維持恆溫。再添加1 ·丨毫升之 Termamyl直到碘-澱粉反應呈現陰性為止。 就卩現後之糖化反應而言，使對殿粉試驗呈陰性之混合物 達61 c。藉由添加50%濃度之硫酸使pH為4·3。反應過程 中使pH保持在該值。溫度維持在6rc。添加5·74毫升卜 重里 乂酵素/無水物）之Dextr0Zym 〇Α (Novozymes A/S)，使 116419.doc -65- 200804602 液化澱粉轉化成葡萄糖。使反應進行一小時。為使酵素不 活化’因此使混合物在8 5 °C下加熱。將熱的混合物充填於 經殺菌之容器中，經冷卻再儲存於4°C下。獲得370g/l之最 終葡萄糖濃度。 II.3c)小麥榖粉（包含以木糖酶預處理） 將360克去離子水加於反應槽中。將水加熱至55°C，且 使用50重量％濃度之NaOH水溶液將pH調整為6.0。調整溫 度及pH後，添加3.21毫升（=2.5重量％酵素/無水物）之 Shearzyme 500L (Novozymes A/S) 〇 在固定擾拌下將 15 5 克 小麥榖粉緩慢加於溶液中。使溫度及pH保持一定。30分鐘 後，添加額外之榖粉，先添加55克榖粉。再30分鐘後，添 加另外50克榖粉；再30分鐘後，再添加40克榖粉。最後一 次添加3 0分鐘後，開始進行液化。 如II.3b中所述般進行液化作用及糖化作用。所得最終葡 萄糖濃度為400g/l。 III·菌株 ATCC13032 1ysCfbr 下列某些實例中，使用已敘述於WO 05/059144中稱為 ATCC13032 lysCfbr 之改質穀胺酸棒桿菌（Corynebactedum glutamicum strain)菌株。 實例1 在各例中，如下列1)所述般製備玉米、小麥及裸麥水解 物。各此等培養基中之總含糖量因添加各種糠溶液（包括 葡萄糖、粗糖、糖蜜）而增加。於使用穀胺酸棒桿菌 (ATCC13032 lysCfbr)及桿菌 PA824(詳述於 WO 02/061108 116419.doc •66- 200804602 中）作為碳進料之搖動瓶實驗中使用該等培養基β 1)毅粉水合物之製備 a) 玉米榖粉水解物 將360克去離子水加於反應槽中。在固定攪拌下將155克 玉米榖粉緩慢加於水中。 -液化作用 使甩50重量％濃度之Na〇H水溶液將{)11調整為5.8後，添 加2.6毫升（=2重量％酵素/無水物）之LiquoZyme sc (得自 NGV()zymes A/S)。接著將漿料迅速加熱至100°C且沸騰10 分鐘。此製程期間，持續追蹤pH且若適宜則調整。 取出樣品且冷卻至室溫。樣品以去離子水（約1:1〇)稀釋 後’添加一滴濃Lug〇l，s溶液（每升5克碘及1〇克碘化鉀之混 合物）。鮮豔藍色顯示存在殘留澱粉，當所有澱粉水解後 發現變成棕色。 -糖化作用 就Ik後糖化反應而言，使對澱粉試驗呈陰性之混合物達 C藉由’小加5'濃度之硫酸使pH為4.3。反應過程中 使pH保持在該值。溫度維持在6pc。添加2〇毫升卜^重 篁％酵素/無水物）iDextr〇zym ga (Novwyma a/s卜使液 化叙粉轉化成葡萄糖。使反應進行—小時。為使酵素不活 化，因此使混合物在饥下加熱。將熱的混合物充填於經 殺菌之容器中，經冷卻再儲存於4它下。 b) 小麥榖粉水解物 -木糖酶預處理 116419.doc -67- 200804602 將360克去離子水加於反應槽中。將水加熱至55。〇，且 使用50重量％濃度之Na〇iI水溶液將pH調整為6〇。調整溫 度及pH後，添加3·21毫升（=2·5重量％酵素/無水物）之

Shearzyme 500L (Novozymes A/S)。在固定攪拌下將155克 小麥榖粉緩慢加於溶液中。使溫度及ρΙί保持一定。最後一 久添加後3 0分鐘’開始進行液化。 如la)中所述般進行液化及糖化作用。 c)裸麥榖粉水解物 以纖維素酶/半纖維素酶預處理 將3 60克去離子水加於反應槽中。在固定攪拌之下將155 克裸麥榖粉緩慢添加於水中。溫度保持在固定5〇。〇下。使 用50重量％濃度之Na0H水溶液將1)11調整為5·5後，添加 3.21毫升（=2.5重量％酵素/無水物）之visc〇zyme l (NovozymesA/S)。最後一次添加3〇分鐘後，開始液化。 如實例la)中所述般進行液化及糖化作用。 2)接種體之製備 a)就穀胺酸棒桿菌而言 使細胞在殺菌之CM+CaAc瓊膠（組成：見表！；在121它 下20分鐘）上形成斑紋接著在3(rc下培育隔夜。接著自該 板上刮下細胞且再懸浮於鹽水中。在各例中，以使因此製 備之細胞懸浮液之光學密度在61 〇ηηι下之〇D610值達0.5之 量接種於含25宅升培養基（見表4)之250毫升裝置有二調節 板之三角瓶中。 116419.doc -68- 200804602 表1 : CM+CaAc瓊膠板之組成 濃度 成份 10.0 g/1 D-葡萄糖 2.5 g/1 NaCl 2.0 g/1 尿素 5.0 g/1 Bacto 蛋白腺(pifco) 5.0 g/1 酵母萃取物(Difco) 5.0 g/1 牛肉萃取物（Difco) 20.0 g/1 酸水解酿蛋白 20.0 g/1 瓊膠 b)對桿菌而言 在各例中，以0.4毫升冷束培養物接種於含4 2毫升預培 養之培養基（見表2)之250毫升裝置有二調節板之三角瓶 中，且在43 °C下於加濕搖晃器中搖晃培育24小時 (250rpm) 〇 表2 ··預培養之培養基組成 成份 濃度 麥芽糖 28.6 g/1 大豆粉 19.0 g/1 (NH4)2S〇4 7.6 g/1 穀胺酸單鈉 4.8 g/1 檸檬酸鈉 0.95 g/1 FeS04 X 7 H20 9.5 mg/1 MnCl2x4H20 1.9 mg/1 ZnS〇4 x 7 H20 1.4 mg/1 CoC12x6H20 1.9 mg/1 CuS〇4 x 5 H20 0.2 mg/1 Na2Mo〇4 x 2 H20 0.7 mg/1 K2HPO4 x 3 H20 15.2 g/1 KH2P〇4 3.9 g/1 MgCl2x6H20 0.9 g/1 CaCl2x2H20 0.09 g/1 MOPS 59.8 g/1 pH* 7.2 116419.doc -69- 200804602 *需以稀KOH水溶液調整 各例中以1毫升預培養物接種於含42毫升主要培養物培 養基（見表6)之250毫升裝置有二調節板之三角瓶中。 3)發酵液之製備 a)就穀胺酸棒桿菌而言 瓶内培養基組成列於表4。其起初之糖濃度應為60g/l。 一半之糖來自水解物（發酵培養基（1))，另一半以糖溶液形 式添加。因此，製備水解物及糖溶液之混合物且添加於該 # 瓶内培養基中。對照培養基中使用對應量之葡萄糖溶液。 -以添加糖製備榖粉水解物 製備下列溶液（見表3): 表3 ··以添加糖製備榖粉水解物 榖粉水解物 水解物中之 葡萄糖濃度 [g/1] 每升反樣 混合物之 水解物 Ml 糖溶液 糖溶液中之 濃度[g/ι] 每升反應混 合物之糖溶 液[ml] 玉米30% 250.0 240 葡萄糖 626 96 玉米30% 250.0 240 粗糖 639 94 小麥30% 258.9 232 葡萄糖 626 96 小麥30% 258.9 232 粗糖 639 94 裸麥30% 217.9 275 葡萄糖 626 96 裸麥30% 217.9 275 粗糖 94 表4 :瓶内培養基 含糖溶液之榖粉水解物 500 ml/1 (NH4)2S〇4 20 g/1 Urea 5 g/1 KH2P〇4 0.113 g/1 K2HP〇4 0.138 g/1 ACES 52 g/1 -70· 116419.doc 200804602 MOPS 21 g/1 檸檬酸χΗ20 0.49 g/1 3,4-二羥基苯甲酸 3.08 mg/1 NaCl 2.5 g/1 KC1 1 g/1 MgS04 x 7 H20 0.3 g/1 FeS04x7H20 25 mg/1 MnS04x4-6H20 5 mg/1 ZnCl2 10 mg/1 CaCl2 20 mg/1 H3BO3 150 pg/l CoCl2x6n2〇 100 pg/l CuC12x2H20 100 pg/l N1SO4 X 6 H20 100 叩/1 Na2Mo〇4 x 2 H20 25 gg/l 生物素(維他命H) 1050 pg/l 硫胺素xHCl(維他命氐） 2100 pg/l 菸鹼醯胺 2.5 mg/1 泛酸 125 mg/1 氰鈷胺素(維他命仏2) 1 μ§/ΐ 4-胺基苯甲酸(PABA;維他命H〇 600 pg/l 葉酸 1.1 μ^Ι °比多素(Pyridoxin)(維他命B6) 30 pg/1 核黃素(維他命b2) 90 pg/l CSL 40 ml/1 pH1 6.85

116419.doc •71- 1 以稀NaOH水溶液調整 接種後，使該瓶在30°C且在加濕搖晃器中搖晃（200rpm) 下培養3天。發酵結束後，以HPLC测定離胺酸含量。 HPLC分析係以Agilent 1100系列LC系統進行。以高壓液體 層析在Agilent 1100系列LC系統上測定胺基酸濃度。以鄰-苯二甲醛使管柱預先衍生化可對所形成之胺基酸定量；使 用Agilent HypersilAA管柱分離胺基酸混合物。結果列於 表5中。 200804602 表5 :裝置 榖粉水解物 糖溶液 離胺酸[g/1] 產率* 玉米 葡萄糖 12.50 0.21 粗糖 10.64 0.19 糖蜜 10.06 0.18 小麥 葡萄糖 10.82 0.18 粗糖 10.14 0.18 糖蜜 9.67 0.17 裸麥 葡萄糖 10.89 0.18 粗糖 9.59 0.16 糖蜜 9.67 0.16 對照物 11.54 0.20 *以總葡萄糖均等物為準 b)就桿菌而言 瓶内培養基之組成列於表6。其起初之葡萄糖濃度應為 28.6 g/Ι。一半之糖來自水解物，但另一半以葡萄糖溶液形 式添加。對照培養基中使用對應量之葡萄糖溶液。 表6 :瓶内培養基 玉米 250 g/Ι卞 57 ml/11 小麥 259 g/1 f 55 ml/1 % 裸麥 218 g/11 67 ml/1 % 葡萄糖溶液(c=626g/l) 23 ml/1 大丑粉 19.0 g/1 (NH4)2S〇4 7.6 g/1 榖胺酸單鈉 4.8 g/1 檸檬酸 0.95 g/1 FeS04 X 7 H20 9.5 mg/1 MnCl2x4H20 1.9 mg/1 ZnS〇4 x 7 H20 1.4 mg/1 CoC12x6H20 1.9 mg/1 GuS〇4 x 5 H20 0.2 mg/1 Na2Mo04 x 2 H20 0.7 mg/1 K2HP〇4 x 3 H20 15.2 g/1 116419.doc 72· 200804602 KH2P〇4 3.9 g/1 MgCl2 x 6 H20 0.9 g/1 CaCl2x2H20 0.09 g/1 MOPS 59.8 g/1 pH* *以稀NaOH水溶液調整 卞水解物中之葡萄糖濃度 ί每升培養基中所需量之累進水解物量

接種後，使瓶在43°C下及加濕搖晃器中搖晃（250 rpm)培 養24小時。發酵結束後，以HPLC測定葡萄糖及泛酸含 量。葡萄糖係在Bio-Rad之Aminex HPX-87H管柱協助下測 定。泛酸濃度係在Aqua C18管柱（Phenomenex)上經由分離 測定。 結果列於表7 〇 表7 : 24小時後之平均值 泛酸，t=24h[g/l] 產率[g泛酸/g葡萄糖] 玉米 2.7 0.09 小麥 2.4 0.08 裸麥 2.7 0.09 對照組 2.7 0.09 116419.doc -73-

Claims (1)

1. 200804602 十、申請專利範園： 1. -種發酵生產具有至少3個C原子或具有至少2紅原子及 至少-個N原子之至少一種有機化合物之方法，其包括 下列步驟： al)研磨澱粉進料，因而獲得包括該澱粉進料之至少部 分該非澱粉質固體構成份之研磨基料， a2)使該研磨基料懸浮於水性液體中且藉酵素液化作用 使研磨基料中之澱粉部分水解，且若適宜，隨後進 行糖化作用，因而獲得包括單-或寡糖之第一液體 ⑴；及

   b)使包括單-或寡糖之第一液體（1)與可代謝之單_、二_ 或养糖一起或與包括濃度至少5〇重量％之單_、二_ 或募糠且基本上不含不溶於水的固體之組合物一起 添加至包括微生物之發酵培養基中，該微生物可在 發酵條件下過量產生該有機化合物。 如明求項1之方法，其中步驟a2)中獲得之液體（〗）之單_、 二-及寡糖總量在100至400克/公斤之範圍。 如请求項1或2之方法，其中藉添加液體（丨）而 導入該發酵 中之單-、二-及/或募糖之量為導入該發酵中之單_、二一 及/或养糖總量之4〇至95重量％。 4.如刖述請求項中任一項之方法，其中第一液體中單_ 、二-及募糖總濃度係藉添加可代謝單，、二_及/或募糠或 藉添加包括濃度至少50重量❶/❶之可代謝單-、二_及/或募 糖且基本上不含不溶於水之固體之培養基，而增加至少 116419.doc 200804602 5 〇克/公斤。 5· : °月求項4之方法，其中液體⑴中之單-、二-及寡糖總 /辰度增加至在45〇至600克/公斤範圍内之值。 月2、述明求項中任一項之方法，其中包括可代謝單_、 一或寡糖之所用組合物為糖生產中之副產物，包括葡萄 糖及/或蔗糖及若適宜之葡聚糖。 7·如凊求項6之方法，其中包括可代謝單_、二-及/或寡糖 之所用組合物為得自甜菜糖生產之糖蜜。 8 ·如引述明求項中任一項之方法，其中步驟u )中之澱粉進 料為榖類胚仁。 9.如則述凊求項中任一項之方法，其中步驟&幻中，至少部 份之步驟al)所得研磨基料係藉由將其連續或批次添加至 水性液體中在水解條件水解者。 10·如切求項1至8中任一項之方法，其中步驟a2)中，係導入 水蒸氣至研磨基料之懸浮液中而將該懸浮液加熱至高於 研磨基料中存在之糊化溫度。 11 ·如刖述睛求項中任一項之方法，其中已生產之有機化合 物係選自視情況具有經基附接至其上且具有3至10個碳 原子之單-、二-及三羧酸，選自蛋白及非蛋白胺基酸、 嗓呤驗、喷啶驗；核苷、核苷酸、脂質；飽和及不飽和 脂肪酸；具有4至1〇個碳原子之二元醇、具有3或多個羥 基之多元醇、具有至少4個碳原子之長鏈醇、碳水化合 物、芳族化合物、維他命、維他命原、輔因子、營養輔 助品、蛋白質、類葫蘿訇素、具有3至10個碳原子之酮 116419.doc 200804602 類、内酯、生物聚合物及環糊精。 12·如前述請求項中任一項之方法，其中該發酵所用之微生 物係選自可過度生產出下列代謝物之至少一種之天然或 重組微生物：酵素、胺基酸、維他命、二糖類、具有3 至10個C原子之脂族單-及二羧酸、具有3至1〇個c原子之 脂族羥基羧酸、具有3至10個C原子之酮、具有4至10個C 原子之烷醇、具有3至8個C原子之烷二醇及聚羥基烷酸 酉旨。 13·如前述請求項中任一項之方法，其中該微生物係選自下 列菌屬：棒桿菌謂）、桿菌（&〇"—)、子 嚢菌(Ashbya)、埃希氏菌（Escherichia)、曲黴菌 (dwergiZ/Ms)、產驗菌、放線桿菌 (Actinobacillus)、厭 t 螺、菌 ^naerobiospirillum")、乳得 _ 似）、丙酸桿菌、梭菌 (C/wirMkm)及根黴菌（及/。 14.如請求項12或13之方法，其中該發酵所用之微生物係選 自可過度生產出胺基酸之天然或重組微生物。 15·如請求項13或14之方法，其中該微生物為棒桿菌 16·如請求項12或13之方法，其中該發酵所用之微生物係選 自可過度生產出酵素之天然或重組微生物。 17·如請求項16之方法，其中該微生物係選自過度產生植酸 酶之微生物。 18·如前述請求項中任一項之方法，其中使該有機化合物自 116419.doc 200804602 該發酵液巾耗㈣單離，且隨後將該發酵之揮發性構成 伤貝貝移除，獲得固體或半固體蛋白質組合物。/ 19·如明求項1至17中任一項之方法，其中移除該發酵液之 至少些許揮發性構成份而未事先單離或耗竭非揮發性微 生物代謝物，且（若適宜）未事先移除固體構成份，獲得 非揮發性微生物代謝物之固體調配物。

   116419.doc 200804602 七、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）

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