TWI406948B - 有機化合物之發酵生產 - Google Patents

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Description

有機化合物之發酵生產
本發明有關一種具有至少3個C原子或具有至少2個C原子及至少1個N原子之有機化合物之發酵生產，係使用含糖培養基來培養微生物，培養基中包括澱粉進料之至少一部份的非澱粉質構成份。
含糖液體培養基為多數發酵製程之主要營養物，存在於該培養基中之糖成份被所用的微生物所代謝而獲得有價值之有機產物。因此所製備之微生物代謝物範圍(即有機化合物)包括例如低分子量揮發性化合物如乙醇、非揮發性代謝物如胺基酸、維生素及類胡蘿蔔素，以及多種其他物質。
視各種製程條件而異，不同之碳進料被利用於一般已知之微生物發酵製程。其經由甜菜及甘蔗糖蜜及稱為高試驗糖蜜(逆轉甘蔗糖蜜)之純蔗糖擴大至來自澱粉水解物之葡萄糖。再者，乙酸及乙醇據述為輔受質，可利用於工業規模用於藉生物技術生產L－離胺酸(Pfefferle et al.,Biotechnological Manufacture of Lysine,Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Vol.79(2003),59－112)。
基於前述碳進料，已建立用於微生物代謝之糖基發酵製法之各種方法及程序。以L－離胺酸為例，例如Pfefferle等人(上物引用文)描述有關菌株發展、製程發展及工業製造。
用於微生物代謝之微生物調控發酵製法之重要碳進料為澱粉。後者在可作為發酵的糖進料之前，於前置反應中，須先經液化及糖化。結果，通常自天然澱粉進料如馬鈴薯、木薯、榖類例如小麥、玉米、大麥、裸麥、小黑麥或稻米以預先純化型態獲得，且隨後酵素性液化及糖化，隨後利用於確實的發酵操作用以產生所需代謝物。
除了使用此預先純化之澱粉進料以外，使用非預先處理之澱粉進料用於製備供發酵製造微生物代謝物之碳進料亦已被描述。依典型之方式，澱粉進料最初藉研磨磨碎。研磨基料接著進行液化及糖化。由於此研磨基料除了含澱粉以外，自然包括一系列可能對發酵有不良影響之非澱粉質構成份，因此該等構成份一般在發酵前移除。該移除可在研磨後直接進行(WO 02/077252；JP 2001－072701；JP 56－169594；CN 1218111)，液化後(WO 02/077252；CN 1173541)或隨後糖化(CN 1266102；Beukema等人：Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes；potato saccharification to give culture medium (Conference Abstract),Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983),6；NL8302229)。然而，所有變化方式皆涉及在發酵中使用實質上純的澱粉水解物。
發酵製造有機化合物之新穎方法尤其包括發酵前之澱粉進料的純化，例如已液化及糖化之澱粉溶液之純化(JP 57159500)，或提供使得自再生來源製造發酵培養基成為可能之方法(EP 1205557)。
相反地，未加工之澱粉進料已知已應用在大規模發酵製造生物酒精。此處，澱粉進料(一般為全穀物粒)首先進行乾燥研磨，然後使該澱粉進料之澱粉構成份藉酵素水解。此處，該水解可例如於攪拌容器中分批進行，或可例如於噴射烹煮器中連續進行。適宜方法的描述見於例如"The Alcohol Textbook－A reference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries"，Jaques等人(編輯),Nottingham Univ.Press 1995,ISBN 1－8977676－735,Chapter 2,pp.7 to 23及McAloon等人之"Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks",NREL/TP－580－28893,National Renewable Energy Laboratory,October 2000。
由於生物酒精的發酵製造中，有價值的產物係藉蒸餾獲得，因此使用得自乾研磨製程之非預先純化型態之澱粉進料不會構成嚴重之問題。然而，當使用該研磨方法製造其他微生物代謝物時，經由糖溶液導入該發酵作用之固體液流不僅對發酵產生問題(例如對氧轉換率或所用微生物之氧需求有不利作用。就此內容，參考Mersmann,A.et al.：Selection and Design of Aerobic Bioreactors,Chem.Eng.Technol.13(1990),357－370)，亦可能使後續操作變得相當複雜。
再者，導入固體之結果，懸浮液之黏度甚至在製備含澱粉之懸浮液時即達到臨界值，其結果為例如含大於30重量%玉米粉之懸浮液即已不再能均勻於水中混溶(Industrial Enzymology,2nd Ed.,T.Godfrey,S.West,1996)。此點會限制傳統製程中葡萄糖之濃度。至於發酵製造生物酒精而言，此點不再有關聯(因為產物對發酵所用的酵素具有毒性，故無論如何皆無法使較高之濃度以有意義之方式轉化)。
在酒精以外之有機代謝物發酵製造中，於發酵作用中以低糖濃度饋入含糖培養基理論上較不利，因為此程序導致發酵液體之不均勻稀釋，且結果為相關產物可達到之最終濃度減小，當該等產物係自發酵培養基中獲得時，其首先導致成本增加，且第二，其導致空間－時間產率降低。該等考量在澱粉水解物欲部分饋入較低容積次要發酵作用以製造其他化學品之情況下尤其重要(該澱粉水解物係於大容量製造生物酒精所製造，且傳統上具有低糖或至多約30或33重量%之葡萄糖濃度)。
由於該等困難及限制，已廣泛用於製造生物酒精之乾研磨方法在發酵製造酒精以外之微生物代謝物中一直不具特別的經濟重要性。
迄今，將乾研磨理論及理論上此方法中既有的優點應用至工業規模製造微生物代謝物之各種嘗試之敘述僅涵蓋使用木薯作為澱粉進料。因此，JP 2001/275693描述一種發酵製造胺基酸之方法，其中使用已以乾燥狀態被研磨之剝皮木薯塊莖作為澱粉進料。為了進行此方法，必須調整研磨基料之顆粒大小至≦150 μm。在此目的中所用之過濾步驟中，包含不含澱粉構成份之部分研磨基料在所得澱粉經液化/糖化之前被移除且隨後發酵。此方法中，獲得適度糖濃度。類似方法描述於JP 2001/309751，係用以製造含胺基酸之進料添加物。
在發酵作用所用之液體培養基中增加糖濃度可使用用於糖化作用之大量含有澱粉進料之固體、非澱粉質構成份之研磨基料，藉本案申請人之WO 2005/116228(PCT/EP 2005/005728)中所述方法而達成。意外地，已顯現出在澱粉進料中所存在之固體、非澱粉質構成份在發酵前不須被移除。使用自榖類科粒中選擇之澱粉進料之類似方法描述於本案申請人之PCT/EP 2006/066057(早期專利申請案DE 102005042541.0)。然而，此方法對於持續供給具有高糖濃度之含糖培養基較為複雜。
本發明之一目的係提供發酵生產有機化合物之另一方法，其不需要(至少不完全需要)事先移除澱粉進料中存在之非澱粉質構成份。尤其，該方法使澱粉進料之澱粉成份持續水解成為可能。再者，其特出點是能簡單處理所用的培養基及可毫無問題地使用於發酵方法中。尤其，該方法允許使用榖類作為澱粉進料。
意外的，已經發現生產有機化合物之發酵製程即使在發酵所需之糖係以由下列製備之水性培養基形式提供時可以在固有高的固體導入量下有效地進行：i)研磨澱粉進料，因而獲得包括該澱粉進料之至少一部分非澱粉質固體構成份之研磨基料，ii)使該研磨基料以能使懸浮液中無水物之含量至少為45重量%之量懸浮於水性液體中，iii)藉由液化使研磨基料中之澱粉成份水解，且若適宜接著經糖化，因而獲得包括澱粉進料之經水解澱粉構成份及至少部份澱粉進料之非澱粉質固體構成份之水性培養基M；其中之水解包括經由將水蒸氣導入懸浮液中而使研磨基料之懸浮液在高於研磨基料中存在之澱粉之膠凝溫度之溫度下加熱。
本發明因而提供一種發酵生產具有至少3個C原子或具有至少2個C原子及至少一個N原子之至少一種有機化合物之方法，該方法除步驟i)及ii)外包括下列步驟：iii)藉由液化使研磨基料中之澱粉成份水解，且若適宜接著經糖化，獲得包括澱粉進料之經水解澱粉構成份及至少部份澱粉進料之非澱粉質固體構成份之水性培養基M；及iv)於發酵中使用步驟iii)中製備之水性培養基M以培養可過度生產有機化合物之微生物；其中於步驟iii)中，經由將水蒸氣導入懸浮液中使步驟ii)中製備之懸浮液在高於研磨基料中存在之澱粉膠凝溫度之溫度下加熱。
儘管水解所用懸浮液中有高無水物含量，水解仍可依據本發明之方式毫無問題的進行，且據此獲得高濃度之可代謝糖。意外的，糖經水解後是否以單－或二糖之形式或以寡糖(＝糊精)之形式存在並不重要。意外的，所得培養基中澱粉進料之高含量固體、非澱粉構成份並不會妨礙發酵。再者，本發明之製程可大幅度的避免在澱粉進料液化時在較高研磨基料濃度下會出現之黏度問題。由於發酵培養基中高濃度之可代謝糖(其係高無水物含量所造成)，因此可特別有利的將培養基用於發酵之饋入期間，因而可大幅度的防止不期望之稀釋或至少明顯地降低。當然，可依據本發明製備之培養基M適用作發酵操作之批次期之糖源。
此處及以下之名詞"澱粉成份"及"澱粉含量"可交互使用。
當提及步驟iii)中製備之水性培養基M時，名詞"水性培養基"、"液體培養基"及"水性含糖液體"係交互使用。
此處及以下名詞"液化"意指澱粉水解性降解形成寡糖，尤其是楜精。
此處及以下名詞"糖化作用"或"糖化"意指楜經水解獲得單糖，尤其是獲得單糖如葡萄糖。因此，"糖化酵素"經了解意指使糊精水解獲得單糖之酵素。
此處及下列之名詞"糊精"意指因澱粉水解降解獲得之寡糖，該寡糖通常由3至18個，尤其是6至12個單糖原子，尤其是葡萄糖單元組成。
名詞"葡萄糖對等物含量"及"糖濃度"係指可能用於發酵之培養基中單－、二－及寡糖總濃度。名詞"葡萄糖對等物"意包括不同於葡萄糖之可代謝糖或糖單元。
此處及以下名詞"過度產生"或"過度生產"係用於指微生物以確認其產出一或多種量超過導致發酵培養基中累積之微生物增加所需量之其代謝物之特性，累積可能發生在細胞外或細胞內。
適合作為研磨用之澱粉進料主要為乾穀物或種子，其中澱粉含量為至少40重量%且較好至少50重量%(乾重)。此可見於目前大規模生長之許多榖類植物如玉米、小麥、燕麥、大麥、裸麥、小黑麥、稻米、甜菜、馬鈴薯、樹薯及各種蜀黍屬及稗粟物種，例如蘆粟及稗粟中。澱粉進料較好選自榖類，尤其較好為玉米、裸麥、小黑麥及小麥仁。理論上，本發明之方法亦可以類似澱粉進料進行，例如各種含澱粉之榖類或種子之混合物。
為了製備含糖液體培養基，相關之澱粉進料於步驟i)中，不添加或添加液體例如水之情況下研磨，較好未添加液體之下進行研磨。亦可能組合任何乾研磨及隨後之濕研磨步驟。
典型上可用於乾研磨之裝置為錘磨研磨機、轉子研磨機或輥研磨機；適用於濕研磨之裝置為紡錘混合機、攪動之球研磨機、循環研磨機、盤式研磨機、環室研磨機、擺振式研磨機或行星式研磨機。理論上，其他研磨機亦適用。濕研磨所需之液體量可藉熟知此項技術者於例行實驗中加以決定。一般調整方式為乾燥物含量在10至20重量%之範圍。
研磨使得顆粒適用於隨後方法步驟中。就此而言，已證明當研磨步驟(尤其是乾研磨步驟，步驟i))中獲得之研磨基料具有粉狀顆粒，亦即粒徑在100至630 μm範圍之微粒量在30至100重量%，較好40至95重量%且最好50至90重量%之微粒構成份時較有利。較好，所得之研磨基料包括50重量%之具有粒徑大於100 μm。通常，至少95重量%之所得粉狀顆粒具有小於2 mm之粒徑。就此而言，該粒徑係使用振動分析儀藉過篩分析而測量。理論上，小粒徑對於以高產率獲得產品而言較有利。然而，粒徑過小可能導致問題，尤其是當研磨基料在液化期間予以漿料化或加工例如發酵步驟後之固體乾燥期間，會有由於結塊形成/凝聚而產生問題。
一般，粉狀物係以萃取率或粉末等級加以特徵描述，其彼此修正成粉狀物等級特性隨萃取率增加而增加。萃取率對應於基於所施用之100重量份研磨基料所獲得之粉狀物重量之量。然而，研磨方法期間，最先獲得例如得自榖類胚仁內部之純的超微細粉狀物，而隨著進一步研磨，亦即隨著萃取率增加，粉狀物中粗纖維量及外皮含量增加且澱粉含量減少。因此萃取率亦反映於粉狀物等級，其用作為分類粉狀物之數字，尤其是榖類粉狀物，且其基於粉狀物之灰份含量(稱為灰份等級)。粉狀物等級或類別數值表示當100克粉狀固體焚燒時留下之灰份(礦物)毫克數。在榖類粉狀物之例中，較高類型數字意指較高萃取率，因為該榖類胚仁之核心包括約0.4重量%灰份，同時該外皮包括約5重量%灰份之故。在較低萃取率之情況下，該榖類粉狀物因此主要由粉碎之胚乳所構成，亦即榖類胚仁之澱粉含量，該榖類粉狀物亦包括榖類顆粒之經粉碎之含蛋白質糊粉層；在粗麥片粉之例中，其亦包括含蛋白質及含脂肪之胚芽及種子外皮之構成份，其包括粗纖維及灰份。就本發明目的而言，具有高萃取率或高類別數值之粉狀物理論上較佳。若利用榖類作為澱粉進料，則較好完整胚仁與其外皮一起研磨及加工，若適當，在事先機械移除胚芽及外皮之後進行。
依據本發明，所用之研磨基料含有至少些許，較好至少20重量%，尤其至少50重量%，特別是至少90重量%且最特別是至少99重量%之非澱粉質之固體構成份，其存在於經研磨之榖類胚仁中，相當於萃取率。基於研磨基料之澱粉質構成份(且因此基於培養基M中之可代謝糖之量)，研磨基料中非澱粉質固體構成份的量較好至少10重量%且尤其是至少15重量%，例如在15至75重量%之間，且特別是在20至60重量%之間。
接著，使步驟i)中之研磨基料與水性液體例如新鮮的水、循環製程水例如來自後續之發酵之製程水或與此等液體之混合物混合，形成水性懸浮液。此程序通常亦稱為漿料化。
通常，此等量之澱粉進料或研磨基料將與水性液體混合使所得之懸浮液具有無水物至少為45重量%，經常至少為50重量%，尤其至少為55重量%，特佳為至少60重量%，例如45至80重量%，較好50至75重量%，尤其55至70重量%，且最佳為60至70重量%。
理論上，可以使用以懸浮固體研磨基料之水性液體預熱至適度升溫，例如在40至70℃之範圍。較好液體溫度係選擇為所得之懸浮液具有低於膠凝溫度之溫度，較好至少低於澱粉膠凝溫度至少5 K。較好懸浮液溫度不超過60℃，尤其55℃。
使粒狀研磨基料懸浮於水性液體中可於該目的慣用之裝置，例如於攪拌混合器中分批，或於使固體與液體混合之連續操作混合裝置，例如以轉子/固定片原理操作之混煉機中分批或者連續進行達成。
為進行水解，先經由導入水蒸氣使包括研磨基料之水性懸浮液加熱至高於澱粉進料或研磨基料中存在之澱粉膠凝溫度。針對該目的之特定澱粉所需溫度為熟悉本技藝者已知(參見"The Alcohol Textbook－A reference for the beverage,fuel and industrial alcohol industries"(已於開頭提出)，第2章，第11頁)，或可由熟悉本技藝者以例行實驗決定。通常，懸浮液會在高於相關膠凝溫度至少10 K且尤其是至少20 K，例如10至100 K，尤其是20至80 K之溫度下加熱。尤其是將懸浮液加熱至90至150℃，尤其100至140℃之溫度。
將懸浮液加熱所用之水蒸氣通常為溫度至少105℃，尤其是至少110℃，例如110至210℃之超加熱水蒸汽。水蒸氣較好在超大氣壓之壓力下導入懸浮液中。據此，水蒸氣之壓力較好至少為1.5巴，例如1.5至16巴，尤其是2至12巴。
通常，水蒸氣係在超大氣壓之壓力，較好在1至10巴，最好在1.5至5巴之超大氣壓之壓力下，且較好在高速下導入懸浮液中。導入水蒸氣之結果為使懸浮液立即加熱至高於90℃之溫度，亦即高於膠凝溫度之溫度。
以水蒸氣加熱較好以連續操作裝置進行，其係在懸浮液之黏度、饋入速率及裝置之幾何形狀造成之特定饋入壓力下持續注入懸浮液，且經由可調整噴嘴，在以饋入之壓力為準升高壓力之下於懸浮液之注入區中注入熱的水蒸氣。在升高壓力下饋入水蒸汽意指不僅懸浮液被加熱，而且於系統中導入機械能，且該機械能會促使研磨基料顆粒進一步粉碎，引起特別均勻之能量供給，且因此造成研磨基料中之粒狀澱粉顆粒特別均勻之膠凝。此等裝置通常為管狀幾何形狀。水蒸氣較好延著管狀裝置之縱軸饋入。通常，懸浮液以至少45°角或以直角供給。可調整噴嘴之形狀通常為延著水蒸氣流動方向逐漸縮小之圓錐型。該噴嘴中配置沿著可縱向移動桿之尖針或圓錐體。尖針或圓錐體與尖針之圓錐體一起形成隙縫。經由軸向錯置尖針或桿，可以簡易之方式調整隙縫大小及因此形成之噴嘴終端處之剖面區域，因此可以簡單之方式控制水蒸氣供給之速度。
此等裝置通常亦配備有混合管，於其中輸送有已供給水蒸氣之懸浮液並使懸浮液離開該裝置。該混合管通常沿著水蒸氣供給且與饋入物垂直之方向排列。混合管與噴嘴通常一起形成間隙，懸浮液通過該間隙輸送。因此間隙之結果，在懸浮液傳送過程中將額外之剪力加於其上，且因此增加對懸浮液施加之機械能。混合管可依縱向移動之方式排列。混合管之移動為調整間隙大小簡易之方式，且因此降低裝置之壓力。
該裝置在先前技藝已知稱之為噴射烹煮器，例如"The Alcohol Textbook",Chapter 2，上述引用文，圖13所示且購自美國Waukesha WI,Hydro Thermal Corp.之稱為HYDROHEATER之裝置，當反應持續進行時，以水蒸氣處理之懸浮液通常隨後被送到後反應區，以便使澱粉成份持續膠凝。通常，後反應區中普遍為超大氣壓，一般為在2至8巴間之絕對壓力。後反應區中之溫度通常在90至150℃之間。該後反應區中之駐留時間可在1分鐘至4小時之間，視懸浮液之溫度而定。後反應區通常為管狀或管柱體。一具體例中，後反應區之形狀為垂直排列之管柱體。此處，一旦離開該水蒸氣處理裝置，懸浮液於施加於管柱體之上面區域中，且於下面區域中抽取出來。本發明另一具體例中，後反應區之形狀為管狀。
當懸浮液離開後反應區後，通常壓力會被釋放，且接著進行液化。壓力釋放較好依快速蒸發形式進行，以使懸浮液冷卻至較好低於100℃，尤其低於85℃之溫度。通常，在另一反應槽中使因此崩解之澱粉液化。該液化可如上述般進行。
液化可依慣用方式進行。通常，步驟ii)中之液化係在至少一種澱粉－液化酵素存在下進行，該酵素通常選自α－澱粉酶。亦可使用在反應條件下使澱粉有效且穩定的液化之其他酵素。
為使研磨基料中之澱粉部分液化，理論上可能使用所有澱粉－液化酵素，尤其是α－澱粉酶(酵素類EC 3.2.1.1)，例如獲自地衣型芽孢桿菌(Bacillus lichenformis )或嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus staerothermophilus )之α－澱粉酶，尤其是就生物酒精生產目的而言，為經由乾燥－研磨法獲得之液化物質所用者。較佳之酵素係溫度穩定，亦即即使在高於膠凝溫度之溫度下加熱亦不會喪失其酵素活性。液化作用適用之α－澱粉酶亦為可商業獲得，例如購自Novozymes之商品名Termamyl 120 L,L型；或購自Genencor之商品名Spezyme。對液化作用而言亦可使用不同α－澱粉酶之組合。
較好，澱粉－液化酵素，尤其是α－澱粉酶之量係依達成使澱粉迅速且完全降解成寡糖之方式選擇。澱粉－液化酵素，尤其是α－澱粉酶之量以所用澱粉進料之總量為準通常在0.002至3.0重量%之間，較好在0.01至1.5重量%之間，且最好在0.02至0.5重量%之間。α－澱粉酶(或所用之澱粉－液化酵素)可先導入反應槽中或者在液化步驟期間添加。
就最適效率的α－澱粉酶(或使用之澱粉－液化酵素)而言，步驟ii)較好在液化酵素最適之pH間之pH值下進行－至少些許時段，通常在弱酸範圍之pH下，較好在4.0至7.0，尤其是在5.0至6.5下，其中pH之調整經常使在步驟ii)開始之前或開始時進行；該pH較好經檢查且若適宜於液化製程期間再調整該pH。pH較好使用稀無機酸如H2 SO4 或H3 PO4 ，或稀鹼性氫氧化物溶液如NaOH或KOH調整。
為使所用之酵素安定，若適當，可使用例如CaCl2 將Ca2 ＋ 離子之濃度調整至酵素特定之最佳值。適用之濃度值可由熟悉本技藝者依慣用之實驗測定。例如若使用Termamyl作為α－澱粉酶，則較好將液體培養基中之Ca2 ＋ 濃度調整至例如10至100 ppm，較好20至80 ppm，且最好約30至70 ppm，單位ppm係以重量為準，且意指g/1000 Kg。
為使澱粉完全降解成糊精，使反應混合物維持在設定之溫度下，直到以碘偵測澱粉或若適宜以其他偵測澱粉之試驗為陰性或至少基本上為陰性為止。若適宜，可於此時將一或更多額外之α－澱粉酶部份，例如以所用澱粉原料之總量為準為0.001至0.5重量%，且較好為0.002至0.2重量%添加於反應混合物中。
依本發明較佳具體例，在水蒸氣加熱製程之前將至少部份或所有，通常至少50%，尤其至少80%或者所有澱粉－液化酵素添加於含研磨基料之水性液體懸浮液中。依此方式，在混合物加熱至高於膠凝溫度之溫度時已經發生液化製程。若適宜，進行水蒸氣加熱及後反應期。可省略另一反應槽中之後續液化步驟。不管如何，較好進行該液化步驟使澱粉完全降解成糊精。
此可獲得澱粉水解物水溶液，其包括來自研磨基料之液化澱粉部份，通常為糊精及若適宜之其他寡糖及單－或二糖，及研磨基料之非澱粉成份，尤其是液化所用研磨基料之固體、非澱粉成份。
此水解物可直接饋入用以製備有機化合物之發酵中作為水性培養基M。然而，經常進行糖化作用。該糖化可以類似本技藝中已知之糖化方法進行。
糖化作用可連續或分批進行。結果，在例如饋入後續發酵步驟之前，此液化培養基典型上在特定糖化槽中完全糖化。結果，液化後所得之水性產物將以可引起糖化之效素(典型上為葡萄糖酶)在一般用於此目的之條件下處理。
所用楜精(亦即寡糖)之糖化作用原則上可由所有葡萄糖酶(酵素種類EC 3.2.1.3)進行，尤其是得自曲黴(Aspergilus )之葡萄糖酶，尤其是使經由乾燥研磨法配合生物酒精生產製備所得之物質糖化所用者。適用於糖化作用之葡萄糖酶亦為商業獲得，例如購自Novozymes之品名Dextrozyme GA；或購自Genencor之品名Optidex。亦可使用不同葡萄糖酶之組合。
糖化酵素係以所用澱粉進料總量為準，以通常為0.001至5.0重量%，較好0.005至3.0重量%，且最好0.01至1.0重量%之量添加於液化後所得之含糊精水解物中。
通常，糖化作用係在使酵素糖化最適之溫度或稍低，例如在50至70℃，較好在60至65℃之溫度下進行。較好先使水性液化產物到達此等溫度，接著以引發糖化作用之酵素處理。較好再添加糖化酵素例如葡萄糖酶之前調整液態水合物之pH值至所用酵素最適活性之值，較好在3.5至6.0之間，更好在4.0至5.5之間，且最好在4.0至5.0之間。
添加糖化酵素後，較好使含糊精之懸浮液維持在所設定之溫度一段時間，例如自2至72小時或更長，且若需要特別是自5至48小時，此期間糊精會糖化獲得單糖。該糖化製程之過程可由熟悉本技藝者使用已知之方法，例如HPLC、酵素分析或葡萄糖試驗條片而監控。該糖化作用在單糖濃度實質上不再上升或再度下降時結束。
因為，使用基本上含澱粉原料之所有構成份，或至少除澱粉外亦含些許固體非澱粉質構成份之研磨基料製備含糖之液體培養基(1)(亦即未完全移除澱粉進料之非澱粉質固體成份)，經液化且視情況糖化後獲得之液體水解物亦含有澱粉原料之部分或全部量之非澱粉質固體構成份。此經常導入一定量例如來自穀類之植酸鹽，該量並不被期望。為避免因此造成之抑制作用，較好在進行後續之發酵步驟之前將一或多種植酸酶添加於水解物中，植酸酶若對於個別之高溫足夠穩定，則亦可在液化或糖化作用之前、期間或之後添加。任何植酸酶均可使用，只要在各情況下其活性在反應條件下不超過最低限度之作用即可。所用植酸酶之熱安定性(T50)較好>50℃，且最好>60℃。植酸酶之量通常為1至10000單位/公斤澱粉進料，且最好為10至4000單位/公斤澱粉進料。
為增加總體糖產量或獲得游離胺基酸，在液化期間或糖化作用期間可添加其他酵素例如支鏈澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、葡糖酶、木糖酶、葡萄糖苷酶或蛋白酶。此等酵素之添加對於黏度可能有正面作用，亦即降低黏度(例如經由使長鏈(亦稱為較長之鏈)葡萄聚糖及/或(阿拉伯糖(arabino)－)木聚糖(xylanes))斷鏈，且使可代謝之葡糖苷釋出且使(殘留)之澱粉釋出。使用蛋白酶具有類似之正面作用，另外可釋出可作為發酵成長因子之胺基酸。
本發明另一具體例中，在發酵之前未進行或僅進行部分糖化作用。該例中，發酵期間亦即就地至少達到部分糖化作用。例如，可依循其中液體培養基中存在之部分楜精，例如以楜經(或最初澱粉)總量為準為10至90重量%，尤其是20至80重量%被糖化之程序，且於發酵中使用所得含糖之培養基。接著可在發酵培養基中就地進行進一步之糖化作用。再者，糖化作用可於發酵槽中直接進行，省略掉另一糖化作用槽。
就地糖化作用可配合添加上述之糖化酵素，或者在無該酵素之下達成，因為許多微生物本身即可使寡糖代謝。該例中，楜精可經微生物或在進行糖化作用之後使對菌株為固有之酵素，例如對於菌株為固有之葡萄糖酶糖化且代謝進行。後者之最佳目標為發酵期間之糖化，尤其是釋出葡萄糖之速率係先因生物體之量，接著藉由對菌株為固有之酵素糖化表現之水準自動的適應微生物之需求。
就地糖化作用之優點首先為減低投資成本，第二為若適宜，可延遲葡萄糖釋出，使得以分批導入較高之葡萄糖濃度，而不使所用微生物發生抑制作用或代謝改變。例如大腸桿菌(E.coli)中，過度高的葡萄糖濃度會導致形成有機酸(乙酸鹽)，但此情況下，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae )會切換成發酵，儘管在通風之發酵槽中含有足夠之氧亦然(Crabtree作用)。延遲釋出葡萄糖可經由控制葡萄糖酶濃度而調整。此使得可能壓制上述作用，且最初可導入更多受質，因此可降低因供給之饋入物流造成之稀釋。
液化及若適宜之已進行糖化作用後獲得之水性水解物，亦即培養基M之無水物含量通常至少為45重量%，經常至少為50重量%，尤其至少為55重量%，最好至少60重量%，例如45至80重量%，較好50至75重量%，更好55至70重量%，且最好60至70重量%。據此，水解後獲得之水性培養基M以培養基M之總重為準之糖濃度－以葡萄糖對等物計算－通常至少為35重量%，經常至少為40重量%，尤其至少45重量%，最好至少50重量%，例如35至70重量%，尤其是40至65重量%，特別是45至60重量%，且最好為50至60重量%。
依如何進行製程而定，所得培養基M中存在之葡萄糖對等物係以單－或寡糖之形式，尤其是楜精存在。主要成份通常為單糖如六碳糖及五碳糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖及核糖，尤其是葡萄糖或此等單糖之寡糖。游離態葡萄糖以外之單糖量或作為培養基M中之寡糖成份可以所用之澱粉進料及其中包含之非澱粉質構成份作為函數而改變，且受所進行之製程影響，例如添加纖維素破壞纖維素構成份。通常，培養基M之葡萄糖對等物中之游離或結合形式之葡萄糖部份以葡萄糖對等物之總量為準總計為50至99重量%，尤其是75至97重量%，且最好為80至95重量%。
步驟iii)中獲得之水性培養基M依據本發明係用於步驟iv)中供發酵生產所需之有機化合物用。因此，使培養基M進行發酵，於其中其用於培養發酵所用之微生物。該方法中以揮發性或非揮發性微生物代謝物獲得個別有機化合物。
通常，含糊精之培養基M將在供給至發酵之前冷卻至發酵溫度，經常在32至37℃之間。
水性含糊精培養基M若適宜可在發酵之前先經殺菌，微生物通常會於此處因熱或化學方法而被破壞。結果，通常使水性培養基M在超過80℃之溫度加熱。細胞破壞或溶胞可在發酵之前立即發生。結果，使所有培養基M進行溶胞或破壞製程。此可經由熱或化學方法進行。然而，已證實在本發明製程之範圍中於發酵之前進行此處所述之殺菌步驟並非必要；當然經證實較好不要進行該殺菌步驟。據此，本發明較佳具體例係關於將步驟iii)中獲得之培養基M直接供應至發酵中，亦即不需先經歷殺菌步驟之方法。
培養基中存在之糖於發酵中經代謝。若培養基中存在之糖係以寡糖之形式，尤其是以楜精之形式存在，則其以該形式或先以添加或菌株中固有之糖化酵素，尤其是葡萄糖糖化之形式被微生物攝取且代謝。若未添加糖化酵素且培養基中存在之糖係以寡糖，尤其是楜精之形式存在，則液化澱粉構成份之糖化作用係經由微生物與糖尤其是單糖葡萄糖之代謝作用同時達成。
發酵可依熟悉本技藝者已知之慣用方式進行。因此，通常於以本文所述方法製備之液體培養基中培養所需微生物。
發酵方法可分批進行或者以逐批饋入之方式(包含配合收取中間物分批饋入)進行，較佳者為分批饋入之製程。
例如，以本發明方法所得之培養基M或習知糖進料，亦即可代謝之單－、二－及/或寡糖，或包括可代謝單－、二－及/或寡糖之培養基若適宜隨後以水稀釋且添加慣用之培養基構成份如緩衝液、營養鹽、氮進料如硫酸銨、尿素等，複合營養培養基構成份，包括胺基酸如酵母萃取物、蛋白腖、CSL等，且此微生物可在發酵條件下增殖直至微生物濃度達到發酵所需之固定狀態。此處，發酵培養基中存在之糖經代謝且形成所需之代謝物(亦稱為批式製程或批式期)。
當進行分批饋入方法時，培養基M係在批次期間之後，例如在總糖濃度已經降至特定值以下時連續或分批添加於發酵培養基中。
本發明方法典型之具體例為分批饋入方法，該方法包括下列步驟：v)培養可在水性發酵培養基F中過度產生有機化合物之微生物；及vi)將培養基M添加於發酵培養基F中，其中培養基M中存在之水解澱粉構成份，亦即糖藉由可過度產生有機化合物之微生物代謝，而產生有機化合物。
步驟v)中可以水性液體尤其是水稀釋先將習知之含糖培養基，通常為葡萄糖溶液調整至適宜之糖濃度，且添加發酵慣用之培養基構成份如緩衝液、營養鹽、氮進料如硫酸銨、尿素等，複合營養培養基構成份，包括胺基酸如酵母萃取物、蛋白腖、CSL等。此時，糖與液體之比通常較好以使發酵培養基F中之微生物總濃度以葡萄糖對等物計算且以發酵培養基F之總重為準小於6重量%，例如在>0至5重量%之間之方式選擇。因而製備之含糖批次培養基係以所需微生物接種，且微生物在發酵條件下於批次培養基(發酵培養基F)中增殖，直到微生物濃度達到發酵所需之固定狀態為止。此處，導入發酵培養基F中之糖經代謝，且形成所需代謝物。
依據步驟vi)將水性培養基M添加於發酵培養基F中維持該發酵方法，且微生物所過度產生之代謝物累積於發酵液中。饋入之培養基M與先導入且包括微生物之批次培養基(發酵培養基F)之體積比通常在1：10至10：1之間，且較好約1：5至5：1，且最好在1：1至5：1之間。發酵液中之糖含量尤其可經由含糖液體培養基之饋入速率控制。通常，饋入速率可以發酵液中之單糖含量在>0重量%至約5重量%之間，且最好不超過3重量%之值之方式調整。
較佳具體例中，步驟v)中之發酵培養基F(亦即本例中之批次培養基)基本上包括培養基M、可過度產生有機化合物之微生物、營養鹽、習知佐劑如鹼或緩衝液、及若適宜之稀釋用水。因此，培養基M若適宜將稀釋至所需糖濃度，例如以葡萄糖對等物計算且以用於直接構成發酵培養基F(批次培養基)之培養基M總重為準在0.1至10重量%之間。
用於維持發酵所用步驟vi)之含糊精培養基之糖含量經常較高，例如在上述範圍中，以使發酵培養基F之稀釋為最少。
較好，依循製備具有較高糖濃度，例如以葡萄糖對等物計算且以水性培養基M之總重為準至少40重量%，尤其至少45重量%，且最好至少50重量%之水性培養基M之程序。接著該培養基M以水稀釋以構成批次培養基(發酵培養基F)後先用於步驟v)中，接著依步驟vi)添加於發酵培養基F中。
當然，依據本發明，批次期及/或分批饋入期之發酵中使用且欲代謝之大部分糖，較好至少60重量%，最好至少70重量%係來自培養基M。本發明之一具體例中，發酵中使用且欲代謝之部分糖，例如1至50重量%，尤其是5至40重量%，且最好10至30重量%係來自習知之糖進料。習知之糖進料包含單－及二糖如葡萄糖及蔗糖，但亦包含包括濃度至少50重量%且基本上不含不溶於水之固體例如葡萄糖漿、蔗糖糖漿、濃稠果汁、麥芽糖漿、糊精糖漿之可代謝單－、二－及/或寡糖之培養基，以及糖生產之廢棄產物(糖蜜)，尤其是甜菜糖生產所產生之糖蜜及甘蔗糖生產所產生之糖蜜。
本發明之方法使得可能在發酵方法中產生具有至少3個C原子或具有至少2個C原子及1個N原子之揮發性及非揮發性，尤其是非揮發性微生物代謝物。
本文中，非揮發性產物經了解意指無法在不經歷分解下自發酵液體蒸餾回收之化合物。通常，此等化合物之沸點在大氣壓力下高於水之沸點，經常高於150℃，尤其是高於200℃。通常，其為在標準條件(298 K，101.3 kPa)下為固體之化合物。
然而，亦可在非揮發性微生物代謝物生產之發酵中使用本發明之液體培養基，該等代謝物在大氣壓力下之熔點低於水之沸點及/或具有油性黏度。
名詞非揮發性微生物代謝物尤其包括具有3至10個碳原子，且若適宜具有一或多個，例如1、2、3或4個羥基附接於其上之有機單－、二－及三羧酸，例如酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3－羥基丙酸、富馬酸、馬來酸、2,5－呋喃二羧酸、戊二酸、乙醛酸、葡萄糖酸、烏頭酸及二胺基壬二酸、檸檬酸；蛋白及非蛋白胺基酸例如離胺酸、穀胺酸、蛋胺酸、苯基丙胺酸、天門冬胺酸、色胺酸及蘇胺酸；嘌呤及嘧啶鹼；核苷及核苷酸，例如菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NDA)及腺苷－5'－單磷酸鹽(AMP)；脂質；較好具有10至22個碳原子之飽和及不飽和脂肪酸，例如γ－亞麻油酸、二均－γ－亞麻油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、及二十二碳六烯酸；較好具有3至8個碳原子之二元醇，例如丙二醇及琥珀醇；具有3或多個，例如3、4、5或6個OH基之多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇及阿拉伯糖醇；具有至少4個碳原子，例如4至22個碳原子之長鏈(亦稱為較長鏈)醇，例如丁醇；碳水化合物例如玻尿酸及海藻糖；芳族化合物例如芳族胺、香草醛及靛藍；維他命及維他命原例如抗壞血酸、維他命B6 、維他命B1 2 及核黃素、輔因子及已知為營養輔助品者；蛋白質例如酵素如澱粉酶、果酸酶、酸、混合或天然之纖維素酶、酯酶如脂質酶、胰腺酶、蛋白酶、木糖酶及氧化還原酶如蟲漆、過氧化氫及過氧化物酶、葡萄聚糖酶、植酸酶、類葫蘿蔔素、例如茄紅素、β－葫蘿蔔素、蝦青素、玉米黃素及斑蝥黃質；具有較好3至10個碳原子及若適宜之1或多個羥基之酮類，例如丙酮及乙偶因(acetoin)；內酯例如γ－丁內酯、環糊精、生物聚合物例如聚羥基乙酸酯、聚酯例如聚乳交酯、聚糖、類聚異戊二烯、聚醯胺；及前驅物及上述化合物之衍生物。適合作為非揮發性微生物代謝物之其他化合物描述於Gutcho之發酵化學品(Chemicals by Fermentation),Noyes Data Corporation(1973),ISBN：0818805086中。
名詞"輔因子"包括對於正常酵素活性發生為必要之非蛋白值化合物。此等化合物可為有機或無機，較好本發明之輔因子分子為有機者。該等分子之實例為NAD及菸鹼醯胺腺苷二核苷磷酸鹽(NADP)；此等輔因子之前驅物為菸酸。
名詞"營養輔助品"包括可促進植物及動物，尤其是人類健康之食物添加劑。該等分子實例為維他命、抗氧化劑及某些脂質，例如多不飽和脂肪酸。
產生之代謝物尤其選自酵素、胺基酸、維他命、二糖、具有3至10個C原子之脂肪族單－及二羧酸類，具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸類，具有3至10個C原子之酮類，具有4至10個C原子之烷醇類，及具有3至10個C原子尤其是3至8C原子之烷二醇類。
熟悉本技藝者可了解因此發酵產生之化合物在各情況下係藉由所用微生物產生之對映體形式(若存在不同之對映體)而獲得。因此，通常在胺基酸之情況下係獲得個別之L－對映體。
發酵中所用之微生物依本身已知之方式取決於相關微生物代謝物，如後文詳述。其可為天然源或經基因改良。適宜之微生物及發酵製程實例列於下表A中。
本發明較佳具體例中，已製造之有機化合物係選自視情況有羧基附接於其上且具有3至10個C原子之單－、二－及三羧酸，選自蛋白質及非蛋白質胺基酸、嘌呤鹼、嘧啶鹼、核苷、核苷酸、脂質；飽和及不飽和脂肪酸；具有4至10個C原子之二元醇、具有3或多個羥基之多元醇、具有至少4個C原子之較長鏈醇、碳水化合物、芳族化合物、維他命、維生素原、輔因子、營養輔助品、蛋白質、類葫蘿蔔素、具有3至10個C原子之酮類、內酯、生物聚合物及環糊精。
本發明第一較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括糖之液體培養基用於酵素如植酸酶、木糖酶或糊精酶之發酵生產中之用途。
本發明第二較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括糖之液體培養基用於胺基酸如離胺酸、蛋胺酸、蘇胺酸及穀胺酸之發酵生產之用途。
本發明其他較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括糖之液體培養基用於維他命如泛酸及核黃素、及前驅物與衍生物之發酵生產之用途。
本發明其他較佳具體例係關於可依據本發明獲得之包括糖之液體培養基用於下列之發酵生產之用途：－具有3至10個C原子之單－、二－及三羧酸，尤其是脂質單－及二羧酸，如丙酸、富馬酸及琥珀酸；－具有3至10個C原子之脂質羥基羧酸，如乳酸；－如上述之長鏈烷醇，尤其是具有4至10個C原子之烷醇如丁醇；－上述之二元醇，尤其是具有3至10個，特別是3至8個C原子之烷二醇。如丙二醇；－上述之酮，尤其是具有3至10個C原子之酮，如丙酮；及－上述之碳水化合物，尤其是二糖如海藻糖。
其他特佳具體例中，以微生物發酵生產之代謝物為多羥烷酸酯如聚－3－羥基丁酸酯及與其它有機羥基羧酸之共聚酯，該其它有機羥基羧酸如3－羥基戊酸、4－羥基丁酸及Steinbchel(上述引用文)中所述之其他者，包含例如長鏈之羥基羧酸如3－羥基辛酸、3－羥基癸酸及3－羥基十四烷酸，及此等之混合物。為進行此發酵，可使用已就其他碳進料所描述之類似條件及程序，例如S.Y.Lee,Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria,Tibtech,Vol.14,(1996),pp.431－438。
較佳具體例中，發酵所用之微生物因此係選自過度生產出下列代謝物之至少一種之天然或重組微生物：－酵素如植酸酶、木糖酶或葡糖酶；－胺基酸如離胺酸、蘇胺酸或蛋胺酸；－維他命如泛酸及核黃素；及其前驅物及/或衍生物；－二糖類如海藻糖；－具有3至10個C原子之脂族單－及二羧酸，如丙酸、富馬酸及琥珀酸；－具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸，如乳酸；－聚羥基烷酸酯如聚－3－羥基丁酸酯及3－羥基丁酸之共聚酯；－具有3至10個C原子之酮如丙酮；－具有4至10個C原子之烷醇如丁醇；及具有3至8個C原子之烷二醇如丙二醇。
適宜之微生物通常選自下列菌屬：棒桿菌(Corynebacterium )、桿菌(Bacillus )、子囊菌(Ashbya )、埃希氏菌(Escherichia )、曲黴菌(Aspergillus )、產鹼菌(Alcaligenes )、放線桿菌(Actinobacillus )、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum )、乳桿菌(Lactobacillus )、丙酸桿菌(Propionibacterium )、根黴菌(Rhizopus )及梭菌(Clostridium )，尤其是葡萄棒桿菌(Corynebacterium glutamicum )、枯草桿菌(Bacillus subtilis )、絲狀子囊菌(Ashbya gossypii )、埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli )、黑麴菌(Aspergillus niger )或協腹產鹼菌(Alcaligenes latus )、琥珀酸厭氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniproducens )、琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) 、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbr ckii )、賴氏乳桿菌(Lactobacillus leichmannii )、阿拉伯糖丙酸桿菌(Propionibacterium arabinosum )、希氏丙酸桿菌(Propionibacterium schermanii )、塞氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii )、丙酸梭菌(Clostridium propionicum )、福米卡梭菌(Clostridium formicoaceticum )、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum )、鬚根黴菌(Rhizopus arrhizus )及米根黴菌(Rhizopus oryzae )之菌株。
較佳具體例中，發酵中所用之微生物為棒桿菌(Corynebacterium )屬，尤其是葡萄棒桿菌(Corynebacterium glutamicum )之菌株。尤其，棒桿菌屬之菌株，特別是葡萄棒桿菌，其過度產生胺基酸，尤其是離胺酸、蛋胺酸或穀胺酸。
另一較佳具體例中，發酵中使用之微生物為埃希氏菌(Escherichia )屬之菌株，尤其是埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli )菌株。尤其，其為埃希氏菌(Escherichia )屬之菌株，尤其是埃希氏大腸桿菌(Escherichia coli )菌株，其可過度產出胺基酸，尤其是離胺酸、蛋胺酸或蘇胺酸。
最佳具體例中，發酵中微生物所產生之代謝物為離胺酸。為進行發酵，可使用已就其他碳進料所敘述之類似條件及程序，例如述於Pfefferle等人(上述引用文)及US 3,708,395。原則上，連續及不連續(批式或批次饋入)操作模式均適用，但較佳者為批次饋入。
又最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為蛋胺酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料所敘述之類似條件及程序，例如WO 03/087386及WO 03/100072中所述者。
另一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為泛酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料敘述之類似條件及程序，例如WO 01/021772中所述者。
另一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為核黃素。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條件及程序，例如WO 01/011052、DE 19840709、WO 98/29539、EP 1 186 664及Fujioka,K.：核黃素(維他命B2)之新穎生物技術及該核黃素之特性，Fragrance Journal (2003),31(3),44－48中所述者。
又另一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為富馬酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條件及程序，例如Rhodes等人之"於20升發酵槽中製造富馬酸"，Applied Microbiology,1962,10(1),9－15中所述者。
又一最佳具體例中，發酵中之微生物所產生之代謝物為琥珀酸。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條件及程序，例如Int.J.Syst.Bacteriol.26 ,498－504(1976)；頒與Lemme及Datta之EP 249773(1987)；頒予Guettler,Jain及Soni之US 5,504,004(1996)；Arch.Microbiol.167,332－342(1997)；Guettler MV,Rumler D,Jain MK.,Actinobacillus succinogenes sp.nov.,a novel succinic－acid－producing strain from the bovine rumen.Int J Syst Bacteriol.1999 Jan；49 Pt 1：207－16；US 5,723,322,US 5,573,931,US 5,521,075,WO99/06532,US 5,869,301或US 5,770,435中所述者。
另一最佳具體例，發酵中之微生物所產生之代謝物為植酸酶。為進行發酵，可使用對其他碳進料所述之類似條件及程序，例如WO 98/55599中所述者。
發酵會產生發酵液，該發酵液除所需之微生物代謝物以外，基本上包括發酵期間產生之生物量，液化澱粉溶液之非代謝構成份，且尤其是澱粉原料之非澱粉質固體成份如纖維及未利用之糖，以及未使用之緩衝液及營養鹽。依本申請案，該液體培養基亦稱為發酵液，發酵液亦涵蓋(包括糊精)培養基(I)，其中存在之糖僅進行部份或不完全之發酵轉化，亦即已發生可利用之糖(例如單－及二糖)之部分或不完全之微生物代謝作用。
分離或消耗微生物代謝物之前或移除發酵液之揮發性構成份之前，可依上述方式進行殺菌步驟。
本發明之特定具體例(I)係關於自發酵液消耗或分離至少一種微生物代謝物之方法。隨後移除發酵液之大部分揮發性構成份，獲得固體或半固體蛋白質組成物。進行該製程及所得蛋白質組成物之更詳細敘述為本申請公司之WO 2005/116228(PCT/EP2005/005728)之主題，其提及相關之細節。
自發酵液分離或消耗之代謝物，亦即具有至少3個C原子或具有至少2個C原子及至少一個N原子之有機化合物(此後亦稱為有價值產物)通常係以自發酵液消耗或分離至少一種代謝物，使發酵液中之該代謝物含量總計不超過20重量%，尤其不超過10重量%，更好不超過5重量%，且最好不超過2.5重量%之方式進行，各情況均以留下之發酵液總重為準。
微生物代謝物可依一或多步驟自發酵液分離或消耗。本文中之基本步驟係自發酵液移除固體成份。此可在分離有價值產物之前或之後進行。亦包括針對有價值產物之粗略清洗及精細純化之步驟以及其調配之本技藝中習知使用之方法對分離有價值產物及移除固體(例如固－液相分離)兩者均為已知(例如述於Belter,P.A,Bioseparations：生物技術之下游加工(Downstream Processing for Biotechnology),John Wiley & Sons(1988)，及Ullmann's之工業化學手冊(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry)，第五版於CD－ROM上，Wiley－VCH)。
為分離有價值產物，宜依循之程序為先經由例如離心或過濾自發酵液移除固體構成份，接著經由例如結晶、沉澱、吸附或蒸餾自液相分離有價值產物。或者，亦可經由例如使用層析法或萃取法直接自發酵液分離有價值產物。須特別提及之層析法為離子交換層析，其中有價值產物可於層析管柱上選擇性分離。此例中，自留下之發酵液移除固體較好經由例如傾析、蒸發及/或乾燥進行。
在揮發性或油狀化合物之情況下，通常需要監控加工期間之最大溫度，尤其是乾燥期間。此等化合物較好亦經由在吸附劑上調配成擬－固體而製備。適用於此目的之吸附劑詳述於例如本申請公司之WO 2005/116228(PCT/EP 2005/005728)中。可有利的以該方式製備之化合物實例為γ－亞麻油酸、二均－γ－亞麻油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸，以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇及丙酮。擬固體調配物中之此等化合物就本發明之目的而言亦了解為固體非揮發性微生物代謝物。
另一特定具體例(II)係關於其中實質上或完全移除發酵液之揮發性構成份，而未事先分離或消耗非揮發性微生物代謝物，且若適宜，未事先移除部份固體構成份，產生非揮發性微生物代謝物之固體調配物。進行該製程之更詳細敘述見於本申請公司之PCT/EP 2006/066057(早期專利申請案DE 10 2005 042 541.0)中。
"實質上"意指一旦移除揮發性構成份後，留下固體或至少半固體殘留物，其若適宜可經由添加固體轉化成固體產物。通常，此意指移除揮發性構成份至殘留之含水量不超過30重量%，經常不超過20重量%，且尤其不超過15重量%。通常，發酵液之揮發性構成份宜自發酵液移除至殘留之含水量為經乾燥後所測定之固成份總重為準之0.2至30重量%之間，較好為1至20重量%，尤其好為2至15重量%，且最好為5至15重量%。殘留之含水量可經由熟悉本技藝者藉熟悉之習知方法測定，例如藉由熱比重計測定(Hemminger 等人，熱分析法(Methoden der thermischen Analyse),Springer Verlag,Berlin,Heidelberg,1989)。
自發酵液獲得固體非揮發性代謝物可以一、二或多步驟進行，尤其是以一－或二－步驟程序進行。通常，就獲得固體代謝物而言，至少一步驟，尤其是最後步驟會包含乾燥步驟。
一步驟程序中，發酵液之揮發性構成份若適宜可在前述預先移除之後移除，直到達到所需殘留含水量為止。
二或多步驟程序中，熱濃縮發酵液將先經過濾(微過濾、超過濾)濃縮，或經由使部份揮發性構成份蒸發而濃縮。此步驟中移除之揮發性構成份量，以發酵液之揮發性構成份之無水物為準，通常為10至80重量%且最好為20至70重量%。一或多道後續步驟中，係移除發酵液之剩餘揮發性構成份，直到達到所需之殘留含水量為止。
依據此具體例(II)，揮發性構成份實質上自液體培養基移除而未經事先消耗或確實分離有價值產物。因此，當移除發酵液之揮發性構成份時，非揮發性代謝物基本上不隨同液體培養基之揮發性構成份一起移除，但會與發酵液之至少部份，經常與其大部分，尤其是與全部其它固體成份一起留在所得殘留物中。據此，然而，當移除此等成份時，亦可能與發酵液之揮發性構成份一起移除－較好小量－的所需非揮發性微生物代謝物，且以代謝物之總無水物為準，通常不超過20重量%，例如0.1至20重量%，較好不超過10，尤其是不超過5重量%，更好不超過2.5重量%，且最好不超過1重量%。特佳具體例中，所需非揮發性微生物代謝物留下之量，以代謝物總乾重為準，至少為90重量%，特別是至少95重量%，尤其是99重量%，且最好約100重量%，該非揮發性微生物代謝物為含有已移除揮發性構成份後獲得之發酵培養基之固體成份之部分或含發酵培養基之所有固體構成份之混合物固體。
若需要，可在移除揮發性構成份之前，經由例如離心或過濾自發酵液分離部分(例如5至80重量%，尤其是30至70重量%)非澱粉質固體成份。若適宜，將進行該預先分離以移除不包括或僅包括小量非揮發性微生物代謝物之粗固體顆粒。該預先過濾可使用熟悉本技藝者已知之習知方法，例如使用粗篩網、網狀物、穿孔板等進行。若適宜，亦可以離心力分離器分離粗的固體顆粒。此處所用之設備如傾析器、離心機、沉降機及分離器亦為熟悉本技藝者已知。此方式中，可獲得包括澱粉原料之非揮發性代謝物及非揮發性、通常為固體之非澱粉質構成份，或至少其大部份、經常至少90重量%或所有固體非澱粉質構成份之固體或半固體(例如糊料)殘留物。
與發酵之固體成份一起存在之無水代謝物性質可依本身已知方式，經由添加調配助劑如載劑及塗覆物質、黏合劑或其他添加劑而調配，尤其是針對各種參數如活性物質含量、粒徑、顆粒形狀、形成粉塵傾向、吸濕性、安定性尤其是儲存安定性、顏色、氣味、流動行為、凝聚傾向、靜電荷、對光之敏感性及溫度敏感性、機械安定性及再分散性加以調配。
習知使用之調配助劑包含例如黏合劑、載劑物質、粉化/流動佐劑、其他之調色顏料、殺菌劑、分散劑、消泡劑、黏度調節劑、酸、鹼、抗氧化劑、酵素安定劑、酵素抑制劑、吸附劑、脂肪、脂肪酸、油或此等之混合物。該等調配助劑可有利的用做乾燥助劑，特別是當使用調配及乾燥方法時，如噴霧乾燥、流動床乾燥及冷凍乾燥時。其他細節參見PCT/EP 2006/066057(早期申請案DE 10 2005 042 541.0)中。
上述添加劑及若適宜之其他添加劑如塗覆物質之量可依相關代謝物特定之需求及所用添加劑之性質大幅度變化，且可在例如0.1至80重量%，尤其是1至30重量%之間變化，各情況均以其最終調配之形式中之產物或物質混合物之總重為準。
調配助劑之添加可在收取發酵液(亦稱為產物調配或固體設計)之前、期間或之後進行，尤其是在乾燥期間。較好在收取發酵液或代謝物之前添加發酵助劑可能較有利，尤其是改善欲收取物質或產物之加工性。調配助劑可添加至以固體獲得之代謝物中或包括該代謝物之溶液或懸浮液中，例如在發酵完成後直接加於發酵液中，或收取期間及最終乾燥步驟之前添加於所得溶液或懸浮液中。
因此，例如此等助劑可與微生物代謝物之懸浮液預混合；該懸浮液亦可經由例如噴佈於其載體物質上或與其混合而施加於載劑物質。乾燥期間調配助劑之添加在當噴佈包括該代謝物之溶液或懸浮液時相當重要。添加調配助劑最好是在乾燥之後進行，例如當施加塗料/塗覆層於經乾燥顆粒時。其他佐劑可在乾燥之後及視需要的塗覆步驟之後添加於產物中。
自發酵液移除揮發性構成份係依本身已知方式，經由自液相分離固體之慣用方法進行，包含過濾法及使液相之揮發性構成份揮發之方法。亦可能涵蓋粗略清洗有價值產物之步驟及調配步驟之該方法敘述於例如Belter,P.A,生物分離：生物技術之下游加工(Bioseparations：Downstream Processing for Biotechnology),John Wiley & Sons(1988),及Ullmann's之工業化學手冊(Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry),第五版於CD－ROM上,Wiley－VCH。可用於產物調配物之範圍中或發酵結束後之收取之熟悉本技藝者已知之方法、設備、助劑及通用或特定具體例進一步敘述於EP 1038 527、EP 0648 076、EP 835613、EP 0219 276、EP 0394 022、EP 0547 422、EP 1088 486、WO 98/55599、EP 0758 018及WO 92/12645中。
此具體例(II)之第一種變化，當非揮發性微生物代謝物以溶解態存在於液相時，係經由例如結晶或沉澱自液相轉成固相。隨後，經由例如離心、傾析或過濾分離非揮發性固體構成份(包含代謝物)。亦可以類似方式分離油狀代謝物，相關之該油狀發酵產物可經由添加吸附劑例如氧化矽、矽膠、肥土、黏土及活性碳轉化成固體。
該具體例(II)之第二種變化中，係經由蒸發移除揮發性構成份。該蒸發可依本身已知方式進行。使揮發性構成份揮發之適宜方法為噴霧乾燥、流體床乾燥或流體床凝聚、冷凍乾燥、空氣乾燥機及接觸乾燥機，及押出乾燥。亦可進行上述方法與成形方法如押出、造粒或噴射造粒法之組合。此等後述方法中，較好使用部分或大部分預先乾燥之包括代謝物之物質混合物。
較佳具體例中，移除發酵液之揮發性構成份包含噴霧乾燥法或流體床乾燥法，包含流體床造粒法。為此，係將該發酵液(若適宜可預先分離以移除僅包括小量任何非揮發性微生物代謝物之粗固體顆粒(若有的話)之後)饋入一或多個噴霧乾燥或流化床乾燥裝置中。負載有固體之發酵液之輸送或饋入係藉由包括固體之液體之慣用輸送裝置之方式，例如泵浦如偏心單旋轉翼螺旋泵浦(例如得自Delasco PCM)或高壓泵浦(如得自LEWA Herbert Ott GmbH)方便地進行。
使用本發明含糖液體培養基之發酵亦可依下列方式進行：vii)自步驟iii)中獲得之包括澱粉進料之非澱粉質固體構成份之培養基M移除以總重為準不超過50重量%之部份，例如5至45重量%，且將剩餘部份供應至發酵中，以生產第一種代謝物(A)，例如固體非揮發性代謝物(A)或揮發性代謝物(A)；及viii)該部分，若適宜係在先前已移除澱粉進料之所有或部分非澱粉質固體成份之後加於發酵中，以生產與代謝物(A)相同或不同之第二種代謝物(B)。
若分離(vii)之非澱粉質固體構成份，則培養基M剩餘部份之固體含量較好不超過50重量%，較好不超過30重量%，最好不超過10重量%，且最好不超過5重量%。該情況下，最好在用以生產第二種代謝物(B)之發酵前使所有固體分離。
此程序使得在vii)之個別發酵中使用微生物成為可能，而該微生物須符合某些最小要件例如關於氧輸送速率。於vii)之個別發酵中使用之適宜微生物為例如芽孢桿菌屬，較好為枯草桿菌(Bacillus subtilis )。此個別發酵中藉該微生物所生產之化合物尤其選自維他命、輔因子及營養輔助品、嘌呤及嘧啶鹼、核苷及核苷酸、脂質、飽和及不飽和脂肪酸、芳族化合物、蛋白質、類葫蘿蔔素、尤其是選自維他命、輔因子及營養輔助品、蛋白質及類葫蘿蔔素者，且最特別者為選自核黃素及泛酸鈣者。
此程序之較佳具體例係關於於二個個別發酵中平行生產相同之代謝物(A)及(B)。此尤其對於具有不同純度需求之相同代謝物之不同應用有利。據此，第一種代謝物(A)，例如欲作為進料添加劑之胺基酸例如離胺酸、蛋胺酸、蘇胺酸或穀胺酸係使用含固體之發酵液生產，且相同之第二種代謝物(B)例如欲作為食品添加劑用之相同胺基酸係使用viii)之固體經消耗之發酵液生產。由於完全或部份移除非澱粉質固體構成份，當收取其應用領域具有高純度需求例如食品添加劑之代謝物時，可降低其純化複雜性。
又較佳具體例中，此程序可如下列般進行。用以生產代謝物A例如胺基酸如離胺酸、蛋胺酸、穀胺酸或蘇胺酸、生產檸檬酸或乙醇之較佳大容積發酵係依據例如述於WO 2005/116228(PCT/EP 2005/005728)或PCT/EP 2006/066057(早期專利申請案DE 10 2005 042 541.0)之方法進行，或依據生物酒精發酵生產之已知方法進行。依據vii)，移除步驟iii)中獲得之部份培養基M。依據vii)移除之部分可經由慣用方法例如離心或過濾(取決於生產B之發酵需求)，在viii)中完全或部份不含該固體。依此方式獲得之培養基M(其視情況完全或部分不含固體)係依據viii)饋入生產代謝物B之發酵中。依據viii)中分離之固體流較好回到此大容積發酵之培養基M流中。
若大容積發酵中產生之微生物代謝物(A)為乙醇，則步驟iii)中產生之培養基M之單－、二－或寡糖濃度在發酵生產之乙醇(生物酒精)中經常在例如25至33重量%之間。而且此處，步驟viii)中之固體分離係依據生產個別代謝物B之發酵需求進行。
上述程序之較佳具體例中，此發酵中以微生物生產之代謝物B為核黃素。為進行該發酵，可使用已對其他碳進料敘述之類似條件及程序，例如WO 01/011052、DE 19840709、WO 98/29539、EP 1186664及Fujioka,K.：核黃素(維他命B2)之新穎生物技術及核黃素之特性(New biotechnology for riboflavin(vitamin B2)and character of this riboflavin).Fragrance Journal(2003),31(3),44－48。
為進行該製程之其他變化法，就生產代謝物A例如胺基酸如離胺酸、或蛋胺酸或穀胺酸、生產檸檬酸或乙醇而言，係如上述般進行較佳之大容積發酵。依據vii)，移除步驟iii)中獲得之部份培養基M，且依據viii)經由慣用方法例如離心或過濾使完全或部分不含固體。基本上完全或部分不含固體之由其獲得之培養基M，在該核黃素之例中係依據vii)饋入生產代謝物B之發酵中。依據viii)分離之固體流較好回到大容積發酵之培養基M流中。
依據viii)因而產生之含核黃素發酵液可經由對其他碳進料所敘描述之類似條件及程序而獲取，例如DE 4037441、EP 464582、EP 438767及DE 3819745。細胞體溶胞後，較好經由傾析分離以結晶態存在之核黃素。亦可能有其他分離固體之方式例如過濾。隨後，較好藉由噴霧乾燥機及流體床乾燥機使核黃素乾燥。或者，依據viii)生產之含核黃素發酵混合物可在類似條件下及使用如EP 1048668及EP 730034中所述類似程序加工。經加熱殺菌後，使發酵液離心，且以無機酸處理剩餘之含固體部分。藉過濾自酸性水溶液培養基移除所形成之核黃素，若適宜則經洗滌且接著乾燥。
此程序之其他較佳具體例中，發酵中由微生物生產之代謝物B為泛酸。為進行發酵，可使用如對其他碳進料所描述如WO 01/021772所述之類似條件及程序。
為進行此製程變化方法，可依循上述針對核黃素所述之程序。已依據viii)進行預先純化且較好實質上不含固體之培養基M饋入依據viii)之用以生產泛酸之發酵中。此時，最好使黏度比含固體之液體培養基降低。分離之固體流較好回到大容積發酵之含糖液體培養基流中。
依據viii)生產之含泛酸發酵液可在類似條件下且使用已對其他碳進料敘述之類似程序下收取，如EP 1 050 219及WO 01/83799所述。所有發酵液經加熱殺菌後，以例如離心或過濾移除剩餘固體。使該固體分離步驟中獲得之澄清液部分蒸發，若適宜則以氯化鈣處理且經乾燥，尤其是噴霧乾燥。
已分離之固體可與平行之大容積發酵製程之範圍內之個別所需微生物代謝物(A)一起獲得。
乾燥及/或調配步驟後，可將全部或經研磨之穀類胚仁，較好為玉米、小麥、大麥、小米、小黑麥及/或裸麥添加於產物調配物或蛋白質組成物中。
下列實例將說明本發明之各目的，但須了解並非用以限制本發明。
實例 I.研磨澱粉進料
以下所用之研磨基料係如下列般製造。使用旋轉研磨機徹底研磨全部玉米胚仁。使用不同攪拌器、研磨方式及篩網元件，獲得三種不同程度之細度。以實驗室震動篩網(振動分析器：Retsch Vibrotronic type VE1；過篩時間5分鐘，振幅：1.5 mm)過篩分析研磨基料，獲得表I中所列之結果。
II.酵素性澱粉液化作用及澱粉糖化作用
II.1.)噴射烹煮鍋中之液化為使乾燥研磨之玉米穀粉連續液化，因此設置兩個250升之攪拌桶；每一小時將已與水形成漿料之玉米穀粉自各桶中交互饋入噴射烹煮鍋中。通常，此等桶係以導入117公斤之水，且將α－澱粉酶例如以0.10重量%之濃度(以所用穀粉之總重為準)添加於水中。隨後，在約45℃下將133公斤穀粉分數步驟饋入且於其中混合。例如添加CaCl2 調整Ca2 ＋ 之濃度為50 ppm後，將pH調整在5.6至5.8之間。所有成份均添加後，藉攪拌充分混合玉米穀粉懸浮液直到用於噴射烹煮鍋中為止。接著使該懸浮液在5巴之壓力下以250250公斤/h饋入噴射烹煮鍋中。同時經由供給25公斤/h水蒸氣(7.5巴)使玉米穀粉懸浮液在高於膠凝溫度下加熱至105℃。在管狀反應器中留置時間5分鐘後(其係排列在噴射烹煮鍋下游)，部份膠凝之澱粉會斷裂成糊精(液化作用1)。隨後，經由沖洗使反應混合物之溫度下降至90℃，該製程期間排出約5公斤/h之水蒸氣。接著，在另一管狀反應器中於90℃下進行第二次液化歷時100分鐘，使澱粉完全斷裂成糊精。接著藉由重新沖洗使所得反應混合物冷卻至61℃之糖化溫度，製程期間損耗為約14公斤/h之水。
II.1)糖化作用使II.1)中獲得之一部份反應混合物在隨機試驗中糖化。因此，將約1000克之反應混合物移入攪拌桶中，且持續攪拌維持在61℃。實驗之全部過程中均持續攪拌。使用H2 SO4 將pH調整為4.3後，添加17.9克(15.2毫升)之Dextrozyme GA(Novozymes A/S)。保持該溫度約3小時，製程期間以HPLC監控反應過程。結束後，葡萄糖濃度為420克/公斤。
III.菌株
ATCC13032 lysCf b r 下列某些實例中，使用已敘述於WO 05/059144中稱為ATCC13032 lysCf b r 之改質穀胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)菌株。
實例1
在使用穀胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)之搖晃瓶試驗中使用已經如方法II中所述之液化及糖化玉米穀粉水解物。
菌株
使用具有解除回饋控制之門冬胺酸激酶ATCC13032 lysCf b r 之改質野生種。
接種體之製備
使細胞在殺菌之CM＋CaAc瓊膠(組成：見表1；在121℃下20分鐘)上形成斑點接著在30℃下培育隔夜。接著自該板上刮下細胞，且再懸浮於鹽水中。在各例中，以使因此製備之細胞懸浮液之光學密度在610 nm下之OD6 1 0 值達0.5之量接種於含25毫升培養基(見表2)之250毫升裝置二葉片之三角瓶。
發酵液之製備
瓶內培養基之組成列於表2中。該試驗重複進行三次測定。
接種後，使該瓶在30℃且在加濕搖晃器中搖晃(200 rpm)下培養48小時。發酵結束後，以HPLC測定葡萄糖含量及離胺酸含量。HPLC分析係以Agilent 1100系列LC系統進行。以高壓液體層析在Agilent 1100系列LC系統上測定胺基酸濃度。以鄰－苯二甲醛使管柱預先衍生化可對所形成之胺基酸定量；使用Agilent Hypersil AA管柱分離胺基酸混合物。
實例2
使用黑曲黴(Aspergillus niger )在搖晃瓶實驗中使用已於方法II中製備之液化及糖化玉米穀粉水解物。
菌株
在控制glaA啟動子下得自無花果曲黴(Aspergillus ficuum )之具有6備份phyA基因之黑曲黴(Aspergillus niger )植酸酶生產菌株係如WO 98/46772詳述之製備NP505－7般產生。使用具有3個改質glaA擴增子(amplicons)(類似ISO505)(但無整合之phyA表現盒)之菌株作為對照例。
接種體之製備
在於裝置有一調節板之100毫升三角瓶中之20毫升預培養培養基(見表3)中各接種100 μl凍乾培養物且在34℃下於加濕之搖晃器中搖晃(170 rpm)培養24小時。
在裝置有一調節板之250毫升三角瓶中之50毫升主要培養物培養基(見表4)中各接種以5毫升預培養物。
發酵液之製備
瓶內培養基之組成列於表4中。對各樣品設定二瓶。
接種後，使瓶在加濕搖晃器(170 rpm)中於34℃下培養6天。終止發酵後，在適宜植酸酶活性水平(標準：0.6 U/ml)，於250 mM乙酸/乙酸鈉/Tween 20(0.1重量%)、pH 5.5緩衝液中，使用植酸作為受質測定植酸酶活性。對用於微量滴定盤(MTPs)而言使此分析標準化。使10 μl酵素溶液在250 mM乙酸鈉緩衝液(pH 5.5)(植酸鹽：植酸之十二鈉鹽)中與140 μl之6.49 mM植酸鹽溶液混合。在37℃下培育一小時後，添加等體積(150 μl)之三氯乙酸終止反應。將一整數份之該混合物(20 μl)移到280 μl之包括0.32 N H2 SO4 、0.27重量%鉬酸銨及1.08重量%之抗壞血酸之溶液中。接著使之在50℃下培育25分鐘。在820 nm下測量藍色溶液之吸附。

Claims (16)

  1. 一種發酵生產具有至少3個C原子或具有至少2個C原子及至少一個N原子之至少一種有機化合物之方法，該有機化合物係選自可具有或不具有羥基附接至其上且具有3至10個碳原子之單-、二-及三羧酸，選自蛋白及非蛋白胺基酸、嘌呤鹼、嘧啶鹼；核苷、核苷酸、脂質；飽和及不飽和脂肪酸；具有4至10個碳原子之二元醇、具有3或更多個羥基之多元醇、具有至少4個碳原子之長鏈醇、碳水化合物、芳族化合物、維他命、維他命原、輔因子、營養輔助品、蛋白質、類葫蘿蔔素、具有3至10個碳原子之酮類、內酯、生物聚合物及環糊精，該方法包括下列步驟：i)研磨選自榖類胚仁之澱粉進料，因而獲得包括該澱粉進料之至少一部分非澱粉質固體構成份之研磨基料；ii)將該研磨基料以能使懸浮液中無水物之含量至少為45重量%之量懸浮於水性液體中，該研磨基料包括存在於澱粉進料中之至少20%之澱粉進料的固體非澱粉質構成份；iii)藉由液化使研磨基料中之澱粉成份水解，且接著經糖化，因而獲得包括澱粉進料之經水解澱粉構成份及至少部份澱粉進料之非澱粉質固體構成份之水性培養基M；及iv)將步驟iii)中製備之水性培養基M用於發酵操作中用 以培養可過度生產有機化合物之微生物，該微生物係選自下列菌屬：棒桿菌(Corynebacterium )、桿菌(Bacillus )、子囊菌(Ashbya )、埃希氏菌(Escherichia )、曲黴菌(Aspergillus )、產鹼菌(Alcaligenes )、放線桿菌(Actinobacillus )、厭氧螺菌(Anaerobiospirillum )、乳桿菌(Lactobacillus )、丙酸桿菌(Propionibacterium )、梭菌(Clostridium )及根黴菌(Rhizopus )；其中於步驟iii)中，經由將水蒸氣導入懸浮液中使步驟ii)中獲得之懸浮液在高於研磨基料中存在之澱粉膠凝溫度之溫度下加熱，且該以水蒸氣之加熱係在噴射烹煮器中進行。
  2. 如請求項1之方法，其中該研磨基料之該經加熱懸浮液係藉快速蒸發冷卻至低於膠凝溫度，且隨後在澱粉液化酵素存在下進行澱粉液化。
  3. 如請求項1或2中任一項之方法，其中在加熱前於該懸浮液中添加至少一種澱粉液化酵素。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該澱粉之水解包括糖化步驟。
  5. 如請求項1或2之方法，其又包括下列步驟：v)培養可在包括可代謝糖之水性發酵培養基F中過度產生有機化合物之微生物；及vi)將水性培養基M添加於發酵培養基F中，此製程期間水性培養基M中存在之水解澱粉構成份係藉由微生 物代謝而形成該有機化合物。
  6. 如請求項5之方法，其中步驟v)中之發酵培養基F包括水性培養基M、可過度產生有機化合物之微生物、營養鹽、習知佐劑及稀釋用水。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該澱粉液化酵素為α-澱粉酶。
  8. 如請求項1或2之方法，其中該發酵所用之微生物係選自可過度生產出下列代謝物之至少一種之天然或重組微生物：酵素、胺基酸、維他命、二糖類、具有3至10個C原子之脂族單-及二羧酸、具有3至10個C原子之脂族羥基羧酸、具有3至10個C原子之酮、具有4至10個C原子之烷醇、具有3至8個C原子之烷二醇及聚羥基烷酸酯。
  9. 如請求項8之方法，其中該微生物係選自可過度生產一或多種胺基酸之微生物。
  10. 如請求項8之方法，其中該微生物係選自可過度生產一或多種具有3至10個C原子之脂族單-及二羧酸之微生物。
  11. 如請求項8之方法，其中該微生物係選自可過度生產一或多種酵素之微生物。
  12. 如請求項11之方法，其中該微生物係選自可過度生產植酸酶之微生物。
  13. 如請求項1之方法，其中該微生物為棒桿菌(Corynebacterium )屬菌株。
  14. 如請求項1或2之方法，其中至少一種微生物代謝物係自 該發酵液中耗竭或自其單離，且隨後將該發酵液之揮發性構成份移除至殘留之含水量不超過30重量%，獲得固體或半固體蛋白質組合物。
  15. 2及13中任一項之方法，其中至少部分該發酵液之揮發性構成份未經事先單離或耗竭非揮發性微生物代謝物且未事先移除固體構成份即移除，獲得非揮發性微生物代謝物之固體調配物。
  16. 如請求項1或2之方法，其中至少部分該發酵液之揮發性構成份未經事先單離或耗竭非揮發性微生物代謝物即移除，獲得非揮發性微生物代謝物之固體調配物。
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