CN101313076B - 发酵产生有机化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵生产至少一种有机化合物的方法，所述有机化合物具有至少3个C原子或具有至少2个C原子和至少1个N原子，所述方法包括下面的步骤：i)碾磨淀粉原料，从而得到碾磨产物，其包含淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分；ii)将碾磨产物以这样的量悬浮在水性液体中使得得到的悬浮液中干物质含量为按重量计至少45％，iii)通过液化，和如果合适，通过随后的糖化作用水解碾磨产物中的淀粉组分，从而得到水性培养基M，该水性培养基M包含淀粉原料的水解的淀粉组分和淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分；和iv)在发酵中使用步骤iii)中得到的水性培养基M培养能够过量产生所述有机化合物的微生物；其中，在步骤iii)中，通过向步骤ii)中得到的悬浮液中导入蒸汽将所述悬浮液在高于碾磨产物中存在的淀粉的胶化温度的温度下加热。

Description

发酵产生有机化合物
本发明涉及使用含糖的培养基培养微生物来发酵产生有机化合物，所述有机化合物具有至少3个C原子或具有至少两个C原子和至少一个N原子，所述培养基包含淀粉原料(feedstock)的至少部分非淀粉固体组分。
含糖的液体培养基是用于多种发酵过程的一种基本营养源；存在于培养基中的糖成分被使用的微生物代谢，得到有价值的有机产物。这样制备的微生物代谢产物(即有机化合物)的范围包括例如低分子量挥发性化合物如乙醇，非挥发性代谢产物如氨基酸、维生素和类胡萝卜素，以及多种其它物质。
根据多种过程的条件，这类通常已知的微生物发酵过程利用不同的碳原料。它们从经由甜菜和甘蔗糖蜜的纯净蔗糖扩展到已知的优质(high-test)糖蜜(转化的甘蔗糖蜜)到来自淀粉水解产生的葡萄糖。另外，乙酸和乙醇作为协同底物被提及，其能够以工业规模用于L-赖氨酸的生物技术生产(Pfefferle等，BiotechnologicalManufactureofLysine，AdvancesinBiochemicalEngineering/Biotechnology，Vol.79(2003)，59-112)。
根据上述的碳原料，建立了多种方法和步骤用于微生物代谢产物的基于糖的发酵生产。以L-赖氨酸为例，关于菌株开发、方法开发和工业生产的方法例如由Pfefferle等(上述引文中)描述。
用于微生物介导发酵生产微生物代谢产物的一种重要碳原料是淀粉。淀粉首先必须在前面的反应步骤中被液化和糖化，然后其可以作为发酵中的碳原料被利用。为此，通常从天然淀粉原料如马铃薯、木薯、谷物(例如小麦、玉米、大麦、黑麦、黑小麦或稻)中以预纯化的形式获得淀粉，随后将其用酶液化并糖化，随后其用于实际发酵中来产生目的代谢产物。
除了这类预纯化的淀粉原料的用途以外，还描述了未预处理的淀粉原料用于制备碳原料的用途，所述碳原料用于发酵产生微生物代谢产物。通常，最初通过磨碎将淀粉原料粉碎。然后将碾磨产物(millbase)进行液化和糖化。因为该碾磨产物除淀粉外天然地含有一系列非淀粉组分，所述非淀粉组分可不利地影响发酵，所以通常在发酵前去除这些组分。去除可以在磨碎后直接进行(WO02/077252；JP2001-072701；JP56-169594；CN1218111)、在液化后进行(WO02/077252；CN1173541)或在糖化后进行(CN1266102；Beukema等：Productionoffermentationsyrupsbyenzymatichydrolysisofpotatoes；potatosaccharificationtogiveculturemedium(ConferenceAbstract)，Symp.Biotechnol.Res.Neth.(1983)，6；NL8302229)。然而，所有的变型涉及在发酵中使用基本纯的淀粉水解产物。
发酵产生有机化合物的新方法尤其包括在发酵前纯化淀粉原料，例如经液化和糖化的淀粉溶液的纯化(JP57159500)；或提供旨在使得可能从可再生资源制备发酵培养基的方法(EP1205557)。
相反，未加工的淀粉原料已知被大规模地用于发酵生产生物乙醇。此处淀粉原料(通常为完整的谷粒)首先进行干磨，随后使用酶将淀粉原料的淀粉组分水解。此处水解可以分批进行(例如在搅拌容器中)或连续进行(例如在蒸汽加压锅(jetcooker)中)。合适过程的描述可例如见于″TheAlcoholTextbook-Areferenceforthebeverage，fuelandindustrialalcoholindustries″，Jaques等(Ed.)，NottinghamUniv.Press1995，ISBN1-8977676-735，Chapter2，pp.7to23，和McAloon等，″Determiningthecostofproducingethanolfromcornstarchandlignocellulosicfeedstocks″，NREL/TP-580-28893，NationalRenewableEnergyLaboratory，October2000中。
因为在生物乙醇的发酵生产中，价值产物通过蒸馏获得，所以使用来自干磨过程的非预纯化形式的淀粉原料不构成严重的问题。然而，当使用干磨法用于生产其它微生物代谢产物时，通过糖溶液被引入发酵中的固体流是有问题的，因为其不仅可对发酵具有例如关于氧转移速率或使用的微生物的需氧量(在该语境中参阅Mersmann，A.等：SelectionandDesignofAerobicBioreactors，Chem.Eng.Technol.13(1990)，357-370)的不良作用，而且也可以可观地将随后的加工复杂化。
另外，作为引入固体的结果，甚至制备含淀粉的悬浮液时悬浮液的粘度可达到临界值，因为例如含有多于30％重量玉米粉的悬浮液在水中不再是可均相混溶的(IndustrialEnzymology，第2版，T.Godfrey，S.West，1996)。这限制了传统步骤中的葡萄糖浓度。就生物酒精的发酵生产而言这不再有关，因为产物对用于发酵的酵母的毒性导致在任何情况下不能以有意义的方式转化更高的浓度。
用低糖浓度补充含糖的发酵培养基原则上在除乙醇外的有机代谢产物的发酵生产中是不利的，因为该步骤导致发酵液不成比例的稀释，并因而导致可达到的目的产物最终浓度被降低，当这些产物得自发酵培养基中时，这首先导致提高的成本和其次空间时间产率(space-timeyield)降低。这些考虑是重要的，特别是在淀粉水解产物旨在被部分地添加至较低体积的次级发酵中用于生产其它化学品的情况下，所述淀粉水解产物被生产用于大体积生物乙醇生产并传统地具有按重量计最多约30％或33％的低糖或葡萄糖浓度。
由于这些困难和限制，干磨法因为已经被广泛用于生产生物乙醇而至今保留在发酵生产除乙醇以外的微生物代谢产物中，但不具有特别的经济学重要性。
迄今为止，仅描述了使用木薯作为淀粉原料，将干磨法概念和原则上与该方法有关而存在的优点应用于工业规模生产微生物代谢产物的尝试。因此，JP2001/275693描述了用于发酵生产氨基酸的一种方法，其中在干燥状态下被磨碎的去皮木薯块茎被用作淀粉原料。为了进行该过程，必须将碾磨产物的颗粒尺寸调节至≤150μm。在用于该目的的过滤步骤中，在将获得的淀粉液化/糖化和随后发酵之前去除使用的一部分碾磨产物，所述部分包括不含淀粉的组分。在该过程中，获得中等的糖浓度。类似的过程描述于JP2001/309751中，用于生产含氨基酸的饲料添加剂。
用于发酵的液体培养基中提高的糖浓度可以通过使用下述碾磨产物来达成，所述碾磨产物主要包含淀粉原料的固体的、非淀粉的组分，用于通过申请公司的WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)中所述方法糖化。令人惊奇的是，显示存在于淀粉原料中的固体的、非淀粉的组分不需要在发酵前被去除。使用在谷粒中选择淀粉原料的一种类似方法描述于申请公司的PCT/EP2006/066057(较早的专利申请DE102005042541.0)中。然而，该方法对于连续提供具有高糖浓度的含糖培养基而言相对复杂。
提供用于发酵产生有机化合物的另一方法是本发明的一个目的，所述方法不要求之前去除存在于淀粉原料中的非淀粉固体组分，至少不要求完全去除。特别地，该方法应当使得可能连续水解淀粉原料的淀粉组分。另外，其特征在于容易操作所使用的培养基和它们在发酵过程中没有问题的用途。特别地，该过程将允许使用谷物作为淀粉原料。
令人惊奇地，已经发现当发酵所需的糖以水性培养基形式提供时，可以有效地进行有机化合物生产的发酵方法，尽管内在产生大量的固体，所述水性培养基可以如下得到：
i)碾磨淀粉原料，从而得到碾磨产物(millbase)，其包含淀粉原料的至少部分的非淀粉固体组分；
ii)将碾磨产物以这样的量悬浮在水性液体中使得得到的悬浮液中干物质含量为按重量计至少45％，
iii)通过液化水解碾磨产物中的淀粉组分，和如果合适，随后进行糖化作用，从而得到水性培养基M，其包含淀粉原料的水解的淀粉组分和淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分，其中水解包括通过将蒸汽导入悬浮液中至高于碾磨产物中存在的淀粉的胶化温度的温度来加热碾磨产物的悬浮液。
本发明从而提供了发酵生产具有至少3个C原子或者具有至少2个C原子和至少1个N原子的至少一种有机化合物的方法，其除了包括步骤i)和ii)之外，还包括以下步骤：
iii)通过液化水解碾磨产物中的淀粉组分，和如果合适，随后进行糖化作用，从而得到水性培养基M，其包含淀粉原料的水解的淀粉组分和淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分；和
iv)在发酵中使用步骤iii)中得到的水性培养基M培养能够过量产生所述有机化合物的微生物；
其中在步骤iii)中，通过向步骤ii)中得到的悬浮液中导入蒸汽，在高于碾磨产物中存在的淀粉的胶化温度的温度下加热。
尽管用于水解的悬浮液中存在高的干物质含量，但是以根据本发明的方式可以进行水解而不存在问题，并且因此，得到高浓度的可代谢的糖。令人惊奇地，水解后糖是以单糖、二糖或寡糖(＝糊精)的形式存在都不是重要的。令人惊奇地，所得的培养基中淀粉原料的高含量的固体的非淀粉组分不干扰发酵。此外，由于根据本发明的方法，在以较高碾磨产物浓度液化淀粉原料时可以发生的粘性问题在很大程度上被避免。由于发酵培养基中高浓度的可代谢的糖(其是高干物质含量的结果)，该培养基可以尤其有利地用于发酵的进料期，从而很大程度上避免或者至少显著减小了所希望的稀释度。自然地，根据本发明可以得到的培养基M适于作为发酵的分批相中的糖源。
在这里和下文中，术语“糖组分”和“淀粉组分”以同义使用。
关于步骤iii)中得到的水性培养基M，术语“水性培养基”、“液体培养基”和“水性含糖液体”以同义使用。
这里和下文中，术语“液化”指淀粉的水解降解以得到寡糖，尤其糊精。
这里和下文中，术语“糖化作用”或“糖化”指水解糊精得到单糖，尤其得到单糖，如葡萄糖，结果，“糖化酶”应理解为表示将糊精水解为单糖的酶。
此处和下文中，术语“糊精”表示作为淀粉水解降解的结果获得的寡糖，该寡糖通常由3到18个(特别是6到12个)单糖单元(特别是葡萄糖单元)组成。
术语“葡萄糖当量含量”和“糖浓度”是指发酵可能使用的培养基中单糖、二糖和寡糖的总浓度。术语“葡萄糖当量”也包括除葡萄糖外的可代谢糖或糖单元。
此处和下文中，术语“过量产生”用于表示微生物，以鉴定其以下述量产生一种或多种其代谢产物的特征，所述量超过了微生物繁殖所需的量，导致在发酵培养基中蓄积，所述蓄积能够在细胞外或细胞内发生。
适合用作碾磨的淀粉原料的主要是干谷物或种子，其中干燥状态下淀粉总计为按重量计至少40％，优选按重量计至少50％。它们存在于目前大规模种植的许多谷类植物(例如玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、黑小麦、稻)中和甜菜、马铃薯、木薯和多种高粱和黍(millet)物种，例如甜高粱(sorgo)和买罗高粱(milo)。淀粉原料优选选自谷类，特别优选玉米、黑麦、黑小麦和小麦仁。原则上，根据本发明的方法也可以用类似的淀粉原料进行，所述淀粉原料例如多种含淀粉谷类或种子的混合物。
为了制备含糖的液体培养基，将所述淀粉原料在步骤i)中碾磨，期间添加或不添加液体例如水，优选不添加液体。也可能将干磨与随后的湿磨步骤结合。
通常用于干磨的设备为锤磨机(hammermill)、转子磨(rotormill)或滚筒式磨(rollermill)；适用于湿磨的是桨式混合机(paddlemixer)、搅拌式球磨机(agitatedballmill)、环流磨(circulationmill)、盘式磨(diskmill)、annularchambermill、振动磨(oscillatorymill)或行星式磨(planetarymill)。原则上，其它磨也是合适的。湿磨法需要的液体量可以由技术人员在常规实验中确定。通常如下调节：干物质含量按重量计在从10％到20％的范围内。
碾磨得到了适用于随后方法步骤的颗粒尺寸。在本文语境中，已经证明当碾磨步骤(特别是干磨步骤)中、步骤i)中获得的碾磨产物以按重量计从30％到100％、优选按重量计从40％到95％、特别优选按重量计50％到90％的量含有下述粉末颗粒(即微粒组分)时是有利的，所述粉末颗粒具有从100μm到630μm范围内的颗粒尺寸。优选获得的碾磨产物按重量计包含50％的粉末颗粒，所述粉末颗粒具有大于100μm的颗粒尺寸。通常按重量计至少95％的磨碎的粉末颗粒具有少于2mm的颗粒尺寸。在本文上下文中，借助于使用振动分析仪的筛选分析测量颗粒尺寸。通常，小的颗粒尺寸对于获得高产物产率是有利的。然而，过分小的颗粒尺寸可导致问题，特别是当碾磨产物在液化或加工期间被调成浆时(例如在发酵步骤后干燥固体时)由凝块形成/团聚引起的问题。
通常，粉末由出粉率(extractionrate)或粉末级别表征，它们彼此之间的关系是粉末级别特征随着提高的出粉率而提高。出粉率对应于以按重量计每100份使用的碾磨产物为基础获得的按重量计的粉末量。当在碾磨过程中最初用进一步的碾磨(即以提高的出粉率)获得纯净的、超细的粉末(例如来自谷物仁内部)时，粉末中的粗纤维和外壳含量提高，淀粉含量下降。因此出粉率也反映在已知的粉末级别中，其用作分级粉末(特别是谷粉)的特征，并以粉末的灰分含量(ashcontent)为基础(已知为灰分标尺(ashscale))。粉末级别或类型编号指出100g粉末固体焚烧后残余的以mg计的灰分(矿物)量。在谷粉的情况下，更高的类型编号表示更高的出粉率，因为谷物仁的核心包含按重量计约0.4％的灰分，而外壳包含按重量计约5％的灰分。因此在更低出粉率的情况下，谷粉主要由粉碎的胚乳(即谷物仁中的淀粉含量)组成；在更高出粉率的情况下，谷粉也包含粉碎的、含蛋白质的谷粒糊粉层；在粗粉的情况下，它们也包含胚(其含有蛋白质并含有脂肪)和种壳(其含有粗纤维和灰分)的组分。就本发明的目的而言，原则上优选具有高出粉率或高类型编号的粉末。如果使用谷类作为淀粉原料，优选将完整的仁与它们的壳一起碾磨并进一步加工，如果适当的话在机械去除胚和壳之后。
根据本发明，使用的碾磨产物对应于出粉率包含至少一部分、优选按重量计至少20％、尤其是按重量计至少50％、特别是按重量计至少90％和非常特别是按重量计至少99％的存在于碾碎的谷物仁中的非淀粉固体组分。根据碾磨产物的淀粉组分(从而根据培养基M)中可代谢糖的量)，碾磨产物中的非淀粉固体组分优选总计为按重量计至少10％、尤其是按重量计至少15％、例如按重量计从15％到75％，特别是按重量计在从20％到60％的范围内。
随后步骤ii)中的碾磨产物与水性液体(例如新鲜的水、例如来自随后发酵的再循环过程的水)混合，或与这些液体的混合物混合，产生水性悬浮液。该步骤也通常称作浆化。
通常，这种量的淀粉原料或者碾磨产物将与水性液体混合，所得的悬浮液的干物质含量按重量计为至少45％，通常按重量计至少50％，尤其按重量计至少55％，特别按重量计至少60％，例如，按重量计45到80％，优选按重量计50到75％，尤其按重量计55到70％，特别按重量计60到70％。
原则上，可能将用于悬浮固体碾磨产物的水性液体预热到适度升高的温度，例如，40到70℃。优选以这样的方式选择液体的温度使得所得的悬浮液具有低于胶化温度的温度，优选低于淀粉胶化温度至少5K。优选地，悬浮液的温度将不超过60℃，尤其55℃。
将颗粒碾磨产物悬浮在水性液体中可以在常用于该目的的装置中分批完成或者连续完成，例如，在搅拌混合器中分批完成或者在用于混合固体与液体的连续操作的混合设备，例如在通过转子/定子原理操作的混合器中完成。
为了进行水解，首先将包含碾磨产物的水性悬浮液通过导入蒸汽加热到高于淀粉原料或碾磨产物中存在的淀粉的胶化温度。该目的的特定淀粉所需的温度是本领域技术人员已知的(见“TheAlcoholTextbook-Areferenceforthebeverage，fuelandindustrialalcoholindustries”，第2章第11页，其已经在开头提出)或可以通过技术人员熟悉的惯常实验确定。通常悬浮液会被加热至比所述胶化温度高至少10K、尤其是至少20K、例如10到100K、尤其是20到80K的温度。尤其是将悬浮液加热至从90℃到150℃的范围内、特别是从100℃到140℃的范围内。
用于加热悬浮液的蒸汽通常是具有至少105℃、尤其是至少110℃、例如110℃到210℃温度的预热蒸汽。该蒸汽优选在超大气压(superatmosphericpressure)下被引入。因此，该蒸汽优选具有至少1.5巴、例如1.5巴到16巴、尤其是2巴到12巴的压强。
通常如下将蒸汽引入悬浮液中：优选以高速度将蒸汽在超大气压下引入悬浮液中，优选1到10或11巴、尤其是1.5到5巴的超大气压。引入蒸汽的结果是悬浮液被瞬间加热至高于90℃的温度，即高于胶化温度的温度。
用蒸汽加热优选在装有悬浮液的连续操作的设备中以特定的补料压强连续进行，所述补料压强是由悬浮液粘度、补料速率和设备的几何形状引起的，并在悬浮液负荷区中通过可调节的喷嘴在提高的压强下根据补料压强补充热蒸汽。在提高的压强下补充蒸汽表示不仅加热悬浮液，而且向体系中引入机械能，并且该机械能促进碾磨产物颗粒的进一步粉碎，导致特别均一的能量供应，并从而导致碾磨产物中颗粒状淀粉颗粒的特别均一的凝胶化。这些设备通常具有管状的几何形状。优选蒸汽沿管状设备的纵轴补充。通常，悬浮液以至少45°的角度或以直角提供。可调节喷嘴通常具有圆锥形的几何形状，该圆锥在蒸汽的流动方向逐渐变细。在该喷嘴中安置了针或安置于纵向可移动杆上的椎体(nappe)。针或椎体与喷嘴的圆锥一起形成孔。通过纵向移动针或杆，可以以简单的方式调节孔的大小并从而调节喷嘴末端的横断面积，藉此可以以简单的方式控制提供蒸汽的速度。
这些设备通常也装备有混合管，在提供蒸汽后悬浮液被运入其中并在该管中离开设备。该混合管通常沿着蒸汽提供方向并与补料垂直设置。混合管和喷嘴一起通常形成孔，悬浮液通过该孔运输。作为该孔的结果，在运输过程中额外的剪切力作用于悬浮液并从而提高对悬浮液的机械能供应。混合管可以以可纵向移置的方式安置。移动混合管是调节孔的尺寸从而调节设备压差(pressuredrop)的简单途径。
现有技术中这类设备已知称作蒸汽加压锅，例如″TheAlcoholTextbook″第2章(上述引文中)的图13中所示的设备是可商业获得的，例如来自HydroThermalCorp.WaukeshaWI，USA的名称HYDROHEATER。
当反应连续进行时，用蒸汽处理的悬浮液通常随后被转移进入“反应后区域”(after-reactionzone)中以继续淀粉组分的胶凝。通常，在反应后区域中主要为超大气压(通常是在2到8巴范围内的绝对压强)。反应后区域中的温度通常在90℃到150℃的范围内。该反应后区域中的滞留时间可以在1分钟到4小时的范围内，取决于悬浮液的温度。反应后区域通常具有管状或柱状的几何形状。在一个实施方案中，反应后区域具有垂直安置的柱的几何形状。此处悬浮液一旦离开蒸汽处理设备便被施加于柱的上部区域，并在下部区域离开。在本发明的另一实施方案中，反应后区域具有管状的几何形状。
悬浮液离开反应后区域后，压强通常被释放，并随后进行液化。压强的释放优选以闪蒸的形式进行，从而将悬浮液冷却至(优选)低于100℃、尤其是低于85℃的温度。通常，然后在独立的反应容器中将被这样崩解的淀粉液化。液化可以如上文所述进行。
可以以常规方式进行液化。通常，在至少一种淀粉液化酶的存在下完成步骤ii)中的液化，所述酶通常选自α-淀粉酶。也可以使用在反应条件下液化活性的和稳定淀粉的其他酶。
为了液化碾磨产物中的淀粉部分，原则上可能使用所有淀粉液化酶，尤其α-淀粉酶(酶类别EC3.2.1.1)，例如，从地衣芽孢杆菌(Bacilluslichenformis)或Bacillusstaerothermophilus得到的α-淀粉酶，特别是用于液化在生物乙醇生产范围内通过干磨方法得到的物质的那些酶。优选的酶是温度稳定的，即它们甚至在高于胶化温度的温度下加热也不失去它们的酶活性。适于液化的α-淀粉酶也可以通过商业途径得到，例如，从Novozymes以名称Termamyl120L，L型得到，或者从Genencor以名称Spezyme得到。还可能使用不同α-淀粉酶的组合进行液化。
有利地，以这样的方式选择淀粉液化酶，尤其α-淀粉酶的量，使得实现淀粉快速和完全降解成寡糖。基于使用的淀粉原料的总量，淀粉液化酶，尤其α-淀粉酶的总量通常为按重量计0.002到3.0％，尤其按重量计0.01到1.5％，特别优选按重量计0.02到0.5％。可以将α-淀粉酶(或者使用的淀粉液化酶)最初导入反应容器中或者在液化步骤期间加入。
对于α-淀粉酶(或者使用的淀粉液化酶)的最佳活性，步骤ii)优选在液化酶的最适pH内的pH值进行至少一定时间，所述pH值通常是在弱酸性范围内的pH值，优选4.0到7.0，特别优选5.0到6.5，其中通常在步骤ii)之前或开始时调节pH；优选在液化期间检查该pH并且如果合适，重新调节pH。优选使用稀的无机酸如H2SO4、H3PO4，或者稀的碱性氢氧化物溶液，如NaOH或KOH调节pH。
为了稳定使用的酶，如果适当的话可以例如使用CaCl2将Ca2+离子的浓度调节为酶特异的最佳值。合适的浓度值可以由技术人员在常规实验中确定。如果例如使用Termamyl作为α-淀粉酶，则将液体培养基中的Ca2+离子浓度调节至例如10到100ppm、优选20到80ppm和特别优选约30到70ppm是有利的，单位ppm是以重量为基础的并表示g/1000kg。
为了将淀粉完全降解为糊精，将反应混合物保持在设定温度下，直到通过碘或适当时通过检测淀粉的另一测试的淀粉检测是阴性的或至少基本上是阴性的。如果适当的话，这时可以向反应混合物中添加一个或多个其它α-淀粉酶部分，例如以使用的淀粉原料总量为基础按重量计从0.001％到0.5％、优选按重量计从0.002％到0.2％的范围内。
在本发明的优选实施方案中，在蒸汽加热过程之前，向水性液体中的碾磨产物悬浮液加入至少一些或全部、通常至少50％，尤其至少80％或者所有的淀粉液化酶。以这种方式，液化过程已经发生，而将混合物加热到高于胶化温度的温度。适宜地用进行蒸汽加热，和之后的反应期。可以免除随后在单独的反应容器中的液化步骤。然而，将进行这种液化步骤以将淀粉完全降解为糊精。
这得到水性淀粉水解产物，其包含来自碾磨产物的液化淀粉部分，通常为糊精，并且如果合适，还包含寡糖和单糖或二糖，和碾磨产物的非淀粉组分，尤其用于液化的碾磨产物的固体的非淀粉组分。
可以将该水解产物直接送入发酵以作为水性培养基M制备有机化合物。然而，通常，将进行糖化作用。可以与现有技术的已知的糖化方法类似地进行糖化作用。
可以连续地或分批进行糖化作用。为此，通常在特定糖化罐中完全糖化液化的培养基，然后送入例如随后的发酵步骤。为此，液化后得到的水性产物将通常用引起糖化作用的酶、通常葡糖淀粉酶在常用于该目的的条件下处理。
为了糖化糊精(即，寡糖)，原则上可以使用所有葡糖淀粉酶(酶类别EC3.2.1.3)，尤其从曲霉属得到的葡糖淀粉酶，特别是用于糖化通过与生物乙醇的生产有关的干磨法得到的物质的那些葡糖淀粉酶。适于糖化的葡糖淀粉酶也可以通过商业途径得到，如从Novozymes以名称DextrozymeGA；或从Genencor以名称Optidex得到。也可以使用不同的葡糖淀粉酶的组合。
将糖化酶加入到液化后得到的含糊精的水解产物中，所述糖化酶的量基于使用的淀粉原料总量为按重量计通常为0.001到5.0％，优选按重量计0.005到3.0％，特别优选按重量计0.01到1.0％。
通常，在糖化酶的最适温度范围内或者稍低的温度下，如在50到70℃，优选60到65℃下进行糖化作用。优选首先使水性液化产物的温度达到这些温度并随后用引起糖化作用的酶处理。有利地在加入糖化酶如葡糖淀粉酶之前调节液体水解产物的pH到所用酶的最佳活性范围内的值，优选3.5到6.0之间；特别优选4.0到5.5之间，非常特别优选4.0到5.0之间。
加入糖化酶后，优选将含有糊精的悬浮液保持在设定的温度下一段时间，例如2到72小时或更长时间，如果需要，尤其5到48小时，在该时间内糊精被糖化得到单糖。技术人员可以使用已知方法，例如，HPLC、酶测定法或者葡萄糖试纸监测糖化过程的进展。当单糖浓度基本上不再升高或者再次下降时结束糖化作用。
因为将碾磨产物用于制备含糖的液体培养基(1)，所述碾磨培养基基本上包含淀粉原料的所有成分或者至少除了淀粉外还包括一些固体非淀粉组分(即，淀粉原料的非淀粉固体组分没有被完全除去)，所以液化和任选糖化后得到的液体水解产物也包含淀粉原料的一些或者全部量的非淀粉固体组分。这通常引起导入一定量的肌醇六磷酸，例如，来自谷类的肌醇六磷酸，该量不应该被忽视。为了避免这样产生的抑制效应，有利的是在向水解产物中加入一种或多种肌醇六磷酸酶，然后将水解产物进行发酵步骤。如果肌醇六磷酸酶对于各自的高温足够稳定，那么肌醇六磷酸酶可以在液化之前、期间或者之后加入。可以使用任何肌醇六磷酸酶，只要在反应条件下它们的活性在每种情况下至多受到可忽略的影响。使用的肌醇六磷酸酶优选具有＞50℃，特别优选＞60℃的热稳定性(T50)。肌醇六磷酸酶的量通常为1到10000单位/kg淀粉原料，尤其10到4000单位/kg淀粉原料。
为了增加总的糖产量，或者得到游离氨基酸，可以在液化期间或者糖化作用期间加入其他酶，如支链淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶或蛋白酶。这些酶的加入对粘性具有积极作用，即降低粘性(例如，通过切割长链(也称作较长链)葡聚糖和/或(阿拉伯)木聚糖)，并导致释放可代谢的葡糖苷和释放(残留的)淀粉。蛋白酶的使用具有类似的积极作用，还可能的是释放作为发酵的生长因子的氨基酸。
在本发明的另一实施方案中，在发酵前将不进行或者进行仅仅部分的糖化作用。在该情况中，在发酵期间至少部分，即原位完成糖化作用。例如，可以按照这样的程序，其中液体培养基中存在的部分糊精，例如，基于糊精(或者最初淀粉)的总重量按重量计10到90％，尤其按重量计20到80％的糊精被糖化并且在发酵中使用所得的含糖培养基。然后可以在发酵培养基中原位实现进一步的糖化作用。此外，可以在发酵罐中直接进行糖化作用，免除了单独的糖化罐。
可以加入如上述的糖化酶或者不存在此类酶的情况下完成原位糖化。因为许多微生物自身能够代谢寡糖。在这种情况下，糊精可以被微生物原样吸收或者在前面的糖化作用后被菌株内在的糖化酶代谢或水解，并且然后被代谢，所述糖化酶为例如菌株内在的葡糖淀粉酶。后一情况的尤其有利的方面是在发酵期间糖化速率，尤其葡萄糖释放速率自动地适应微生物的需要，首先通过生物量的量，其次通过菌株内在的糖化酶的表达水平来实现。
原位糖化的优点首先是成本支出减少；其次，葡萄糖的延迟释放可以(如果合适)允许更高的葡萄糖浓度导入批次而在使用的微生物中不发生抑制或者代谢改变。在大肠杆菌中，例如，过度的高葡萄糖浓度导致形成有机酸(乙酸)，而在这种情况中，酿酒酵母转向例如发酵，尽管在充氧的发酵罐中存在足够的氧(Crabtree效应)。通过控制葡糖淀粉酶浓度可以调节葡萄糖的延迟释放。这使得可能抑制上述效应，并且可以在最初导入更多的底物，使得所提供的饲料流引起的稀释度可以被降低。
已经进行的液化和(如果合适)糖化后得到的水性水解产物，即培养基M通常具有按重量计至少45％，通常按重量计至少50％，尤其按重量计至少55％，特别按重量计至少60％，例如，按重量计45到80％，尤其按重量计50到75％，尤其按重量计55到70％，和特别按重量计60到70％的干物质含量。因此，水解后得到的水性培养基M通常具有的糖含量基于培养基M的总重量为——作为葡萄糖当量计算-按重量计至少35％，通常按重量计至少40％，尤其按重量计至少45％，特别按重量计至少50％，例如，按重量计35到70％，优选按重量计40到65％，尤其按重量计45到60％，和特别按重量计50到60％。
取决于该方法是怎样进行的，所得培养基M中存在的葡萄糖当量以单糖或寡糖，尤其糊精的形式存在。主要组分通常为单糖，如己糖和戊糖，例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、山梨糖、木糖、阿拉伯糖和核糖，尤其葡萄糖或这些单糖的寡糖。以游离形式或者寡糖的组分形式存在于培养基M中的除了葡萄糖之外的单糖的量可以作为使用的淀粉原料和它包含的非淀粉组分的函数而变，并且可以受到所进行的方法的影响，例如，通过加入纤维素酶崩解纤维素成分。通常，培养基M的葡萄糖当量中游离或结合形式的葡萄糖部分基于葡萄糖当量的总量达到按重量计50到99％，尤其按重量计75到97％，特别按重量计80到95％。
步骤iii)中得到的水性培养基M根据本发明用于步骤iv)中用于发酵生产所希望的有机化合物。为此，将培养基M进行发酵，其中它用于培养发酵中使用的微生物。在该方法中得到各自的有机化合物作为挥发性或非挥发性微生物代谢产物。
通常，将含有糊精的培养基M冷却到发酵温度，通常32到37℃，然后将其提供给发酵。
如果合适，水性的含有糊精的培养基M可以在发酵前被灭菌，其中通常通过热或者化学方法破坏微生物。为此，通常在高于80℃的温度下加热水性培养基M。可以在临发酵前完成细胞的破坏或裂解。为此，将所有培养基M进行裂解或破坏过程。这可以例如，通过热或化学方法完成。然而，已经证明在根据本发明的方法范围内不必在发酵前进行如本文所述的灭菌步骤；相反，已经证明有利的是不进行这种灭菌步骤。因此，本发明的优选实施方案涉及一种方法，其中将步骤iii)中得到的培养基M直接提供给发酵，即不事先经历灭菌过程。
在发酵中，培养基中存在的糖被代谢。如果培养基中存在的糖以寡糖形式，特别糊精形式存在，那么它们被微生物原样吸收或者事先通过加入的或者菌株内在的糖化酶、尤其葡糖淀粉酶糖化后被吸收，并被代谢。如果不加入糖化酶并且培养基中存在的糖以寡糖形式，特别糊精形式存在，那么液化的淀粉组分的糖化与微生物对糖、尤其单糖葡萄糖的代谢平行地完成。
可以以技术人员已知的常规方式进行发酵。为此，通常在本文方法得到的液体培养基中培养所希望的微生物。
发酵方法可以分批或者补料分批(包括进料批与中间收获)进行，优选补料分批方法。
例如，通过本发明方法得到的培养基M或者常规糖原料，即可代谢的单糖、二糖和/或寡糖或者包含可代谢的单糖、二糖和/或寡糖的培养基如果合适，用水稀释并加入常规的培养基成分，如缓冲剂、营养盐、氮原料，如硫酸铵、尿素等等、包含氨基酸的复杂培养基成分，如酵母提取物、蛋白胨、CSL等等后，该微生物可以在发酵条件下增殖直到微生物浓度达到发酵所希望的稳定态。这里，发酵培养基中存在的糖被代谢并且形成所希望的代谢产物(也称作分批法或分批相)。
当进行补料分批方法时，例如，当总糖浓度下降到低于特定值时，将培养基M连续或分批加入到分批相后的发酵培养基中。
根据本发明方法的典型的实施方案是补料分批方法，其包括下面的步骤：
v)在水性发酵培养基F中培养能够过量产生所述有机化合物的微生物；和
vi)将培养基M加入发酵培养基F，其中培养基M中存在的水解的淀粉组分，即糖被过量产生所述有机化合物的微生物代谢，产生所述有机化合物。
在步骤v)中，可能例如首先将常规的含糖培养基，通常葡萄糖溶液调节到合适的糖浓度，通过将所述培养基用水性液体，尤其水稀释，并加入常规地用于发酵的培养基成分，如缓冲剂、营养盐、氮源，如硫酸铵、尿素等等、包含氨基酸的复杂培养基成分，如酵母提取物、蛋白胨、CSL等等进行所述调节。这里，将通常优选以这样的方式选择糖与液体的比例使得发酵培养基F中单糖的总浓度小于按重量计6％，例如，按重量计＞0到5％的范围内，所述浓度以葡萄糖当量计算并且基于发酵培养基F的总重量。以所希望的微生物接种所制备的含糖批培养基并在发酵条件下在批培养基(发酵培养基F)中增殖微生物，直到微生物浓度达到发酵所希望的稳定态。这里，导入发酵培养基F中的糖被代谢，并且形成所所希望的代谢产物。
根据步骤vi)，水性培养基M向发酵培养基F的加入保持发酵过程，并且微生物过量产生的代谢产物在发酵液中积累。喂饲的培养基M与最初导入并且包含所述微生物的批培养基(发酵培养基F)的体积比通常为约1∶10到10∶1的范围内，优选约1∶5到5∶1，特别1∶1到5∶1的范围内。尤其通过含糖液体培养基的喂饲速率控制发酵液中的糖含量。通常，将以这样的方式调节喂饲速率使得发酵液中单糖含量为按重量计＞0％到按重量计约5％的范围内，并且尤其不超过按重量计3％的值。
在优选实施方案中，步骤v)中的发酵培养基F(在本情况中即批培养基)基本上包含培养基M、能够过量产生所述有机化合物的微生物、营养盐、常规佐剂，如碱或缓冲液，和如果合适，用于稀释的水。为此，如果合适，培养基M将被稀释到所希望的糖浓度，例如，按重量计0.1到10％，其计算为葡萄糖当量并且基于培养基M的总重量，将它直接用于补足发酵培养基F(批培养基)。
用于保持发酵的根据步骤vi)的含糊精培养基的糖含量通常较高，例如，在上述范围内，以便使发酵培养基F的稀释度最小。
优选地，将按照这样的程序，其中制备水性培养基M，其具有较高的糖含量，例如，以葡萄糖当量计算并且基于水性培养基M的总重量，为按重量计至少40％，特别按重量计至少45％，非常特别按重量计至少50％。然后培养基M用水稀释后首先根据步骤v)用于补足批培养基(发酵培养基F)，然后根据步骤vi)用于加入到发酵培养基F中。
自然地，根据本发明，分批相和/或补料分批相中发酵中使用并且被代谢的多数糖来自培养基M，所述糖优选按重量计至少60％，尤其按重量计至少70％。在本发明的一个实施方案中，用于发酵并且将被代谢的部分糖，例如，按重量计1到50％、尤其按重量计5到40％、特别按重量计10到30％的糖来自常规的糖原料。常规的糖原料包括单糖和二糖，如葡萄糖和蔗糖，以及包含按重量计至少50％的可代谢的单糖、二糖和/或寡糖并且基本上没有不溶于水的固体的培养基，例如，葡萄糖糖浆、蔗糖糖浆、浓汁、麦芽糖糖浆、糊精糖浆，以及来自糖生产的废品(糖蜜)，尤其来自甜菜糖生产的糖蜜，以及来自甘蔗糖生产的糖蜜。
根据本发明的方法使得可能在发酵过程中产生挥发性和非挥发性、尤其非挥发性微生物代谢产物，该代谢产物具有至少3个C原子或至少2个C原子和1个N原子。
在该上下文中，非挥发性产物被理解为表示不进行分解时不能通过蒸馏从发酵液中回收的化合物。通常，这些化合物具有高于水沸点的沸点，在大气压下通常高于150℃，尤其高于200℃。通常，它们是在标准条件(298K，101.3kPa)下处于固态的化合物。
然而，也可能在用于产生不挥发微生物代谢产物的发酵中使用根据本发明的液体培养基M，所述代谢产物在大气压下具有低于水沸点的熔点和/或油性稠度(oilyconsistency)。
术语非挥发性微生物代谢产物尤其包括有机的单、二和三羧酸，其优选地具有3到10个碳原子，并且适当时附着有一个或多个(例如1、2、3或4个)羟基，例如酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羟基丙酸、延胡索酸、马来酸、2，5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、乌头酸和二氨基庚二酸、柠檬酸；产蛋白质的和不产蛋白质的氨基酸，例如赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸；嘌呤和嘧啶碱基；核苷和核苷酸，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和腺苷-5’-单磷酸(AMP)；脂类；优选具有10到22个碳原子的饱和和不饱和的脂肪酸，例如γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；优选具有3到8个碳原子的二元醇，例如丙二醇和丁二醇；具有3个或更多(例如3、4、5或6个)OH基团的多元醇(也称作具有较高官能度的醇)，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇；具有至少4个碳原子(例如4到22个碳原子)的长链(也称作较长链)醇，例如丁醇；糖类，例如透明质酸和海藻糖；芳香族化合物，例如芳香族胺、香草醛和靛蓝；维生素和维生素原，例如抗坏血酸、维生素B6、维生素B12和核黄素，辅因子和已知的营养药物；蛋白质如酶，例如淀粉酶，果胶酶，酸性、杂合或中性的纤维素酶，酯酶如脂肪酶，胰腺酶，蛋白酶，木聚糖酶和氧化还原酶如漆酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，葡聚糖酶，肌醇六磷酸酶；类胡萝卜素，例如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素和角黄素；优选具有3到10个碳原子和适当时1个或多个羟基基团的酮，例如丙酮和3-羟基丁酮；内酯，例如γ-丁内酯、环糊精、生物聚合物例如聚羟基乙酸酯、聚酯例如聚交酯、多糖、聚类异戊二烯、聚酰胺；和上述化合物的前体和衍生物。适合用作不挥发微生物代谢产物的其它化合物由Gutcho描述于ChemicalsbyFermentation，NoyesDataCorporation(1973)，ISBN：0818805086中。
术语“辅因子”包含正常酶活性发生所需的非蛋白质的化合物。这些化合物可以是有机的或无机的；优选本发明的辅因子分子是有机的。这类分子的实例是NAD和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)；这些辅因子的前体是烟酸。
术语“营养药”包含促进植物和动物、尤其是人健康的食品添加剂。这类分子的实例是维生素、抗氧化剂和某些脂类，例如多不饱合脂肪酸。
产生的代谢产物尤其选自酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个C原子的脂肪族单羧酸和二羧酸、具有3到10个C原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个C原子的酮、具有4到10个C原子的链烷醇和具有3到10个、尤其是3到8个C原子的链烷二醇(alkanediol)。
技术人员明白这样发酵产生的化合物在各情况下以使用的微生物产生的对映异构体形式获得(如果存在不同的对映异构体的话)。因此，在氨基酸的情况下通常获得各自的L-对映异构体。
发酵中使用的微生物以本身已知的方式取决于所述微生物代谢产物，如下文所详细描述的。它们可以是天然来源或经遗传修饰的。合适的微生物和发酵方法的实例为下文表A中给出的那些：
表A：
物质 微生物 参考文献
酒石酸 乳杆菌属(Lactobacill)I(例如德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)) Rehm，H.-J.：Biotechnology，Weinheim，VCH，1980 and 1993-1995；Gutcho，Chemicals by Fermentation，NoyesData Corporation(1973)，
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柠檬酸 黑曲霉(Aspergillusniger)、温特曲霉(Aspergilluswentii) Crit.Rev.Biotechnol.3，331-373(1986)；Food Biotechnol.7，221-234(1993)；10，13-27(1996).
乌头酸 黑曲霉(Aspergillusniger)、温特曲霉(Aspergilluswentii) Crit.Rev.Biotechnol.3，331-373(1986)；Food Biotechnol.7，221-234(1993)；10，13-27(1996).；Rehm，H.-J.：Biotechnology，Weinheim，VCH，1980 and 1993-1995；
苹果酸 曲霉(Aspergilli)，例如黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉、米曲霉，棒杆菌属 US 3063910
葡糖酸 曲霉，例如黑曲霉 Gutcho，Chemicals by Fermentation，NoyesData Corporation(1973)，
丁酸 梭状芽孢杆菌(例如Clostridiumacetobutlyicum，酪酸梭状芽孢杆菌 Rehm，H.-J.：Biotechnology，Weinheim，VCH，1980 and 1993-1995；
物质 微生物 参考文献
(C.butyricum))
乳酸 乳杆菌，例如德氏乳杆菌、L.leichmannii Rehm，H.-J.：Biotechnology，Weinheim，VCH，1980 and 1993-1995；
赖氨酸 谷氨酸棒杆菌 Ikeda，M.：Amino Acid Production Process(2003)，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79，1-35.
谷氨酸 谷氨酸棒杆菌 Ikeda，M.：Amino Acid Production Process(2003)，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79，1-35.
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苯丙氨酸 谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌 Trends Biotechnol.3，64-68(1985)；J.Ferment.Bioeng.70，253-260(1990).
苏氨酸 大肠杆菌 Ikeda，M.：Amino Acid Production Process(2003)，Adv.Biochem.Engin/Biotechnol 79，1-35.
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嘌呤和嘧啶碱基 枯草芽孢杆菌 Rehm，H.-J.：Biotechnology，Weinheim，VCH，1980 and 1993-1995；Gutcho，Chemicals by Fermentation，NoyesData Corporation(1973)，
物质 微生物 参考文献
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) 枯草芽孢杆菌 Rehm，H.-J.：Biotechnology，Weinheim，VCH，1980 and 1993-1995；Gutcho，Chemicals by Fermentation，NoyesData Corporation(1973)，
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γ-亚麻酸 毛霉、Mortiella、曲霉属 Gill，I.，Rao，V.：Polyunsaturated fatty acids，part 1：occurence，biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10)，401-409；Zhu，H.：Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University，31.10.2002(URN etd-1111102-205855).
二高-γ-亚麻酸 Mortiella、耳霉属(Conidiobolus)、水霉属(Saprolegniaspp.) Gill，I.，Rao，V.：Polyunsaturated fatty acids，part 1：occurence，biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10)，401-409；Zhu，H.：Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University，31.10.2002(URN etd-1111102-205855).
花生四烯酸 Mortiella、Phytium spp. Gill，I.，Rao，V.：Polyunsaturated fatty acids，part 1：occurence，biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10)，401-409；Zhu，H.：Utilization of Rice Brain by Pythium
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二十碳五烯酸 Mortiella、Phytium spp.、Rhodopseudomonas、水霉属 Gill，I.，Rao，V.：Polyunsaturated fatty acids，part 1：occurence，biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10)，401-409；Zhu，H.：Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University，31.10.2002(URN etd-1111102-205855).
二十二碳六烯酸 破囊壶菌(Thraustochytrium)、虫霉属(Entomophthora spp.)、Rhodopseudomonas、水霉属 Gill，I.，Rao，V.：Polyunsaturated fatty acids，part 1：occurence，biological activities andapplications(1997).Trends inBiotechnology 15(10)，401-409；Zhu，H.：Utilization of Rice Brain by Pythiumirregulare for Lipid Production.MasterThesis Lousiana State University，31.10.2002(URN etd-1111102-205855).
丙二醇 大肠杆菌 DE 3924423，US 440379，WO 9635799，US5164309
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在本发明优选的实施方案中，被产生的有机化合物选自任选地连接有羟基并具有3到10个碳原子的单羧酸、二羧酸和三羧酸、产蛋白质的和不产蛋白质的氨基酸、嘌呤碱基、嘧啶碱基；核苷、核苷酸、脂类；饱和和不饱和的脂肪酸；具有4到10个碳原子的二元醇、具有3个或更多羟基的多元醇、具有至少4个碳原子的长链醇、糖类、芳香族化合物、维生素、维生素原、辅因子、营养药、蛋白质、类胡萝卜素、具有3到10个碳原子的酮、内酯、生物聚合物和环糊精。
本发明第一个优选的实施方案涉及可以根据本发明获得的含糖液体培养基用于发酵产生酶的用途，所述酶是例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶或葡聚糖酶。
本发明第二个优选的实施方案涉及可以根据本发明获得的含糖液体培养基用于发酵产生氨基酸的用途，所述氨基酸是如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和谷氨酸。
本发明另一优选的实施方案涉及可以根据本发明获得的含糖液体培养基用于发酵产生维生素的用途，所述维生素是如泛酸和核黄素，及前体和衍生物。
本发明进一步优选的实施方案涉及使用可以根据本发明得到的含糖液体培养基发酵生产：
-具有3到10个碳原子的单、二和三羧酸，尤其脂肪族单、二和三羧酸，例如丙酸、延胡索酸和琥珀酸；
-具有3到10个C原子的脂肪族羟基羧酸，例如乳酸；
-如上所述的长链链烷醇，尤其是具有4到10个C原子的链烷醇，例如丁醇；
-如上所述的二元醇，尤其是具有3到10个、尤其是3到8个C原子的链烷二醇，例如丙二醇；
-如上所述的酮，尤其是具有3到10个C原子的酮，例如丙酮；和
-如上所述的糖类，尤其是二糖，如海藻糖。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是聚羟链烷酸，例如聚-3-羟基丁酸和与其它有机羟基羧酸的共聚多酯，所述其它有机羟基羧酸例如3-羟基戊酸、4-羟基丁酸和描述于Steinbüchel(上文所述)中的其它有机羟基羧酸，包括例如长链(也称作较长链)的羟基羧酸，如3-羟基辛酸、3-羟基癸酸和3-羟基十四烷酸及其混合物。为了进行发酵，可以使用已经例如在S.Y.Lee，PlasticBacteriaProgressandprospectsforpolyhydroxyalkanoateproductioninbacteria，Tibtech，Vol.14，(1996)，pp.431-438中描述用于其它碳原料的类似条件和步骤。
在优选的实施方案中，可用于发酵的微生物因此选自天然或重组的微生物，所述微生物过量产生至少一种以下的代谢产物：
-酶，例如肌醇六磷酸酶、木聚糖酶或葡聚糖酶；
-氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸；
-维生素，例如泛酸和核黄素；和它们的前体和/或衍生物；
-二糖，如海藻糖；
-具有3到10个碳原子的脂肪族单和二羧酸，例如丙酸、延胡索酸和琥珀酸；
-具有3到10个碳原子的脂肪酸羟基羧酸，例如乳酸；
-聚羟链烷酸，例如聚-3-羟基丁酸和3-羟基丁酸的共聚多酯；
-具有3到10个C原子的酮，例如丙酮；
-具有4到10个C原子的链烷醇，例如丁醇；和
-具有3到8个C原子的链烷二醇，例如丙二醇。
合适的微生物通常选自棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、阿舒囊霉属(Ashbya)、埃希氏菌属(Escherichia)、曲霉属(Aspergillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、放线杆菌属(Actinobacillus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、根霉属(Rhizopus)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，尤其是选自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)或广泛产碱菌(Alcaligeneslatus)、Anaerobiospirillumsucciniproducens、Actinobacillussuccinogenes、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrückii)、Lactobacillusleichmannii、阿拉伯糖丙酸杆菌(Propionibacteriumarabinosum)、Propionibacteriumschermanii、费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)、蚁酸乙酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、醋酪酸梭状芽孢杆菌、少根根霉(Rhizopusarrhizus)和米根霉(Rhizopusoryzae)。
在优选的实施方案中，发酵中使用的微生物是棒杆菌属的菌株，尤其是谷氨酸棒杆菌的菌株。过量产生氨基酸，特别是赖氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸的尤其是棒杆菌属的菌株，特别是谷氨酸棒杆菌的菌株。
在另一优选的实施方案中，发酵中使用的微生物是埃希氏菌属，尤其是大肠杆菌。其尤其是过量产生氨基酸(特别是赖氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸)的埃希氏菌属菌株，特别是大肠杆菌。
在特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是赖氨酸。为了进行发酵，可以使用已经针对其它碳原料描述的类似条件和步骤，例如在上文所述的Pfefferle等和US3,708,395中所描述。原则上，连续和不连续(分批或补料分批)的操作模式都是合适的，优选补料分批模式。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是甲硫氨酸。为了进行发酵，可使用针对其它碳原料描述的类似条件和步骤，例如WO03/087386和WO03/100072中所述。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是泛酸。为了进行发酵，可使用例如WO01/021772中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是核黄素。为了进行发酵，可使用例如WO01/011052、DE19840709、WO98/29539、EP1186664和Fujioka，K.：Newbiotechnologyforriboflavin(vitaminB2)andcharacterofthisriboflavin.FragranceJournal(2003)，31(3)，44-48中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是延胡索酸。为了进行发酵，可使用例如Rhodesetal，ProductionofFumaricAcidin20-LFermentors，AppliedMicrobiology，1962，10(1)，9-15中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是琥珀酸。为了进行发酵，可使用例如Int.J.Syst.Bacteriol.26，498-504(1976)；EP249773(1987)，Lemme&Datta；US5504004(1996)，Guettler，Jain&Soni；Arch.Microbiol.167，332-342(1997)；GuettlerMV，RumlerD，JainMK.，Actinobacillussuccinogenessp.nov.，anovelsuccinic-acid-producingstrainfromthebovinerumen.IntJSystBacteriol.1999Jan；49Pt1：207-16；US5,723,322，US5,573,931、US5,521,075、WO99/06532、US5,869,301或US5,770,435中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
在另一特别优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物是肌醇六磷酸酶。为了进行发酵，可使用例如WO98/55599中针对其它碳原料描述的类似条件和步骤。
发酵产生发酵液，所述发酵液除了所期望的微生物代谢产物外，主要含有发酵中产生的生物量、液化的淀粉溶液的未代谢的组分，和尤其是淀粉原料的非淀粉固体组分，例如纤维和未利用的糖，以及未利用的缓冲液和营养盐。在本申请中，该液体培养基也称作发酵液，发酵液也包含含糊精培养基(I)，其中存在的糖仅进行部分或不完全的发酵转化，即其中发生可利用的糖(例如单糖和二糖)的部分或不完全的微生物代谢。
在分离或耗尽微生物代谢产物之前或去除发酵液的挥发性组分之前，如果适当地话以上述方式进行灭菌步骤。
本发明的特定实施方案(I)涉及方法，该方法中至少一种微生物代谢产物被从发酵液中耗尽或分离。随后去除发酵液的大部分挥发性组分，得到固体或半固体蛋白质组合物。进行这类耗尽的更详细描述，以及获得的蛋白质组合物的更纤细描述是本申请公司的WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)的主题，其涉及进一步的细节。
从发酵液中分离或耗尽代谢产物即，具有至少3个C原子或具有至少2个C原子和至少1个N原子的有机化合物(下文中也称作价值产物)通常以下述方式进行：至少一种代谢产物被从发酵液中耗尽或分离，使得发酵液中该代谢产物的含量维持在按重量计不多于20％、尤其是按重量计不多于10％、特别是按重量计不多于5％、非常特别地按重量计不多于2.5％，每种情况下以剩余的发酵液总重为基础。
微生物代谢产物可以在一个或多个步骤中从发酵液中被分离或耗尽。该上下文中的一个关键步骤是从发酵液中去除固体组分。这可以在分离价值产物之前或之后进行。本领域常规使用的方法(其也包括用于粗清洁和精纯化价值产物的步骤和用于配制的步骤)是已知用于分离价值产物和用于去除固体的，即固液相分离(例如描述于Belter，P.A，Bioseparations：DownstreamProcessingforBiotechnology，JohnWiley&Sons(1988)，和Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，第五版CD-ROM上，Wiley-VCH)。
为了分离价值产物，随后可有利地进行一个步骤，其中首先例如借助于离心或过滤将固体组分从发酵液中去除，随后例如通过结晶、沉淀、吸附或蒸馏将价值产物从液相中分离。或者，价值产物也可以通过例如使用层析方法或萃取方法从发酵液中直接分离。必须提到的层析方法尤其是离子交换层析，其中价值产物可以在层析柱上选择性地被分离。在该情况下，例如通过倾析、蒸发和/或干燥有利地从剩余的发酵液中去除固体。
在挥发性或油性化合物的情况下，通常必须在加工期间、尤其在干燥期间监测最大温度。也可以通过将其配制在吸附剂上的假固体形式中有利地制备这些化合物。适用于该目的的吸附剂详细地描述于例如本申请公司的WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)中。可以有利地以这种方式制备的化合物的实例为γ-亚麻酸、二高-γ亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，以及丙酸、乳酸、丙二醇、丁醇和丙酮。就本发明的目的而言，假固体制剂中的这些化合物也被理解为固体形式的非挥发性微生物代谢产物。
另一特定实施方案(II)涉及一种方法，其中发酵液的挥发性组分基本被去除，而之前不分离或耗尽非挥发性微生物代谢产物，并且如果适当的话，之前不去除至少一些固体组分，得到非挥发性微生物代谢产物的固体制剂。进行这类方法的更详细的描述可见于本申请公司的PCT/EP2006/066057(较早专利申请为DE102005042541.0)。
“基本上”表示一旦挥发性组分被去除，固体或至少半固体的残余物如果适当的话可以通过添加固体被转化为固体产物。通常，这表示挥发性组分的去除低至按重量计不多于30％、通常按重量计不多于20％、尤其是按重量计不多于15％的残余水分含量。通常，发酵液的挥发性组分会有利地从发酵液中去除，低至按重量计0.2％到30％、优选按重量计1％到20％、特别优选按重量计2％到15％、非常特别优选按重量计5％到15％范围内的残余水分含量，其以干燥后测定的固体组分的总重为基础。可以通过技术人员熟悉的常规方法测定残余的水分含量，例如借助于热重量分析法(Hemminger等，MethodenderthermischenAnalyse[Methodsofthermalanalysis]，SpringerVerlag，Berlin，Heidelberg，1989)。
以固体形式从发酵液中获得不挥发代谢产物可以在一个、两个或更多步骤中，尤其是在一步或两步的操作中达成。通常，用于以固体形式获得代谢产物的至少一个步骤，尤其是最终步骤应包括干燥步骤。
在一步操作中，发酵液的挥发性组分会被去除，如果适当的话在前述初步去除之后，直到达到期望的残余水分含量。
在两步或多步操作中，应首先例如通过过滤(微量过滤、超滤)浓缩发酵液，或通过蒸发一部分挥发性组分热浓缩发酵液。在该步骤中被去除的挥发性组分的量通常总计为按重量计10％到80％、尤其是按重量计20％到70％，所述量以发酵液的挥发性组分的干物质为基础。在一个或多个步骤随后的中，发酵液的残余的挥发性组分被去除，直到达到期望的残余水分含量。
根据该实施方案(II)，挥发性组分基本上被从液体培养基中去除，不事先耗尽或事实上分离价值产物。因此，当去除发酵液的挥发性组分时，非挥发性代谢产物基本上不与液体培养基的挥发性组分一起被去除，而是与来自发酵液的至少一部分、通常大部分和尤其是所有的其它固体组分一起保留在得到的残余物中。然而，因此可能在去除发酵液的挥发性组分时与其一起去除一定量(优选小量)的期望的非挥发性微生物代谢产物，通常按重量计不多于20％、例如按重量计0.1％到20％，优选不多于10％、尤其按重量计不多于5％、特别优选按重量计不多于2.5％、非常特别优选按重量计不多于1％，所述用量以代谢产物的总干物质为基础。在非常特别优选的实施方案中，期望的不挥发微生物代谢产物作为混合物中的固体，维持为按重量计至少90％、尤其是按重量计至少95％、特别是按重量计至少99％、非常特别是按重量计约100％，每种情况以代谢产物总干重为基础，所述混合物是与去除挥发性组分后获得的发酵培养基的固体组分部分的混合物，或者是与发酵培养基的所有固体组分的混合物。
如果期望的话，可以在去除挥发性组分前，例如借助于离心或过滤将一部分非淀粉固体组分从发酵液中分离，所述部分例如为按重量计5％到80％，尤其是按重量计30％到70％。如果适当的话应进行这类初步分离，从而去除粗固体颗粒，所述颗粒不包含或仅包含小量的非挥发性微生物代谢产物。该初步过滤可以使用技术人员已知的常规方法进行，例如使用粗筛、网、穿孔板(perforatedorificeplates)等。如果适当的话，也可以在离心力分离器中分离粗固体颗粒。此处使用的仪器如倾析器、离心机、sedicanters和分离器也是技术人员已知的。以此种方式获得固体或半固体的(例如糊状的)残余物，所述残余物包含非挥发性代谢产物和淀粉原料的非挥发性、通常是固体的、非淀粉的组分或其至少一大部分，通常按重量计至少90％或所有的固体非淀粉组分。
与发酵的固体组分一起存在的干的代谢产物的特性可以通过添加配制辅料(如载体和包衣材料、粘合剂和其它添加剂)，以本身已知的方式，特别是根据多种参数配制，所述参数如活性物质含量、颗粒尺寸、颗粒形状、成尘趋势、吸湿性、稳定性尤其是储存稳定性、颜色、气味、流动行为、团聚趋势、静电荷、对光和温度的敏感性、机械稳定性和再分散性。
常规使用的配制辅料包括例如粘合剂、载体材料、成粉/流动佐剂，另外有色素、杀生物剂、分散剂、消泡剂、粘度调节剂、酸、碱、抗氧化剂、酶稳定剂、酶抑制剂、吸附剂、脂肪、脂肪酸、油或这些的混合物。这类配方辅料有利地作为干燥助剂使用，尤其是使用例如喷雾干燥、流化床干燥和冷冻干燥的配制和干燥方法时。进一步的细节可见于PCT/EP2006/066057(较早申请DE102005042541.0)。
上述添加剂和适当时其它添加剂(如包衣材料)的用量可显著变化，取决于所述代谢产物的特定要求和使用的添加剂的特征，并可以例如在按重量计0.1％到80％的范围内，尤其是按重量计从1％到30％的范围内，各情况下以完成配制形式的产物或物质混合物的总重为基础。
配制辅料的添加可以在加工发酵液(也称作产物配制或固体设计)之前、期间或之后进行，尤其是在干燥期间进行。在加工发酵液或代谢产物之前添加配制辅料可以是有利的，尤其是对促进要加工的物质或产物的可加工性是有利的。配制辅料可以添加至固体形式获得的代谢产物中，或添加至含有代谢产物的溶液或悬浮液中，例如在发酵完成后直接添加进发酵液中或在加工期间和最后的干燥步骤之前添加进获得的溶液或悬浮液中。
因此，例如辅料可以与微生物代谢产物的悬浮液混合；这类悬浮液也可以例如通过喷雾或混合应用于载体材料。在干燥期间添加配制辅料可以是重要的，例如当包含代谢产物的溶液或悬浮液被喷雾时。配制辅料的添加尤其是在干燥后进行，例如当对干燥的颗粒应用包衣/包衣层时。也可以在干燥后和任选的包衣步骤后对产物应用其它辅料。
从发酵液中去除挥发性组分以本身已知的方式、通过用于将固相从液相中分离的常规方法进行，所述方法包括过滤方法和蒸发液相的挥发性组分的方法。这类方法(其也可以包含用于粗清洁价值产物的步骤和配制步骤)描述于例如Belter，P.A，Bioseparations：DownstreamProcessingforBiotechnology，JohnWiley&Sons(1988)和Ullmann’sEncyclopediaofIndustrialChemistry，5thed.onCD-ROM，Wiley-VCH中。发酵结束后产物配制或加工的范围内可以使用的、技术人员已知的方法、仪器、辅料和一般或特定的实施方案进一步描述于EP1038527、EP0648076、EP835613、EP0219276、EP0394022、EP0547422、EP1088486、WO98/55599、EP0758018和WO92/12645中。
在该实施方案(II)的一个变型中，非挥发性微生物代谢产物如果以溶解的形式存在于液相中，将例如通过结晶或沉淀从液相中转化进入固相中。
此后，非挥发性固体组分(包括代谢产物)例如借助于离心、倾析或过滤被分离。油性代谢产物也可以以类似的方式被分离，所述油性发酵产物通过添加吸附剂(例如二氧化硅、硅胶、壤土、粘土和活性炭)被转化成为固体形式。
在该实施方案(II)的第二个变型中，挥发性组分通过蒸发被去除。蒸发可以以本身已知的方式进行。用于蒸发挥发性组分的合适方法的实例是喷雾干燥、流化床干燥或流化床团聚、冷冻干燥、气流干燥器(pneumaticdriers)和接触干燥器，以及挤压干燥。也可以进行上述方法与形状赋予方法(shape-impartingmethod，例如挤压、造粒(pelleting)或成球(prilling))的组合。在这些最后提到的方法中，优选部分或主要地使用含预干燥的代谢产物的物质混合物。
在优选的实施方案中，发酵液的挥发性组分的去除包括喷雾干燥方法或流化床干燥方法，包括流化床颗粒化。为此，如果适当的话在初步分离以去除粗固体颗粒(其仅包含小量的不挥发微生物代谢产物，如果有的话)后，将发酵液补料进一个或多个喷雾干燥或流化床干燥装置中。固体负荷的发酵液的运输或补料方便地借助于常规运输设备进行，所述设备用于含固体的液体，例如泵，如偏心单转子螺旋泵(例如来自于DelascoPCM)或高压泵(例如来自于LEWAHerbertOttGmbH)。
使用本发明的含糖液体培养基的发酵也可以以如下方式进行：
vii)将以总重为基础按重量计不多于50％、例如按重量计在5％到45％范围内的一部分从在步骤iii)中获得的培养基M(其包含淀粉原料的非淀粉固体组分)中去除，并将剩余部分提供给用于产生第一种代谢产物(A)的发酵，例如固体形式的不挥发代谢产物(A)或挥发性代谢产物(A)；和
viii)如果适当的话，在先前去除了淀粉原料的所有或一些非淀粉固体组分之后，将该部分提供给用于产生第二种代谢产物(B)的发酵，所述第二种代谢产物与代谢产物(A)相同或不同。
如果(vii)的非淀粉固体组分被分离，则培养基M剩余部分的固体含量总计为优选按重量计不多于50％、尤其是按重量计不多于30％、特别优选按重量计不多于10％、非常特别优选按重量计不多于5％。在这类情况下，尤其优选在用于产生第二种代谢产物(B)的发酵之前分离所有的固体。
该步骤使得可能在vii)的独立发酵中使用下述微生物，所述微生物的某些最小需要(例如关于输氧率)必须被满足。用于vii)的独立发酵中的合适微生物是例如芽孢杆菌物种，优选枯草芽孢杆菌。由这类微生物在独立发酵中产生的化合物尤其选自维生素、辅因子和营养药、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸、脂类、饱和和不饱和的脂肪酸、芳香族化合物、蛋白质、类胡萝卜素，特别是选自维生素、辅因子和营养药、蛋白质和类胡萝卜素，非常特别选自核黄素和泛酸钙。
该步骤的优选的实施方案涉及在两个独立的发酵中平行产生相同的代谢产物(A)和(B)。这是有利的，尤其是相同的代谢产物的不同应用具有不同的纯度要求时。因此，使用含固体的发酵液产生第一种代谢产物(A)，例如要用作饲料添加剂的氨基酸(例如赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或谷氨酸)；而使用viii)的固体被耗尽的发酵液产生相同的第二种代谢产物(B)，例如要用作食物添加剂的相同氨基酸。由于非淀粉固体组分的完全或部分去除，加工代谢产物时纯化的复杂性可以被降低，所述代谢产物的应用领域具有更高的纯度要求，例如作为食品添加剂。
在另一优选的实施方案中，该步骤可以例如如下进行。用于产生代谢产物A(例如氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸或苏氨酸)或柠檬酸或乙醇优选的大体积发酵例如根据WO2005/116228(PCT/EP2005/005728)或PCT/EP2006/066057(较早申请DE102005042541.0)、或根据已知的生物乙醇发酵生产方法实现。根据vii)，去除在步骤iii)中获得的一些培养基M。根据vii)被去除的部分可以通过常规方法根据viii)完全或部分没有固体，所述常规方法例如离心或过滤，取决于发酵产生B的需要。以此种方式获得的培养基M根据viii)被提供给用于产生代谢产物B的发酵中，所述培养基M任选全部或部分地没有固体。根据viii)分离的固体流被有利地返回大体积发酵的培养基M的流中。
如果在大体积发酵中产生的微生物代谢产物(A)是乙醇，则步骤iii)中制备的培养基M具有乙醇(生物乙醇)的发酵产生中常规的浓度，例如按重量计从25％到33％的范围内。这里，根据步骤viii)分离固体根据产生各自代谢产物B的发酵要求进行。
在上述步骤的优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物B是核黄素。为了进行发酵，可以使用例如WO01/011052、DE19840709、WO98/29539、EP1186664和Fujioka，K.：Newbiotechnologyforriboflavin(vitaminB2)andcharacterofthisriboflavin.FragranceJournal(2003)，31(3)，44-48中针对其他碳原料描述的类似条件和步骤。
为了进行该方法的变型，如上所述进行优选的大体积发酵用于产生代谢产物A，例如氨基酸如赖氨酸、甲硫氨酸或谷氨酸、柠檬酸或乙醇。根据vii)，在步骤iii)中获得的培养基M的一些通过常规方法被去除并根据viii)被完全或部分地没有固体，所述常规方法例如为离心或过滤。从中获得的几乎完全或部分地没有固体的培养基M根据viii)被提供给用于产生代谢产物B的发酵中，所述代谢产物B在本情况下为核黄素。根据viii)分离的固体流被有利地返回大体积发酵的培养基M的流中。
如此根据viii)产生的含核黄素的发酵液可以例如通过DE4037441、EP464582、EP438767和DE3819745中针对其他碳原料描述的类似条件和步骤加工。在细胞量裂解之后，将以结晶形式存在的核黄素被分离，优选通过倾析分离。分离固体的其他途径(例如过滤)也是可能的。此后优选借助于喷雾干燥器和流化床干燥器干燥核黄素。或者，可以通过例如EP1048668和EP730034中描述的类似条件和使用类似步骤加工根据viii)产生的含核黄素的发酵混合物。巴氏消毒后，离心发酵液并用无机酸处理剩余的含固体级分。通过离心将形成的核黄素从水性酸性培养基中去除、洗涤，如果适当的话随后干燥。
在该步骤的另一优选的实施方案中，由微生物在发酵中产生的代谢产物B为泛酸。为了进行发酵，可以使用例如WO01/021772中针对其他碳原料描述的类似条件和步骤。
为了进行该步骤变型，可以随后进行如上针对核黄素所述的步骤。将已经根据viii)进行初步纯化并优选基本不含固体的培养基M喂饲给用于产生泛酸的根据viii)的发酵中。此处，与含固体的液体培养基相比粘度被降低的事实是尤其有利的。独立的固体流优选被返回大体积发酵的含糖液体培养基的流中。
根据viii)产生的含泛酸发酵液可以通过例如EP1050219和WO01/83799中针对其他碳原料描述的类似条件和使用类似步骤加工。当所有的发酵液被巴氏消毒后，例如通过离心或过滤分离剩余的固体。在该固体分离步骤中得到的澄清流出液被部分蒸发，如果适当的话用氯化钙处理并干燥，尤其是喷雾干燥。
已经被分离的固体可以与平行的大体积发酵方法范围内各自期望的微生物代谢产物(A)一起获得。
干燥和/或配制步骤后，可以向产物制剂或蛋白质组合物中添加完整的或碾碎的谷物仁，优选玉米、小麦、大麦、粟、黑小麦和/或黑麦。
以下的实施例旨在阐述本发明的各方面，但是不应以任何方式被理解为限制。
实施例
I.碾磨淀粉原料
如下产生本文下文中使用的碾磨产物。使用转子磨将完整的玉米仁充分磨碎。使用不同的打浆机、碾磨途径或筛选元件，得到三种不同的精细程度。借助于实验室振动筛(振动分析仪：RetschVibrotronicVE1型，筛分时间5分钟，振幅：1.5mm)对碾磨产物进行的筛选分析得到表I中所列的结果。
表I
实验编号 T 70/03 T 71/03 T 72/03
＜2mm/％ 99.4 100 100
＜0.8mm/％ 66 100 99
＜0.63mm/％ 58.6 98.5 91
＜0.315mm/％ 48.8 89 65
＜0.1mm/％ 25 9.6
＜0.04mm/％ 8 3.2
碾磨产物总量 20kg 11.45kg 13.75kg
II.淀粉的酶促液化和淀粉糖化
II.1.)在蒸汽加压锅中液化
为了连续液化干磨的玉米粉，设置两个具有250l体积的搅拌罐；每1小时将用水制成浆液的玉米粉从它们的每个交替喂饲到蒸汽加压锅。通常，以这样的方式设置这些罐使得导入117kg水，并且以按重量计0.1％的浓度(基于所用粉的量)向水中加入α-淀粉酶，例如，TermamylSC。之后，在多个步骤中在约45℃下喂饲133kg玉米粉并在其中混合。例如，通过加入CaCl2调节Ca2+浓度为50ppm后，调节pH在5.6到5.8的范围内。加入所有组分后，通过搅拌充分混合玉米粉悬浮液直到它用于蒸汽加压锅中。然后将该悬浮液以250kg/h在5巴的压力下加入蒸汽加压锅中。通过平行地提供25kg/h蒸汽(7.5巴)完成加热玉米粉悬浮液超过胶化温度至105℃。在管式反应器(其被安排在蒸汽加压锅的下游)中，使用5分钟的保持时间，一些胶化的淀粉被分解成糊精(液化1)。之后，通过闪蒸(flashing)到90℃降低反应混合物的温度，在该过程中约5kg/h的蒸汽逃逸。然后，在另一管式反应器中90℃下进行第二次液化100分钟以上，以便完全将淀粉分解成糊精。然后通过重新闪蒸，冷却所得的反应混合物至61℃的糖化温度，在该过程中失去约14kg/h水。
II.1)糖化
在随机测试中糖化II.1)中得到的部分反应混合物。为此，将约1000g反应混合物转移到搅拌罐中并在恒定搅拌下保持在61℃。在该实验的整个持续时间内持续搅拌。用H2SO4调节pH到4.3后，加入17.9g(15.2ml)DextrozymeGA(NovozymesA/S)。保持温度约3小时，在该过程期间通过HPLC监测反应过程。结束时，葡萄糖浓度为420g/kg。
III.菌株
ATCC13032lysCfbr
在以下的一些实施例中，使用在WO05/059144中以名称ATCC13032lysCfbr描述的经修饰的谷氨酸棒状杆菌菌株。
实施例1
使用谷氨酸棒杆菌，在摇瓶试验中使用如方案II所述制备的液化和糖化的玉米粉水解产物。
菌株
使用具有反馈去调节的天冬氨酸激酶的经修饰的野生型ATCC13032lysCfbr。
接种物的制备
将细胞在无菌的CM+CaAc琼脂(组成：见表1；121℃20分钟)上划线，然后在30℃培育过夜。之后，将细胞从平板上刮下并重悬于盐水中。用下述量的制备的细胞悬浮液接种装有两个挡板的250-ml-锥形瓶中25ml的培养基(见表2)，所述用量使得610nm处的光密度OD610值达到0.5。
表1：CM+CaAc琼脂平板的组成
浓度 组分
10.0g/l D-葡萄糖
2.5g/l NaCl
2.0g/l 尿素
5.0g/l Bacto蛋白胨(Difco)
5.0g/l 酵母提取物(Difco)
5.0g/l 牛肉膏(Difco)
20.0g/l 水解酪蛋白氨基酸
20.0g/l 琼脂
发酵液的制备
烧瓶培养基的组成在表2中列出。试验以一式三份进行。
表2：烧瓶培养基
玉米粉水解产物 143g/l
(NH4)2SO4 20g/l
尿素 5g/l
KH2PO4 0.113g/l
K2HPO4 0.138g/l
ACES 52g/l
MOPS 21g/l
柠檬酸×H2O 0.49g/l
3，4-二羟基苯甲酸 3.08mg/l
NaCl 2.5g/l
KCl 1g/l
MgSO4×7H2O 0.3g/l
FeSO4×7H2O 25mg/l
MnSO4×4-6H2O 5mg/l
ZnCl2 10mg/l
CaCl2 20mg/l
H3BO3 150μg/l
CoCl2×6H2O 100μg/l
CuCl2×2H2O 100μg/l
NiSO4×6H2O 100μg/l
Na2MoO4×2H2O 25μg/l
生物素(维生素H) 1050μg/l
硫胺素×HCl(维生素B1) 2100μg/l
烟酰胺 2.5mg/l
泛酸 125mg/l
氰钴胺素(维生素B12) 1μg/l
4-氨基苯甲酸(PABA；维生素H1) 600μg/l
玉米粉水解产物 143g/l
叶酸 1.1μg/l
吡哆醇(维生素B6) 30μg/l
核黄素(维生素B2) 90μg/l
CSL 40ml/l
pH* 6.85
*用稀的NaOH水溶液调节
接种后，将烧瓶在湿润的摇床中摇动(200rpm)下在30℃培育48小时。发酵结束后，通过HPLC测定葡萄糖含量和赖氨酸含量。用Agilent1100系列LC系统进行HPLC分析。借助于高压液相层析在Agilent1100系列LC系统HPLC上测定氨基酸浓度。用邻苯二醛柱前衍生允许定量形成的氨基酸；使用AgilentHypersilAA柱分离氨基酸混合物。
实施例2
在使用黑曲霉的摇瓶实验中使用通过方案II制备的液化的糖化的玉米粉水解产物。
菌株
与WO98/46772详述的NP505-7制备类似地制备了黑曲霉肌醇六磷酸酶生产菌株，所述菌株带有处于glaA启动子调控下的来自Aspergillusficuum的6个拷贝的phyA基因。使用具有3个经修饰的glaA扩增子(与ISO505类似)但未整合phyA表达盒的菌株作为对照。
接种物的制备
将装备有挡板的100-ml-锥形瓶中的20ml预培养培养基(见表3)在每种情况下用100μl冻干的培养物接种，并在34℃下在潮湿的摇床中振动(170rpm)下培育24小时。
表3：预培养培养基的组成
组分 浓度
葡萄糖 30.0g/l
来自酪蛋白的蛋白胨 10.0g/l
酵母提取物 5.0g/l
KH2PO4 1.0g/l
MgSO4×7H2O 0.5g/l
ZnCl2 30mg/l
CaCl2 20mg/l
MnSO4×1H2O 9mg/l
FeSO4×7H2O 3mg/l
吐温80 3.0g/l
青霉素 50000IU/l
链霉素 50mg/l
pH* 5.5
*用稀硫酸调节
将装有挡板的250-ml锥形瓶中的50ml主要培养基(见表4)在每种情况下用5ml预培养物接种。
发酵液的制备
烧瓶培养基的组成在表4中列出。对每个样品建立两个烧瓶。
表4：烧瓶培养基
玉米粉水解产物 166g/l
来自酪蛋白的蛋白胨 25.0g/l
酵母提取物 12.5g/l
KH2PO4 1.0g/l
K2SO4 2.0g/l
MgSO4×7H2O 0.5g/l
ZnCl2 30mg/l
CaCl2 20mg/l
MnSO4×1H2O 9mg/l
FeSO4×7H2O 3mg/l
青霉素 50000IU/l
链霉素 50mg/l
pH* 5.6
*将用稀硫酸调节
接种后，将烧瓶在34℃湿润的摇床中振动(170rpm)下培养6天。发酵结束后，在250mM乙酸/乙酸钠/吐温20(按重量计0.1％)，pH5.5缓冲液中使用肌醇六磷酸作为底物在合适的肌醇六磷酸酶活性水平(标准：0.6U/ml)测定肌醇六磷酸酶活性。该测定被标准化以用于微量滴定板(MTP)。将10μl的酶溶液与140μl的6.49mM肌醇六磷酸酶溶液在250mM的乙酸钠缓冲液，pH5.5(肌醇六磷酸：肌醇六磷酸的十二钠盐)中混合。在37℃温育一小时后，通过添加等体积(150μl)的三氯乙酸淬灭反应。将该混合物的一个等分试样(20μl)转移进280μl的溶液中，所述溶液包含0.32NH2SO4、按重量计0.27％的钼酸铵和按重量计1.08％的抗坏血酸。随后在50℃温育25分钟。在820nm处测量蓝色溶液的吸光度。

Claims (17)

1.发酵产生至少一种有机化合物的方法，所述有机化合物具有至少3个C原子或具有至少2个C原子和至少1个N原子，所述方法包括下面的步骤：
i)碾磨选自玉米、黑麦、黑小麦和小麦仁的谷物仁的淀粉原料，从而得到碾磨产物，其包含按重量计至少90％的存在于淀粉原料中的淀粉原料的非淀粉固体组分并且其中碾磨产物中非淀粉成分的量基于碾磨产物的淀粉成分为按重量计至少15％；
ii)将碾磨产物以这样的量悬浮在水性液体中使得得到的悬浮液中干物质含量为按重量计至少45％，所述碾磨产物包含存在于淀粉原料中的淀粉原料的至少90％的固体非淀粉组分，并且其中碾磨产物中非淀粉成分的量基于碾磨产物的淀粉成分为按重量计至少15％，
iii)通过液化，和如果合适，通过随后的糖化作用水解碾磨产物中的淀粉组分，从而得到水性培养基M，该水性培养基M包含淀粉原料的水解的淀粉组分和淀粉原料的至少部分非淀粉固体组分；和
iv)在发酵中使用步骤iii)中得到的水性培养基M培养能够过量产生所述有机化合物的微生物；
其中，在步骤iii)中，通过向步骤ii)中得到的悬浮液中导入蒸汽将所述悬浮液在高于碾磨产物中存在的淀粉的胶化温度的温度下加热并且在蒸汽加压锅中完成该用蒸汽加热。
2.根据权利要求1的方法，其中通过闪蒸到低于胶化温度的温度冷却碾磨产物的加热的悬浮液并随后在淀粉液化酶存在下进行淀粉的液化。
3.根据权利要求1的方法，其中在加热前向悬浮液中加入至少一种淀粉液化酶。
4.根据权利要求1的方法，其中淀粉的水解包括糖化步骤。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其还包括下面的步骤：
v)在包含可代谢的糖的水性发酵培养基F中培养能够过量产生所述有机化合物的微生物；和
vi)向发酵培养基F中加入水性培养基M，在该过程中，水性培养基M中存在的被水解的淀粉组分被微生物代谢，并形成所述有机化合物。
6.根据权利要求5的方法，其中在步骤v)中，发酵培养基F基本上包含水性培养基M、能够过量产生所述有机化合物的微生物、营养盐、常规辅料和稀释用水。
7.根据权利要求1-4任一项5的方法，其中淀粉液化酶是α-淀粉酶。
8.根据权利要求1-4任一项5的方法，其中所产生的有机化合物选自任选地连接有羟基并具有3到10个碳原子的单羧酸、二羧酸和三羧酸、产蛋白质的和不产蛋白质的氨基酸、嘌呤碱基、嘧啶碱基；核苷、核苷酸、脂类；饱和和不饱和的脂肪酸；具有4到10个碳原子的二元醇、具有3个或更多羟基的多元醇、具有至少4个碳原子的长链醇、糖类、芳香族化合物、维生素、维生素原、辅因子、营养药、蛋白质、类胡萝卜素、具有3到10个碳原子的酮、内酯、生物聚合物和环糊精。
9.根据权利要求1-4任一项5的方法，其中用于发酵的微生物选自过量产生至少一种以下代谢产物的天然或重组的微生物：酶、氨基酸、维生素、二糖、具有3到10个碳原子的脂肪族单和二羧酸、具有3到10个碳原子的脂肪族羟基羧酸、具有3到10个C原子的酮、具有4到10个C原子的链烷醇、具有3到8个C原子的链烷二醇和聚羟链烷酸。
10.根据权利要求9的方法，其中所述微生物选自过量产生一种或多种氨基酸的微生物。
11.根据权利要求9的方法，其中所述微生物选自过量产生一种或多种具有3到10个C原子的脂肪族单和二羧酸的那些微生物。
12.根据权利要求9的方法，其中所述微生物选自过量产生一种或多种酶的那些微生物。
13.根据权利要求12的方法，其中所述微生物选自过量产生肌醇六磷酸酶的那些微生物。
14.根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述微生物选自棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、阿舒囊霉属(Ashbya)、埃希氏菌属(Escherichia)、曲霉属(Aspergillus)、产碱菌属(Alcaligenes)、放线杆菌属(Actinobacillus)、厌氧螺菌属(Anaerobiospirillum)、乳杆菌属(Lactobacillus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)和根霉属(Rhizopus)。
15.根据权利要求14的方法，其中所述微生物选自棒杆菌属的菌株。
16.根据权利要求1-4任一项的方法，其中至少一种微生物代谢产物被耗尽或从发酵液中分离，并且发酵液的挥发性组分随后被基本去除，获得固体或半固体的蛋白质组合物。
17.根据权利要求1-4任一项的方法，其中发酵液的至少一些挥发性组分被去除，不事先分离或耗尽非挥发性的微生物代谢产物，并且如果适当的话，不事先去除固体组分，获得非挥发性的微生物代谢产物的固体制剂。
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