CN106916856B - 提高产脂微生物生产奇数碳脂肪酸产量的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供提高产脂微生物生产奇数碳脂肪酸产量的培养基及方法。本发明的用于发酵产脂微生物的发酵培养基，其含有：(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐。本发明生产奇数碳脂肪酸的方法或提高产脂微生物奇数碳脂肪酸产率的方法包括在含(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐的发酵培养基中发酵产脂微生物。
Description
技术领域
本发明属于微生物生产脂质领域，具体涉及提高产脂微生物生产奇数碳脂肪酸产量的培养基及方法。
背景技术
奇数碳脂肪酸(Odd chain fatty acid，OCFA)的功能类似不饱和脂肪酸，有助于提高细胞膜的流动性。在某些细菌中含量较多，但在动物、低等植物中含量不超过1％。奇数碳脂肪酸代谢后产生糖残基，因而有更佳的营养效果〔杨渝珍等，奇数碳中链脂肪酸对饥饿大鼠葡萄糖体内平衡及储脂动员的代谢效应，武汉医学院学报，1983:29-35；Ratsenriched with odd-carbon fatty acids:maintenance of liver glycogen duringstarvation，Science，1969，165(3895):811-813〕，不存在不利作用〔张大昕，奇数碳脂肪酸的代谢与营养，生理科学进展，1979，10(3):250-255〕；此外，含有奇数碳脂肪酸的甘三酯可以减少脓毒症及重症特护治疗的继发性并发症的发生频率或减轻炎症性或缩短病程〔CN200980145702.6〕。奇数碳脂肪酸的增加也被认为是微生物应对环境压力的一种适应机制〔Zhu L,Zhang X,Ji L,et al.Changes of lipid content and fatty acidcomposition of Schizochytrium limacinum in response to different temperaturesand salinities[J].Process Biochemistry,2007,42(2):210-214〕。由于奇数碳脂肪酸在自然界中合成量很少，因而常被额外添加以作为脂肪酸定量分析、脂肪酸摄入量分析的内参〔A review of odd-chain fatty acid metabolism and the role of pantadecanoicacid(C15:0)and heptadecanoic acid(C17:0)in health and disease,Molecules,2015,20:2425-2444〕。
奇数碳脂肪酸可通过偶数碳脂肪酸的α氧化以及脂肪酸合成两条途径产生。α氧化一般发生在脂肪酸β位存在基团修饰的情况下，正常情况下细胞内不会大量积累这种脂肪酸。从头合成途径一般认为是脂肪酸合成系统采用了丙酰辅酶A为前体〔Horning et al.,Fatty acid synthesis in adipose tissue,The journal of biological chemistry,1961,236(3):669-672〕，而常规偶数碳脂肪酸的合成使用乙酰辅酶A为前体(图1中的1)。丙酰辅酶A产生的直接途径是丙酸在硫激酶的作用下形成丙酰辅酶A，硫激酶分为3类，EC6.2.1.1激活乙酸、丙酸，EC6.2.1.2激活4～10个碳原子的脂肪酸，EC6.2.1.3激活12个碳以上的脂肪酸。不过微生物体内通常很难积累丙酸，因此OCFA合成的底物少。此外，还有图1中的2和3两条途径可生成丙酰辅酶A。
已有研究团队试图依此提高起始物来增加OCFA的合成。如CN201280054084.6通过增强丙酰辅酶A的合成来提高OCFA的生产。该文献通过引入可产生丙酰辅酶A的酶来制备奇数碳脂肪酸，如天冬氨酸激酶、丝氨酸脱氢酶、丝氨酸激酶、苏氨酸合酶、苏氨酸脱氢酶、(R)-柠苹酸合酶、异丙基苹果酸异构酶、β-异丙基苹果酸脱氢酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、甲基丙二酰辅酶A羧酶、甲基丙二酰辅酶A羧基转移酶等。经过一系列操作，在重组大肠杆菌中合成OCFA达总脂肪酸的82％，不过大肠杆菌不是油脂微生物，因此OCFA的总量只有325mg/L。
裂殖壶菌又称裂壶藻，属于破囊壶菌科的一类海洋真菌。裂壶菌能够积累大量活性物质，如DHA、胡萝卜素、虾青素等。采用葡萄糖或甘油做碳源发酵，细胞干重可达到150克/升，油脂占细胞干重能到70％以上，DHA占总脂肪酸35％以上，且主要以甘三酯形式存在，少量以卵磷脂形式存在〔魏萍等，裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展,食品工业科技，2010，20:398-404〕。因为它有很强的脂质积累能力和较纯的脂肪酸组成，裂壶藻是极佳的脂质合成宿主。裂壶藻某些菌也能够生产奇数碳脂肪酸。如Chang等〔Odd-chain polyunsaturatedfatty acids in Thraustochytrids,Phytochemistry,2011,72:1460-1465〕介绍了破囊壶菌科Schizochytrium疑似菌积累15.4％的OCFA，Thraustochytrium疑似菌积累21％OCFA。如EP0823475A实施例3中，Schizochytrium SR21菌奇数碳脂肪酸含量达到C15:0为10.1％，C17:0为1.8％。如Chang等〔Fatty acid shifts and metabolic activity changes ofSchizochytriumn sp.S31cultured on glycerol,Broresource Technology 2013，142：255-260〕中，裂壶藻ATCC 20888分批发酵，在发酵72h时检测到最高量的C15:0为9.16％和C17:0为2.91％，但到发酵后期时会降到很低水平(C15:01.25％,C17:00.99％)。可见，Schizochytrium藻发酵生产奇数碳脂肪酸，细胞内最高含量的报道为15.4％。
目前现有的公开中，仅Chang等〔Fatty acid shifts and metabolic activitychanges of Schizochytriumn sp.S31cultured on glycerol,BroresourceTechnology2013，142：255-260〕推测过裂壶藻内奇数碳脂肪酸的合成途径：C15及C17脂肪酸是C12、C14与2-甲基丙酰CoA的缩合。
裂壶藻发酵产脂的报道已经很多，但尚未有提及裂壶藻可产生β分枝脂肪酸的报道，因而经过α氧化产生10％以上这么多OCFA的可能很低。经由丙酰辅酶A的途径可能是裂壶藻合成大量OCFA的机制，但丙酸一般通过Wood-Werkman循环合成，大量的生产仅在丙酸菌厌氧发酵中才能达成，是较难进行的代谢途径〔赵树欣等，固定化丙酸菌发酵底物的研究，《中国食品添加剂》，2005〕。
裂壶藻属于海洋微藻，如CN201210139766.9所述，裂壶藻在淡水中不能生长。因此培养海洋微藻，如裂壶藻，需要使用天然海水或海盐(海水晶)或含有近似所需海盐中氯化钠含量的复配盐。但海水或海盐中含有大量氯离子，氯离子对发酵罐及其他下游处理设备有腐蚀作用(例如，可参见CN 1416320A)。因此CN 1416320A以及WO94/08467、CN201510201809.5使用硫酸钠替代氯化钠进行发酵。而且WO94/08467指出硫酸钠取代后的复配海盐能得到更好的生物量和脂质生产效果。虽然CN201110111247.7、CN201310021713.1、CN201410377164.6、CN201410086785.9、CN201010561184.X、CN201210139766.9、CN201310683597.X都使用了海水、海盐(海水晶)或氯化钠来模拟海洋环境发酵裂壶藻，但都未检测到奇数碳脂肪酸的产生。同样地，使用裂壶藻ATCC 20888的CN1416320A、WO94/08467也未检测到奇数碳脂肪酸。
因此，本领域仍然需要一种奇数碳脂肪酸的生产方法。
发明内容
本发明第一方面提供生产奇数碳脂肪酸的方法或提高产脂微生物奇数碳脂肪酸产率的方法，所述方法包括在含(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐的发酵培养基中发酵产脂微生物。
在一个或多个实施方案中，所述奇数碳脂肪酸选自C13:0、C15:0、C17:0和C21:0中的一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基含有丙酸和/或丙酸盐作为碳源。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基中丙酸或丙酸盐的含量为0.5～3.0wt％，例如0.8～2.5wt％、0.8～2.0wt％。
在一个或多个实施方案中，丙酸盐选自丙酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基含有乳酸和/或乳酸盐作为碳源。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基中乳酸或乳酸盐的含量为0.5～3wt％，例如0.8～2.5wt％、0.8～2.0wt％。
在一个或多个实施方案中，乳酸盐选自乳酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基还含有甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜和淀粉中的一种或多种作为碳源，其中，所述(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐占发酵培养基碳源总量的0.1～100％，优选1～100％，更优选10～100％，更优选20～100％，更优选30～100％，更优选40～100％，更优选50～100％。
在一个或多个实施方案中，所述碳源为葡萄糖。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，发酵培养基中葡萄糖的含量为0.5～3.0wt％，例如0.8～2.5wt％、0.8～2.0wt％。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基中的碳源为葡萄糖及丙酸和/或丙酸盐，其中，葡萄糖与丙酸和/或丙酸盐的重量比为1：3～3：1。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基还含有甘油。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基中的碳源为葡萄糖及乳酸和/或乳酸盐，其中，葡萄糖与乳酸和/或乳酸盐的重量比为1：3～3：1。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基还含有海盐或其替代物。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基中，海盐或其替代物的浓度为2.5～36g/L，优选12～24g/L。
在一个或多个实施方案中，海盐替代物为海水，或含有选自氯化钠、硫酸钠、磷酸钠盐、磷酸钾盐、硫酸钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、氯化钾、氯化钙、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化钴的盐以及选自硫胺素和泛酸钙的维生素的组合。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基含有蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆蛋白、氨基酸、氨基酸盐、蛋白质、玉米浆、动物性副产品、无机铵盐和氨水中的一种或多种作为氮源。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基含有蛋白胨和酵母粉。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基的pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，所述产脂微生物是破囊壶菌(Thraustochytrid)。
在一个或多个实施方案中，所述产脂微生物是裂殖壶菌(Schizochytrium)。
本发明第二方面提供一种用于发酵产脂微生物的发酵培养基，所述发酵培养基含有(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基含有丙酸和/或丙酸盐作为碳源。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基中丙酸或丙酸盐的含量为0.5～3.0wt％，例如0.8～2.5wt％、0.8～2.0wt％。
在一个或多个实施方案中，丙酸盐选自丙酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基含有乳酸和/或乳酸盐作为碳源。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基中乳酸或乳酸盐的含量为0.5～3wt％，例如0.8～2.5wt％、0.8～2.0wt％。
在一个或多个实施方案中，乳酸盐选自乳酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基还含有甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜和淀粉中的一种或多种作为碳源，其中，所述(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐占发酵培养基碳源总量的0.1～100％，优选1～100％，更优选10～100％，更优选20～100％，更优选30～100％，更优选40～100％，更优选50～100％。
在一个或多个实施方案中，所述碳源为葡萄糖。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，发酵培养基中葡萄糖的含量为0.5～3.0wt％，例如0.8～2.5wt％、0.8～2.0wt％。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基中的碳源为葡萄糖及丙酸和/或丙酸盐，其中，葡萄糖与丙酸和/或丙酸盐的重量比为1：3～3：1。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基还含有甘油。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基中的碳源为葡萄糖及乳酸和/或乳酸盐，其中，葡萄糖与乳酸和/或乳酸盐的重量比为1：3～3：1。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基还含有海盐或其替代物。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基中，海盐或其替代物的浓度为2.5～36g/L，优选12～24g/L。
在一个或多个实施方案中，海盐替代物为海水，或者含有选自氯化钠、硫酸钠、磷酸钠盐、磷酸钾盐、硫酸钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、氯化钾、氯化钙、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化钴的盐以及选自硫胺素和泛酸钙的维生素的组合。
在一个或多个实施方案中，所述发酵培养基含有蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆蛋白、氨基酸、氨基酸盐、蛋白质、玉米浆、动物性副产品、无机铵盐和氨水中的一种或多种作为氮源。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基含有蛋白胨和酵母粉。
在一个或多个实施方案中，发酵培养基的pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，以发酵培养基总重计，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在一个或多个实施方案中，所述产脂微生物是破囊壶菌(Thraustochytrid)。
在一个或多个实施方案中，所述产脂微生物是裂殖壶菌(Schizochytrium)。
本发明还包括丙酸和/或丙酸盐在生产奇数碳脂肪酸中的应用，以及乳酸和/或乳酸盐在生产奇数碳脂肪酸中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述应用为在产脂微生物发酵中的应用。
附图说明
图1显示脂肪酸合成系统使用丙酰辅酶A为前体来合成奇数碳脂肪酸，其中1显示由丙酰辅酶A合成奇数碳脂肪酸的途径，2和3分别显示丙酰辅酶A的两条合成途径。
具体实施方案
本发明通过优化培养的方式提高产脂微生物(尤其是裂壶藻)生产奇数碳脂肪酸的效果。具体而言，本发明在产脂微生物的常规发酵培养基中添加丙酸和/或其盐，和/或乳酸和/或其盐，作为碳源，可显著提高产脂微生物发酵产物中奇数碳脂肪酸的含量。
产脂微生物通常为破囊壶菌(Thraustochytrid)，优选为裂殖壶菌(Schizochytrium)。
本文中，奇数碳脂肪酸主要指C13:0、C15:0、C17:0和C21:0。本文中，奇数碳脂肪酸含量的提高即可以指单种奇数碳脂肪酸含量的提高，也可以指脂肪酸中全部奇数碳脂肪酸的含量提高。
适用于本发明的丙酸盐可以是丙酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物，优选是钠盐和钾盐。
适用于本发明的乳酸盐可以是乳酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物，优选是钠盐和钾盐。
丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐可以0.5～3.0wt％的量添加到常规的用于产脂微生物的发酵的发酵培养基中。通常，丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐的添加量(以发酵培养基重量计)为0.5～2.5wt％，例如0.5～2.0wt％、0.5～1.5wt％、0.5～1.0wt％等。
可使用丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐来替换常规发酵培养基中的一部分或全部碳源。因此，当替换发酵培养基中的全部碳源时，丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐的添加量可达例如1.0～3.0wt％，如1.0～2.0wt％。当替换发酵培养基中的部分碳源时，丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐的添加量可以为0.5～2.0wt％，例如0.5～1.5wt％、0.5～1.0wt％等。
发酵培养基中的碳源可以是本领域周知的用于发酵产脂微生物所需的碳源，包括但不限于各种碳水化合物，例如甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜和淀粉中的一种或多种的化合物。优选的这类碳源是葡萄糖和甘油。发酵培养基中这类碳源的用量为常规用量，当如本文所述添加丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐时，这类碳源的用量可作相应的减少。在某些实施方案中，丙酸和/或丙酸盐、乳酸和/或乳酸盐占发酵培养基碳源总量的0.1～100％，优选1～100％，更优选10～100％，更优选20～100％，更优选30～100％，更优选40～100％，更优选50～100％。
例如，在某些实施方案中，使用葡萄糖与丙酸和/或丙酸盐作为碳源，两者的重量比可以在1：3到3：1的范围内。或者，以发酵培养基的总重计，葡萄糖的含量为0.5～2.0wt％，如0.5～1.5wt％，丙酸和/或丙酸盐的含量为0.5～2.0wt％，如0.5～1.5wt％。在某些实施方案中，葡萄糖的含量为1wt％，而丙酸和/或丙酸盐的含量为1wt％。
在某些实施方案中，使用葡萄糖与乳酸和/或乳酸盐作为碳源，两者的重量比可以在1：3到3：1的范围内。或者，以发酵培养基的总重计，葡萄糖的含量为0.5～2.0wt％，如0.5～1.5wt％，乳酸和/或乳酸盐的含量为0.5～2.0wt％，如0.5～1.5wt％。在某些实施方案中，葡萄糖的含量为1wt％，而乳酸和/或乳酸盐的含量为1wt％。
通常，当产脂微生物为海洋微生物时，发酵培养基中还含有海盐或其替代物，用以提供海盐微生物生长所需的渗透压和微量元素。海盐替代物为海水，或者含选自氯化钠、硫酸钠、磷酸钠盐、磷酸钾盐、硫酸钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、氯化钾、氯化钙、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化钴的盐以及硫胺素、泛酸钙的维生素的组合(即本领域周知的“复配海盐”)。本领域周知，裂壶藻可以忍受一定范围的盐度变化，因此，本发明发酵培养基的盐度范围可以是WO94/08467所公开的低盐培养条件到该藻天然生存的海洋环境盐度。在某些实施方案中，发酵培养基中海盐的含量范围可以为2.5～36g/L，例如12～24g/L、15～20g/L。当使用海水或复配海盐时，可对海水和复配海盐的量做适当调整，以将其所含的对应于海盐的成分的含量控制在上述范围之内。换言之，本文中所用的“2.5～36g/L的海盐替代物”指的是海水或复配海盐中对应于海盐的成分的浓度。
发酵培养基中还可含有氮源。所用氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆蛋白、氨基酸、氨基酸盐、蛋白质、玉米浆、动物性副产品、无机铵盐、氨水等。优选的，使用蛋白胨和酵母粉。发酵培养基中氮源的含量为产脂微生物发酵培养基中氮源的常规含量。例如，氮源的总含量占发酵培养基重量的1～5wt％，如1～3wt％等。在某些实施方案中，使用1.0～3.0wt％的蛋白胨和1.0～3.0wt％的酵母粉作为发酵培养基中的氮源。
发酵培养基的pH通常在6.5～7.0的范围内，优选6.8±0.1。虽然本发明使用乳酸或丙酸作为碳源，在配置培养基时，可使用其它的酸或碱来调节pH。
因此，在某些实施方案中，发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在其它实施方案中，发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在其它实施方案中，发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在其它实施方案中，发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。
在某些实施方案中，本发明涉及提高C13:0、C15:0和C21:0的产率的方法，该方法包括使用本文所述的含丙酸和/或丙酸盐的发酵培养基发酵产脂微生物。例如，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0；或者含有0.5～3.0wt％的丙酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。优选地，所述产脂微生物是裂壶藻。
在某些实施方案中，本发明涉及提高C17:0的产率的方法，所述方法包括使用本文所述的含乳酸和/或乳酸盐的发酵培养基发酵产脂微生物。例如，所述发酵培养基含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0；或者含有0.5～3.0wt％的乳酸或其盐，0.5～3.0wt％的葡萄糖或甘油，1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和任选的2.5～36g/L、优选12～24g/L的海盐或其替代物，pH为6.5～7.0。优选地，所述产脂微生物是裂壶藻。
在优选的实施方式中，本发明涉及使用本文所述的各含乳酸和/或乳酸盐的发酵培养基发酵产脂微生物的方法。
本发明还包括丙酸和/或丙酸盐在生产奇数碳脂肪酸或提高奇数碳脂肪酸产量中的应用，以及乳酸和/或乳酸盐在生产奇数碳脂肪酸或提高奇数碳脂肪酸产量中的应用。所述应用优选为在本文所述的产脂微生物发酵中的应用。
本发明当然也包括(i)丙酸和/或丙酸盐，和/或(ii)乳酸和/或乳酸盐在制备产脂微生物发酵培养基中的应用。
适用于本发明的发酵条件，如温度、压力、时间等均为本领域用于发酵所述产脂微生物的常规发酵温度、压力和时间。作为一个例子，本发明在发酵裂壶藻时，发酵温度为室温(23～30℃)，发酵压力为常压，发酵时间为1～10天。
在本发明的具体实施例中，本发明以裂殖壶菌为生产菌株，以本领域研究者熟知的方法进行摇瓶发酵培养。所用培养基采用葡萄糖或甘油，额外添加丙酸盐或乳酸盐为碳源，以蛋白胨、酵母粉为氮源，以海盐提供海藻生长所需的渗透压和微量元素，显著提高了裂壶藻奇数碳脂肪酸合成的能力，比现有公开的水平增加至少一倍。采用的方法为发酵优化，比转基因改造方法更安全、简单。本发明达到的奇数碳脂肪酸的含量可以比现有公开的含量增加110％，比相同菌株的含量提高150％。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明。实施例中所采用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。若非特别说明，均购自上海生工，海盐购自天津中盐海洋生物科学有限公司。
对比例1
Chang等〔Fatty acid shifts and metabolic activity changes ofSchizochytriumn sp.S31cultured on glycerol,Broresource Technology 2013，142：255-260〕使用甘油、酵母粉和硫酸钠复配海盐培养ATCC 20888，在发酵罐中使用挡板三角瓶培养裂壶藻ATCC 20888，培养基为100g/L的葡萄糖或甘油，40g/L酵母粉，1g/L硫酸铵，1g/L磷酸二氢钾，12g/L硫酸钠，3g/L硫酸镁，5g/L硫酸钾，1g/L氯化钾，0.02g/L氯化钙，0.0052g/L氯化锰，0.0052g/L硫酸锌，0.0008g/L硫酸铜，0.000016g/L钼酸钠，0.008g/L硫酸镍，0.01g/L硫酸亚铁，0.000066g/L氯化钴，0.00076g/L硫胺素，0.0012g/L，0.0256g/L泛酸钙，pH6.5-7.5，28℃，在250rpm下摇床培养64h。
培养结束后，室温下4000rpm离心5min收集细胞，将菌体在60℃烘箱中烘干至恒重并计算生物量干重。干菌体在研磨中磨成粉，使用文献〔蒋霞敏，郑亦周，14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究，《水生生物学报》，2003，27(3):243-247〕公开的方法提取总脂质、甲酯化及气相色谱分析。
发酵后菌体脂肪酸合成情况见下表1。
表1
从表1可以看出，裂壶藻ATCC 20888中，仅发现奇数碳脂肪酸(C15，C17)两种，未发现C21或C23碳脂肪酸。以甘油为碳源，摇瓶发酵，奇数碳脂肪酸产率最高仅为0.16g/L，葡萄糖为碳源，奇数碳脂肪酸的最高产率仅为0.02g/L。推测聚酮合成酶系统(PKS系统)仅利用乙酰辅酶A作为起始单位，不会合成奇数碳脂肪酸。因此奇数碳脂肪酸的合成仅与脂肪酸合成酶系统(FAS系统)有关。
实施例1
丙酰辅酶A可能是奇数碳脂肪酸合成的直接前体，而丙酸是丙酰辅酶A的前体。本实施例向裂壶藻(ATCC 20888)培养基中添加丙酸，进行裂壶藻的高供氧发酵。在2％丙酸，2％蛋白胨、1％酵母粉，18g/L海盐，pH6.8。培养条件为50ml培养液装入250ml挡板三角瓶中，在28℃250rpm摇床培养5天。根据对比例1所述的方法提取脂质并进行气相色谱分析，结果如下表2所示。
表2
从上表可以看出，单独使用丙酸作为碳源，奇数碳脂肪酸在胞内的含量达到总脂肪酸含量的38％，显著高于使用葡萄糖时的0.09％或使用甘油时的0.72％。
实施例2
本实施例使用丙酸盐与葡萄糖作为碳源进行发酵。碳源为葡萄糖+丙酸钠(1％+1％)混合碳源、其余组分为1％酵母粉、2％蛋白胨、18g/L海盐，pH6.8。挡板三角瓶，装液量50ml/250ml。28℃摇床200rpm培养5天。培养后，根据对比例1所述方法提取菌体脂质，分析脂肪酸组成并与前期实验进行对比，结果如下表3所示。
表3
| 脂肪酸(％) | 葡萄糖(1％)+丙酸钠(1％) | 丙酸钠(2％) |
| C13:0 | 7.96 | 8.245 |
| C14:0 | 12.498 | 6.915 |
| C15:0 | 21.174 | 19.973 |
| C16:0 | 13.856 | 13.591 |
| C17:0 | 4.26 | 4.417 |
| C18:0 | 15.167 | 25.568 |
| C18:1 | 16.776 | 15.581 |
| C21:0 | 8.31 | 5.71 |
| DPA | 0 | 0 |
| DHA | 0 | 0 |
| ODD FA | 41.704 | 38.345 |
| DCW | 2.7 | 2.1 |
由表3可以看出，使用复合碳源培养，奇数碳脂肪酸的总含量有所增加。
实施例3
本实施例采用乳酸(羟基丙酸)为碳源。使用葡萄糖+乳酸钠(1％+1％)混合碳源、仅乳酸钠碳源(2％)两种碳源培养，其余组分为1％酵母粉、2％蛋白胨、18g/L人造海盐，pH6.8。挡板三角瓶，装液量50ml/250ml。28℃摇床200rpm培养5天。培养后，根据对比例1所述方法提取菌体脂质，分析脂肪酸组成并与前期实验对比，结果如下表5所示。
表4
| 脂肪酸(％) | 葡+乳 | 葡+丙 | 乳 | 丙 |
| C13:0 | 0.888 | 7.96 | 2.74 | 8.245 |
| C14:0 | 0.657 | 12.498 | 3.393 | 6.915 |
| C15:0 | 12.243 | 21.174 | 14.185 | 19.973 |
| C16:0 | 11.411 | 13.856 | 10.229 | 13.591 |
| C17:0 | 10.005 | 4.26 | 12.192 | 4.417 |
| C18:0 | 3.361 | 15.167 | 6.136 | 25.568 |
| C18:1 | 8.331 | 16.776 | 6.615 | 15.581 |
| C21:0 | 0.378 | 8.31 | 2.244 | 5.71 |
| DPA | 11.161 | 0 | 9.145 | 0 |
| DHA | 34.937 | 0 | 32.112 | 0 |
| ODD FA | 23.524 | 41.704 | 32.37 | 38.345 |
| 干重 | 7.8 | 2.7 | 4.5 | 2.1 |
根据表4的结果，采用单乳酸盐碳源的发酵，生物量(干重)跟丙酸碳源的培养相比，有了100％的提高而且其奇数碳脂肪酸的含量达到32％，远高于对比例1或公开文献披露的含量。而且其DHA的含量保持在较高的水平。以乳酸盐、葡萄糖混合发酵，虽然奇数碳脂肪酸的含量低于仅使用乳酸或丙酸，但依然远高于现有文献公开的最高含量。
Claims (8)
1.提高产脂微生物奇数碳脂肪酸C13:0、C15:0和C21:0的产率的方法，其特征在于，所述方法包括在发酵培养基中发酵产脂微生物；其中，所述发酵培养基的碳源由乳酸和/或乳酸盐和任选的葡萄糖组成；所述产脂微生物是裂壶藻；所述乳酸或乳酸盐的含量为0.8～2.0wt％；其中，所述发酵培养基含有葡萄糖与所述乳酸和/或乳酸盐时，葡萄糖与乳酸和/或乳酸盐的重量比为1：3～3：1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸盐选自乳酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐、铵盐和铜盐中的一种或多种的混合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还含有：
氮源，选自蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆蛋白、氨基酸、氨基酸盐、蛋白质、玉米浆、动物性副产品、无机铵盐和氨水中的一种或多种；以及
海水、海盐或含有选自氯化钠、硫酸钠、磷酸钠盐、磷酸钾盐、硫酸钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、氯化钾、氯化钙、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化钴的盐以及选自硫胺素和泛酸钙的维生素的组合；
其中，所述乳酸和/或乳酸盐占发酵培养基碳源总量的30～100%；
所述发酵培养基的pH为6.5～7.0。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸和/或乳酸盐占发酵培养基碳源总量的40～100%。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳酸和/或乳酸盐占发酵培养基碳源总量的50～100%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
以发酵培养基总重计，所述发酵培养基的碳源为0.8～2.0wt％的乳酸或其盐，且含有1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和2.5～36g/L的海盐，pH为6.5～7.0；或
以发酵培养基总重计，所述发酵培养基的碳源为0.8～2.0wt％的乳酸或其盐和0.5～3.0wt％的葡萄糖，且含有1.0～3.0wt％的蛋白胨，1.0～3.0wt％的酵母粉，和2.5～36g/L的海盐，pH为6.5～7.0。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述海盐的浓度为12～24g/L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基还含有：
氮源，选自蛋白胨、酵母粉、尿素、硝酸盐、亚硝酸盐、大豆蛋白、氨基酸、氨基酸盐、蛋白质、玉米浆、动物性副产品、无机铵盐和氨水中的一种或多种；以及
海水、海盐或含有选自氯化钠、硫酸钠、磷酸钠盐、磷酸钾盐、硫酸钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、氯化钾、氯化钙、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、钼酸钠、硫酸镍、硫酸亚铁、氯化钴的盐以及选自硫胺素和泛酸钙的维生素的组合；
其中，所述发酵培养基的pH为6.5～7.0。
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