CN104694595A - 发酵产品产生方法 - Google Patents

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凯文·S·温格
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Abstract

本发明涉及发酵产品产生方法，具体地涉及用于从含淀粉材料产生发酵产品的方法，其包含用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；用蛋白酶处理；在糖源产生酶存在下糖化；在发酵生物存在下发酵。

Description

发酵产品产生方法
本发明申请是基于申请日为2006年2月7日、申请号为“200680004345.8”(国际申请号为PCT/US2006/006966)、名称为“发酵产品产生方法”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及产生发酵产品的方法，例如乙醇，所述方法从含淀粉材料产生发酵产品，包括降解包含于含淀粉材料中的蛋白质。
发明背景
大量难以合成生产的商业产品可以通过发酵产生。这种产品包括酒精(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)，和更复杂的化合物，包括，举例来说，抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素；以及通常用在消耗性的酒精(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如，在酸奶和干酪的生产中)、皮革和烟草工业中的产品。
乙醇具有广泛的应用，包括，作为化工原料、汽油添加剂或直馏(straight)液体燃料。作为燃料或燃料添加剂，乙醇显著地减少气体排放同时改进发动机性能。作为可再生燃料，乙醇减少对有限的并且主要是外来的化石燃料资源的国家依赖，同时减少大气层中二氧化碳的净累积。
通常乙醇通过液化含淀粉材料，接着是相继或同时的糖化作用和发酵作用而产生。液化包括淀粉的糊化，与之同时或在其之后添加α-淀粉酶以降解淀粉成为糊精。当产生乙醇时，将液化的含淀粉材料糖化。糖化是将糊精转化成低分子DP1-3糖的步骤，例如，酵母能够将该糖转化成为乙醇。
美国专利编号5,231,017A公开的乙醇产生方法包含(a)在α-淀粉酶存在下液化原料，(b)在葡糖淀粉酶存在下糖化液化醪(liquefied mash)，(c)发酵和(d)乙醇回收，其中在糖化和/或发酵期间将蛋白酶引入液化醪。
加拿大专利1,143,677公开从淀粉原料产生乙醇的方法，其通过用源自康宁木霉(Trichoderma)培养物的淀粉分解酶和纤维素酶制备物水解所述原材料，该制备物包含水解酶和多种淀粉分解酶的复合物，所述水解酶包括C1酶、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶、蛋白酶。
Mullins等,"Biomass"16(1988)2,pp.77-87论证向醪液添加碱性蛋白酶导致氨基氮的增加，其足以支持加速的乙醇发酵速率。
存在对进一步改进发酵产品产生方法的需求。
发明概述
本发明的一方面涉及从含淀粉材料产生发酵产品的方法，所述产品例如乙醇，该方法包括：
(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；
(b)用蛋白酶处理；
(c)在糖源产生酶(carbohydrate-source generating enzyme)存在下糖化；
(d)在发酵生物存在下发酵。
步骤(a)和(b)中所述的液化和蛋白质降解可以同时或相继地(sequentially)进行。同样所述糖化和发酵步骤可以同时(SSF)或相继地进行。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.从含淀粉材料生产发酵产品的方法，包含：
(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；
(b)用蛋白酶处理；
(c)在糖源产生酶存在下糖化；
(d)在发酵生物存在下发酵。
2.项1的方法，其中步骤(a)和(b)同时或相继地进行。
3.项2的方法，其中在步骤(b)用蛋白酶处理液化醪。
4.项1-3中任一项的方法，进一步包含步骤：
(e)蒸馏以获得发酵产品。
5.项1-4中任一项的方法，其中所述发酵产品是乙醇。
6.项1的方法，其中步骤(a)使用细菌α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶进行。
7.项6的方法，其中所述细菌α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体，所述变体具有突变：R179*和G180*或I181*+G182*，特别是I181*+G182*+N193F。
8.项6或7的方法，其中所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS之间的量使用，优选0.001-1KNU每g DS，例如大约0.050KNU每g DS。
9.项1-8中任一项的方法，其中所述液化期间的pH为大约4.5-7，优选5-6，优选大约5.4或5.6。
10.项1-9中的方法，在步骤(a)之前，进一步包含步骤：
i)碾磨含淀粉材料；
ii)形成包含碾磨的含淀粉材料和水的浆。
11.项10的方法，其中加热所述浆至初始糊化温度以上。
12.项10或11的方法，其中在步骤(a)之前，将浆在95-140℃的温度，优选105-125℃的温度蒸汽蒸煮1-15分钟，优选3-10分钟，特别是约5分钟。
13.项1的方法，其中步骤(b)作为液化后蛋白酶处理进行。
14.项1-13中任一项的方法，其中所述蛋白酶是真菌、细菌或植物来源的。
15.项1-13中任一项的方法，其中所述蛋白酶是内切蛋白酶和/或外切蛋白酶，优选是细菌或真菌来源。
16.项1-12中任一项的方法，其中所述蛋白酶是金属蛋白酶。
17.项1-16中任一项的方法，其中所述蛋白酶是真菌蛋白酶，其源自曲霉属，优选黑曲霉、斋藤曲霉、泡盛曲霉、棘孢曲霉、米曲霉；毛霉属，优选微小毛霉或米黑毛霉；根毛霉属，优选微小根毛霉或曼赫根毛霉；根霉属；念珠菌属；革盖菌属；内座壳菌；Enthomophtra；耙菌属；青霉属；小核菌属；嗜热子囊菌属，优选嗜热子囊菌和球拟酵母菌属。
18.项1-16中任一项的方法，其中所述蛋白酶是细菌蛋白酶，其源自芽孢杆菌属，优选解淀粉芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌；拟诺卡氏菌属，优选Nocardiopsis prasina或Nocardiopsis dassonavilla。
19.项1-18中任一项的方法，其中所述蛋白酶是源自大麦的植物蛋白酶。
20.项1-20中任一项的方法，其中步骤(b)在对于所讨论蛋白酶最佳的条件进行。
21.项1-20中任一项的方法，其中步骤(b)中的蛋白酶处理期间的温度在25-90℃的范围内，优选30-80℃，例如从65-75℃，特别大约50℃或70℃。
22.项1-21中任一项的方法，其中步骤(b)中蛋白酶处理期间的pH在2-11。
23.项1-22中任一项的方法，其中步骤(b)中液化的淀粉具有在20-50％(w/w)总固体(TS)，优选30-40％(w/w)TS的浓度。
24.项1-19中任一项的方法，其中步骤(b)中的蛋白酶处理进行0.1至12小时，优选1至10小时，特别是2至8小时。
25.项1-24中任一项的方法，其中所述蛋白酶以0.0001至1wt.-％的TS的浓度存在，优选0.001至0.1wt.-％的TS。
26.项1-25中任一项的方法，其中步骤(c)的糖化按照如下步骤进行：预糖化步骤，其在从大约28至65℃的温度，在pH 4-6持续大约40至90分钟，然后是在同时糖化和发酵方法(SSF)中的发酵期间的完全糖化。
27.项1-26中任一项的方法，其中所述糖化和发酵步骤作为同时的糖化和发酵方法(SSF方法)进行。
28.项27的方法，其中SSF进行20-100小时，优选大约24至72小时。
29.项1-28中任一项的方法，其中所述糖源产生酶是葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、β-淀粉酶，或它们的组合。
30.项1-29中任一项的方法，其中所述糖源产生酶是葡糖淀粉酶，优选以0.005-5AGU/g DS的浓度存在，更优选0.01-1AGU/g DS之间，例如特别大约0.1-0.5AGU/g DS的浓度存在。
31.项30的方法，其中所述葡糖淀粉酶源自曲霉属菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉，或踝节菌属(Talaromyces)属的菌株，优选Talaromyesemersonii的菌株，或Athelia属的菌株，优选Athelia rolfsii，或栓菌属的菌株，优选Trametes ciingulata的菌株。
32.项1-31中任一项的方法，其中所述发酵生物是酵母，优选能够发酵糖成为乙醇的酵母，例如酵母属菌种，特别是酿酒酵母。
附图简述
图1显示SSF之后的乙醇收率(glg Ds)1)用蛋白酶ALC(Alc)液化后处理和2)不用酶(NE-无酶)，其是于多种温度、处理时间和pH下进行；
图2显示达到在没有液化后(post-liquefaction)对照发酵中所观察到的乙醇产率发酵理论上所需的时间。数值基于每克玉米醪(mash)的重量损失；
图3显示甘油/乙醇关系(g/g)1)用蛋白酶ALC(Alc)液化后处理和2)不用酶(NE-无酶)，于多种温度、处理时间和pH条件下；
图4显示残基葡萄糖[g/gDS]1)用蛋白酶ALC(Alc)液化后处理和2)不用酶(NE-无酶)，于多种温度、处理时间和pH条件下；
图5显示两种蛋白酶与无蛋白酶对照比较，于67.5℃同时液化和蛋白质降解的重量损失与发酵时间之间函数的分布图(profile)；
图6显示两种蛋白酶与无蛋白酶对照比较，于70℃同时液化和蛋白质降解的重量损失与发酵时间之间函数的分布图；
图7显示当液化和蛋白质降解同时进行时，70小时发酵之后的乙醇收率(g/g DS)，其分别是于67.5℃和70℃、有和无蛋白酶条件下进行。
图8显示当液化和蛋白质降解同时进行时，70小时发酵之后的甘油水平(g/g DS)，其分别于67.5℃和70℃、有和无蛋白酶条件下。
图9显示当液化和蛋白质降解同时进行时，70小时发酵之后的甘油/乙醇比率(g甘油/g乙醇)，其分别于67.5℃和70℃、有和无蛋白酶条件下；
发明详述
本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产品的方法，所述产品例如乙醇。
发明者们惊讶地发现，通过使用蛋白酶在糖化和发酵之前(同时)处理液化的玉米醪，能够获得显著较快的发酵速率、较高的发酵收率、较低的甘油/乙醇关系(relationship)和较低的残基葡萄糖浓度。
液化之后分开的保留(holding)步骤提供对于蛋白酶的最佳温度和pH条件。在液化后步骤中蛋白质的初始分解释放游离氨基氮(FAN)，其作为发酵生物例如酵母的生长因子。FAN的释放帮助酵母承受住来自高底物和产品浓度的胁迫(stress)，由此降低甘油产生并且增加乙醇生产力和乙醇收率。在最适酶条件所需的时间是仅数小时。例如，发现与相应的不进行液化后处理的SSF发酵相比，2小时液化后处理改进乙醇产率多于14％。所增加的生产力在价值上大大地超过在液化后处理上的时间消耗。
在实施例1(图2)中显示，与不存在蛋白酶的同样条件相比，液化玉米醪后用源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的碱性蛋白酶发酵到达标准SSF发酵(即，无液化后处理)的乙醇产率的时间约为一半。发现增加处理时间和蛋白酶剂量二者均增加总的最终产率。然而，增加在较低剂量的蛋白酶中最为明显，即，添加的每数量酶引起在产率上最高的反应。发现当浓度接近0.1wt.-％DS时，对于增加的蛋白酶剂量的反应呈平稳状态。然而，在测试的时间间隔中，显然增加处理时间持续地改进发酵性能。用剂量水平0.007wt.-％TS的蛋白酶ALC液化后处理7到8小时之间被认为是最佳的。
发明者们还惊讶地发现，蛋白酶处理与液化同时进行可能是有利的。这在实施例2中有所说明。相信玉米粉中的蛋白质基质稳定了蛋白酶，与之相反已蒸煮的玉米醪中蛋白质是沉淀的。发明者们发现甚至相对短的蛋白酶处理周期是充分的。因此蛋白质的降解不是同时液化和蛋白质降解的时限因子。而是作用于含淀粉材料的α-淀粉酶的能力。
从含淀粉材料产生发酵产品的方法
本发明涉及从含淀粉材料产生发酵产品的方法，所述产品尤其是乙醇，所述方法包括相继或同时的液化、蛋白质降解、糖化和发酵步骤。
在本发明的这个方面涉及从含淀粉材料产生发酵产品的方法，其包含以下步骤：
(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；
(b)用蛋白酶处理；
(c)在糖源产生酶存在下糖化；
(d)在发酵生物存在下发酵。
在实施方案中，本发明的方法进一步包含回收发酵产品的步骤(e)，所述产品例如乙醇，优选通过蒸馏回收。
液化–步骤(a)
根据本发明，步骤(a)是液化步骤。液化是将含淀粉材料分解(水解)成麦芽糖糊精(糊精)的加工步骤，所述含淀粉材料优选碾磨的(完整的)谷物(grain)。液化通常使用α-淀粉酶进行，或通过本领域已知的提供这种效果的其它方法(例如，酸解)。优选的α-淀粉酶是细菌或真菌来源的α-淀粉酶。α-淀粉酶可以0.0005-5KNU每g DS(Dry Solids；干固体)之间的量使用，优选0.001-1KNU每g DS之间，例如大约0.050KNU每g DS。α-淀粉酶合适的实例可在以下“α-淀粉酶”部分找到。液化期间的pH可以在约4.5-7之间，优选在5-6之间，优选约5.4或5.6。
起始物料可以是任何含淀粉的植物材料。优选的是碾磨的整个谷物(whole grain)，特别是玉米、小麦和milo。预期的含淀粉材料的实例可在以下“含淀粉材料”部分中找到。在具体实施方案中，本发明的方法进一步包含，在步骤(a)之前，以下步骤：
i)碾磨含淀粉材料；
ii)形成包含碾磨的含淀粉材料和水的浆。
含水的浆可以含有10-50wt-％，优选20-40wt-％，特别是25-35wt.-％的含淀粉材料。将浆加热至初始糊化温度以上，并且可以添加α-淀粉酶以起始液化(稀释(thinning))。
术语“初始糊化温度(initial gelatinization temperature)”的意思是淀粉糊化开始的最低温度。在水中加热的淀粉在55℃和75℃之间开始糊化；糊化的精确温度取决于特异的淀粉，并且能够容易地由熟练技术人员测定。因此，初始糊化温度可以根据植物的品种(species)、植物品种的具体变种(variety)以及生长条件变化。在本发明的上下文中，特定含淀粉材料的初始糊化温度是5％的淀粉颗粒损失双折射时(birefringence is lost in 5％of the starch granules)的温度，使用由Gorinstein.S.and Lii.C.,Starch/Vol.44(12)pp.461-466(1992)描述的方法测定。
可将实施方案中的浆蒸汽蒸煮(jet-cooked)，以在施以本发明步骤(a)中的α-淀粉酶之前进一步糊化所述浆。
更具体地液化的进行可以如三步热浆方法(process)一样。将浆加热至60-95℃之间，优选65-90℃，并且可以添加α-淀粉酶(通常为总剂量的大约1/3)以起始液化(稀释)。随后可以将所述浆在95-140℃之间的温度蒸汽蒸煮，优选105-125℃，持续1-15分钟，优选3-10分钟，特别大约5分钟。随后将所述浆冷却至60-95℃，优选80-90℃，并且添加更多的α-淀粉酶(通常为总剂量的大约2/3)以完成水解(二次液化)。所述液化步骤通常在pH 4.5-6.5进行，特别在pH 5-6之间。碾磨并且液化的整个谷物被称为醪。
液化后–步骤(b)
在液化之后进行蛋白酶处理，优选在对于所讨论的蛋白酶合适的条件，优选在对于所讨论的蛋白酶最佳的条件。这将通常意味着在步骤(b)中蛋白酶处理期间的温度将在25-90℃之间的范围内，优选30-80℃，优选在45℃-65℃之间或65℃-75℃之间，特别大约50℃或70℃，并且pH将在2-10的范围内。对于酸性蛋白酶，步骤(b)期间的pH将在2-7。对于中性蛋白酶，步骤(b)期间的pH将在5-8。对于碱性蛋白酶，步骤(b)期间的pH将在7-10。然而，本领域技术人员能够容易地确定进行液化后步骤的最佳条件。在步骤(b)液化的淀粉可具有在20-50wt.-％的总固体(Total Solid；TS)范围内的浓度，优选30-40wt.-％的TS之间。所述蛋白酶处理可以进行0.1-12小时，优选1-10小时，特别地2-8小时。所述蛋白酶可以从0.0001至1.0wt.-％的TS范围的浓度存在，优选0.001-0.1wt.-％的TS。所述蛋白酶可以是任何来源。优选的蛋白酶是真菌的、细菌的或植物来源，并且可以是酸性、中性或碱性。合适蛋白酶的实例可在以下的“蛋白酶”部分找到。
同时液化和蛋白质降解
在优选实施方案中，蛋白质降解与液化含淀粉材料同时地进行。换句话说，步骤(a)和步骤(b)可以同时进行。蛋白酶处理期间的温度取决于使用的酶，但可以在从25-90℃的范围，优选30-80℃，例如从65-75℃，特别大约50℃或70℃。如果所用蛋白酶和α-淀粉酶是热稳定的，可以使用较高范围内的温度。优选的pH取决于以上的“液化”部分指出的所用的酶，但根据本发明优选pH 4-7，特别是5-6。所需的液化时间决定用于进行根据本发明的同时液化和蛋白质降解的合适的时间周期。因此，同时液化和蛋白质降解可以根据本发明进行0.1-12小时的周期，优选1-10小时，特别2-8小时。应该理解的是包含于含淀粉材料的蛋白质的降解可以在液化期间的任何时间起始(通过添加蛋白酶)，例如在步骤(a)之前可将蛋白酶加到含水(aqueous)的浆中。
糖化–步骤(c)和发酵–步骤(d)
“糖化”是将麦芽糖糊精(例如液化后的含淀粉材料)转化成低分子糖的方法，所述糖例如DP1-3糖。
步骤(c)中的糖化可以使用本领域熟知的条件进行。
糖化在糖源产生酶存在下进行。糖源产生酶的实例是葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶(maltogenic enzyme)、β-淀粉酶和它们的组合。所述糖源产生酶，优选葡糖淀粉酶，优选以0.005-5AGU/g DS的浓度存在，更优选0.01-1AGU/gDS之间，例如特别大约0.1-0.5AGU/g DS。糖源产生酶的实例可在以下的“酶”部分找到，并且包括源自例如曲霉属(Aspergillus)、踝节菌属(Talaromyces)和Athelia菌属菌株的葡糖淀粉酶。
例如，完整糖化方法可以持续约20至100小时，优选24至约72小时。
只进行通常40-90分钟的预糖化是普遍的，于30-65℃之间的温度，通常大约60℃，接着是发酵期间的完全糖化。糖化期间的pH通常在4-6的范围内，通常在大约pH 4.5-5.5。
发酵步骤(d)在发酵生物存在下进行。发酵生物的选择取决于待产生的产品。本领域技术人员能够容易地选择合适的发酵生物。在乙醇产生的情况下，发酵生物是酵母，优选糖酵母属(Saccharomyces)菌株，特别酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株。合适的发酵生物将在以下的“发酵生物”部分提及。
在优选实施方案中，将糖化和发酵步骤结合为同时的糖化和发酵(SSF)方法，其中没有糖化的保留阶段，意味着该发酵生物，例如酵母，和酶可以共同添加。如上所述，通常在SSF之前包含预糖化。SSF方法通常进行20至100小时之间，优选大约24至72小时，并且在对于所述发酵生物最佳的温度。在乙醇产生的情况下，SSF方法可以在28至34℃之间的温度进行，优选大约32℃。发酵期间的pH可以在3-6，优选pH 4-5。
根据本发明的发酵步骤包括，但不限于，用于产生酒精(例如，乙醇,甲醇,丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素的发酵方法。优选的发酵方法包括酒精发酵方法，如本技术领域中所熟知。优选的发酵方法是无氧发酵方法，如本技术领域中所熟知。
含淀粉材料
根据本发明所用的含淀粉材料可以是任何含淀粉的植物材料。优选的是选自下组的含淀粉材料：块茎、根和整个谷物；以及任何它们的组合。在实施方案中，所述含淀粉材料从谷物获得。含淀粉材料可以是，例如，选自下组：玉米(玉蜀黍)、玉米穗轴(cob)、小麦、大麦、木薯(cassava)、高粱、黑麦、milo和马铃薯；或任何它们的组合。
当发酵产品是乙醇是，所述含淀粉材料优选是整个谷物或至少主要是整个谷物。原料还可以由淀粉加工的侧线馏分组成或包含淀粉加工的侧线馏分(side-stream)，例如，含C6糖的加工馏分(process streams)，其不适合用于糖浆的生产。
碾磨
在本发明的优选实施方案中，将所述含淀粉材料的大小减少，例如通过步骤(a)之前的碾磨以打开结构并且允许进一步的加工。通常使用两种碾磨的方法：湿和干碾磨。术语“干碾磨”指整个谷物的碾磨。在干碾磨中，将完整的谷粒(kernels)碾磨并且用在所述方法的剩余部分中。湿碾磨提供胚芽和粉(meal)(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且除了少数例外均应用于存在并行的糖浆产生的情况的位置(location)。干碾磨在针对产生乙醇的方法中是优选的。
将术语“研磨”同样理解成碾磨。在本发明的优选实施方案中使用干碾磨。其它减少大小的技术例如乳化技术、旋转脉动(rotary pulsation)也可以使用。
发酵生物
术语“发酵生物”指能够提供期望的发酵产品的任何生物。合适的发酵生物根据本发明能够发酵，即，转化，优选DP1-3糖，例如特别葡萄糖和麦芽糖，直接地或间接地成为所期望的发酵产品，例如乙醇。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种的菌株，并且特别酿酒酵母。可从商业途径获得的酵母包括，例如，RED STARTM/Lesaffre、ETHANOLREDTM(可从Red Star/Lesaffre,USA获得)、FALI(可从Fleischmann’s Yeast获得，a division of Burns Philp Food Inc.,USA)、SUPERSTART(可从Alltech获得)、GERT STRAND(可从Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOLTM(可从DSM Specialties获得)
酵母细胞优选以每mL发酵肉汤活酵母计数105到1012的量应用，优选从107至1010，特别5x107。在乙醇生产阶段，所述酵母细胞计数应该优选在107至1010的范围内，特别大约2x 108。关于使用酵母发酵的进一步指导可以在例如“The alcohol Textbook”(Editors K.Jacques,T.P.Lyons and D.R.Kelsall,Nottingham University Press,United Kingdom 1999)中找到，其因此作为参考文献并入本文。
酶
蛋白酶
根据本发明所述含淀粉材料可以用任何来源的蛋白酶处理。蛋白酶的添加增加FAN(游离氨基氮)水平并且增加发酵生物新陈代谢速率，所述发酵生物例如酵母，并且进一步提供较高的发酵效率。根据本发明，肽酶和其它蛋白降解酶被认为是蛋白酶。在优选实施方案中，所述蛋白酶是内切蛋白酶和/或外切蛋白酶。
合适的蛋白酶可以是真菌、细菌和植物来源，包括丝状真菌和酵母。
在实施方案中，所述蛋白酶是酸性蛋白酶，即，蛋白酶，其特征为在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的能力，例如在pH 2-7之间。在实施方案中，所述酸性蛋白酶具有最适pH在从2.5至3.5的范围内(于37℃，0.7％w/v高氮酪蛋白底物测定)和温度最适在5至50℃之间(在酶浓度10mg/mL时于PH3.5在0.1M哌嗪/乙酸/甘氨酸缓冲液中进行一小时)。
在另外的实施方案中，所述蛋白酶是碱性蛋白酶，即，蛋白酶，其特征为在pH7以上的碱性条件下水解蛋白质的能力，例如，在pH 7-11之间。在实施方案中，所述碱性蛋白酶源自芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，优选地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。在实施方案中，所述碱性蛋白酶在7到11的范围内具有最适温度，并且在pH 9测定温度最适大约70℃。
在另外的实施方案中，所述蛋白酶是中性蛋白酶，即，蛋白酶，其特征为在pH 5-8的条件下水解蛋白质的能力。在实施方案中，所述中性蛋白酶源自芽孢杆菌属菌株，优选解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在实施方案中，所述中性蛋白酶具有最适pH在7-11的范围内(于25℃测定，10分钟反应时间，酶浓度为0.01-0.2AU/L)并且温度最适在50℃-70℃(于pH 8.5测定，10分钟反应时间和0.03-0.3AU/L酶浓度)。
在实施方案中，所述蛋白酶是金属蛋白酶。在优选实施方案中所述蛋白酶源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，优选嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)的菌株，特别嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)CGMCC No.0670，其具有WO 03/048353中SEQ ID NO:2的成熟部分所示的序列，WO03/048353作为参考文献并入本文。嗜热子囊菌蛋白酶从20-90℃是活性的，最适温度大约70℃。另外，所述酶在pH 5-10之间是活性的，最适大约pH 6。
合适的植物蛋白酶可以源自大麦。
合适的细菌蛋白酶包括源自解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的芽孢杆菌属蛋白酶。合适的丝状细菌蛋白酶可以源自拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)菌株，优选Nocardiopsis prasina NRRL 18262蛋白酶(或拟诺卡氏菌属菌种10R)和Nocardiopsis dassonavilla NRRL 18133(Nocardiopsis dassonavilla M58-1)，其二者均在WO 1988/003947(Novozymes)有所描述。
合适的酸性真菌蛋白酶包括源自以下菌属的真菌蛋白酶：曲霉菌属、毛霉属(Mucor)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、念珠菌属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳菌(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)和球拟酵母属(Torulopsis)。特别预期的蛋白酶源自黑曲霉(Aspergillus niger)(参见，例如，Koaze等,(1964),Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)、斋藤曲霉(Aspergillussaitio)(参见，例如，Yoshida,(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)(Hayashida等,(1977)Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)或米曲霉(Aspergillusoryzae)；公开于美国专利编号4,357,357和美国专利编号3,988,207的源自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的蛋白酶；和公开于，例如WO 94/24880(在此作为参考文献并入)的曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)或微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)。
天冬氨酸蛋白酶在例如Hand-book of Proteolytic Enzymes,Edited by A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner,Aca-demic Press,San Diego,1998,Chapter 270中有所描述。天冬氨酸蛋白酶的合适实例包括，例如，那些公开于R.M.Berka等Gene,96,313(1990)；R.M.Berka等Gene,125,195-198(1993)；和Gomi等Biosci.Biotech.Biochem.57,1095-1100(1993)中的蛋白酶，所述文献作文参考文献并入本文。
商业上能够获得的产品包括ESPERASETM、NOVOZYMTMFM 2.0L和NOVOZYMTM50006(可从Novozymes A/S,Denmark获得)和来自Genencor Int.,Inc.,USA的GC106TM和SPEZYMETMFAN。
所述蛋白酶可以从0.0001至1.0wt.-％的TS范围内的浓度存在，优选0.001至0.1wt.-％的TS。
α-淀粉酶
所述α-淀粉酶可以根据本发明是任何来源的。优选的是真菌或细菌来源的α-淀粉酶。
在优选实施方案中，所述α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”的意思是以有效量添加具有最适活性在pH 3至7范围内的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，优选从3.5至6，或更优选从4-5。
细菌α-淀粉酶
根据本发明，细菌α-淀粉酶可优选源自芽孢杆菌属。
在优选实施方案中，芽孢杆菌属α-淀粉酶是源自菌株地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，但也可以源自其它芽孢杆菌属菌种。预期的α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)、WO 99/19467中SEQ ID NO:5所示的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAN)和WO 99/19467中SEQ ID NO:3所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)。在本发明的实施方案中，所述α-淀粉酶是与WO 99/19467中分别为SEQ ID NOS:1、2、3、4或5所示的任何序列具有至少60％同一性程度的酶，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
芽孢杆菌属α-淀粉酶还可以是变体和/或杂种，特别描述于WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(所有文献均作为参考文献并入本文)任一所述的一种。具体预期的α-淀粉酶变体公开于美国专利编号6,093,562、6,297,038或美国专利编号6,187,576(作为参考文献并入本文)，并且包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，其在位点R179至G182具有一种或两种氨基酸的缺失，优选公开于WO1996/023873——参见例如，20页，1-10行(作为参考文献并入本文)中的双缺失，优选与公开于WO 99/19467中SEQ ID NO:3的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列比较相应于delta(181-182)的或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3编号的氨基酸R179和G180的缺失，(该文献作为参考文献并入本文)。更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与公开于WO 99/19467中的SEQ ID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比，具有相应于delta(181-182)的双缺失，并且进一步包含N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。
所述α-淀粉酶还可以是麦芽(maltogenic)α-淀粉酶。“麦芽α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽水解酶，E.C.3.2.1.133)能够水解直链淀粉和支链淀粉成为α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽α-淀粉酶可从Novozymes A/S,Denmark通过商业途径获得。所述麦芽α-淀粉酶在美国专利编号4,598,048、4,604,355和6,162,628中有所描述，其作为参考文献并入本文。
细菌杂合α-淀粉酶
杂合α-淀粉酶具体预期包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(在WO 99/19467中作为SEQ ID NO:4显示)的445C末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(在WO 99/194676中作为SEQ ID NO:3显示)的37N末端氨基酸残基，具有一种或多种，特别所有以下取代：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用地衣芽孢杆菌编号)。同样优选的是具有一种或多种以下突变的变体(或在其它芽孢杆菌属α-淀粉酶骨架中相应的突变)：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S和/或在位点176和179之间缺失两种残基，优选缺失E178和G179(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5编号)。
所述细菌α-淀粉酶可以本领域熟知的量添加。当以KNU单位(在下面的“材料和方法”部分有所描述)测量时，所述α-淀粉酶活性优选以0.0005-5KNU每g DS的量存在，优选在0.001-1KNU每g DS之间，例如大约0.050KNU每g DS。
真菌α-淀粉酶
真菌酸性α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉、黑曲霉或川地曲霉(Aspergillus Kawachii)。
优选的酸性真菌α-淀粉酶是芬加密尔类α-淀粉酶，其优选源自米曲霉菌株。在本公开中，术语“芬加密尔类(Fungamyl-like)α-淀粉酶”指与WO 96/23874中SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的成熟部分呈现高同一性的α-淀粉酶，即多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％或甚至100％的同一性。
另外优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉菌株。在优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶来自Swiss-prot/TeEMBL数据库中以初级登录号P56271作为“AMYA_ASPNG”公开的黑曲霉的并且在WO 89/01969(实施例3)中更具体描述的酸性真菌α-淀粉酶。酸性黑曲霉α-淀粉酶也作为SEQ ID NO:1示于作为参考文献并入本文的WO 2004/080923(Novozymes)中。同样预期所述酸性真菌淀粉酶的变体与WO 2004/080923中的SEQ ID NO:1具有至少70％的同一性，例如至少80％或甚至至少90％的同一性，例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。合适的商业上能够获得的源自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
其它预期的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属和Meripilus菌属菌株的那些α-淀粉酶，优选微小根毛霉或Meripilus giganteus的菌株。
真菌酸性α-淀粉酶还可以是野生型酶，其包含糖结合模块(CBM)和α-淀粉酶催化结构域(即，非杂合)，或所述野生型酶的变体。在实施方案中，所述野生型酸性真菌α-淀粉酶源自川地曲霉菌株，例如，由Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81:292-298(1996)“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase fromAspergillus kawachii."；and further as EMBL:#AB008370公开的α-淀粉酶。
真菌杂合α-淀粉酶
在实施方案中，所述真菌α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括在作为参考文献并入本文的WO 2005/003311或美国专利公开编号2005/0054071(Novozymes)或美国专利申请编号60/638,614(Novozymes)中公开的α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化结构域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，例如淀粉结合域和任选的接头。
预期的杂合α-淀粉酶的具体实例包括在共同提交的美国专利申请编号60/638,614实施例中表1至5公开的那些α-淀粉酶，包括带有催化结构域JA118的芬加密尔变体和Athelia rolfsii SBD(美国申请60/638,614中的SEQ IDNO:100)、带有Athelia rolfsii AMG接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(美国60/638,614中的SEQ ID NO:101)和带有Athelia rolfsii葡糖淀粉酶接头和SBD的Meripilus giganteusα-淀粉酶(美国60/638,614中的SEQ ID NO:102)。
预期的杂合α-淀粉酶的其它具体实例包括公开在美国专利申请编号2005/0054071中的那些α-淀粉酶，包括公开在15页表3中的那些α-淀粉酶，例如带有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。
商业α-淀粉酶产品
优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASETM(DSM,Holland)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X和SANTMSUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM ETHYL、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(Genencor Int.)，和以商品名SP288销售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。
酸性α-淀粉酶可以根据本发明以0.1至10AFAU/g DS的量添加，优选0.10至5AFAU/g DS，特别0.3至2AFAU/g DS。
糖源产生酶
术语“糖源产生酶”包括葡糖淀粉酶(作为葡萄糖发生器)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(作为麦芽糖发生器)。糖源产生酶能够产生糖，其能够被所讨论的发酵生物用作能源，例如，当用在本发明用于产生发酵产品例如乙醇的方法中时。产生的糖可以直接或间接地转化成期望的发酵产品，优选乙醇。根据本发明，可以使用糖源产生酶的混合物。特别预期的混合物是至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶的混合物，特别酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶。酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)/葡糖淀粉酶活性(AGU)(AFAU/AGU)之间的比率在本发明的实施方案中是至少0.1，特别至少0.16，例如在从0.12至0.50的范围内或更多。
葡糖淀粉酶
根据本发明使用的葡糖淀粉酶可以源自任何合适的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源，例如，选自曲霉菌属葡糖淀粉酶，特别黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)，或它们的变体，例如公开于WO 92/00381、WO 00/04136、WO01/04273和WO 03/029449(来自Novozymes,Denmark，作为参考文献并入本文)的葡糖淀粉酶；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO 84/02921)、米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)，或它们的变体或片段。
其它曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996),Prot.Eng.9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995),Prot.Engng.8,575-582)；N182(Chen等(1994),Biochem.J.301,275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等(1996),Biochemistry,35,8698-8704；和在位点A435和S436引入Pro残基(Li等(1997),Protein Engng.10,1199-1204。其它葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsii(之前表示为Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参见美国专利编号4,727,026和(Nagasaka,Y.等(1998)Purification and properties of theraw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii,Appl MicrobiolBiotechnol 50:323-330)；Talaromyces葡糖淀粉酶，特别源自Talaromycesemersonii(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利编号Re.32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(美国专利编号4,587,215)。预期的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别C.thermoamylolyticum(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 86/01831)。
预期的其它葡糖淀粉酶包括来自栓菌属(Trametes)菌株的葡糖淀粉酶，优选公开于2005年2月7日提交的共同提交美国临时申请编号60/650,612(作为参考文献并入本文)的Trametes cingulata菌株。
在另外的实施方案中，所述葡糖淀粉酶是杂合酶，优选包含真菌来源的催化结构域。所述催化结构域可以源自曲霉属菌株，优选来自黑曲霉或米曲霉菌株；Athelia菌属菌株，优选Athelia rolfsii；Talaromyces菌株，优选Talaromycesemersonii。在优选实施方案中，杂合葡糖淀粉酶包含真菌来源的糖结合模块，例如源自曲霉属菌株，川地曲霉α-淀粉酶，或源自黑曲霉葡糖淀粉酶，或源自Athelia菌种的葡糖淀粉酶，优选来自Athelia rolfsii葡糖淀粉酶。
在优选的实施方案中，所述杂合葡糖淀粉酶是在WO 2005/045018(作为参考文献并入本文)中公开的葡糖淀粉酶。
商业上能够获得的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTM EXTRA L、SPIRIZYMETM PLUS、SPIRIZYMETMFUEL、SPIRIZYMETM B4U和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM300(from Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
葡糖淀粉酶可以在实施方案中以0.005-2AGU/g DS的量添加，优选在0.01-1AGU/g DS之间，例如特别大约0.3AGU/g DS。
β-淀粉酶
至少根据本发明，所述β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)是传统上赋予外切作用麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关的葡萄糖多聚体中1,4-α-糖苷键的水解。将麦芽糖单位连续地从非还原链末端以逐步的方式去除，直至将分子降解，或在支链淀粉的情况下，直至达到分支点。释放的麦芽糖具有β-异头构型，因此称为β-淀粉酶。
β-淀粉酶已从多种植物和微生物中分离(W.M.Fogarty and C.T.Kelly,Progress in Industrial Microbiology,vol.15,pp.112-115,1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具有最适温度在40℃至65℃的范围内和最适pH在4.5至7的范围内。商业上能够获得的来自大麦的β-淀粉酶是来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTM WBA和来自Genencor Int.,USA的SPEZYMETM BBA 1500。
麦芽糖淀粉酶
所述淀粉酶还可以是麦芽α-淀粉酶。“麦芽α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够水解直链淀粉和支链淀粉成为α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶能够从Novozymes A/S通过商业途径获得。麦芽α-淀粉酶在作为参考文献并入本文的美国专利编号4,598,048、4,604,355和6,162,628中有所描述。
所述麦芽糖淀粉酶在优选实施方案中可以0.05-5mg总蛋白质/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
即使在本发明所述方法的上下文中未具体提及，应该理解所述酶以“有效量”使用。
在本文描述并且提出权利要求的发明不限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在举例说明本发明的几个方面。任何等同的实施方案均在本发明的范围内。当然，由于前面的描述，除了本文所说明和描述的之外，对于本发明的各种修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这些修饰同样应该在提出的权利要求范围之内。如有冲突，包括定义的本公开将控制。
本文中引用了不同的参考文献，作为参考文献将它们的公开内容全部并入。
以下实施例将进一步描述本发明，这些实施例不应理解为对本发明范围的限制。
材料和方法
酶
蛋白酶ALC：源自地衣芽孢杆菌的野生型碱性蛋白酶。
葡糖淀粉酶T：源自Talaromyces emersonii和WO 99/28448中作为SEQ IDNO:7公开的葡糖淀粉酶。
α-淀粉酶A：具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，其公开于美国专利编号6,187,576中，并且能够从Novozymes A/S,Denmark索取获得。
肽酶A是源自曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的异种集团AA-肽酶家族A1酶并且在米曲霉中重组产生。所述酶可从Novozymes A/S,Denmark索取获得。
酵母
可从Red Star/Lesaffre,USA获得的RED STARTM
方法：
α-淀粉酶活性(KNU)
淀粉酶活性可以使用马铃薯淀粉作为底物测定。这种方法基于通过所述酶分解改性(modified)的马铃薯淀粉，并且通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪所述反应。最初，形成黑蓝色，但在分解淀粉期间蓝色变弱，并且逐渐转变成红棕色，其与有色玻璃标准比较。
将一千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件(即，于37℃+/-0.05；0.0003M Ca2+；和pH 5.6)下糊精化5260mg淀粉干底物Merck Amylumsolubile的酶量。
更详细描述这种分析方法的文件EB-SM-0009.02/01可以向NovozymesA/S,Denmark请求索取获得，该文件以参考文献方式包括在此。
FAU活性的测定
将一真菌α-淀粉酶单位(FAU)定义为在以下标准条件下每小时分解5.26g淀粉(Merck Amylum solubile Erg.B.6,Batch 9947275)的酶量：
底物........可溶淀粉
温度........37℃
pH.........4.7
反应时间....7-20分钟
酸性α-淀粉酶活性测定(AFAU)
酸性α-淀粉酶活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量，其相对于酶标准测定。
所用标准是AMG 300L(来自Novozymes A/S,Denmark，葡糖淀粉酶野生型黑曲霉G1，同样公开于Boel等(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)和WO 92/00381)。这种AMG中的中性α-淀粉酶在储存于室温3周后从约1FAU/mL下降至0.05FAU/mL以下。
这种AMG标准中的酸性α-淀粉酶活性根据以下描述测定。在这种方法中，将1AFAU定义为在标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。
碘与淀粉一起形成蓝色复合物，但不与其降解产品形成蓝色复合物。颜色的强度因此与淀粉浓度成正(directly)比例。使用反向比色法在特定分析条件下测定淀粉浓度的减少作为淀粉酶活性。
标准条件/反应条件：(每分钟)
如果进一步细节是优选的，这些能够在EB-SM-0259.02/01中找到，其可以从Novozymes A/S,Denmark索取获得，并且作为参考文献并入。
酸性α-淀粉酶单位(AAU)
酸性α-淀粉酶活性能够以AAU(酸性α-淀粉酶单位)测量，其是绝对法。一酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准化条件下每小时将1g淀粉(100％干物质)转化成产品的酶量，其中在与相当于颜色参考(color reference)之一的已知强度(strength)的碘溶液反应之后，所述产品在620nm具有透射(transmission)。
标准条件/反应条件(每分钟)：
所述淀粉应该是Lintner淀粉，其是微弱煮沸的(thin-boiling)淀粉，用在实验室中作为比色指示剂。Lintner淀粉通过用稀盐酸处理天然淀粉获得，因而其保持了与碘一起变为蓝色的能力。进一步的细节可见EP0140410B2，该公开作为参考文献包括在此。
葡糖淀粉酶活性(AGI)
葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡糖苷酶)转化淀粉成为葡萄糖。此处葡萄糖的量由用于活性测定的葡萄糖氧化酶方法测定。该方法在“Approved methods ofthe American Association of Cereal Chemists”.Vol.1-2AACC,from AmericanAssociation of Cereal Chemists,(2000)；ISBN:1-891127-12-8中的节76-11Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucose withGlucose Oxidase中有所描述。
一葡糖淀粉酶单位(AGI)是在所述方法的标准条件下每分钟形成1微摩尔葡萄糖的酶量。
标准条件/反应条件：
所述淀粉应该是Lintner淀粉，其是微弱煮沸的淀粉，用在实验室中作为比色指示剂。Lintner淀粉通过稀盐酸处理天然淀粉获得，因而其保持了与碘一起变为蓝色的能力。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量，所述标准条件是37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：醋酸盐0.1M，反应时间5分钟。
可以使用自动分析器系统。将变旋光酶加入到葡萄糖脱氢酶试剂中，从而将任何存在的α-D-葡萄糖转变成β-D-葡萄糖。在上述反应中葡萄糖脱氢酶与β-D-葡萄糖特异地反应，形成NADH，其使用光度计在340nm测定，作为原始葡萄糖浓度的量度。
AMG温育：
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 醋酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
显色反应：
GlucDH： 430U/L
变旋光酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
温育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
更详细描述这种分析方法的文件(EB-SM-0131.02/01)可以向NovozymesA/S,Denmark请求索取获得，该文件以参考文献方式包括在此。
麦芽糖淀粉酶活性的测定(MANU)
可以将一MANU(麦芽糖淀粉酶Novo单位)定义为在以下条件每分钟释放一微摩尔麦芽糖需要的酶量：每毫升0.1M柠檬酸盐缓冲液10mg浓度的麦芽三糖(Sigma M 8378)底物，pH 5.0，于37℃进行30分钟。
实施例
实施例1
玉米醪的液化后蛋白酶处理
在15mL带保护装置试管(test snap-cap tube)中使用5g玉米醪(34wt.-％g总固体/g)进行以下实验：
·碱性地衣芽孢杆菌蛋白酶(蛋白酶ALC)处理相对于(VS.)无酶
·温度(50°和70℃)
·时间(0.5和2小时)
·pH(5和8)
来自蛋白酶处理(液化后处理)的效果通过进行标准SSF发酵来评估。
液化后处理：将液化的玉米醪(CM)分成2x 500mL的两份，并且将pH分别调节至5和8。在调节pH之前，取样用于总固体(TS)测定。将调节了pH的液化CM分配(5mL)至15mL试管中，将其分配至四个用于各种时间和温度试管架：
50℃于30分钟，
50℃于120分钟，
70℃于30分钟，
70℃于120分钟。
根据固体含量在每个试管中添加蛋白酶，并且将试管架置于水浴中，于所需的温度和时间。当液化后处理完成时，将所述试管快速冷却并且贮藏在冰上。在发酵之前将试管使用H2SO4(约140microL的20％H2SO4)调节至pH 5。
SSF：发酵按照(as)SSF进行，于32℃、65小时、0.054-％w/w DS葡糖淀粉酶T、pH＝5，使用RED STARTM酵母。所有试验均进行四次重复并且在所述发酵中包含对照。通过下述监测发酵，称量单独的试管，并且记录测量的时间和日期。随后将该数据集用于计算每个试管相对于时间的重量损失。在发酵结束时，将试管取样用于糖和发酵产品的HPLC分析。结果示于图1至4(NE＝无酶)(Alc＝蛋白酶ALC)。
结论：
发现蛋白酶的添加对乙醇的收率、甘油产生和残基葡萄糖水平具有显著的正面影响。该结果显示蛋白酶处理液化后玉米醪的显著较高的乙醇收率；显著较低的甘油/乙醇关系；和显著较低的残基葡萄糖浓度。
使用液化后玉米醪的SSF发酵在显著较少的时间内达到标准SSF对照即无液化后的收率。
实施例2
同时液化和蛋白质降解
为了研究同时进行淀粉液化和蛋白质降解的效果，在分别于67.5℃和70℃液化期间，分别添加α-淀粉酶A和蛋白酶ALC和肽酶A。
液化：将玉米粉与水混合以获得34.10wt.％的DS部分。将pH调节至5.6并且取样用于DS测定。将5g这种玉米浆转移至15mL试管，在所述玉米浆达到指定的液化温度67.5℃和70℃后液化后分别使用α-淀粉酶A和蛋白酶ACL和肽酶A分别液化1小时。
SSF发酵：将葡糖淀粉酶T在液化之后添加至所有试管。发酵作为SSF使用RED STARTM酵母，于32℃进行70小时。以大约1x107细胞/mL添加酵母。所有处理进行8次重复，并且将未液化的玉米浆对照包含于所述发酵中。通过称量单独的试管，并且记录测量的时间和日期来监测发酵。在发酵结束时，将试管取样用于糖和发酵产品的HPLC分析。评估的主要参数是乙醇和甘油。
表1.实验进行概览(DS＝干固体；EP＝酶蛋白)
处理 AGU/g DS NU/g DS mg EP/g DS mg EP/g DS
葡糖淀粉酶T 0.5 50
α-淀粉酶A 0.5 50
蛋白酶ALC 0.5 50 0.02
肽酶A 0.5 50 0.02
试验结果示于图5-9。
乙醇：
图5和6显示分别使用蛋白酶ALC和肽酶A同时液化和蛋白质降解与盲试(无蛋白酶)相比具有较高的重量损失。
乙醇产率在24、48和70小时之后测定。
表2.24和48小时发酵之后的HPLC乙醇结果
24和48小时之后的HPLC结果显示，分别在67.5℃和70℃的同时液化和蛋白质降解改进乙醇的收率。
该结果说明，当进行同时液化和蛋白质降解时，增加的乙醇收率在70小时发酵后获得(参见图7)(NoP＝无蛋白酶；Pro Alc＝蛋白酶ALC；PEP A＝肽酶A)。同时液化和蛋白质降解之后的乙醇收率，在70℃时高于在67.5℃时。
甘油
该结果说明当进行同时液化和蛋白质降解时，降低的甘油水平在70小时发酵之后获得(参见图8)(NoP＝无蛋白酶；Pro Alc＝蛋白酶ALC；PEP A＝肽酶A)。
甘油/乙醇
该结果说明当进行同时液化和蛋白质降解时，改进的甘油/乙醇比率在70小时发酵之后获得(图9)(NoP＝无蛋白酶；Pro Alc＝蛋白酶ALC；PEP A＝肽酶A)。

Claims (10)

1.从含淀粉材料生产发酵产品的方法，包含：
(a)用α-淀粉酶液化所述含淀粉材料；
(b)用蛋白酶处理；
(c)在糖源产生酶存在下糖化；
(d)在发酵生物存在下发酵。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)和(b)同时或相继地进行。
3.权利要求2的方法，其中在步骤(b)用蛋白酶处理液化醪。
4.权利要求1-3中任一项的方法，进一步包含步骤：
(e)蒸馏以获得发酵产品。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述发酵产品是乙醇。
6.权利要求1的方法，其中步骤(a)使用细菌α-淀粉酶或真菌α-淀粉酶进行。
7.权利要求6的方法，其中所述细菌α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体，所述变体具有突变：R179*和G180*或I181*+G182*，特别是I181*+G182*+N193F。
8.权利要求6或7的方法，其中所述细菌α-淀粉酶以0.0005-5KNU每g DS之间的量使用，优选0.001-1KNU每g DS，例如大约0.050KNU每g DS。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述液化期间的pH为大约4.5-7，优选5-6，优选大约5.4或5.6。
10.权利要求1-9中的方法，在步骤(a)之前，进一步包含步骤：
i)碾磨含淀粉材料；
ii)形成包含碾磨的含淀粉材料和水的浆。
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