JP7097805B2 - 脂質製造のための工程 - Google Patents

脂質製造のための工程 Download PDF

Info

Publication number
JP7097805B2
JP7097805B2 JP2018242706A JP2018242706A JP7097805B2 JP 7097805 B2 JP7097805 B2 JP 7097805B2 JP 2018242706 A JP2018242706 A JP 2018242706A JP 2018242706 A JP2018242706 A JP 2018242706A JP 7097805 B2 JP7097805 B2 JP 7097805B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plant
seq
algae
polypeptide
polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018242706A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019088285A (ja
Inventor
トーマス・ヴァンハーケ
ジェームズ・ロバートソン・ペトリー
アンナ・エル・ターチー
スリンダー・パル・シン
キン・リウ
Original Assignee
コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション filed Critical コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション
Publication of JP2019088285A publication Critical patent/JP2019088285A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7097805B2 publication Critical patent/JP7097805B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L5/00—Solid fuels
    • C10L5/40—Solid fuels essentially based on materials of non-mineral origin
    • C10L5/44—Solid fuels essentially based on materials of non-mineral origin on vegetable substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10B—DESTRUCTIVE DISTILLATION OF CARBONACEOUS MATERIALS FOR PRODUCTION OF GAS, COKE, TAR, OR SIMILAR MATERIALS
    • C10B53/00—Destructive distillation, specially adapted for particular solid raw materials or solid raw materials in special form
    • C10B53/02—Destructive distillation, specially adapted for particular solid raw materials or solid raw materials in special form of cellulose-containing material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B3/00—Hydrogen; Gaseous mixtures containing hydrogen; Separation of hydrogen from mixtures containing it; Purification of hydrogen
    • C01B3/02—Production of hydrogen or of gaseous mixtures containing a substantial proportion of hydrogen
    • C01B3/22—Production of hydrogen or of gaseous mixtures containing a substantial proportion of hydrogen by decomposition of gaseous or liquid organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/40—Carbon monoxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/48—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
    • C10G2/00—Production of liquid hydrocarbon mixtures of undefined composition from oxides of carbon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10G—CRACKING HYDROCARBON OILS; PRODUCTION OF LIQUID HYDROCARBON MIXTURES, e.g. BY DESTRUCTIVE HYDROGENATION, OLIGOMERISATION, POLYMERISATION; RECOVERY OF HYDROCARBON OILS FROM OIL-SHALE, OIL-SAND, OR GASES; REFINING MIXTURES MAINLY CONSISTING OF HYDROCARBONS; REFORMING OF NAPHTHA; MINERAL WAXES
    • C10G2/00—Production of liquid hydrocarbon mixtures of undefined composition from oxides of carbon
    • C10G2/30—Production of liquid hydrocarbon mixtures of undefined composition from oxides of carbon from carbon monoxide with hydrogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10J—PRODUCTION OF PRODUCER GAS, WATER-GAS, SYNTHESIS GAS FROM SOLID CARBONACEOUS MATERIAL, OR MIXTURES CONTAINING THESE GASES; CARBURETTING AIR OR OTHER GASES
    • C10J3/00—Production of combustible gases containing carbon monoxide from solid carbonaceous fuels
    • C10J3/72—Other features
    • C10J3/82—Gas withdrawal means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C10L1/026—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only for compression ignition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/10—Liquid carbonaceous fuels containing additives
    • C10L1/14—Organic compounds
    • C10L1/18—Organic compounds containing oxygen
    • C10L1/19—Esters ester radical containing compounds; ester ethers; carbonic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/001—Refining fats or fatty oils by a combination of two or more of the means hereafter
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/006—Refining fats or fatty oils by extraction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/10—Refining fats or fatty oils by adsorption
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B3/00—Refining fats or fatty oils
    • C11B3/12—Refining fats or fatty oils by distillation
    • C11B3/14—Refining fats or fatty oils by distillation with the use of indifferent gases or vapours, e.g. steam
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B7/00—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils
    • C11B7/0075—Separation of mixtures of fats or fatty oils into their constituents, e.g. saturated oils from unsaturated oils by differences of melting or solidifying points
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/003—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with alcohols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01101—Alpha-1,3-mannosyl-glycoprotein 2-beta-N-acetylglucosaminyltransferase (2.4.1.101)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B2203/00—Integrated processes for the production of hydrogen or synthesis gas
    • C01B2203/12—Feeding the process for making hydrogen or synthesis gas
    • C01B2203/1205—Composition of the feed
    • C01B2203/1211—Organic compounds or organic mixtures used in the process for making hydrogen or synthesis gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10J—PRODUCTION OF PRODUCER GAS, WATER-GAS, SYNTHESIS GAS FROM SOLID CARBONACEOUS MATERIAL, OR MIXTURES CONTAINING THESE GASES; CARBURETTING AIR OR OTHER GASES
    • C10J2300/00—Details of gasification processes
    • C10J2300/09—Details of the feed, e.g. feeding of spent catalyst, inert gas or halogens
    • C10J2300/0903—Feed preparation
    • C10J2300/0906—Physical processes, e.g. shredding, comminuting, chopping, sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10J—PRODUCTION OF PRODUCER GAS, WATER-GAS, SYNTHESIS GAS FROM SOLID CARBONACEOUS MATERIAL, OR MIXTURES CONTAINING THESE GASES; CARBURETTING AIR OR OTHER GASES
    • C10J2300/00—Details of gasification processes
    • C10J2300/09—Details of the feed, e.g. feeding of spent catalyst, inert gas or halogens
    • C10J2300/0913—Carbonaceous raw material
    • C10J2300/0916—Biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10J—PRODUCTION OF PRODUCER GAS, WATER-GAS, SYNTHESIS GAS FROM SOLID CARBONACEOUS MATERIAL, OR MIXTURES CONTAINING THESE GASES; CARBURETTING AIR OR OTHER GASES
    • C10J2300/00—Details of gasification processes
    • C10J2300/16—Integration of gasification processes with another plant or parts within the plant
    • C10J2300/164—Integration of gasification processes with another plant or parts within the plant with conversion of synthesis gas
    • C10J2300/1656—Conversion of synthesis gas to chemicals
    • C10J2300/1659—Conversion of synthesis gas to chemicals to liquid hydrocarbons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10J—PRODUCTION OF PRODUCER GAS, WATER-GAS, SYNTHESIS GAS FROM SOLID CARBONACEOUS MATERIAL, OR MIXTURES CONTAINING THESE GASES; CARBURETTING AIR OR OTHER GASES
    • C10J2300/00—Details of gasification processes
    • C10J2300/18—Details of the gasification process, e.g. loops, autothermal operation
    • C10J2300/1846—Partial oxidation, i.e. injection of air or oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C10L2200/0476—Biodiesel, i.e. defined lower alkyl esters of fatty acids first generation biodiesel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2200/00—Components of fuel compositions
    • C10L2200/04—Organic compounds
    • C10L2200/0461—Fractions defined by their origin
    • C10L2200/0469—Renewables or materials of biological origin
    • C10L2200/0492—Fischer-Tropsch products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2270/00—Specifically adapted fuels
    • C10L2270/02—Specifically adapted fuels for internal combustion engines
    • C10L2270/026—Specifically adapted fuels for internal combustion engines for diesel engines, e.g. automobiles, stationary, marine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/02—Combustion or pyrolysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/04—Gasification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/06—Heat exchange, direct or indirect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/26—Composting, fermenting or anaerobic digestion fuel components or materials from which fuels are prepared
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/28—Cutting, disintegrating, shredding or grinding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/30—Pressing, compressing or compacting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/42—Fischer-Tropsch steps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L2290/00—Fuel preparation or upgrading, processes or apparatus therefore, comprising specific process steps or apparatus units
    • C10L2290/54—Specific separation steps for separating fractions, components or impurities during preparation or upgrading of a fuel
    • C10L2290/544—Extraction for separating fractions, components or impurities during preparation or upgrading of a fuel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E20/00—Combustion technologies with mitigation potential
    • Y02E20/16—Combined cycle power plant [CCPP], or combined cycle gas turbine [CCGT]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E20/00—Combustion technologies with mitigation potential
    • Y02E20/16—Combined cycle power plant [CCPP], or combined cycle gas turbine [CCGT]
    • Y02E20/18—Integrated gasification combined cycle [IGCC], e.g. combined with carbon capture and storage [CCS]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Description

本発明は、脂質を製造する方法に関する。具体的には、本発明は、トランスジェニック生物またはその一部における、１以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量を増加させる方法に関する。１つの特定の実施形態において、本発明は、植物の種子および／または葉を含む、植物またはその任意の部分、藻類ならびに菌類における、１以上の、モノアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、ジアシルグリセロール アシルトランストランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、油体タンパク質、および／または、デンプン生合成および脂肪酸不飽和化経路における重要な酵素段階を抑制しながら、１つ以上の非極性脂質のレベルおよび／または非極性脂質の総含量および／または一価不飽和脂肪酸含量を増加させる、脂質生合成を調節する転写因子、の任意の組み合わせに関する。
世界のエネルギー、特に輸送に関するエネルギーの大部分は、有限の石油から得られる燃料により供給されている。たとえば、生物的に生成される油等の、再生可能な代替原料が必要とされている。
トリアシルグリセロール生合成
トリアシルグリセロール類（ＴＡＧ）は、種子中の脂質の主形態を構成し、エステル化されグリセロール主鎖となる３つのアシル鎖から構成される。脂肪酸は、アシル－アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）中間体として、最初の不飽和化触媒を受けることができる色素体中で合成される。この反応は、ステアロイル－ＡＣＰデサチュラーゼ（不飽和化酵素）により触媒され、オレイン酸（Ｃ１８：１Δ９）を生成する。次いで、アシル鎖は、アシル－コエンザイム（ＣｏＡ）エステルとして細胞質および小胞体（ＥＲ）へと移送される。主要なＴＡＧ生合成経路（Ｋｅｎｎｅｄｙ経路またはグリセロール３リン酸（Ｇ３Ｐ）経路としてもまた知られる）に入る前に、アシル鎖は、通常、ＥＲ膜のリン脂質へと組み込まれ、さらなる不飽和化を受けることができる。多価不飽和脂肪酸の産生における２つの重要な酵素は、膜結合ＦＡＤ２およびＦＡＤ３デサチュラーゼであり、それらは、それぞれ、リノール酸（Ｃ１８：２Δ９、１２）およびαリノレン酸（Ｃ１８：３Δ９、１２、１５）を産生する。
Ｋｅｎｎｅｄｙ経路を介したＴＡＧ生合成は、引き続く一連のアシル化（各々、アシル－ドナーとして、アシル－ＣｏＡエステルを用いる）から構成される。最初のアシル化のステップは、主に、Ｇ３Ｐ主鎖のｓｎ１－位で発生し、グリセロール３リン酸アシルトランスフェラーゼ（ｓｎ１-ＧＰＡＴ）により触媒される。産生物である、ｓｎ１－リゾホスファチジン酸（ｓｎ１－ＬＰＡ）は、第二のアシル鎖をｓｎ２－位で連結させ、ホスファチジン酸を形成するリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）の基質として供される。ＰＡはさらに、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）によりジアシルグリセロール（ＤＡＧ）へと脱リン酸化され、それによって、最後のアシル化ステップの基質がもたらされる。最後に、３番目のアシル鎖が、ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）により触媒される反応においてＤＡＧのｓｎ３－位でエステル化され、油体に蓄積されるＴＡＧを形成する。２番目の酵素反応である、ホスファチジルグリセロール・アシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）によっても、ＤＡＧからＴＡＧへの転換がもたらされる。この反応は、ＤＧＡＴとは関連が無く、アシル－ドナーとして、リン脂質を使用する。
脂質の商用生産量を最大化するために、トランスジェニック生物またはそれらの一部（たとえば植物、種子、葉、藻類および菌類）における、脂質、特に、たとえばＤＡＧおよびＴＡＧ等の非極性脂質のレベルを上げる手段がさらに求められている。植物における中性脂質の産生量を上げる試みは、主に、脂肪酸生合成またはＴＡＧアセンブリに関連する個々の重要な酵素ステップに焦点が置かれてきた。しかしこれらの戦略は、種子の油体または葉の油体において、ほどほどの増加をもたらしたのみであった。油性酵母Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおける近年の代謝工学研究により、グリセロール３リン酸産生の増加と、β酸化を介したＴＡＧ分解の阻害を組み合わせたアプローチにより、総脂質含量の累積的増加がもたらされたことが示された（Dulermo et al., 2011）。
米国特許出願２０１０００２２１４００
たとえば種子油のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）等の植物油は、料理用途（ショートニング、テクスチャ、フレーバー）、工業用途（石鹸、蝋燭、香料、化粧品、適切な乾燥剤、絶縁体、潤滑剤）等の多くの用途があり、そして栄養的な価値がある。また、バイオ燃料産生のための植物油の使用に、注目が集まってきている。
脂質の商用生物的生産を最大化するために、脂質、特に非極性脂質（たとえば、ＤＡＧおよびＴＡＧ等）の、トランスジェニック生物またはその一部（たとえば植物、種子、葉、藻および菌類等）におけるレベルを増加させるためのさらなる手段が必要とされている。
本発明者らは、脂質生合成および脂質アセンブリ経路双方の操作により、生物、特に植物の生育部位および種子における、脂質含量が著しく増加することを示した。遺伝子の様々な組み合わせを用いて、油含量の十分な増加を得ることができ、それはバイオ燃料および油から生産される他の工業製品の生産にとって大きな意義がある。
第一の態様において、本発明は、非極性脂質を高レベルで含有する生育植物部分（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｐａｒｔ）または非ヒト生物もしくはそれらの一部から、工業製品を産生する方法を提供する。
他の実施形態において、本発明は、工業製品の製造方法を提供し、当該方法は、以下のステップを含む：
ｉ）少なくとも約３％、好ましくは少なくとも約５％、または少なくとも約７％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質総含量を有する生育植物部分を得ること、
ｉｉ）加熱手段、化学的手段もしくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせにより、生育植物部位の脂質の少なくとも一部を、ｉｎ ｓｉｔｕで工業製品に転換すること、および、
ｉｉｉ）当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
他の実施形態において、工業製品を製造する方法には、以下の工ステップを含む：
ｉ）少なくとも約３％、好ましくは少なくとも約５％、または少なくとも約７％（ｗ／ｗ乾重量）の非極性脂質総含量を有する生育植物部位を得ること、
ｉｉ）ステップｉ）の植物部位を物理的に処理すること、
ｉｉｉ）加熱手段、化学的手段、もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを、当該処理された生育植物部位中の脂質に与えることにより、当該処理された生育植物部位の脂質の少なくとも一部を工業製品へと転換すること、および、
ｉｖ）当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
他の実施形態において、工業製品を製造する方法には、以下のステップが含まれる：
ｉ）１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、非ヒト生物またはその一部を得ることであって、ここで、１以上の外因性ポリヌクレオチドの各々は、非ヒト生物またはその一部において、当該ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターと動作可能に連結され、および、当該非ヒト生物またはその一部は、当該１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、１以上の非極性脂質のレベルが増加していること、および、
ｉｉ）加熱手段、化学的手段もしくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせにより、非ヒト生物またはその一部の、少なくとも一部の脂質をｉｎ ｓｉｔｕで、工業製品へと転換すること、および、
ｉｉｉ）当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
さらなる実施形態において、工業製品を製造する方法には、以下のステップが含まれる：
ｉ）１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む非ヒト生物またはその一部を得ることであって、ここで、当該非ヒト生物またはその一部は、当該１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、１以上の非極性脂質のレベルが増加していること、
ｉｉ）ステップｉ）の非ヒト生物またはその一部を物理的に処理すること、
ｉｉｉ）当該処理された非ヒト生物またはその一部の、少なくとも一部の脂質を、加熱手段、化学的手段もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを当該処理された非ヒト生物またはその一部の脂質へと適用することにより、工業製品へと転換すること、
ｉｖ）当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
上述の各実施形態において、当業者であれば、当該転換ステップが、物理的処理ステップと同時、または引き続いて行われうることを、理解するであろう。
上述の核実施形態において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部（好ましくは、植物の葉もしくはその一部、茎または茎塊）の非極性総脂質含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ乾重量）である。さらに好ましい実施形態において、非極性総脂質含量は、５％と２５％の間、７％と２５％の間、１０％と２５％の間、１２％と２５％の間、１５％と２５％の間、７％と２０％の間、１０％と２０％の間、１０％と１５％の間、１５％と２０％の間、２０％と２５％の間、１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％または、約２２％（それぞれ、乾重量のパーセント）である。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその部分である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
さらに、上述の実施形態の各々において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、好ましくは植物の葉またはその一部、茎または茎塊の総ＴＡＧ含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、より好ましくは少なくとも約１５％、またはより好ましくは少なくとも約１７％（ｗ／ｗ乾重量）である。さらに好ましい実施形態において、総ＴＡＧ含量は、５％と３０％の間、７％と３０％の間、１０％と３０％の間、１２％と３０％の間、１５％と３０％の間、７％と３０％の間、１０％と３０％の間、２０％と２８％の間、１８％と２５％の間、２２％と３０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％（それぞれ、乾重量のパーセント）である。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその部分である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
さらに、上述の実施形態の各々において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、好ましくは植物の葉またはその一部、茎または茎塊の総脂質含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約１７％（ｗ／ｗ乾重量）、より好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％である。さらに好ましい実施形態において、総脂質含量は、５％と３５％の間、７％と３５％の間、１０％と３５％の間、１２％と３５％の間、１５％と３５％の間、７％と３５％の間、１０％と２０％の間、１８％と２８％の間、２０％と２８％の間、２２％と２８％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、約２２％または約２５％（それぞれ、乾重量のパーセント）である。通常、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の総脂質含量は、非極性脂質含量よりも約２～３％高い。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその部分である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
工業製品は、たとえば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび／もしくは脂肪酸エチルエステル等の炭化水素製品、たとえばメタン、エタンもしくはより長い鎖のアルカン類等のアルカン、より長い鎖のアルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素および／もしくは水素ガス、たとえばエタノール、プロパノール、もしくはブタノール等のバイオアルコール、バイオ炭（ｂｉｏｃｈａｒ）、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の組み合わせであり得る。工業製品は、これらの成分の任意の混合物であっても良く、たとえば、アルカン類、またはアルカン類およびアルケン類の混合物、好ましくは、大部分（５０％超）がＣ４～Ｃ８アルカン類、または大部分がＣ６～Ｃ１０アルカン類または大部分がＣ６～Ｃ８アルカン類である混合物であっても良い。工業製品は、二酸化炭素ではなく、および、水ではないが、これらの分子は、工業製品と一緒に生産されうる。工業製品は、大気圧／室温で、ガスであっても良く、または好ましくは、液体、またはたとえばバイオ炭等の固体であっても良く、または、工程により、ガス成分、液体成分および固体成分の組み合わせ（たとえば、一酸化炭素、水素ガス、アルカン類およびバイオ炭）が製造されてもよく、それらは、次いで、分離されても良い。ある実施形態において、炭化水素製品は、大部分が脂肪酸メチルエステルである。他の実施形態において、炭化水素製品は、脂肪酸メチルエステル以外の製品である。
工業製品は、たとえば脂肪酸を含む製品等の中間体製品であってもよく、それは次いで、たとえば、脂肪酸エステルへのトランス－エステル化により、たとえばバイオ燃料等に転換することができる。
たとえば、熱分解、燃焼、ガス化により、または酵素的分解（嫌気的分解、たい肥化、発酵を含む）と共に、当該方法において加熱を適用させても良い。低い温度のガス化は、たとえば、約７００℃～約１０００℃の間で、行われる。高い温度のガス化は、たとえば、約１２００℃～１６００℃の間で行われる。低い温度の熱分解（遅い熱分解）は、たとえば、約４００℃で行われ、一方、高い温度の熱分解は、たとえば、約５００℃で行われる。中温性分解は、たとえば、約２０℃と約４０℃の間で行われる。高温分解は、たとえば、約５０℃～約６５℃の間で行われる。
化学的手段には、限定されないが、触媒クラッキング、嫌気性分解、発酵、たい肥化およびトランスエステル化が挙げられる。１つの実施形態において、化学的手段は、触媒または触媒の混合物を使用し、加熱と共に適用されてもよい。その工程は、同種の触媒、異種の触媒、および／または酵素触媒を用いても良い。１つの実施形態において、触媒は、遷移金属触媒、分子篩型触媒、活性化アルミナ触媒、または炭酸ナトリウムである。触媒としては、たとえば硫酸等の酸触媒、または水酸化カリウムもしくは水酸化ナトリウムもしくは他の水酸化物等のアルカリ触媒が挙げられる。化学的手段は、脂質中の脂肪酸のトランスエステル化を含んでもよく、その工程で同種触媒、異種触媒および／または酵素触媒を使用しても良い。転換は、熱を与える熱分解を含んでも良く、ならびに、化学的手段を適用しても良く、および、遷移金属触媒、分子篩型触媒、活性化アルミナ触媒、および／または炭酸ナトリウムを使用しても良い。
酵素的手段には、限定されないが、たとえば嫌気的分解、発酵もしくはたい肥化における、微生物による分解、または組換え酵素タンパク質による分解が挙げられる。
本発明の本態様において工業製品へと転換される脂質は、生育植物部分（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｐａｒｔ）または非ヒト生物もしくはその一部中の非極性脂質の一部またはすべてであっても良く、または、好ましくは、当該転換物には、少なくとも非極性脂質の一部、および少なくとも極性脂質の一部が入っており、ならびに、さらに好ましくは、実質的に生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部中の脂質（極性および非極性の両方）のすべてが、工業製品（複数含む）へと転換される。
１つの実施形態において、工業製品への脂質の転換は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の物理的な破壊を伴わず、ｉｎ ｓｉｔｕで行われる。この実施形態において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部は、最初に乾燥（たとえば、熱を与えることにより）させてもよく、または、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部を、乾燥させることなく、実質的に採取された状態で用いても良い。別の実施形態において、当該工程は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の物理的処理ステップを含む。物理的処理は、生育植物部分、非ヒト生物またはその一部を回転、プレス（たとえば押圧剥離）、破砕または研削することのうち１つ以上を含んでもよく、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の乾燥と組み合わせてもよい。たとえば、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部を、最初に、実質的に乾燥させ、次いで、次の処理が容易になるよう、細かな材料へと挽いてもよい。
１つの実施形態において、当該方法において用いられる生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の重量は、少なくとも１ｋｇ、または好ましくは少なくとも１トン（乾重量）のプールされた生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部である。当該工程は、たとえば野外で成長した少なくとも１００または１０００の植物から、生育植物部分を採集し、少なくとも１０００のそのような（すなわち、実質的に同一である）生育植物部分の収集物を得る第一のステップをさらに含有してもよい。好ましくは、生育植物部分は、非極性脂質の産生量が最大となった時点で、採集される。１つの実施形態において、生育植物部分は、花が咲いた頃に、採集される。他の実施形態において、生育植物部分は、花が咲いた頃から枯れ始める頃の間に採集される。他の実施形態において、生育植物部分は、植物が少なくとも約１か月齢となった時点で採集される。
当該工程は、転換ステップの前に、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の非極性脂質含有物の一部を抽出することをさらに含んでも、含まなくても良い。１つの実施形態において、当該工程は、
（ａ）生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の非極性脂質含有物の少なくとも一部を、非極性脂質として、抽出すること、および、
（ｂ）当該抽出された非極性脂質を回収すること、
のステップを含み、
（ａ）および（ｂ）のステップは、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部中の脂質の少なくとも一部を工業製品へと転換させるステップの前に実施される。最初に抽出される非極性脂質の割合は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部中の総非極性脂質の、５０％未満、または５０％超、または好ましくは少なくとも７５％であり得る。この実施形態において、抽出される非極性脂質は、トリアシルグリセロールを含み、ここで、当該トリアシルグリセロールは、抽出された脂質の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％を構成する。抽出された脂質は、それ自体、それ自体の脂質以外（たとえばトランスエステル化により脂肪酸エステル等）の工業製品へと、転換されても良い。
２番目の態様において、本発明により、非ヒト生物またはその一部から抽出される脂質を製造する工程が提供される。
１つの実施形態において、本発明により、抽出脂質を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）１以上の外因性ポリヌクレオチドおよび、それぞれに１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、高いレベルの１以上の非極性脂質を含む非ヒト生物またはその一部を得ること、
ｉｉ）非ヒト生物またはその一部から脂質を抽出すること、および、
ｉｉｉ）当該抽出脂質を回収すること、
それにより、抽出脂質を製造するであって、ここで、各１以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部において、当該ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、および、以下の特長の１つ以上またはすべてが該当する：
（ａ）１以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部において、１以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるＲＮＡまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、１以上の非極性脂質の生合成に関与するＲＮＡまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
（ｂ）もし非ヒト生物が植物である場合、植物の生育部分が、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ乾重量）の総非極性脂質含量を有している、
（ｃ）非ヒト生物が、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類からなる群から選択される藻類である、
（ｄ）１以上の非極性脂質は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖）またはそれらの２以上の組み合わせ、または、前述の基、結合もしくは鎖の任意の２、３、４、５もしくは６つを含む脂肪酸を含む、
（ｅ）非極性脂質（複数含む）の総脂肪酸含有量が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の非極性脂質（複数含む）よりも、少なくとも２％多いオレイン酸および／または少なくとも２％少ないパルミチン酸を含む、
（ｆ）非極性脂質（複数含む）が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の非極性脂質（複数含む）と比較して、改変レベルの総ステロール類（好ましくは遊離（非エステル化）ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド）を含む、
（ｇ）非極性脂質（複数含む）が、ワックスおよび／またはワックスエステルを含む、
（ｈ）非ヒト生物またはその一部は、それぞれ、脂質が抽出される、少なくとも１０００のそのような非ヒト生物もしくはその一部の、プールされた群またはコレクションの一員である。
上述の（ｂ）の１つの実施形態において、総非極性脂質含有量は、５％と２５％の間、７％と２５％の間、１０％と２５％の間、１２％と２５％の間、１５％と２５％の間、７％と２０％の間、１０％と２０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％（それぞれ、乾重量のパーセント）である。
１つの実施形態において、非ヒト生物は藻類、またはたとえば菌類等の発酵に適した生物、または好ましくは植物である。非ヒト生物の一部は、種子、果実または植物の生育部分であり得る。好ましい実施形態において、植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。他の好ましい実施形態において、非ヒト生物は植物であり、当該部分は、植物の種子であり、そして抽出された脂質は種子油である。より好ましい実施形態において、植物は、油糧種子類由来であり、油生産のために商業的に用いられるか、または用いられ得るものである。その種類は、Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ （ｍａｃａｕｂａ ｐａｌｍ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ｍｕｒｕｍｕｒｕ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ （ｔｕｃｕｍａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ （Ｉｎｄａｉａ－ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ （Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｉｌ ｐａｌｍ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ （ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ （ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ （ｂａｂａｓｓｕ）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オーツ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（たとえばＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（カノーラ）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ （ｆａｌｓｅ ｆｌａｘ）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ （大麻）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ、サフラワー）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ｐｅｑｕｉ）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ （ココナッツ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ （Ａｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｋａｌｅ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ （Ａｆｒｉｃａｎ ｐａｌｍ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （大豆）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．たとえば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ （ｐｈｙｓｉｃ ｎｕｔ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ （ａｒａｒａ ｎｕｔ－ｔｒｅｅ）、Ｌｅｍｎａ ｓｐ．（ウキクサ）（たとえばＬｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌｅｍｎａ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（ｓｗｏｌｌｅｎ ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、Ｌｅｍｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｕｔａ、Ｌｅｍｎａ ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ、Ｌｅｍｎａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌｅｍｎａ ｔｅｎｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌｅｍｎａ ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｌｅｍｎａ ｙｕｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ （ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ｂｕｒｉｔｉ ｐａｌｍ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ （ｉｎａｊａ ｐａｌｍ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（たとえばＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ および Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．（タバコ）（たとえば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ または Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ （ｂａｃａｂａ－ｄｏ－ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ （ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ （ｂａｃａｂａ－ｄｅ－ｌｅｑｕｅ），Ｏｒｙｚａ ｓｐ．（イネ）（たとえば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ および Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ （スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ （ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ （アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ （Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ｃａｓｔｏｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ （ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ （ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（たとえば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ （ｃｕｐｕａｓｓｕ）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ （Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（小麦）（たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）および、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）からなる群から選択され得る。１つの実施形態において、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物は、Ｗｅｓｔａｒの亜種である。別の実施形態において、植物がＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓである場合、Ｗｅｓｔａｒ以外の亜種または栽培品種である。１つの実施形態において、植物は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ以外の種である。他の実施形態において、植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ以外の種である。別の実施形態において、植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ以外の種である。１つの実施形態において、植物は、たとえば、スイッチグラス等の多年生植物である。第二の態様の植物について記述される特長の各々は、第一の態様の生育植物部分に対して、必要な変更を加えて準用することができる。
１つの実施形態において、非ヒト生物は、たとえば油性酵母等の油性菌類である。
好ましい実施形態において、脂質は、抽出の前に、非ヒト生物またはその部分を乾燥させることなく、抽出される。抽出された脂質は、次いで、乾燥または分画化され、その含水量を減少させても良い。
この態様のさらなる実施形態において、本発明により、特定の油糧種子植物から抽出された脂質を製造する工程が提供される。１つの実施形態において、本発明により、抽出カノーラ油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも４５％の種子油を含むカノーラ（菜種、ｃａｎｏｌａ ｓｅｅｄ）の種を得ること、
ｉｉ）当該カノーラの種より油を抽出すること、および、
ｉｉｉ）当該油を回収することであって、当該回収された油は、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含むこと、それにより、カノーラ油が製造される。好ましい実施形態において、カノーラの種は、重量ベースで少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、または少なくとも５６％の油含量を有する。油含量は、通常通り採取され脱穀された種から抽出される油の量を測定することにより測定することができ、種の重量のパーセンテージ、すなわち、％（ｗ／ｗ）として、算出される。カノーラの種の含水量は、５％と１５％の間であり、好ましくは約８．５％である。１つの実施形態において、オレイン酸含量は、カノーラ油中の総脂肪酸の約５８％と６２％の間であり、好ましくは少なくとも６３％であり、および、パルミチン酸含量は、カノーラ油中の総脂肪酸の約４％～約６％である。好ましいカノーラ油は、１１０～１２０のヨード価および、３０ｐｐｍ未満のクロロフィルレベルを有する。
他の実施形態において、本発明により、抽出トウモロコシ種子油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも５％の種子油を含むトウモロコシの種子を得ること、
ｉｉ）当該トウモロコシの種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、トウモロコシ種子油を製造する。好ましい実施形態において、トウモロコシの種子は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、または少なくとも１３％の油含量を有する。トウモロコシ種子の含水量は、約１３％～約１７％であり、好ましくは約１５％である。好ましいトウモロコシ油は、約０．１％のトコフェロールを含む。
他の実施形態において、本発明により、抽出大豆油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも２０％の種子油を含む大豆の種子を得ること、
ｉｉ）当該大豆の種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、大豆油を製造する。好ましい実施形態において、大豆の種子は、種の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、または少なくとも３１％の油含量を有する。１つの実施形態において、オレイン酸含量は、大豆油中の総脂肪酸の約２０％～約２５％の間であり、好ましくは少なくとも３０％、リノール酸含量は、約４５％～約５７％の間であり、好ましくは４５％未満、および、パルミチン酸含量は、大豆油中の総脂肪酸の約１０％～約１５％であり、好ましくは１０％未満である。好ましくは、大豆種子のタンパク質含量は、乾重量ベースで約４０％であり、大豆種子の含水量は、約１０％～約１６％であり、好ましくは約１３％である。
他の実施形態において、本発明により、抽出ルピナス種子油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも１０％の種子油を含むルピナスの種子を得ること、
ｉｉ）当該ルピナスの種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、ルピナス種子油を製造する。好ましい実施形態において、ルピナスの種子は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、または少なくとも１６％の油含量を有する。
他の実施形態において、本発明により、抽出ピーナッツ油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも５０％の種子油を含むピーナッツを得ること、
ｉｉ）当該ピーナッツから油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、ピーナッツ油を製造する。好ましい実施形態において、ピーナッツの種子（ピーナッツ）は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、または少なくとも５６％の油含量を有する。１つの実施形態において、オレイン酸含量は、ピーナッツ油の総脂肪酸の約３８％～５９％の間であり、好ましくは少なくとも６０％、およびパルミチン酸含量は、ピーナッツ油中の総脂肪酸の約９％～約１３％であり、好ましくは９％未満である。
他の実施形態において、本発明により、抽出ヒマワリ油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも５０％の種子油を含むヒマワリの種子を得ること、
ｉｉ）当該ヒマワリの種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、ヒマワリ油を製造する。好ましい実施形態において、ヒマワリの種子は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、または少なくとも５５％の油含量を有する。
他の実施形態において、本発明により、抽出綿実油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも４１％の種子油を含む綿実を得ること、
ｉｉ）当該綿実から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、綿実油を生製造する。好ましい実施形態において、綿実は、種の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、または少なくとも５０％の油含量を有する。１つの実施形態において、オレイン酸含量は、綿実油中の総脂肪酸の約１５％～２２％の間であり、好ましくは少なくとも２２％、リノール酸含量は、約４５％～約５７％の間であり、好ましくは４５％未満、およびパルミチン酸含量は、綿実油中の総脂肪酸の約２０％～約２６％であり、好ましくは１８％未満である。１つの実施形態において、綿実油はまた、シクロプロパン化脂肪酸（たとえば、ステルクリン酸およびマルバリン酸）を含み、および、少量のゴシポールを含有しても良い。
他の実施形態において、本発明により、抽出サフラワー油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも３５％の種子油を含むサフラワーの種子を得ること、
ｉｉ）当該サフラワーの種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、サフラワー油を製造する。好ましい実施形態において、サフラワーの種子は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、または少なくとも４５％の油含量を有する。
他の実施形態において、本発明により、抽出亜麻仁油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも３６％の種子油を含む亜麻の種子を得ること、
ｉｉ）当該亜麻の種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、亜麻仁油を製造する。好ましい実施形態において、亜麻の種子は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％の油含量を有する。
他の実施形態において、本発明により、抽出カメリナ油を製造する工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）重量ベースで少なくとも３６％の種子油を含むＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａの種子を得ること、
ｉｉ）当該Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａの種子から油を抽出すること、
ｉｉｉ）油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含み、それによって、カメリナ油を製造する。好ましい実施形態において、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａの種子は、種子の重量ベース（ｗ／ｗ）で、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、または少なくとも４５％の油含量を有する。
第二の態様の工程は、Hom et al. (2007)に記述される近赤外反射分光法により、種子の油含量および／またはタンパク質含量を測定することもまた含み得る。
１つの実施形態において、本発明の第二の態様の工程は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部を部分的に、または完全に乾燥させること、および／または、抽出工程において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子を、回転させること、プレス（たとえば押圧剥離）、破砕すること、もしくは研削すること、またはこれらの方法の任意の組み合わせを含む。当該工程では、抽出工程において、特に含水量を下げるための前乾燥工程との組み合わせで、有機溶媒（たとえば、ｎ－ヘキサン等のヘキサン、またはイソヘキサンとｎ－ヘキサンの組み合わせ、またはブタン単独もしくはヘキサンとの組み合わせ）を用いて、脂質もしくは油を抽出、または抽出工程の効率を上げてもよい。
１つの実施形態において、当該工程は、抽出された脂質または油を、容器内にまとめることにより回収すること、ならびに／または、たとえば、抽出された脂質または油を、ガム除去すること、臭気除去すること、脱色すること、乾燥させること、および／もしくは、分画化すること等により抽出された脂質または種子油を精製すること、ならびに／または、少なくとも一部の、好ましくは実質的にすべてのワックスおよび／もしくはワックスエステルを、抽出された脂質または油から除去することを含む。当該工程は、抽出された脂質または油の脂肪酸組成を分析することを含んでも良く、たとえば、抽出された脂質または油の脂肪酸を脂肪酸メチルエステルへと転換し、ＧＣを用いてこれらを分析し、脂肪酸組成を測定する。脂質または油の脂肪酸組成は、その脂肪酸組成を変える脂質または油の任意の分画化の前に、測定される。抽出された脂質または油は、たとえば遊離脂肪酸等の脂質の誘導体が１つ以上および／または脂質型の混合物を含み得る。
１つの実施形態において、本発明の第二の態様の工程により、相当量の抽出脂質または抽出油が得られる。１つの実施形態において、抽出された脂質または油の量は、少なくとも１リットル、好ましくは少なくとも１０リットルである。好ましい実施形態において、抽出された脂質または油は、輸送または販売ができる状態でパッケージされている。
１つの実施形態において、抽出された脂質または油は、重量ベースで、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、または少なくとも９６％のＴＡＧを含む。抽出された脂質または油は、少量の成分として、重量で約８％まで、好ましくは重量で５％未満、より好ましくは重量で３％未満のリン脂質を含み得る。
１つの実施形態において、本工程により、抽出脂質または抽出油がもたらされ、ここで、以下の特長の１つ以上またはすべてが該当する：
（ｉ）トリアシルグリセロールが、抽出脂質または抽出油の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％または９６％を構成する、
（ｉｉ）抽出脂質または抽出油は、遊離ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド、ワックスもしくはワックスエステル、またはそれらの任意の組み合わせを含む、および、
（ｉｉｉ）抽出脂質または抽出油中の総ステロール含量および／または組成は、対応する非ヒト生物もしくはその一部または種から製造された抽出脂質または抽出油中のステロール含量および／または組成とは明らかに異なる。
１つの実施形態において、当該工程はさらに、抽出脂質または抽出油を工業製品へと転換することを含む。すなわち、抽出脂質または抽出油は、抽出後、工業製品である他の化学的形態へと転換される。好ましくは、当該工業製品は、たとえば、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび／もしくは脂肪酸エチルエステル等の脂肪酸エステル、たとえばメタン、エタンもしくは長鎖アルカン等のアルカン、長鎖アルカンの混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素および／もしくは水素ガス、エタノール、プロパノールもしくはブタノール等のバイオアルコール、バイオ炭もしくは、一酸化炭素、水素およびバイオ炭の組み合わせ等の炭化水素製品である。
本発明の第一の態様または第二の態様のいずれの工程においても、生育植物部分または非ヒト生物の一部は、気生植物部分または緑色植物部分（たとえば、植物の葉または茎）、木質部分（たとえば茎、枝もしくは幹等）、または根もしくは塊茎であり得る。好ましくは、植物は野外で育ち、たとえば種子等の部分は、野外で植物から採取される。
１つの実施形態において、当該工程は、生育植物部分、非ヒト生物またはその一部を、好ましくは機械的な収穫機を用いて採集するステップを含む。
好ましくは、生育植物部分は、非極性脂質の産生量が最大となるときに、採取される。１つの実施形態において、生育植物部分は、花が咲いた頃に採集される。他の実施形態において、生育植物部分は、花が咲いた頃から、枯れ始める頃に、採集される。他の実施形態において、生育植物部分は、植物が少なくとも約１か月齢のときに採集される。
当該生物が藻類または菌類生物である場合、当該細胞は、封入された容器内で増殖しても良く、または開放系（たとえば、池沼）で増殖しても良い。得られた生物（非極性脂質を含む）は、たとえば藻類または菌類生物を、たとえば培地のｐＨを調節することにより、ろ過、遠心、沈殿、浮遊または凝集する工程により回収されてもよい。沈殿はあまり好ましくない。
本発明の第二の態様の工程において、たとえば生育植物部分または種子等の、非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質含量は、対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部または種子と比較して、増加している。
１つの実施形態において、本発明の第一または第二の態様の、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、さらに、３つの特長、すなわち、特長（ｉ）、特長（ｉｉ）、および特長（ｉｉｉ）の単独または組み合わせにより定義される。
特長（ｉ）は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の１以上の非極性脂質または総非極性脂質含量の増加の程度を定量化し、重量ベース（乾重量ベースまたは種子重量ベース）での増加の程度として表されるか、または対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子のレベルと比較した相対増加量として表されてもよい。特長（ｉｉ）は、植物の属もしくは種、または菌類もしくは藻類の種、または他の細胞型を規定し、そして特長（ｉｉｉ）は、非極性脂質含量中で増加される１以上の特定の脂質を規定する。
特長（ｉ）については、１つの実施形態において、１以上の非極性脂質の増加の程度は、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部よりも、乾重量または種子重量ベースで、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、または少なくとも２６％、大きい。
また、特長（ｉ）に対し、好ましい実施形態において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の総非極性脂質含量は、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、増加している。１つの実施形態において、総非極性脂質含量は、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子よりも、乾重量または種子重量ベースで、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、または少なくとも２６％で、増加される。
さらに、特長（ｉ）に対し、１つの実施形態において、１以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量は、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子よりも、相対ベースで、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、大きい。
また、特長（ｉ）に対し、１以上の非極性脂質のレベルおよび／または総非極性脂質含量の増加の程度は、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子よりも、相対ベースで、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、好ましくは少なくとも約１３倍、または少なくとも約１５倍大きくあり得る。
特長（ｉ）に定義される１以上の非極性脂質のレベルおよび/または総非極性脂質含量の増加の結果として、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の総非極性脂質含量は、好ましくは５％～２５％の間、７％～２５％の間、１０％～２５％の間、１２％～２５％の間、１５％～２５％の間、７％～２０％の間、１０％～２０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量または種子重量のパーセンテージ）。
特長（ｉｉ）に対し、１つの実施形態において、非ヒト生物は植物、藻類または、たとえば酵母もしくは他の菌類等の発酵に適した生物であり、好ましくは、たとえば油性酵母等の油性菌類である。植物は、たとえば、Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ （ｍａｃａｕｂａ ｐａｌｍ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ｍｕｒｕｍｕｒｕ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ （ｔｕｃｕｍａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ （Ｉｎｄａｉａ－ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ （Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｉｌ ｐａｌｍ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ （ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ （ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ （ｂａｂａｓｓｕ）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オーツ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（たとえばＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（カノーラ）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ （ｆａｌｓｅ ｆｌａｘ）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ （大麻）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ、サフラワー）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ｐｅｑｕｉ）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ （ココナッツ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ （Ａｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｋａｌｅ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ （Ａｆｒｉｃａｎ ｐａｌｍ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ （大豆）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．たとえば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ （ｐｈｙｓｉｃ ｎｕｔ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ （ａｒａｒａ ｎｕｔ－ｔｒｅｅ）、Ｌｅｍｎａ ｓｐ．（ウキクサ）（たとえばＬｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌｅｍｎａ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（ｓｗｏｌｌｅｎ ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、Ｌｅｍｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｕｔａ、Ｌｅｍｎａ ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ、Ｌｅｍｎａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌｅｍｎａ ｔｅｎｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌｅｍｎａ ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｌｅｍｎａ ｙｕｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ （ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ｂｕｒｉｔｉ ｐａｌｍ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ （ｉｎａｊａ ｐａｌｍ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（たとえばＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ および Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．（タバコ）（たとえば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ または Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ （ｂａｃａｂａ－ｄｏ－ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ （ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ （ｂａｃａｂａ－ｄｅ－ｌｅｑｕｅ），Ｏｒｙｚａ ｓｐ．（イネ）（たとえば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ および Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ （スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ （ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ （アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ （Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ｃａｓｔｏｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ （ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ （ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（たとえば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ （ｃｕｐｕａｓｓｕ）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ （Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（小麦）（たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）および、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）である植物であってもよく、または生育植物部分は、前述の植物由来のものであってもよい。１つの実施形態において、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ植物は、Ｗｅｓｔａｒの亜種である。別の実施形態において、植物がＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓである場合、Ｗｅｓｔａｒ以外の亜種または栽培品種である。１つの実施形態において、植物は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ以外の種である。他の実施形態において、植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ以外の種である。別の実施形態において、植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ以外の種である。１つの実施形態において、植物は、たとえば、スイッチグラス等の多年生植物である。第二の態様の植物について記述される特長の各々は、第一の態様の生育植物部分に対して、必要な変更を加えて、準用することができる。
特長（ｉｉｉ）に対して、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、総多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、または、たとえばエイコサジエン酸（ＥＤＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、αリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等の特定のＰＵＦＡ、またはヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、たとえばメチル化もしくはヒドロキシル化分枝鎖等の分子鎖、またはそれらの２以上の組み合わせ、または２、３、４、５もしくは６つの前述の任意の基、結合、または分子鎖が、増加または減少している。ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、ＰＵＦＡ、特定のＰＵＦＡ、または脂肪酸の増加の程度は、上述の特長（ｉ）に定義されている通りである。好ましい実施形態において、ＭＡＧは、２－ＭＡＧである。好ましくは、ＤＡＧおよび／またはＴＡＧ、より好ましくはＤＡＧおよびＴＡＧ、またはＭＡＧおよびＴＡＧの総量が増加している。１つの実施形態において、ＭＡＧおよび／またはＤＡＧ含量は増加せずに、ＴＡＧのレベルが増加している。
また、特長（ｉｉｉ）については、１つの実施形態において、総非極性脂質含量の総脂肪酸含量および／またはＴＡＧ含量は、（ａ）１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、非極性脂質（複数含む）と比較して、少なくとも２％多い、好ましくは少なくとも５％多い、より好ましくは少なくとも７％多い、最も好ましくは少なくとも１０％多い、少なくとも１５％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも２５％多いオレイン酸、または少なくとも３０％多くを含む。１つの実施形態において、非極性脂質（複数含む）中の総脂質含量は、（ｂ）１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、非極性脂質（複数含む）と比較して、少なくとも２％少ない、好ましくは少なくとも４％少ない、より好ましくは少なくとも７％少ない、少なくとも１０％少ない、少なくとも１５％少ない、または少なくとも２０％少ないパルミチン酸を含む。１つの実施形態において、総非極性脂質含量の総脂肪酸含量は、（ｃ）１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の非極性脂質（複数含む）と比較して、少なくとも２％少ない、好ましくは少なくとも４％少ない、より好ましくは少なくとも７％少ない、少なくとも１０％少ない、または少なくとも１５％少ないＡＬＡを含む。１つの実施形態において、総非極性脂質含量の総脂肪酸含量は、（ｄ）１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、非極性脂質（複数含む）と比較して、少なくとも２％多い、好ましくは少なくとも５％多い、より好ましくは少なくとも７％多い、最も好ましくは少なくとも１０％多い、または少なくとも１５％多いＬＡを含む。最も好ましくは、総非極性脂質含量の総脂肪酸および／またはＴＡＧ含量は、（ａ）で定義される値に従ってオレイン酸のレベルが増加し、（ｂ）に定義される値に従ってパルミチン酸含量が減少している。１つの実施形態において、総ステロール含量は、対応する種子由来の種子油と比較して、少なくとも１０％、増加している。１つの実施形態において、抽出脂質または抽出油は、少なくとも１０ｐｐｍのクロロフィル、好ましくは少なくとも３０ｐｐｍのクロロフィルを含む。クロロフィルは、その後に、抽出脂質または抽出油の脱色により除去され得る。
好ましい実施形態において、１以上の非極性脂質および／または総非極性脂質含量は、特長（ｉ）（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせ、または特長（ｉ）および（ｉｉ）の組み合わせ、または特長（ｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせ、または特長（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組み合わせにより定義される。
本発明の第二の態様の工程により、１つの実施形態において、以下の特長の１以上、またはすべてが該当する：
（ｉ）生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の１以上の非極性脂質のレベルが、それぞれ、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも０．５％大きいか、または、好ましくは、特長（ｉ）にさらに定義されるものである、
（ｉｉ）生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の１以上の非極性脂質のレベルが、それぞれ、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも１％大きいか、または、好ましくは、特長（ｉ）にさらに定義されるものである、
（ｉｉｉ）生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の１以上の総非極性脂質が、それぞれ、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも０．５％大きいか、または、好ましくは、特長（ｉ）にさらに定義されるものである、
（ｉｖ）生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の１以上の総非極性脂質が、それぞれ、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも１％大きいか、または、好ましくは、特長（ｉ）にさらに定義されるものである、
（ｖ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の１以上の非極性脂質および／または総非極性脂質含量は、それぞれ１以上の外因性ポリヌクレオチドを有しておらず、そしてＡｒａｂｉｄｏｐｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子よりも、重量ベースで、少なくとも０．５％超、および／または相対量ベースで少なくとも１％超、大きいか、または好ましくは特長（ｉ）に定義されるものである、
（ｖｉ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質、および／または、それらから抽出された脂質中のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、または対応するそれらからの抽出脂質のそれぞれの中の脂質中のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量よりも、相対量ベースで、少なくとも１０％大きいか、または好ましくは特長（ｉ）に定義されるものである、
（ｖｉｉ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質中の総多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含量、またはそれらから抽出された脂質中のＰＵＦＡ含量は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、または対応するそれらからの抽出脂質のそれぞれの中の脂質中の総ＰＵＦＡ含量と比較して、増加している（たとえば、ＭＧＡＴの存在下で）、または減少している（たとえば、ＭＧＡＴの非存在下で）か、または、好ましくは特長（ｉ）もしくは特長（ｉｉｉ）にさらに定義されているものである。
１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、および／またはそれらからの抽出脂質中のＰＵＦＡのレベルは、対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のＰＵＦＡのレベル、またはそれらから抽出されるそれぞれの脂質中のＰＵＦＡのレベルと比較して増加しており、ここで、当該多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸、アラキドン酸（ＡＲＡ）、αリノレン酸（ＡＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサトリエン酸（ＥＴＥ）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはそれらの２以上の組み合わせである。好ましくは、増加の程度は、特長（ｉ）に定義されているものである。
第二の態様の１つの実施形態において、対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、それぞれ、非トランスジェニックの生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子である。好ましい実施形態において、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、同じ栽培品種、系統、または亜種であるが、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない。さらに好ましい実施形態において、対応する生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子と同じ発育段階（たとえば、開花期）にある。他の実施形態において、生育植物部分は、開花の頃から、枯れ始める頃に、採取される。他の実施形態において、種子は、植物が少なくとも約１か月齢のときに採取される。
１つの実施形態において、非ヒト生物の一部は、種子であり、および、当該種子の総油含量、または総脂肪酸含量は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する種子よりも、重量ベースで、少なくとも０．５％～２５％、または少なくとも１．０％～２４％、大きい。
１つの実施形態において、種子油の相対ＤＡＧ含量は、対応する種子由来の種子油よりも、相対ベースで、少なくとも１０％、少なくとも１０．５％、少なくとも１１％、少なくとも１１．５％、少なくとも１２％、少なくとも１２．５％、少なくとも１３％、少なくとも１３．５％、少なくとも１４％、少なくとも１４．５％、少なくとも１５％、少なくとも１５．５％、少なくとも１６％、少なくとも１６．５％、少なくとも１７％、少なくとも１７．５％、少なくとも１８％、少なくとも１８．５％、少なくとも１９％、少なくとも１９．５％、少なくとも２０％大きい。１つの実施形態において、種子のＤＡＧ含量は、特長（ｉ）に定義される量で増加しており、および、種子は、特長（ｉｉ）において定義される属および／または種由来のものである。
１つの実施形態において、種子の相対ＴＡＧ含量は、対応する種子と比較して、絶対量ベースで、少なくとも５％、少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、少なくとも７％、少なくとも７．５％、少なくとも８％、少なくとも８．５％、少なくとも９％、少なくとも９．５％、少なくとも１０％、または少なくとも１１％、大きい。１つの実施形態において、種子のＴＡＧ含量は、特長（ｉ）で定義される量で増加しており、および、種子は、特長（ｉｉ）において定義される属および／または種由来のものである。
他の実施形態において、非ヒト生物の一部は、生育植物部分であり、生育植物部分のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量よりも、相対量ベースで、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、大きい。好ましい実施形態において、ＭＡＧは、２－ＭＡＧである。１つの実施形態において、生育植物部分のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、生育植物部分の抽出可能な脂質中のこれらの脂質成分の量から決定される。さらなる実施形態において、トランスジェニック生育植物部分のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量は、特長（ｉ）に定義される量で増加している。
１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の総非極性脂質含量の脂肪酸含量の、または、それらから抽出された脂質または油の、好ましくはＴＡＧ分画の、少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、より好ましくは少なくとも６６％（ｍｏｌ％）、少なくとも６７％（ｍｏｌ％）、少なくとも６８％（ｍｏｌ％）、少なくとも６９％（ｍｏｌ％）、または少なくとも７０％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である。そのような高いオレイン酸の含有物は、バイオディーゼル応用での使用に好ましい。
他の実施形態において、生育植物部分または、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のＰＵＦＡ含量は、対照生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較した場合、増加（たとえば、ＭＧＡＴの存在下で）、または減少（たとえば、ＭＧＡＴの非存在下で）している。この文脈において、ＰＵＦＡ含量には、エステル化ＰＵＦＡ（ＴＡＧ、ＤＡＧ等を含む）および非エステル化ＰＵＦＡの両方を含む。１つの実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子のＰＵＦＡ含量は、好ましくは、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の抽出可能な脂質中のＰＵＦＡの量から決定される。ＰＵＦＡにおける増加の程度は、特長（ｉ）に定義されているものであり得る。ＰＵＦＡの内容は、ＥＤＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＥ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡまたはそれらの２以上の組み合わせを含み得る。
他の実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、またはそれらから抽出される脂質もしくは油中のＰＵＦＡのレベルは、対応する生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、またはそれらから抽出される脂質もしくは油と比較した場合、増加または減少している。ＰＵＦＡは、ＥＤＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＥ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ、またはそれらの２以上の組み合わせであり得る。ＰＵＦＡの増加の程度は、特長（ｉ）に定義されるものであり得る。
他の実施形態において、抽出された脂質または油中の脂肪酸のレベルは、対応する生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子から抽出された脂質と比較した場合、増加しており、ここで、当該脂肪酸は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえば、メチル化またはヒドロキシル化分枝鎖）、またはそれらの２以上の組み合わせ、前述の基、結合もしくは分枝鎖の２、３、４、５もしくは６つの内の任意のもの、を含む。脂肪酸の増加の程度は、特長（ｉ）に定義されるものであり得る。
１つの実施形態において、１以上の非極性脂質（たとえば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、ＭＡＧ、ＰＵＦＡ、または特定のＰＵＦＡ、または特定の脂肪酸）のレベル、および／または、総非極性脂質内容は、抽出された脂質から得られた脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いることにより分析され、決定される。これらの内容の任意のものを決定する別の方法は当分野に公知であり、生物もしくはその一部からの脂質の抽出を必要としない方法（たとえば、近赤外光分析（ＮＩＲ）または核磁気共鳴分析（ＮＭＲ））が含まれる。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の、１以上の非極性脂質のレベル、および／または、総非極性脂質含量は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していないが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１（配列番号８３）をコードする外因性ポリヌクレオチドは含有する対応する生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子よりも、乾重量で、または種子重量ベースで、少なくとも０．５％大きく、および／または、相対ベースで少なくとも１％大きく、好ましくは、乾重量で、または種子重量ベースで、少なくとも１％もしくは２％大きい。
よりさらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、さらに、（ｉ）１以上の導入変異、および／または、（ｉｉ）生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部の内因性酵素（脂肪酸アシルトランスフェラーゼ（たとえば、ＤＧＡＴ、ｓｎ－１ グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ｓｎ－１、ＧＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシル－ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ））、たとえば（ＡＤＰ）－グルコース ピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）等のデンプン生合成に関与する酵素、たとえばΔ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）等の脂肪酸デサチュラーゼ、から選択される内因性酵素）の産生および／または活性を下方制御する外因性ポリヌクレオチド、または、脂質分解に関与し、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチドまたはＳＵＧＡＲ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼ等のリパーゼ等の脂質含量を減少させるポリペプチド、または、それらの２以上の組み合わせ、を含む。別の１つの実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部は、上述の（ｉ）を含まず、または、上述の（ｉｉ）を含まず、または、上述の（ｉ）を含まず、および上述の（ｉｉ）を含まない。１つの実施形態において、ＡＧＰａｓｅの産生を下方制御する外因性ポリヌクレオチドは、Sanjaya et al. (2011)に開示されるポリヌクレオチドではない。１つの実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の外因性ポリヌクレオチドは、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチド、および、ＡＧＰａｓｅをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドから構成されない。
第一および第二の態様のいずれの方法においても、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、または抽出脂質もしくは油は、好ましい実施形態においてさらに定義される。それゆえ、１つの実施形態において、以下の特長の１以上またはすべてが該当する：
（ｉ）オレイン酸は、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の非極性脂質もしくは油の総脂肪酸含量の、少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）を構成する、
（ｉｉ）オレイン酸は、抽出された脂質または油中の総脂肪酸含量の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）を構成する、
（ｉｉｉ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の非極性脂質または油は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえば、メチル化またはヒドロキシル化分枝鎖）、またはそれらの２以上の組み合わせ、または、上述の基、結合、もしくは分枝鎖のうちの任意の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを含む、脂肪酸を含む、および、
（ｉｖ）抽出された脂質または油は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえば、メチル化またはヒドロキシル化分枝鎖）、またはそれらの２以上の組み合わせ、または、上述の基、結合、もしくは分枝鎖のうちの任意の２つ、３つ、４つ、５つ、または６つを含む、脂肪酸を含む。この実施形態において、脂肪酸組成は、脂肪酸組成の任意の改変（たとえば、抽出脂質または油を分画化して、脂肪酸組成を変える）の前に、測定される。好ましい実施形態において、増加の程度は、特長（ｉ）に定義されるものである。
１つの実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、および／または、抽出脂質もしくは油中の脂質のレベルは、抽出脂質または油から調製された脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いて分析されることにより、決定することができる。分析方法は、好ましくは、本明細書の実施例１に記述されるものである。
第一または第二の態様のいずれに関しても、再度、本発明は、本方法に用いられる、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の１以上の外因性ポリヌクレオチドを提供する。ゆえに、１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、それぞれ、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、ＲＮＡ、または、好ましくは１以上の解糖系遺伝子もしくは脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを含み、そして、１以上の非極性脂質の生合成に関与するＲＮＡまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、第一および第二の外因性ポリペプチドは、それぞれ、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに、各々が動作可能に連結されている。すなわち、第一および第二の外因性ポリペプチドは、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の非極性脂質含量の増加を共にもたらす、異なる因子をコードする。
増加は、第一または第二の外因性ポリヌクレオチドのいずれかが単独で存在する場合と比較して、好ましくは付加的であり、より好ましくは相乗的である。第一および第二のポリヌクレオチドによりコードされる因子は、異なる機序で作用する。好ましくは、転写因子ポリペプチドは、たとえば、解糖系または脂肪酸生合成（たとえば、限定されないが、１以上のＡＣＣａｓｅ、スクローストランスポーター（ＳｕＳｙ、細胞壁インベルターゼ）、ケトアシル合成（ＫＡＳ）、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）（たとえば、（Ａｔ５ｇ５２９２０， Ａｔ３ｇ２２９６０）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソーストランスポーター（たとえば、ＧＰＴ２およびＰＰＴ１）、サイトゾルフルクトキナーゼ、サイトゾルホスホグリセリン酸ムターゼ、エノイル－ＡＣＰリダクターゼ（Ａｔ２ｇ０５９９０）、およびホスホグリセリン酸ムターゼ（Ａｔ１ｇ２２１７０））に関与する、たとえば少なくとも５または少なくとも８の遺伝子、好ましくは各カテゴリーの１以上の遺伝子の発現させることにより、たとえば、グリセロール－３－リン酸および／または好ましくはアシル－ＣｏＡの形態にある脂肪酸等を増加させる、非極性脂質合成の基質の利用可能性を上げる。１つの実施形態において、第一の外因性ポリヌクレオチドは、Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１）転写因子、Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ １（Ｌｅｃ１）転写因子、Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ２（ＬＥＣ２）転写因子、Ｆｕｓ３転写因子、ＡＢＩ３転写因子、Ｄｏｆ４転写因子、ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ（ＢＢＭ）転写因子、またはＤｏｆ１１転写因子をコードする。１つの実施形態において、ＬＥＣ２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＬＥＣ２ではない。この実施形態の一端として、または別に、第二の外因性ポリヌクレオチドは、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性（たとえば、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）活性および／もしくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性、または、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）活性）を有するポリペプチドをコードし得る。１つの実施形態において、ＤＧＡＴは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＤＧＡＴではない。
好ましい実施形態において、本発明の第一の態様または第二の態様の、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、２以上の外因性ポリヌクレオチド（複数含む）を含み、それらの内の１つは、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子において、１以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチド（たとえば、Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１））をコードし、それらの内の２つめは、たとえばＤＧＡＴ等の１以上の非極性脂質の生合成に関与するポリペプチドをコードする。
１つの実施形態において、本発明の第一の態様または第二の態様の生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子はさらに、第三の、またはより多くの、外因性ポリヌクレオチド（複数含む）を含む。第三の、またはより多くの外因性ポリヌクレオチド（複数含む）は、以下の任意の組み合わせ、または１つ以上をコードし得る：
（ｉ）非ヒト生物またはその一部において、１以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、さらなるＲＮＡまたは転写因子ポリペプチド（たとえば、もし第一の外因性ポリヌクレオチドがＷｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子をコードする場合、第三の外因性ポリヌクレオチドはＬＥＣ２またはＢＢＭ転写因子（好ましくは、誘導可能なプロモーターもしくは高い導入遺伝子の発現レベルをもたらさないプロモーターにより発現制御されるＬＥＣ２またはＢＢＭ）をコードし得る）、
（ｉｉ）１以上の非極性脂質の生合成に関与するさらなるＲＮＡまたはポリペプチド（たとえば、もし第二の外因性ポリヌクレオチドがＤＧＡＴをコードする場合、第三の外因性ポリヌクレオチドは、ＭＧＡＴまたはＧＰＡＴをコードしても良く、または２つのさらなる外因性ポリヌクレオチドが、ＭＧＡＴおよびＧＰＡＴをコードして存在し得る）
（ｉｉｉ）１以上の非極性脂質、好ましくは、オレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）、たとえばポリオレオシン（ｐｏｌｙｏｌｅｏｓｉｎ）またはカレオシン（ｃａｌｅｏｓｉｎ）、より好ましくはポリオレオシン、を安定化させるポリペプチド、
（ｉｖ）たとえばＡＧＰａｓｅポリペプチド等のデンプン生合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子、
（ｖ）脂質分解に関与し、および／または、脂質含量を減少させる、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチドもしくはＳＵＧＡＲ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼ等のリパーゼ等のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子、または、
（ｖｉ）サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
ここで、第三の、またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチド（複数含む）は、それぞれ、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチド（複数含む）の発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
遺伝子の多くの特定の組み合わせが、本明細書において、非極性脂質含量の増加に有効なものとして示されている。それゆえに、本発明の第一または第二の態様のいずれの方法に関しても、１つの実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下をコードする１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む：
ｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子およびＤＧＡＴ、
ｉｉ）ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴおよびオレオシン、
ｉｉｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、
ｉｖ）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、
ｖ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、
ｖｉ）ＭＧＡＴおよびグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｖｉｉ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｖｉｉｉ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｉｘ）ＷＲＩ１転写因子およびＭＧＡＴ、
ｘ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、
ｘｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ、
ｘｉｉ）ＤＧＡＴおよびオレオシン、または、
ｘｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびオレオシン、ならびに、
ｘｉｖ）任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
ここで、１以上の外因性ポリヌクレオチドの各々は、それぞれ、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中で、ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。好ましくは、１以上の外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子のゲノム中に安定に組み込まれており、および、より好ましくは、ホモ接合性の状態で存在する。ポリヌクレオチドは、たとえば、植物、酵母または動物起源の天然酵素と同じ配列である、アミノ酸配列を有する酵素をコードし得る。さらに、ポリヌクレオチドは、天然酵素と比較した場合に、１以上の保存的変異を有する酵素をコードしても良い。
１つの実施形態において、
（ｉ）ＧＰＡＴはまた、ＭＡＧを産生するホスファターゼ活性を有し、たとえば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、および／または、
（ｉｉ）ＤＧＡＴは、ＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２であり、および／または、
（ｉｉｉ）ＭＧＡＴは、ＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２である。
好ましい実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む。
他の好ましい実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、および、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ，好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、ＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、ＬＥＣ２またはＢＢＭ等の第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、および、ＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第六の外因性ポリヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、種子は、ＧＰＡＴをコードする第五の外因性ポリヌクレオチドをさらに含有する。
適切な場合、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドの代わりに、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、変異を有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、リパーゼポリペプチドのレベル減少に寄与する、ＣＧｉ５８遺伝子等のリパーゼ遺伝子中に、１以上の導入遺伝子を有する。
好ましい実施形態において、ＤＧＡＴおよびオレオシンをコードする外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、構造的なプロモーター、または、少なくとも開花期の前、および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態となるプロモーターに動作可能に連結されている。さらに好ましい実施形態において、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子は、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、構造的プロモーター、少なくとも開花期の前および開花期までに植物の緑色組織中で活性状態となるプロモーター、または誘導プロモーターに、動作可能に連結されている。よりさらに好ましい実施形態において、ＬＥＣ２、ＢＢＭおよび／またはＭＧＡＴ２をコードする外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる誘導プロモーターに動作可能に連結されている。
上述の実施形態のそれぞれにおいて、ポリヌクレオチドは、分離された分子として提供されていてもよく、または、（たとえば、単一のＴ－ＤＮＡ分子上の）連続した単一分子として提供されてもよい。１つの実施形態において、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの遺伝子の転写の方向は、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの他の遺伝子の転写の方向とは逆である。
上述の実施形態のそれぞれにおいて、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは植物の葉もしくはその一部、茎もしくは塊茎の総非極性脂質含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ乾重量）である。さらに好ましい実施形態において、総非極性脂質含量は、５％～２５％の間、７％～２５％の間、１０％～２５％の間、１２％～２５％の間、１５％～２５％の間、７％～２０％の間、１０％～２０％の間、１０％～１５％の間、１５％～２０％の間、２０％～２５％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量または種子重量のパーセンテージ）。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
さらに、上述の実施形態のそれぞれにおいて、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは植物の葉もしくはその一部、茎もしくは塊茎、の総ＴＡＧ含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、より好ましくは少なくとも約１５％、またはより好ましくは少なくとも約１７％（ｗ／ｗ乾重量）である。さらに好ましい実施形態において、総ＴＡＧ含量は、５％～３０％の間、７％～３０％の間、１０％～３０％の間、１２％～３０％の間、１５％～３０％の間、７％～３０％の間、１０％～３０％の間、２０％～２８％の間、１８％～２５％の間、２２％～３０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量または種子重量のパーセンテージ）。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
さらに、上述の実施形態のそれぞれにおいて、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは植物の葉もしくはその一部、茎もしくは塊茎の総脂質含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約１７％（ｗ／ｗ乾重量）、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％である。さらに好ましい実施形態において、総脂質含量は、５％～３５％の間、７％～３５％の間、１０％～３５％の間、１２％～３５％の間、１５％～３５％の間、７％～３５％の間、１０％～２０％の間、１８％～２８％の間、２０％～２８％の間、２２％～２８％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、約２２％、または約２５％である（それぞれ、乾重量のパーセンテージ）。通常、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部の総脂質含量は、非極性脂質含量よりも、およそ２～３％高い。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下の特長のうちの１つ以上またはすべてを有している：
ｉ）少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、または少なくとも１５．５％（重量％）の総脂質含量、
ｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、生育植物部分、または非ヒト生物中の総脂質含量が、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍、高い、
ｉｉｉ）少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、または少なくとも７％（乾重量または種子重量の重量％）の総ＴＡＧ含量、
ｉｖ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも１００倍、高い総ＴＡＧ含量、
ｖ）オレイン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１５％、少なくとも１９％または少なくとも２２％（重量％）を構成する、
ｖｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のオレイン酸のレベルが、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも１７倍、高い、
ｖｉｉ）パルミチン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３３％（重量％）を構成する、
ｖｉｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも１．５倍、高い、
ｉｘ）リノール酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２２％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３４％（重量％）を構成する、
ｘ）αリノレン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の２０％未満、１５％未満、１１％未満、または８％未満（重量％）を構成する、および、
ｘｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも５倍、または少なくとも８倍、低い。この実施形態において、好ましくは、少なくとも生育植物部分は、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｉ）およびｉｉ）、ｉ）およびｉｉｉ）、ｉ）およびｉｖ）、ｉ）～ｉｉｉ）、ｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）、ｉ）～ｉｖ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）、ｉｉ）およびｉｖ）、ｉｉ）～ｉｖ）、またはｉｉｉ）およびｉｖ）の特長（複数含む）を有する。１つの実施形態において、乾重量％は、葉の乾重量％である。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、当該生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下の特長の内の１つ以上、またはすべてを有している：
ｉ）少なくとも１０％、少なくとも１２．５％、少なくとも１５％、または少なくとも１７％（乾重量または種子重量の重量％）の総ＴＡＧ含量、
ｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分またはヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中の総ＴＡＧ含量が、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも１００倍、高い、
ｉｉｉ）オレイン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１９％、少なくとも２２％、または少なくとも２５％（重量％）を構成する、
ｉｖ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のＴＡＧ中のオレイン酸のレベルが、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、または少なくとも１９倍、高い、
ｖ）パルミチン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも２８％（重量％）を構成する、
ｖｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のＴＡＧ中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも１．２５倍、高い、
ｖｉｉ）リノール酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１５％、または少なくとも２０％（重量％）を構成する、
ｖｉｉｉ）αリノレン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の１５％未満、１１％未満、または８％未満（重量％）を構成する、および、
ｉｘ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のＴＡＧ中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも５倍、または少なくとも８倍、低い。この実施形態において、好ましくは、生育植物部分は少なくとも、特長ｉ）、ｉｉ）、またはｉ）およびｉｉ）を有する。１つの実施形態において、乾重量％は、葉の乾重量％である。
好ましくは、２つの上述の実施形態に対し定義された特長は、植物の開花期での時点のものである。
別の実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＤＧＡＴ１およびＬＥＣ２をコードする１以上の外因性ポリヌクレオチドからなる。
好ましい実施形態において、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号２３１～２７８の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号２７９～３３７の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
好ましい実施形態において、ＤＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号２０４～２１１、３３８～３４６の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号８３、２１２～２１９、３４７～３５５の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
他の好ましい実施形態において、ＭＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号１～４４の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号４５～８２の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
他の好ましい実施形態において、ＧＰＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号８４～１４３の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号１４４～２０３の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
他の好ましい実施形態において、ＤＧＡＴ２をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号２０４～２１１の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号２１２～２１９の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
他の好ましい実施形態において、オレオシンをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号３８９～４０８の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号３６２～３８８の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
１つの実施形態において、ＣＧｉ５８ポリペプチドは、以下の１以上を含む：
ｉ）配列番号４２２～４２８の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号４２９～４３６の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
他の実施形態において、ＬＥＣ２をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の内の１以上を含む：
ｉ）配列番号４３７～４３９の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号４４２～４４４の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
さらなる実施形態において、ＢＢＭをコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下の内の１以上を含む：
ｉ）配列番号４４０～４４１の内の任意の１つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ｉｉ）配列番号４４５～４４６の内の任意の１つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも３０％同一である、配列を有するヌクレオチド、
ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）の内の任意の１つとハイブリダイズするヌクレオチド。
明白に、１つの実施形態において好ましい配列が、他の実施形態において好ましい配列と組み合わされても良く、および、より有利にするために、さらに他の実施形態において好ましい配列とさらに組み合わされても良い。
１つの実施形態において、１以上の外因性ポリヌクレオチドは、変異ＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴをコードする。たとえば、１以上の外因性ポリヌクレオチドは、本明細書において、配列番号で定義される野生型ＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴと比較して、１または１以上の保存的アミノ酸置換（表１に例示される）を有するＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴおよび／またはＧＰＡＴをコードしても良い。好ましくは、変異ポリペプチドは、変異の無いポリペプチドと比較して、同等か、またはより高い活性を有する。
１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＭＧＡＴをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＧＰＡＴをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む。第一および第二のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または連続した単一分子（たとえば、単一のＴ－ＤＮＡ分子上で）として提供されてもよい。１つの実施形態において、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの遺伝子の転写の方向は、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの他の遺伝子の転写の方向と逆である。好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、たとえばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等のホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴである。ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴは、非ヒト生物またはその一部で、Ｇ－３－ＰからのＭＡＧの形成を触媒するように作用する（すなわち、ＬＰＡを形成するためにＧ－３－Ｐをアシル化し、次いで、ＭＡＧを形成するためにリン酸基を除去する）。次いで、ＭＧＡＴは、非ヒト生物またはその一部で、脂肪酸－ＣｏＡから誘導されたアシル基とのＭＡＧのアシル化により、ＤＡＧの形成を触媒するように作用する。また、たとえば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＭＧＡＴ１等のＭＧＡＴは、非ヒト生物またはその一部で、もしそれがＤＧＡＴ活性も有している場合には、ＴＡＧの形成を触媒するようにも作用し得る。
生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、たとえばＤＧＡＴ等をコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを含有してもよい。第一、第二、および第三のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または連続した単一分子（たとえば、単一のＴ－ＤＮＡ分子上で）として提供されてもよい。ＤＧＡＴは、トランスジェニック生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子で、ＤＡＧ（好ましくはＭＧＡＴ経路により産生されたもの）と、脂肪アシル－ＣｏＡから誘導されたアシル基とのアシル化により、ＴＡＧの形成を触媒するように作用する。１つの実施形態において、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの遺伝子の転写の方向は、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの他の遺伝子の転写の方向と逆である。
他の実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子で、ＭＧＡＴをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、およびＤＧＡＴをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む。第一および第二のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または連続した単一分子（たとえば、単一のＴ－ＤＮＡ分子上で）として提供されてもよい。１つの実施形態において、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの遺伝子の転写の方向は、Ｔ－ＤＮＡ分子上の少なくとも１つの他の遺伝子の転写の方向と逆である。生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、たとえばＧＰＡＴ、好ましくは、たとえばＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等のホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴをコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを含有してもよい。第一、第二、および第三のポリヌクレオチドは、別々の分子として提供されてもよく、または連続した単一分子として提供されてもよい。
さらに、植物、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の外因性遺伝子の活性は、下方制御されていても良い。ゆえに、１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下の１以上を含む：
ｉ）植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素をコードする遺伝子中に、１以上の導入変異、または、
ｉｉ）植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素の産生および／または活性を下方制御する外因性ポリヌクレオチド、
ここで、各内因性酵素は、たとえばＤＧＡＴ等の脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、ｓｎ－１グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ｓｎ－１ ＧＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシル－ＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、たとえば（ＡＤＰ）－グルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）等のデンプン生合成に関与する酵素、たとえばΔ１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）等の脂肪酸デサチュラーゼ、脂質分解に関与するポリペプチドおよび／または脂質含有量を減少させるポリペプチド（たとえばＣＧｉ５８ポリペプチドもしくはＳＵＧＡＲ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼ等のリパーゼ等）、またはそれらの２以上の組み合わせ、からなる群から選択される。１つの実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒性ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二重鎖ＲＮＡ分子または、それらから誘導されたプロセッシングされたＲＮＡ分子からなる群から選択される。１つの実施形態において、ＡＧＰａｓｅの産生を下方制御する外因性ポリヌクレオチドは、Sanjaya et al. (2011)に開示されているポリヌクレオチドではない。１つの実施形態において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の外因性ポリヌクレオチドは、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチド、および、ＡＧＰａｓｅをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドから構成されない。
非極性脂質のレベルの増加は、特に脂肪酸に関連するアプリケーションにとって重要である。それゆえ、１つの実施形態において、総非極性脂質、抽出脂質または油は、以下を含む：
（ｉ）ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧまたはＭＡＧである、非極性脂質、および、
（ｉｉ）ＥＤＡ、ＡＲＡ、ＳＤＡ、ＥＴＥ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡである特定のＰＵＦＡ（前記特定のＰＵＦＡは、非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも１％のレベルである）、もしくは、特定のＰＵＦＡの２以上の組み合わせ、または、
（ｉｉｉ）非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも１％のレベルで存在し、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖）もしくはそれらの２以上の組み合わせ、または、前述の基、結合、分枝鎖のうちの任意の２、３、４、５もしくは６つを含む脂肪酸。
第三の態様において、本発明により、第一および第二の態様の方法、または以下に記述されるさらなる態様において有用な、非ヒト生物、好ましくは植物、または生育植物部分もしくは種子等のそれらの一部が提供される。第一および第二の態様に対して記述される実施形態における各特長は、必要な変更を加えて、第三の態様の、非ヒト生物、好ましくは植物、または生育植物部分もしくは種子等のその一部に準用することができる。具体的な実施形態は、以下に強調される。
第三の態様の１つの実施形態において、本発明により、生育部分を含む植物、またはその生育部分が提供され、ここで、生育部分は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、より好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ乾重量）の総非極性脂質含有量を有する。さらに好ましい実施形態において、総非極性脂質含量は、５％～２５％の間、７％～２５％の間、１０％～２５％の間、１２％～２５％の間、１５％～２５％の間、７％～２０％の間、１０％～２０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量のパーセンテージ）。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。さらなる実施形態において、非極性脂質は、少なくとも９０％のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む。好ましくは、植物は、繁殖力があり、形態的に正常であり、および／または農学的に有用である。植物の種子は、好ましくは、対応する野生型植物のものと実質的に同じ比率で発芽する。好ましくは、生育部分は、葉もしくは茎であり、またはその２つの組み合わせであり、または、根もしくは塊茎（たとえばジャガイモ塊茎等）である。
他の実施形態において、非ヒト生物、好ましくは植物またはその一部（たとえば生育植物部分または種子）は、本明細書に定義される１以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、１以上の非極性脂質および／または総非極性脂質含量のレベルが増加しており、そのレベルは、１以上の当該外因性ポリヌクレオチドを有していない、対応する非ヒト生物、好ましくは植物、またはその一部（たとえば、生育植物部分または種子）よりも相対ベースで、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１２倍、好ましくは少なくとも約１３倍、または少なくとも約１５倍、高い。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも４５％の油含量を有するカノーラの種子を含むカノーラ植物が提供される。好ましくは、当該カノーラ植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも５％の油含量を有するトウモロコシの種子を含むトウモロコシの植物が提供される。好ましくは、当該トウモロコシの植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも２０％の油含量を有する大豆の種子を含む大豆の植物が提供される。好ましくは、当該大豆の植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも１０％の油含量を有するルピナスの種子を含むルピナスの植物が提供される。好ましくは、当該ルピナスの植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも５０％の油含量を有するピーナッツの種子を含むピーナッツの植物が提供される。好ましくは、当該ピーナッツの植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも５０％の油含量を有するヒマワリの種子を含むヒマワリの植物が提供される。好ましくは、当該ヒマワリの植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも４１％の油含量を有する綿の種子を含む綿の植物が提供される。好ましくは、当該綿の植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも３５％の油含量を有するサフラワーの種子を含むサフラワーの植物が提供される。好ましくは、当該サフラワーの植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも３６％の油含量を有する亜麻の種子を含む亜麻の植物が提供される。好ましくは、当該亜麻の植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
１つの実施形態において、本発明により、重量ベースで少なくとも３６％の油含量を有するＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａの種子を含むＣａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａの植物が提供される。好ましくは、当該Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａの植物またはその種子は、本発明の第一および第二の態様において記述される特長を有する。
実施形態において、当該植物は、本明細書に前述される特長（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）によりさらに定義されてもよい。好ましい実施形態において、当該植物またはその生育部分は、以下の特長の１以上またはすべてを含む：
（ｉ）エステル化した形態、またはエステル化していない形態のオレイン酸である、当該植物の生育部分または種子中のオレイン酸であり、ここで、当該生育部分または種子の脂質含量中の総脂肪酸の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である。
（ｉｉ）非極性脂質でのエステル化した形態のオレイン酸である、当該植物の生育植物部分または種子中のオレイン酸であり、ここで、当該生育部分または種子の非極性脂質含量の総脂肪酸の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である。
（ｉｉｉ）エステル化した形態、またはエステル化していない形態、好ましくは生育部分または種子の非極性脂質のエステル化した形態の改変脂肪酸である、当該植物の生育部分または種子の改変脂肪酸であり、ここで、当該改変脂肪酸は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖）、またはそれらの２以上の組み合わせ、または前述の基、結合、もしくは分枝鎖の任意の２、３、４、５または６つを含み、および、
（ｉｖ）植物の生育部分または種子の非極性脂質中のワックスおよび／またはワックスエステル。
１つの実施形態において、植物または生育植物部分は、そのような植物または部分の、少なくとも約１０００の群またはコレクションのメンバーである。すなわち、群またはコレクション中の各植物または生育部分は、本質的に同じ特性を有するか、または、当該群またはコレクションの他のメンバーと同じ外因性核酸を含む。好ましくは、当該植物は、外因性ポリヌクレオチドに対してホモ接合性であり、ある程度の統一性をもたらす。好ましくは、当該植物は、野外で生育する。生育植物部分のコレクションは、好ましくは、野外で生育する植物から採取される。好ましくは、生育植物部分は、非極性脂質の産生量が、その最大となる時点で採取される。１つの実施形態において、生育植物部分は、開花期の頃に採取される。他の実施形態において、生育植物部分は、当該植物が少なくとも約１か月齢のときに採取される。他の実施形態において、生育植物部分は、開花期の頃から、枯れ始める頃までの間に、採取される。他の実施形態において、生育植物部分は、誘導可能な遺伝子の発現誘導の後、少なくとも約１か月で採取される。
第三の態様のさらなる実施形態において、本発明により、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有し、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較し、１以上の非極性脂質のレベルが増加している、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が提供され、ここで、１以上の各外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、ここで、１以上またはすべての以下の特長が該当する：
（ｉ）１以上の外因性ポリヌクレオチドが、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の１以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるＲＮＡまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、１以上の非極性脂質の生合成に関与するＲＮＡまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
（ｉｉ）もし非ヒト生物が植物である場合、当該植物の生育部分は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ乾重量）の総非極性脂質含有量を有している、
（ｉｉｉ）非ヒト生物が、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔ ａｌｇａｅ）からなる群から選択される藻類である、
（ｉｖ）非極性脂質（複数含む）が、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖）またはそれらの２以上の組み合わせ、または、上述の基、結合もしくは分枝鎖の任意の２、３、４、５または６つを含む脂肪酸を含む、
（ｖ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、その脂質中で、エステル化形態またはエステル化していない形態で、オレイン酸を含んでおり、ここで、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の脂質中の総脂肪酸の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である、
（ｖｉ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、その非極性脂質中にエステル化された形態でオレイン酸を含んでおり、ここで、当該生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の非極性脂質の総脂肪酸の、少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、好ましくは少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である、
（ｖｉｉ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の脂質中の総脂肪酸含量が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質よりも、少なくとも２％多いオレイン酸、および／または、少なくとも２％少ないパルミチン酸、を含む、および／または、
（ｖｉｉｉ）生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の非極性脂質中の総脂肪酸含量が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質よりも、少なくとも２％多いオレイン酸、および／または、少なくとも２％少ないパルミチン酸、を含む、
（ｉｘ）非極性脂質（複数含む）が、総ステロール、好ましくは遊離ステロール、ステロールエステルおよび／またはステロールグリコシド、の改変レベルを含む、
（ｘ）非極性脂質（複数含む）が、ワックスおよび／またはワックスエステルを含む、および、
（ｘｉ）非ヒト生物またはその一部が、少なくとも約１０００のそのような非ヒト生物もしくはその一部の群またはコレクションの一員である。
１つの実施形態において、１以上の外因性ポリヌクレオチドが、第一の外因性ポリヌクレオチド、および第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、特長（ｉｉ）～（ｘｉ）のうちの１以上またはすべてが該当する。
上述の（ｉｉ）の１つの実施形態において、総非極性脂質含量は、５％～２５％の間、７％～２５％の間、１０％～２５％の間、１２％～２５％の間、１５％～２５％の間、７％～２０％の間、１０％～２０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量のパーセンテージ）。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
好ましい実施形態において、非ヒト生物またはその一部は、植物、藻類、またはたとえば菌類等の発酵に適した生物である。非ヒト生物の一部は、種子、果実、または、たとえば気生植物部分または緑色植物部分（たとえば、葉または茎）等の植物の生育部分であり得る。他の実施形態において、当該部分は、多細胞生物の細胞である。非ヒト生物の当該部分に関して、当該部分は、非ヒト生物の少なくとも１つの細胞を含む。さらに好ましい実施形態において、非ヒト生物またはその一部は、限定されないが、特長（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む、本発明の第一および第二の態様において記述される実施形態のうちの任意のもので定義される特長、および、本発明の第一および第二の態様において記述される実施形態のうちの任意のもので定義される外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ポリヌクレオチドの組み合わせにより、さらに定義される。
１つの実施形態において、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下をコードする外因性ポリヌクレオチドの１以上を含む：
ｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１）転写因子およびＤＧＡＴ、
ｉｉ）ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴおよびオレオシン
ｉｉｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、
ｉｖ）モノアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、
ｖ）ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、
ｖｉ）ＭＧＡＴおよびグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｖｉｉ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｖｉｉｉ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｉｘ）ＷＲＩ１転写因子およびＭＧＡＴ、
ｘ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、
ｘｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ、
ｘｉｉ）ＤＧＡＴおよびオレオシン、または、
ｘｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびオレオシン、および、
ｘｉｖ）任意選択的に、サイレンシング サプレッサー ポリペプチド、
ここで、各外因性ポリヌクレオチドは、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれのポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。１以上の外因性ポリヌクレオチドが、本明細書に定義される配列を有するヌクレオチドを含有してもよい。好ましくは、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、１以上の外因性ポリヌクレオチドに対して、ホモ接合性である。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のゲノムに組み込まれている。１以上のポリヌクレオチドが、別々の分子として提供されてもよく、または連続した単一分子として提供されてもよい。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、単一遺伝子座または遺伝的に関連のある遺伝子座で、より好ましくはホモ接合性の状態で、植物または生物のゲノムに組み込まれている。より好ましくは、組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、たとえば除草剤耐性遺伝子等の選択可能マーカー遺伝子と遺伝的に結び付けられている。
好ましい実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む。
他の好ましい実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もfしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第六の外因性ポリヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、種子は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよび、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチドおよび、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、当該種子はさらに、ＧＰＡＴをコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
適切な場合、たとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドの代わりに、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、たとえばＣＧｉ５８遺伝子等の、変異を有していない同系生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較した場合に、リパーゼポリペプチドのレベルを減少させるような、リパーゼ遺伝子中に導入された変異を１つ以上、有する。
好ましい実施形態において、ＤＧＡＴおよびオレオシンをコードする外因性ポリヌクレオチドは、構造性のプロモーター、または少なくとも開花期の前および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態であるプロモーターに動作可能に連結されており、当該プロモーターは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子で、ポリヌクレオチドの発現を指示することができる。さらに好ましい実施形態において、ＷＲＩ１をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子は、構造性のプロモーター、または少なくとも開花期の前および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態であるプロモーターに動作可能に連結されているか、または、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、誘導可能なプロモーターに動作可能に連結されている。よりさらに好ましい実施形態において、ＬＥＣ２、ＢＢＭおよび／またはＭＧＡＴ２をコードする外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、誘導可能なプロモーターに動作可能に連結されている。
上述の各実施形態において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは植物の葉またはその一部、茎または塊茎、の総非極性脂質含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ乾重量または種子重量）である。さらに好ましい実施形態において、総非極性脂質含量は、５％～２５％の間、７％～２５％の間、１０％～２５％の間、１２％～２５％の間、１５％～２５％の間、７％～２０％の間、１０％～２０％の間、１０％～１５％の間、１５％～２０％の間、２０％～２５％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量または種子重量のパーセンテージ）。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
さらに、上述の各々において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは植物の葉またはその一部、茎または塊茎、の総ＴＡＧ含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、より好ましくは少なくとも約１５％、またはより好ましくは少なくとも約１７％（ｗ／ｗ乾重量または種子重量）である。さらに好ましい実施形態において、総ＴＡＧ含量は、５％～３０％の間、７％～３０％の間、１０％～３０％の間、１２％～３０％の間、１５％～３０％の間、７％～３０％の間、１０％～３０％の間、２０％～２８％の間、１８％～２５％の間、２２％～３０％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、または約２２％である（それぞれ、乾重量または種子重量のパーセンテージ）。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
さらに、上述の実施形態の各々において、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは植物の葉またはその一部、茎または茎塊、の総脂質含量は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、より好ましくは少なくとも約１５％、より好ましくは少なくとも約１７％（ｗ／ｗ乾重量または種子重量）、より好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約２５％である。さらに好ましい実施形態において、総脂質含量は、５％～３５％の間、７％～３５％の間、１０％～３５％の間、１２％～３５％の間、１５％～３５％の間、７％～３５％の間、１０％～２０％の間、１８％～２８％の間、２０％～２８％の間、２２％～２８％の間、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約２０％、約２２％、または約２５％である（それぞれ、乾重量または種子重量のパーセンテージ）。通常、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部の総脂質含量は、非極性脂質含量よりも、およそ２～３％高い。特に好ましい実施形態において、生育植物部分は、葉（複数含む）またはその一部である。より好ましい実施形態において、生育植物部分は、少なくとも１ｃｍ２の表面積を有する葉の部分である。
１つの実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下の特長のうちの１つ以上またはすべてを有している：
ｉ）少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、または少なくとも１５．５％（乾重量または種子重量の重量％）の総脂質含量、
ｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、生育植物部分、または非ヒト生物中の総脂質含量が、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、または少なくとも１０倍、高い、
ｉｉｉ）少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、または少なくとも７％（乾重量または種子重量の重量％）の総ＴＡＧ含量、
ｉｖ）総ＴＡＧ含量が、外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも１００倍、高い、
ｖ）オレイン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１５％、少なくとも１９％または少なくとも２２％（重量％）を構成する、
ｖｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のオレイン酸のレベルが、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも１７倍、高い、
ｖｉｉ）パルミチン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３３％（重量％）を構成する、
ｖｉｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも１．５倍、高い、
ｉｘ）リノール酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２２％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または少なくとも３４％（重量％）を構成する、
ｘ）αリノレン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の２０％未満、１５％未満、１１％未満、または８％未満（重量％）を構成する、および、
ｘｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、ＴＡＧ中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも５倍、または少なくとも８倍、低い。この実施形態において、好ましくは、生育植物部分は、少なくとも、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｉ）およびｉｉ）、ｉ）およびｉｉｉ）、ｉ）およびｉｖ）、ｉ）～ｉｉｉ）、ｉ）、ｉｉｉ）およびｉｖ）、ｉ）～ｉｖ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）、ｉｉ）およびｉｖ）、ｉｉ）～ｉｖ）、またはｉｉｉ）およびｉｖ）の特長（複数含む）を有する。１つの実施形態において、乾重量％は、葉の乾重量％である。
さらなる実施形態において、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分は、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、当該生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下の特長の内の１つ以上、またはすべてを有している：
ｉ）少なくとも１０％、少なくとも１２．５％、少なくとも１５％、または少なくとも１７％（乾重量または種子重量の重量％）の総ＴＡＧ含量、
ｉｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分またはヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中の総ＴＡＧ含量が、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも１００倍、高い、
ｉｉｉ）オレイン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１９％、少なくとも２２％、または少なくとも２５％（重量％）を構成する、
ｉｖ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のＴＡＧ中のオレイン酸のレベルが、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも１７倍、または少なくとも１９倍、高い、
ｖ）パルミチン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも２８％（重量％）を構成する、
ｖｉ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のＴＡＧ中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも１．２５倍、高い、
ｖｉｉ）リノール酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１５％、または少なくとも２０％（重量％）を構成する、
ｖｉｉｉ）αリノレン酸が、ＴＡＧ中の脂肪酸の１５％未満、１１％未満、または８％未満（重量％）を構成する、および、
ｉｘ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のＴＡＧ中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも５倍、または少なくとも８倍、低い。この実施形態において、好ましくは、生育植物部分は少なくとも、特長ｉ）、ｉｉ）、またはｉ）およびｉｉ）を有する。１つの実施形態において、乾重量％は、葉の乾重量％である。
好ましくは、２つの上述の実施形態に対して定義された特長は、植物の開花期の時点でのものである。
第四の態様において、本発明により、本発明の植物へと成長することができる植物の種子、または本発明の植物（たとえば、植物である、本発明の非ヒト生物）から得られる種子が提供される。１つの実施形態において、当該種子は、本明細書に定義される１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。
第五の態様において、本発明により、１以上の非極性脂質を産生する能力が増強された細胞を得るための方法が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ａ）細胞に１以上の外因性ポリヌクレオチドを導入すること、
ｂ）細胞またはその子孫細胞中で、当該１以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させること、
ｃ）当該細胞または子孫細胞の脂質含量を分析すること、
ｄ）外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞または子孫細胞と比較して、１以上の非極性脂質のレベルが増加している細胞または子孫細胞を選択すること、
ここで、当該１以上の外因性ポリヌクレオチドは、
ｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子およびＤＧＡＴ、
ｉｉ）ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴおよびオレオシン、
ｉｉｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、
ｉｖ）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、
ｖ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、
ｖｉ）ＭＧＡＴおよびグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｖｉｉ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｖｉｉｉ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｉｘ）ＷＲＩ１転写因子およびＭＧＡＴ、
ｘ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、
ｘｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ、
ｘｉｉ）ＤＧＡＴおよびオレオシン、または、
ｘｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびオレオシン、ならびに、
ｘｉｖ）任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
をコードし、
ここで、各外因性ポリヌクレオチドは、当該細胞または子孫細胞中で当該外因性ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
１つの実施形態において、当該選択細胞または子孫細胞は、
ｉ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
ｉｖ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
ｖ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
ｖｉ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
ｖｉｉ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
ｖｉｉｉ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、または、
ｉｘ）ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、および、ＬＥＣ２またはＢＢＭをコードする第六の外因性ポリヌクレオチド、
を含む。
さらなる実施形態において、選択細胞または子孫細胞は、植物の種子の細胞であり、ＷＲＩ１をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、ＤＧＡＴ、好ましくはＤＧＡＴ１をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、ＭＧＡＴ、好ましくはＭＧＡＴ２をコードする第四の外因性ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、当該種子はさらに、ＧＰＡＴをコードする第五の外因性ポリヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態において、１以上の外因性ポリヌクレオチドが、細胞または子孫細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。
好ましい実施形態において、当該方法はさらに、１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む細胞または子孫細胞から、トランスジェニック植物を再生させるステップを含む。トランスジェニック植物の再生ステップは、細胞もしくはその子孫細胞中での１以上の外因性ポリヌクレオチドの発現ステップの前に、および／または、細胞もしくは子孫細胞の脂質含量の分析ステップの前に、および／または１以上の非極性脂質のレベルが増加している細胞もしくは子孫細胞の選択ステップの前に、行われても良い。当該工程はさらに、トランスジェニック植物から種子または子孫植物を得るステップが含まれても良く、ここで、当該種子または子孫植物は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。
第五の態様の工程は、外因性ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、所望の機能を有しているかどうかを測定するスクリーニングアッセイとして用いられ得る。この態様における１以上の外因性ポリヌクレオチドは、上に定義される配列を含有し得る。さらに、１以上の外因性ポリヌクレオチドは、ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴ、ＷＲＩ１転写因子およびＭＧＡＴ、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびオレオシン、ＤＧＡＴおよびオレオシン、またはＭＧＡＴおよびオレオシンをコードするための方法の前に、公知ではなく、それらに対する候補であり得る。ゆえに、当該工程は、ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴ、ＷＲＩ１転写因子およびＭＧＡＴ、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ、ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびオレオシン、ＤＧＡＴおよびオレオシン、またはＭＧＡＴおよびオレオシンをコードするポリヌクレオチドを同定または選択するアッセイとして用いられても良い。当該候補ポリヌクレオチドは細胞に導入され、当該産物は、当該候補が所望の機能を有しているかどうかを測定するために分析される。
第六の態様において、本発明により、本発明の方法を用いて得られるトランスジェニック植物またはトランスジェニック細胞が提供され、または、それらから得られる種子が提供され、それらは、１以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。
第七の態様において、本発明により、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、１以上の非極性脂質を産生する能力が増強されているトランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子を産生するための、以下をコードする１以上のポリヌクレオチドの使用、または以下をコードする遺伝的構築物の使用が提供される：
ｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１）転写因子およびＤＧＡＴ、
ｉｉ）ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴおよびオレオシン
ｉｉｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、
ｉｖ）モノアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、
ｖ）ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ２（ＤＧＡＴ２）、
ｖｉ）ＭＧＡＴおよびグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、
ｖｉｉ）ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｖｉｉｉ）ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴおよびＤＧＡＴ、
ｉｘ）ＷＲＩ１転写因子およびＭＧＡＴ、
ｘ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、
ｘｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ、
ｘｉｉ）ＤＧＡＴおよびオレオシン、または、
ｘｉｉｉ）ＭＧＡＴおよびオレオシン、および、
ｘｉｖ）任意選択的に、サイレンシング サプレッサー ポリペプチド、
ここで、１以上の各ポリヌクレオチドは、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
１つの実施形態において、本発明により、第一および第二のポリヌクレオチドを有していない対応する細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、１以上の非極性脂質を産生する能力が増強されているトランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子を産生するための、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、１以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるＲＮＡまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドと、１以上の非極性脂質の生合成に関与するＲＮＡまたはポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドの使用を提供し、ここで、当該第一および第二のポリヌクレオチドは各々、当該細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、および、各々が、それぞれ、トランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
さらなる実施形態において、本発明により、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、１以上の非極性脂質を産生する能力が増強されているトランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子を産生するための、１以上のポリヌクレオチドの使用が提供され、ここで、１以上の各ポリヌクレオチドは、当該細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、および、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、および、ここで、非極性脂質（複数含む）は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖）、またはそれらの２以上の組み合わせ、または前述の基、結合もしくは分枝鎖の任意の２、３、４、５または６つを含む脂肪酸を含有する。そのような使用には、スクリーニングアッセイとしての有用性も有する。
第八の態様において、本発明により、種子を産生する方法が提供され、当該工程は以下を含む：
ｉ）本発明による、植物、複数の植物、または非ヒト生物を成長させること、および、
ｉｉ）当該植物、（複数含む）または非ヒト生物から種子を採取すること。
好ましい実施形態において、当該工程は、野外で少なくともおよそ１０００のそのような植物の群を成長させること、および、当該植物群から種子を採取することを含む。当該採取された種子は、容器の中におかれ、当該野外から移送され（たとえば、当該国から輸出され）、または使用の前に保存されても良い。
第九の態様において、本発明により、以下を含む発酵工程が提供される：
ｉ）発酵に適している本発明の非ヒト生物、ならびに発酵および脂肪酸生合成に必要な構成要素を含む液体組成物を含有する容器を提供すること、
ｉｉ）当該容器中に含まれる液体組成物の発酵をもたらす条件を提供すること。
第十の態様において、本発明により、本発明の工程により得ることが可能な、もしくは生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または細胞もしくは子孫細胞、トランスジェニック植物または本発明の種子から得ることが可能な回収脂質または抽出脂質が提供される。回収脂質または抽出脂質、好ましくはたとえば種子油等の油は、増加したＴＡＧ含量、ＤＡＧ含量、ＴＡＧおよびＤＡＧ含量、ＭＡＧ含量、ＰＵＦＡ含量、特定のＰＵＦＡ含量、または特定の脂肪酸含量、および／もしくは総非極性脂質含量を有し得る。好ましい実施形態において、ＭＡＧは２－ＭＡＧである。ＴＡＧ含量、ＤＡＧ含量、ＴＡＧおよびＤＡＧ含量、ＭＡＧ含量、ＰＵＦＡ含量、特定のＰＵＦＡ含量、特定の脂肪酸含量および／もしくは非極性脂質含量の増加の程度は、特長（ｉ）において定義されるものであり得る。
第十一の態様において、本発明により、本発明の工程により生産される工業製品が提供され、好ましくは、それらは炭化水素製品（たとえば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび／または脂肪酸エチルエステル、アルカン（たとえばメタン、エタンまたは長鎖アルカン）、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素および／または水素ガス、バイオアルコール（たとえば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等）である。
第十二の態様において、本発明により、工業製品製造のための、本発明の方法により産生された、植物、本生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、細胞もしくは子孫細胞、トランスジェニック植物、または種子、または採取脂質もしくは抽出脂質の使用が提供される。工業製品は、上述に定義されるものであり得る。
第十三の態様において、本発明により、燃料の製造工程が提供され、当該工程は、以下のステップを含む：
ｉ）任意選択的に触媒の存在下で、本発明の脂質とアルコールを反応させ、アルキルエステルを産生すること、および、
ｉｉ）任意選択的にアルキルエステルと石油ベースの燃料とを混合させること。アルキルエステルは好ましくはメチルエステルである。本工程により製造される燃料は、本発明の脂質またはそれらから製造された炭化水素製品を最小限レベル、たとえば体積の少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％で含有し得る。
第十四の態様において、本発明により、合成ディーゼル燃料を製造する工程が提供され、当該工程は、以下を含む：
ｉ）本発明の生育植物、非ヒト生物もしくはその一部の脂質を、ガス化により合成ガスへと転換すること、および、
ｉｉ）合成ガスを、金属触媒または微生物触媒を用いて、バイオ燃料へと転換すること。
第十五の態様において、本発明により、バイオ燃料を製造する工程が提供され、当該工程は、本発明の生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部を、熱分解によりバイオ油へと転換すること、発酵によりバイオアルコールへと転換すること、またはガス化もしくは嫌気性消化によりバイオガスへと転換することを含む。
第十六の態様において、本発明により、飼料を製造する工程が提供され、当該工程は、本発明の方法により産生された植物、その生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、細胞もしくは子孫細胞、トランスジェニック植物、種子、採取脂質もしくは抽出脂質、またはその抽出物もしくは一部と、少なくとも１つの他の食物成分とを混合することを含む。
第十七の態様において、本発明により、本発明の工程により産生された植物、その生育部分、非ヒト生物もしくはその一部、細胞もしくは子孫細胞、トランスジェニック植物、種子、または本発明の回収脂質もしくは抽出脂質、またはその抽出物もしくは一部を含む、飼料、化粧品または化学薬品が提供される。
必然的に、その油含有量を理由として植物の生育物質を採取する場合、脂質レベルができるだけ高いときに当該物質を採取することが望ましい。本発明者らは、本発明の植物の生育組織の光沢度と油含量との間の関係性、すなわち光沢度が高いと脂質のレベルが高くなるという関係性を見出した。ゆえに、生育物質の光沢度をマーカーとして用いて、材料の採取時期決定を補助することができる。
さらなる態様において、本発明により、１以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞と比較して、１以上の非極性脂質が高いレベルにある、組換え細胞が提供され、
ここで、１以上の各外因性ポリヌクレオチドは、細胞中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、ここで、以下の特長の１つ以上またはすべてが該当する：
（ａ）当該１以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物もしくはその一部の１以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるＲＮＡまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、１以上の非極性脂質の生合成に関与するＲＮＡまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
（ｂ）もし当該細胞が、植物の生育部分の細胞である場合、当該細胞は、少なくとも約３％、より好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも約７％、より好ましくは少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１１％、より好ましくは少なくとも約１２％、より好ましくは少なくとも約１３％、より好ましくは少なくとも約１４％、またはより好ましくは少なくとも約１５％（ｗ／ｗ）の総非極性脂質含量を有する、
（ｃ）当該細胞が、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類からなる群から選択される藻類である、
（ｄ）当該１以上の非極性脂質は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖（たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖）またはそれらの２以上の組み合わせ、または前述の基、結合もしくは鎖の任意の２、３、４、５もしくは６つを含む脂肪酸を含む、
（ｅ）非極性脂質（複数含む）の総脂肪酸含有量が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞中の非極性脂質（複数含む）よりも、少なくとも２％多いオレイン酸および／または少なくとも２％少ないパルミチン酸を含む、
（ｆ）非極性脂質（複数含む）が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞中の非極性脂質（複数含む）と比較して、改変レベルの総ステロール類（好ましくは遊離（非エステル化）ステロール）、ステロールエステル、ステロールグリコシド）を含む、
（ｇ）非極性脂質（複数含む）が、ワックスおよび／またはエステルワックスを含む、および、
（ｈ）当該細胞は、少なくとも約１０００のそのような細胞の、群またはコレクションの一員である。
１つの実施形態において、１以上の外因性ポリヌクレオチドは、第一の外因性ポリヌクレオチドおよび第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、特長（ｂ）～（ｈ）のうちの１以上またはすべてが該当する。
さらなる態様において、本発明により、収穫期の植物の生育組織中の脂質量を最大化するための、植物を採取する時期を決定する方法が提供され、当該方法は、以下を含む：
ｉ）生育組織の光沢を計測すること、
ｉｉ）前もって計測された最小光沢度レベルと、当該測定結果を比較すること、
ｉｉｉ）任意選択的に、当該植物を採取すること。
本発明の他の態様において、植物の生育組織中の脂質の量を予測する方法が提供され、当該方法は、生育組織の光沢を測定することを含む。
上述の２つの態様の好ましい実施形態において、生育組織は、葉（複数含む）またはその一部である。
さらなる態様において、本発明により、本発明の細胞を含む植物または一部を得ることと、金銭的利益のために、得られた植物または植物部分を取引することを含む、植物またはその一部を取引する方法が提供される。
１つの実施形態において、当該方法は、以下の１以上またはすべてをさらに含む：
ｉ）植物を栽培すること、
ｉｉ）当該植物から植物部分を採取すること、
ｉｉｉ）当該植物またはその一部を保存すること、または、
ｉｖ）当該植物またはその一部を異なる場所へ移送すること。
さらなる態様において、本発明により、植物部分が入った容器を作製する工程が提供され、当該工程は、以下を含む：
ａ）本発明の細胞を含む植物部分を、植物から植物部分を回収することにより、または、植物の他の部分から植物部分を分離することにより、採取すること、
ｂ）任意選択的に、採取された植物部分を選別および／または保存すること、ならびに、
ｃ）ａ）の植物部分または、ｂ）の選択されたおよび／または保存された植物部分を、容器内へと入れ、それにより、植物部分の入った容器を作製すること。
本明細書の任意の実施形態は、別様に特定して述べられない限り、任意の他の実施形態に、変更するべきところは変更して、適用されるものとする。
本発明は、本明細書に記述される特定の実施形態により範囲を限定されることは無く、それらは、例示の目的のみを意図されている。機能的に同等な生成物、組成物および方法は、明確に、本明細書に記載される、本発明の範囲内にある。
本明細書を通じて、別様に特定して述べられない限り、または文脈上、別様に要求されない限り、１つのステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群への言及は、それらのステップ、物質の組成、ステップの群または物質の組成の群の１つおよび複数（すなわち、１以上）を包含するものとする。
本発明は、以下の非限定的な実施例により、および付随する図面を参照することにより、以下に記載される。
脂質合成の中心的な分子であるＤＡＧにその大部分が収束する、種々の脂質合成経路の代表的な図である。このモデルは、グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）からＤＡＧを形成するために、二機能性のＭＧＡＴ／ＤＧＡＴによって使用することができ得る、ｓｎ－２－ＭＡＧを形成する１つの可能な経路を含む。省略形は、以下の通りである。Ｇ－３－Ｐ：グリセロール－３－リン酸ＬｙｓｏＰＡ：リゾホスファチジン酸ＰＡ：ホスファチジン酸ＭＡＧ：モノアシルグリセロールＤＡＧ：ジアシルグリセロールＴＡＧ：トリアシルグリセロールアシルＣｏＡおよびＦＡ－ＣｏＡ：アシルコエンザイムＡおよび脂肪酸アシルコエンザイムＡＰＣ：ホスファチジルコリンＧＰＡＴ：グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、グリセロール－３－リン酸 Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：ｓｎ－グリセロール－３－リン酸 １－Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．１５ＧＰＡＴ４：グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ４ＧＰＡＴ６：グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ６ＬＰＡＡＴ：１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ、１－アシルグリセロール－３－リン酸塩 Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：１－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸 ２－Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．５１ＰＡＰ：ホスファチジン酸ホスファターゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、リン酸ホスホヒドロラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼ、ＥＣ ３．１．３．４ＭＧＡＴ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ；２－アシルグリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：２－アシルグリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．２２）活性を有する、アシルトランスフェラーゼＭ／ＤＧＡＴ：モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ；２－アシルグリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：２－アシルグリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．２２）、および／またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ；ジアシルグリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．２０）活性を有する、アシルトランスフェラーゼＬＰＣＡＴ：アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ、１－アシルグリセロホスホコリン Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡ：１－アシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．２３ＰＬＤ－Ｚ：ホスホリパーゼＤゼータ、コリンホスファターゼ、レシチナーゼＤ、リポホスホジエステラーゼＩＩ、ＥＣ ３．１．４．４ＣＰＴ：ＣＤＰコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、１－アルキル－２－アセチルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、アルキルアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルコリン－グリセリドトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．７．８．２ＰＤＣＴ：ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼＰＬＣ：ホスホリパーゼＣ、ＥＣ ３．１．４．３ＰＤＡＴ：リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、リン脂質：１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール Ｏ－アシルトランスフェラーゼ、ＥＣ ２．３．１．１５８Ｐｉ：無機リン酸塩 それぞれが３５Ｓプロモーターから発現した、ｐ１９（陰性対照）、アラビドプシス・サリアナ（アラビドプシス・サリアナ）ＤＧＡＴ１、マス・マスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＭＧＡＴ１、ならびにＤＧＡＴ１およびＭＧＡＴ１の組み合わせをコードする構築物で形質転換したニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉組織における、ＤＡＧおよびＴＡＧの相対的な増加を示す図である。ＭＧＡＴ１酵素は、葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧ双方の蓄積を促進することにおいて、ＤＧＡＴ１酵素よりもはるかに活性であった。ＭＧＡＴ１遺伝子の発現は、ＤＧＡＴ１単独の発現と比較して、葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧの蓄積が２倍になった。 ｐ１９（陰性対照）、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２、ならびにＭＧＡＴ２およびＤＧＡＴ１の組み合わせをコードする構築物で形質転換したニコチアナ・ベンサミアナ葉組織における、ＴＡＧの相対的な増加を示す図である。誤差バーは、３つ組の試料の標準誤差を意味する。 ｓｎ－２－ＭＡＧ［１４Ｃ］および非標識オレイン酸を時間経過とともに供給した、一過性に形質転換したニコチアナ・ベンサミアナ葉溶解物から単離したＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧ画分における放射活性（ＤＰＭ）を示す図である。使用した構築物は、図３と同じである。 図４と同じであるが、［１４Ｃ］Ｇ－３－Ｐおよび非標識オレイン酸を供給した、放射活性を示す図である。 酵母アッセイにおいて、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１、およびＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１によるが、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２にはよらないＴＡＧ形成を示す、ＴＬＣプレートのオートラジオグラムである。アッセイは、実施例５で説明される。 元の対照（形質転換されていない対照）と比較した、ＭＧＡＴ２を発現するキメラＤＮＡで形質転換されたアラビドプシス・サリアナＴ２およびＴ３種子中のＴＡＧレベル。種子は、成熟期（乾燥した）で採取された。ＳＷ：乾燥種子重量。ＴＡＧレベルは、１００μｇ種子重量中のＴＡＧμｇとして表される。 ＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２をコードする構築物で形質転換された形質転換アラビドプシス・サリアナ植物の種子中の総脂肪酸含量。 アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１過剰発現と比較した、一過性に形質転換されたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織中の相対ＴＡＧレベル。 ｐ１９対照、アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１、およびアラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ２のミクロソームを発現するニコチアナ・ベンサミアナの葉組織由来の、ＤＧＡＴアッセイにおける、ｓｎ－１，２－ＤＡＧからのＴＡＧ転換。 ｐＪＰ３３８２およびｐＪＰ３３８３で形質転換されたアラビドプシス・サリアナ種子の総ＦＡＭＥ定量。 ニコチアナ・ベンサミアナの葉において一過性に発現された異なる遺伝子の組み合わせに対して得られた、最大ＴＡＧレベル。Ｖ２陰性対照は、１５の独立した反復実験に基づく平均ＴＡＧレベルを表す。 アラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼおよびＡ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１転写因子をコードする遺伝子の共発現により、ニコチアナ・ベンサミアナの葉におけるＴＡＧレベルに相乗的な効果がもたらされた。示されるデータは、５つの独立した浸透（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｓ）の平均および標準偏差である。 安定的に形質転換されたニコチアナ・ベンサミアナ気生実生組織におけるＴＡＧレベル。総脂質は、ニコチアナ・ベンサミアナ実生の気生組織から抽出され、試料間の正確な比較を行なえるように、ＤＡＧＥ内部標準を用いてＴＬＣ－ＦＩＤにより分析された。 対照ベクター（ｐＯＲＥ０４）、Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＭＧＡＴ１（３５Ｓ：ＭＧＡＴ１）またはＭ． ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＭＧＡＴ２（３５Ｓ：ＭＧＡＴ２）で形質転換されたアラビドプシス・サリアナＴ２種子群の総脂肪酸レベル。 ｐＪＰ３５０２の左右境界の間の、挿入領域のマップ。ＴＥＲ Ｇｌｙｍａ－Ｌｅｃｔｉｎは、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）レクチンターミネーター；Ａｒａｔｈ－ＷＲＩ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ） ＷＲＩ１転写因子コード領域；ＰＲＯ Ａｒａｔｈ－Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター；Ｓｅｓｉｎ－オレオシンは、Ｓｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｃｕｍ オレオシンコード領域；ＰＲＯ ＣａＭＶ３５Ｓ－Ｅｘ２は、二重のエンハンサー領域を有するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ プロモーター；Ａｒａｔｈ－ＤＧＡＴ１は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼコード領域；ＴＥＲ Ａｇｒｔｕ－ＮＯＳは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス） ノパリンシンターゼターミネーターを意味する。 ｐＪＰ３５０３の左右境界の間の挿入領域を含むｐＪＰ３５０３構築物の略図。ＴＥＲ Ａｇｒｔｕ－ＮＯＳは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ノパリンシンターゼターミネーター；Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２は、Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＭＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼ； ＰＲＯ ＣａＭＶ２４Ｓ－Ｅｘ２は、エンハンサー領域が二重化されたカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ；ＴＥＲ Ｇｌｙｍａ－Ｌｅｃｔｉｎは、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）レクチンターミネーター；Ａｒａｔｈ－ＷＲＩ１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）ＷＲＩ１転写因子；ＰＲＯ Ａｒａｔｈ－Ｒｕｂｉｓｃｏ ＳＳＵは、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ｒｕｂｉｓｃｏ 小サブユニットプロモーター；Ｓｅｓｉｎ－オレオシンは、Ｓｅｓａｍｅ ｉｎｄｉｃｕｍ オレオシン；Ａｒａｔｈ－ＤＧＡＴ１は、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼを意味する。 ３種の野生型タバコ植物（ｗｔ１－３）および３つのｐＪＰ３５０３初代形質転換体（４、２９、２１）の異なる齢の葉における、ＴＡＧ産生量。葉のステージは、「Ｇ」は緑、「ＹＧ」は黄緑、「Ｙ」は黄色を示している。サンプリングの間の植物のステージは、発芽、野生型１は最初に現れる開花の時期、野生型２は開花期、野生型３は種子莢の産生時期で行われた（ｐＪＰ３５０３形質転換体）。 Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ） アルファ サブユニット ベータ－コングリシニンプロモーターにより発現されたＵｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｒａｍａｎｎｉａｎａ ＤＧＡＴ２Ａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター３プロモーターにより発現されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）ＷＲＩ１、およびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ） アルファ サブユニット ベータ－コングリシニンプロモーターにより発現されたＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＭＧＡＴ２、に対する発現カセットを含むＤＮＡインサート。遺伝子コード領域および発現カセットは、制限酵素消化により切り取ることができる。 誘導可能なＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｌｃＡプロモーターにより発現されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）ＬＥＣ２およびＷＲＩ１転写因子遺伝子、構造性ＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターにより発現されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）ＤＧＡＴ１、および、構造性ＣｓＶＭＶプロモーターにより発現されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｌｃＲ遺伝子、に対する発現カセットを含むＤＮＡインサート。ＬＥＣ２およびＷＲＩ１転写因子の発現物が、エタノールまたは類似の化合物により誘導される。 ｐＪＰ３５０７マップ ｐＪＰ３５６９マップ
配列表の説明
配列番号１：マス・マスクルスのコドンを最適化したＭＧＡＴ１
配列番号２：マス・マスクルスのコドンを最適化したＭＧＡＴ２
配列番号３：シオナ・インテスチナリスのコドンを最適化したＭＧＡＴ１
配列番号４：トリボリウム・カスタネウムのコドンを最適化したＭＧＡＴ１
配列番号５：ダニオ・レリオのコドンを最適化したＭＧＡＴ１
配列番号６：ダニオ・レリオのコドンを最適化したＭＧＡＴ２
配列番号７：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＡＦ３８４１６３）
配列番号８：マス・マスクルスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＡＦ３８４１６２）
配列番号９：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド転写物変異形（ＸＭ＿００１１６６０５５）
配列番号１０：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド転写物変異形２（ＸＭ＿０５２６０４４．２）
配列番号１１：カニス・ファミリアリスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿５４５６６７．２）
配列番号１２：ボス・タウルスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１００１１５３．２）
配列番号１３：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１０８８０３．１）
配列番号１４：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１２２６２３．１）
配列番号１５：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０７３０１２．４）
配列番号１６：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１８２３８０．５）
配列番号１７：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０６５２５８．３）
配列番号１８：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０７５０６８．３）
配列番号１９：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０７２２４８．３）
配列番号２０：クライベロマイセス・ラクティスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿４５５５８８．１）
配列番号２１：アシビア・ゴシピイのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿２０８８９５．１）
配列番号２２：マグナポルテ・オリザエのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿３６８７４１．１）
配列番号２３：シオナ・インテスチナリスのＭＧＡＴ１ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２１２０８４３．１）
配列番号２４：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＹ１５７６０８）
配列番号２５：マス・マスクルスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＹ１５７６０９）
配列番号２６：パン・トログロデュテスの予測ＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿５２２１１２．２）
配列番号２７：カニス・ファミリアリスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿５４２３０４．１）
配列番号２８：ボス・タウルスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０９９１３６．１）
配列番号２９：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１０９４３６．２）
配列番号３０：ガッルス・ガッルスのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿４２４０８２．２）
配列番号３１：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１００６０８３．１）
配列番号３２：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３６４７４．２）
配列番号３３：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３６４７３．２）
配列番号３４ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１３６４７５．２）
配列番号３５：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１６８８７０９．１）
配列番号３６：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿３１５９８５）
配列番号３７：トリボリウム・カスタネウムのＭＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＸＭ＿９７００５３．１）
配列番号３８：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＡＹ２２９８５４）
配列番号３９：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド転写物変異形１（ＸＭ＿００１１５４１０７．１）
配列番号４０：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド転写物変異形２（ＸＭ＿００１１５４１７１．１）
配列番号４１：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド転写物変異形３（ＸＭ＿５２７８４２．２）
配列番号４２：カニス・ファミリアリスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿８４５２１２．１）
配列番号４３：ボス・タウルスのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿８７０４０６．４）
配列番号４４：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ３ポリヌクレオチド（ＸＭ＿６８８４１３．４）
配列番号４５：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７８．１）
配列番号４６：マス・マスクルスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７７．１）
配列番号４７：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ１ポリペプチドアイソフォーム１（ＸＰ＿００１１６６０５５．１）
配列番号４８：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ１ポリペプチドアイソフォーム２（ＸＰ＿５２６０４４．２）
配列番号４９：カニス・ファミリアリスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿５４５６６７．２）
配列番号５０：ボス・タウルスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１００１１５３．１）
配列番号５１：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１１０２２７３．１）
配列番号５２：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿００１１１６０９５．１）
配列番号５３：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５０５４１３．１）
配列番号５４：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿８７２１８０．１）
配列番号５５：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿４９７６５９．１）
配列番号５６：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５０７４６９．１）
配列番号５７：カエノラブディティス・エレガンスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５０４６４９．１）
配列番号５８：クライベロマイセス・ラクティスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿４５５５８８．１）
配列番号５９：アシビア・ゴシピイのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿９８３５４２．１）
配列番号６０：マグナポルテ・オリザエのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿３６８７４１．１）
配列番号６１：シオナ・インテスチナリスのＭＧＡＴ１ポリペプチド（ＸＰ＿００２１２０８７９）
配列番号６２：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡ０２３６７２．１）
配列番号６３：マス・マスクルスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡ０２３６７３．１）
配列番号６４：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿５２２１１２．２）
配列番号６５：カニス・ファミリアリスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿５４２３０４．１）
配列番号６６：ボス・タウルスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿００１０９２６０６．１）
配列番号６７：ラッタス・ノルベギカスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿００１１０２９０６．２）
配列番号６８：ガッルス・ガッルスのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿４２４０８２．２）
配列番号６９：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿００１００６０８３．１）
配列番号７０：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿６１０３１８．１）
配列番号７１：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿６１０３１７．１）
配列番号７２：ドロソフィラ・メラノガスターのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿６１０３１９．２）
配列番号７３：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿００１６８８７６１）
配列番号７４：アノフェレス・ガンビェのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿３１５９８５．３）
配列番号７５：トリボリウム・カスタネウムのＭＧＡＴ２ポリペプチド（ＸＰ＿９７５１４６）
配列番号７６ ：ホモ・サピエンスのＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＡＡ０６３５７９．１）
配列番号７７：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ３ポリペプチドアイソフォーム１（ＸＰ＿００１１５４１０７．１）
配列番号７８：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ３ポリペプチドアイソフォーム２（ＸＰ＿００１１５４１７１．１）
配列番号７９：パン・トログロデュテスのＭＧＡＴ３アイソフォーム３（ＸＰ＿５２７８４２．２）
配列番号８０：カニス・ファミリアリスのＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＸＰ＿８５０３０５．１）
配列番号８１：ボス・タウルスのＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＸＰ＿８７５４９９．３）
配列番号８２：ダニオ・レリオのＭＧＡＴ３ポリペプチド（ＸＰ＿６９３５０５．１）
配列番号８３：アラビドプシス・サリアナのＤＧＡＴ１ポリペプチド（ＣＡＢ４４７７４．１）
配列番号８４：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１０００４３．４）
配列番号８５：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ６ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１２９３６７．３）
配列番号８６：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＡＦ１９５１１５．１）
配列番号８７：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＡＹ０６２４６６．１）
配列番号８８：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＡＣ１１８１３３．４）
配列番号８９：ピセア・シトケンシスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＥＦ０８６０９５．１）
配列番号９０：ゼア・マイスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＢＴ０６７６４９．１）
配列番号９１：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＡＫ２２８８７０．１）
配列番号９２オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＡＫ２４１０３３．１）
配列番号９３：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＣＭ０００１２７．１）
配列番号９４：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＣＭ０００１３０．１）
配列番号９５：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＣＭ０００１３９．１）
配列番号９６：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＣＭ０００１２６．１）
配列番号９７：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＣＭ０００１２８．１）
配列番号９８：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＣＭ０００１４０．１）
配列番号９９：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６６７．１）
配列番号１００：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６６７．１）
配列番号１０１：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６４８．１）
配列番号１０２：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７６２２．１）
配列番号１０３：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７５９０．１）
配列番号１０４：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７５７６．１）
配列番号１０５：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＧＬ３７７５７６．１）
配列番号１０６：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０５１３７４．２）
配列番号１０７：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０５２２０３．１）
配列番号１０８：ゼア・マイスのＧＰＡＴ８ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１５３９７０．１）
配列番号１０９：ゼア・マイスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１５５８３５．１）
配列番号１１０：ゼア・マイスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１１７４８８０．１）
配列番号１１１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（アブラナ）のＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＪＱ６６６２０２．１）
配列番号１１２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ８ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１６２６４．５）
配列番号１１３：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７６４９４９．１）
配列番号１１４：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７６９６１９．１）
配列番号１１５：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７６９６７２．１）
配列番号１１６：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００１７７１１３４．１）
配列番号１１７：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリヌクレオチドＸＭ＿００１７８０４８１．１）
配列番号１１８：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２６８４７７．１）
配列番号１１９：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２７５３１２．１）
配列番号１２０：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２７５９９６．１）
配列番号１２１：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２２７９０５５．１）
配列番号１２２：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３０９０８８．１）
配列番号１２３：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３０９２４０．１）
配列番号１２４：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３２２７１６．１）
配列番号１２５：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３２３５２７．１）
配列番号１２６：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４３９８４２．１）
配列番号１２７：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４５８７４１．１）
配列番号１２８：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４６３８７１．１）
配列番号１２９：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４６４５８５．１）
配列番号１３０：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５１１８２７．１）
配列番号１３１：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５１７３９２．１）
配列番号１３２：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５２０１２５．１）
配列番号１３３：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８７２９０９．１）
配列番号１３４：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ６ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８８１５１８．１）
配列番号１３５：ベルニシア・フォルジイの推定ＧＰＡＴ８ポリヌクレオチド（ＦＪ４７９７５３．１）
配列番号１３６：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０５７７２４．１）
配列番号１３７：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＪＱ６６６２０３．１）
配列番号１３８：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２３２０１０２．１）
配列番号１３９：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２４５１３３２．１）
配列番号１４０：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２５３１３０４．１）
配列番号１４１：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ４ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８８９３１５．１）
配列番号１４２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１００５３１．２）
配列番号１４３：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ３ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１６４２６．２）
配列番号１４４：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＮＰ＿１７１６６７．１）
配列番号１４５：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ６ポリペプチド（ＮＰ＿１８１３４６．１）
配列番号１４６：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴポリペプチド（ＡＡＦ０２７８４．１）
配列番号１４７：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴポリペプチド（ＡＡＬ３２５４４．１）
配列番号１４８：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＡＡＰ０３４１３．１）
配列番号１４９：ピセア・シトケンシスのＧＰＡＴポリペプチド（ＡＢＫ２５３８１．１）
配列番号１５０：ゼア・マイスのＧＰＡＴポリペプチド（ＡＣＮ３４５４６．１）
配列番号１５１：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴポリペプチド（ＢＡＦ００７６２．１）
配列番号１５２：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＢＡＨ００９３３．１）
配列番号１５３：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＡＹ８４１８９．１）
配列番号１５４：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＡＹ９８２４５．１）
配列番号１５５：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＡＺ２１４８４．１）
配列番号１５６：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＥＣ７１８２６．１）
配列番号１５７：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＥＣ７６１３７．１）
配列番号１５８：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＥＥ５９８８２．１）
配列番号１５９：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ０８９６３．１）
配列番号１６０：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ０８９６４．１）
配列番号１６１：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ１１２００．１）
配列番号１６２：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ１５６６４．１）
配列番号１６３：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ２４０８６．１）
配列番号１６４：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ２９８１６．１）
配列番号１６５：セラギネラ・ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉのＧＰＡＴポリペプチド（ＥＦＪ２９８１７．１）
配列番号１６６：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＮＰ＿００１０４４８３９．１）
配列番号１６７：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＮＰ＿００１０４５６６８．１）
配列番号１６８：ゼア・マイスのＧＰＡＴ８ポリペプチド（ＮＰ＿００１１４７４４２．１）
配列番号１６９：ゼア・マイスのＧＰＡＴポリペプチド（ＮＰ＿００１１４９３０７．１）
配列番号１７０：ゼア・マイスのＧＰＡＴポリペプチド（ＮＰ＿００１１６８３５１．１）
配列番号１７１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＡＦＨ０２７２４．１）
配列番号１７２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ８ポリペプチド（ＮＰ＿１９１９５０．２）
配列番号１７３：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００１７６５００１．１）
配列番号１７４：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００１７６９６７１．１）
配列番号１７５：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００１７６９７２４．１）
配列番号１７６：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００１７７１１８６．１）
配列番号１７７：フィスコミトレラ・パテンスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００１７８０５３３．１）
配列番号１７８：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２２６８５１３．１）
配列番号１７９：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２２７５３４８．１）
配列番号１８０：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２２７６０３２．１）
配列番号１８１：ヴィティス・ヴィニフェラのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２２７９０９１．１）
配列番号１８２：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２３０９１２４．１）
配列番号１８３：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２３０９２７６．１）
配列番号１８４：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２３２２７５２．１）
配列番号１８５：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２３２３５６３．１）
配列番号１８６：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２４３９８８７．１）
配列番号１８７：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２４５８７８６．１）
配列番号１８８：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２４６３９１６．１）
配列番号１８９：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２４６４６３０．１）
配列番号１９０：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２５１１８７３．１）
配列番号１９１：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２５１７４３８．１）
配列番号１９２：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２５２０１７１．１）
配列番号１９３：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２８７２９５５．１）
配列番号１９４：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ６ポリペプチド（ＸＰ＿００２８８１５６４．１）
配列番号１９５：ベルニシア・フォルジイのＧＰＡＴポリペプチド（ＡＣＴ３２０３２．１）
配列番号１９６：オリザ・サティバのＧＰＡＴポリペプチド（ＮＰ＿００１０５１１８９．１）
配列番号１９７：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＡＦＨ０２７２５．１）
配列番号１９８：ポピュラス・トリコカルパのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２３２０１３８．１）
配列番号１９９：ソルガム・バイカラーのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２４５１３７７．１）
配列番号２００：リシナス・コムニスのＧＰＡＴポリペプチド（ＸＰ＿００２５３１３５０．１）
配列番号２０１：アラビドプシス・ｌｙｒａｔａのＧＰＡＴ４ポリペプチド（ＸＰ＿００２８８９３６１．１）
配列番号２０２：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ１ポリペプチド（ＮＰ＿５６３７６８．１）
配列番号２０３：アラビドプシス・サリアナのＧＰＡＴ３ポリペプチド（ＮＰ＿１９２１０４．１）
配列番号２０４：アラビドプシス・サリアナのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１５０１１．３）
配列番号２０５：リシナス・コムニスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＹ９１６１２９．１）
配列番号２０６：ベルニシア・フォルジイのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＤＱ３５６６８２．１）
配列番号２０７：モルティエレラ・ラマニアナのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＦ３９１０８９．１）
配列番号２０８：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿０３２５６４．１）
配列番号２０９：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０１３５７９．２）
配列番号２１０：ボス・タウルスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＮＭ＿２０５７９３．２）
配列番号２１１：マス・マスクルスのＤＧＡＴ２ポリヌクレオチド（ＡＦ３８４１６０．１）
配列番号２１２：アラビドプシス・サリアナのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＮＰ＿５６６９５２．１）
配列番号２１３：リシナス・コムニスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＹ１６３２４．１）
配列番号２１４ ：ベルニシア・フォルジイのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＢＣ９４４７４．１）
配列番号２１５：モルティエレラ・ラマニアナのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７９．１）
配列番号２１６：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ９６ＰＤ７．２）
配列番号２１７：ホモ・サピエンスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ５８ＨＴ５．１）
配列番号２１８：ボス・タウルスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（Ｑ７０ＶＺ８．１）
配列番号２１９：マス・マスクルスのＤＧＡＴ２ポリペプチド（ＡＡＫ８４１７５．１）
配列番号２２０：ＹＦＰトリペプチド－保存ＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２配列モチーフ
配列番号２２１：ＨＰＨＧテトラペプチド－保存ＤＧＡＴ２またはＭＧＡＴ１／２配列モチーフ
配列番号２２２：ＥＰＨSテトラペプチド－保存植物ＤＧＡＴ２配列モチーフ
配列番号２２３：ＲＸＧＦＸ（Ｋ／Ｒ）ＸＡＸＸＸＧＸＸＸ（Ｌ／Ｖ）ＶＰＸＸＸＦＧ（Ｅ／Ｑ）－推定グリセロールリン脂質ドメインの一部であるＤＧＡＴ２の長い保存配列モチーフ
配列番号２２４：ＦＬＸＬＸＸＸＮ－マウスＤＧＡＴ２の保存配列モチーフおよび推定中性脂質結合ドメインであるＭＧＡＴ１／２
配列番号２２５：ＧＰＡＴのｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３）
配列番号２２６：ＧＰＡＴのＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０）スーパーファミリードメイン
配列番号２２７ホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２）。ＧＰＡＴ４～８は、このドメインに相同のＮ末端領域を含む。
配列番号２２８：保存ＧＰＡＴアミノ酸配列ＧＤＬＶＩＣＰＥＧＴＴＣＲＥＰ
配列番号２２９：保存ＧＰＡＴ／ホスファターゼアミノ酸配列（モチーフＩ）
配列番号２３０：保存ＧＰＡＴ／ホスファターゼアミノ酸配列（モチーフＩＩＩ）
配列番号２３１：アラビドプシス・サリアナのＷＲＩ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿２０２７０１．２）
配列番号２３２：アラビドプシス・サリアナＷＲＩ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿００１０３５７８０．２）
配列番号２３３：アラビドプシス・サリアナＷＲＩ１ポリヌクレオチド（ＮＭ＿１１５２９２．４）
配列番号２３４：アラビドプシス ｌｙｒａｔａ亜種 ｌｙｒａｔａ ポリヌクレオチド（ＸＭ＿００２８７６２０５．１）
配列番号２３５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＷＲＩ１ポリヌクレオチド（ＤＱ３７０１４１．１）
配列番号２３６：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＷＲＩ１ポリヌクレオチド（ＨＭ３７０５４２．１）
配列番号２３７：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ） ＷＲＩ１ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５３０３２２．１）
配列番号２３８：Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ（ナンヨウアブラギリ） ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＪＦ７０３６６６．１）
配列番号２３９：リシナス・コムニス ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２５２５２５９．１）
配列番号２４０：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２３１６４２３．１）
配列番号２４１：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（ヤマカモジグサ） ＷＲＩ１ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５７８９４９．１）
配列番号２４２：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（オオムギ） 亜種 ｖｕｌｇａｒｅ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＡＫ３５５４０８．１）
配列番号２４３：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２４５０１４９．１）
配列番号２４４：ゼア・マイス ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＥＵ９６０２４９．１）
配列番号２４５：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５６１１４１．１）
配列番号２４６：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２４３７７７４．１）
配列番号２４７：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２４４１３９９．１）
配列番号２４８：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５３０６３８．１）
配列番号２４９：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５５３１５５．１）
配列番号２５０：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２３１５７５８．１）
配列番号２５１：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ブドウ） ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２２７０１１３．１）
配列番号２５２：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５３３５００．１）
配列番号２５３：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５５１６７５．１）
配列番号２５４：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ（タルウマゴヤシ） ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３６２１０６９．１）
配列番号２５５：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２３２３８００．１）
配列番号２５６：リシナス・コムニス ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２５１７４２８．１）
配列番号２５７：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５７２１８８．１）
配列番号２５８：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２４４４３８４．１）
配列番号２５９：ゼア・マイス ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿００１１７６８８８．１）
配列番号２６０：アラビドプシス ｌｙｒａｔａ 亜種 ｌｙｒａｔａ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２８８９２１９．１）
配列番号２６１：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿１０６６１９．３）
配列番号２６２：アラビドプシス ｌｙｒａｔａ 亜種 ｌｙｒａｔａ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２８９００９９．１）
配列番号２６３：Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＡＫ３５２７８６．１）
配列番号２６４：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿１０１４７４．２）
配列番号２６５：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５３０３０２．１）
配列番号２６６：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５７８０９４．１）
配列番号２６７：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２４６０１９１．１）
配列番号２６８：ゼア・マイス ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿００１１５２８６６．１）
配列番号２６９：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５１９１１９．１）
配列番号２７０：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５５０６２８．１）
配列番号２７１：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３６１０２１３．１）
配列番号２７２：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５２３９８２．１）
配列番号２７３：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５２５９０１．１）
配列番号２７４：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２３２５０７５．１）
配列番号２７５：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２２７３０１０．２）
配列番号２７６：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド （ ＸＭ＿００２３０３８３０．１）
配列番号２７７：Ｌｕｐｉｎｉｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド、部分配列（ＮＡ－０８０８１８＿Ｐｌａｔｅ１４ｆ０６．ｂ１）
配列番号２７８：Ｌｕｐｉｎｉｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ ＷＲＩ１ ポリヌクレオチド
配列番号２７９：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリペプチド （Ａ８ＭＳ５７）
配列番号２８０：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリペプチド （Ｑ６Ｘ５Ｙ６）
配列番号２８１：アラビドプシス ｌｙｒａｔａ 亜種 ｌｙｒａｔａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２８７６２５１．１）
配列番号２８２：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＷＲＩ１ポリペプチド（ＡＢＤ１６２８２．１）
配列番号２８３：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＷＲＩ１ポリペプチド（ＡＤＯ１６３４６．１）
配列番号２８４：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ポリペプチド （ＸＰ＿００３５３０３７０．１）
配列番号２８５：Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ ＷＲＩ１ポリペプチド （ＡＥＯ２２１３１．１）
配列番号２８６：リシナス・コムニス ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２５２５３０５．１）
配列番号２８７：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２３１６４５９．１）
配列番号２８８：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＣＢＩ２９１４７．３）
配列番号２８９：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００３５７８９９７．１）
配列番号２９０：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ． ｖｕｌｇａｒｅ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＢＡＪ８６６２７．１）
配列番号２９１：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ） ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＥＡＹ７９７９２．１）
配列番号２９２：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２４５０１９４．１）
配列番号２９３：ゼア・マイス ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＡＣＧ３２３６７．１）
配列番号２９４：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００３５６１１８９．１）
配列番号２９５：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＡＢＬ８５０６１．１）
配列番号２９６：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＢＡＤ６８４１７．１）
配列番号２９７：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２４３７８１９．１）
配列番号２９８：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２４４１４４４．１）
配列番号２９９：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３０６８６．１）
配列番号３００：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５５３２０３．１）
配列番号３０１：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２３１５７９４．１）
配列番号３０２：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２２７０１４９．１）
配列番号３０３：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３３５４８．１）
配列番号３０４：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５５１７２３．１）
配列番号３０５：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３６２１１１７．１）
配列番号３０６：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２３２３８３６．１）
配列番号３０７：リシナス・コムニス ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２５１７４７４．１）
配列番号３０８：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＣＡＮ７９９２５．１）
配列番号３０９：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００３５７２２３６．１）
配列番号３１０：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＢＡＤ１００３０．１）
配列番号３１１：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２４４４４２９．１）
配列番号３１２：ゼア・マイス ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＮＰ＿００１１７０３５９．１）
配列番号３１３：アラビドプシス ｌｙｒａｔａ 亜種 ｌｙｒａｔａ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２８８９２６５．１）
配列番号３１４：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＡＡＦ６８１２１．１）
配列番号３１５：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＮＰ＿１７８０８８．２）
配列番号３１６：アラビドプシス ｌｙｒａｔａ 亜種 ｌｙｒａｔａ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２８９０１４５．１）
配列番号３１７：Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＢＡＪ３３８７２．１）
配列番号３１８：アラビドプシス・サリアナ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＮＰ＿５６３９９０．１）
配列番号３１９：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５３０３５０．１）
配列番号３２０：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５７８１４２．１）
配列番号３２１：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＥＡＺ０９１４７．１）
配列番号３２２：ソルガム・バイカラー ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２４６０２３６．１）
配列番号３２３：ゼア・マイス ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＮＰ＿００１１４６３３８．１）
配列番号３２４：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５１９１６７．１）
配列番号３２５：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５５０６７６．１）
配列番号３２６：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００３６１０２６１．１）
配列番号３２７：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５２４０３０．１）
配列番号３２８：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００３５２５９４９．１）
配列番号３２９：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリペプチド（ＸＰ＿００２３２５１１１．１）
配列番号３３０：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＣＢＩ３６５８６．３）
配列番号３３１：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２２７３０４６．２）
配列番号３３２：ポピュラス・トリコカルパ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＸＰ＿００２３０３８６６．１）
配列番号３３３：Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ ＷＲＩ１ ポリペプチド （ＣＢＩ２５２６１．３）
配列番号３３４：Ｓｏｒｂｉ－ＷＲＬ１
配列番号３３５：Ｌｕｐａｎ－ＷＲＬ１
配列番号３３６：Ｒｉｃｃｏ－ＷＲＬ１
配列番号３３７：Ｌｕｐｉｎ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ ＷＲＩ１ ポリペプチド
配列番号３３８：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ＤＧＡＴ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿７５００７９．１）
配列番号３３９：リシナス・コムニス ＤＧＡＴ ポリヌクレオチド （ＡＹ３６６４９６．１）
配列番号３４０：Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ ＤＧＡＴ１ ポリヌクレオチド （ＤＱ３５６６８０．１）
配列番号３４１：Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ ＤＧＡＴ１ ポリヌクレオチド （ＥＦ６５３２７６．１）
配列番号３４２：Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ ＤＧＡＴ１ ポリヌクレオチド （ＥＦ６５３２７７．１）
配列番号３４３：Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ（ニシキギ） ＤＧＡＴ１ ポリヌクレオチド （ＡＹ７５１２９７．１）
配列番号３４４：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（線虫） ＤＧＡＴ１ ポリヌクレオチド （ＡＦ２２１１３２．１）
配列番号３４５：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ドブネズミ） ＤＧＡＴ１ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿０５３４３７．１）
配列番号３４６：ホモ・サピエンス ＤＧＡＴ１ポリヌクレオチド （ＮＭ＿０１２０７９．４）
配列番号３４７：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（アスペルギルス フミガーツス） ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＸＰ＿７５５１７２．１）
配列番号３４８：リシナス・コムニス ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＡＡＲ１１４７９．１）
配列番号３４９：Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＡＢＣ９４４７２．１）
配列番号３５０：Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＡＢＶ２１９４５．１）
配列番号３５１：Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＡＢＶ２１９４６．１）
配列番号３５２：Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＡＡＶ３１０８３．１）
配列番号３５３：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＡＡＦ８２４１０．１）
配列番号３５４：Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＮＰ＿４４５８８９．１）
配列番号３５５：ホモ・サピエンス ＤＧＡＴ１ ポリペプチド （ＮＰ＿０３６２１１．２）
配列番号３５６：ＷＲＩ１モチーフ（Ｒ Ｇ Ｖ Ｔ／Ｓ Ｒ Ｈ Ｒ Ｗ Ｔ Ｇ Ｒ）
配列番号３５７：ＷＲＩ１モチーフ（Ｆ／Ｙ Ｅ Ａ Ｈ Ｌ Ｗ Ｄ Ｋ）
配列番号３５８：ＷＲＩ１モチーフ（Ｄ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｋ Ｙ Ｗ Ｇ）
配列番号３５９：ＷＲＩ１モチーフ（Ｓ Ｘ Ｇ Ｆ Ｓ／Ａ Ｒ Ｇ Ｘ）
配列番号３６０：ＷＲＩ１モチーフ（Ｈ Ｈ Ｈ／Ｑ Ｎ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｗ Ｅ Ａ Ｒ Ｉ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｖ）
配列番号３６１：ＷＲＩ１モチーフ（Ｑ Ｅ Ｅ Ａ Ａ Ａ Ｘ Ｙ Ｄ）
配列番号３６２：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン ポリペプチド （ＣＡＡ５７５４５．１）
配列番号３６３：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ１－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５０４．１）
配列番号３６４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ２－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５０３．１）
配列番号３６５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ３－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５１３．１）
配列番号３６６：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ４－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５０７．１）
配列番号３６７：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ５－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５１１．１）
配列番号３６８：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ラッカセイ） オレオシン １ ポリペプチド （ＡＡＺ２０２７６．１）
配列番号３６９：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン ２ ポリペプチド （ＡＡＵ２１５００．１）
配列番号３７０：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン ３ ポリペプチド （ＡＡＵ２１５０１．１）
配列番号３７１：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン ５ ポリペプチド （ＡＢＣ９６７６３．１）
配列番号３７２：リシナス・コムニス オレオシン １ ポリペプチド （ＥＥＦ４０９４８．１）
配列番号３７３：リシナス・コムニス オレオシン ２ ポリペプチド （ＥＥＦ５１６１６．１）
配列番号３７４：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ オレオシン アイソフォームａ ポリペプチド （Ｐ２９５３０．２）
配列番号３７５：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ オレオシン アイソフォームｂ ポリペプチド （Ｐ２９５３１．１）
配列番号３７６：Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻） オレオシン低分子量アイソフォームポリペプチド （ＡＢＢ０１６２２．１）
配列番号３７７：Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍのオレオシン高分子量アイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列（ＡＢＢ０１６２４．１）
配列番号３７８：Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）オレオシン ポリペプチド（ＣＡＡ４４２２４．１）
配列番号３７９：ゼア・マイス オレオシン ポリペプチド （ＮＰ＿００１１０５３３８．１）
配列番号３８０：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン ポリペプチド （ＡＢＭ３０１７８．１）
配列番号３８１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン ＳＬＯ１－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５２２．１）
配列番号３８２：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン ＳＬＯ２－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５２５．１）
配列番号３８３：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ） ステロレオシン ポリペプチド （ＡＡＬ１３３１５．１）
配列番号３８４：ゼア・マイス ステロレオシン ポリペプチド （ＮＰ＿００１１５２６１４．１）
配列番号３８５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ カレオシン ＣＬＯ－１ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５２９．１）
配列番号３８６：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ カレオシン ＣＬＯ－３ ポリペプチド （ＡＣＧ６９５２７．１）
配列番号３８７：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ カレオシン ポリペプチド （ＡＡＦ１３７４３．１）
配列番号３８８：ゼア・マイス カレオシン ポリペプチド （ＮＰ＿００１１５１９０６．１）
配列番号３８９：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン ポリヌクレオチド （Ｘ８２０２０．１）
配列番号３９０：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ１－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２５６．１）
配列番号３９１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ２－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２５５．１）
配列番号３９２：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ３－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２６５．１）
配列番号３９３：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ４－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２５９．１）
配列番号３９４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン Ｓ５－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２６３．１）
配列番号３９５：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン １ ポリヌクレオチド （ＤＱ０９７７１６．１）
配列番号３９６：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン ２ ポリヌクレオチド （ＡＹ７２２６９５．１）
配列番号３９７：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン ３ ポリヌクレオチド （ＡＹ７２２６９６．１）
配列番号３９８：Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン ５ ポリヌクレオチド （ＤＱ３６８４９６．１）
配列番号３９９：Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ オレオシン ポリヌクレオチド （Ｘ６２３５２．１）
配列番号４００：ゼア・マイス オレオシン ポリヌクレオチド （ＮＭ＿００１１１１８６８．１）
配列番号４０１：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン ポリヌクレオチド （ＥＦ１４３９１５．１）
配列番号４０２：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン ＳＬＯ１－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２７４．１）
配列番号４０３：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン ＳＬＯ２－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２７７．１）
配列番号４０４：ゼア・マイス ステロレオシン ポリヌクレオチド （ＮＭ＿００１１５９１４２．１）
配列番号４０５：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ カレオシン ＣＬＯ－１ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２８１．１）
配列番号４０６：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ カレオシン ＣＬＯ－３ ポリヌクレオチド （ＥＵ６７８２７９．１）
配列番号４０７：Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ カレオシン ポリヌクレオチド（ＡＦ１０９９２１．１）
配列番号４０８：ゼア・マイス カレオシン ポリヌクレオチド （ＮＭ＿００１１５８４３４．１）
配列番号４０９：ｐＪＰ３５０２全ベクター配列（３遺伝子）
配列番号４１０：ｐＪＰ３５０３全ベクター配列（４遺伝子）
配列番号４１１：ｐＪＰ３５０２ ＴＤＮＡ（ゲノムへと挿入）配列
配列番号４１２：ｐＪＰ３５０３ ＴＤＮＡ（ゲノムへと挿入）配列
配列番号４１３：ｐＪＰ３５０７ベクター配列
配列番号４１４：リンカー配列
配列番号４１５：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｓｙｎｅｒｇｙ
配列番号４１６：１２ＡＢＦＪＹＣ＿ｐＪＰ３５６９＿ｉｎｓｅｒｔ
配列番号４１７：ｈｐＲＮＡｉサイレンシングのために選択された部分Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ＣＧＩ－５８配列（ｐＴＶ４６）
配列番号４１８：ｈｐＲＮＡｉサイレンシングのために選択された部分Ｎ． ｔａｂａｃｕｍ ＡＧＰａｓｅ配列（ｐＴＶ３５）
配列番号４１９：ＧＸＳＸＧリパーゼモチーフ
配列番号４２０：ＨＸ（４）Ｄ アシルトランスフェラーゼモチーフ
配列番号４２１：ＶＸ（３）ＨＧＦ 推定脂質結合モチーフ
配列番号４２２：アラビドプシス・サリアナ ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿１１８５４８．１）
配列番号４２３：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５７８４０２．１）
配列番号４２４：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３５２３５９０．１）
配列番号４２５：ゼア・マイス ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿００１１５５５４１．１）
配列番号４２６：ソルガム・バイカラー ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２４６０４９３．１）
配列番号４２７：リシナス・コムニス ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００２５１０４３９．１）
配列番号４２８：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＣＧｉ５８ ポリヌクレオチド （ＸＭ＿００３６０３６８５．１）
配列番号４２９：アラビドプシス・サリアナ ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＮＰ＿１９４１４７．２）
配列番号４３０：Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＸＰ＿００３５７８４５０．１）
配列番号４３１：Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＸＰ＿００３５２３６３８．１）
配列番号４３２：ゼア・マイス ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＮＰ＿００１１４９０１３．１）
配列番号４３３：ソルガム・バイカラー ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＸＰ＿００２４６０５３８．１）
配列番号４３４：リシナス・コムニス ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＸＰ＿００２５１０４８５．１）
配列番号４３５：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＸＰ＿００３６０３７３３．１）
配列番号４３６：Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＣＧｉ５８ ポリペプチド （ＥＡＺ０９７８２．１）
配列番号４３７：アラビドプシス・サリアナ ＬＥＣ２ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿１０２５９５．２）
配列番号４３８：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＬＥＣ２ ポリヌクレオチド （Ｘ６０３８７．１）
配列番号４３９：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＥＣ２ ポリヌクレオチド （ＨＭ３７０５３９．１）
配列番号４４０：アラビドプシス・サリアナ ＢＢＭ ポリヌクレオチド （ＮＭ＿１２１７４９．２）
配列番号４４１：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＢＢＭ ポリヌクレオチド （ＡＹ８９９９０９．１）
配列番号４４２：アラビドプシス・サリアナ ＬＥＣ２ ポリペプチド （ＮＰ＿５６４３０４．１）
配列番号４４３：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＬＥＣ２ ポリペプチド （ＣＡＡ４２９３８．１）
配列番号４４４：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＬＥＣ２ ポリペプチド （ＡＤＯ１６３４３．１）
配列番号４４５：アラビドプシス・サリアナ ＢＢＭ ポリペプチド （ＮＰ＿１９７２４５．２）
配列番号４４６：Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＢＢＭ ポリペプチド （ＡＡＷ８２３３４．１）
配列番号４４７：誘導可能なＡｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｌｃＡ プロモーター
配列番号４４８：エタノールの存在下でＡｌｃＡプロモーターを活性化する、ＡｌｃＲインデューサー
一般的な手法および定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、脂質および脂肪酸化学、バイオ燃料生成、ならびに生化学において）当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有するものと解釈されるものとする。
別途指示されていない限り、本発明で利用される組み換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的手法は、標準的な手順であり、当業者によく知られている。そのような手法は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １および２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９５および１９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての最新版を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、およびＪ．Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての最新版を含む）等の出展の文献全体を通して記載および説明されている。
選択された定義
「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、例えば、外因性ポリヌクレオチド（導入遺伝子）または外因性ポリペプチドを含む、植物、藻類、非ヒト動物、または酵母もしくは真菌等の発酵に好適な生物全体を指す。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、動物またはその一部ではない。一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、日光からエネルギーを得て、栄養のための有機化合物を合成することができる、光合成生物（例えば、植物または藻類）である。別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、光合成細菌である。
「外因性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの関連において、その自然な状態ではポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有しない細胞に存在するときの、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。そのような細胞は、本明細書において、「組換え細胞」または「トランスジェニック細胞」と呼称される。１つの実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む細胞に対して異なる属由来である。別の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる種に由来する。一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、宿主植物または植物細胞において発現し、外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異なる種または属に由来する。外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然発生のものではなくともよく、たとえば、組換えＤＮＡ技術により製造される合成ＤＮＡ分子等であってもよい。ＤＮＡ分子は、多くの場合、好ましくは、細胞での発現に最適化されたコドンである、タンパク質コード領域を含んでも良く、それにより、タンパク質コード領域の核酸配列は非天然発生型であるが、天然発生型のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが製造される。外因性ポリヌクレオチドは、以下をコードしても良く、または外因性ポリペプチドは、以下であっても良い：ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）（たとえばＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２）、グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）（たとえばＭＡＧを合成することができるＧＰＡＴ等）、Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １（ＷＲＩ１）転写因子、オレオシンまたは、サイレンシングサプレッサーポリペプチド。１つの実施形態において、外因性ポリペプチドは、たとえばＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２等の外因性ＭＧＡＴである。
本明細書で使用される「抽出脂質」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含む、トランスジェニック生物またはその一部から抽出される組成物を指す。
本明細書で使用される「非極性脂質」という用語は、有機溶媒には溶解するが、水には溶解しない、脂肪酸およびその誘導体を指す。脂肪酸は、遊離脂肪酸および／またはエステル化形態であってもよい。エステル化形態の例としては、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。非極性脂質としては、ステロール、ステロールエステル、および蝋エステルも挙げられる。非極性脂質は、「中性脂質」としても知られている。非極性脂質は、典型的に、室温で液体である。好ましくは、非極性脂質は、主に（５０％超の）、少なくとも１６個の炭素長である、脂肪酸を含む。より好ましくは、非極性脂質中の総脂肪酸の少なくとも５０％は、Ｃ１８脂肪酸、例えばオレイン酸である。一実施形態において、本発明の非極性脂質中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％を、ＴＡＧとして見出すことができる。非極性脂質は、例えば、強塩基で加水分解して遊離脂肪酸を放出させることによって、または分画、蒸留等によって、さらに精製または処理してもよい。非極性脂質は、たとえば種子、葉もしくは果実等の植物部分、または組換え細胞、またはたとえば酵母等の非ヒト生物に存在してもよく、またはそれらから得ても良い。本発明の非極性脂質は、種子から得られた場合に、「種子油」の一部を形成し得る。遊離ステロールおよびエステル化ステロール（たとえば、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、Δ５－アベナステロール（ａｖｅｎａｓｔｅｒｏｌ）、シトスタノール、カンペスタノール、およびコレステロール等）の抽出脂質中の濃度は、Phillips et al., 2002に記述されるものであってもよい。植物油中のステロールは、遊離アルコール、脂肪酸の付随したエステル（エステル化ステロール）、ステロールのグリコシドおよりアシル化グリコシドとして存在する。天然発生の植物油（種子油）中のステロール濃度は、最大で約１１００ｍｇ／１００ｇまでの範囲である。水素化ヤシ油は、最も低い天然発生植物油の濃度（約６０ｍｇ／１００ｇ）を有するものの一つである。本発明の採取種子油または抽出種子油は、好ましくは、約１００～約１０００ｍｇ総ステロール／１００ｇ油である。食物または飼料としての使用のためには、ステロールはグリコシル化形態ではなく、遊離形態またはエステル化形態として主に存在するほうが好ましい。本発明の種子油において、当該油中のステロールの好ましくは少なくとも５０％が、エステル化ステロールとして存在する（約２５％のエステル化ステロールを有する大豆種子油を除く）。本発明のカノーラ種子油および菜種油は、好ましくは、約５００～約８００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールであり、カンペステロールが次に最も多いステロールである。本発明のトウモロコシ種子油は、好ましくは、約６００～約８００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明の大豆種子油は、好ましくは、約１５０～約３５０ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールであり、スチグマステロールが次に最も多いステロールであり、エステル化ステロールよりも遊離ステロールのほうが多い。本発明の綿実油は、好ましくは、約２００～約３５０ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のココナツ油は、好ましくは、約５０～約１００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のサフラワー種子油は、好ましくは、約１５０～約２５０ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のピーナッツ種子油は、好ましくは、約１００～約２００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のゴマ種子油は、好ましくは、約４００～約６００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明のヒマワリ種子油は、好ましくは、約２００～４００ｍｇ総ステロール／１００ｇであり、シトステロールが主なステロールである。本発明の生育植物部分から得られる油は、好ましくは、２００ｍｇ総ステロール／１００ｇ未満であり、より好ましくは１００ｍｇ総ステロール／１００ｇ未満であり、および、最も好ましくは、５０ｍｇ総ステロール／１００ｇ未満であり、ステロールのほとんどが遊離ステロールである。
本明細書で使用される「種子油」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含む植物の種子／穀粒から得られる、または種子／穀粒中に種子油がさらに存在する場合に、種子／穀粒から得ることが可能な組成物を指す。すなわち、本発明の種子油は、種子／穀粒中またはその一部分に存在する種子油、ならびに種子／穀粒から抽出した種子油を含む。種子油は、好ましくは、抽出した種子油である。種子油は、典型的に、室温で液体である。好ましくは、種子油における総脂肪酸（ＴＦＡ）含量は、主に（５０％超が）、少なくとも１６個の炭素長である、脂肪酸を含む。より好ましくは、種子油中の総脂肪酸の少なくとも５０％は、Ｃ１８脂肪酸、例えばオレイン酸である。脂肪酸は、典型的に、例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、アシルＣｏＡ、またはリン脂質等の、エステル化形態である。脂肪酸は、遊離脂肪酸および／またはエステル化形態であってもよい。一実施形態において、本発明の種子油中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％を、ＴＡＧとして見出すことができる。一実施形態において、本発明の種子油は、１つ以上の他の脂質、核酸、ポリペプチド、または種子もしくは粗抽出物に伴う他の汚染分子から分離された、「実質的に精製した」または「精製した」油である。実質的に精製した種子油は、種子もしくは抽出物に伴う他の成分を、少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ましい。本発明の種子油は、ステロール等が挙げられるが、これに限定されない、非脂肪酸分子をさらに含んでもよい。一実施形態において、種子油は、カノーラ油（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．たとえば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）からし油（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、他のＢｒａｓｓｉｃａ油（たとえば、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｅｌｉｎａ）、ヒマワリ油（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．たとえば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、亜麻仁油（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、大豆油（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、サフラワー油（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、トウモロコシ油（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、タバコ油（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．たとえば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ピーナッツ油（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、ヤシ油（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、綿実油（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ココナッツ油（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、アボカド油（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、オリーブ油（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、カシュー油（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア油（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド油（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、オート麦種子油（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、米油（Ｏｒｙｚａ ｓｐ．たとえば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ および Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ種子油（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、または、Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ （ｍａｃａｕｂａ ｐａｌｍ）、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ｍｕｒｕｍｕｒｕ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ （ｔｕｃｕｍａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ （Ｉｎｄａｉａ－ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ （Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｉｌ ｐａｌｍ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ （ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ （ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ （ｂａｂａｓｓｕ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ （ｆａｌｓｅ ｆｌａｘ）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ｐｅｑｕｉ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ （Ａｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｋａｌｅ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ （ｐｈｙｓｉｃ ｎｕｔ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ （ａｒａｒａ ｎｕｔ－ｔｒｅｅ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ｂｕｒｉｔｉ ｐａｌｍ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ （ｉｎａｊａ ｐａｌｍ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（たとえばＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ および Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ （ｂａｃａｂａ－ｄｏ－ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ （ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ （ｂａｃａｂａ－ｄｅ－ｌｅｑｕｅ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ （スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ （ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ （アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ （Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ（ポピュラス・トリコカルパ）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（リシナス・コムニス）（ｃａｓｔｏｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ （ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ （ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（たとえば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ（ソルガム・バイカラー）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ （ｃｕｐｕａｓｓｕ）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ （Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（小麦）（たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）の種子から得られる油である。種子油は、当技術分野で知られている任意の方法によって、種子／穀粒から抽出されてもよい。これは、典型的に、ジエチルエーテル、石油エーテル、クロロホルム／メタノール、またはブタノール混合物等の非極性溶媒による抽出を伴い、一般に、最初に種子を粉砕することが含まれる。穀粒のデンプンに伴う脂質は、水飽和したブタノールで抽出され得る。種子油は、当技術分野で知られている方法によって「脱ガム」して多糖類を除去してもよく、または汚染物質を除去するための、または他の方法で処理して、純度、安定性、もしくは色を改善してもよい。種子油中のＴＡＧおよび他のエステルは、遊離脂肪酸を放出するように加水分解してもよく、または種子油を水素化してもよく、または当技術分野で知られているように化学的もしくは酵素的に処理されてもよい。
本明細書で使用される「脂肪酸」という用語は、少なくとも８個の炭素原子長の飽和または不飽和の長脂肪族末端を伴う、カルボン酸を指す。典型的に、脂肪酸は、少なくとも１２個の炭素長の炭素－炭素結合鎖を有する。大部分の自然の脂肪酸は、それらの生合成が２個の炭素原子を有する酢酸塩を伴うので、偶数個の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）であってもよく、またはＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、アシルＣｏＡ（チオエステル）結合の一部、もしくは他の共有的に結合した形態等のエステル化形態であってもよい。本明細書では、エステル化形態で共有的に結合したときの脂肪酸を「アシル」基と称する。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール等のリン脂質としてエステル化されてもよい。飽和脂肪酸は、鎖に沿っていかなる二重結合または他の官能基も含まない。「飽和」という用語は、全ての炭素（カルボン酸（－ＣＯＯＨ）基は除く）が可能な限り多くの水素を含むという点で、水素を指す。換言すれば、オメガ（ω）末端は、３つの水素（ＣＨ３－）を含み、鎖の範囲内の各炭素は、２つの水素（－ＣＨ２－）を含む。不飽和脂肪酸は、飽和脂肪酸に類似した形態のものであるが、１つ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在し、各アルケンが、鎖の単結合「－ＣＨ２－ＣＨ２－」部が、二重結合「－ＣＨ＝ＣＨ－」部分（すなわち、別の炭素に二重結合した炭素）と置換されていることが異なる。二重結合のどちらかの側に結合した、鎖の中の２個の隣の炭素原子は、シスまたはトランス配置で起こり得る。
本明細書で使用される、「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」という用語は、その炭素鎖の中に少なくとも１２個の炭素原子を含み、少なくとも２個のアルケン基（炭素－炭素二重結合）を含む、脂肪酸を指す。本発明の生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部のＰＵＦＡ含量は、本発明の生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中で発現される外因性ポリヌクレオチドの組み合わせに依存して増加または減少し得る。たとえば、ＭＧＡＴが発現される場合、ＰＵＦＡレベルは通常、増加し、一方でＤＧＡＴ１が単独で発現、またはＷＲＩ１と組み合わせて発現される場合は、ＰＵＦＡレベルは、通常、オレイン酸レベルの増加により、減少する。さらに、Δ１２デサチュラーゼ活性が減少する場合（たとえば、内因性Δ１２デサチュラーゼのサイレンシング等により）、ＰＵＦＡ含有量は、異なるΔ１２デサチュラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドの非存在下では増加する可能性は少ない。
「モノアシルグリセリド」または「ＭＡＧ」は、グリセロールが１つの脂肪酸でエステル化された、グリセリドである。本明細書で使用されるＭＡＧは、ｓｎ－１／３位に水酸基を含み（本明細書では、ｓｎ－１－ＭＡＧ、１－ＭＡＧ、または１／３－ＭＡＧとも称される）、またはｓｎ－２位に水酸基を含み（本明細書では、２－ＭＡＧとも称される）、したがって、ＭＡＧは、ＰＡまたはＰＣ等のリン酸化分子を含まない。したがって、ＭＡＧは、細胞中の中性脂質の成分である。
「ジアシルグリセリド」または「ＤＡＧ」は、グリセロールが２つの脂肪酸（それらは同じか、または好ましくは異なるものであってもよい）でエステル化された、グリセリドである。本明細書で使用されるＤＡＧは、ｓｎ－１，３位またはｓｎ－１，３またはｓｎ－２位に水酸基を含み、したがって、ＤＡＧは、ＰＡまたはＰＣ等のリン酸化分子を含まない。したがって、ＤＡＧは、細胞中の中性脂質の成分である。ＤＡＧ合成のケネディ経路（図１）では、前駆体ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）が、ＬｙｓｏＰＡを形成するためにｓｎ－１位においてグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）によって触媒する第１の反応、続いて、ホスファチジン酸（ＰＡ）を形成するためにｓｎ－２位においてリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）によって触媒する第２のアシル化で、それぞれが脂肪酸コエンザイムＡエステルに由来する、２つのアシル基にエステル化される。次いで、この中間体は脱リン酸化されて、ＤＡＧを形成する。代替同化経路（図１）において、ＤＡＧは、ＭＧＡＴによって触媒されて、ｓｎ－１－ＭＡＧ、または好ましくは、ｓｎ－２－ＭＡＧのいずれかのアシル化によって形成され得る。ＤＡＧはまた、リパーゼによるアシル基の除去によってＴＡＧから形成してもよく、または本質的に、酵素ＣＰＴ、ＰＤＣＴ、またはＰＬＣのいずれかによるコリン頭部基の除去によってＰＣから形成してもよい（図１）。
「トリアシルグリセリド」または「ＴＡＧ」は、グリセロールが３個の脂肪酸（それらは同じか（たとえば、トリ－オレインなどで）、またはより一般的には、異なっていても良い）でエステル化された、グリセリドである。ＴＡＧ合成のケネディ経路では、ＤＡＧが前述のように形成され、次いで、第３のアシル基がエステル化されて、ＤＧＡＴの活性によってグリセロール骨格にエステル化される。ＴＡＧの形成のための代替経路は、本明細書で説明される酵素ＰＤＡＴおよびＭＧＡＴ経路によって触媒されるものを含む。
本明細書で使用される「アシルトランスフェラーゼ」という用語は、アシルＣｏＡから基質上にアシル基を転移させることができるタンパク質を指し、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、およびＤＧＡＴを含む。
本明細書において、「Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １」または「ＷＲＩ１」または「ＷＲＬ１」という用語は、解糖系およびｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸生合成に関与する数種の酵素の発現を制御するＡＰ２／ＥＲ ＷＥＢＰクラスの転写因子を指す。ＷＲＩ１は、２つの植物特異的（ＡＰ２／ＥＲＥＢ）ＤＮＡ結合ドメインを有する。少なくとも、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＷＲＩ１は、解糖系を介して、スクロースの分解も制御し、それにより、脂肪酸生合成のための前駆体の供給を制御する。言い換えると、光合成産物から保存脂質への炭素の流れを制御する。ｗｒｉ１変異体は、ＴＡＧへのスクロースおよびグルコースの組み込みにおける欠損があるため、しわのある種子の表現型を有する。
ＷＲＩ１により転写される遺伝子の例としては、限定されないが、ピルビン酸キナーゼ（Ａｔ５ｇ５２９２０、Ａｔ３ｇ２２９６０）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）Ｅ１アルファ サブユニット（Ａｔ１ｇ０１０９０）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）、ＢＣＣＰ２サブユニット（Ａｔ５ｇ１５５３０）、エノイル－ＡＣＰリダクターゼ（Ａｔ２ｇ０５９９０；ＥＡＲ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（Ａｔ１ｇ２２１７０）、細胞質フルクトキナーゼおよび細胞質ホスホグリセリン酸ムターゼ、スクロース合成酵素（ＳｕＳｙ）（たとえば、Liu et al., 2010b; Baud et al., 2007; Ruuska et al., 2002を参照のこと）のうち、１以上の、好ましくはすべてが挙げられる。
ＷＲＬ１は、保存ドメインＡＰ２（ｃｄ０００１８）を含有する。ＡＰ２は、たとえばＡＰＥＴＡＬＡ２およびＥＲＥＢＰ（エチレン応答性エレメント結合タンパク質）等の植物における転写レギュレーター中に見いだされるＤＮＡ結合ドメインである。ＥＲＥＢＰにおいて、当該ドメインは、エチレン応答性エレメント（ＥＲＥ）（エチレン応答性にとって必須のプロモーターエレメント）の１１ｂｐのＧＣＣ ｂｏｘに特異的に結合する。ＥＲＥＢＰおよびＣ－リピート結合因子ＣＢＦ１（ストレス応答に関与する）は、１コピーのＡＰ２ドメインを含む。ＡＰＥＴＡＬＡ２様タンパク質（植物の発生において役割を果たす）は２つのコピーを含む。
ＷＲＩ１中の他の配列モチーフおよびその機能的ホモログとしては以下が挙げられる：
１．Ｒ Ｇ Ｖ Ｔ／Ｓ Ｒ Ｈ Ｒ Ｗ Ｔ Ｇ Ｒ （配列番号３５６）。
２．Ｆ／Ｙ Ｅ Ａ Ｈ Ｌ Ｗ Ｄ Ｋ （配列番号３５７）。
３．Ｄ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｋ Ｙ Ｗ Ｇ （配列番号３５８）。
４．Ｓ Ｘ Ｇ Ｆ Ｓ／Ａ Ｒ Ｇ Ｘ （配列番号３５９）。
５．Ｈ Ｈ Ｈ／Ｑ Ｎ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｗ Ｅ Ａ Ｒ Ｉ Ｇ Ｒ／Ｋ Ｖ （配列番号３６０）。
６．Ｑ Ｅ Ｅ Ａ Ａ Ａ Ｘ Ｙ Ｄ （配列番号３６１）。
本明細書において、「Ｗｒｉｎｋｌｅｄ １」または「ＷＲＩ１」という用語には、「Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１様」または「ＷＲＩ１様」タンパク質もまた含まれる。ＷＲＩ１タンパク質の例としては、アクセッション番号Ｑ６Ｘ５Ｙ６、（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号２８０）、ＸＰ＿００２８７６２５１．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． Ｌｙｒａｔａ；配列番号２８１）、ＡＢＤ１６２８２．１ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；配列番号２８２）、ＡＤＯ１６３４６．１ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；配列番号２８３）、ＸＰ＿００３５３０３７０．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号２８４）、ＡＥＯ２２１３１．１ （Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ；配列番号２８５）、ＸＰ＿００２５２５３０５．１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号２８６）、ＸＰ＿００２３１６４５９．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号２８７）、ＣＢＩ２９１４７．３ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号２８８）、ＸＰ＿００３５７８９９７．１ （Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号２８９）、ＢＡＪ８６６２７．１ （Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ ｓｕｂｓｐ． ｖｕｌｇａｒｅ；配列番号２９０）、ＥＡＹ７９７９２．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号２９１）、ＸＰ＿００２４５０１９４．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号２９２）、ＡＣＧ３２３６７．１ （Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号２９３）、ＸＰ＿００３５６１１８９．１ （Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号２９４）、ＡＢＬ８５０６１．１ （Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ；配列番号２９５）、ＢＡＤ６８４１７．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号２９６）、ＸＰ＿００２４３７８１９．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号２９７）、ＸＰ＿００２４４１４４４．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号２９８）、ＸＰ＿００３５３０６８６．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号２９９）、ＸＰ＿００３５５３２０３．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３００）、ＸＰ＿００２３１５７９４．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号３０１）、ＸＰ＿００２２７０１４９．１ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号３０２）、ＸＰ＿００３５３３５４８．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３０３）、ＸＰ＿００３５５１７２３．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３０４）、ＸＰ＿００３６２１１１７．１ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ；配列番号３０５）、ＸＰ＿００２３２３８３６．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ； 配列番号３０６）、ＸＰ＿００２５１７４７４．１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号３０７）、ＣＡＮ７９９２５．１ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号３０８）、ＸＰ＿００３５７２２３６．１ （Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号３０９）、ＢＡＤ１００３０．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号３１０）、ＸＰ＿００２４４４４２９．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号３１１）、ＮＰ＿００１１７０３５９．１ （Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号３１２）、ＸＰ＿００２８８９２６５．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． ｌｙｒａｔａ；配列番号３１３）、ＡＡＦ６８１２１．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ； 配列番号３１４）、ＮＰ＿１７８０８８．２ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号３１５）、ＸＰ＿００２８９０１４５．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． ｌｙｒａｔａ；配列番号３１６）、ＢＡＪ３３８７２．１ （Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ；配列番号３１７）、ＮＰ＿５６３９９０．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号３１８）、ＸＰ＿００３５３０３５０．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３１９）、ＸＰ＿００３５７８１４２．１ （Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ；配列番号３２０）、ＥＡＺ０９１４７．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ； 配列番号３２１）、ＸＰ＿００２４６０２３６．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号３２２）、ＮＰ＿００１１４６３３８．１ （Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号３２３）、ＸＰ＿００３５１９１６７．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３２４）、ＸＰ＿００３５５０６７６．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３２５）、ＸＰ＿００３６１０２６１．１ （Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ；配列番号３２６）、ＸＰ＿００３５２４０３０．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３２７）、ＸＰ＿００３５２５９４９．１ （Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ；配列番号３２８）、ＸＰ＿００２３２５１１１．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号３２９）、ＣＢＩ３６５８６．３ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号３３０）、ＸＰ＿００２２７３０４６．２ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号３３１）， ＸＰ＿００２３０３８６６．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号３３２）および、ＣＢＩ２５２６１．３ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号３３３）が挙げられる。さらなる例としては、Ｓｏｒｂｉ－ＷＲＬ１（配列番号３３４）、Ｌｕｐａｎ－ＷＲＬ１（配列番号３３５）、Ｒｉｃｃｏ－ＷＲＬ１（配列番号３３６）およびＬｕｐｉｎ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ ＷＲＩ１（配列番号３３７）が挙げられる。
本明細書で使用される「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」または「ＭＧＡＴ」という用語は、アシルＣｏＡからＭＡＧ基質に脂肪アシル基を転移させてＤＡＧを生成する、タンパク質を指す。したがって、「モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、少なくとも、アシルＣｏＡからＭＡＧにアシル基を転移させてＤＡＧを生成することを指す。ＭＧＡＴは、哺乳類の腸における脂肪吸収でのその役割で最も知られており、そこでは食餌脂肪の消化から生成される脂肪酸およびｓｎ－２－ＭＡＧは、カイロミクロン合成および分泌のために、腸細胞においてＴＡＧに再合成される。ＭＧＡＴは、この過程の第１のステップを触媒し、その過程では、脂肪酸およびＣｏＡから形成される脂肪アシルＣｏＡ由来のアシル基、およびｓｎ－２－ＭＡＧが共有的に結合される。本明細書で使用される「ＭＧＡＴ」という用語は、ｓｎ－１／３－ＭＡＧおよび／またはｓｎ－２－ＭＡＧ基質に作用して、それぞれ、ｓｎ－１，３－ＤＡＧおよび／またはｓｎ－１，２／２，３－ＤＡＧを形成する、酵素を含む。好ましい実施形態において、ＭＧＡＴは、ｓｎ－１－ＭＡＧと比べてｓｎ－２－ＭＡＧ基質に対する選好を有するか、または基質として実質的にｓｎ－２－ＭＡＧだけを使用する（例としては、Ｃａｏet al.,２００３（ｓｎ－１／３－１８：１－ＭＡＧよりも大きい、ｓｎ－２－１８：１－ＭＡＧに対するマウスＭＧＡＴ１の特異性（図５）に記載されたＭＧＡＴが挙げられる）、ＹｅｎおよびＦａｒｅｓｅ，２００３（マウスＭＧＡＴ１およびヒトＭＧＡＴ２の一般的な活性は、１－ＭＡＧアシル－受容体基質に対するよりも２－ＭＡＧに対する方が高い（図５））、およびＣｈｅｎｇ et al.,２００３（２－ＭＡＧに対するヒトＭＧＡＴ３の活性は、１／３－ＭＡＧ基質に対する活性よりもはるかに高い（図２Ｄ）が挙げられる）。
本明細書で使用されるＭＧＡＴは、ＭＡＧと比較して、アシル基を選好的にＬｙｓｏＰＡに転送する酵素を含まず、そのような酵素は、ＬＰＡＡＴとして知られている。すなわち、ＭＧＡＴは、非リン酸化モノアシル基質がＬｙｓｏＰＡに対して低い触媒活性を有し得るが、選好的に非リン酸化モノアシル基質を使用する。好ましいＭＧＡＴは、ＬｙｓｏＰＡをアシル化する際に検出可能な活性を有しない。示されるように、ＭＧＡＴ（すなわち、ハツカネズミＭＧＡＴ２）はまた、ＤＧＡＴ機能を有し得るが、主に、ＭＧＡＴとして機能する。すなわち、酵素活性を、産物－ｎｍｏｌｅ／分／ｍｇ－タンパク質で表したときに、ＤＧＡＴとしての触媒活性よりも高い、ＭＧＡＴとしての触媒活性を有する（Ｙｅｎ et al.,２００２も参照されたい）。
ＭＧＡＴには、それぞれ、ＭＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２、およびＭＧＡＴ３と称される、３つの既知のクラスがある。ヒトＭＧＡＴ１遺伝子（ＡＦ３８４１６３（配列番号７））の相同体は、少なくとも、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、カエノラブディティス・エレガンス、シゾサッカロミセス・ポンベ、サッカロミセス・セレビシエ、クライベロマイセス・ラクティス、エレモテシウム・ゴシピイ、マグナポルテ・グリセア、およびニューロスポラ・クラッサに存在する（すなわち、配列が分かっている）。ヒトＭＧＡＴ２遺伝子（ＡＹ１５７６０８）の相同体は、少なくとも、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ミバエ、および蚊に存在する。ヒトＭＧＡＴ３遺伝子（ＡＹ２２９８５４）の相同体は、少なくとも、チンパンジー、イヌ、ウシ、およびゼブラフィッシュに存在する。しかしながら、他の生物由来の相同体は、当技術分野で知られている相同的配列を識別するための方法によって容易に特定することができる。
ＭＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ＡＦ３８４１６３；配列番号７）， Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ （ＡＦ３８４１６２；配列番号８）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ （ＸＭ＿００１１６６０５５およびＸＭ＿０５２６０４４．２；それぞれ、配列番号９および配列番号１０）、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ （ＸＭ＿５４５６６７．２；配列番号１１）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ （ＮＭ＿００１００１１５３．２；配列番号１２）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ （ＮＭ＿００１１０８８０３．１；配列番号１３）、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ ＭＧＡＴ１ （ＮＭ＿００１１２２６２３．１；配列番号１４）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ （ＮＭ＿０７３０１２．４， ＮＭ＿１８２３８０．５， ＮＭ＿０６５２５８．３， ＮＭ＿０７５０６８．３およびＮＭ＿０７２２４８．３；それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ （ＸＭ＿４５５５８８．１；配列番号２０）、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ （ＮＭ＿２０８８９５．１；配列番号２１）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ （ＸＭ＿３６８７４１．１；配列番号２２）、予測Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ＸＭ＿００２１２０８４３．１ 配列番号２３）由来のＭＧＡＴ１遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＭＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ （ＡＹ１５７６０８；配列番号２４）、 Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ （ＡＹ１５７６０９；配列番号２５）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ （ＸＭ＿５２２１１２．２；配列番号２６）、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ （ＸＭ＿５４２３０４．１；配列番号２７）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ （ＮＭ＿００１０９９１３６．１；配列番号２８）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ （ＮＭ＿００１１０９４３６．２；配列番号２９）、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ （ＸＭ＿４２４０８２．２；配列番号３０）、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ （ＮＭ＿００１００６０８３．１ 配列番号３１）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ （ＮＭ＿１３６４７４．２， ＮＭ＿１３６４７３．２および、ＮＭ＿１３６４７５．２；それぞれ、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４）、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ （ＸＭ＿００１６８８７０９．１およびＸＭ＿３１５９８５；それぞれ、配列番号３５および配列番号３６）、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ（ＸＭ＿９７００５３．１；配列番号３７）由来のＭＧＡＴ２遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＭＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ （ＡＹ２２９８５４；配列番号３８）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ （ＸＭ＿００１１５４１０７．１， ＸＭ＿００１１５４１７１．１および、ＸＭ＿５２７８４２．２；配列番号３９，配列番号４０および、配列番号４１）、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ （ＸＭ＿８４５２１２．１；配列番号４２）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ （ＸＭ＿８７０４０６．４；配列番号４３）、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ （ＸＭ＿６８８４１３．４；配列番号４４）由来のＭＧＡＴ３遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。
本明細書で使用される「ＭＧＡＴ経路」は、ＴＡＧの形成のためのケネディ経路とは異なる同化経路を指し、そこにおいて、ＤＡＧは、ＭＧＡＴによって触媒された、ｓｎ－１－ＭＡＧ、または好ましくは、ｓｎ－２－ＭＡＧのいずれかのアシル化によって形成される。ＤＡＧは、その後、ＴＡＧまたは他の脂質を形成するために使用され得る。ＭＧＡＴ経路を図１で例示する。
本明細書で使用される「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＤＧＡＴ）という用語は、アシルＣｏＡからＤＡＧ基質に脂肪アシル基を転移させてＴＡＧを生成する、タンパク質を指す。したがって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、アシルＣｏＡからＤＡＧにアシル基を転移させてＴＡＧを生成することを指す。ＤＧＡＴはまた、ＭＧＡＴ機能も有し得るが、主にＤＧＡＴとして機能する。すなわち、酵素活性を、産物－ｎｍｏｌｅ／分／ｍｇ－タンパク質で表したときに、ＭＧＡＴとしての触媒活性よりも高い、ＤＧＡＴとしての触媒活性を有する（例えば、Ｙｅｎ et al.,２００５を参照されたい）。
ＤＧＡＴには、それぞれ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ３と呼ばれる、３つの既知のクラスがある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的に、１０個の膜貫通ドメインを有し、ＤＧＡＴ２ポリペプチドは、典型的に、２個の膜貫通ドメインを有するのに対して、ＤＧＡＴ３ポリペプチドは、典型的に、いずれも有しておらず、細胞質に溶解するが、膜には組み込まれないと考えられている。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ （ＸＰ＿７５５１７２．１；配列番号３４７）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ （ＣＡＢ４４７７４．１；配列番号８３）， Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ＡＡＲ１１４７９．１；配列番号３４８）， Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ （ＡＢＣ９４４７２．１；配列番号３４９）， Ｖｅｒｎｏｎｉａ ｇａｌａｍｅｎｓｉｓ （ＡＢＶ２１９４５．１およびＡＢＶ２１９４６．１；それぞれ、配列番号３５０および、配列番号３５１）、Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ （ＡＡＶ３１０８３．１；配列番号３５２）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ （ＡＡＦ８２４１０．１；配列番号３５３）、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ （ＮＰ＿４４５８８９．１；配列番号３５４）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ （ＮＰ＿０３６２１１．２；配列番号３５５）、ならびにそれらの変異型および／または突然変異体由来のＤＧＡＴ１遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ （ＮＰ＿５６６９５２．１；配列番号２１２）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ＡＡＹ１６３２４．１；配列番号２１３）、Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ （ＡＢＣ９４４７４．１；配列番号２１４）、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｒａｍａｎｎｉａｎａ （ＡＡＫ８４１７９．１；配列番号２１５）、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ （Ｑ９６ＰＤ７．２；配列番号２１６） （Ｑ５８ＨＴ５．１；配列番号２１７）、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ （Ｑ７０ＶＺ８．１；配列番号２１８）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ （ＡＡＫ８４１７５．１；配列番号２１９）、ならびにそれらの変異型および／または突然変異体由来のＤＧＡＴ２遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。
ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例としては、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ、Saha, et al., 2006）ならびにそれらの変異型および／または突然変異体由来のＤＧＡＴ３遺伝子によりコードされるタンパク質が挙げられる。ＤＧＡＴは、検出可能なＭＧＡＴ活性をほとんどまたは全く有さず、例えば、３００ｐｍｏｌ／分／ｍｇ タンパク質未満、好ましくは、２００ｐｍｏｌ／分／ｍｇ タンパク質未満、より好ましくは、１００ｐｍｏｌ／分／ｍｇ タンパク質未満である。
ＤＧＡＴ１ではなくＤＧＡＴ２は、ＭＧＡＴ酵素と高い配列相同性を共有し、これは、ＤＧＡＴ２およびＭＧＡＴ遺伝子が、共通の遺伝的起源を共有している可能性があることを示唆している。触媒する際には、複数のアイソフォームがＴＡＧ合成の際と同じステップを伴うが、これらのアイソフォームは、酵素のＤＧＡＴ／ＭＧＡＴファミリーの差次的な組織分配および細胞内局在化によって示唆されるように、異なった機能的役割を果たし得る。哺乳類では、ＭＧＡＴ１が、主に胃、腎臓、脂肪組織で発現するのに対して、ＭＧＡＴ２およびＭＧＡＴ３は、小腸において最も高い発現を示す。哺乳類では、ＤＧＡＴ１が、数多くの組織で遍在して発現し、小腸で最も高い発現を伴うのに対して、ＤＧＡＴ２は、肝臓において最大である。ＭＧＡＴ３は、生物情報科学分析から、齧歯動物にはなく、哺乳類およびヒトにだけより高く存在する。ＭＧＡＴ３は、ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ３よりもＤＧＡＴ２に対して高い配列相同性を共有する。ＭＧＡＴ３は、ＭＡＧまたはＤＡＧを基質として使用したときに、ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２酵素よりも大幅に高いＤＧＡＴ活性を呈するが（ＭＧＡＴ３＞ＭＧＡＴ１＞ＭＧＡＴ２）、これは、ＭＧＡＴ３が、推定ＴＡＧシンターゼとして機能することを示唆している。
ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２は、どちらも、ＤＧＡＴ２と同じアシルトランスフェラーゼのクラスに属する。いくつかのＤＧＡＴ２において、ＤＧＡＴ２の触媒活性に重要であることが示されたモチーフのいくつかも、ＭＧＡＴアシルトランスフェラーゼに保存される。特に関心があるのは、コンセンサス配列ＦＬＸＬＸＸＸＮ（配列番号２２４）を伴う推定中性脂肪結合ドメインであり、配列中、各Ｘは独立に、プロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｎは、Ｎ末端膜貫通領域内に位置する任意の非極性アミノ酸であり、その後に推定グリセロール／リン脂質アシルトランスフェラーゼドメインが続く。ＦＬＸＬＸＸＸＮモチーフ（配列番号２２４）は、マウスＤＧＡＴ２（アミノ酸８１～８８）およびＭＧＡＴ１／２で見られるが、酵母または植物ＤＧＡＴ２では見られない。これは、マウスＤＧＡＴ２の活性に重要である。他のＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２配列のモチーフは、以下を含む。
１．ＹＦＰトリペプチド（配列番号２２０）。大部分のＤＧＡＴ２ポリペプチドに、およびＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２にも高度に保存され、例えば、マウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸１３９～１４１として存在する。酵素が機能しないようにした非保存的置換体で、酵母ＤＧＡＴ２内でこのモチーフを変異させる。
２．ＨＰＨＧテトラペプチド（配列番号２２１）。ＭＧＡＴに、ならびに動物および菌類由来のＤＧＡＴ２配列に高度に保存され、例えばマウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸１６１～１６４として存在し、少なくとも酵母およびマウスＤＧＡＴ２の触媒活性に重要である。植物ＤＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼは、代わりに、ＥＰＨＳ（配列番号２２２）保存配列を有するので、第１および第４のアミノ酸に対する保存的変化を許容することができる。
３． 推定グリセロールリン脂質ドメインの一部である、より長い保存されたモチーフ。このモチーフの例は、ＲＸＧＦＸ（Ｋ／Ｒ）ＸＡＸＸＸＧＸＸＸ（Ｌ／Ｖ）ＶＰＸＸＸＦＧ（Ｅ／Ｑ）（配列番号２２３）であり、マウスＤＧＡＴ２においてアミノ酸３０４～３２７として存在する。このモチーフは、その長さから予想されるように、他の配列よりもアミノ酸配列に保存されないが、相同体は、モチーフ検索によって認識することができる。間隔は、より保存されたアミノ酸の間で様々であり得る。すなわち、前述の配列と比較して、モチーフ内には、Ｘアミノ酸がより多い場合、またはＸアミノ酸がより少ない場合がある。
本明細書で使用される「グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ」または「ＧＰＡＴ」という用語は、グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）をアシル化してＬｙｓｏＰＡおよび／またはＭＡＧを形成するタンパク質を指し、後者の産物は、ＧＰＡＴがＬｙｓｏＰＡに対してホスファターゼ活性も有する場合に形成する。転移されるアシル基は、典型的に、アシルＣｏＡに由来する。したがって、「グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、Ｇ－３－Ｐをアシル化してＬｙｓｏＰＡおよび／またはＭＡＧを形成することを指す。「ＧＰＡＴ」という用語は、Ｇ－３－Ｐをアシル化してｓｎ－１－ＬＰＡおよび／またはｓｎ－２－ＬＰＡ、好ましくは、ｓｎ－２－ＬＰＡを形成する、酵素を包含する。好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、ホスファターゼ活性を有する。最も好ましい実施形態において、ＧＰＡＴは、ｓｎ－２－ＭＡＧを生成するｓｎ－２－ＧＰＡＴを有する、ホスファターゼ活性である。
本明細書で使用される、「ｓｎ－１－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ｓｎ－１－ＧＰＡＴ）という用語は、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）をアシル化して選好的に１－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（ｓｎ－１－ＬＰＡ）を形成する、タンパク質を指す。したがって、「ｓｎ－１－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸をアシル化して１－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（ｓｎ－１－ＬＰＡ）を形成することを指す。
本明細書で使用される、「ｓｎ－２グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ」（ｓｎ－２－ＧＰＡＴ）という用語は、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）をアシル化して選好的に２－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（ｓｎ－２－ＬＰＡ）を形成する、タンパク質を指す。したがって、「ｓｎ－２グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸をアシル化して２－アシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（ｓｎ－２－ＬＰＡ）を形成することを指す。
ＧＰＡＴファミリーは大きく、全ての既知のメンバーは、２つの保存されたドメイン、すなわち、ｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメイン（ＰＦ０１５５３、配列番号２２５）およびＨＡＤ様ヒドロラーゼ（ＰＦ１２７１０、配列番号２２６）スーパーファミリードメインを含む。これに加えて、アラビドプシス・サリアナにおいて、ＧＰＡＴ４～８は全て、ホスホセリンホスファターゼドメイン（ＰＦ００７０２、配列番号２２７）に相同的なＮ末端領域を含む。ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６は、どちらも、ホスファターゼ活性に不可欠であることが知られている保存された残基、特に、Ｎ末端に位置するモチーフＩ（ＤＸＤＸ［Ｔ／Ｖ］［Ｌ／Ｖ］、配列番号２２９）およびモチーフIII（Ｋ－［Ｇ／Ｓ］［Ｄ／Ｓ］ＸＸＸ［Ｄ／Ｎ］、配列番号３３０）において特異的に保存されたアミノ酸（太字で示す）を含む（Ｙａｎｇ et al.,２０１０）。好ましくは、ＧＰＡＴは、グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）から、例えばアラビドプシス由来の（ＧＰＡＴ４（ＮＰ＿１７１６６７．１）（配列番号１４４）およびＧＰＡＴ６（ＮＰ＿１８１３４６．１）（配列番号１４５））から、ｓｎ－２－ＭＡＧ（本明細書で、「２－ＭＡＧ」とも称される）（図１）を生成するｓｎ－２選好およびホスファターゼ活性を有する。より好ましくは、ＧＰＡＴは、脂肪酸基質としてアシルＣｏＡを使用する。
ＧＰＡＴ４のホモログ（ＮＰ＿１７１６６７．１；配列番号１４４）およびＧＰＡＴ６のホモログ（ＮＰ＿１８１３４６．１；配列番号１４５）としては、ＡＡＦ０２７８４．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号１４６）、ＡＡＬ３２５４４．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号１４７）、ＡＡＰ０３４１３．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１４８）、ＡＢＫ２５３８１．１ （Ｐｉｃｅａ ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ；配列番号１４９）， ＡＣＮ３４５４６．１ （Ｚｅａ Ｍａｙｓ；配列番号１５０）、ＢＡＦ００７６２．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号１５１）、ＢＡＨ００９３３．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５２）、ＥＡＹ８４１８９．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５３）、ＥＡＹ９８２４５．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５４）、ＥＡＺ２１４８４．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５５）、ＥＥＣ７１８２６．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５６）、ＥＥＣ７６１３７．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５７）、ＥＥＥ５９８８２．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１５８）、ＥＦＪ０８９６３．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１５９）、ＥＦＪ０８９６４．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１６０）、ＥＦＪ１１２００．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１６１）、ＥＦＪ１５６６４．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１６２）、ＥＦＪ２４０８６．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１６３）、ＥＦＪ２９８１６．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１６４）、ＥＦＪ２９８１７．１ （Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｍｏｅｌｌｅｎｄｏｒｆｆｉｉ；配列番号１６５）、ＮＰ＿００１０４４８３９．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１６６）、ＮＰ＿００１０４５６６８．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１６７）、ＮＰ＿００１１４７４４２．１ （Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号１６８）、ＮＰ＿００１１４９３０７．１ （Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号１６９）、ＮＰ＿００１１６８３５１．１ （Ｚｅａ ｍａｙｓ；配列番号１７０）、ＡＦＨ０２７２４．１ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；配列番号１７１） ＮＰ＿１９１９５０．２ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ；配列番号１７２）、ＸＰ＿００１７６５００１．１ （Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ；配列番号１７３）、ＸＰ＿００１７６９６７１．１ （Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ；配列番号１７４）、ＸＰ＿００１７６９７２４．１ （Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ；配列番号１７５）、ＸＰ＿００１７７１１８６．１ （Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ；配列番号１７６）、ＸＰ＿００１７８０５３３．１ （Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ；配列番号１７７）、ＸＰ＿００２２６８５１３．１ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号１７８）、ＸＰ＿００２２７５３４８．１ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号１７９）、ＸＰ＿００２２７６０３２．１ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号１８０）、ＸＰ＿００２２７９０９１．１ （Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ；配列番号１８１）、ＸＰ＿００２３０９１２４．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号１８２）、ＸＰ＿００２３０９２７６．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号１８３）， ＸＰ＿００２３２２７５２．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号１８４）、ＸＰ＿００２３２３５６３．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号１８５）、ＸＰ＿００２４３９８８７．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号１８６）、ＸＰ＿００２４５８７８６．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号１８７）、ＸＰ＿００２４６３９１６．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号１８８）、ＸＰ＿００２４６４６３０．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号１８９）、ＸＰ＿００２５１１８７３．１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号１９０）、ＸＰ＿００２５１７４３８．１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号１９１）、ＸＰ＿００２５２０１７１．１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号１９２）、ＸＰ＿００２８７２９５５．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ； 配列番号１９３）， ＸＰ＿００２８８１５６４．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ；配列番号１９４）、ＡＣＴ３２０３２．１ （Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ；配列番号１９５）、ＮＰ＿００１０５１１８９．１ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ；配列番号１９６）、ＡＦＨ０２７２５．１ （Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ；配列番号１９７）、ＸＰ＿００２３２０１３８．１ （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；配列番号１９８）、ＸＰ＿００２４５１３７７．１ （Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；配列番号１９９）， ＸＰ＿００２５３１３５０．１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ；配列番号２００）および、ＸＰ＿００２８８９３６１．１ （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ；配列番号２０１）が挙げられる。
保存されたモチーフまたは残基は、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼ酵素を同定するための、配列に基づく診断として使用することができる。あるいは、より緊縮な機能に基づくアッセイを利用することが可能である。そのようなアッセイは、例えば、標識したグリセロール－３－リン酸を細胞またはミクロソームに供給することと、薄層クロマトグラフィまたは類似した手法によって、標識した産物のレベルを定量化することとを含む。ＧＰＡＴ活性は、標識したＬＰＡの生成をもたらす一方で、ＧＰＡＴ／ホスファターゼ活性は、標識したＭＡＧの生成をもたらす。
本明細書において、「オレオシン」という用語は、種子の貯蔵組織中の油体膜に存在する両親媒性のタンパク質を指す（たとえば、Huang, 1996; Lin et al., 2005; Capuano et al., 2007; Lui et al., 2009; Shimada and Hara-Nishimura, 2010を参照のこと）。
植物の種子は、油体と呼ばれる細胞内構造中にＴＡＧを蓄積する。これらの細胞小器官は、オレオシンを含む数種の包埋タンパク質を含むリン脂質単分子層により囲まれたＴＡＧコアからなる（Jolivet et al., 2004）。オレオシンは、油体膜中に最も多く存在するタンパク質である。
オレオシンは、低いＭｒ（１５～２６，０００）である。各種子類の中で、通常、異なるＭｒの２以上のオレオシンが存在する。各オレオシン分子は、比較的親水性のＮ末端ドメイン（たとえば、約４８アミノ酸残基）、たとえばアラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシンおよびバリン等の脂肪族アミノ酸に特に富んでいる、中心の全体的に疎水性のドメイン（たとえば、約７０～８０アミノ酸残基のもの）、および、Ｃ末端の、またはＣ末端近傍の両親媒性αヘリカルドメイン（たとえば、約３３アミノ酸残基のもの）を含む。一般に、疎水性残基の中心の連続配列が脂質コアの中に挿入され、両親媒性のＮ末端および／または両親媒性のＣ末端は、油体表面に位置し、陽荷電残基はリン脂質単分子層に包埋され、陰荷電残基は外部に露出される。
本明細書において、「オレオシン」という用語は、たとえば２ｘ、４ｘまたは６ｘオレオシンペプチド等の、単一のポリペプチドとして共に融合された複数のオレオシンポリペプチドを有するポリオレオシン、およびカルシウムに結合するカレオシン（ｃａｌｅｏｓｉｎｓ）（Froissard et al., 2009）、およびステロールに結合するステロレオシン（ｓｔｅｒｏｌｅｏｓｉｎｓ）を包含する。しかしながら、油体のオレオシンの大部分は、通常、カレオシンおよび／またはステロレオシンではない。
オレオシンタンパク質配列およびそれらをコードするヌクレオチド配列の相当数が、多くの異なる植物種で知られている。例としては、限定されないが、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｐｏｓｉｓ）、カノーラ、トウモロコシ、コメ、ピーナッツ、ｃａｓｔｏｒ、大豆、亜麻、グレープ、キャベツ、綿、ヒマワリ、ソルガム、および大麦由来のオレオシンが挙げられる。オレオシンの例（アクセッション番号付き）としては、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシン（ＣＡＡ５７５４５．１；配列番号３６２）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ｏｌｅｏｓｉｎ Ｓ１－１ （ＡＣＧ６９５０４．１；配列番号３６３）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシンＳ２－１ （ＡＣＧ６９５０３．１；配列番号３６４）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシンＳ３－１ （ＡＣＧ６９５１３．１；配列番号３６５）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシンＳ４－１ （ＡＣＧ６９５０７．１；配列番号３６６）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ オレオシンＳ５－１ （ＡＣＧ６９５１１．１；配列番号３６７）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン１ （ＡＡＺ２０２７６．１；配列番号３６８）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン２ （ＡＡＵ２１５００．１；配列番号３６９）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン３（ＡＡＵ２１５０１．１；配列番号３７０）、Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ オレオシン５（ＡＢＣ９６７６３．１；配列番号３７１）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ オレオシン１（ＥＥＦ４０９４８．１；配列番号３７２）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ オレオシン２（ＥＥＦ５１６１６．１；配列番号３７３）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ オレオシンアイソフォームａ（Ｐ２９５３０．２；配列番号３７４）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ オレオシンアイソフォームｂ（Ｐ２９５３１．１；配列番号３７５）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ オレオシン低分子量アイソフォーム（ＡＢＢ０１６２２．１；配列番号３７６）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ オレオシン高分子量アイソフォーム（ＡＢＢ０１６２４．１；配列番号３７７）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ オレオシン（ＣＡＡ４４２２４．１；配列番号３７８）、Ｚｅａ ｍａｙｓ オレオシン（ＮＰ＿００１１０５３３８．１；配列番号３７９）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシン（ＡＢＭ３０１７８．１；配列番号３８０）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシンＳＬＯ１－１（ＡＣＧ６９５２２．１；配列番号３８１）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ステロレオシンＳＬＯ２－１（ＡＣＧ６９５２５．１； 配列番号３８２）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ ステロレオシン（ＡＡＬ１３３１５．１；配列番号３８３）、Ｚｅａ ｍａｙｓ ステロレオシン（ＮＰ＿００１１５２６１４．１；配列番号３８４）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ カレオシンＣＬＯ－１（ＡＣＧ６９５２９．１；配列番号３８５）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ カレオシンＣＬＯ－３（ＡＣＧ６９５２７．１；配列番号３８６）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ カレオシン（ＡＡＦ１３７４３．１；配列番号３８７）、Ｚｅａ ｍａｙｓ カレオシン（ＮＰ＿００１１５１９０６．１；配列番号３８８）が挙げられる。
本明細書において、「デンプン生合成に関与するポリペプチド」という用語は、細胞中の正常レベル（野生型）を下回る下方制御によりデンプン合成のレベル減少をもたらし、デンプンのレベルの増加をもたらす、任意のポリペプチドを指す。そのようなポリペプチドの例としては、ＡＧＰａｓｅがある。
本明細書において、「ＡＤＰ－グルコース ホスホリラーゼ」または「ＡＧＰａｓｅ」という用語は、デンプン生合成を制御し、グルコース－１－リン酸およびＡＴＰのＡＤＰ－グルコース（デンプンポリマーに対する構成要素として供される）への転換を触媒する酵素を指す。ＡＧＰａｓｅ酵素の活性型は、２つの大きなサブユニットと、２つの小さなサブユニットからなる。
植物におけるＡＤＰａｓｅ酵素は、主に、２つの大きなサブユニットと２つの小さなサブユニットからなる四量体として存在している。これらのサブユニットは、種によって、その触媒および制御の働きが異なるが（Kuhn et al., 2009）、植物において、小サブユニットは通常、触媒活性を示す。小サブユニットの分子量はおよそ５０～５５ｋＤａである。大きな大きなサブユニットの分子量はおよそ５５～６０ｋＤａである。植物の酵素は、二酸化炭素固化の産物である３－ホスホグリセリン酸塩（ＰＧＡ）により強く活性化され、ＰＧＡの非存在下では、酵素は約３％のみしかその活性を示さない。植物のＡＧＰａｓｅはまた、無機リン酸塩（Ｐｉ）により強く阻害される。対照的に、細菌のＡＧＰａｓｅおよび藻類のＡＧＰａｓｅは、５０ｋＤａのホモ四量体として存在する。藻類の酵素は、その植物の対応物と類似して、ＰＧＡにより活性化され、Ｐｉにより阻害される一方、細菌の酵素は、フルクトース－１，６－重リン酸塩（ＦＢＰ）により活性化され、ＡＭＰおよびＰｉにより阻害される。
本明細書において、「脂質分解に関与するポリペプチドおよび／または脂質含量を減少させるポリペプチド」という用語は、細胞中の正常レベル（野生型）を下回る下方制御により細胞中の、好ましくは植物の生育組織の細胞中の油（たとえば脂肪酸および／またはＴＡＧ）のレベルの増加をもたらす、任意のポリペプチドを指す。そのようなポリペプチドの例としては、限定されないが、リパーゼ、またはたとえばＣＧｉ５８ポリペプチド、ＳＵＧＡＲ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼ（たとえば、Kelly et al., 2012を参照のこと）またはＷＯ２００９／０２７３３５に記述されるリパーゼ等のリパーゼが挙げられる。
本明細書において、「リパーゼ」という用語は、脂肪をグリセロールと脂肪酸に加水分解するタンパク質を指す。ゆえに、「リパーゼ活性」という用語は、脂肪をグリセロールと脂肪酸に加水分解することを指す。
本明細書において、「ＣＧｉ５８」という用語は、可溶性のアシル－ＣｏＡ－依存性リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（当分野で「Ａｔ４ｇ２４１６０」（植物）および「Ｉｃｔ１ｐ」（酵母）としてもまた知られる）を指す。たとえば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子座、Ａｔ４ｇ２４１６０由来の植物の遺伝子は、以下の２つの別の転写産物として発現される：長い全長アイソフォーム（Ａｔ４ｇ２４１６０．１）および、３´末端の部分が失われた短いアイソフォーム（Ａｔ４ｇ２４１６０．２）（James et al., 2010; Ghosh et al., 2009;米国特許出願２０１０００２２１４００を参照のこと）。両方のｍＲＮＡとも、ヒトＣＧＩ－５８タンパク質とホモログであり、このα／β加水分解酵素ファミリー（ＡＢＨＤ）のオルソロガスな他のメンバーのタンパク質をコードする。ある実施形態において、ＣＧＩ５８（Ａｔ４ｇ２４１６０）は、植物種の広い範囲で保存されている３つのモチーフ：ＧＸＳＸＧリパーゼモチーフ（配列番号４１９）、ＨＸ（４）Ｄアシルトランスフェラーゼモチーフ（配列番号４２０）、およびＶＸ（３）ＨＧＦ、推定脂質結合モチーフ（配列番号４２１）を含有する。ヒトＣＧＩ－５８タンパク質は、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）活性を有しているが、リパーゼ活性は無い。対照的に、植物およびタンパク質のタンパク質は、脊椎動物（ヒト、マウスおよびゼブラフィッシュ）タンパク質では存在していない、標準的なリパーゼ配列モチーフＧＸＳＸＧ（配列番号４１９）を有する。植物および酵母のＣＧＩ５８タンパク質は、ＬＰＡＡＴ活性に加え、検出可能な量のＴＡＧリパーゼおよびホスホリパーゼＡ活性を有していると思われるが、ヒトのタンパク質には無い。
アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）中のホモログＣＧＩ－５８遺伝子を攪乱することにより、成熟した葉の中で、中性脂質滴の蓄積がもたらされる。ｃｇｉ－５８の機能を失った突然変異体由来の単離脂質滴の質量分析により、普遍的な葉特異的脂肪酸と共にトリアシルグリセロールが含有していることが示された。成熟したｃｇｉ－５８植物の葉は、野生型植物よりも１０倍超高い、トリアシルグリセロール絶対レベルの著しい増加を示す。ｃｇｉ－５８の機能が失われている植物の油貯蔵種子中の脂質のレベルは変化せず、β酸化の突然変異体と異なり、ｃｇｉ－５８種子は正常に発芽および成長し、スクロースのレスキューは必要としなかった（James et al., 2010）。
ＣＧｉ－５８ポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ （ＮＰ＿１９４１４７．２；配列番号４２９）、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（ＸＰ＿００３５７８４５０．１；配列番号４３０）、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ＸＰ＿００３５２３６３８．１；配列番号４３１）、Ｚｅａ ｍａｙｓ （ＮＰ＿００１１４９０１３．１；配列番号４３２）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （ＸＰ＿００２４６０５３８．１；配列番号４３３）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＸＰ＿００２５１０４８５．１；配列番号４３４）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ （ＸＰ＿００３６０３７３３．１；配列番号４３５）および、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ （ＥＡＺ０９７８２．１；配列番号４３６）由来のタンパク質が挙げられる。
本明細書において、「Ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ２」または「ＬＥＣ２」という用語は、接合性胚形成および体細胞性胚形成に関与するＢ３ドメイン転写因子を指す。その異所性発現により、生育植物組織からの胚形成が促進される（Alemanno et al., 2008）。ＬＥＣ２はまた、今のところ植物タンパク質においてのみ見つかっているＤＮＡ結合領域を含有する。ＬＥＣ２ポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿５６４３０４．１）（配列番号４４２）、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ （ＣＡＡ４２９３８．１）（配列番号４４３）およびＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（ＡＤＯ１６３４３．１）（配列番号４４４）由来のタンパク質が挙げられる。
本明細書において、「ＢＡＢＹ ＢＯＯＭ」または「ＢＢＭ」という用語は、野生型植物においては通常、再生をサポートしないような培養条件下で再生を誘導するＡＰ２／ＥＲＦ転写因子を指す。Ｂ． ｎａｐｕｓ、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるＢｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ ＢＢＭ （ＢｎＢＢＭ）遺伝子の異所性の発現により、ホルモンフリーの基礎培地で成長した実生からの自発的な体細胞性胚形成および器官形成が誘導される（Boutilier et al., 2002）。タバコにおいては、基礎培地での不定芽および不定根の再生の誘導には異所性のＢＢＭ発現で十分であるが、体細胞性胚（ＳＥ）形成には異所性のサイトカイニン（ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）が必要である（Srinivasan et al., 2007）。ＢＢＭポリペプチドの例としては、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ （ＮＰ＿１９７２４５．２）（配列番号４４５）およびＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ （ＡＡＷ８２３３４．１）（配列番号４４６）由来のタンパク質が挙げられる。
本明細書において、「ＦＡＤ２」という用語は、オレイン酸（１８：１Δ９）をデサチュラーゼしてリノール酸（Ｃ１８：２Δ９、１２）を産生する膜結合デルタ－１２脂肪酸デサチュラーゼを指す。
本明細書において、「エポキシゲナーゼ」または「脂肪酸エポキシゲナーゼ」という用語は、エポキシ基を脂肪酸に導入し、エポキシ脂肪酸の産生をもたらす酵素を指す。好ましい実施形態において、エポキシ基は、脂肪酸鎖の１２番目の炭素に導入され、その場合、エポキシゲナーゼは、特に、Ｃ１６またはＣ１８脂肪酸鎖のΔ１２－エポキシゲナーゼである。エポキシゲナーゼは、Δ９－エポキシゲナーゼ、Δ１５－エポキシゲナーゼであってもよく、または当分野公知のアシル鎖の異なる位置で作用してもよい。エポキシゲナーゼは、ｐ４５０クラスのものであっても良い。好ましいエポキシゲナーゼは、ＷＯ９８／４６７６２に記述されるモノ－オキシゲナーゼである。多くのエポキシゲナーゼまたは推定エポキシゲナーゼがクローニングされ、当分野に公知である。エポキシゲナーゼのさらなる例としては、ＷＯ ２００９／１２９５８２の配列番号２１に提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質、Ｃｒｅｐｉｓ ｐａｌｅａｓｔｉｎａ （ＣＡＡ７６１５６， Lee et al., 1998）、Ｓｔｏｋｅｓｉａ ｌａｅｖｉｓ （ＡＡＲ２３８１５， Hatanaka et al., 2004）（モノオキシゲナーゼ型）、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｌａｇａｓｃａｅ （ＡＡＬ６２０６３）（Ｐ４５０型）、ヒトＣＹＰ２Ｊ２（アラキドン酸エポキシゲナーゼ、Ｕ３７１４３）；ヒトＣＹＰＩＡ１（アラキドン酸エポキシゲナーゼＫ０３１９１）由来の遺伝子にコードされるポリペプチド、ならびにそれらの変異型および／または突然変異体が挙げられる。
本明細書において、「ヒドロキシラーゼ」または「脂肪酸ヒドロキシラーゼ」という用語は、ヒドロキシル基を脂肪酸に導入し、ヒドロキシル化脂肪酸の産生をもたらす酵素を指す。好ましい実施形態において、ヒドロキシル基は、Ｃ１８脂肪酸鎖の２、１２および／または１７番目の炭素に導入される。好ましくは、ヒドロキシル基は、１２番目の炭素で導入され、その場合、ヒドロキシラーゼは、Δ１２－ヒドロキシラーゼである。他の好ましい実施形態において、ヒドロキシル基は、Ｃ１６脂肪酸鎖の１５番目の炭素に導入される。ヒドロキシラーゼはまた、脂肪酸デサチュラーゼとしての酵素活性を有していても良い。Δ１２－ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の例としては、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ＡＡＣ９０１０， van de Loo 1995）； Ｐｈｙｓａｒｉａ ｌｉｎｄｈｅｉｍｅｒｉ、（ＡＢＱ０１４５８， Dauk et al., 2007）； Ｌｅｓｑｕｅｒｅｌｌａ ｆｅｎｄｌｅｒｉ、（ＡＡＣ３２７５５， Broun et al., 1998）； Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ、（ＡＡＫ３０２０６）由来のもの；たとえば、Ａ， ｔｈａｌｉａｎａ ＣＹＰ８６Ａ１（Ｐ４８４２２、脂肪酸ω－ヒドロキシラーゼ）；Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ ＣＹＰ９４Ａ１（Ｐ９８１８８、脂肪酸ω－ヒドロキシラーゼ）；マウスＣＹＰ２Ｅ１（Ｘ６２５９５、ラウリン酸ω－１ヒドロキシラーゼ）；ラットＣＹＰ４Ａ１ （Ｍ５７７１８、脂肪酸ω－ヒドロキシラーゼ）等の脂肪酸の末端をヒドロキシル化する脂肪酸ヒドロキシラーゼ、ならびにそれらの変異型および／または突然変異体が挙げられる。
本明細書において、「コンジュガーゼ」または「脂肪酸コンジュガーゼ」という用語は、脂肪酸のアシル鎖において共役結合を形成することが出来る酵素を指す。コンジュガーゼの例としては、Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ （ＡＦ３４３０６４， Qiu et al., 2001）； Ｖｅｒｎｉｃｉａ ｆｏｒｄｉｉ （ＡＡＮ８７５７４， Dyer et al., 2002）； Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ （ＡＹ１７８４４６， Iwabuchi et al., 2003）および、Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ（ＡＹ１７８４４４，Iwabuchi et al., 2003）由来の遺伝子によりコードされるもの、ならびにそれらの変異型および／または突然変異体が挙げられる。
本明細書において、「アセチレナーゼ（ａｃｅｔｙｌｅｎａｓｅ）」または「脂肪酸アセチレナーゼ」という用語は、三重結合を脂肪酸に導入し、アセチレン脂肪酸の産生をもたらす酵素を指す。好ましい実施形態において、三重結合は、Ｃ１８脂肪酸鎖の２、６、１２および／または１７番目の炭素に導入される。アセチレナーゼの例としては、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ （ＡＡ０３８０３２、ＡＢＣ５９６８４）由来のもの、ならびにその変異型および／または突然変異体が挙げられる。
そのような脂肪酸改変遺伝子の例としては、以下のアクセッション番号に従う、推定機能によりグループ化されたタンパク質、および他種由来のホモログが挙げられる：Δ１２アセチレナーゼＡＢＣ００７６９、ＣＡＡ７６１５８、ＡＡＯ３８０３６、ＡＡＯ３８０３２；Δ１２コンジュガーゼＡＡＧ４２２５９、ＡＡＧ４２２６０、ＡＡＮ８７５７４；Δ１２デサチュラーゼＰ４６３１３、ＡＢＳ１８７１６、ＡＡＳ５７５７７、ＡＡＬ６１８２５、ＡＡＦ０４０９３、ＡＡＦ０４０９４；Δ１２エポキシゲナーゼＸＰ＿００１８４０１２７、ＣＡＡ７６１５６、ＡＡＲ２３８１５；Δ１２ヒドロキシラーゼＡＣＦ３７０７０、ＡＡＣ３２７５５、ＡＢＱ０１４５８、ＡＡＣ４９０１０；および、Δ１２Ｐ４５０酵素（たとえば、ＡＦ４０６７３２）。
本明細書において、「生育組織」または「生育植物部分」という用語は、植物の有性生殖のための器官（具体的には、器官を担持する種子、花、花粉、果実および種子）以外の任意の植物の組織、器官または部分である。生育組織およびその部分としては、少なくとも植物の葉、茎（ボルト（早熟実）および分げつを含むが、結球を除く）、塊茎および根を含むが、花、花粉、種子（種皮、胚内胚乳を含む）、果実（中果皮組織を含む）、種子を担持した鞘および種子を担持した結球を除く。１つの実施形態において、植物の生育部分は、気生植物部分である。他の実施形態または好ましい実施形態において、生育植物部分は、たとえば葉または茎等の緑色部分である。
本明細書で使用される「野生型」という用語またはその変形は、遺伝的に修飾されていない細胞または非ヒト生物もしくはその一部を指す。
「対応する」という用語は、本発明の生育植物部分、細胞または非ヒト生物もしくはその一部、または種子と同一または同様の遺伝的背景を有するが、本明細書で説明されるように修飾されていない、生育植物部分、細胞または非ヒト生物もしくはその一部、または種子（例えば、ＭＧＡＴをコードする外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ＭＧＡＴが欠如している、生育植物部分、細胞または非ヒト生物もしくはその一部、または種子）を指す。好ましい実施形態において、生育植物部分、細胞、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、本発明の生育植物部分、細胞、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子と同じ成長段階にある。たとえば、もし非ヒト生物が開花期の植物である場合、好ましくは、対応する植物もまた開花期である。対応する生育植物部分、細胞または非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、核酸またはタンパク質発現のレベル、または、例えば非極性脂質産物および／または含量の、または本明細書で説明されるように修飾された生育植物部分、細胞または非ヒト生物もしくはその一部、または種子による形質修飾の程度または性質を比較するための対照として使用することができる。当業者であれば、そのような比較のために、適切な「対応する」細胞、組織、器官または生物を容易に決定することができる。
本明細書で使用される「～と比較する」は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは外因性ポリペプチドを発現する、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部の非極性脂質のレベルまたは総非極性脂質含量を、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが欠如しているトランスジェニック非ヒト生物またはその一部と比較することを指す。
本明細書で使用される「非極性脂質を生成する増強された能力」は、対応する細胞または非ヒト生物もしくはその一部と比較して、本発明の細胞または非ヒト生物もしくはその一部によって生成される非極性脂質の総量が増加することを指す、相対語である。一実施形態では、非極性脂質のＴＡＧまたは多価不飽和脂肪酸含量が増加する。
本明細書において、「対応する野生型植物に対するものと実質的に同じ比率での発芽」とは、規定の外因性ポリヌクレオチド（複数含む）を有していない野生型植物の種子と比較した場合に、比較的、繁殖力のある本発明の植物の種子を指す。１つの実施形態において、たとえばその植物種にとって最適な温室条件下で育つ場合に、発芽する種子の数が、対応する野生型の種子の数と比較して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である。他の実施形態において、たとえばその植物種にとって最適な温室条件下で粗立つ場合に、発芽する種子の成長率が、対応する野生型植物のそれと比較した場合に、平均して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％である。
本明細書で使用される「内因性酵素の生成および／または活性を下方制御する単離または組み換えポリヌクレオチド」という用語またはその変形は、内因性酵素、例えば、ＤＧＡＴ、ｓｎ－１グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＡＧＰａｓｅもしくはデルタ－１２脂肪酸デサチュラーゼ（ＦＡＤ２）、またはこれらの２つ以上の組み合わせの、生成および／または活性を下方制御するＲＮＡ分子をコードする（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｈｐＲＮＡｉをコードする）ポリヌクレオチド、またはその生成および／または活性をそれ自体が下方制御する（例えば、細胞に直接送達することができるｓｉＲＮＡである）ポリヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される、「重量基準で」という用語は、物質を含む組成物（例えば、種子、葉）の重量のパーセンテージとしての、物質（例えば、ＴＡＧ、ＤＡＧ、脂肪酸）の重量を指す。例えば、トランスジェニック種子が１２０μｇの種子重量あたり２５μｇの総脂肪酸を有する場合、総脂肪酸のパーセンテージは、重量基準で２０．８％である。
本明細書で使用される「相対基準で」という用語は、対応する組成物と比較したときの、パーセンテージとしての、物質を含む組成物中の物質の量を指す。
本明細書で使用される「相対非脂質含量」という用語は、対応する細胞、生物、もしくはその一部、または細胞、生物、もしくはその一部から抽出した脂質と比較したときの、パーセンテージとしての、細胞、生物、もしくはその一部、またはそこから抽出した脂質の非極性脂質含量の表現を指す。例えば、トランスジェニック種子が２５μｇの総脂肪酸を有するのに対して、対応する種子が２０μｇの総脂肪酸を有する場合、相対基準での非極性脂質含量の増加は、２５％に相当する。
本明細書において、「バイオ燃料」という用語は、典型的には、たとえば自動車、トラックまたは石油で動力を得るエンジン等の機械に動力を与えるために用いられる燃料の任意の型を指し、そのエネルギーは、生物学的炭素固定から得られる。バイオ燃料としては、バイオマス転換、ならびに固形バイオマス、液体燃料およびバイオガスから得られる燃料が含まれる。バイオ燃料の例としては、バイオアルコール、バイオディーゼル、合成ディーゼル、植物油、バイオエーテル、バイオガス、合成ガス、固形バイオ燃料、藻類から得られる燃料、バイオ水素、バイオメタノール、２，５－ジメチルフラン（ＤＭＦ）、バイオジメチルエーテル（ｂｉｏＤＭＥ）、Ｆｉｓｃｈｅｒ－Ｔｒｏｐｓｃｈディーゼル、バイオ水素ディーゼル、混合アルコールおよび木質ディーゼル（ｗｏｏｄ ｄｉｅｓｅｌ）が挙げられる。
本明細書において、「バイオアルコール」という用語は、生物学的に製造されたアルコール（たとえば、エタノール、プロパノールおよびブタノール）を指す。バイオアルコールは、微生物および／または酵素の作用により、糖、ヘミセルロースまたはセルロースの発酵を介して、製造される。
本明細書において、「バイオディーゼル」という用語は、非極性脂質から、トランスエステル化により得られる、脂肪酸メチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルを含む組成物を指す。
本明細書において、「合成ディーゼル」という用語は、ほとんどのディーゼル燃料において用いられている化石原料ではなく、再生可能な原料から得られるディーゼル燃料の形態を指す。
本明細書において、「植物油」という用語は、純粋な植物油（またはストレートの植物油）または廃棄植物油（または他の工業製品による）を含む。
本明細書において、「バイオエーテル」という用語は、オクタン価エンハンサーとして作用する化合物を指す。
本明細書において、「バイオガス」という用語は、嫌気性生物による有機物質の嫌気性消化により産生される、メタンまたは、メタンおよび他のガスの可燃性の混合物を指す。
本明細書において、「合成ガス」という用語は、バイオマスの部分燃焼により産生される、様々な量の一酸化炭素および水素、ならびに場合によっては他の炭化水素を含むガス混合物を指す。
本明細書において、「固形バイオ燃料」という用語は、木、おがくず、草刈込物および食物ではないエネルギー作物を含む。
本明細書において、「セルロース系エタノール」という用語は、セルロースまたはヘミセルロースから製造されるエタノールを指す。
本明細書において、「藻類の燃料」という用語は、藻類から作製されるバイオ燃料をサシ、藻類のバイオディーゼル、バイオブタノール、バイオガソリン、メタン、エタノールおよび藻類から作製される植物油の等価物が含まれる。
本明細書において、「バイオ水素」という用語は、たとえば、藻類等により、生物学的に産生される水素を指す。
本明細書において、「バイオメタノール」という用語は、生物学的に製造されるメタノールを指す。バイオメタノールは、有機物質の合成ガスへのガス化、次いで、従来的なメタノール合成により、製造されても良い。
本明細書において、「２，５－ジメチルフラン」または「ＤＭＦ」という用語は、式（ＣＨ３）２Ｃ４Ｈ２Ｏを有する複素環化合物を指す。ＤＭＦは、セルロースから誘導可能なフランの誘導体である。
本明細書において、「バイオジメチルエーテル」または「バイオＤＭＥ」（メトキシメタンとしてもまた知られる）という用語は、式ＣＨ３ＯＣＨ３を有する有機化合物を指す。合成ガスは、触媒（通常は、銅ベース）の存在下で、メタノールへと転換されてもよく、次に、異なる触媒（たとえば、シリカ－アルミナ）の存在下で、メタノールの脱水を行い、ＤＭＥが製造される。
本明細書において、「Ｆｉｓｃｈｅｒ-Ｔｒｏｐｓｃｈ」という用語は、一酸化炭素と水素の混合物を液体炭化水素へと転換する一連の化学反応を指す。合成ガスは最初に、たとえば水ガスシフトを用いて調整され、必要とされるＨ２／ＣＯ比を得ることができる。転換は、触媒（通常は、鉄またはコバルト）の存在下で行われる。温度、圧力および触媒によって、重油または軽油のいずれが製造されるかが決定される。たとえば、３３０℃では、主にガソリンおよびオレフィンが製造される一方で、１８０℃～２５０℃では主にディーゼルとワックスが製造される。様々な炭化水素分画を含む合成ガスから製造される液体は、非常に清浄な（硫黄の無い）直鎖炭化水素である。Ｆｉｓｃｈｅｒ-Ｔｒｏｐｓｃｈディーゼルは、直接的に製造することができるが、最初にＦｉｓｃｈｅｒ-Ｔｒｏｐｓｃｈワックスが製造され、次いで水素化分解を行う場合、高い産生量が得られる。
本明細書において、「バイオ炭（ｂｉｏｃｈａｒ）」という用語は、バイオマスから作製される（たとえば、バイオマスの熱分解による）、炭を指す。
本明細書において、「原料」という用語は、たとえば、バイオディーゼルまたは合成ディーゼル等のバイオ燃料等の製品の製造に用いられる場合、たとえばバイオマスまたはそれからの転換産物（たとえば、合成ガス）等の物質を指す。
本明細書において、「工業製品」という用語は、たとえば、脂肪酸メチルおよび／もしくはエチルエステル、またはアルカン類（たとえば、メタン）、長鎖アルカン類（大気温度では通常、液体である）の混合物、バイオ燃料、一酸化炭素および／もしくは水素、またはバイオアルコール（たとえば、エタノール、プロパノールまたはブタノール）、またはバイオ炭等の、主に炭素および水素からできている炭化水素製品を指す。「工業製品」という用語は、他の工業製品に転換させることができる中間産物を含むことが意図され、たとえば、合成ガスはそれ自身、工業製品であるとみなされ、また、炭化水素製品を合成するために用いることができる工業製品であるともみなされる。本明細書において工業製品という用語は、上述の化合物の純粋な形態、または様々な化合物と成分のより普遍的な混合物の形態の両方を含み、たとえば、炭化水素製品は、当分野に良く知られる広範な長さの炭素鎖を含んでも良い。
本明細書において、「光沢」とは、表面の外観を評価する際に生じる光学的な現象を指す。光沢の評価は、向けられた光を反射する表面の能力を表す。
本明細書全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語またはたとえば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、記述される要素、完全体もしくはステップ、または要素の群、複数の完全体もしくは複数のステップを含むことを示唆するが、任意の他の要素、完全体もしくはステップ、または要素の群、複数の完全体もしくは複数のステップが排除されることは示唆されないことを理解されたい。
「および／または」（たとえば、Ｘおよび／またはＹ）という用語は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかであることを意味することを理解されたく、および、両方の意味またはいずれかの意味に対して明示的な支持をもたらすと解釈されなければならない。
本明細書において、反対のことが述べられない限り、約という用語は、指定された値の、＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％、より好ましくは＋／－２％、より好ましくは＋／－１％、さらにより好ましくは＋／－０．５％を指す。
ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロールの生成
一実施形態において、本発明の生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、対応する生育植物部分、非ヒト生物またはその一部よりも高いレベルの、ＤＡＧまたはＴＡＧ等の、好ましくは双方の非極性脂質を生成する。一実施例において、本発明のトランスジェニック植物は、対応する種子、葉、表面積が少なくとも１ｃｍ２の葉の部分、茎および／または塊茎と比較したときに、ＤＡＧまたはＴＡＧ等の、好ましくは双方の増加した非極性脂質含量を有する種子、葉、表面積が少なくとも１ｃｍ２の葉の部分、茎および／または塊茎を生成する。生育植物部分、非ヒト生物またはその一部の非極性脂質含量は、対応する非ヒト生物またはその一部と比較したときに、重量基準で０．５％大きいか、または特長（ｉ）にさらに定義されるものである。
別の実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部、好ましくは、植物または種子は、１つ以上の特定の脂肪酸について富化された、ＤＡＧおよび／またはＴＡＧを生成する。飽和および不飽和脂肪酸、ならびに短鎖および長鎖脂肪酸を含む、広範囲の脂肪酸をＤＡＧおよび／またはＴＡＧに組み込むことができる。ＤＡＧおよび／またはＴＡＧに組み込まれ、レベルが増加しうる脂肪酸のいくつかの非限定的な例としては、カプリン脂肪酸（１０：０）、ラウリン脂肪酸（１２：０）、ミリスチン脂肪酸（１４：０）、パルミチン脂肪酸（１６：０）、パルミトレイン脂肪酸（１６：１）、ステアリン脂肪酸（１８：０）、オレイン脂肪酸（１８：１）、バクセン脂肪酸（１８：１）、リノール脂肪酸（１８：２）、エレオステアリン脂肪酸（１８：３）、γリノレン脂肪酸（１８：３）、αリノレン脂肪酸（１８：３ω３）、ステアリドン脂肪酸（１８：４ω３）、アラキン脂肪酸（２０：０）、エイコサジエン脂肪酸（２０：２）、ジホモ－γリノール脂肪酸（２０：３）、エイコサトリエン脂肪酸（２０：３）、アラキドン脂肪酸（２０：４）、エイコサテトラエン脂肪酸（２０：４）、エイコサペンタエン脂肪酸（２０：５ω３）、ベヘン脂肪酸（２２：０）、ドコサペンタエン脂肪酸（２２：５ω）、ドコサヘキサエン脂肪酸（２２：６ω３）、リグノセリン脂肪酸（２４：０）、ネルボン脂肪酸（２４：１）、セロチン脂肪酸（２６：０）、およびモンタン脂肪酸（２８：０）が挙げられる。本発明の１つの実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック生物またはその一部は、オレイン酸または、多価不飽和脂肪酸を含むＤＡＧおよび／またはＴＡＧについて富化される。
本発明の一実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部、好ましくは、植物または種子は、ＤＧＡＴ活性を有してもよく、または有しなくてもよい、ＭＧＡＴをコードするキメラＤＮＡで形質転換される。ＭＧＡＴの発現は、好ましくは、該生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部において、より高いレベルのＤＡＧまたはＴＡＧ等の非極性脂質、および／または増加した非極性脂質の収量をもたらす。好ましい実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、植物である。
さらなる実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、ＧＰＡＴまたはＤＧＡＴをコードするキメラＤＮＡで形質転換される。好ましくは、生育植物部分またはトランスジェニック非ヒト生物は、双方のキメラＤＮＡで形質転換され、好ましくは、例えば単一のＴ－ＤＮＡ分子等の、１つのＤＮＡ分子に共有的に結合する。
Ｙａｎｇ et al.,（２０１０）は、グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）からｓｎ－２－ＭＡＧを生成することができる（図１）、ｓｎ－２選好およびホスファターゼ活性を有するアラビドプシス由来の、２つのグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６）を説明している。これらの酵素は、クチン合成経路の一部であることが提唱されている。アラビドプシスＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６は、脂肪酸基質としてアシルＣｏＡを使用することが示されている（Ｚｈｅｎｇ et al.,２００３）。
二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼをＭＧＡＴと組み合わせることで、一方の基質としてＧ－３－Ｐを使用し、もう一方の基質としてアシルＣｏＡに由来する２つのアシル基を使用する、新しいＤＡＧ合成経路を生ずる。同様に、そのような二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼを、ＤＧＡＴ活性を有するＭＧＡＴと組み合わせることで、一方の基質としてグリセロール－３－リン酸を使用し、もう一方の基質としてアシルＣｏＡに由来する３つのアシル基を使用する、新しいＴＡＧ合成経路を生ずる。
故に、本発明の一実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼで、およびＤＧＡＴ活性を有しないＭＧＡＴで共形質転換される。これは、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼによるＭＡＧの生成をもたらし、次いで、ＭＧＡＴによってＤＡＧに変換され、次いで、ＤＧＡＴまたは他の活性によってＴＡＧに変換される。新しいＤＡＧの生成は、例えば、Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ et al.,（２００７、図２）によって説明されるような、致死ＳＬＣ１＋ＳＬＣ４ノックアウトを含む酵母株においてそのような共形質転換を行うことによって、確認および選択することが可能である。Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ et al.,（２００７）の図２は、２つの酵母ＬＰＡＴ（ＳＬＣ１およびＳＬＣ４）をノックアウトすることが致死的であることを示す。トランス中のｓｌｃ遺伝子（それらの場合、ＳＬＣ１）の１つを提供する補足プラスミドのため、ＳＬＣ１＋ＳＬＣ４二重酵母変異を維持することだけしかできない。ＦＯＡを培地に添加することによる陰性選択は、この補足プラスミドの損失（Ｕｒａ選択マーカーの対抗選択）をもたらし、細胞を生存できないようにする。
本発明の別の実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部、好ましくは、植物または種子は、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼおよびＤＧＡＴ活性を有するＭＧＡＴをコードするキメラＤＮＡで共形質転換される。これは、二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼによるＭＡＧの生成をもたらし、ＭＧＡＴによってＤＡＧに変換され、次いで、ＴＡＧに変換される。
さらなる実施形態では、いかなる検出可能なホスファターゼ活性も伴わない１つ以上の内因性ＧＰＡＴがサイレンシングされる。例えば、ケネディ経路においてグリセロール－３－リン酸をアシル化してＬＰＡを形成するＧＰＡＴ（例えば、アラビドプシスＧＰＡＴ１）をコードする、１つ以上の遺伝子がサイレンシングされる。
他の実施形態において、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、好ましくは植物または種子は、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子、オレオシン、またはサイレンシングサプレッサーポリペプチドをコードするキメラＤＮＡで形質転換される。キメラＤＮＡは、好ましくは、たとえば単一のＴ－ＤＮＡ分子等の１つのＤＮＡ分子上に共有結合され、生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部は、好ましくは、そのゲノム内に挿入された１つのＤＮＡ分子に対してホモ接合性である。
基質選好は、例えば、野生型ＭＧＡＴ遺伝子による相補を防止する濃度の特定の遊離脂肪酸（例えば、ＤＨＡ）をＭＧＡＴ変異形を発現するトランスジェニックＨ１２４６酵母株に供給することによって、新しいＤＡＧおよびＴＡＧ合成経路に操作することが可能である。供給された遊離脂肪酸を使用することができる変異形だけが成長するであろう。数サイクルのＭＧＡＴの操作により、特定の脂肪酸に対する増加した選好を伴うＭＧＡＴが生成されるであろう。
上で説明した種々のケネディ経路の相補および補充は、初期の基質であるグリセロール－３－リン酸の遍在的な性質のため、任意の細胞型で行うことが可能である。一実施形態において、導入遺伝子の使用は、増加した油収量をもたらす。
ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、同じ意味で使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体である、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成もしくは合成起源、２本鎖もしくは１本鎖のものであってもよく、また、その起源または操作によって、（１）自然界で伴うポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、（２）自然界で連結されるもの以外のポリヌクレオチドに連結する、または（３）自然界で生じない。ポリヌクレオチドの限定的でない例としては、遺伝子または遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連結分析から定義される座（単数または複数）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、任意の配列のキメラＤＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合前または集合後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分との複合体化等によって、重合後にさらに修飾することができる。
「単離されたポリヌクレオチド」とは、一般に、その自然状態において会合または連結されるポリヌクレオチド配列から分離された、ポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、自然に会合または連結されるポリヌクレオチド配列を、少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まない。
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、その最も広い文脈において解釈すべきであり、構造遺伝子の転写された領域、および翻訳された場合は、タンパク質コード領域を含み、かつ、５’および３’のいずれの末端においても少なくとも約２ｋｂの距離にわたって両末端上のコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を含む、デオキシリボヌクレオチドを含む。この点に関して、遺伝子は、所与の遺伝子と自然に関連するプロモーター、エンハンサー、終結および／またはポリアデニル化シグナル等の制御シグナル、または異種制御シグナルを含み、その場合、遺伝子は、「キメラ遺伝子」と称される。タンパク質コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。タンパク質コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の双方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と称される非コード配列で中断され得る、コード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｎＲＮＡ）の中に転写される、遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサー等の調節要素を含んでもよい。イントロンは、核転写物または一次転写物から除去または「スプライス除去」され、したがって、イントロンは、ｍＲＮＡ転写物中には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を規定するように機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書で説明される本発明のタンパク質の全部または一部をコードする合成分子または融合分子、および前述のいずれか１つに対する相補的ヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用される「キメラＤＮＡ」は、自然界では自然に見出されないあらゆるＤＮＡ分子を指し、本明細書では「ＤＮＡ構築物」とも称される。典型的には、キメラＤＮＡは、自然界では一緒に自然に見出されない調節配列および転写配列またはタンパク質コード配列を含む。故に、キメラＤＮＡは、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列およびコード配列を含むことができる。オープンリーディングフレームは、その自然の上流および下流の調節要素に連結されてもよく、または連結されなくてもよい。オープンリーディングフレームは、例えば、植物ゲノムの中、非自然的な場所、または細菌プラスミドもしくはウイルスベクター等の自然に見出されないレプリコンもしくはベクターに組み込まれ得る。「キメラＤＮＡ」という用語は、宿主において複製可能であるＤＮＡ分子に限定されず、例えば特異的アダプター配列によってレプリコンの中に連結することができるＤＮＡを含む。
「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノムの中に導入された遺伝子である。本用語には、それらの先祖細胞のゲノム内に導入された、子孫細胞、植物、種子、非ヒト生物もしくはその一部中の遺伝子が含まれる。そのような子孫細胞等は、初代形質転換細胞の先祖細胞から、少なくとも３世代または４世代後の子孫細胞であってもよい。子孫細胞は、有性生殖または植物性（たとえば、ジャガイモの塊茎または、サトウキビの新芽等）に産生されてもよい。「遺伝的に修飾された」という用語、およびその変化形は、形質転換または形質導入によって遺伝子を細胞の中に導入することと、細胞中の遺伝子を変異させることと、細胞中の遺伝子、もしくは上で説明したように修飾される任意の細胞の子孫細胞の制御を遺伝子的に変化または調節することとを含む、広義の用語である。
本明細書で使用される「ゲノム領域」という用語は、導入遺伝子または導入遺伝子群（本明細書では、塊とも称される）が細胞またはその祖先の中に挿入された、ゲノム内の位置を指す。そのような領域は、本明細書で説明される方法等により、人の介入によって組み込まれたヌクレオチドのみを含む。
本発明の「組み換えポリヌクレオチド」は、人工組み換え方法によって構成または修飾された、核酸分子を指す。組み換えポリヌクレオチドは、その自然状態と比較して、（例えば、ｍＲＮＡの場合）変化した量で細胞中に存在し得るか、または変化した速度で発現し得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、自然にはそのポリヌクレオチドを含まない細胞の中に導入される。典型的に、外因性ＤＮＡがｍＲＮＡの転写のためのテンプレートとして使用され、次いで、形質転換した細胞内に本発明のポリペプチドをコードするアミノ酸残基の連続配列に翻訳される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性であり、その発現は、組み換え手段によって変化させられる。例えば、外因性制御配列が、関心の内因性遺伝子の上流に導入されて、形質転換された細胞が、遺伝子によってコードしたポリペプチドを発現することを可能にする。
本発明の組み換えポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが存在する、細胞に基づく、または細胞を含まない発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、および該細胞に基づく、または細胞を含まない発現系において生成され、その後に、少なくとも他のいくつかの成分から精製されるポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、自然界に存在する隣接する一続きのヌクレオチドとすることができ、または単一のポリヌクレオチドを形成するように接合した異なる源（自然発生的および／または合成的なもの）に由来する２つ以上の隣接する一続きのヌクレオチドを含むことができる。典型的に、そのようなキメラポリヌクレオチドは、関心の細胞中のオープンリーディングフレームの転写を駆動するのに好適なプロモーターに動作可能に連結される本発明のポリペプチドをコードする、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。
定義されたポリヌクレオチドに関して、本明細書で提供されるものよりも高い同一性％の値が、好ましい実施形態を包含することを理解されるであろう。したがって、該当する場合、最小の同一性％の値に照らして、ポリヌクレオチドは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指定された配列番号と同一である、ポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
本発明の、または本発明に有用なポリヌクレオチドは、緊縮条件下で、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリッド形成させてもよい。本明細書で使用される緊縮条件とは（１）ハイブリッド形成中に、ホルムアミド等の変性剤を用いること、例えば、４２℃で、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、０．１％のフィコール、０．１％のポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌを有するｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、７５ｍＭのクエン酸クエン酸ナトリウムを伴う５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを用いること、または（２）０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中に、４２℃で、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａｃｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、超音波振動処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを用いること、および／または（３）洗浄のために低イオン強度で高温を用いること、例えば、５０℃で０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳを用いること、である。
本発明のポリヌクレオチドは、自然発生的な分子と比較したときに、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換である、１つ以上の変異を保有し得る。参照配列に対して変異を有するポリヌクレオチドは、自然に発生するもの（すなわち、天然源から単離したもの）、または（例えば、上で説明したように、部位特異的変異誘発またはＤＮＡシャフリングを行うことによって）合成したものとすることができる。
内因性タンパク質の発現レベルを減少させるためのポリヌクレオチド
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するのに特に有用である。理論に限定されることを望まないが、Waterhouse et al. (1998)により、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を用いてタンパク質産生を減少させることができる機序のモデルが提唱されている。この技術は、対照の遺伝子またはその一部のｍＲＮＡと本質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に依存している。便利なことに、ｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列が関連の無い配列によって隣り合っており、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖がハイブリダイズし、ループ構造を形成する非関連配列を有するｄｓＲＮＡを形成することができる、組換えベクターまたは宿主細胞中の１つのプロモーターから産生することができる。適切なｄｓＲＮＡ分子の設計および製造は、当業者の能力の範囲内であり、具体的には、Waterhouse et al. (1998)、Smith et al. (2000)、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／３４８１５を考慮のこと。
１つの例において、ＤＮＡは、非活性化される標的遺伝子に対する相同性を有する、少なくとも部分的に二重鎖のＲＮＡ産物（複数含む）の合成を指示するＤＮＡが導入される。ゆえに、当該ＤＮＡは、ＲＮＡに転写される際、ハイブリダイズして、二重鎖ＲＮＡ領域を形成することができるセンス配列とアンチセンス配列の両方を含む。本発明の１つの実施形態において、センス配列とアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写された際に、スプライス除去されるイントロンを含むスペーサー領域により分離されている。この配置によって、より高効率で遺伝子サイレンシングが起こることが示されている。二重鎖領域は、１つのＤＮＡ領域または２つのＤＮＡ領域のいずれかから転写される、１つまたは２つのＲＮＡ分子を含有しても良い。二重鎖分子の存在によって、二重鎖ＲＮＡおよび、標的遺伝子からの相同ＲＮＡ転写物の両方を破壊する内因性システムからの応答が引き起こされ、標的遺伝子の活性が効率的に減少または消去されると考えられている。
ハイブリダイズするセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、それぞれ、少なくとも１９の連続的なヌクレオチドでなければならない。遺伝子転写物全体に対応する完全長配列を用いても良い。標的転写物に対するセンス配列およびアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５～１００％でなければならない。ＲＮＡ分子は、もちろん、分子の安定化のために機能しうる非関連配列を含有してもよい。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で、発現されても良い。後者の例としては、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターが挙げられる。
好ましい低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９～２１の連続したヌクレオチドと同一な、ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡから始まり、ＧＣ含量が約３０～７０％（好ましくは、３０～６０％、より好ましくは４０～６０％、およびより好ましくは約４５～５５％）であり、そして、導入される生物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列と高い同一性パーセンテージ（たとえば標準的なＢＬＡＳＴサーチにより決定される）を有してはいない。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（略語は、ｍｉＲＮＡ）は、一般的には、不完全なステムループ構造を形成する大きな前駆体から誘導される、１９～２５ヌクレオチド（通常、植物においては約２０～２４ヌクレオチド）の非コーディングＲＮＡ分子である。
ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補配列に結合し、通常、翻訳の抑制または標的の分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。
植物細胞において、ｍｉＲＮＡ前駆体分子は、核内で大部分がプロセッシングされると考えられている。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（１以上の局所的な二重鎖または「ヘアピン」領域、ならびに通常のｍＲＮＡの５´「キャップ」およびポリアデニル化テールを含有）は、プロセッシングされて、ステムループ構造または折り畳み構造をまた含有する、より短いｍｉＲＮＡ前駆体分子となり、「ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ」と呼称される。植物において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、独特なＤＩＣＥＲ様（ＤＣＬ）酵素により開裂され、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖を産生する。核から外に輸送される前に、これらの二本鎖はメチル化される。
細胞質において、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ二本鎖由来のｍｉＲＮＡ鎖は、標的認識のために、選択的に、活性ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へと組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体は、配列特異的遺伝子抑制を行うＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の特定のサブセットを含む（たとえば、Millar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al., 2005; Almeida and Allshire, 2005を参照のこと）。
共抑制
遺伝子は、関連内因性遺伝子および／またはゲノム中に既に存在している導入遺伝子の発現を抑制することができ、その現象は、相同性依存遺伝子サイレンシング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）と呼称される。相同性依存遺伝子サイレンシングの例のほとんどは、２つに分類され、一つは、導入遺伝子の転写レベルでの機能するものであり、もう１つは、転写後に操作するものである。
転写後の相同性依存遺伝子サイレンシング（すなわち、共抑制）により、トランスジェニック植物の、導入遺伝子および関連内因性遺伝子またはウイルス性遺伝子の発現の消失が説明される。共抑制はしばしば（常にではない）、導入遺伝子の転写物が豊富にある場合に発生し、多くの場合、ｍＲＮＡプロセッシングのレベル、局在および／または分解で引き起こされると考えられている。どのように共抑制が機能するかを説明するモデルがいくつか存在する（Taylor, 1997を参照のこと）。
１つのモデルは、「定量」モデルまたは「ＲＮＡ閾値」モデルであり、細胞は導入遺伝子の大量の転写物の蓄積に対応することができるが、それはある程度までである、ということを提唱している。臨界を超えると、導入遺伝子および関連内因性遺伝子の転写物の両方の配列依存的な分解が開始される。この共抑制の様式は、恐らくは内因性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる、過剰な導入遺伝子ｍＲＮＡの逆転写による、コピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）分子の合成の後で引き起こされる可能性があると提唱している。これらのｃＲＮＡは、導入遺伝子および内因性ｍＲＮＡとハイブリダイズし、異常なハイブリダイズにより相同の転写物が分解の標的となる。しかしながら、このモデルは、導入遺伝子の転写が無くても、および／または導入遺伝子転写物の検出可能な蓄積が無くても、共抑制が明らかに発生することを提唱する結果を説明していない。
これらのデータを説明するために、第二のモデルである、「定性」モデルまたは「異常ＲＮＡ」モデルにより、導入ＲＮＡおよびＤＮＡの間の相互作用、ならびに／または、内因性ＤＮＡおよび導入ＤＮＡの間の相互作用により、遺伝子の転写領域のメチル化がもたらされるということが提唱されている。メチル化遺伝子は、ある意味では異常であるＲＮＡを産生し、その特異な特徴により、すべての関連転写物の特異的な分解が発生することが提唱されている。そのような異常なＲＮＡは、複合的な導入遺伝子の遺伝子座（特に、逆方向反復を含むもの）により産生されうる。
三番目のモデルは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの作用を介して産生されるｃＲＮＡ－ｍＲＮＡハイブリッドではなく、転写物間の分子間塩基対が、共抑制を引き起こしうるということを提唱している。そのような塩基対は、転写レベルが上がるにつれてより発生しやすくなり得、推定二重鎖領域が相同転写物の標的化分解を引き起こす。同様のモデルにより、転写物間の分子間塩基対の代わりに、分子内塩基対が提唱されている。
共抑制は、必要以上の遺伝子のコピーまたはそれらの断片の、その発現のためのプロモーターに対してセンス方向での植物内への導入に関与する。当業者であれば、センス断片のサイズ、標的遺伝子領域への対応、および標的遺伝子に対する配列同一性の程度が変化しうることを認識するであろう。一部の例において、遺伝子配列の付加的なコピーは、標的植物遺伝子の発現を妨げる。共抑制法を実施する方法に対する参照文献は、ＷＯ９７／２０９３６およびＥＰ０４６５５７２にある。
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、内因性ポリペプチドをコードする特定のｍＲＮＡと少なくとも一部で相補的であり、たとえばｍＲＮＡ翻訳等の転写後事象に干渉することができる分子である、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを意味すると捉えられる。アンチセンス法の使用は当分野に公知である（たとえば、G. Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)を、参照のこと）。植物におけるアンチセンス技法の使用は、Bourque (1995)および、Senior (1998)により概説されている。Bourque (1995)は、植物システムにおいてどのようにアンチセンス配列を、遺伝子不活化の方法として利用するかについての多くの例をリストアップしている。Bourqueはまた、部分阻害により、高い確率で、システム中で測定可能な変化がもたらされ得るので、任意の酵素活性の１００％阻害を達成することは必ずしも必要ではないと述べている。Senior (1998)は、アンチセンス法は、現在、非常によく確立された、遺伝子発現の操作に対する技術であることを述べている。
１つの実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは、生理的条件下でハイブリダイズする、すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド（完全一本鎖または部分一本鎖である）は、細胞中の通常の条件下で、たとえば内因性酵素（たとえば、ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡ、ＬＰＣＡＴ、ＰＡＰ、ＡＧＰａｓｅ）等をコードするｍＲＮＡと、少なくとも二重鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。
アンチセンス分子は、構造遺伝子に対応する配列、または遺伝子発現もしくはスプライシングイベントに対する管理をもたらす配列を含んでも良い。たとえば、アンチセンス配列は、内因性遺伝子の標的コード領域、または５´非翻訳領域（ＵＴＲ）もしくは３´－ＵＴＲ、またはこれらの組み合わせに対応し得る。転写の間、または転写後にスプライス除去されうるイントロン配列に対して、部分的に相補的であっても良く、好ましくは、標的遺伝子のエキソン配列にのみ相補的であっても良い。ＵＴＲが通常、相違性が高いことを考慮すると、これらの領域を標的とすることにより、遺伝子阻害の特異性が高められる。
アンチセンス配列の長さは、少なくとも１９の連続したヌクレオチドでなくてはならず、好ましくは少なくとも５０のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドである。遺伝子転写物全体に対して相補的な全長配列を用いても良い。長さは、最も好ましくは１００～２０００ヌクレオチドである。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％でなければならず、より好ましくは９５～１００％である。アンチセンスＲＮＡ分子は、もちろん、分子の安定化のために機能しうる非関連配列を含有しても良い。
触媒ポリヌクレオチド
「触媒ヌクレオチド」という用語は、個別の基質を特異的に認識し、この基質の化学的修飾を触媒する、ＤＮＡ分子もしくは分子を含むＤＮＡ（当分野では「デオキシリボザイム」としてもまた知られる）、または、ＲＮＡもしくは分子を含むＲＮＡ（「リボザイム」としてもまた知られる）を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（および、ＲＮＡに対してはＵ）であっても良い。
典型的には、触媒核酸は、標的核酸の特異的認識のためのアンチセンス配列、および酵素活性を開裂する核酸（本明細書において「触媒ドメイン」ともまた呼ばれる）を含む。本発明において特に有用なリボザイムのタイプは、ハンマーヘッド型のリボザイム（Haseloff and Gerlach, 1988; Perriman et al., 1992）およびヘアピン型のリボザイム（Zolotukhin et al., 1996; Klein et al., 1998; Shippy et al., 1999）である。
本発明に有用なリボザイムおよび当該リボザイムをコードするＤＮＡは、当分野に公知の方法を用いて化学的に合成することができる。リボザイムはまた、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（たとえば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ等）に動作可能に連結された、（転写によってＲＮＡ分子を産生する）ＤＮＡ分子から調製することができる。別の実施形態において、ＤＮＡは、発現カセットまたは転写カセット内に挿入することができる。合成後、ＲＮＡ分子は、リボザイムを安定化させ、ＲＮａｓｅに対して抵抗性にさせる能力を有するＤＮＡ分子へのライゲーションにより、改変することができる。
本明細書に記述されるアンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡと同様に、本発明に有用な触媒ポリヌクレオチドは、「生理的な条件」下、すなわち、植物、藻類または菌細胞内の条件下で、標的核酸分子に「ハイブリダイズ」することができるものとする。
組み換えベクター
本発明の一実施形態は、組み換えベクターを含み、該組み換えベクターは、本明細書で定義される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる。組み換えベクターとしては、発現ベクターが挙げられる。組み換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、自然には見出されず、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに隣接し、好ましくは、異なる種に由来する、ポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかとすることができ、典型的に、ウイルスに由来するウイルスベクター、またはプラスミドである。プラスミドベクターは、典型的に、原核生物細胞、例えば、ｐＵＣ由来のベクター、ｐＳＫ由来のベクター、ｐＧＥＭ由来のベクター、ｐＳＰ由来のベクター、ｐＢＳ由来のベクター、または１つ以上のＴ－ＤＮＡ領域を含むバイナリーベクターにおける容易な発現カセットの選択、増幅、および形質転換を提供する、付加的な核酸配列を含む。付加的な核酸配列は、ベクターの自律複製を提供する複製の起源、好ましくは、抗生物質または除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸配列または核酸構築物にコードされる遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する一意の多重クローニング部位、ならびに原核生物および真核生物（特に植物）細胞の形質転換を増強する配列を含む。
本明細書で使用される「動作可能に連結する」とは、２つ以上の核酸（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的に、転写配列に対する転写調節要素（プロモーター）の機能的関係を指す。例えば、プロモーターは、適切な細胞においてコード配列の転写を刺激または調節する場合に、本明細書で定義されるポリヌクレオチドのコード配列に動作可能に連結されている。一般に、転写配列に動作可能に連結されるプロモーター転写調節要素は、転写配列に物理的に隣接する。すなわち、それらは、シス作用性である。しかしながら、エンハンサー等のいくつかの転写調節要素は、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接する、または極めて近接して位置する必要がない。
複数のプロモーターが存在するときに、各プロモーターは、独立して同一であるかまたは異なっていてもよい。
組み換えベクターはまた、（ａ）本明細書で定義される発現されるポリペプチドが、ポリペプチドを生成する細胞から分泌されることを可能にするように、シグナルペプチド配列をコードする、または発現したポリペプチドの局在化（例えば、細胞中の小胞体（ＥＲ）におけるポリペプチドの保持）、もしくはプラスチドの中への転移を提供する、１つ以上の分泌シグナル、および／または（ｂ）融合タンパク質としての核酸分子の発現を誘導する、融合配列を含む。好適なシグナルセグメントの例としては、本明細書で定義されるポリペプチドの分泌または局在化を指令することができる、任意のシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、ニコチアナ・ネクタリンシグナルペプチド（米国特許第ＵＳ５，９３９，２８８号）、タバコエクステンシンシグナル、またはダイズオレオシン油体結合タンパク質シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。組み換えベクターはまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの核酸配列を囲んで、および／またはその中に、介在配列および／または非翻訳配列を含んでもよい。
形質転換体の特定を容易にするために、組み換えベクターは、望ましくは、本明細書で定義されるポリヌクレオチドの核酸配列として、またはこれに加えて、選択可能な、もしくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」とは、そのマーカー遺伝子を発現する細胞に異なる表現型を与えて、したがって、該マーカーを有しない細胞からそのような形質転換された細胞を区別することを可能にする、遺伝子を意味する。選択可能マーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、または非形質転換細胞に損傷を与える他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」することができる形質を与える。スクリーニング可能なマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち「スクリーニング」によって特定することができる形質（例えば、非形質転換細胞中に存在しない、β－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、または他の酵素活性）を与える。例えば米国特許第ＵＳ４，３９９，２１６号で説明されるように、連結されていない遺伝子の共形質転換が、例えば植物の形質転換における効率的な過程でもあるので、関心のマーカー遺伝子およびヌクレオチド配列を連結させる必要はない。マーカーの実際の選択は、植物細胞等の細胞の選択との組み合せにおいてそれが機能的（すなわち、選択的）である限り、重要ではない。
細菌性選択可能マーカーの例は、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性等の、抗生物質耐性を与えるマーカーである。植物の形質転換体の選択のための例示的な選択可能なマーカーとしては、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８に対する耐性を与える、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔII）遺伝子；例えば欧州特許第ＥＰ２５６２２３号で説明されるような、グルタチオン由来の除草剤に対する耐性を与える、ラット肝臓由来のグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ遺伝子；例えば国際特許公開第ＷＯ８７／０５３２７号で説明されるような、過剰発現に応じてホスフィノトリシン等のグルタミンシンテターゼ阻害剤に対する耐性を付与する、グルタミンシンテターゼ遺伝子；例えば欧州特許第ＥＰ２７５９５７号で説明されるような、選択剤ホスフィノトリシンに対する耐性を与える、ストレプトマイセス・ヴィリドクロモゲネス由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子；例えばＨｉｎｃｈｅｅ他（１９８８）によって説明されているようなＮ－ホスホノメチルグリシンに対する耐性を与える、５－エノルシキメート－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子；例えば国際特許公開ＷＯ９１／０２０７１で説明されるような、ビアラホスに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子、ブロモキシニルに対する耐性を与える、クレブシーラオザエナエ由来のｂｘｎ等（Ｓｔａｌｋｅｒ et al.,１９８８）のニトリラーゼ遺伝子；メトトレキサートに対する耐性を与える、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ et al.,１９８８）；イミダゾリノン、スルホニル尿素、または他のＡＬＳ阻害化学薬品に対する耐性を与える、変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許第ＥＰ１５４，２０４号）；５－メチルトリプトファンに対する耐性を与える、変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤に対する耐性を与える、ダラポンデハロゲナーゼ遺伝子、が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましいスクリーニング可能なマーカーとしては、種々の発色基質が知られているβ－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードする、ｕｉｄＡ遺伝子；発色基質が知られている酵素をコードする、β－ガラクトシダーゼ遺伝子；カルシウム感受性生物発光検出において用いられ得る、エクオリン遺伝子（Ｐｒａｓｈｅｒ et al.,１９８５）；緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚ et al.,１９９５）もしくその誘導体；または、生物発光検出を可能にする、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗ et al.,１９８６）が挙げられるが、これらに限定されない。「リポーター分子」とは、その化学的性質によって、タンパク質産物を参照することによりプロモーター活性の決定を容易にする分析的に特定可能なシグナルを提供する分子を意味する。
好ましくは、組み換えベクターは、植物細胞等の細胞のゲノムの中に安定的に組み込まれる。故に、組み換えベクターは、ベクターをゲノムに組み込むこと、または細胞の染色体に組み込むことを可能にする、適切な要素を含んでもよい。
発現ベクター
本明細書で使用される「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換すること、および１個以上の特定のポリヌクレオチドの発現を生じさせることができる、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性とすることができ、典型的に、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、細菌、真菌、内寄生性生物、節足動物、動物、藻類、および植物細胞を含む、本発明の宿主細胞において機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）、あらゆるベクターが挙げられる。本発明の特に好ましい発現ベクターは、酵母、藻類、および／または植物細胞の遺伝子発現を指令することができる。
本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製の起源等の調節配列、および宿主細胞と適合性があり、かつ本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する他の調節配列を含む。特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写開始、伸長、および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびリプレッサー配列等の、転写開始を制御するものである。好適な転写制御配列としては、本発明の組み換え細胞の少なくとも１つにおいて機能することができる、あらゆる転写制御配列が挙げられる。使用する調節配列の選択は、関心の植物および／または標的器官もしくは組織等の標的生物に依存する。そのような調節配列は、植物もしくは植物ウイルス等の任意の真核生物から得てもよく、または化学的に合成してもよい。種々のそのような転写制御配列は、当業者に知られている。特に好ましい転写制御配列は、植物またはその一部の使用に応じて、構成的に、または段階特異的および／もしくは組織特異的に植物における転写を指令する際に活性なプロモーターである。
植物細胞の安定した形質移入またはトランスジェニック植物の確立に好適な数多くのベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５， ｓｕｐｐ．１９８７、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０で説明される。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下の１つ以上のクローン化した植物遺伝子、ならびに優性選択可能マーカーを含む。そのような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘発もしくは構成的、環境的もしくは発生的調節、または細胞もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルをも含むことができる。
植物細胞において活性である、多くの構成的プロモーターが説明されている。植物における構成的発現に好適なプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状ウイルスプロモーター、コメリナ黄色斑点ウイルスプロモーター、リブロース－１，５－ビス－リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット由来の光誘発性プロモーター、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、アラビドプシスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、ならびにクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、植物において発現されるＤＮＡベクターを作成するために使用されている（例えば、国際特許公開第ＷＯ８４／０２９１３号を参照されたい）。これらのプロモーターの全ては、種々の型の植物発現可能な組み換えＤＮＡベクターを作成するために使用されている。
植物の源組織（例えば、葉、種子、根または茎）における発現の目的で、本発明で利用されるプロモーターは、これらの特異的組織において比較的高い発現を有することが好ましい。この目的のために、組織もしくは細胞に特異的な発現、または組織もしくは細胞で増強された発現を伴う遺伝子に対する数多くのプロモーターから選択してもよい。文献で報告されているそのようなプロモーターの例としては、エンドウ由来のクロロプラストグルタミンシンテターゼＧＳ２プロモーター、コムギ由来のクロロプラストフルクトース－１，６－ビスホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ＳＴ－ＬＳ１プロモーター、セリン／トレオニンキナーゼプロモーター、およびアラビドプシス・サリアナ由来のグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが挙げられる。また、イースタンカラマツ（ラリクス・ラリキナ）由来のリブロース－１，５－ビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーター、マツ由来のＣａｂ遺伝子（Ｃａｂ６）に対するプロモーター、コムギ由来のＣａｂ－１遺伝子に対するプロモーター、ホウレンソウ由来のＣａｂ－１遺伝子に対するプロモーター、イネ由来のＣａｂ１Ｒ遺伝子に対するプロモーター、ゼア・マイス由来のピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）プロモーター、タバコＬｈｃｂ１＊２遺伝子に対するプロモーター、アラビドプシス・サリアナＳｕｃ２スクロース－Ｈ３０共輸送体プロモーター、およびホウレンソウ由来のチラコイド膜タンパク質遺伝子（ＰｓａＤ、ＰｓａＦ、ＰｓａＥ、ＰＣ、ＦＮＲ、ＡｔｐＣ、ＡｔｐＤ、Ｃａｂ、ＲｂｃＳ）に対するプロモーターも、光合成活性組織において活性であることが報告されている。また、シロガラシ（シナピス・アルバ）由来のＬｈｃＢ遺伝子およびＰｓｂＰ遺伝子に対するプロモーター等の、クロロフィルα／β結合タンパク質に対する他のプロモーターを、本発明で利用してもよい。
植物細胞におけるＲＮＡ結合タンパク質遺伝子の発現には、（１）熱、（２）光（例えば、エンドウＲｂｃＳ－３Ａプロモーター、メイズＲｂｃＳプロモーター）、（３）ホルモン（アブシジン酸等）、（４）損傷（例えば、ＷｕｎＩ）、または（５）化学薬品（ジャスモン酸メチル、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（国際特許公開第ＷＯ９７／０６２６９号）によって調節されるプロモーターを含む、環境、ホルモン、化学、および／または発育シグナルに応答して調節される、種々の植物遺伝子プロモーターも使用することができ、または（６）器官特異的プロモーターを使用することも有益であり得る。
本明細書で使用される「植物貯蔵器官特異的プロモーター」という用語は、他の植物組織と比較したときに、植物の貯蔵器官における遺伝子転写を選好的に指令するプロモーターを指す。好ましくは、プロモーターは、貯蔵器官における関心の遺伝子の発現を指令するだけであり、ならびに／または葉等の植物の他の部分における関心の遺伝子の発現は、ノーザンブロット分析および／もしくはＲＴ－ＰＣＲによって検出できない。典型的に、プロモーターは、貯蔵器官の成長および発育中の、特に貯蔵器官における貯蔵化合物の合成および蓄積段階中の、遺伝子の発現を駆動する。そのようなプロモーターは、双子葉植物の種子における種皮、胚、もしくは子葉、または単子葉植物の種子の胚乳もしくはアリューロン層等の、植物貯蔵器官全体またはその一部だけにおいて遺伝子発現を駆動することができる。
ジャガイモ植物の塊茎、トマトの実、またはダイズ、カノーラ、綿、ゼア・マイス、コムギ、イネ、およびオオムギの種子等の植物のシンク組織における発現の目的で、本発明で利用されるプロモーターは、これらの特異的組織において比較的高い発現を有することが好ましい。塊茎特異的または塊茎で増強された発現を伴う遺伝子に対する多くのプロモーターが知られており、クラスＩパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子に対するプロモーター、大サブユニットおよび小サブユニットの双方、スクロースシンターゼプロモーター、２２ｋＤタンパク質複合体およびプロテイナーゼ阻害剤を含む大塊茎タンパク質に対するプロモーター、顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子（ＧＢＳＳ）に対するプロモーター、ならびに他のクラスＩおよびIIパタチンプロモーターが挙げられる。また、他のプロモーターを使用して、種子または果実等の特異的組織においてタンパク質を発現させることもできる。β－コングリシニンに対するプロモーター、またはナピン、ゼイン、リニン、およびファゼオリンプロモーター等の他の種子特異的プロモーターを使用することができる。根特異的プロモーターを使用してもよい。そのようなプロモーターの一例は、酸キチナーゼ遺伝子に対するプロモーターである。根組織における発現は、特定されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメインを利用することによって達成することも可能である。
特に好ましい実施形態において、プロモーターは、脂質生合成が行われる組織および器官における発現を指令する。そのようなプロモーターは、種子における脂質組成物を修飾するのに好適な時点で種子の発育時に作用してもよい。
１つの実施形態において、プロモーターは、植物貯蔵器官特異的プロモーターである。一実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、種子特異的プロモーターである。より好ましい実施形態において、プロモーターは、種子の胚における発現と比較して、または葉等の植物における他の器官と比較して、双子葉植物の子葉における、または単子葉植物の胚乳における発現を選好的に指令する。種子特異的発現のための好ましいプロモーターとしては、１）デサチュラーゼおよびエロンガーゼ等の、種子における脂質生合成および蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーター、２）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに３）種子における炭水化物生合成および蓄積に関与する酵素をコードする遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。好適である種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター（米国特許第ＵＳ５，６０８，１５２号）、ビキア・ファバＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ他，１９９１）、アラビドプシス・オレオシンプロモーター（国際特許公開第ＷＯ９８／４５４６１号）、ファセオルス・ウルガリスファゼオリンプロモーター（米国特許第ＵＳ５，５０４，２００号）、ブラッシカＢｃｅ４プロモーター（国際特許公開第ＷＯ９１／１３９８０号）、またはレグミンＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ他，１９９２）、およびトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネ等の単子葉植物において種子特異的発現を誘導するプロモーターである。好適である顕著なプロモーターは、オオムギｌｐｔ２もしくはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（国際特許公開第ＷＯ９５／１５３８９号および国際特許公開第ＷＯ９５／２３２３０号）または国際特許公開第ＷＯ９９／１６８９０号で説明されるプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、オート麦グルテリン遺伝子、モロコシカジリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子に由来するプロモーター）である。他のプロモーターとしては、Ｂｒｏｕｎ他（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａ他（２００４）、米国特許公開第ＵＳ２００７０１９２９０２号および米国特許公開第ＵＳ２００３０１５９１７３号で説明されるものが挙げられる。一実施形態において、種子特異的プロモーターは、子葉または胚乳等の種子の規定の部分において選好的に発現する。子葉特異的プロモーターの例としては、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ他，１９９６）、エンドウレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ他，２０００）、およびビーンフィトヘマグルトニンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ他，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。胚乳特異的プロモーターの例としては、メイズゼイン－１プロモーター（Ｃｈｉｋｗａｍｂａ他，２００３）、イネグルテリン－１プロモーター（Ｙａｎｇ他，２００３）、オオムギＤ－ホルデインプロモーター（Ｈｏｒｖａｔｈ他，２０００）、およびコムギＨＭＷグルテニンプロモーター（Ａｌｖａｒｅｚ他，２０００）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、種子特異的プロモーターは、胚において、および／または種子の発芽後に、発現しないか、または低レベルでしか発現しない。
別の実施形態において、植物貯蔵器官特異的プロモーターは、塊茎特異的プロモーターである。例としては、ジャガイモパタチンＢ３３、ＰＡＴ２１、およびＧＢＳＳプロモーター、ならびにサツマイモスポラミンプロモーター（概説について、Ｐｏｔｅｎｚａ他，２００４を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターは、塊茎の外層（表皮、樹皮）または胚と比較して、選好的に塊茎の髄中における発現を指令する。
別の実施形態において、植物貯蔵器官特性プロモーターは、果実特異的プロモーターである。例としては、トマトポリガラクツロナーゼ、Ｅ８およびＰｄｓプロモーター、ならびにリンゴＡＣＣオキシダーゼプロモーター（概要について、Ｐｏｔｅｎｚａ他，２００４を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、プロモーターは、果実の表皮または果実内の種子と比較して、果実の可食部、例えば果実の髄における発現を選好的に指令する。
１つの実施形態において、誘導可能なプロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｌｃ系である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ａｌｃシステムの代わりに用いることができる誘導可能な発現システムの例は、Padidam (2003)および、Corrado and Karali (2009)に記述されている。これらには、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）ベースの、テトラサイクリン誘導可能系（Gatz,1997）、テトラサイクリンリプレッサーベースの、テトラサイクリン非活性化可能系（Weinmann et al., 1994）、グルココルチコイド受容体ベース（Picard, 1994）、エストロゲン受容体ベースの、他のステロイド誘導可能系（Bruce et al., 2000）、グルココルチコイド受容体、テトラサイクリンリプレッサーベースのデュアル制御系（Bohner et al., 1999）、エクジソン受容体ベースの、殺虫剤誘導可能系（Martinez et al., 1999, Padidam et al., 2003, Unger et al, 2002, Riddiford et al., 2000, Dhadialla et al., 1998, Martinez and Jepson, 1999）、ＡｌｃＲベースの、エタノール誘導可能系（Felenbok, 1991）および、ＡＣＥＩベースの、銅誘導可能系（Mett et al., 1993）が含まれる。
他の実施形態において、誘導可能なプロモーターは、たとえば、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）ｌｎ２－１ または ｌｎ２－２プロモーター（Hershey and Stoner, 1991）のような毒性緩和剤で誘導可能なプロモーターがあり、毒性緩和剤で誘導可能なプロモーターは、トウモロコシＧＳＴ－２７プロモーター（Jepson et al., 1994）または、大豆ＧＨ２／４プロモーター（Ulmasov et al., 1995）がある。
毒性緩和剤は、除草性化合物の毒性効果に対する植物の耐性を増加させるために用いられる、構造的に様々な化学物質の群である。これらの化合物の例としては、以下が挙げられる；トウモロコシおよびモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）を、チオカルバメート除草剤から保護するナフタル酸無水物およびＮ，Ｎ－ジアリル－２，２－ジクロロアセトアミド（ＤＤＣＡ）；メトクロール（ｍｅｔｏｃｈｌｏｒ）からモロコシを保護する、シオメトリニル（ｃｙｏｍｅｔｒｉｎｉｌ）；メトリブジンから大豆を保護する、トリアペンテノール（ｔｒｉａｐｅｎｔｈｅｎｏｌ）；および、スルホニル尿素除草剤に対する数種の穀物栽培種の耐性を改善する、置換ベンゼンスルホンアミド。
他の実施形態において、誘導可能なプロモーターは、老化誘導可能なプロモーター（たとえば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来の、老化誘導プロモーターＳＡＧ（老化関連遺伝子）１２およびＳＡＧ１３（Gan, 1995; Gan and Amasino, 1995）および、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＬＳＣ５４（Buchanan-Wollaston,1994））がある。
生育組織での発現のために、葉特異的プロモーター（たとえば、リブロース重リン酸カルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）プロモーター等）を用いることができる。たとえば、トマトＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子は、葉および光成長実生(Meier et al., 1997)で発現される。Matsuoka et al. (1994)に記述される、葉身および葉鞘の葉肉細胞中で、ほぼ独占的に高レベルで発現されるリブロース重リン酸カルボキシラーゼプロモーターを用いることができる。他の葉特異的プロモーターは、光収穫（ｌｉｇｈｔ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター（Shiina et al., 1997を参照のこと）がある。Li et al. (1996)に記述される、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｍｙｂ関連遺伝子プロモーター（Ａｔｍｙｂ５）は葉特異的である。Ａｔｍｙｂ５プロモーターは、発達中の葉トリコーム、托葉、および若いロゼット（ｒｏｓｅｔｔｅ）および茎葉の縁上の外皮細胞および未成熟な種子で発現している。Busk et al. (1997)による、トウモロコシで同定された葉プロモーターもまた使用することができる。
いくつかの例において、たとえば、ＬＥＣ２またはＢＢＭが組換えで発現される場合、導入遺伝子は高レベルで発現されないことが望ましい場合がある。そのような状況で用いることができるプロモーターの例は、種子特異的発現パターンは保持しているが、発現レベルは減少している、不完全ナピン（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｎａｐｉｎ）Ａプロモーターがある（Tan et al., 2011）。
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種遺伝子配列を発現するように選択されるプロモーターから得ることができ、または生成すべき酵素のコード領域に対して異種であってもよく、および所望であれば、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるように特異的に修飾することができる。導入遺伝子の発現を最適化する概説については、Ｋｏｚｉｅｌ他（１９９６）を参照されたい。また、５’非翻訳領域は、植物ウイルスＲＮＡ（とりわけ、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、メイズ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、好適な真核細胞遺伝子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列から得ることもできる。本発明は、非翻訳領域がプロモーター配列を伴う５’非翻訳配列に由来する構築物に限定されない。リーダー配列はまた、無関係なプロモーターまたはコード配列に由来することもできる。本発明の状況において有用なリーダー配列は、メイズＨｓｐ７０リーダー（米国特許第ＵＳ５，３６２，８６５号および米国特許第ＵＳ５，８５９，３４７号）、およびＴＭＶオメガエレメントを含む。
転写の終結は、発現ベクターにおいて関心のポリヌクレオチドに動作可能に連結される３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組み換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物においてアデニレートヌクレオチドをＲＮＡの３’末端に付加させるように機能する、ポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞において発現される種々の遺伝子から得ることができる。一般に、この目的で、ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ小サブユニットルビスコ遺伝子由来の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子由来の３’非翻訳領域を使用することができる。また、アグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む、３’転写非翻訳領域も好適である。
組み換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内のポリヌクレオチドのコピー数、それらのポリヌクレオチドを転写する効率、結果として生じた転写物を翻訳する効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換ポリヌクレオチドの発現を改善するために使用することができる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有用な組み換え手法としては、ポリヌクレオチドの高コピー数プラスミドへの動作可能な連結、ポリヌクレオチド分子の１つ以上の宿主細胞染色体への組み込み、ベクター安定配列のプラスミドへの追加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、転写制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン－ダルガルノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に対応するポリヌクレオチドの修飾、および転写物を不安定にする配列の欠失が挙げられるが、これらに限定されない。
転移核酸
転移核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用することができ、１つ、好ましくは２つの境界配列と、関心のポリヌクレオチドとを含む。転移核酸は、選択可能なマーカーをコードしてもよく、またはコードしなくてもよい。好ましくは、転移核酸は、細菌においてバイナリーベクターの一部を形成し、バイナリーベクターは、細菌におけるベクターの複製を可能にするか、またはベクターを含む細菌細胞の選択もしくは維持を可能にする要素をさらに含む。真核細胞へ転移すると、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞をゲノムに組み込むことができる。
本明細書において使用される「染色体外転移核酸」という用語は、アグロバクテリウム種等の細菌から植物の葉細胞等の真核細胞に転移させることができる、核酸分子を指す。染色体外転移核酸は、転移させることができ、その後に、その境界内に含まれるヌクレオチド配列をレシピエント細胞のゲノムに組み込むことを伴う要素としてよく知られている、遺伝的要素である。この点で、転移核酸は、典型的に、２つの「境界」配列が側面に位置するが、いくつかの事例において、一方の末端の単一の境界を使用することができ、転移させた核酸の第２の末端が、転移過程でランダムに生成される。関心のポリヌクレオチドは、典型的に、転移核酸の左境界様配列と右境界様配列との間に位置する。転移核酸内に含まれるポリヌクレオチドは、その発現、すなわち、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を容易にする様々な異なるプロモーターおよびターミネーター調節要素に動作可能に連結されてもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス等のアグロバクテリウム種に由来する転移ＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）およびその人工の変異形／変異体は、おそらく、転移核酸の最高に特徴付けられている例である。別の例は、植物に由来するＴ－ＤＮＡ境界様配列を含む、Ｐ－ＤＮＡ（「植物ＤＮＡ」）である。
本明細書で使用される「Ｔ－ＤＮＡ」は、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴｉプラスミドのＴ－ＤＮＡを指すか、またはアグロバクテリウム・リゾゲネスＲｉプラスミドもしくはＴ－ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）として機能するその人工の変異形に由来するＴ－ＤＮＡを指す。Ｔ－ＤＮＡは、右境界配列および左境界配列の両方を含むＴ－ＤＮＡ全体を含み得るが、転移のためには、シスにおいて必要とされる最小の配列、すなわち、右境界配列およびＴ－ＤＮＡ境界配列を含むことだけしか必要としない。本発明のＴ－ＤＮＡは、（存在する場合）右境界配列および左境界配列の間のどこかで、部位特異的リコンビナーゼに対する標的部位が側面に並ぶ関心のポリヌクレオチドをそれらに挿入している。ｖｉｒ遺伝子等の、植物細胞の中にＴ－ＤＮＡを転移させるためにトランスにおいて必要とされる因子をコードする配列は、Ｔ－ＤＮＡの中に挿入さてもよく、またはＴ－ＤＮＡと同じレプリコン上に存在してもよく、または、好ましくは、アグロバクテリウム宿主の適合性レプリコン上のトランスに存在する。そのような「バイナリーベクター系」は、当技術分野でよく知られている。
本明細書において使用される「Ｐ－ＤＮＡ」は、植物ゲノムから単離された転移核酸またはその人工の変異形／変異体を指し、各末端または一方の末端だけにＴ－ＤＮＡ境界様配列を含む。境界様配列は、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム・リゾゲネス等のアグロバクテリウム種由来のＴ－ＤＮＡ境界配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％であるが、１００％未満の配列同一性を共有する。したがって、Ｐ－ＤＮＡは、Ｐ－ＤＮＡ内に含まれるヌクレオチド配列を、例えばアグロバクテリウムから別の細胞に転移させるために、Ｔ－ＤＮＡの代わりに使用することができる。Ｐ－ＤＮＡは、転移させる外因性ポリヌクレオチドの挿入前に、クローニングを容易にするために修飾してもよく、好ましくは、いかなるタンパク質もコードするべきでない。Ｐ－ＤＮＡは、少なくとも右境界配列を含み、好ましくは左境界配列も含むことを特徴とする。
本明細書で使用される転移核酸の「境界」配列は、植物もしくは細菌等の選択した生物から単離することができ、またはその人工の変異形／変異体とすることができる。境界配列は、それが連結するポリヌクレオチドの転移を促進し、かつ容易にし、また、レシピエント細胞ゲノムにおけるその組込みを容易にし得る。一実施形態において、境界配列は、長さが５～１００塩基対（ｂｐ）、長さが１０～８０ｂｐ、長さが１５～７５ｂｐ、長さが１５～６０ｂｐ、長さが１５～５０ｂｐ、長さが１５～４０ｂｐ、長さが１５～３０ｂｐ、長さが１６～３０ｂｐ、長さが２０～３０ｂｐ、長さが２１～３０ｂｐ、長さが２２～３０ｂｐ、長さが２３～３０ｂｐ、長さが２４～３０ｂｐ、長さが２５～３０ｂｐ、または長さが２６～３０ｂｐの間である。アグロバクテリウム種に由来するＴ－ＤＮＡに由来する境界配列は、当技術分野でよく知られており、Ｌａｃｒｏｉｘ他（２００８）、ＴｚｆｉｒａおよびＣｉｔｏｖｓｋｙ（２００６）、ならびにＧｌｅｖｉｎ（２００３）で説明されるものが挙げられる。
従来、遺伝子を植物細胞に転移させるためにアグロバクテリウム種だけが使用されてきたが、現在、アグロバクテリウム種と類似の方法で作用する、特定／開発された数多くの系が存在する。近年、いくつかの非アグロバクテリウム種が、遺伝子転移に適切になるように遺伝的に修飾されている（Ｃｈｕｎｇ他，２００６、Ｂｒｏｏｔｈａｅｒｔｓ他，２００５）。これらには、リゾビウム種ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティおよびメゾリゾビウム・ロティが挙げられる。細菌は、形質転換過程に必要とされる機構を伴う細菌、すなわち、アグロバクテリウムＴｉプラスミドおよび別々の小さいバイナリープラスミド上に存在するＴ－ＤＮＡセグメントによってコードされる一組の病原性遺伝子を提供することによって、遺伝子転移に対して適切なものとされる。このようにして操作される細菌は、異なる植物組織（葉片、カルス、および楕円形組織）、単子葉植物または双子葉植物、ならびに種々の異なる植物種（例えば、タバコ、イネ）を形質転換することが可能である。
細菌から真核生物宿主への真核生物発現プラスミドの直接転移は、最初に、哺乳類細胞およびプラスミド担持大腸菌のプロトプラストの融合によって、数十年前に達成された（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，１９８０）。それ以後、４つのグループ（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ他，１９９５、Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ他，１９９５、Ｐｏｗｅｌｌ他，１９９６、Ｄａｒｊｉ他，１９９７）によって独立して発見され、遺伝子を哺乳類細胞中に送達することが可能な細菌の数は、着実に増加している（Ｗｅｉｓｓ，２００３）。
シゲラ・フレクスネリの病原性プラスミド（ｐＷＲ１００）によって侵襲性とされた弱毒化Ｓ．フレクスネリ、サルモネラ・チフィムリウム、または大腸菌は、宿主細胞の侵襲、および代謝の減衰による細胞内死の後に、発現プラスミドを転移させることができることを示している。そのような組み換えシゲラまたはサルモネラの経鼻的または経口的のいずれかによる粘膜塗布は、発現プラスミドによってコードした抗原に対する免疫応答を誘発した。その間に、インビトロおよびインビボで発現プラスミドを哺乳類宿主細胞に転移させることができることを示した細菌のリストは、２倍を超え、Ｓ．チフィ、Ｓ．コレラスイス、リステリア・モノサイトゲネス、エルシニア・シュードツベルクローシス、およびＹ．エンテロコリチカについて文書化されている（Ｆｅｎｎｅｌｌｙ他，１９９９、Ｓｈｉａｕ他，２００１、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ他，１９９８、Ｈｅｎｓｅ他，２００１、Ａｌ－Ｍａｒｉｒｉ他，２００２）。
一般に、（Ｓ．フレクスネリまたはＬ．モノサイトゲネスのような）宿主細胞のサイトゾルに入り、この細胞区画内で溶解することができる全ての細菌は、ＤＮＡを転移させることができるはずであると考えられ得る。これは、ＤＮＡの転移を起こすために細菌を溶解させなければならないので、「頓挫性」または「自殺的」侵襲として知られている（Ｇｒｉｌｌｏｔ－Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ他，１９９９）。加えて、さらに多くの（Ｓ．チフィムリウムのような）食胞のままである細菌も溶解させることができ得る。したがって、侵襲的であるが、ファゴソーム回避ができないように操作した大腸菌の組み換え実験室株は、それらのプラスミドロードを、感染した哺乳類細胞の核に送達することができ得る（Ｇｒｉｌｌｏｔ－Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ他，１９９８）。さらに、近年、アグロバクテリウム・ツメファシエンスはまた、導入遺伝子を哺乳類細胞の中に導入することも示されている（Ｋｕｎｉｋ他，２００１）。
本明細書で使用される「形質移入」、「形質転換」という用語およびそれらの変形は、全般的に、同じ意味で使用される。「形質移入された」または「形質転換された」細胞は、関心のポリヌクレオチドを導入するように操作されていてもよく、またはそれに由来する子孫細胞であってもよい。
組み換え細胞
本発明はまた、本明細書で定義される１つ以上のポリヌクレオチドもしくはベクター、またはその組み合わせで形質転換される宿主細胞である、組み換え細胞、例えば、組み換え植物細胞も提供する。本明細書では、「組み換え細胞」という用語は、「トランスジェニック細胞」という用語と同じ意味で使用される。本発明の好適な細胞としては、例えば本明細書で説明されるポリペプチドまたは酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターで形質転換することができる、あらゆる細胞が挙げられる。細胞は、好ましくは、それによって、脂質を生成するために使用することができる細胞である。組み換え細胞は、培養物中の細胞、インビトロの細胞、または例えば植物等の生物中の細胞、または例えば種子もしくは葉等の器官中の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、植物中にあり、より好ましくは、植物の種子中にある。１つの実施形態においては、組換え細胞は、非ヒト細胞である。
ポリヌクレオチドが導入される宿主細胞は、非形質転換細胞か、または少なくとも１個の核酸で既に形質転換された細胞のいずれかとすることができる。そのような核酸は、脂質合成に関連していてもよく、または関連していなくてもよい。本発明の宿主細胞は、本明細書において定義されるポリペプチドを内因的に（すなわち、自然に）生成することができ得るか（その場合、それに由来する組み換え細胞は、ポリペプチドを生成する増強された能力を有する）、または本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後にだけ該タンパク質を生成することができ得る。一実施形態において、本発明の組み換え細胞は、非極性脂質を生成する増強された能力を有する。
本発明の宿主細胞は、本明細書で説明される少なくとも１つのタンパク質を生成することができるあらゆる細胞とすることができ、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生生物、節足動物、動物、藻類、および植物細胞が挙げられる。細胞は、原核生物であってもよく、または真核生物であってもよい。 好ましい宿主細胞は、酵母、藻類、および植物細胞である。好ましい実施形態において、植物細胞は、種子細胞であり、具体的には、種子の子葉または胚乳における細胞である。一実施形態において、細胞は、動物細胞である。動物細胞は、例えば、非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳類細胞、または魚類もしくは甲殻類等の水生動物、無脊椎動物、昆虫等の細胞等、あらゆる種類の動物のものであってもよい。節足動物細胞の非限定的な例としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、トリコプルシア・ニ細胞、およびドロソフィラＳ２細胞等の、昆虫細胞が挙げられる。本発明の宿主細胞として有用な細菌細胞の例は、シネココッカス種（シネコシスティス種としても知られる）、例えば、シネココッカス・エロンガタスである。本発明の宿主細胞として有用な藻細胞の例としては、例えば、クラミドモナス種（例えば、クラミドモナス・ラインハーディ）、ドナリエラ種、ヘマトコッカス種、クロレラ種、スラウストキトリウム種、シゾキトリウム種、およびボルボックス種が挙げられる。
ここで記載する核酸の発現のための宿主細胞は、広範囲の温度およびｐＨ値にわたる単炭水化物もしくは複合炭水化物、有機酸、およびアルコール、ならびに／または炭化水素を含む、種々の原料上で成長する微生物宿主を含んでもよい。好ましい微生物宿主は、非極性脂質の合成が自然にできる、油脂性生物である。
宿主細胞は、例えば、ヤロウィアリ・ポリティカまたは他の酵母等の、発酵過程に好適な生物であってもよい。
トランスジェニック植物
本発明はまた、本発明の外因性ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、本発明の細胞、本発明のベクター、またはこれらの組み合わせを含む植物も提供する。「植物」という用語は、全植物を指すが、「その一部」という用語は、植物器官（例えば、葉、茎、根、花、果実）、単一の細胞（例えば、花粉）、種子、胚、胚乳、胚盤、または種皮等の種子部、脈管組織等の植物組織、植物細胞、およびその子孫を指す。本明細書で使用される植物部は、植物細胞を含む。
本明細書で使用される「植物」という用語は、最も広い意味で使用される。草の種、観賞用もしくは装飾用植物、作物もしくは穀粒（例えば、油糧種子、メイズ、ダイズ）、飼料もしくは馬草、果実もしくは野菜植物、ハーブ植物、木本植物、観花植物、または樹木が挙げられるが、これらに限定されない。植物を任意の特定の構造に限定することを意味するものではない。また、単細胞植物（例えば、微細藻類）も指す。植物を参照しての「その一部」という用語は、植物細胞およびその子孫、大部分が群体に分化される複数の植物細胞（例えば、ボルボックス）、植物の成長の任意の段階で存在する構造体、または植物組織を指す。そのような構造としては、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子、種皮、胚が挙げられるが、これらに限定されない。「植物組織」という用語は、葉、茎、花、果実、木の実、根、種子に存在する、例えば、胚組織、胚乳、真皮組織（例えば、表皮、周皮）、脈管組織（例えば、木質部、篩部）、または基本組織（柔組織、厚角組織、および／または厚膜組織細胞を含む）、ならびに培養物中の細胞（例えば、単細胞、プロトプラスト、カルス、胚等）といった、分化したおよび分化していない植物の組織を含む。植物組織は、植物体、器官培養物、組織培養物、または細胞培養物中にあってもよい。
「トランスジェニック植物」、「遺伝的に修飾された植物」、またはそれらの変形は、同じ種、変種、または栽培品種の野生型植物では見出されない導入遺伝子を含む植物を指す。本発明の文脈において定義されるトランスジェニック植物としては、所望の植物またはその一部において本明細書で定義される少なくとも１つのポリペプチドを生成させるように組み換え技術を使用して遺伝的に修飾された植物およびそれらの子孫が挙げられる。トランスジェニック植物部は、対応する意味を有する。
本明細書において、「種子」および「穀粒」という用語は、同じ意味で使用される。「穀粒」は、成熟した穀粒、例えば、収穫した穀粒または依然として植物上にあるが収穫され得る状態にある穀粒を指すが、文脈に応じて、吸水または発芽後の穀粒を指すこともできる。成熟した穀粒は、一般的に、約１８％～２０％未満の含水率を有する。好ましい実施形態において、穀粒の含水率は、保存に安全であると一般的にみなされるレベルであり、好ましくは５％～１５％の間、６％～８％の間、８％～１０％の間、または１２％～１５％の間である。本明細書で使用される「発育中の種子」は、典型的に、受精または開花後の植物の生殖構造において見出される成熟前の種子を指すが、植物から単離された成熟期前のそのような種子も指すことができる。成熟種子は通常、約１８～２０％未満の含水率を有する。好ましい実施形態において、種子の含水率は、保存に安全であると一般的にみなされるレベルであり、好ましくは５％～１５％の間、６％～８％の間、８％～１０％の間、または１２％～１５％の間である。
本明細書で使用される「植物貯蔵器官」という用語は、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質の形態でエネルギーを貯蔵するように特殊化された、植物の一部を指す。植物貯蔵器官の実施例は、種子、果実、塊状根、および塊茎である。本発明の好ましい植物貯蔵器官は、種子である。
本明細書において使用される「表現型的に正常」という用語は、未修飾の植物またはその一部と比較したときに、成長し、繁殖する能力が大幅に低下していない、遺伝的に修飾された植物またはその一部、特に、本発明の種子、塊茎、または果実等の貯蔵器官を指す。一実施形態において、表現型的に正常な遺伝的に修飾された植物またはその一部は、植物貯蔵器官特異的プロモーターに動作可能に連結されるサイレンシングサプレッサーをコードする組み換えポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを含まない対応する植物またはその一部と基本的に同じである成長または繁殖する能力を有する。好ましくは、バイオマス、成長速度、発芽率、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、および／または生成された生存可能な種子の数は、同一の条件下で成長させたときに、該組み換えポリヌクレオチドが欠如している植物のバイオマス、成長速度、発芽率、貯蔵器官のサイズ、種子のサイズ、および／または生成された生存可能な種子の数の９０％を下回ることがない。この用語は、野生型植物と異なり得るが、例えば葉の芽のバレリーナ表現型等の、商業的目的のための植物の有用性をもたらさない植物の特徴を包含しない。
本発明の実践に際して提供されるか、または使用が企図される植物には、単子葉植物および双子葉植物の双方が含まれる。好ましい実施形態において、本発明の植物は、作物植物（例えば、穀類および豆類、メイズ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、ソルガム、キビ、カッサバ、オオムギ、またはエンドウ）または他のマメ類である。植物は、食用の根、塊茎、葉、茎、花、または果実の生成のために成長させられ得る。植物は、野菜または観賞植物であってもよい。本発明の植物は、以下であっても良い：Ａｃｒｏｃｏｍｉａ ａｃｕｌｅａｔａ （ｍａｃａｕｂａ ｐａｌｍ）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アラビドプシス・サリアナ）、Ａｒａｃｉｎｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ（ピーナッツ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｍｕｒｕｍｕｒｕ（ｍｕｒｕｍｕｒｕ）、Ａｓｔｒｏｃａｒｙｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ （ｔｕｃｕｍａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｇｅｒａｅｎｓｉｓ （Ｉｎｄａｉａ－ｒａｔｅｉｒｏ）、Ａｔｔａｌｅａ ｈｕｍｉｌｉｓ （Ａｍｅｒｉｃａｎ ｏｉｌ ｐａｌｍ）、Ａｔｔａｌｅａ ｏｌｅｉｆｅｒａ （ａｎｄａｉａ）、Ａｔｔａｌｅａ ｐｈａｌｅｒａｔａ （ｕｒｉｃｕｒｉ）、Ａｔｔａｌｅａ ｓｐｅｃｉｏｓａ （ｂａｂａｓｓｕ）、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オーツ）、Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ（サトウダイコン）、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．（たとえばＢｒａｓｓｉｃａ ｃａｒｉｎａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｏｂｒａｓｓｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ（カノーラ）、Ｃａｍｅｌｉｎａ ｓａｔｉｖａ （ｆａｌｓｅ ｆｌａｘ）、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ （大麻）、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ（ベニバナ、サフラワー）、Ｃａｒｙｏｃａｒ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ（ｐｅｑｕｉ）、Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ （ココナッツ）、Ｃｒａｍｂｅ ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ （Ａｂｙｓｓｉｎｉａｎ ｋａｌｅ）、Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ（メロン）、Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ （Ａｆｒｉｃａｎ ｐａｌｍ）、ダイズ （大豆）、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（綿）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｓｐ．たとえば、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ（ヒマワリ）、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ（大麦）、Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ （ｐｈｙｓｉｃ ｎｕｔ）、Ｊｏａｎｎｅｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ （ａｒａｒａ ｎｕｔ－ｔｒｅｅ）、Ｌｅｍｎａ ｓｐ．（ウキクサ）（たとえばＬｅｍｎａ ａｅｑｕｉｎｏｃｔｉａｌｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｄｉｓｐｅｒｍａ、Ｌｅｍｎａ ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｍｎａ ｇｉｂｂａ（ｓｗｏｌｌｅｎ ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、Ｌｅｍｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｏｒ、Ｌｅｍｎａ ｍｉｎｕｔａ、Ｌｅｍｎａ ｏｂｓｃｕｒａ、Ｌｅｍｎａ ｐａｕｃｉｃｏｓｔａｔａ、Ｌｅｍｎａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ、Ｌｅｍｎａ ｔｅｎｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｔｒｉｓｕｌｃａ、Ｌｅｍｎａ ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ、Ｌｅｍｎａ ｖａｌｄｉｖｉａｎａ、Ｌｅｍｎａ ｙｕｎｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｉｃａｎｉａ ｒｉｇｉｄａ（オイチシカ）、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ（亜麻）、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ （ルピナス）、Ｍａｕｒｉｔｉａ ｆｌｅｘｕｏｓａ（ｂｕｒｉｔｉ ｐａｌｍ）、Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎａ ｍａｒｉｐａ （ｉｎａｊａ ｐａｌｍ）、Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｐ．（たとえばＭｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｘ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ および Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｐ．（タバコ）（たとえば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ または Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｃａｂａ （ｂａｃａｂａ－ｄｏ－ａｚｅｉｔｅ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｂａｔａｕａ （ｐａｔａｕａ）、Ｏｅｎｏｃａｒｐｕｓ ｄｉｓｔｉｃｈｕｓ （ｂａｃａｂａ－ｄｅ－ｌｅｑｕｅ），Ｏｒｙｚａ ｓｐ．（イネ）（たとえば、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ および Ｏｒｙｚａ ｇｌａｂｅｒｒｉｍａ）、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ （スイッチグラス）、Ｐａｒａｑｕｅｉｂａ ｐａｒａｅｎｓｉｓ （ｍａｒｉ）、Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｎｃａｎａ （アボカド）、Ｐｏｎｇａｍｉａ ｐｉｎｎａｔａ （Ｉｎｄｉａｎ ｂｅｅｃｈ）、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ （ｃａｓｔｏｒ）、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐ．（サトウキビ）、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ （ゴマ）、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ （ジャガイモ）、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｓｐ．（たとえば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｏｒｕｍ （ｃｕｐｕａｓｓｕ）、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｔｒｉｔｈｒｉｎａｘ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ （Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｎｅｅｄｌｅ ｐａｌｍ）、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐ．（小麦）（たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）および、Ｚｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒａｌｅ）、サツマイモ（Ｌｏｐｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｅａ ｓｐｐ．）、パイナップル（Ａｎａｎａ ｃｏｍｏｓｕｓ）、ｃｉｔｒｉｓ ｔｒｅｅ （Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ．）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｅｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ ｓｐｐ．）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｒｇｒｉｆｏｌｉａ）およびアーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）。
他の好ましい植物としては、上述に加えて、たとえば、Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉ、Ｂｏｕｔｅｌｏｕａ ｃｕｒｔｉｐｅｎｄｕｌａ、Ｂ． ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｂｕｃｈｌｏｅ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ、Ｓｃｈｉｚａｃｈｙｒｉｕｍ ｓｃｏｐａｒｉｕｍ、Ｓｏｒｇｈａｓｔｒｕｍ ｎｕｔａｎｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ ｃｒｙｐｔａｎｄｒｕｓ等のＣ４草；Ｅｌｙｍｕｓ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、マメ科植物のＬｅｓｐｅｄｅｚａ ｃａｐｉｔａｔａおよび、Ｐｅｔａｌｏｓｔｅｍｕｍ ｖｉｌｌｏｓｕｍ、広葉草本のＡｓｔｅｒ ａｚｕｒｅｕｓ等のＣ３草；Ｑｕｅｒｃｕｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓおよび、Ｑ． ｍａｃｒｏｃａｒｐａ等の木質の植物が挙げられる。他の好ましい植物としては、Ｃ３草が挙げられる。
好ましい実施形態において、植物は、被子植物である。
一実施形態において、植物は、油糧種子植物、好ましくは油糧種子作物植物である。本明細書で使用される「油糧種子植物」とは、植物の種子からの脂質の商業的生成に使用される、植物種である。油糧種子植物は、たとえば、アブラナ（例えば、カノーラ）、メイズ、ヒマワリ、ベニバナ、ダイズ、モロコシ、アマ（アマニ）、またはサトウダイコンであってもよい。さらに、油糧種子植物は、他のブラッシカ、綿、ピーナッツ、ケシ、マスタード、トウゴマ、ゴマ、ベニバナ、または木の実を生成する植物であってもよい。植物は、その果実（例えば、オリーブ、アブラヤシ、またはココナッツ）において高レベルの脂質を生成し得る。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、エンダイブ、またはキャベツ、ブロッコリもしくはカリフラワーを含む野菜のブラッシカである。本発明は、タバコ、ククルビット、ニンジン、イチゴ、トマト、またはコショウに適用され得る。
好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、その子孫が所望の表現型を分離しないように導入されたどの遺伝子（導入遺伝子）に対してもホモ接合性である。トランスジェニック植物はまた、例えばハイブリッド種子から成長したＦ１子孫等に導入された導入遺伝子に対してヘテロ接合性、好ましくは導入遺伝子に対して一様にヘテロ接合性であってもよい。そのような植物は、当技術分野でよく知られているハイブリッド強勢等の利点を提供し得る。
適切な場合、トランスジェニック植物はまた、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＡＰ、もしくはリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ１、ＰＤＡＴ２、またはＰＤＡＴ３、例えば、Ｇｈｏｓａｌ他，２００７を参照されたい）、またはこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、非極性脂質の生成に関与する酵素をコードする、付加的な導入遺伝子を含んでもよい。本発明のトランスジェニック植物はまた、外因性ポリヌクレオチドからオレオシンを発現し得る。
植物の形質転換
トランスジェニック植物は、Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２００３）、およびＰ．Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ａｎｄ Ｈ．Ｋｌｅｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（２００４）で一般に説明されているもの等の、当技術分野で知られている手法を使用して生成することができる。
本明細書で使用される「安定的に形質転換する」、「安定的に形質転換された」という用語、およびそれらの変形は、ポリヌクレオチドが、それらの存在を積極的に選択することを必要とせずに、細胞分裂中に、子孫細胞に転移されるように、ポリヌクレオチドを細胞のゲノムに組み込むことを指す。安定した形質転換体またはその子孫は、染色体ＤＮＡに対するサザンブロットまたはゲノムＤＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の、当技術分野で知られているあらゆる手段によって選択することができる。
一過性発現のために、または植物細胞ゲノムにおけるＤＮＡの安定的な組み込みのために、植物組織全体もしくは植物器官の細胞、または組織培養物中の外植体にＤＮＡを導入することができるので、アグロバクテリウム媒介転移は、遺伝子を植物細胞の中に導入するための広く適用可能な系である。ＤＮＡを植物細胞の中に導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組み込みベクターの使用は、当技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第ＵＳ５１７７０１０号、米国特許第ＵＳ５１０４３１０号、米国特許第ＵＳ５００４８６３号、または米国特許第ＵＳ５１５９１３５号を参照されたい）。転移されるＤＮＡの領域は、境界配列によって定義され、介在ＤＮＡ（Ｔ－ＤＮＡ）は、通常、植物ゲノムの中に挿入される。さらに、Ｔ－ＤＮＡの組み込みは、比較的精密な過程であり、再配列をほとんどもたらさない。アグロバクテリウム媒介形質転換が効率的である植物品種では、遺伝子転移の容易かつ定義された性質のため、それが最適な方法である。好ましいアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌ならびにアグロバクテリウムにおける複製が可能であり、（Ｋｌｅｅ他が、Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ，Ｈｏｈｎ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７９－２０３（１９８５）で）説明しているように、好都合な操作を可能にする。
使用され得る加速法としては、例えば、マイクロプロジェクタイルボンバードメント等が挙げられる。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の１つの例は、マイクロプロジェクタイルボンバードメントである。この方法は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）によって概説されている。非生物学的粒子（マイクロプロジェクタイル）を核酸で被覆して、推進力によって細胞の中に送達してもよい。例となる粒子としては、タングステン、金、白金等から成るものが挙げられる。マイクロプロジェクタイルボンバードメントの特別の利点は、単子葉植物を再現的に形質転換する有効な手段であることに加えて、原形質体の単離も、アグロバクテリウム感染に対する感受性も必要としないことである。加速によってＤＮＡをゼア・マイス細胞に送達するための方法の例示的実施形態は、ＤＮＡで被覆した粒子を、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーン等のスクリーンを通して、懸濁液中で培養したトウモロコシ細胞で覆ったフィルタ表面上に推進するために使用することができる、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓα粒子送達系である。本発明とともに使用するのに適切な粒子送達システムは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なヘリウム加速ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ銃である。
ボンバードメントのために、懸濁液中の細胞は、フィルタ上で濃縮させてもよい。衝突される細胞を含むフィルタは、マイクロプロジェクタイルストッピングプレートの下側に適切な距離で位置付けられる。所望により、銃と衝突される細胞との間に１つ以上のスクリーンも配置される。
代替として、未成熟胚または他の標的細胞を固体培養培地上に配置してもよい。衝突される細胞は、マイクロプロジェクタイルストッピングプレートの下側に適切な距離で配置される。所望により、加速デバイスと衝突される細胞との間に１つ以上のスクリーンも配置される。本明細書で説明される手法の使用により、マーカー遺伝子を一過性に発現する細胞の最高１０００個以上の増殖巣が得られ得る。ボンバードメントの４８時間後に遺伝子産物を発現する増殖巣中の細胞数は、多くの場合１～１０個の範囲であり、平均１～３個の範囲である。
ボンバードメント形質転換では、最大数の安定した形質転換体を生ずるように、ボンバードメント前培養条件およびボンバードメントパラメータを最適化してもよい。この技術では、ボンバードメントに関する物理的パラメータおよび生物学的パラメータの双方が重要である。物理的因子は、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイルの沈殿物の操作に関与するもの、または、マクロプロジェクタイルもしくはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものである。生物学的因子としては、ボンバードメント前および直後の細胞の操作に関与する全てのステップ、ボンバードメントと関連する外傷の軽減を補助するための標的細胞の浸透圧調整、また、線形化ＤＮＡまたは無損傷超螺旋プラスミド等の形質転換ＤＮＡの性質が挙げられる。ボンバードメント前操作は、未成熟胚の効を奏する形質転換のために特に重要であると考えられる。
別の代替的実施形態では、プラスチドを安定的に形質転換させることができる。高等植物におけるプラスチド形質転換について開示されている方法としては、選択可能なマーカーを含むＤＮＡの粒子銃送達、および相同的組み換えを通してのプラスチドゲノムへのＤＮＡの標的化が挙げられる（米国特許第ＵＳ５，４５１，５１３号、米国特許第ＵＳ５，５４５，８１８号、米国特許第ＵＳ５，８７７，４０２号、米国特許第ＵＳ５，９３２，４７９号、および国際特許公開第ＷＯ９９／０５２６５号）。
故に、条件を十分に最適化するために、小規模な研究でボンバードメントパラメータの種々の側面を調整することが望ましくなり得ると考えられる。特に、間隙距離、飛行距離、組織距離、およびヘリウム圧力等の物理的パラメータの調整が特に望まれる場合がある。また、レシピエント細胞の生理学的状態に影響を及ぼし、したがって、形質転換および組み込みの効率に影響を及ぼし得る条件を修正することによって、外傷低減因子を最小にする場合もある。例えば、浸透圧状態、組織水和、および継代培養状態、またはレシピエント細胞の細胞周期を、最適な形質転換のために調整してもよい。他の日常的な調整の実行は、本開示に照らして当業者に知られるであろう。
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、およびこれらの処理の組み合せに基づいた方法を使用して達成することができる。異なる植物の種類に対するこれらの系の適用は、プロトプラストからその特定の植物株を再生する能力に依存する。プロトプラストから穀類を再生するための例示的な方法が説明されている（Ｆｕｊｉｍｕｒａ他，１９８５、Ｔｏｒｉｙａｍａ他，１９８６、Ａｂｄｕｌｌａｈ他，１９８６）。
細胞形質転換の他の方法を使用することもでき、そのような方法としては、花粉の中への直接のＤＮＡ転移によって、植物の生殖器官の中へのＤＮＡの直接注入によって、または未成熟胚の細胞の中へのＤＮＡの直接注入、その後の乾燥させた胚の再水和によって、植物の中にＤＮＡを導入することが挙げられるが、これらに限定されない。
単一植物プロトプラストの形質転換体からの、または種々の形質転換された外植体からの、植物の再生、発育、および栽培は、当技術分野でよく知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，（１９８８））。この再生および成長過程は、典型的に、形質転換細胞を選択するステップ、個別化した細胞を、発根した苗木段階を経て、通常の胚の発育段階を通して培養するステップを含む。トランスジェニック胚および種子が、同様に再生される。その後に、結果として生じたトランスジェニック発根芽を、土壌等の適切な植物成長培地に植え付ける。
外来の外因性遺伝子を含む植物の発育または再生は、当技術分野でよく知られている。好ましくは、再生植物を自家授粉させて、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供する。それ以外の場合、再生植物から得られた花粉を、農学的に重要な系列の種子から成長させた植物に交配する。逆に、これらの重要な系列の植物からの花粉を使用して、再生植物に授粉する。所望のポリヌクレオチドを含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者によく知られている方法を使用して栽培される。
主としてアグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用による、双子葉植物を形質転換するための方法、およびトランスジェニック植物を得るための方法が、綿（米国特許第ＵＳ５，００４，８６３号、米国特許第ＵＳ５，１５９，１３５号、米国特許第ＵＳ５，５１８，９０８号）、ダイズ（米国特許第ＵＳ５，５６９，８３４号、米国特許第ＵＳ５，４１６，０１１号）、ブラッシカ（米国特許第ＵＳ５，４６３，１７４号）、落花生（Ｃｈｅｎｇ他，１９９６）、およびエンドウ（Ｇｒａｎｔ他，１９９５）について公開されている。
外因性核酸の導入によって遺伝的変種を植物の中に導入するために、ならびにプロトプラストまたは未成熟植物胚から植物を再生するために、コムギおよびオオムギ等の穀物植物を形質転換するための方法が、当技術分野においてよく知られており、例えば、カナダ特許第ＣＡ２，０９２，５８８号、豪州特許第ＡＵ６１７８１／９４号、豪州特許第ＡＵ６６７９３９号、米国特許第ＵＳ６，１００，４４７号、国際特許公開第ＷＯ９７／０４８８１４号、米国特許第ＵＳ５，５８９，６１７号、米国特許第ＵＳ６，５４１，２５７号を参照されたく、また、他の方法は、国際特許公開第ＷＯ９９／１４３１４号に記載されている。好ましくは、トランスジェニックコムギまたはオオムギ植物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換手順によって生成される。所望のポリヌクレオチドを担持するベクターは、組織培養した植物もしくは外植体の再生可能なコムギ細胞、またはプロトプラスト等の適切な植物系の中に導入されてもよい。
再生可能なコムギ細胞は、好ましくは、未成熟胚の胚盤、成熟胚の胚盤、これらに由来するカルス、または分裂組織に由来する。
トランスジェニック細胞およびトランスジェニック植物における導入遺伝子の存在を確認するために、当業者に知られている方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を行うことができる。導入遺伝子の発現産物は、その産物の性質に依存して、種々の方法のいずれかで検出することができ、そのような方法としては、ウエスタンブロット法および酵素アッセイが挙げられる。タンパク質発現を定量するための、および異なる植物組織における複製を検出するための１つの特に有用な方法は、ＧＵＳ等のレポーター遺伝子を使用することである。トランスジェニック植物が得られると、それらを成長させて、所望の表現型を有する植物組織または一部が生成され得る。植物組織または植物部は、収穫してもよく、および／または種子を採集してもよい。この種子は、所望の特性を有する組織または一部を伴う付加的な植物を成長させるための源としての役割を果たし得る。好ましくは、生育植物部分は、非極性脂質の産生量が最大になった時点で採取される。１つの実施形態において、生育植物部分は、開花期の頃に採取される。
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を使用して形成されたトランスジェニック植物は、典型的には、１つの染色体上に単一の遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物は、付加遺伝子に対してヘミ接合性であると称することができる。付加遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加遺伝子（染色体対の各染色体上の同じ遺伝子座に１つの遺伝子）を含むトランスジェニック植物が、より好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、ヘミ接合性トランスジェニック植物を自家受精させ、生成した種子の一部を発芽させ、そして、結果として生じた植物を関心の遺伝子について分析することによって得ることができる。
２つの独立して隔離された外因性遺伝子または遺伝子座を含む２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて（掛け合わせて）、両組の遺伝子または遺伝子座を含む子孫を生成することができることも理解されたい。適切なＦ１子孫の自殖は、双方の外因性遺伝子または遺伝子座に対してホモ接合性である植物を生成することができる。栄養繁殖と同じように、親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との異系交配も企図される。異なる形質および作物に一般的に使用される他の増殖方法の説明は、ＦｅｈｒのＢｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．（１９８７）に見出すことができる。
ＴＩＬＬＩＮＧ法
一実施形態において、ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）は、内因性遺伝子、例えば、ＤＧＡＴ、ｓｎ－１－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１－アシル－グリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、アシルＣｏＡ：リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、またはその二つ以上の組み合わせをコードする遺伝子がノックアウトされる植物を生成するために使用することができる。
第１のステップでは、化学的変異原で種子（または花粉）を処理することによって新しい単一塩基対変化等の導入変異を、植物の集団において誘発させ、次いで、植物を変異が安定的に継承される世代まで成長させる。ＤＮＡを抽出し、種子を、集団の全てのメンバーから貯蔵して、経時的に繰り返して利用することができる供給源を作成する。
ＴＩＬＬＩＮＧアッセイのために、ＰＣＲプライマーは、関心の単一の遺伝子標的を特異的に増幅するように設計される。標的が遺伝子ファミリーのメンバーまたは倍数体ゲノムの一部である場合は、特異性が特に重要である。次に、色素標識したプライマーを使用して、複数の固体のプールしたＤＮＡから、ＰＣＲ産物を増幅することができる。これらのＰＣＲ産物は、ミスマッチ塩基対の形成を可能にするように、変性させ、再アニールする。ミスマッチまたはヘテロ２本鎖は、自然発生的な一塩基多型（ＳＮＰ）（すなわち、集団からのいくつかの植物が、同じ多型性を持つ可能性がある）、および誘発されたＳＮＰ（すなわち、ごく稀に、個々の植物が変異を示す可能性がある）の双方を表す。ヘテロ２本鎖の形成後、ミスマッチＤＮＡを認識して切断する、ＣｅｌＩ等のエンドヌクレアーゼの使用は、ＴＩＬＬＩＮＧ集団内で新しいＳＮＰを発見するための鍵である。
この手法を使用することで、何千もの植物をスクリーニングして、ゲノムの任意の遺伝子または特定の領域における単一塩基変化、ならびに小挿入もしくは欠失（１～３０ｂｐ）を伴うあらゆる個体を特定することができる。アッセイされるゲノム断片は、０．３～１．６ｋｂのサイズの範囲のいずれかになり得る。８重プーリング、１．４ｋｂの断片（ノイズのためＳＮＰの検出が問題を含む断片の末端を除く）、および１アッセイあたり９６レーンで、この組み合わせは、単一のアッセイあたり、ゲノムＤＮＡの最高１００万の塩基対をスクリーニングすることを可能にし、ＴＩＬＬＩＮＧを高スループットの手法にする。ＴＩＬＬＩＮＧは、ＳｌａｄｅおよびＫｎａｕｆ（２００５）、ならびにＨｅｎｉｋｏｆｆ他（２００４）でさらに説明されている。
変異の効率的な検出を可能にすること加えて、高スループットのＴＩＬＬＩＮＧ技術は、自然多型性の検出に理想的である。したがって、既知の配列に対してヘテロ２本鎖を形成することによって未知の相同的ＤＮＡを確認することは、多型性部位の数および位置を明らかにする。少なくともいくつかの反復数多型性を含む、ヌクレオチドの変化、ならびに小挿入および欠失の双方が特定される。これは、Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇと呼ばれている（Ｃｏｍａｉ他，２００４）。
各ＳＮＰは、２、３個のヌクレオチド内のそのおよその位置に記録される。したがって、各ハプロタイプを、その運動性に基づいて保管することができる。配列データは、ミスマッチ切断アッセイに使用される同じ増幅ＤＮＡのアリコートを使用して、比較的小さい漸増作業で入手することができる。単一の反応に対する左側または右側配列決定プライマーは、多型性に対するその近接度によって選択される。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウエアは、複数のアラインメントを行って、塩基変化を発見し、それぞれの場合において、ゲルバンドを確認する。
ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ法は、完全配列決定よりも安価に行うことができ、現在、この方法が大部分のＳＮＰ発見に使用されている。変異させた植物由来のＤＮＡのプールではなく、整列させた生態型ＤＮＡを含むプレートをスクリーニングすることができる。検出は、塩基対に近い分解能を伴うゲル上であり、背景パターンは、レーン全体にわたって均一であるので、サイズが同一であるバンドをマッチさせることができ、したがって、単一のステップでＳＮＰを発見して遺伝子型決定することができる。このように、ＳＮＰの最終的な配列決定は、簡単かつ効率的であるが、スクリーニングに使用される同じＰＣＲ産物のアリコートをＤＮＡ配列決定に供することができるという事実によって、さらに簡単かつ効率的になる。
外因性ＲＮＡレベルの増強および安定発現
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、細胞性ｍＲＮＡおよびウイルス性ｍＲＮＡの両方を分解の標的とすることができる、ヌクレオチド配列特異的な防御メカニズムである。ＰＴＧＳは、組換えポリヌクレオチド（複数含む）で一過性に形質転換させた、または安定的に形質転換させた植物または菌類で発生し、導入されたポリヌクレオチドに対する配列類似性を有するＲＮＡ分子の蓄積の減少をもたらす。「転写後」とは、少なくとも部分的に、しかし必ずしも完全である必要は無く、最初のＲＮＡ転写物の産生後、たとえば最初のＲＮＡ転写物のプロセッシングの間に、またはＲＮＡのスプライシングもしくは細胞質へのＲＮＡの輸送と同時に、またはＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質に関連した複合体により細胞質内での、作用機序を指す。
植物またはその一部の貯蔵器官におけるサイレンシングサプレッサーの発現を制限することによって、ＲＮＡ分子レベルを増加させることができ、および／または、ＲＮＡ分子レベルを多くの世代にわたって、もしくは異なる環境条件下において、安定化させることができる。本明細書で使用される「サイレンシングサプレッサー」は、特に最初に形質転換された植物からの世代の繰り返しを通じて、植物細胞における異なる導入遺伝子に由来する発現産物のレベルを増強する植物細胞において発現させることができる、いかなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドでもある。一実施形態において、サイレンシングサプレッサーは、ウイルスサイレンシングサプレッサーまたはその変異体である。数多くのウイルスサイレンシングサプレッサーが当技術分野で知られており、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ－Ｐｏ、およびＲＰＶ－Ｐ０が挙げられるが、これらに限定されない。好適なウイルスサイレンシングサプレッサーの例としては、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５７２４６号で説明されるものが挙げられる。サイレンシングサプレッサーは、本発明の植物またはその一部において安定的に発現し得る。
本明細書で使用される「安定的に発現される」またはその変形は、サイレンシングサプレッサーをコードする外因性ポリヌクレオチドが欠如している対応する植物と比較したときに、ＲＮＡ分子のレベルが、世代の繰り返しを通じて、例えば少なくとも３世代、少なくとも５世代、または少なくとも１０世代にわたって、子孫植物において基本的に同じであるか、またはより高いことを指す。しかしながら、この用語は、世代の繰り返しを通じて、前世代と比較したときに、ＲＮＡ分子のレベルの多少の低下、例えば１世代あたり１０％以上の低下があるという可能性を排除しない。
サプレッサーは、任意の源（たとえば、植物、ウイルス、哺乳類等）から選択することができる。サプレッサーは、たとえば、ｆｌｏｃｋ ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ Ｂ２、ｐｏｔｈｏｓ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ Ｐ１４、ｐｏｔｈｏｓ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ＡＣ２、Ａｆｒｉｃａｎ ｃａｓｓａｖａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＡＣ４、ｂｈｅｎｄｉ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ２、ｂｈｅｎｄｉ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ４、ｂｈｅｎｄｉ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ βＣ１、ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ｐ２２、ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ＣＰ、ｔｏｍａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ ＣＰｍ、 ｔｏｍａｔｏ ｇｏｌｄｅｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＡＬ２、ｔｏｍａｔｏ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｊａｖａ ｖｉｒｕｓ βＣ１、ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ Ｖ２、ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ－Ｃｈｉｎａ Ｃ２、ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｃｈｉｎａ ｖｉｒｕｓ Ｙ１０ ｉｓｏｌａｔｅ βＣ１、ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｉｓｒａｅｌｉ ｉｓｏｌａｔｅ Ｖ２、ｍｕｎｇｂｅａｎ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ－Ｖｉｇｎａ ＡＣ２、ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ＣＰ、ｔｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｐ３８、ｔｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ ＣＰ、ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｐ６、ｂｅｅｔ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ ｐ２１、ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ ｐ２０、ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ ｐ２３、ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ ＣＰ、ｃｏｗｐｅａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＳＣＰ、ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ ｐ２２、ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ２ｂ、ｔｏｍａｔｏ ａｓｐｅｒｍｙ ｖｉｒｕｓ ＨＣ－Ｐｒｏ、ｂｅｅｔ ｃｕｒｌｙ ｔｏｐ ｖｉｒｕｓ Ｌ２、ｓｏｉｌ ｂｏｒｎｅ ｗｈｅａｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ １９Ｋ、ｂａｒｌｅｙ ｓｔｒｉｐｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｇａｍｍａｂ、ｐｏａ ｓｅｍｉｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ Ｇａｍｍａｂ、ｐｅａｎｕｔ ｃｌｕｍｐ ｐｅｃｌｕｖｉｒｕｓ Ｐ１５、ｒｉｃｅ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ Ｐｎｓ１０、ｃｕｒｕｂｉｔ ａｐｈｉｄ ｂｏｒｎｅ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ Ｐ０、ｂｅｅｔ ｗｅｓｔｅｒｎ ｙｅｌｌｏｗｓ ｖｉｒｕｓ Ｐ０、ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｘ Ｐ２５、ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｖｅｉｎ ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ ｖｉｒｕｓ Ｐ１ｂ、ｐｌｕｍ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ＨＣ－Ｐｒｏ、ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＨＣ－Ｐｒｏ、ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ ＨＣ－Ｐｒｏ、ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ Ｐ１／ＨＣ－Ｐｒｏ、ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ Ｐ１／ＨＣ－Ｐｒｏ、ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｐ１、ｃｏｃｋｓｆｏｏｔ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ－Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ ｉｓｏｌａｔｅ Ｐ１、ｒｉｃｅ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ Ｐ１、ｒｉｃｅ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ－Ｎｉｇｅｒｉａｎ ｉｓｏｌａｔｅ Ｐ１、ｒｉｃｅ ｈｏｊａ ｂｌａｎｃａ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３、ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ ＮＳ３、ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ １２６Ｋ、ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｐ１２２、ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｐ１２２、ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ １２６、ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ １３０Ｋ、ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ １６Ｋ、ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ Ｐ１９、ｔｏｍａｔｏ ｓｐｏｔｔｅｄ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓ ＮＳｓ、ａｐｐｌｅ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｌｅａｆ ｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ Ｐ５０、ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａ ｐ１０、ＢＹＶ ｐ２１のｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｌｅａｆｒｏｌｌ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－２ホモログ、ならびにそれらの変異型／突然変異体であってもよい。上述のリストにより、サプレッサーを得ることができるウイルスおよび、各特定のウイルス由来のサプレッサーに対して指定されるタンパク質（Ｂ２、ｐ１４等）またはコード領域が提供されている。既知のサイレンシングサプレッサーを含む関連ウイルスゲノムの構造と比較して、ウイルスゲノム内の同じ位置でコードされるポリペプチドに対するウイルスゲノム配列を検証することにより、他の候補サイレンシングサプレッサーを得ても良く、これは当業者には十分に理解できることである。
サイレンシングサプレッサーは、その作用様式に基づいて、分類することができる。たとえば、平滑末端を有する、対応する二重鎖ＲＮＡ分子と比較して、オーバーハング型の５´末端を有する二重鎖ＲＮＡ分子に選択的に結合するＶ２等のサプレッサーは、遺伝子サイレンシング（ｄｓＲＮＡをコードする外因性ポリヌクレオチド）と組み合わせて使用する場合の、導入遺伝子発現の増強に特に有用である。たとえば、異なる長さのｄｓＲＮＡ分子と比較して、２１塩基対の長さのｄｓＲＮＡ分子に選択的に結合するｐ１９等の他のサプレッサーにより、ｄｓＲＮＡをコードする外因性ポリヌクレオチドの存在下での導入遺伝子発現もまた可能になるが、通常、たとえばＶ２よりも、程度は低い。これにより、特定の目的のための、ｄｓＲＮＡ、サイレンシングサプレッサーおよび過剰発現導入遺伝子の最適な組み合わせの選択が可能となる。そのような最適な組み合わせは、本発明の方法を用いて特定することができる。
１つの実施形態において、サイレンシングサプレッサーは、平滑末端を有する対応する二重鎖ＲＮＡ分子と比較して、オーバーハング型の５´末端を有する二重鎖ＲＮＡ分子に選択的に結合する。この文脈において、好ましくは、対応する二重鎖ＲＮＡ分子は、５´オーバーハング型末端を有する分子と同じヌクレオチド配列を有するが、オーバーハングしている５´末端は有していない。結合アッセイ（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ）は、当業者に公知の任意の方法により、日常的に行われている。
サプレッサーの複数のコピーが、使用されてもよい。異なるサプレッサーが、ともに（例えば、相前後して）使用されてもよい。
基本的に、植物貯蔵器官において発現することが望ましいいかなるＲＮＡ分子も、サイレンシングサプレッサーと共発現させることができる。ＲＮＡ分子は、農業形質、耐虫性、耐病性、除草剤耐性、不稔性、穀粒特性等に影響を与え得る。コードされたポリペプチドは、脂質、デンプン、炭水化物、栄養素等の代謝に関与し得、またはタンパク質、ペプチド、脂質、蝋、デンプン、糖、炭水化物、香料、臭気、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン、セルロース、糖タンパク質、糖脂質等の合成を担い得る。
特定の例において、植物は、Ｂｒａｓｓｉｃａｓ（ブラッシカ類）（例えば、アブラナもしくはヒマワリ、ベニバナ、アマ、綿、ダイズ、またはトウモロコシ）等の植物における脂質生成のための増加したレベルの酵素を生成した。
植物バイオマス
植物バイオマスの総脂質含量の増加は、エネルギー含量が大きくなることと同じであり、バイオ燃料の産生におけるその使用が、より経済的なものとなる。
植物バイオマスは、植物（たとえば、葉、根、種子および茎等）により産生される有機物質である。植物バイオマスは、有機物質（たとえば、炭水化物、脂質およびタンパク質等）と少量のミネラル（たとえば、ナトリウム、リン、カルシウムおよび鉄）の複合的な混合物である。植物バイオマスの主な構成成分は、炭水化物（およそ７５％、乾重量）およびリグニン（およそ２５％）であり、植物の種類によって変化しうる。炭水化物は主に、セルロースまたはヘミセルロース繊維であり、植物の構造に強度を与え、リグニンは、線維を共に維持する。一部の植物はまた、主に種子および根の中に、エネルギー源としてデンプン（他の炭水化物ポリマー）および脂質を貯蔵する（たとえば、トウモロコシ、大豆およびジャガイモ）。
植物バイオマスは多くの場合、その物理的形状および含水率の両方の結果として、エネルギー濃度は低い。このため、通常は何らかの前処理を行わなければ、貯蔵および輸送には不便で非効率であり、使用にも適さない。
より便利な形態へと転換するために利用可能な方法が多くあり、以下が含まれる：１）物理的前処理（たとえば、研削）または、２）熱による転換（たとえば、燃焼、ガス化、熱分解）または化学的な転換（たとえば、嫌気的消化、発酵、たい肥化、トランスエステル化）方法。このようにして、バイオマスは、バイオマス燃料として特徴付けられるものへと転換される。
燃焼
燃焼は、可燃性の物質を、空気または酸素の存在下で、熱の放出と共に燃やさせる方法である。基本的な方法は、酸化である。燃焼は、バイオマスをエネルギーに用いることができるようにする最も単純な方法であり、熱を提供するために用いられている。この熱は、それ自身、多くの方法で用いることができる：１）空間を加熱、２）セントラル暖房もしくは地域暖房またはプロセス加熱のために、水（または他の液体）を加熱、３）電力産生または原動力のためのスチーム発生。可燃性燃料物質がバイオマスの形態である場合、酸化は主に、セルロース、ヘミセルロース、リグニンおよび存在する他の分子中の炭素（Ｃ）および水素（Ｈ）による、二酸化炭素（ＣＯ２）および水（Ｈ２Ｏ）形成である。
ガス化
ガス化は、部分的な酸化方法であり、これにより、たとえば植物バイオマス等の炭素源を、一酸化炭素（ＣＯ）および水素（Ｈ２）そして二酸化炭素（ＣＯ２）、および、場合によっては、たとえばメタン（ＣＨ４）等の炭化水素分子へと分解する。もしガス化が比較的低い温度（たとえば、７００℃～１０００℃）で発生する場合、ガス産物は、高い温度でのガス化と比較して、比較的高レベルの炭化水素を有する。結果として、それは、電力産生のための内部燃焼エンジンの稼働のために、適切なガスの清浄化とともに、スチームタービンを介した熱産生または電力産生のために、燃焼して直接的に使用されうる。単純なボイラーのための燃焼チャンバは、ガス化装置に連結されて閉鎖されていても良く、または、発生炉ガスは、長鎖炭化水素（タール）が清浄化され、輸送され、保存および遠隔操作で燃焼されるものであってもよい。ガス化システムは、電力産生のための複合サイクルガスタービン（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｙｃｌｅ ｇａｓ ｔｕｒｂｉｎｅ）と、しっかりと結合されていてもよい（ＩＧＣＣ－石炭ガス化複合発電（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇａｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｙｃｌｅ））。高い温度（１２００℃～１６００℃）でのガス化により、ガス製品中の炭化水素が少なくなり、ＣＯおよびＨ２の比率が高くなる。これは、たとえばＦｉｓｃｈｅｒ－Ｔｒｏｐｓｃｈ（ＦＴ）合成等の技術を用いた長鎖炭化水素の合成に用いることが出来るので、合成ガス（合成ガスまたはバイオ合成ガス）として知られている。もしＣＯに対するＨ２の比率が、正しい（２：１）ものであれば、ＦＴ合成を用いて、合成ガスを、従来の化石ディーゼルおよびディーゼルエンジンとの互換性、適合性がある高品質の合成ディーゼルバイオ燃料へと転換することができる。
熱分解
本明細書において、「熱分解」という用語は、酸素の非存在下でゆっくりと加熱し、バイオマスからガス製品、油製品、および炭化製品を製造する方法を意味する。熱分解は、脂質ベース、特にトリグリセリドベースの物質の熱転換または熱－化学転換である。熱分解の製品には、ガス、液体および固体炭が含まれ、それぞれの比率は当該方法のパラメータに依存する。低い温度（約４００℃）では、より固形の炭が製造される傾向があり（ゆっくりとした熱分解）、一方で、いくらか高い温度（約５００℃）では、気化ガス居留時間が、およそ１秒かそれ以下まで下がり続けるとすれば、液体（バイオ油）の比率がより高い製品が製造される。この後、第二の反応が発生し、ガス産生量が増加する。早い（高い温度）の熱分解により製造されたバイオ油は、従来の燃料油よりもおよそ半分の発熱量を有する、暗褐色で、流動性の液体である。これは直接燃焼するか、共燃成するか、他の燃料にアップグレードするか、またはガス化することができる。
熱分解には、液体の直接的な熱分解、または熱分解と触媒的分解の組み合わせが関与する。約４００～５００℃の温度では、分解が発生し、短鎖炭化水素（たとえばアルカン類、アルケン類、アルカジエン類、芳香族類、オレフィン類およびカルボン酸類）ならびに一酸化炭素および二酸化炭素が産生される。
遷移金属触媒、分子ふるい型触媒、活性化アルミナおよび炭酸ナトリウムを含む、４つの触媒型を用いることができる（Maher et al., 2007）。米国特許４１０２９３８号に例がある。酸により活性化されたアルミナ（Ａｌ２Ｏ３）は、効果的な触媒である（米国特許５２３３１０９）。分子ふるい触媒は、サイズ選択性を示す多孔性で、結晶性の構造であり、あるサイズの分子のみを通すことができる。これらには、ＡｌＯ４およびＳｉＯ４を含む結晶性物質であるゼオライト触媒（たとえば、ＺＳＭ－５または、ＨＺＳＭ－５）ならびに他のシリカ－アルミナ触媒が含まれる。これらの触媒の活性および選択性は、酸性度、孔のサイズおよび孔の形状に依存し、通常は、３００～５００℃で作用する。遷移金属触媒は、たとえば米国特許４９９２６０５号に記載されている。炭酸ナトリウム触媒は、油の熱分解に用いられている（Dandik and Aksoy, 1998）。
トランスエステル化
本明細書において、「トランスエステル化」は、たとえばアルカリまたは酸触媒の存在下での、短鎖アルコール（たとえば、メタノールまたはエタノール）を用いた、脂質（主にはトリアシルグリセロール）の脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルへの、転換である。低コストおよび入手の容易さにより、メタノールがより一般的に用いられている。触媒は、同種触媒、異種触媒、または酵素触媒であっても良い。同種触媒には、硫酸鉄、次いでＫＯＨが挙げられる。異種触媒には、ＣａＯ、Ｋ３ＰＯ４およびＷＯ３／ＺｒＯ２が挙げられる。酵素触媒には、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａから産生されるＮｏｖｏｚｙｍｅ４３５が挙げられる。
嫌気的消化
嫌気的消化は、空気の非存在下で、細菌が有機物質に分解される過程であり、それによりメタンを含むバイオガスが産生される。この過程の生成物は、バイオガス（主にはメタン（ＣＨ４）および二酸化炭素（ＣＯ２））、たい肥に似た（しかし同一ではない）固形残渣（繊維または消化物）および、肥料として用いることができる液体の蒸留酒（ｌｉｑｕｉｄ ｌｉｑｕｏｒ）がある。メタンは、熱産生または電力産生のために燃焼させることができる。嫌気的消化方法の固形残渣は、土壌改良剤として用いることができ、あるいは、燃料として燃焼させることができ、またはガス化することができる。
嫌気的消化は通常、水性のスラリー中、生物学的材料で行われる。しかしながら、乾消化槽の数も増えている。中温性消化は２０℃～４０℃の間で発生し、完了に１か月または２か月を要し得る。好熱性消化は５０～６５℃で発生し、より速いが、細菌はより過敏である。
発酵
バイオアルコール産生のための従来的な発酵方法は、作物植物のデンプンおよび糖成分を使用する。第二世代のバイオアルコールは、これに先行し、ヘミセルロースおよびセルロースの、発酵性のサッカリドへの酸加水分解および／または酵素加水分解を伴い、利用可能なバイオマスをより高い比率で使用できるようにする。詳細は、「脂質産生のための発酵方法」の項目以下に提供される。
たい肥化
たい肥化は、微生物による有機物質の嫌気的分解である。通常、スラリーではなく比較的乾燥した材料で行われる。放出される可燃性バイオガスを採集する代わりに、あるいは採集することに加え、通常はヒートポンプを用いて、たい肥化法の発熱状態を利用、および産生された熱を使用することができる。
非極性脂質の生成
当技術分野で日常的に行われている手法を使用して、本発明の細胞、生物、またはその一部によって生成される非極性脂質を抽出、処理、精製、および分析することができる。そのような手法は、ＦｅｒｅｉｄｏｏｎＳｈａｈｉｄｉ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＦｏｏｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１）Ｄ１．１．１－Ｄ１．１．１１、およびＰｅｒｅｚ－Ｖｉｃｈ他（１９９８）等の出展の文献全体を通して記載および説明されている。
種子油の生成
典型的に、植物種子は、粗製種子油を生成するために調理、圧搾、および／または抽出され、次いで、脱ガムされ、精製され、消色され、そして、消臭される。一般に、種子を破砕するための手法は、当技術分野で知られている。例えば、油料種子は、水を噴霧することによって、例えば８．５％まで含水量を増加させることによって柔らかくし、そして、滑らかなローラーを使用して０．２３～０．２７ｍｍの間隙設定でフレーク状にすることができる。種子の種類によっては、破砕する前に水を加えなくてもよい。熱の適用は、酵素を不活性化し、さらなる細胞の破裂を促進し、脂質液滴を癒合させ、タンパク質粒子を塊にし、これらの全てが、抽出工程を容易にする。
１つの実施形態において、大部分の種子油は、スクリュー圧搾機を通過させることによって放出される。次いで、スクリュー圧搾機から排出されたケーキを、ヒートトレースカラムを使用して、例えばヘキサンで溶媒抽出される。代替として、圧搾動作によって生成した粗製種子油に、スロット付きワイヤ排液頂部を伴う沈殿槽を通過させて、圧搾動作中に種子油とともに現れる固形物を除去することができる。浄化した種子油は、プレートおよびフレームフィルタを通過させて、あらゆる残りの微細な固形粒子を除去することができる。所望であれば、抽出工程から回収した種子油を、浄化した種子油と組み合わせて、混合粗製種子油を生成することができる。
溶媒が粗製種子油から取り除かれると、圧搾されて抽出された部分が組み合わせられて、標準的な脂質処理手順（すなわち、脱ガム、苛性精製、消色、および脱臭）に供される。
１つの実施形態において、種子の油および／またはタンパク質含量は、Hom et al. (2007)に記述される、近赤外光反射分光法により分析される。
脱ガム
脱ガムは、油精製の早期ステップであり、その主な目的は、油からリン脂質（総抽出脂質のおよそ１～２％で存在しうる）の大部分を除去することである。典型的には、リン酸を含む約２％の水を７０～８０℃で原油に添加することにより、微量の金属および色素と共にリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性金属は主にリン脂質とトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしてもまた知られている。脱ガムは、濃縮したリン酸を粗種子油に添加して非水和性リン脂質を水和可能な形態に変換し、存在する少量の金属をキレート化することによって行うことができる。ガムは、遠心分離によって種子油から分離される。種子油は、十分な量の水酸化ナトリウム溶液を添加して全ての脂肪酸を滴定し、それにより形成された石鹸を除去することによって精製することができる。
アルカリ精製
アルカリ精製は、原油を処理するための精製工程の一つであり、中和ともまた呼称されることがある。通常、脱色の前、脱ガムの後に行われる。脱ガムの後、種子油は、全ての脂肪酸およびリン酸を滴定するために十分な量のアルカリ溶液が添加され、それにより形成される石鹸を除去することにより、処理することができる。適切なアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび水酸化アンモニウムが挙げられる。この方法は通常、室温で行われ、遊離脂肪酸分画を除去する。石鹸は、遠心または、石鹸に対する溶媒中への抽出により除去され、中和された油は水で洗浄される。もし必要であれば、油中の任意の過剰量のアルカリを、適切な酸（たとえば、塩酸または硫酸）で中和してもよい。
脱色
脱色は、脱色土の存在下（０．２～２．０％）、および酸素の非存在下で、窒素またはスチームで行うことにより、または真空中で行うことにより、１０～３０分、９０～１２０℃で油を加熱する精製工程の１つである。油処理のこのステップは、望ましくない色素（カロテノイド類、クロロフィル、ゴシポール等）の除去を目的としており、当該方法により、酸化産物微量金属、硫黄化合物および石鹸の痕跡もまた除去される。
脱臭
脱臭は、高温（２００～２６０℃）および低圧（０．１～１ｍｍＨｇ）での油および脂質の処理である。これは通常、約０．１ｍｌ／分／種子油１００ｍｌの比率で、スチームを種子油に導入することにより行われる。脱臭は、真空下で種子油を２６０℃に加熱し、種子油１００ｍＬあたり約０．１ｍＬ／分の速度で蒸気を種子油の中に緩やかに導入することによって行うことができる。約３０分スパージした後に、種子油を真空下で冷却させる。種子油は、典型的には、ガラス容器に移され、アルゴンでフラッシングされ、その後に、冷凍下で貯蔵される。種子油の量が限られている場合、種子油は、真空下で、例えばＰａｒｒ反応器中に置いて、脱臭にかかったとされる時間と同じ長さで２６０℃に加熱することができる。この処理は、種子油の色を改善し、大半の揮発性物質または任意の残留脂肪酸、モノアシルグリセロールおよび酸化産物を含む臭気化合物を除去する。
脱ろう
脱ろうは、油および脂質の、大気温度下での結晶化による、固体（ステアリン）および液体（オレイン）分画への分離のための、市販の油製品に時折用いられる工程である。元々は、固形分の無い製品を製造するために綿実油に適用されていた。典型的には、油の飽和脂肪酸含量を減少させるために用いられる。
脂質生成のための植物バイオマス
光合成に関与する植物の一部（例えば、より高度な植物の茎および葉、ならびに藻類等の水生植物）も、脂質を生成するために使用することができる。植物の種類とは関係なく、グリーンバイオマスから脂質を抽出するためのいくつかの方法がある。１つの方法は、物理的抽出であるが、これは、しばしば、溶媒抽出を使用しない。これは、いくつかの異なる種類の機械的抽出を使用した「従来の」方法である。搾油機で圧搾する抽出は一般的な種類であり、スクリュー圧搾機およびラム圧搾機による抽出方法も同様である。これらの方法を使用して抽出される脂質の量は、用いた植物材料および機械的工程によって大幅に変動する。機械的抽出は、典型的に、下記で説明される溶媒抽出よりも非効率的である。
溶媒抽出では、有機溶媒（例えば、ヘキサン）を、少なくとも遺伝的に修飾された植物のグリーンバイオマスと（好ましくは、グリーンバイオマスを乾燥させてすりつぶした後に）混合する。当然、グリーンバイオマス以外の、植物の他の部分（例えば、脂質含有種子）も同様に、すりつぶして混合することができる。溶媒は、バイオマス中の脂質等を溶解し、次いで、この溶液を、機械的作用によって（例えば、前述の圧搾工程で）、バイオマスから分離する。この分離ステップはまた、濾過によって（例えば、圧搾濾過機または類似したデバイスで）、または遠心分離等によって行うこともできる。次いで、有機溶媒を、非極性脂質から（例えば、蒸留によって）分離することができる。この第２の分離ステップは、植物からの非極性脂質を生じ、従来の蒸気再生を用いれば、再使用可能な溶媒を生ずることができる。
たとえば、もし本明細書に記述される生育組織が、脂質の抽出および／または処理のために直ちに使用されるのではなければ、採取後、脂質含量を減少させないよう、または脂質含量の任意の減少が、可能な限り最小限となるよう、管理することが好ましい（たとえば、Christie, 1993を参照のこと）。１つの実施形態において、生育組織は、たとえば、ドライアイスまたは液体窒素等を用いて、採取後ただちに凍結する。他の実施形態において、生育組織は、窒素雰囲気下、冷温（たとえば、－２０℃または－６０℃）で保存される。
脂質生成のための藻類
藻類は、陸生植物よりも、年に１０～１００倍も大きい質量を産生することができる。多産生生物であることに加え、藻類は、バイオ燃料へと転換することができる油およびデンプンを産生することもできる。
バイオ燃料生成にもっとも有用な具体的な藻類は、小さな、多くの場合は単細胞のタイプからなる、微細藻類として知られる。これらの藻類は、ほとんどどこででも繁殖することができる。１００，０００超の既知の珪藻（藻類のタイプ）の種、４０，０００の既知の緑色植物様藻類の種、および少数の他の藻類の種があり、藻類は、ほとんどどんな種類の水でも、どんな環境下でも急速に増殖する。具体的には、たとえば乾燥した、ほぼ不毛なアメリカの南西地域等の、水分が制限され、または低品質の水しかない限界地域においても、有用な藻類は、増殖することができる。これらの地域では、光合成のための太陽光はふんだんにある。要約すると、藻類は、バイオ燃料生成のための理想的な生物（効率的に増殖する、高品質の土地または水は不要、食物作物とは競合しない、食物作物と比較してごく少量の土地のみを必要とする、および、所望される形態でエネルギーを保存する）となりうる。
藻類は、油またはデンプンのいずれかの形態で、その細胞構造中にエネルギーを貯蔵する。貯蔵された油は、藻類の重量の６０％にもなりうる。油またはデンプンを高度に産生するある種が特定され、増殖条件が検証されている。抽出方法およびこれらの物質の燃料への転換方法もまた開発されている。
最も一般の油産生藻類は、通常、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、および金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）を含む、または本質的にこれらからなることができる。加えて、ハプト藻類として知られる第五の群を用いてもよい。群は、褐藻類および黄色藻類（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔｓ）を含む。具体的な非限定的な藻類の例としては、以下のクラスが含まれる：緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ、ハプト藻類（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、珪藻類（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）。油を産生することができる珪藻類には、以下の属が含まれる：Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａ、Ａｍｐｈｏｒａ、Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ、Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ、Ｃｙｍｂｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ、Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ、Ｎａｖｉｃｕｌａ、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍおよび、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ。具体的な、油を産生することができる緑藻類の非限定的な例としては、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ、Ｏｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓおよび、Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓが含まれる。１つの態様において、緑藻類はＣｈｌｏｒｅｌｌａまたはＤｕｎａｌｉｅｌｌａになりうる。具体的な、油を産生することができる青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）の非限定的な例には、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａおよび、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓが含まれる。具体的な、油を産生することができる金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）の例としては、Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａが含まれる。具体的な、ハプト藻類の例としては、Ｉｓｏｃｈｙｓｉｓおよび、Ｐｌｅｕｒｏｃｈｙｓｉｓが含まれる。
本発明に有用な具体的な藻類としては、たとえば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．（たとえば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓｐ．（たとえば、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ、Ｄ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌａ、Ｄ． ｂａｒｄａｗｉｌ、Ｄ． ｂｉｏｃｕｌａｔａ、Ｄ． ｌａｔｅｒａｌｉｓ、Ｄ． ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｄ． ｍｉｎｕｔａ、Ｄ． ｐａｒｖａ、Ｄ． ｐｅｉｒｃｅｉ、Ｄ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｄ． ｐｒｉｍｏｌｅｃｔａ、Ｄ． ｐｓｅｕｄｏｓａｌｉｎａ、Ｄ． ｑｕａｒｔｏｌｅｃｔａ． Ｄ． ｖｉｒｉｄｉｓ）、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．（たとえば、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａまたは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｖｏｌｖｏｘ ｓｐ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．、６０ｗｔ％を超える脂質を含むことができるＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｓｐ．、Ｐａｖｌｏｖａ ｓｐ．、Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐ、Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ ｓｐ．、Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐ．が含まれる。
さらに、本発明の油産生藻類は、各系統からの利点を最大化するために、２以上の系統の有効量の組み合わせを含むことができる。実際問題として、藻類の１００％純度の単一系統を得ること、または所望される藻類株の組み合わせを得ることは困難である。しかしながら、本明細書で考察される場合、油産生藻類は、意図的に導入された藻類の系統に及ぶことが意図される一方、外来系統は好ましくは最小限であり、所望される油産生藻類および藻類油の産生量に有害な影響を与えうる量を下回るよう維持される。所望されない藻類の系統は、様々な技法を用いて制御および／または排除することができる。たとえば、増殖環境の注意深い制御により、外来系統の導入を減少させることができる。あるいは、または他の技法に加えて、外来系統のみを特異的に標的とするよう選択的に選ばれたウイルスを、外来系統を減少および／または排除するのに有効な量で、増殖容器に導入することができる。適切なウイルスは、従来法を用いて容易に特定することができる。たとえば、外来藻類の飼料は、当該外来藻類を標的とするウイルスを少量含むことがよくある。このウイルスを単離し、より望ましい油産生藻類の間の外来藻類群を有効的に制御または排除する量を産生するまで増殖させることができる。
藻類養殖は、藻類（微細藻類を含む。また、植物プランクトン、微細植物、またはプランクトン藻類とも称され、一般的に海藻として知られる）の種の養殖を伴う水産養殖の１つの形態である。
商業的および産業的な藻類栽培は、食物成分、食物、および藻類燃料の生成を含む、数多くの用途を有する。
単一または混合した藻類培養物は、開口池（水路型池および湖等）または光バイオ反応器において培養することができる。
藻類は、マイクロスクリーンを使用して、遠心分離によって、凝集（例えば、キトサン、ミョウバン、および塩化鉄を使用したもの）によって、およびフロス浮選によって収穫することができる。二酸化炭素の供給を中断することで、藻類を自然に凝集させることができ、これは、「自己凝集」と呼ばれる。フロス浮選では、カルチベーターが水に通気して泡立たせ、次いで、頂部から藻類をすくい取る。超音波および他の収穫方法が、現在開発されている。
脂質は、機械的に破砕することによって藻類から分離され得る。藻類は、乾燥させたときに、その脂質含量を保持し、よって、搾油機で「圧搾する」ことができる。藻類の株が異なれば、それらの物理的性状も大幅に変動するので、特定の藻類の型について、様々な圧搾構成（スクリュー、搾油機、ピストン等）がより良好に機能する。
藻類から脂質等の細胞成分を放出させるために、浸透圧衝撃が使用されることもある。浸透圧衝撃は、浸透圧力を突然減少させるもので、溶液中の細胞を破裂させることができる。
超音波抽出は、抽出工程、特に、藻類から脂質を取り出すために用いられる酵素抽出工程を加速することができる。超音波は、キャビテーション気泡を溶媒材料中に作成するために使用される。これらの気泡が細胞壁の近くで崩壊すると、結果として生じる衝撃波および液体ジェットが細胞壁の破壊を生じさせ、細胞の内容物を溶媒中に放出させる。
藻類からの脂質の抽出には、しばしば、化学溶媒（例えば、ヘキサン、ベンゼン、石油エーテル）が使用される。ソックスレー抽出は、特殊ガラス器具中で有機溶媒を還流させて、洗浄の繰り返しまたはパーコレーションを通して、藻類から脂質を抽出するために使用することができる。
藻類から脂質を抽出するために、酵素抽出を使用してもよい。酵素抽出は、酵素を使用して、水を溶媒として作用させて細胞壁を分解する。酵素抽出は、超音波処理によって支援することができる。
超臨界のＣＯ２を溶媒として使用することもできる。この方法では、ＣＯ２を加圧下で液化し、超臨界になる（液体およびガスの双方の特性を有する）まで加熱することで、溶媒として作用することを可能にする。
脂質生成のための発酵工程
本明細書で使用される「発酵工程」という用語は、いかなる発酵工程、または発酵ステップをむいかなる工程をも指す。発酵工程としては、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール）、有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸）、ケトン（例えば、アセトン）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸）、ガス（例えば、Ｈ２およびＣＯ２）、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン）、酵素類、ビタミン類（例えば、リボフラビン、ベータカロテン）およびホルモン類を生成するために使用される発酵工程が挙げられるが、これらに限定されない。発酵工程はまた、消費アルコール業界（例えば、ビールおよびワイン）、酪農業界（例えば、発酵酪農製品）、革製品業界、およびタバコ業界で使用される発酵工程も含む。好ましい発酵工程としては、当技術分野でよく知られているようなアルコール発酵工程が挙げられる。好ましい発酵工程は、当技術分野でよく知られているような嫌気性発酵工程である。好適な発酵性細胞は、典型的に、発酵させることが可能である、すなわち、グルコースまたはマルトース等の糖を所望の発酵産物に直接的または間接的に変換することが可能である微生物である。
発酵性微生物の例としては、酵母等の真菌性生物、好ましくは、油脂性生物が挙げられる。本明細書で使用される「油脂性生物」は、その乾燥重量の少なくとも２５％がトリグリセリドとして蓄積するものである。本明細書で使用される「酵母」としては、サッカロミセス種、サッカロミセス・セレビジエ、サッカロミセス・カールベルゲンシス、カンジダ種、クルヴェロマイシス種、ピキア種、ハンゼヌラ種、トリコデルマ種、リポミセス・スターケイ、およびヤロウィア・リポリティカが挙げられる。好ましい酵母としては、ヤロウィア・リポリティカ、または他の油脂性酵母、およびサッカロミセス種、特に、サッカロミセス・セレビジエの株が挙げられる。
１つの実施形態において、発酵性微生物は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物であり、ここで、当該トランスジェニック生物は、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生物と比較した場合、１以上の非極性脂質のレベルが増加している。トランスジェニック微生物は、好ましくは、脂肪酸生合成遺伝子および脂肪酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子の活性を最適化する条件下で成長させる。これは、脂質の最大で最も経済的な収量の生成をもたらす。概して、最適化され得る培地の条件としては、炭素源の種類および量、窒素源の種類および量、炭素対窒素の比率、酸素レベル、成長温度、ｐＨ、バイオマス生成段階の長さ、脂質蓄積段階の長さ、および細胞収穫時期が挙げられる。
発酵培地は、好適な炭素源を含まなければならない。好適な炭素源としては、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース）、二糖類（例えば、ラクトース、スクロース）、オリゴ糖、多糖類（例えば、デンプン、セルロース、またはこれらの混合物）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、または再生可能な原料（例えば、チーズホエー透過物、コーンスティープリーカー、サトウダイコンモラセス、オオムギモルト）由来の混合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。加えて、炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ならびに植物油（例えば、ダイズ油）および動物脂肪を含む脂肪酸の種々の商業的供給源が挙げられ得る。加えて、炭素基質としては、鍵となる生化学的中間体への代謝的変換が実証されている、１炭素基質（例えば、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、炭素含有アミン）が挙げられ得る。したがって、本発明で利用される炭素の供給源は、様々な炭素含有基質を包含し得、宿主微生物の選択によってだけ限定されることが想定される。上述の炭素基質の全ておよびそれらの混合物は、本発明において好適であると考えられるが、好ましい炭素基質は、糖類および／または脂肪酸である。１０～２２個の炭素を含むグルコースまたは脂肪酸が最も好ましい。
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機源（例えば、尿素、グルタミン酸塩）から供給されてもよい。適切な炭素源および窒素源に加えて、発酵培地はまた、好適な無機質、塩、共同因子、緩衝剤、ビタミン類、および脂質の生成に必要な微生物の成長および酵素的経路の促進に好適な、当業者に知られている他の成分を含んでもよい。
発酵に好適なｐＨの範囲は、典型的に、約ｐＨ４．０～ｐＨ８．０であり、初期成長条件の範囲としては、ｐＨ５．５～ｐＨ７．０が好ましい。発酵は、好気性または嫌気性条件下で行われてもよいが、ここでは、微好気性条件が好ましい。
典型的に、代謝の状態は、脂肪の成長と合成／貯蔵との間で「バランスを取ら」なければならないので、油脂性微生物の細胞における高レベルの脂質の蓄積は、２段階工程を必要とする。したがって、最も好ましくは、２段階発酵工程が微生物における脂質の生成に必要である。この手法において、発酵の第１段階は、細胞塊の生成および蓄積専用であり、迅速な細胞成長および細胞分裂を特徴とする。発酵の第２段階では、高レベルの脂質の蓄積を促進するために、培養物中に窒素欠乏状態を確立することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞中のＡＭＰの有効濃度を低減させることであり、それによって、ミトコンドリアのＮＡＤ依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼの活性が低減する。これが起こると、クエン酸が蓄積し、したがって、アセチルＣｏＡの大量のプールを細胞質中に形成し、脂肪酸の合成に備える。したがって、この段階は、細胞分裂の停止、それに続く、脂肪酸の合成およびＴＡＧの蓄積を特徴とする。
細胞は、典型的に、約３０℃で成長するが、いくつかの研究は、より低い温度での増加した不飽和脂肪酸の合成を示している。工程の経済的な側面に基づいて、この温度シフトは、大量の微生物の成長が起こったときに、２段階発酵の第１段階の後に起こる可能性が高い。
本核酸を使用した脂質の商業的生成が所望される場合に、種々の発酵工程設計が適用され得ることが想定される。例えば、組み換え微生物宿主由来の脂質の商業的生成は、バッチ、フェドバッチ、または連続発酵工程によって生成されてもよい。
バッチ発酵工程は、閉じた系であり、該系において、培地組成は、工程の開始時にセットされ、工程中のｐＨおよび酸素レベルの維持に必要なもの以外は、さらなる添加を受けない。したがって、培養工程の開始時に、所望の生物が培地に接種され、培地への付加的な基質（すなわち、炭素源および窒素源）の追加を伴わずに、成長活性または代謝活性が可能となる。バッチ工程において、系の代謝物質およびバイオマス組成物は、培養が終了するまで常に変化する。典型的なバッチ工程において、細胞は、静止遅滞期から高成長対数期までを通して、そして最終的に静止期まで加減し、成長速度は、低下または停止される。静止段階において、未処理のままの細胞は、最終的に死滅する。標準的なバッチ工程の変形例は、フェドバッチ工程であり、該工程では、発酵工程の間、基質が発酵槽に継続的に添加される。フェドバッチ工程も、本発明において好適である。フェドバッチ工程は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があるとき、またはどの時点においても培地中の基質の量を制限することが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系における基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶解した酸素、および廃ガス（例えば、ＣＯ２）の分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて推定され得る。バッチ培養法およびフェドバッチ培養法は、一般的であり、当技術分野でよく知られており、ＢｒｏｃｋのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，（１９８９）、またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ（１９９２）で見出され得る。
ここで記載する細胞を使用した脂質の商業的生成はまた、発酵工程によっても達成され得、該発酵工程では、規定培地が生物反応器に連続的に添加されると同時に、産物回収のために等量の培地体積が同時に除去される。連続培養法は、一般に、細胞を、一定の細胞密度で成長の対数期に維持する。連続培養法または半連続培養法は、細胞成長または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの因子もしくは任意の数の因子の調節を可能にする。例えば、１つの手法は、炭素源を制限して、全ての他のパラメータが代謝を加減することを可能にする。他の系では、成長に影響を及ぼすいくつかの因子が連続的に変化させ得る一方で、培地濁度で測定される細胞濃度は、一定に保たれる。連続系は、恒常的成長を維持することを目指し、したがって、細胞成長速度は、培養物から取り除かれている媒体による細胞の損失に対してバランスを取らなければならない。連続培養工程の栄養および成長因子を調節する方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための手法は、産業微生物学の技術分野でよく知られており、前掲のＢｒｏｃｋによって種々の方法が詳述されている。
ＰＵＦＡを含む脂肪酸は、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、または糖脂質等のエステル化形態で、宿主微生物中に見出され得、当技術分野でよく知られている種々の手段を通して宿主細胞から抽出され得る。
概して、ＰＵＦＡを含む脂肪酸を精製するための手段としては、有機溶媒による抽出、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を使用する）、鹸化および圧搾等の物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられ得る。特に関心があるのは、水の存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ，１９５９）。所望により、負に帯電した部分をプロトン化し、それによって、所望の産物の有機層中への分配を増加させるために、水層を酸性化することができる。抽出後、窒素流の下での蒸発によって有機溶媒を除去することができる。複合体の形態で単離したときに、遊離脂肪酸またはそれほど複雑でない関心の複合体を放出するように、産物を酵素的または化学的に切断してもよく、次いで、所望の最終産物を得るために更なる操作に供することができる。望ましくは、脂肪酸の複合体の形態は、水酸化カリウムで切断する。
さらなる精製が必要である場合は、標準的な方法を用いることができる。そのような方法としては、抽出、尿素での処理、分別結晶、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィ、高速遠心分離もしくは蒸留、またはこれらの手法の組合せが挙げられる。酸またはアルケニル基等の反応基の保護は、既知の技術（例えば、アルキル化またはヨウ素化）を通して、任意のステップで行なってもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に、保護基は、任意のステップで除去されてもよい。望ましくは、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡ含有する画分の精製は、尿素での処理および／または分別蒸留による処理によって達成されてもよい。
酵母を用いたバイオマススラリー産生のための植物バイオマスの使用例は、ＷＯ２０１１／１００２７２に記述されている。
脂質の用途
説明される方法によって生成される脂質は、種々の用途を有する。いくつかの実施形態において、脂質は、食物油として使用される。他の実施形態において、脂質は、精製されて、潤滑剤として、またはプラスチックの合成等の他の工業的用途に使用される。いくつかの好適な実施形態において、脂質は、バイオディーゼルを生成するために精製される。
バイオ燃料
本明細書において、「バイオ燃料」という用語には、バイオディーゼルおよびバイオアルコールが含まれる。バイオディーゼルは、植物、藻類および菌類から誘導された油から製造することができる。バイオアルコールは、糖の発酵から製造することができる。この糖は、植物（たとえば、サトウキビ）から直接抽出することができ、植物デンプン（たとえば、トウモロコシまたは小麦）から誘導することができ、またはセルロース（たとえば、木質、葉または茎）から生成することができる。
バイオ燃料は、現在のところ、石油燃料よりも産生によりコストがかかる。処理コストに加え、バイオ燃料作物には、植え付け、施肥、農薬および除草剤を撒き、収穫および輸送が必要となる。本発明の植物、藻類および菌類は、バイオ燃料の生産コストを減少しうる。
バイオ燃料製造の一般的な方法は、たとえば、Maher and Bressler, 2007；Greenwell et al., 2010；Karmakar et al., 2010；Alonso et al., 2010；Lee and Mohamed, 2010；Liu et al., 2010a；Gong and Jiang, 2011；Endalew et al., 2011；Semwal et al., 2011に見出すことができる。
バイオアルコール
生物学的に製造される、たとえば、エタノール、プロパノールおよびブタノール等のアルコールの製造は、公知である。エタノールは最も一般的なバイオアルコールである。
エタノールの大量生産の基本的なステップは、以下である：１）微生物（たとえば、酵母）の糖発酵、２）蒸留、３）脱水および任意選択的に、４）変性。発酵の前に、一部の作物は、炭水化物（たとえばセルロースおよびデンプン）の糖への糖化または加水分解が必要となる。セルロースの糖化は、セルロース分解（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｓｉｓ）と呼ばれている。酵素を用いて、デンプンを糖類へと転換することができる。
発酵
バイオアルコールは、糖類の微生物発酵により生成される。微生物発酵は、現在のところ、糖類とのみ直接的に機能する。２つの主な植物の構成成分であるデンプンとセルロースは共に、糖類から構成されており、原理上、発酵のために糖類に転換することができる。
蒸留
エタノールが燃料として使用可能となるためには、大部分の水を除去しなければならない。水の大部分は蒸留により除去されるが、低沸点の水－エタノール共沸混合物の形成のために、純度は９５～９６％に制限され、最大で（９５．６％ ｍ／ｍ（９６．５％ ｖ／ｖ）エタノールおよび、４．４％ ｍ／ｍ （３．５％ ｖ／ｖ）水）である。この混合物は、水和エタノールと呼ばれ、単独で燃料として用いることができるが、無水エタノールとは異なり、水和エタノールはガソリンと全ての比率で混ざり合うことは無く、そのため、ガソリンエンジンでガソリンと組み合わせて燃焼させるために、通常、さらなる処理で水分画を除去する。
脱水
水は、エタノール／水の共沸混合物から、脱水により除去することができる。多くの早期燃料エタノールプラントにおいて用いられている共沸混合物蒸留は、混合物にベンゼンまたはシクロヘキサンを添加することからなる。これらの化合物が混合物に添加されると、蒸気－液体－液体平衡の異種共沸混合物を形成し、それは蒸留されると、カラムの底に無水エタノール、および水とシクロヘキサン／ベンゼンの上記混合物を生成する。濃縮されると、これは二相性の液体混合物となる。抽出蒸留と呼ばれる他の早期方法は、エタノールの相対揮発度を上げる三元成分の添加からなる。三元混合物が蒸留されると、カラムのトップストリーム上に、無水エタノールを生成する。
第三の方法が開発され、最新のエタノールプラントのほとんどに採用されている。この新しい方法は、分子篩（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ）を用いて、燃料エタノールから水を除去する。この工程において、圧力下のエタノール蒸気は、分子篩ビーズのベッドを通過する。ビーズの孔は、エタノールを排除しながら、水を吸収するように大きさを設定されている。ある一定期間後、吸収された水を除去するベッドが真空下、または不活雰囲気（たとえば、Ｎ２）のフロー中で再生される。２つのベッドが多くの場合、他を再生させながら、水を吸収させるために利用可能であるように用いられる。
バイオディーゼル
バイオディーゼルまたはアルキルエステルの生成は、よく知られている。脂質からのエステル生成には、次の３つの基本的な経路がある。すなわち、１）アルコールによる、脂質の塩基触媒エステル交換、２）メタノールによる脂質の直接的な酸触媒エステル化、および３）脂質の脂肪酸への変換、その後の、酸触媒によるアルキルエステルへの変換、である。
脂肪酸アルキルエステルおよびグリセロールエーテル（グリセロール上の１、２、または３つのヒドロキシ基がエーテル化している）を調製する任意の方法を用いることができる。たとえば、脂肪酸は、トリグリセリドを酸性触媒で加水分解、または塩基性触媒でけん化することにより調製することができ、またはたとえばリパーゼやエステラーゼ糖の酵素を用いることで調製することができる。脂肪酸アルキルエステルは、酸性触媒の存在下でアルコールと脂肪酸を反応させることにより調製することができる。脂肪酸アルキルエステルはまた、酸性触媒または塩基性触媒の存在下で、トリグリセリドとアルコールを反応させることにより調製することができる。グリセロールエーテルは、たとえば、塩基性触媒の存在下で、グリセロールとアルキルハライドを反応させることにより、または酸性触媒の存在下で、グリセロールとオレフィンもしくはアルコールと反応させることにより調製することができる。
一部の好ましい実施形態において、脂質をトランスエステル化し、メチルエステルおよびグリセロールを生成する。一部の好ましい実施形態において、脂質を触媒（たとえば、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウム糖）の存在下で、アルコール（たとえば、メタノールまたはエタノール）と反応させ、アルキルエステルを生成する。アルキルエステルは、バイオディーゼルに、または石油ベースの燃料との混合に用いることができる。
アルキルエステルは、ディーゼル燃料と直接混合することができ、または混合の前に、水もしくは他の水性溶液と洗浄し、様々な混入物（触媒を含む）を除去することができる。酸性触媒を塩基で中和することが可能である。しかしながら、この工程により塩が産生される。エンジンの腐食を避けるために、燃料添加剤組成中の塩濃度は最小限とすることが好ましい。塩は、たとえば水で組成物を洗浄することにより、組成物から実質的に除去することができる。
他の実施形態において、組成物を、洗浄の後に、たとえば硫酸カルシウム等の乾燥剤に組成物を通すことにより、乾燥させる。
さらに他の実施形態において、中性燃料添加剤が、塩の産生無く、得られるか、またはたとえばＤｏｗｅｘ ５０（登録商標）（スルホン酸基を含む樹脂）等のポリマー酸を用いることによる洗浄ステップを用いて得ることができる。触媒は、エステル化の後で、ろ過により容易に除去され、エステル化反応は完了する。
バイオ燃料源としての植物トリアシルグリセロール
バイオ燃料生成のための植物トリアシルグリセロールの使用は、Durrett et al. (2008)に概要が記述されている。簡潔に述べると、植物油は主に、グリセロールにエステル化された三脂肪酸鎖（通常、１８または１６炭素長）からなる分子である、様々なトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）から構成される。脂肪酸鎖は、ガソリンおよびディーゼル中に見いだされる分子のほとんどを構成する脂肪族炭化水素と化学的に類似している。ガソリン中の炭化水素は、一分子あたり５～１２の炭素原子を含んでおり、この揮発性燃料は、空気と混合され、従来的なエンジン中で火花と共に発火する。対照的に、ディーゼル燃焼成分は、通常、一分子あたり１０～１５の炭素原子を有し、ディーゼルエンジン中で得られる非常に高い圧縮により発火する。しかしながら、ほとんどの植物ＴＡＧは、従来的なディーゼルよりも非常に高い粘度範囲を有しており、それぞれ、１．９～４．１ ｍｍ２ｓ－１と比較して、１７．３～３２．９ ｍｍ２ｓ－１である（ASTM D975; Knothe and Steidley, 2005）。この高い粘度により、最新型のディーゼルエンジン中ではわずかしか燃料が微粒化せず、それにより、たとえば炭素析出およびコーキング等の不完全燃焼から生じる問題が発生する（Ryan et al., 1984）。この問題を克服するために、ＴＡＧを、第１級アルコール（最も普遍的なのはメタノール）でエステル化することにより、より低い粘度の脂肪酸エステルへと転換する。得られる燃料は、一般に、バイオディーゼルと呼ばれ、１．９～６．０ ｍｍ２ｓ－１の粘度ダイナミックレンジを有している （ＡＳＴＭ Ｄ６７５１）。バイオディーゼル中に見いだされる脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）は、高い燃焼熱に反映されるように、高いエネルギー密度を有しており、従来的なディーゼルのそれと、大きくは無くとも、類似である（Knothe, 2005）。同様に、バイオディーゼル中に見いだされるＦＡＭＥのセタン数（ディーゼル発火性の測定値）は、従来的なディーゼルのそれを超える（Knothe, 2005）。
植物油は、ほとんどが、５つの一般の脂肪酸（すなわち、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３））から構成されるが、個々の種に依存して、長い脂肪酸または短い脂肪酸もまた、主な構成成分となりうる。これらの脂肪酸は、アシル鎖の長さおよび二重結合の数の点で互いに異なるため、それにより、物理特性も異なる。その結果、脂肪酸混合物から得られたバイオディーゼルの燃料特性は、その組成に依存することとなる。脂肪酸プロファイルが変わると、たとえば低温フロー特性、酸化安定性およびＮＯｘ排出等のバイオディーゼルの燃料特性が改善される。ＴＡＧの脂肪酸組成を変えることにより、植物油の粘度が減少され、化学的改変の必要が無くなり、そしてバイオ燃料のコストパフォーマンスが改善される可能性がある。
ほとんどの植物油は、種子中に保存されたトリアシルグリセロールから得られる。しかしながら、本発明は、生育組織中の油含有量をもまた増加させる方法を提供する。本発明の植物組織は、総脂質産生量が増加している。さらに、多価不飽和脂肪酸αリノレン酸は減少させながら、オレイン酸レベルを著しく増加させる。
葉が発達すると、受け取り側（栄養素を吸収）から、提供側（糖を供給）へと成長変化を経る。食物作物において、ほとんどの糖は、新しい葉、根、および果実の成長をサポートするために、源の葉から位置を変える。炭水化物の位置替えは、能動的な過程であり、位置替えの間に炭素とエネルギーの消失がある。さらに、成長の後には、種子が植物から炭素を取り込み、炭水化物を種子の油、タンパク質または他の主な構成成分へと転換させて、さらに炭素とエネルギーが消失される（Goffman et al., 2005）。本発明の植物は、地上部分の植物全体を採取およびバイオ燃料生成に用いられるように、葉および／または茎のエネルギー含量を、高めている。
バイオ燃料源としての藻類
藻類は、細胞体の内側、常にではないが時に小胞体中に油を貯蔵している。この油は、溶媒、加熱および／または圧力を含む、比較的単純ないくつかの方法で回収することができる。しかしながら、これらの方法は通常、貯蔵油の約８０％～９０％のみを回収する。貯蔵油を低いコストで、ほぼ１００％近くまで回収することができる、より有効的な油抽出法である工程が当分野には知られている。これらの工程には、脱重合（たとえば、生物学的に藻類細胞の壁および／またはもし存在すれば油小胞体を壊し、油産生藻類から油を放出させる）を含む、またはからなる。
さらに、藻類細胞に侵入し、破裂させる多くのウイルスが存在する。それにより、特定の貯蔵油またはデンプン中の細胞内容物を放出させることができる。そのようなウイルスは、藻類の生態系の不可欠な部分であり、多くのウイルスが、単一の藻類型に特異的である。そのようなウイルスの具体的な例としては、あるＣｈｌｏｒｅｌｌａ藻類に特異的なＣｈｌｏｒｅｌｌａウイルスＰＢＣＶ－１（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ Ｂｕｒｓａｒｉａ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａウイルス）、および青緑藻類Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓに特異的な、たとえばＳＭ－１、Ｐ－６０およびＡＳ－１等のシアノファージが挙げられる。選択される特定のウイルスは、増殖工程で用いられる藻類の特定の種に依存する。本発明の１つの態様において、藻類細胞壁の内側に含有される油を回収することができるように、藻類を破裂させるそのようなウイルスの使用が開示される。本発明の他の詳細な態様において、生物学的な剤の混合物を用いて、藻類細胞壁および／または油小胞体を破裂させることができる。
機械的破砕（たとえば、連続圧搾またはプレス）、ヘキサンもしくはブタン溶媒回収ステップ、超臨界流体抽出法等もまた、油産生藻類の油小胞体からの油の抽出に有用である。あるいは、反応率および／または物質分離を改善するために、生物学的な剤と組み合わせて、機械的アプローチを用いることができる。特定の生物学的剤（複数含む）の有無にかかわらず、そのような選択物を、油産生藻類中の油小胞体（すなわち、単にこれらの内の任意の単なる偶発的な存在ではない）から藻類油が放出される最初のメカニズムとして供されるのに十分な量で、導入することができる。
油が藻類から放出されると、藻類残渣物質（たとえば、細胞残渣、油、酵素、副産物等）のスラリーから１６を回収または分離することができる。これは、沈殿または遠心により行うことができ、通常、遠心のほうが早い。デンプン産生も同様な分離工程に倣うことができる。
藻類の餌料は、バイオマス源の餌料源、ならびに藻類源の餌料源から形成することができる。藻類または陸生のいずれかの源由来のバイオマスは、たとえば、限定されないが、糖化、加水分解等の様々な方法で脱ポリマー化することができる。源物質は、任意の多量のセルロース、リグノセルロース、多糖類もしくは炭水化物、糖タンパク質、または源物質の細胞壁を構成する他の物質でほとんど十分である。
発酵段階は、酵母での使用において、糖をアルコールへと発酵させるための伝統的なものである。発酵工程により、二酸化炭素、アルコール、および藻類の滓が産生される。これらの産物のすべてを、本発明の方法およびシステムのいずれかで用いて、未使用の物質または廃棄熱を実質的に無くすことができる。あるいは、エタノールがそのようにして産生される場合には、製品として販売、または、トランスエステル化工程のための酢酸エチル産生に用いることができる。同様の結果が、エタノール以外のアルコールにも適用されうる。
藻類油は、藻類油の直接的な水素化またはトランスエステル化を介して、バイオディーゼルへと転換することができる。藻類油は、ほとんどの植物油と類似した形態（トリグリセリドの形態）である。トリグリセリドは、３つの脂肪酸鎖からなり、１つはグリセロール主鎖の３つの各炭素原子に付着している。この油の形態は、直接、燃焼させることができる。しかしながら、この形態の油の特性は、ディーゼルエンジンでの使用に適したものではなく、改変を施さないと、エンジンはすぐに良好に作動しなくなるか、機能しなくなる。本発明によれば、トリグリセリドは、石油ディーゼル燃料に類似しているが、多くの点で石油ディーゼル燃料よりも優れているバイオディーゼルへと転換される。
トリグリセリドのバイオディーゼルへの転換の１つの工程は、トランスエステル化であり、トリグリセリドとアルコールまたは他のアシルアクセプターとを反応させ、遊離脂肪酸エステルおよびグリセロールを生成することを含む。遊離脂肪酸は、脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＡＥ）の形態である。
化学的工程と共に、触媒を分離し、脂肪酸を清浄化させるための追加のステップが必要となる。さらに、エタノールをアシルアクセプターとして使用する場合、当該工程における、けん化を介した石鹸の生成を防ぐために、乾燥させることがどうしても必要であり、グリセロールは精製されなければならない。比較すると、生物学的工程はあまり乾燥していない状態でのエタノールを受容可能であり、バイオディーゼルおよびグリセロールの清浄化および精製が、ずっと容易である。
多くの場合、トランスエステル化は単一のアルコール、典型的には石油から得たメタノールを使用する。メタノールを用いる場合、得られるバイオディーゼルは、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）と呼ばれ、今日販売されているほとんどのバイオディーゼルは、特に欧州においては、ＦＡＭＥである。しかしながら、エタノールもまた、トランスエステル化におけるアルコールとして用いることができ、その場合、バイオディーゼルは脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）である。米国においては、２つのタイプは通常、区別されておらず、まとめて脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＡＥ）として知られており、使用されるアシルアクセプターに関わらず、一般名称として適用させることができる。直接的な水素化もまた、藻類油の少なくとも１部をバイオディーゼルへと転換させるために用いることができる。したがって、１つの態様において、バイオディーゼル商品は、アルカンを含むことができる。
藻類トリグリセリドはまた、直接的な水素化によりバイオディーゼルへと転換することができる。この工程において、産物はアルカン鎖、プロパンおよび水である。グリセロール主鎖は、プロパンに水素化され、そして副産物として産生されるグリセロールは実質的に無い。さらに、アルコールまたはトランスエステル化触媒の必要がない。すべてのバイオマスを、油産生藻類のための餌として用いることができ、トランスエステル化のためのアルコールを産生するための発酵に必要とされるものはない。得られるアルカンは、純粋な炭化水素であり、酸素は無く、そして本方法で生成されるバイオディーゼルは、アルキルエステルよりもやや高いエネルギー含有量を有しており、よりゆっくりと分解し、水を引き込むことなく、そして他の望ましい化学特性を有する。
飼料
本発明は、飼料として使用することができる組成物を含む。本発明の目的について、「飼料」としては、体内に取り込んだときに、（１）組織に栄養分を与える、もしくは組織を作り上げる、またはエネルギーを供給する役目をする、および／または（２）十分な栄養状態もしくは代謝機能を維持する、回復させる、もしくは支援する、（経腸および／もしくは腸管外摂取を含む）ヒトまたは動物の摂取のためのあらゆる食品または調製物が挙げられる。本発明の飼料は、乳児および／または幼児のための栄養組成物を含む。
本発明の飼料は、例えば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部、本発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の産物、本発明の発酵工程の産物、または適切な担体を伴う組成物を含む。「担体」という用語は、栄養価を有してもよい、または有しなくてもよいあらゆる成分を包含するように、その最も広い意味で使用される。当業者が理解するように、担体は、飼料を摂取する生物に対して悪影響を有しないように、該飼料における使用に対して好適なものでなければならない（または十分に低い濃度で使用されなければならない）。
本発明の飼料は、本明細書で開示される方法、細胞、または生物を使用することによって直接的または間接的に生成される脂質を含む。組成物は、固体または液体形態のいずれかであってもよい。加えて、組成物は、特定の用途に所望される量の食用の多量栄養素、ビタミン、および／または鉱物を含んでもよい。これらの成分の量は、組成物が、正常な個体による使用を意図しているのか、または代謝障害等を罹患している個体等の特別な必要性を有する個体による使用を意図しているのかに応じて変動する。
栄養価を有する好適な担体の例としては、食用脂肪、炭水化物、およびタンパク質等の多量栄養素が挙げられるが、これらに限定されない。そのような食用脂肪の例としては、ヤシ油、ルリヂサ油、真菌油、ブラックカラント油、ダイズ油、ならびにモノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられるが、これらに限定されない。そのような炭水化物の例としては、グルコース、食用のラクトース、および加水分解されたデンプンが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明の栄養組成物において利用され得るタンパク質の例としては、ダイズタンパク質、電気透析されたホエー、電気透析された脱脂乳、ミルクホエー、またはこれらのタンパク質の加水分解物が挙げられるが、これらに限定されない。
ビタミンおよび鉱物に関して、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、塩化物、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレニウム、ヨウ素、ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、およびＢ複合体が、本発明の飼料組成物に添加されてもよい。また、他のそのようなビタミンおよび無機質が添加されてもよい。
本発明の飼料組成物において利用される成分は、半精製起源または精製起源のものとすることができる。半精製または精製とは、天然材料の精製によって、またはデノボ合成によって調製された材料を意味する。
本発明の飼料組成物はまた、食餌による補充が必要とされないときであっても、食物に添加されてもよい。例えば、組成物は、任意の種類の食物に添加されてもよく、該食物としては、マーガリン、改質バター、チーズ、乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック、サラダ油、料理油、料理脂肪、肉、魚、および飲料が挙げられるが、これらに限定されない。
サッカロミセス種は、ビールの醸造およびワイン製造の双方で使用され、特にパンを焼く際の薬剤としても使用される。酵母は、野菜抽出物の主成分である。酵母はまた、動物飼料における添加剤としても使用される。本明細書で説明されるように脂質を合成するように適合させた、遺伝的に修飾された酵母株を提供できることが明らかになるであろう。次いで、これらの酵母株を、食品に、ならびにワインおよびビールの製造において使用して、増強した脂肪酸含量を有する産物を提供することができる。
加えて、本発明に従って生成される脂肪酸、または対象遺伝子を含み発現するように形質転換された宿主細胞はまた、動物の組織または乳脂肪酸組成をヒトまたは動物の摂取に対してより望ましいものに変化させる、動物の食物サプリメントとしても使用され得る。そのような動物の例としては、ヒツジ、ウシ、ウマ等が挙げられる。
さらに、本発明の飼料は、水産養殖で使用して、ヒトまたは動物が摂取する魚における脂肪酸のレベルを増加させることができる。
本発明の好ましい飼料は、ヒトまたは他の動物の食物または餌として直接使用され得る、葉、果実、および茎等の植物、種子および他の植物部である。例えば、動物は、野外で成長したそのような植物を直接食べてもよく、または制御された給餌でより多くの計量した量を動物に給餌してもよい。本発明は、ヒトおよび他の動物における多価不飽和脂肪酸レベルを増加させるための餌としての、そのような植物および植物部の使用を含む。
組成物
本発明はまた、本発明の方法を使用して生成される１つ以上の脂質を含む、組成物、特に医薬組成物も包含する。
医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤、または乳剤（油中水型乳剤等）等の、標準的な、よく知られている、無毒の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、またはビヒクルと組み合わせた、脂質の１つ以上を含んでもよい。本組成物は、液体形態または固体形態のいずれかであってもよい。例えば、本組成物は、錠剤、カプセル、摂取可能な液体、粉末、局所用軟膏、またはクリームの形態であってもよい。適切な流動性は、例えば、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。また、等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましくなり得る。そのような不活性希釈剤の他に、本組成物は、湿潤剤等のアジュバント、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、および芳香剤を含むこともできる。
懸濁液は、活性化合物に加えて、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴム、またはこれらの物質の混合物等の懸濁化剤を含んでもよい。
錠剤およびカプセル等の固体剤形は、当技術分野でよく知られている手法を使用して調製することができる。例えば、本発明に従って生成される脂質は、結合剤（アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン等）、崩壊剤（ジャガイモデンプンまたはアルギン酸等）、および滑沢剤（ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム等）と組み合わせて、従来の錠剤基剤（ラクトース、スクロース、およびコーンスターチ等）とともに錠剤成形することができる。カプセル剤は、抗酸化剤および関連の脂質とともにこれらの賦形剤をゼラチンカプセルに組み込むことによって調製することができる。
静脈内投与のために、本発明に従って生成される脂質またはその誘導体を、商業的配合物に組み込むことができる。
特定の脂肪酸の典型的な投与量は、０．１ｍｇ～２０ｇで、１日あたり１回～５回（１日最高１００ｇ）服用され、好ましくは、１日あたり約１０ｍｇ～約１、２、５または１０ｇの範囲（１回または複数回投与で服用）である。当技術分野で知られているように、最低で約３００ｍｇ／日の脂肪酸（特に、多価不飽和脂肪酸）が望ましい。しかしながら、任意の量の脂肪酸が対象にとって有益であることが認識されるであろう。
本発明の医薬組成物の可能な投与経路としては、例えば、腸内および腸管外が挙げられる。例えば、液体調製物を経口的に投与してもよい。加えて、均質の混合物を水中に完全に分散させ、生理学的に許容される希釈剤、保存剤、緩衝剤、または噴射剤と無菌条件下で混合して、噴霧剤または吸入剤を形成することができる。
対象に投与される組成物の投与量は、当業者によって決定されてもよく、様々な因子、対象の体重、年齢、全体的な健康、既往歴、免疫状態等の種々の要因に依存する。
さらに、本発明の組成物は、化粧品の目的で利用されてもよい。この組成物は、混合物が形成されるように、先在の化粧品組成物に添加されてもよく、または本発明に従って生成される脂肪酸を、化粧品組成物中の唯一の「活性」成分として使用してもよい。
ポリペプチド
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、一般に、同じ意味で使用される。
ポリペプチドまたはポリペプチド類は、参照アミノ酸配列に対するそのアミノ酸配列の同一性の程度（同一性％）によって、または一方の参照アミノ酸配列が他方よりも大きい同一性％を有することによって定義され得る。参照アミノ酸配列に対するポリペプチドの同一性％は、典型的に、ギャップ作成ペナルティ＝５およびギャップ伸長ペナルティ＝０．３のパラメータで、ＧＡＰ分析（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０、ＧＣＧプログラム）によって決定される。問い合わせ配列は、長さが少なくとも１００個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整合させる。より好ましくは、問い合わせ配列は、長さが少なくとも２５０個のアミノ酸であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列を整合させる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析は、それらの全ての長さにわたって２つの配列を整合させる。ポリペプチドまたはポリペプチド類は、参照ポリペプチドと同じ酵素活性もしくは異なる活性を有してもよく、または参照ポリペプチドの活性が欠如していてもよい。好ましくは、ポリペプチドは、参照ポリペプチドの活性の少なくとも１０％の酵素活性を有する。
本明細書で使用される「生物活性断片」は、完全長参照ポリペプチドの定義された活性、例えばＭＧＡＴ活性を維持する、本発明のポリペプチドの一部分である。本明細書で使用される生物活性断片は、完全長ポリペプチドを除外する。生物活性断片は、定義された活性を維持する限り、あらゆるサイズの部分とすることができる。好ましくは、生物活性断片は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％を維持する。
定義されたポリペプチドまたは酵素に関して、本明細書で提供されるものよりも高い同一性％の値が、好ましい実施形態を包含することを理解されるであろう。したがって、該当する場合、最小の同一性％の値に照らして、ポリヌクレオチド／酵素は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましく少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％、関連する指定された配列番号と同一である、アミノ酸配列を含むことが好ましい。
本明細書で定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を本明細書で定義される核酸の中に導入することによって、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製することができる。そのような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、または置換を含む。最終ペプチド産物が所望の特性を保有するならば、欠失、挿入、および置換の組み合せを行って、最終的な構築物に到達させることができる。
変異（改変）ポリペプチドは、当技術分野で知られている手法、例えば、指向性進化または合理的な設計方策（下記参照のこと）を使用して調製することができる。変異／改変ＤＮＡ由来の産物は、本明細書で説明される手法を使用して容易にスクリーニングして、それらが脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性、例えばＭＧＡＴ、ＤＧＡＴ、ＧＰＡＴ／ホスファターゼ活性を保有するかどうかを判定することができる。
アミノ酸配列変異体を設計する際に、変異部位の場所および変異の性質は、修飾される特性に依存する。変異の部位は、例えば、（１）最初に選択した保存的アミノ酸と置換し、次いで達成する結果に応じてより異なる選択したアミノ酸と置換することによって、（２）標的残基を欠失させることによって、または（３）位置する部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個別にまたは連続的に修飾することができる。
アミノ酸配列欠失は、一般に、約１個～１５個の残基、より好ましくは約１～１０個の残基、および典型的に、約１～５個の連続した残基の範囲に及ぶ。
置換変異体は、除去されたポリペプチド分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基と、その場所に挿入された異なる残基とを有する。置換変異誘発について最も大きい関心の部位としては、活性部位として特定される部位が挙げられる。他の関心の部位は、種々の株または種から得られる特定の残基が同一である部位である。これらの位置は、生物活性にとって重要であり得る。これらの部位、とりわけ、少なくとも３つの他の同様に保存された部位の配列内に含まれる部位は、好ましくは、比較的に保存的な様式で置換される。そのような保存的置換を、「例示的置換」という見出しで表１に示す。
好ましい実施形態において、突然変異体／変異形ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドと比較したときに、１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つだけ、またはそれを超えない保存的アミノ酸変化を有する。保存的アミノ酸変化の詳細を表１で提供する。当業者が認識するように、そのようなわずかな変化は、組み換え細胞において発現したときに、ポリペプチドの活性を変化させないように合理的に予測され得る。
Figure 0007097805000001
指向性進化
指向性進化では、ランダムな変異誘発がタンパク質に適用され、所望の品質、例えば増加した脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性を有する変異形を選択するために、選択レジームが使用される。次いで、さらなる一連の変異および選択が適用される。典型的な指向性進化方策は、次の３つのステップを伴う。すなわち、
１）多様化：関心のタンパク質をコードする遺伝子は、ランダムに変異させて、および／または組み換えて、遺伝子変異形の大きいライブラリを作成する。変異形遺伝子ライブラリは、エラープローンＰＣＲ（例えば、Ｌｅｕｎｇ，１９８９、ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ，１９９２を参照されたい）を通して、親テンプレートから調整されるＤＮａｓｅＩ消化断片のプールから（Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ａ、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４ｂ、Ｃｒａｍｅｒｉ他，１９９８、Ｃｏｃｏ他，２００１）、縮重オリゴヌクレオチドから（Ｎｅｓｓ他，２００２、Ｃｏｃｏ，２００２）、もしくは双方の混合物から、さらには未消化の親テンプレートから（Ｚｈａｏ他，１９９８、Ｅｇｇｅｒｔ他，２００５、Ｊｅｚｅｑｕｅｋ他，２００８）構成することができ、通常は、ＰＣＲを通して組み立てられる。ライブラリはまた、相同的または非相同的組み換えによって、インビボまたはインビトロで再結合させた親配列から作製することもできる（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ他，１９９９、Ｖｏｌｋｏｖ他，１９９９、Ｓｉｅｂｅｒ他，２００１）。変異遺伝子ライブラリはまた、関心の遺伝子を好適なベクターにサブクローン化し、該ベクターを大腸菌ＸＬ－１ ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等の「ミューテーター」株に形質転換し、そして、該形質転換した細菌を好適な数の世代にわたって繁殖させることによって構成することもできる。変異遺伝子ライブラリはまた、Ｈａｒａｙａｍａ（１９９８）によって概略的に説明されるように、関心の遺伝子をＤＮＡシャフリングに供する（すなわち、インビトロで、ランダムな断片化および再組み立てによって、選択された変異遺伝子のプールを相同的に組み換える）ことによって構成することもできる。
２）選択：ライブラリは、スクリーニングまたは選択を使用して、所望の特性を有する変異体（変異形）の存在について試験される。スクリーニングは、手動による高機能性変異体の特定および単離を可能にする一方で、選択は、全ての機能しない変異体を自動的に排除する。スクリーニングは、既知の保存されたアミノ酸モチーフの存在に対するスクリーニングを伴ってもよい。代替として、または加えて、スクリーニングは、変異したポリヌクレオチドを宿主生物またはその一部において発現させることと、例えば生物またはその一部から抽出された脂質中の結果として生じた産物のレベルを定量化することによって、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性のレベルを分析することと、変異したポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較して、生物またはその一部から抽出した脂質中の産物のレベルを判定することと、随意に、親（変異していない）ポリヌクレオチドを発現させることとを伴ってもよい。代替として、スクリーニングは、標識基質を生物またはその一部に供給することと、変異したポリヌクレオチドが欠如している対応する生物またはその一部と比較して、生物またはその一部における基質または産物のレベルを判定することと、随意に、親（変異していない）ポリヌクレオチドを発現させることとを伴ってもよい。
３）増幅：選択またはスクリーニングで同定される変異形は、何度も複製され、どのような変異が起こったのかを研究者が理解するためにそれらのＤＮＡを配列決定することを可能にする。
合わせて、これらの３つのステップは、１「回」の指向性進化と称される。大部分の実験は、２回以上必要になる。これらの実験において、以前の回の「勝者」は、新しいライブラリを作成するために次の回において多様化される。実験終了後、全ての進化したタンパク質またはポリヌクレオチド変異体は、生化学的方法を使用して特徴付けられる。
合理的な設計
タンパク質は、タンパク質構造および折り畳みに関する既知の情報に基づいて、合理的に設計することができる。これは、ゼロからの設計（デノボ設計）によって、または天然の足場に基づく再設計（例えば、Ｈｅｌｌｉｎｇａ，１９９７、およびＬｕ ａｎｄ Ｂｅｒｒｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２，１１５３－１１５７（２００７）を参照されたい）によって達成することができる。タンパク質設計は、典型的に、所与または標的の構造に折り畳む配列を特定することを伴い、コンピュータモデルを使用して達成することができる。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、標的構造に折り畳んだときにエネルギーが低い配列について配列－配座空間を検索する。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、どのくらいの変異がタンパク質の構造および機能に影響を及ぼすのかを評価するために、タンパク質エネルギー学のモデルを使用する。これらのエネルギー関数は、典型的に、分子力学、統計学（すなわち知識に基づくもの）、および他の経験項を含む。好適な、入手可能なソフトウェアとしては、ＩＰＲＯ（Ｉｎｔｅｒａｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）、ＥＧＡＤ（ＡＧｅｎｅｔｉｃ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ）、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｓｈａｒｐｅｎ、およびＡｂａｌｏｎｅ．が挙げられる。
また、本発明の範囲内には、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質切断、抗体分子への結合、または他の細胞リガンド等によって、合成中または合成後に差次的に修飾される、本明細書で定義されるポリペプチドが含まれる。これらの修飾体は、本発明のポリペプチドの安定性および／または生物活性を増加させる役目をし得る。
脂肪酸アシルトランスフェラーゼの特定
一態様において、本発明は、細胞においてＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有する脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定するための方法を提供する。
本方法は、細胞において活性であるプロモーターに動作可能に連結される脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む細胞を得ることを含む。核酸分子は、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、および／もしくはＤＧＡＴ、またはその変異体等の自然発生的な脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードし得る。変異体は、関心の既知の遺伝子に対するランダムな変異誘発、標的変異誘発、もしくは飽和変異誘発による、または異なる遺伝子をＤＮＡシャフリングに供する等による、当技術分野において標準的な手順（上記を参照されたい）を使用して操作されてもよい。例えば、ＭＧＡＴをコードする配列番号１～４４のいずれか１つから選択される配列を含むポリヌクレオチドを、ランダムに変異させて、および／または組み換えて、例えばエラープローンＰＣＲおよび／またはＤＮＡシャフリングを使用して、遺伝子変異形（変異体）の大きいライブラリを作成してもよい。変異体は、それらが保存されたアミノ酸モチーフを含むことに基づいて、さらなる調査のために選択されてもよい。例えば、ＭＧＡＴをコードする候補核酸の場合、当業者は、（例えば、本明細書で説明されるような、植物細胞等の宿主細胞への形質移入、および脂肪酸アシルトランスフェラーゼ（すなわち、ＭＧＡＴ）に対するアッセイによって）核酸が機能的ＭＧＡＴ変異体をコードするかどうかを試験する前に、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、および／または、２２４で提供される配列を含むかどうかを判定してもよい。
核酸またはその断片の直接ＰＣＲ配列決定は、正確なヌクレオチド配列を決定し、対応するアミノ酸配列を推測し、それによって、保存されたアミノ酸配列を特定するために使用されてもよい。保存されたアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを、直接ＰＣＲ増幅に使用してもよい。縮重プライマーはまた、ＤＮＡハイブダイゼーションアッセイのプローブとして使用することもできる。代替として、保存されたアミノ酸配列は、タンパク質ハイブリダイゼーションアッセイで検出され得る。該アッセイは、例えば、保存されたアミノ酸配列に特異的に結合する抗体、または例えば、ＦＬＸＬＸＸＸＮ（推定中性脂質結合ドメイン、配列番号２２４）に結合する脂質等の、保存されたアミノ酸配列に特異的に結合する基質を利用する。
一実施形態において、核酸分子は、ＭＧＡＴをコードする、ヌクレオチドの配列を含む。ヌクレオチドの配列は、ｉ）配列番号１～４４のいずれか１つから選択される配列を含むか、ｉｉ）配列番号４５～８２のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードするか、ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と少なくとも５０％同一であるか、またはｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成してもよい。別のまたは付加的な実施形態において、核酸分子は、配列番号２２０、２２１、２２２、２２３、および２２４で提供される１つ以上の保存されたＤＧＡＴ２および／またはＭＧＡＴ１／２つのアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。好ましい実施形態において、核酸分子は、配列番号２２０および／または配列番号２２４で提供される保存されたアミノ酸配列をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。
別の実施形態において、核酸分子は、ＧＰＡＴ、好ましくは、ホスファターゼ活性を有するＧＰＡＴをコードする、ヌクレオチドの配列を含む。ヌクレオチドの配列は、ｉ）配列番号８４～１４１のいずれか１つから選択される配列を含むか、ｉｉ）配列番号１４４～２０１のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードするか、ｉｉｉ）ｉ）もしくはｉｉ）と少なくとも５０％同一であるか、またはｉｖ）緊縮条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成してもよい。別のまたは付加的な実施形態において、核酸分子は、配列番号２２５、２２６、および２２７で提供される１つ以上の保存されたＧＰＡＴアミノ酸配列をコードするヌクレオチドの配列、またはそれらと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％同一であるアミノ酸の配列を含む。
別の実施形態において、核酸分子は、ＤＧＡＴ２をコードする、ヌクレオチドの配列を含む。ヌクレオチドの配列は、ｉ）配列番号２０４～２１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチドの配列を含むか、ｉｉ）配列番号２１２～２１９のいずれか１つで提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチド、またはその生物活性断片をコードするか、ｉｉｉ）ｉ）もしくはｉｉ）と少なくとも５０％同一であるか、または、ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、ｉ）～ｉｉｉ）のいずれか１つにハイブリッド形成してもよい。好ましい実施形態において、ＤＧＡＴ２は、配列番号２０４のヌクレオチドの配列、および／または配列番号２１２で提供される配列を有するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む。
細胞において活性であるプロモーターに動作可能に連結される脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む細胞は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、およびこれらの処理の組み合せによって、核酸分子を細胞の中に導入すること等による当技術分野において標準的な手順を使用して得てもよい。細胞形質転換の他の方法を使用することもでき、直接的なＤＮＡ転移または注入によるＤＮＡの植物への導入が挙げられるが、これに限定されない。形質転換された植物細胞は、本明細書で説明されるアグロバクテリウム媒介転移および加速法を使用して得てもよい。
本方法は、実施例１で例示されるような当技術分野で知られている手法を使用して、細胞中で生成されたＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧのレベルが、核酸が欠如している対応する細胞と比較して増加したかどうかを判定することをさらに含む。例えば、脂質は、クロロホルム／メタノール溶液中で抽出し、乾燥し、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）によって分離することができる。ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＭＡＧ、遊離脂肪酸、および他の脂質がなにであるかは、ヨウ素蒸気で染色した後に、内部脂質標準で検証することができる。結果として生じたクロマトグラムは、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ、および既知の量の内部標準に基づいて定量化されたＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの量を使用して分析することができ、細胞は、ｓｎ－２－モノオレオイルグリセロール［１４Ｃ］または［１４Ｃ］グリセロール－３－リン酸が供給され、液体シンチレーション計数によって数量化される放射活性が関連付けられてもよい（すなわち標識したＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧの量が定量化される）。
本方法は、細胞のＭＡＧ、ＤＡＧ、および／またはＴＡＧを生成する増加した能力を有する脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定することをさらに含む。好ましい実施形態において、脂肪酸アシルトランスフェラーゼは、ＭＧＡＴ経路における酵素反応を触媒する。さらなる好ましい実施形態において、ＤＡＧは、ＭＧＡＴ経路を介して増加する（すなわち、脂肪アシルＣｏＡによるＭＡＧのアシル化は、ＭＧＡＴによって触媒されて、ＤＡＧを形成する）。別のまたは付加的な実施形態において、基質ＭＡＧは、ホスファターゼ活性も有するＧＰＡＴによって生成され、および／またはＤＡＧは、ＤＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴ活性を有するＭＧＡＴによって脂肪アシルＣｏＡでアシル化されて、ＴＡＧを形成する。
光沢
本発明のある特定の態様は、生育物質の光沢度を、物質中の脂質レベルに対するマーカーとして測定することに関連し、高レベルの光沢度は、高レベルの脂質と関連する。
生育物質の光沢は、公知の手順を用いて測定することができる。光沢計（反射率計）により、正確な照明、および状態の視察を定義することにより、測定の一貫性を確実にする、定量可能な光沢度の測定法が提供される。照明源および観察受信角度の両方の配置により、全体的な反射角度の小さな範囲にわたる、測定が可能となる。光沢系の測定結果は、規定の屈折指標を有する黒色光沢標準からの反射光の量に関連づけられる。光沢標準に対する比率と比較した、試料の入射光に対する反射率は、光沢単位として記録される。
光沢系の測定スケールである光沢単位（ＧＵ）は、特定の角度で１００ＧＵの正反射率を有する、規定の屈折指標を有する、高度に磨かれた黒色の光沢標準に基づいたスケーリングである。この標準を用いて、完全に光沢の無い表面上の、０で確立された下端ポイントと、１００の上端の較正ポイントを確立するために用いる。このスケーリングは、ほとんどの非金属物質に対して適している。
生育物質の最適光沢レベルまたは予測光沢レベルは、植物種間で変化する可能性がある。当業者であれば、本発明の異なる植物の生育物質の脂質含量を容易に分析することができ、および、特定の植物種から生育物質を採取する最も良い時点を分析するための、当該分野における標準として用いることができる適切な規定光沢レベルを特定することができる。
実施例１．一般的な材料および方法
一過性発現系での植物細胞における遺伝子の発現
遺伝子は、基本的に、Ｖｏｉｎｎｅｔ他（２００３）およびＷｏｏｄ他（２００９）によって説明されるような一過性発現系を使用して発現させた。複製したエンハンサー領域を含む強力な構成的ｅ３５Ｓプロモーターによって発現するコード領域を含むバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。ｐ１９ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現するためのキメラバイナリーベクター３５Ｓ：ｐ１９を、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５７２４６号で説明されるように、ＡＧＬ１に別々に導入した。Ｖ２ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現させるためのキメラバイナリーベクター３５Ｓ：Ｖ２を、ＡＧＬ１に別々に導入した。組み換え細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのリファンビシンを補充したＬＢブロスにおいて、２８℃で静止期まで成長させた。次いで、細菌を、５０００ｇで、室温における５分間の遠心分離によってペレット化し、その後に、１０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および１００μＭのアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液中に、ＯＤ６００＝１．０になるように再懸濁した。次いで、細胞を、２８℃で３時間振盪しながらインキュベートし、その後に、ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００＝０．１２５という最終濃度に到達させるために必要とされる量の、ウイルスサプレッサー構築物３５Ｓ：ｐ１９または３５Ｓ：Ｖ２を含む各培養物を新鮮な管に加えた。最終的な体積は、前述の緩衝剤で補った。次いで、培養物混合物を葉に浸潤させ、浸潤後さらに３～５日間植物を成長させ、その後、精製した細胞溶解物調製物または総脂質単離のために葉片を回収した。
精製した葉溶解物アッセイ
上で説明したように事前に浸潤させたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織を、ガラスホモジナイザを使用して、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）および０．３３Ｍのスクロースを含む溶液中ですりつぶした。葉ホモジェネートを、４℃、２０，０００ｇで４５分間遠心分離し、その後に、各上清を採集した。各上清中のタンパク含有量を、Ｗａｌｌａｃ１４２０マルチレベルカウンタおよびＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ色素試薬（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡＵＳＡ）を使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）に従って測定した。アシルトランスフェラーゼアッセイでは、いくつかの改変を伴って、Ｃａｏ他（２００７）に従って、１００μｇのタンパク質を使用した。反応培地は、１００ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（脂肪酸含まず）、２００ｍＭのスクロース、４０ｍＭの低温オレオイル－ＣｏＡ、１６．４μＭのｓｎ－２－モノオレオイルグリセロール［１４Ｃ］（５５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯＵＳＡ）、または６．０μＭの［１４Ｃ］グリセロール－３－リン酸（Ｇ－３－Ｐ）ジナトリウム塩（１５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含めた。アッセイは、７．５分、１５分、または３０分にわたって行った。
脂質分析
要約すると、種子または生育組織中の脂質を分析するために用いられた方法は、以下である。
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種子および任意の他の類似サイズの種子
（ｉ）脂肪酸組成－種子を破砕することなく、種子中の脂肪酸の直接的なメチル化
（ｉｉ）総脂肪酸またはＴＡＧ定量－１７：０ＴＡＧ標準の使用を伴い、種子を破砕することなく、種子中の脂肪酸の直接的なメチル化
カノーラ種子、カメリナ種子および任意の他の、より大きいサイズの種子：
（ｉ）単一種子脂肪酸組成－種皮を破壊した後の、種子中の脂肪酸の直接的なメチル化
（ｉｉ）プールされた種子－総抽出脂質の脂肪酸組成－ＣＨＣｌ３／ ＭｅＯＨ中での種子の破砕および抽出脂質のアリコートのメチル化
（ｉｉｉ）プールされた種子－総脂質含量（種子油含量）－種子破砕後の種子脂質の完全な回収のための、乾燥した既知量の種子からの、２度の脂質抽出（内部標準としての１７：０脂肪酸と共に、既知量の種子からの、脂質のメチル化を伴う）
（ｉｖ）プールされた種子－精製されたＴＡＧ定量－種子破砕後の種子脂質の完全な回収のための、乾燥した既知量の種子からの、２度の脂質抽出、ＴＬＣを用いた脂質由来のＴＡＧ分画化、および内部標準として１７：０ＴＡＧを用いた、ＴＡＧのｉｎ ｓｉｌｉｃａの直接的なメチル化。
葉試料
（ｉ）総脂質の脂肪酸組成－凍結乾燥試料中の脂肪酸の直接的なメチル化
（ｉｉ）総脂質定量－１７：０ ＦＦＡを伴う、凍結乾燥試料の既知重量中の脂肪酸の直接的なメチル化
（ｉｉｉ）ＴＡＧ定量－葉の中にはかなりの量の極性脂質が存在するため、ＴＡＧを、抽出総脂質からＴＬＣにより分画化させ、１７：０ＴＡＧ内部標準の存在下でメチル化した。ステップ：試料の凍結乾燥、計量、脂質抽出、既知量の総脂質からのＴＡＧ分画化、内部標準としての１７：０ＴＡＧと共に、ｉｎ ｓｉｌｉｃａのＴＡＧの直接的なメチル化。
当該方法を以下に詳述する。
アラビドプシス種子中の油含量の分析
種子油含量が、たとえばアラビドプシス種子等の小さな種子で計測される場合、種子は、デシケーター中で２４時間、乾燥させ、およそ４ｍｇの種子を、テフロン加工のねじ蓋を含む２ｍｌのガラスバイアルに移した。０．１ｍｌのトルエンに溶解した０．０５ｍｇのトリヘプタデカノイン（ｔｒｉｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｎ）を、内部標準としてバイアルに添加した。種子ＦＡＭＥは、０．７ｍｌの１ＮのメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を、種子物質を含むバイアルに添加することにより調製した。種子の破砕は、たとえばアラビドプシス種子糖の小さな種子には必要は無かった。混合物を短時間、ボルテックスし、２時間、８０℃でインキュベートした。室温にまで冷却した後、０．３ｍｌの０．９％ ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）および０．１ｍｌのヘキサンをバイアルに添加し、１０分間、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｖｉｂｒａｍａｘ １１０中で良く混合した。ＦＡＭＥを、０．３ｍｌのガラスインサート中へ回収し、上述のように、水素炎イオン化検出器で、ＧＣにより分析した。
個々のＦＡＭＥのピーク領域は、市販の標準ＧＬＣ－４１１（ＮＵ－ＣＨＥＫ ＰＲＥＰ，ＩＮＣ．， ＵＳＡ）中に存在する既知量の同じＦＡＭＥのピーク領域応答に基づき、最初に補正された。ＧＬＣ－４１１は、等量の、Ｃ８：０～Ｃ２２：６に及ぶ、３１の脂肪酸（重量％）を含有する。標準物中に存在しなかった脂肪酸の場合には、最も類似しているＦＡＭＥのピーク領域応答を取った。たとえば、１６：１ｄ９のＦＡＭＥのピーク領域応答は、１６：１ｄ７に対して用いられ、そして、Ｃ２２：６のＦＡＭＥ応答は、Ｃ２２：５に対して用いられた。補正された領域を用いて、内部標準質量との比較により、試料中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。油は、主にＴＡＧの形態で貯蔵され、その重量は、ＦＡＭＥ重量に基づいて算出された。グリセロールの総モルは、各ＦＡＭＥのモルを算出し、ＦＡＭＥの総モルを３で除すことにより決定された。ＴＡＧは、関連性：油重量％＝１００ｘ（（４１ｘ総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ｇＦＡＭＥ－（１５ｘ総モルＦＡＭＥ）））／種子ｇ（ここで、４１および１５は、それぞれ、グリセロール部分およびメチル基の分子量である）を用いて、グリセロールおよび脂肪アシル部分の総和として算出された。
抽出による、カメリナ（Ｃａｍｅｌｉｎａ）種子およびカノーラ（ｃａｎｏｌａ）種子中の油含量の分析
植物が十分に成長した時点での採取の後、カメリナまたはカノーラ種子を、乾燥剤としてシリカゲルを含むデシケーター中、室温で２４時間種子を保存することにより、乾燥させた。種子の含水量は、大体６～８％である。Ｒｅｉｃｈｔ組織ライザー（ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ）（２２頻度／秒、３分間）および金属球を用いて、エッペンドルフチューブ中、クロロホルムとメタノール（２／１ ｖ／ｖ）の混合物を用いて種子を破砕することにより、既知量の乾燥種子から、総脂質を抽出した。１体積の０．１Ｍ ＫＣｌを添加し、混合物を１０分間、振盪させた。３０００ｒｐｍ、５分間の混合物の遠心の後、非極性低層を回収した。残りの上層（水性）を、２体積のクロロホルムで、１０分間、混合することにより洗浄した。第二の非極性層をまた回収し、第一のものと共にプールした。窒素フロー下、抽出物中の脂質から溶媒を蒸発させ、総乾燥脂質を、既知量のクロロホルム中に溶解させた。
抽出物質中の脂質量を測定するために、既知量の１７：０－ＴＡＧを内部標準として添加し、既知量の種子由来の脂質を、１ＮのメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）中で、２時間、８０℃でインキュベートした。このように作成されたＦＡＭＥをヘキサン中で抽出し、ＧＣにより分析した。個々のＦＡＭＥを１７：０ ＴＡＧ－ＦＡＭＥの量に基づいて定量した。ＦＡＭＥからエステル化メチル基の重量を差し引いた後の個々のＦＡＭＥ重量を、個々のＦＡＭＥの分子量で除すことにより、モルへと転換した。すべてのＦＡＭＥの総モルは、ＴＡＧひいてはグリセロールのモルを算出するために、３で除した。次いで、ＴＡＧのモルを、ＴＡＧの重量へと転換した。最後に、種子重量ベースの油含量パーセンテージを、種子重量を用いて算出し、油含量の算出の目的のために、抽出された脂質のすべてが、ＴＡＧまたはＴＡＧに相当するものであると推測した。この方法は、Li et al., (2006)に基づいた。類似サイズのカメリナまたはカノーラ種子以外の種子をまた、この方法で分析することができる。
カノーラおよび他の種子の油含量は、核磁気共鳴法（Rossell and Pritchard, 1991）によっても測定することができ（たとえば、パルス波ＮＭＳ １００ Ｍｉｎｉｓｐｅｃ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｐｔｙ Ｌｔｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｇｅｒｍａｎｙ）による）、または、近赤外光反射スペクトル法（たとえば、ＮＩＲＳｙｓｔｅｍ Ｍｏｄｅｌ ５０００モノクロメーターを用いる）により、測定することができる。ＮＭＲ法は、含水量を同時に測定することができる。含水量はまた、約１００℃で１８時間、試料中の種子を乾燥させることにより、種子のバッチ由来の試料で測定することができる（Li et al., (2006)による）。
脂肪酸組成を、カノーラ種子中の油に対して決定する場合、アラビドプシス種子に対して用いられた直接メチル化法（上述）を、カノーラ種皮を割ることを加える改変を行い、用いることができる。この方法により、種子から十分な油を抽出させ、脂肪酸組成の分析を行うことができる。
葉溶解物アッセイからの脂質の分析
溶解物アッセイによる脂質を、クロロホルム：メタノール：０．１ＭのＫＣｌ（２：１：１）を使用して抽出して、回収した。試料中の異なる脂質クラスを、１０％のホウ酸を含浸させたＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ６０薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）プレート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄｅｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分離した。脂質抽出物からＴＡＧを分画するために使用した溶媒系は、クロロホルム／アセトン（９０／１０ ｖ／ｖ）で構成した。個々の脂質クラスを、プレートをヨウ素蒸気に露出することによって視覚化し、同じＴＬＣプレート上で真正標準を並列に実行することによって特定した。プレートを、蛍光体撮像スクリーンに一晩露出し、ＤＰＭで定量化するために、液体シンチレーション計数の前にＦｕｊｉｆｉｌｍ ＦＬＡ－５０００ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒによって分析した。
総脂質単離および分画化
葉試料を含む組織を凍結乾燥させ、計量し（乾重量）、および総脂質を、Bligh and Dyer (1959)に記述されるように、または溶媒としてクロロホルム：メタノール：０．１Ｍ ＫＣｌ（ＣＭＫ；２：１：１）を用いることにより抽出した。総脂質は、凍結乾燥後、クロロホルム／メタノール（２／１ ｖ／ｖ）混合物を、葉試料１ｃｍ直径あたり、９００μＬで添加することにより、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料から抽出された。ＴＬＣ－ＦＩＤ分析が実施された場合、内部標準として乾燥葉重量０．５ｍｇ当たり、０．８μｇのＤＡＧＥを添加した。試料を、ＩＫＡ ｕｌｔｒａ－ｔｕｒｒａｘ組織ライザーを用いてホモジナイズし、その後、５００μＬの０．１Ｍ ＫＣｌを添加した。試料をボルテックスして、５分間遠心し、低層を回収した。残りの上層は、６００μＬのクロロホルムを添加し、ボルテックスを行い、および５分間遠心することにより、２度、抽出された。低層を回収し、前述の回収物へプールされた。脂質を窒素フロー下で乾燥させ、２μＬクロロホルム／ｍｇ葉乾重量で再懸濁した。Ｎ． ｔａｂａｃｕｍの総脂質または葉試料は、一部改変を加えて、上述のように抽出した。もし４～６の葉ディスク（各々はおよそ１ｃｍ２の表面積）を組み合わせた場合、１．６ｍｌのＣＭＫ溶媒を使用し、一方、もし３以下の葉ディスクを組み合わせた場合、１．２ｍｌのＣＭＫを用いた。凍結乾燥させた葉組織を、Ｒｅｉｃｈｔ ｔｉｓｓｕｅ ｌｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて３分間、２０頻度／秒で、金属球を含むエッペンドルフチューブ内でホモジナイズした。
ＴＬＣおよびトランスメチル化を介した中性脂質の分離
既知体積の葉抽出物（たとえば、３０μＬ）を、ＴＬＣシリカゲル６０プレート（１ｘ２０ｃｍ）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上にロードした。中性脂質は、ヘキサン／ＤＥＥ／酢酸（７０／３０／１ ｖ／ｖ／ｖ）溶媒システムを含む平衡化展開タンクでＴＬＣを介して分離された。ＴＡＧのバンドは、ヨウ素ガスにより可視化され、ＴＬＣプレートからこすり取り、２ｍＬのＧＣバイアルへと写し、Ｎ２で乾燥させた。７５０μＬの１ＮのメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， ＵＳＡ）を、既知量のＣ１７：０ＴＡＧ（たとえば、定量に対する内部標準として３０μｇ）と共に各バイアルに添加した。
特定の遺伝子の組み合わせの、オレイン酸レベルに対する効果を分析する際は、ＴＡＧおよび極性脂質バンドをＴＬＣプレートから回収した。次に、１５μｇのＣ１７：０内部標準を試料（たとえばＴＡＧ試料、極性脂質試料および２０μＬの総脂質抽出物）に添加した。Ｎ２下での乾燥後、７０μＬのトルエンおよび７００μＬのメタノールＨＣｌを添加した。
ＧＣによる脂肪酸組成分析のための脂質試料は、メタノールＨＣｌの存在下で、２時間、８０℃で混合物をインキュベートすることによりトランスメチル化した。試料を室温にまで冷却した後、３５０μＬのＨ２Ｏを添加することにより反応を停止させた。脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を、３５０μｌのヘキサンを添加し、ボルテックスを行い、および５分間、１７００ｒｐｍで遠心することにより、混合物から抽出した。上のヘキサン層を回収し、３００μｌの円錐インサートを有するＧＣバイアルへと移した。蒸発後、試料を３０μｌのヘキサン中に再懸濁した。１μｌを、ＧＣへと注入した。
脂質画分中に存在する個々の脂肪酸および総脂肪酸（ＴＦＡ）の量を、各ピーク面積を決定することによるＧＣにより定量化し、既知の量の内部標準に対するピーク面積と比較することによって計算した。葉のＴＡＧ含量は、関連性：ＴＡＧ重量％＝１００ｘ（（４１ｘ総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ｇＦＡＭＥ－（１５ｘ総モルＦＡＭＥ）））／葉乾重量ｇ（ここで、４１および１５は、それぞれ、グリセロール部分およびメチル基の分子量である）を用いて、ＴＡＧ分画中のグリセロールおよび脂肪アシル部分の総和として算出された。
キャピラリーガス－液体クロマトグラフィー（ＧＣ）
ＦＡＭＥは、ＳＧＥ ＢＰＸ７０ （７０％ シアノプロピル ポリシルフェニレン－シロキサン）カラム（３０ｍ ｘ ０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．，０．２５μｍのフィルムの厚さ）、ＦＩＤ、スプリット／スプリットレス インジェクターおよび、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７６９３ Ｓｅｒｉｅｓオートサンプラ―およびインジェクター、を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ７８９０Ａ ＧＣ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を用いて、ＧＣにより分析された。ヘリウムを、キャリアガスとして用いた。試料は、スプリットモード（５０：１の比率）で、１５０℃のオーブンの温度で注入された。注入後、オーブンの温度は１分間、１５０℃で維持され、次いで、３℃／分-1で２１０℃まで上げ、最後に、５０℃／分-1で２４０℃まで上げた。ピークは、既知量の外部標準ＧＬＣ－４１１（Ｎｕｃｈｅｃｋ）およびＣ１７：０－Ｍｅ内部標準の応答に基づき、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ ソフトウェア（Ｒｅｖ Ｂ．０４．０３ （１６）、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）で定量化された。
Ｉａｔｒｏｓｃａｎを介したＴＡＧの定量
１μＬの脂質抽出物を、ＴＬＣ－ＦＩＤ Ｉａｔｒｏｓｃａｎ（登録商標）（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｄｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ－Ｊａｐａｎ）に対する１つのＣｈｒｏｍａｒｏｄ－ＳＩＩ上にロードした。Ｃｈｒｏｍａｒｏｄのラックを、次いで、７０ｍＬのヘキサン／ＣＨＣｌ３／２－プロパノール／ギ酸（８５／１０．７１６／０．５６７／０．０５６７ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）溶媒システムを含む平衡化展開タンクへと移した。３０分のインキュベーション後、Ｃｈｒｏｍａｒｏｄラックを１００℃で３分間、乾燥させ、ただちに、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ ＭＫ－６ｓ ＴＬＣ－ＦＩＤ 分析器（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｄｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ－Ｊａｐａｎ）上でスキャンした。ＤＡＧＥ内部標準およびＴＡＧのピーク領域は、ＳＩＣ－４８０ＩＩ統合ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ：７．０－Ｅ ＳＩＣ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．， ＬＴＤ－Ｊａｐａｎ）を用いて統合された。
ＴＡＧの定量は、２つのステップで実行された。最初に、ＤＡＧＥを全ての試料中でスキャンし、抽出収量を補正した後、濃縮ＴＡＧ試料が選択および希釈された。次に、外部標準としてグリセリルトリリノレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた外部キャリブレーションに従い、第二のスキャンで、希釈サンプル中のＴＡＧを定量化した。
ＧＣによる葉試料中のＴＡＧ定量
個々のＦＡＭＥのピーク領域は、最初に、市販の標準ＧＬＣ－４１１（ＮＵ－ＣＨＥＫ ＰＲＥＰ， Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）中に存在する、既知量の同じＦＡＭＥのピーク領域応答に基づき、補正された。補正された領域を用いて、内部標準と比較することにより、試料中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。油は主にＴＡＧの形態で貯蔵されているため、油の量は、各試料中のＦＡＭＥの量に基づき算出された。グリセロールの総モルは、ＦＡＭＥのモル数を算出し、ＦＡＭＥの総モルを３で割ることにより決定された。ＴＡＧの量は、式：油重量％＝１００ｘ（（４１ｘ総モルＦＡＭＥ／３）＋（総ＦＡＭＥｇ－（１５ｘ総モルＦＡＭＥ）））／葉乾重量ｇ（ここで、４１および１５は、それぞれ、グリセロール部分およびメチル基の分子量である）を用いて、グリセロールおよび脂肪アシル部分の総和として算出された。
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＨ１２４６のＤＧＡＴアッセイ
サッカロミセス・セレビシエ株Ｈ１２４６は、ＤＧＡＴ活性が全くなく、かつ４つの遺伝子（ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２）におけるノックアウト変異の結果として、ＴＡＧおよびステロールエステルが欠如している。Ｈ１２４６成長媒体への遊離脂肪酸の添加（例えば、１ｍＭ、１８：１Δ９）は、ＤＧＡＴ活性がない場合に有毒である。したがって、そのような培地での成長は、この酵母株におけるＤＧＡＴ活性の存在についての指標または選択肢として使用することができる。
Ｓ．セレビシエＨ１２４６を、ｐＹＥＳ２構築物（陰性対照）、ｐＹＥＳ２においてアラビドプシス・サリアナＤＧＡＴ１をコードする構築物、またはｐＹＥＳ２においてＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードする構築物で形質転換した。形質転換体には、［１４Ｃ］１８：１Δ９遊離脂肪酸を供給した。
別の実験では、Ｓ．セレビシエＨ１２４６を、ｐＹＥＳ２構築物（陰性対照）、ｐＹＥＳ２においてＢｅｒｎａｄｉａ ｐｕｌｃｈｅｌｌａＤＧＡＴ１をコードする構築物、またはｐＹＥＳ２においてＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１をコードする構築物で形質転換し、１８：１Δ９遊離脂肪酸をそれに供給した。ｐＹＥＳ２で形質転換したＳ．セレビシエＳ２８８Ｃ野生型株を、陽性対照として提供した。
酵母形質転換体を、滅菌ｍＱ水中に再懸濁して、ＯＤ６００＝１に希釈した。試料は、４つの連続する希釈物に、それぞれ１／１０にさらに希釈した。２μＬの各希釈物を、２μＬのｍＱ水および２μＬの非形質転換Ｈ１２４６細胞懸濁液（ＯＤ６００＝１）とともに、プレート（ＹＮＢＤ、ＹＮＢＧ、ＹＮＢＧ＋ＦＡ）のそれぞれにスポットした。プレートを、３０℃で６日間インキュベートし、その後に、成長を記録した。
プレート培地、プレートあたり４０ｍＬの培地
・ ＹＮＢＤ：ウラシルを含まず、２％のグルコース、０．０１％のＮＰ４０、および１００μＬのエタノールを含む、最小限のドロップアウト培地。
・ ＹＮＢＧ：ウラシルを含まず、２％のガラクトース、１％のラフィノース、０．０１％のＮＰ４０、および１００μＬのエタノールを含む、最小限のドロップアウト培地。
・ ＹＮＢＧ＋ＦＡ：ウラシルを含まず、２％のガラクトース、１％のラフィノース、０．０１％のＮＰ４０、および１００μＬのエタノールに溶解させた１ｍＭＣ１８：１Δ９を含む、最小限のドロップアウト培地。
実施例２．植物細胞のモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの構成的発現
ＭＧＡＴ１
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の遺伝子によってコードしたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ１（ＭＧＡＴ１）（Ｙｅｎ他，２００２）、およびここでＭＧＡＴ１との比較として使用した、Ａ．サリアナのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）（Ｂｏｕｖｉｅｒ－Ｎａｖｅ他，２０００）の酵素活性を、実施例１で説明されるように一過性発現系を使用して、Ｎ．ベンサミアナの葉組織において実証した。
末端を鈍化させるためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを処理した後に、３５Ｓプロモーターを含むＰｓｔＩをベクターｐＯＲＥ０４ｍｐのＳｆｏＩ部位に挿入することによって、３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４と命名したベクターを作製した（Ｃｏｕｔｕ他，２００７）。ブラシカ・ナパスのためにコドン最適化したＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１をコードするキメラＤＮＡを、Ｇｅｎｅａｒｔによって合成し、０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡと命名した。ＥｃｏＲＩ断片内に含まれる０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡのコード領域全体をＥｃｏＲＩ部位の３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１と命名した、植物細胞における発現のためのＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ９１ＺＶ４）をコードするキメラＤＮＡを作製した。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築物を含むベクターを、ｐＪＰ３１８４と命名した。同様に、ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＶ断片内に含まれるｐＸＺＰ５１３Ｅのコード領域全体をＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＶ部位の３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、植物細胞における発現のためのＡ．サリアナＤＧＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ１９２６２）をコードするキメラＤＮＡ３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を作製した。３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築物を含むベクターを、ｐＪＰ２０７８と命名した。
キメラベクターを、２４℃の成長室において、Ｎ．ベンサミアナ植物の組織に浸潤させた培養物からのＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１および細胞に導入した。試料間の直接的な比較を可能にし、葉の間での変動を低減するために、比較する試料を、同じ葉の両側に浸潤させた。実験は、３つ組で行った。浸潤に続いて、植物をさらに３日間成長させ、その後に、葉片を取り、凍結乾燥し、試料から抽出した脂質を、実施例１で説明されるように分画して、定量化した。この分析は、ＭＧＡＴ１およびＤＧＡＴ１遺伝子がＮ．ベンサミアナにおける葉油レベルを増加させるように機能していることを明らかにした。
３５Ｓ：ｐ１９構築物だけで形質転換した葉組織（陰性対照）は、平均４μｇのＤＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、および５μｇのＴＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９構築物および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築物（ＤＧＡＴ１の発現のための対照）で形質転換した葉組織は、平均４μｇのＤＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡ、および２２μｇのＴＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９構築物および３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築物で形質転換した葉組織は、平均８μｇのＤＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡ、および４４μｇのＴＡＧ／ｍｇ乾燥葉重量由来のＦＦＡを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９構築物、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築物、および３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築物で形質転換した葉組織は、３５Ｓ：ｐ１９および３５Ｓ：ＭＧＡＴ１浸潤体において観察したものよりも高いＤＡＧまたはＴＡＧを含有しなかった（図２）。また、種子中の飽和成分のレベルの減少が、ｐ１９対照またはＤＧＡＴ１試料と比較したときに、ＭＧＡＴの発現後に認められた（表２）。
上に記載したデータは、ＭＧＡＴ１酵素が、葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧ双方の蓄積を促進することにおいて、ＤＧＡＴ１よりもはるかに活性であったことを示した。ＭＧＡＴ１遺伝子の発現は、ＤＧＡＴ１が発現したときと比較して、２倍もの葉組織におけるＤＡＧおよびＴＡＧの蓄積をもたらした。この結果は、ＭＧＡＴが、マウス腸（植物葉とは大幅に異なる生物系）において発現する酵素であることを考えれば、非常に意外であり、また予想外であった。この研究は、植物細胞におけるＭＧＡＴの異所性発現を最初に示したものであった。
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１を浸潤させた葉試料は、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１だけを浸潤させた葉組織と比較して、２倍のＤＡＧおよびＴＡＧを蓄積した。マウスＭＧＡＴがＤＧＡＴとして非常に低い活性しか有しないことを考えれば、ＴＡＧの生成効率も意外であり、また予想外であった。ＭＧＡＴ１およびＤＧＡＴ１の双方をコードする遺伝子を浸潤させた葉組織は、ＭＧＡＴ１だけの葉試料よりもＴＡＧを有意に蓄積しなかった。図１は、種々のＴＡＧの蓄積経路を表す図であり、その大部分は、ＤＡＧ（脂質合成における中心的な分子）に集束している。例えば、ＭＡＧ、ＤＡＧ、およびＴＡＧは、アシル基転移、リパーゼ、ＭＧＡＴ、ＤＧＡＴ、およびＰＤＡＴを含む種々の酵素活性を介して、相互変換することができる。ＭＧＡＴの発現後に、飽和レベルの減少も見られた。
ＭＧＡＴ２
ＥｃｏＲＩ断片内に含まれるＭＧＡＴ２コード領域全体をＥｃｏＲＩ部位の３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４に挿入することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２と命名した、植物細胞における発現のためのＭ．マスクルＭＧＡＴ２をコードするキメラＤＮＡを作製した。Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の遺伝子によってコードしたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２（ＭＧＡＴ２）（Ｙｅｎ，２００3）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ８０Ｗ９４）、およびＭＧＡＴ２との比較として使用したＡ．サリアナのＤＧＡＴ１（Ｂｏｕｖｉｅｒ－Ｎａｖｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）の酵素活性は、実施例１で説明した一過性発現系を使用した、Ｎ．ベンサミアナの葉組織においても示された。
対照と比較して、ＤＧＡＴ１の発現は、葉ＴＡＧで５．９倍、ＭＧＡＴ２で７．３倍、ＭＧＡＴ２＋ＤＧＡＴ１の組み合わせで９．８倍増加した（図３）。ＴＡＧにおけるそのような有意な増加を生ずる、ＭＧＡＴ２単独の能力は、いくつかの理由により、予想外であった。第１に、葉組織に存在する基質ＭＡＧの量は、低いことが分かっており、この基質からのＴＡＧの蓄積の増加は予想されない。第２に、ＭＧＡＴ活性単独の添加（すなわち、ＤＧＡＴ活性を有しないＭＧＡＴ２の添加）は、特に天然の活性ＤＧＡＴが通常ほとんど存在しない葉環境において、ＴＡＧではなく、ＤＡＧを生ずることが予想されるものであった。
考察
本発明者らは、驚くべきことに、ＭＧＡＴ遺伝子のトランスジェニック発現が、植物細胞における脂質収量のかなりの増加をもたらすことを実証した。本発明者らは、Ｔｕｍａｎｅｙ他が、一部のＭＧＡＴ活性によってＤＧＡＴを単離したこと、およびＴｕｍａｎｅｙ他が、本明細書で定義されるように、ＭＧＡＴをコードする遺伝子のクローン化する試みに成功しなかったことを理解している。Ｔｕｍａｎｅｙ他（２００１）は、ピーナッツにおけるＭＧＡＴ活性を報告し、この活性の原因となる酵素を単離した。しかしながら、Ｔｕｍａｎｅｙ他は、ＤＧＡＴ活性についての試験結果を公表せず、したがって、報告した酵素は、いくつかのＭＧＡＴ活性を伴うＤＧＡＴであったと考えられる。実際に、以前の研究では、他の種においていかなるＭＧＡＴ活性も特定できなかった（Ｓｔｏｂａｒｔ他，１９９７）。さらに、意外なことに、Ｔｕｍａｎｅｙ他が単離した酵素は、膜結合酵素ではなく、可溶性のサイトゾル酵素であった。
近年、研究者らにより、未成熟のピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）種子から、ミクロソーム膜結合型モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）が同定されている。ＭＧＡＴは、カオトロピック剤および両性イオン界面活性剤の組み合わせを用いて、ミクロソーム膜から可溶化し、機能的に活性な１４Ｓの多タンパク質複合体を単離し、特徴を解析した。たとえば、モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）のジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２；Parthibane et al., 2012）へのアシル化等の二機能性の活性を行使することができる、オレオシン３（ＯＬＥ３）が、多タンパク質複合体の一部として特定された。
実施例３．葉抽出物におけるトランスジェニックＭＧＡＴ活性の生化学的実証
実施例１に記載されるように、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を浸潤させたＮ．ベンサミアナの葉組織から細胞溶解物を作製した。３５Ｓ：ｐ１９構築物だけしか含まない株（陰性対照）、３５Ｓ：ｐ１９株を伴う３５Ｓ：ＭＧＡＴ２株、ならびに３５Ｓ：ｐ１９株を伴う３５Ｓ：ＭＧＡＴ２株および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１アグロバクテリウム株の混合物について、それぞれ３つ組で、別々の葉浸潤を行った。３日後に３つ組の試料を採取し、精製した細胞溶解物を、機械的組織溶解および遠心分離によって調製した。実施例１で説明されるように［１４Ｃ］ＭＡＧを溶解物に供給することによって、精製した細胞溶解物のＭＧＡＴ活性を比較した。データを図４に示す。
３５Ｓ：ｐ１９対照試料では、アッセイの全体を通して大部分の放射活性がＭＡＧに留まったので、ＭＧＡＴ活性がほとんど観察されなかった。対照的に、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料中の大部分の標識したＭＡＧは、迅速にＤＡＧに変換された（図４中央パネル）。これは、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築物から強力なＭＧＡＴ活性が発現したことを示している。さらに、かなり多くのＴＡＧも生成された。３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料で観察されたＴＡＧの生成は、天然のＮ．ベンサミアナＤＧＡＴ活性によるもの、または別のＴＡＧ合成経路によって生成されたものと考えられる。ＴＡＧの生成量は、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１のさらなる添加によって大幅に増加した（図４右側パネル）。これは、ＭＧＡＴ２酵素が、植物栄養組織中のＤＧＡＴ１によるＴＡＧへの変換を利用できるＤＡＧを生成したことを示している。
実施例４．葉抽出物のＭＧＡＴが利用できるＭＡＧの生成の生化学的実証
葉溶解物を使用した実施例３で説明されるインビトロのアッセイでは、基質（ｓｎ－２－ＭＡＧおよびオレオイル－ＣｏＡ）を外因的に供給したのに対して、無傷の植物組織におけるインビボのＭＧＡＴ活性では、これらの基質が天然に存在することを必要とするであろう。種々の植物組織における低レベルのＭＡＧの存在は、既に報告されている（ＨｉｒａｙａｍａおよびＨｕｊｉｉ，１９６５、Ｐａｎｅｋｉｎａ他，１９７８、Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎａ他，１９８４、ＰｅｒｒｙおよびＨａｒｗｏｏｄ，１９９３）。ＭＧＡＴ２が天然の植物経路によって生成されたＭＡＧを利用できるかどうかを試験するために、前述の実験を繰り返すが、ここでは、［１４Ｃ］Ｇ－３－Ｐを溶解物に供給した。結果として生じたデータを図５に概略的に示す。
標識したＭＡＧの生成が、全ての試料において観察され、これは植物葉溶解物中のＧ－３－ＰからのＭＡＧのデノボ生成を示す。３５Ｓ：ｐ１９対照試料においては比較的に低かったが、標識したＤＡＧおよびＴＡＧ産物も、全ての試料において観察された。これは、この試料において、内因性ケネディ経路によるこれらの中性脂質の生成が比較的に低かったことを示している。対照的に、ＭＧＡＴ２試料およびＭＧＡＴ２＋ＤＧＡＴ１試料中の大部分の標識が、ＤＡＧおよびＴＡＧプールに現れた。これは、外因的に添加したＭＧＡＴが、天然の植物経路によって、標識したＧ－３－Ｐから生成されたＭＡＧの変換を触媒したことを示している。
実施例２～４は、いくつかの要点を実証する。すなわち、１）葉組織は、Ｇ－３－ＰからＭＡＧを合成することができ、よって、ＭＡＧは、葉組織において発現する外因性ＭＧＡＴを利用することができる、２）哺乳類の腸に由来するＭＧＡＴであっても、内因性ＭＧＡＴを保有していないと思われている植物組織において機能することができ、脂質合成に関与する他の植物因子との首尾よい相互作用を必要とする、３）外因性ＭＧＡＴ活性によって生成されるＤＡＧは、ＴＡＧを生成するために、植物ＤＧＡＴまたは外因性ＤＧＡＴを利用することができる、および４）外因性ＭＧＡＴの発現は、大幅に増加したＴＡＧレベルを生ずることができ、そのレベルは、少なくとも外因性Ａ．サリアナＤＧＡＴ１の発現によって生ずるレベルと同じくらい大きい。
実施例５．酵母におけるＤＧＡＴ１、ＭＧＡＴ１、およびＭＧＡＴ２の発現
ｐＹＥＳ２：ＤＧＡＴ１、ｐＹＥＳ２：ＭＧＡＴ１、およびｐＹＥＳ２：ＭＧＡＴ２を生ずるように、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１、およびＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードする遺伝子をｐＹＥＳ２ベクターに挿入することによって、キメラ酵母発現ベクターを構成した。これらの構成体を、ＤＧＡＴ活性が全くなく、かつ４つの遺伝子（ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２）におけるノックアウト変異の結果として、ＴＡＧおよびステロールエステルが欠如している、サッカロミセス・セレビシエ株Ｈ１２４６において形質転換した。酵母株Ｈ１２４６は、外因的に添加した脂肪酸からＤＡＧを合成することができるが、ノックアウト変異のため、ＤＡＧをＴＡＧに変換することができない。形質転換した酵母培養物に、［１４Ｃ］１８：１Δ９を供給し、その後に、実施例１で説明されるように全ての脂質を抽出して、ＴＬＣによって分画した。代表的なＴＬＣプレートのオートラジオグラムを図６に示す。
ＤＧＡＴ活性の存在を示すＴＡＧの形成が、ＤＧＡＴ１（陽性対照）を含む酵母細胞および哺乳類のＭＧＡＴ１を含む酵母細胞のどちらでも観察されたが、天然型Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓコード領域によりコードされるＭＧＡＴ２を含む細胞では観察されなかった。マウス由来のＭＧＡＴ１はまた、酵母細胞においてもＤＧＡＴ活性を有し、したがって、二重機能ＭＧＡＴ／ＤＧＡＴ酵素として機能するのに対して、ＭＧＡＴ２は、検出可能なＤＧＡＴ活性を有さず、したがって、単にＭＧＡＴだけであった、と結論付けられた。酵母における発現に対してコドン最適化されているＭＧＡＴ２コード領域を含む構築物は、酵母ミクロソームおよび標識化ＭＡＧ基質を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで検証した際、ＭＧＡＴ活性（ＤＡＧの産生）を示した一方で、Ｂ．ｎａｐｕｓでの発現に最適化された類似の構築物は、酵母ミクロソームではＤＡＧ産生を示さなかった。この実験により、異種コード領域が発現される生物に対するコドン最適化の利点が示された。
実施例６．植物、種子、および菌類におけるモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼの発現
アラビドプシス・サリアナ種子におけるＭＧＡＴ１の発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードし、種子特異的プロモーター（ＦＰ１、切断したブラシカ・ナパス・ナピン・プロモーター）の制御下にある遺伝子を使用して、安定的に形質転換したＡ．サリアナおよび子孫種子を生成した。ＦＰ１プロモーターおよびグリシネ・マクのレクチンポリアデニル化シグナルが側面に並ぶＥｃｏＲＩ部位を含むＳａｌＩ断片をベクターｐＣＷ１４１のＳａｌＩ－ＸｈｏＩ部位に挿入することによって、ｐＪＰ３１７４と命名したベクターを作製した。ｐＣＷ１４１ベクターはまた、スクリーニング可能なマーカー遺伝子としてＦＰ１駆動、イントロン中断、種子分泌のＧＦＰも含んだ。ＥｃｏＲＩ断片内に含まれる構築物０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡのコード領域全体を、ｐＪＰ３１７９を生成するＥｃｏＲＩ部位のｐＪＰ３１７４に挿入することによって、ＦＰ１：ＭＧＡＴ１－ＧＦＰと命名したキメラ遺伝子を作製した。このキメラベクターを、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物由来の細胞を使用して、形質転換のためのフローラルディップ法（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ，１９９８）を使用してＡ．サリアナ（生態型コロンビア）植物を処理した。成熟後に、処理した植物に由来する種子を、ＬｅｉｃａＭＺＦＬIII解剖顕微鏡およびｅｂｑ１００水銀ランプの下で観察した。１５個のトランスジェニック種子（強いＧＦＰ陽性）および１５個の非トランスジェニック（ＧＦＰ陰性）種子を、単離して、それぞれプールした。ＧＦＰ陽性プールおよびＧＦＰ陰性プールを、実施例１で説明されるように、総脂肪酸含量について分析した。この分析は、ＭＧＡＴ構築物で形質転換した種子について平均的な脂肪酸含量および組成物を提供したが、ヘミ接合性およびホモ接合性双方の形質転換された種子を含んだかもしれない集団におけるものであった。
この分析では、ＭＧＡＴ１遺伝子が、Ａ．サリアナ種子における種子油レベルを増加させるように機能し、１５個の非トランスジェニック種子（対照、野生型と同じ）が平均６９．４μｇの総脂肪酸を含む一方で、ＧＦＰ遺伝子で形質転換した１５個のトランスジェニック種子（したがって、ＦＰ１：ＭＧＡＴ１遺伝的構築物を含む可能性がある）が平均７１．９μｇの総脂肪酸を含むことを明らかにした。これは、対照（野生型）と比較して、３．５％の含油量の増加であった。この分析はまた、ＭＧＡＴ遺伝子が、種子から得た総抽出脂質の脂肪酸組成から見たときに、種子における多価不飽和脂肪酸を富化するように機能していることも明らかにした。特に、種子から抽出した総脂肪酸の割合として、存在するＡＬＡの量が、１６．０％から１９．６％まで増加した。同様に、脂肪酸２０：２ｎ６の割合は、１．２５％から１．９０％に増加し、脂肪酸２０：３ｎ３は、０．２６％から０．５１％に増加した（表２）。

表２ 種子の脂肪酸組成に対するＭＧＡＴ発現の影響
Figure 0007097805000002
ＦＰ１：ＭＧＡＴ１－ＧＦＰキメラＤＮＡを修飾してＧＦＰ遺伝子を除去する、さらなる実験を行った。ＦＰ１：ＭＧＡＴ１と命名したこの遺伝的構築物を、ＦＡＤ２についての変異体であるＡ．サリアナ系統に形質転換した。抗生物質耐性のＴ１植物由来のＴ２種子、ならびにこれらの植物と一緒に成長させた親系統の総脂肪酸含量を、実施例１に従って決定した。データを表３に示す。対照系統由来の種子の平均総脂肪酸は、種子１００個あたり３４７．９μｇであったのに対して、トランスジェニック種子の平均は、種子１００個あたり３８１．０μｇであった。平均を決定するために対照系統Ｃ６についてのデータを除外すると、対照の平均は、種子１００個あたり３７０μｇであった。トランスジェニック種子の含油量は、非形質転換種子の含油量と比較して、相対的に約３％の増加を示した。

表３ アラビドプシス・サリアナＴ２ＦＰ１：ＭＧＡＴ１トランスジェニック種子および親対照種子の、脂肪酸プロファイルおよび総脂肪酸の定量
Figure 0007097805000003
Figure 0007097805000004
植物細胞における発現にコドン最適化された、マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域を、上述の構築物中のＭＧＡＴ１コード領域と置換し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓへと導入した。各トランスジェニック系統（Ｔ１およびＴ２植物、Ｔ２およびＴ３世代の種子を生じさせる）の３０の植物を、ランダムに配置された分布で、温室内で成長させ、対照植物と比較した。トランスジェニック植物由来の種子は、対照種子と比較して、その油含量を増加させていた（図７）。Ｔ３トランスジェニック種子の平均ＴＡＧパーセンテージは、未形質転換種子のＴＡＧパーセンテージとひかうして、約８％の相対的増加を示した（表４）。トランスジェニック種子のＴＡＧ中の多価不飽和脂肪酸、特にＡＬＡのレベルにおいて、著しい増加が認められ、飽和脂肪酸（たとえば、パルミチン酸およびステアリン酸等）のレベルは減少した。さらに、ＴＡＧの増加レベルおよび脂肪酸組成の変化は、Ｔ２種子よりもＴ３世代でより明白であり、Ｔ３種子中の導入遺伝子のホモ接合性の状態によるものと推測される。
表４ 未形質転換対照種子と比較した、ＭＧＡＴ２を発現しているＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＴ２およびＴ３種子から抽出されたＴＡＧレベルおよびＴＡＧ中の脂肪酸組成
Figure 0007097805000005
アブラナ種子におけるＭＧＡＴ１の発現
アラビドプシス・サリアナ種子のＭ．マスクルスＭＧＡＴ１の発現に使用されるベクターＦＰ１：ＭＧＡＴ１を使用して、形質転換されたＢ．ナパス植物を生成した。標準的な電気穿孔手順を介して、ベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。培養物を、１５０ｒｐｍで攪拌しながら、ＬＢ培地中で、２８℃で一晩成長させた。細菌細胞を、４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって採集し、ＷｉｎａｎｓのＡＢ（Ｗｉｎａｎｓ、１９８８）で洗浄し、１０ｍＬのＷｉｎａｎｓのＡＢ培地（ｐＨ５．２）中に再懸濁し、そして１００μＭのアセトシリンゴンを添加しながら、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）で一晩成長させた。ブラッシカ細胞を感染させる２時間前に、スペルミジン（１２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、細菌の最終的な密度を、新鮮なＡＢ媒体で０．３～０．４のＯＤ６００ｎｍに調整した。１／２ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ，１９６２）上で成長させた８日目のＢ．ナパス苗木由来の新鮮に単離した子葉柄、またはＭＳ培地上で３～４日目までに１ｍｇ／Ｌチジアズロン（ＴＤＺ）＋０．１ｍｇ／Ｌのアルファ－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）で予め調整した胚軸セグメントを、１０ｍＬのアグロバクテリウム培養物で５分間感染させた。次いで、アグロバクテリウムを感染させた外植体（子葉柄および胚軸）を、滅菌濾紙で吸い取って余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤（５０ｍｇ／ＬのＬ－システインおよび１５ｍｇ／Ｌのアスコルビン）を補充した、または補充しない、共培養媒体（１ｍｇ／ＬＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１００μＭアセトシリンゴンを伴うＭＳ媒体）に移した。全てのプレートを、パラフィルムで密閉し、暗所において２３～２４℃で４８時間インキュベートした。
次いで、共培養した外植体（子葉柄および胚軸）を、滅菌蒸留水＋５００ｍｇ／Ｌのセフォタキシム＋５０ｍｇ／Ｌのチメンチンで１０分間洗浄し、滅菌蒸留水で１０分間すすぎ、滅菌濾紙で吸い取り、事前に選択した培地（ＭＳ＋１ｍｇ／ＬのＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／Ｌのアデニン硫酸（ＡＤＳ）＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、および５０ｍｇ／Ｌのチメンチン）に移し、１６時間／８時間の光周期で、２４℃で５日間培養した。次いで、それらを、１．５ｍｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウムを伴う選択培地（ＭＳ＋１ｍｇ／ＬのＴＤＺ＋０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、および５０ｍｇ／Ｌのチメンチン）に移し、隔週で同じ培地に継代培養しながら、１６時間／８時間の光周期で、２４℃で４週間培養した。緑色カルスを伴う外植体を、芽形成開始培地（ＭＳ＋１ｍｇ／Ｌのカイネチン＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム＋５０ｍｇ／Ｌのチメンチン＋１．５ｍｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウム）に移して、さらに２～３週間培養した。耐性を示す外植体から発生する芽を、芽伸長培地（０．１ｍｇ／Ｌのジベレリン酸＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフロキシム＋１．５ｍｇ／Ｌのグルホシネートアンモニウムを伴うＭＳ培地）に移して、さらに２週間培養した。長さ２～３ｃｍの健康な芽を選択し、発根培地（１ｍｇ／ＬのＮＡＡ＋２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ＋１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３＋２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを伴う１／２のＭＳ）に移して、２～３週間培養した。十分に定着した根付きの芽を、ポット（苗木栽培混合物）に移し、成長キャビネット中で２週間成長させ、その後に、温室に移した。栽培品種Ｏｓｃａｒにおける、１６個の個々の形質転換体が、ＦＰ１：ＭＧＡＴ１構築物に対してトランスジェニックであること、および温室条件下で正常に成長したことを確認した。植物の成長は正常であると思われ、植物は、稔性であり、正常に開花し、結実した。植物は、成熟期まで成長させ、形質転換された植物から得られた種子を採取した。一部の形質転換植物由来の種子は、種子油含量および脂肪酸組成に対し分析された。これらの予備的な分析から得られたデータは、油含量および脂肪酸組成において、ばらつきを示したが、これは異なる時間および異なる環境条件下で成長した植物であるためと推測される。ばらつきを減少させるため、ＭＧＡＴ１を発現しているＴ１植物を製造し、同じ遺伝子型の対照植物（野生型、栽培品種Ｏｓｃａｒ）と同じ条件下で成長させ、油含量を比較した。
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ（ゴシピウム・ヒルスツム）種子におけるＭＧＡＴ１の発現
アラビドプシス・サリアナ種子のＭ．マスクルスＭＧＡＴ１の発現に使用したものと同じ種子特異的キメラ遺伝子を使用して、形質転換されたゴシピウム・ヒルスツム植物を生成した。ＦＰ１：ＭＧＡＴ１と命名したベクターを、標準的な電気穿孔手順を介してＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、アグロバクテリウム培養物由来の細胞を使用して、キメラＤＮＡをゴシピウム・ヒルスツム（変種Ｃｏｋｅｒ３１５）の細胞に導入した。１０日目の綿苗木から切除した子葉を外植体として使用し、Ａ．ツメファシエンスに感染させて２日間にわたって共培養した。この後に、０．１ｍｇ／Ｌの２，４－Ｄ、０．１ｍｇ／Ｌのカイネチン、５０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシン、および２５ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ，１９６２）に対する６週間選択が続いた。子葉外植体由来の健康なカルスを、２８℃で第２の６週間にわたって、５ｍｇ／Ｌの６－（γ、γ－ジメチルアリルアミノ）－プリン（２ｉｐ）、０．１ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ媒体に移した。インキュベーションの約６～１０週後に形成される体細胞胚を、同じ培地であるが植物ホルモンまたは抗生物質を添加していない培地上で発芽させて維持した。体細胞胚から発育した小植物を、土壌に移し、葉および根が発育した時点で、２８℃／２０℃（昼／夜）の成長温度で、温室において維持した。ＦＰ１－ＭＧＡＴ１構築物を含む１０の独立した最初のトランスジェニック植物（Ｔ０）を、温室において成長させ、開花させ、種子を含む莢を生成させた。種子は、成熟期に採取した。油含量分析の信頼性を上げるために、５つの植物を、１０の最初の各トランスジェニック植物から確立させ、そして成熟Ｔ２種子を油含量の分析に供する。ＭＧＡＴ１の種子特異的発現は、含油量を増加させ、綿種子油における多価不飽和脂肪酸の割合を増加させる。
安定的な形質転換後のＮ．ベンサミアナ植物におけるＭＧＡＴ１およびのＭＧＡＴ２遺伝子の発現
Ｎ．ベンサミアナを、実施例２で説明される３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築物で安定的に形質転換した。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１を、標準的な電気穿孔手順を介して、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。形質転換された細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した個体ＬＢ培地上で成長させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一の群体を使用して、新鮮な培養を開始した。４８時間の活発な培養に続いて、細胞を２，０００ｘｇの遠心分離によって採集し、上清を除去した。ＯＤ６００＝０．５の密度で、５０％のＬＢおよび５０％のＭＳ培地を含む新鮮な溶液中に細胞を再懸濁した。
インビトロで成長させたＮ．ベンサミアナの葉試料を切除し、Ａ．ツメファシエンス溶液に浸した状態で、鋭利な外科用メスで約０．５～１ｃｍ２のサイズ正方形の区画に切断した。切断したＮ．ベンサミアナの葉部分を、Ａ．ツメファシエンスに浸漬し、室温で１０分間放置し、その後に、滅菌濾紙で吸い取り乾燥し、補助剤を伴わないＭＳプレート上に移した。２４℃で２日間の共培養に続いて、外植体を、滅菌液体ＭＳ培地で３回洗浄し、次いで、滅菌濾紙で吸い取り乾燥し、１．０ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２５ｍｇ／Ｌのインドール酢酸（ＩＡＡ）、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充した選択ＭＳ寒天培地上に置いた。プレートを、２４℃で２週間インキュベートして、形質転換されたＮ．ベンサミアナの葉部分から芽を発育させた。
発芽トランスジェニック植物をインビトロで定着させるために、健康な緑色芽を切断して、２５μｇ／ＬのＩＡＡ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充したＭＳ寒天培地を含む２００ｍＬの組織培養ポットに移した。十分に大きい葉片を、トランスジェニック芽から取り出し、実施例１で説明されるように、ＴＡＧ分画および定量化分析のために凍結乾燥した（表５）。最良の３５Ｓ：ＭＧＡＴ１、Ｎ．ベンサミアナ植物は、対照系統における乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり８５．０２μｇの平均ＴＡＧ含量と比較して、乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり２０４．８５μｇのＴＡＧ含量を有し、ＴＡＧ含量が２４１％増加したことを示している。
また、Ｎ．ベンサミアナを、実施例２で説明される３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築物、および対照バイナリーベクターｐＯＲＥ４でも安定的に形質転換した（表６）。最良の３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、Ｎ．ベンサミアナ植物は、対照系統における乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり９．５μｇの平均ＴＡＧ含量と比較して、乾燥葉組織重量１００ｍｇあたり７９．０μｇのＴＡＧ含量を有し、ＴＡＧ含量が７３１％増加したことを表している。ＴＡＧ画分の脂肪酸プロファイルも、大幅に減少したレベルの飽和脂肪酸１６：０および１８：０、および増加したレベルの多価不飽和脂肪酸、特に１８：３のω３（ＡＬＡ）に変化した（表６）。同じ葉試料由来の極性脂質の脂肪酸プロファイルは、大きく影響を及ぼされなかったが、これは、非極性脂質の脂肪酸組成における変化が実質的であったことを示している。この実験における対照植物は、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築物による従来の実験におけるものよりも小さく、また生理学的に異なっており、これは、実験毎に対照植物の含油量が異なることを説明し得る。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築物と、対照植物とを直接比較する実験は、同じサイズおよび生理機能の植物を使用して行う。
新しい組の構成的バイナリー発現ベクターを、複製エンハンサー領域（ｅ３５Ｓ）を伴う３５Ｓプロモーターを使用して作製した。最初に、ｐＪＰ３３４３を生ずるように、ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ断片内に含まれるｅ３５ＳプロモーターをＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩのｐＯＲＥ０４の中にクローン化することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１＃２（ｐＪＰ３３４６）、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２＃２（ｐＪＰ３３４７）、および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１＃２（ｐＪＰ３３５２）を作製した。次いで、ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２遺伝子をそれぞれｐＪＰ３３４３のＥｃｏＲＩ部位の中にクローン化することによって、ｐＪＰ３３４６およびｐＪＰ３３４７を生成した。ＸｈｏＩ－ＡｓｉＳＩ部位内に含まれるＡ．サリアナＤＧＡＴ１をｐＪＰ３３４３のＸｈｏＩ－ＡｓｉＳＩ部位の中にクローン化することによって、ｐＪＰ３３５２を生成した。
上で説明したように、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１中のｐＪＰ３３４６、ｐＪＰ３３４７、およびｐＪＰ３３５２を使用して、Ｎ．ベンサミアナを形質転換した。確認されたトランスジェニック植物は、ｐＪＰ３３４６について１４個回収され、ｐＪＰ３３４７について２２個回収された。複数のカナマイシン耐性の形質転換された芽を、ｐＪＰ３３５２で生成した。ＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２で形質転換した植物に対して、導入遺伝子の発現分析を行った。高レベルの発現を伴う植物を選択した。Ａ．サリアナＤＧＡＴ１で形質転換した植物に関する発現分析を行う。植物は、正常に成長し、成熟期まで成長させる。種子を、成熟期に収穫する。高発現子孫由来の種子を、ホモ接合性およびヘテロ接合性植物の双方を含むＴ２分離集団の脂質分析のために、土壌上に直接蒔く。高レベルのＭＧＡＴ１またはＭＧＡＴ２のいずれかを発現する植物の葉の含油量は、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１で形質転換した植物または対照植物と比較して、大幅に増加する。ＭＧＡＴ２トランスジェニック植物は、ヌル事象と比較して、不飽和脂肪酸１８：１の著しい増加と、総脂肪酸含量の１％の相対増加を示した（表７）。
上で説明したようにＡ．サリアナを形質転換するために、ＡＧＬ１中のｐＪＰ３３４６、ｐＪＰ３３４７、およびの対照ベクターも使用した。２５個のトランスジェニックＴ２植物がｐＪＰ３３４６由来のＴ－ＤＮＡを含むことが確認され、ｐＪＰ３３４７について４３個のトランスジェニック植物を特定した。トランスジェニック植物に関する発現の分析を行った。高発現子孫由来の種子を採取して、直接土壌上に蒔いた。導入遺伝子が欠如している分離体由来のものを含む、Ｔ２およびＴ３子孫由来の葉の含油量を含む脂質分析を行った。最高レベルのＴＡＧは、ＭＧＡＴ導入遺伝子に対してホモ接合性である植物において得られた。
表５ ３５Ｓ：ＭＧＡＴ１構築物で安定的に形質転換されたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織におけるＴＡＧの脂肪酸プロファイルおよび定量化。試料「Ｍ」は、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１であり、試料「Ｃ」は、親対照植物である。
Figure 0007097805000006
表６ ３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築物で安定的に形質転換されたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織におけるＴＡＧの脂肪酸プロファイルおよび定量化。試料「Ｍ」は、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２であり、試料「Ｃ」は、親対照植物である。各植物から２枚の葉を取り、別々に分析した。
Figure 0007097805000007
表７ ３５Ｓ：ＭＧＡＴ２構築物で安定的に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織中の総脂肪酸量（ＴＦＡ）および脂肪酸組成
Figure 0007097805000008
各トランスジェニック系統の３０の植物を、元の対照植物と、温室内において、ランダム配置で成長させた。Ｔ２種子を油含量に対して分析し、元の種子の総脂肪酸含量と比較して、約２％の油含量（総脂肪酸レベル）の増加を示した（図８）。
安定的に形質転換されたトリフォリウム・レペンス植物のＭＧＡＴ１の発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、トリフォリウム・レペンス（別の双子葉植物）を形質転換した。キメラ遺伝子３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を含むベクターを、標準的な電気穿孔手順を介して、Ａ．ツメファシエンスに導入した。双方のベクターはまた、３５Ｓ：ＢＡＲ選択可能なマーカー遺伝子も含む。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した固体ＬＢ培地上で成長させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一の群体を使用して、各構築物のための新鮮な培養を開始した。４８時間の活発な培養に続いて、アグロバクテリウム培養物を使用して、Ｌａｒｋｉｎ他（１９９６）によって説明されるように、給水種子から解離したＴ．レペンス（ｃｖ．Ｈａｉｆａ）子葉を処理した。３日間の共培養に続いて、外植体を、５ｍｇ／ＬのＰＰＴに露出して、形質転換された芽を選択し、次いで、発根培地に移して根を形成させ、その後に、土壌に移した。ＭＧＡＴ１を含む形質転換された植物を得た。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現する。含油量は、少なくとも葉等の栄養組織において増加する。
安定的に形質転換したホルデウム・ブルガレにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、安定的に形質転換されたホルデウム・ブルガレ（単子葉植物の植物）を生成した。キメラ遺伝子Ｕｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１を含むベクターを、Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１およびＡ．サリアナＤＧＡＴ１コード領域全体を、それぞれ、ｐＷＶＥＣ８－Ｕｂｉの中にクローン化することによって構築した。キメラ遺伝子Ｕｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１を含むベクターを、標準的な電気穿孔手順を介して、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンビシン（２５ｍｇ／Ｌ）を補充した個体ＬＢ培地上で成長させ、プレートを、２８℃で２日間インキュベートした。それぞれの単一の群体を使用して、新鮮な培養を開始した。
４８時間の活発な培養に続いて、アグロバクテリウム培養物を使用して、いくつかの改変を伴う公開された方法（Ｔｉｎｇａｙ他，１９９７、Ｂａｒｔｌｅｔｔ他，２００８）に従って、オオムギ（ｃｖ．ゴールデン・プロミス）の未成熟胚の細胞に形質転換した。簡潔には、長さが１．５～２．５ｍｍの胚を、未成熟穎花から単離し、胚軸を除去した。結果として生じた外植体を、トランスジェニックアグロバクテリウムで２～３日間共培養し、次いで、チメンチンおよびハイグロマイシンを含む培地上で４～６週間暗所で培養して、胚形成カルスを生成させ、その後に、微光条件下で２週間転移培地に移した。次いで、カルスを再生培地に移して、芽および根を再生させ、その後に、土壌に移した。形質転換された植物を採取して、温室に移した。ＭＧＡＴ１コード領域は、Ｕｂｉプロモーターの制御下で、形質転換された植物の細胞において構成的に発現する。トランスジェニック植物を作製し、その組織を油含量に対し分析した。最初の形質転換で得られたトランスジェニックイベントの数が少なかったため、統計的に有意な結論は、そのデータからは示すことはできなかった。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、上で説明したようにホルデウムに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織は、含油量が増加する。
酵母細胞におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、酵母（この実施例では、サッカロミセス・セレビシエ、すなわち、発酵による油の生成に好適な真菌微生物）を形質転換した。遺伝的構築物Ｇａｌ１：ＭＧＡＴ１は、ＥｃｏＲＩ断片内に含まれる０９５４３６４＿ＭＧＡＴ＿ｐＭＡと命名した構築物のコード領域全体を、ｐＪＰ３３０１を生成するＥｃｏＲＩ部位のｐＹＥＳ２に挿入することによって作製した。同様に、ここでは比較として使用される、酵素Ａ．サリアナＤＧＡＴ１を別々にコードする遺伝的構築物Ｇａｌ１：ＤＧＡＴ１を、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１コード領域全体をｐＹＥＳ２に挿入することによって作製した。これらのキメラベクターを、熱衝撃によってＳ．セレビシエ株Ｓ２８８Ｃに導入し、形質転換体を、唯一の炭素源として２％のラフィノースを含む酵母最小培地（ＹＭＭ）プレート上に選択した。クローンの接種原培養物を、唯一の炭素源として２％のラフィノースを伴う液体ＹＭＭにおいて確立した。この培養物からの実験培養物を、初期のＯＤ６００が約０．３になるように、１％のＮＰ－４０を含むＹＭＭ培地中に接種した。培養物を、ＯＤ６００が約１．０になるまで、振盪（約１００ｒｐｍ）しながら２８℃で成長させた。この時点で、２％（ｗ／ｖ）の最終濃度になるように、ガラクトースを添加した。遠心分離によって収穫する前に、培養物を、振盪しながらさらに２５℃で４８時間インキュベートした。細胞ペレットを水で洗浄し、その後に、実施例１で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥した。Ｇａｌプロモーターは、形質転換された酵母細胞において誘導的に発現し、細胞における含油量が増加する。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、酵母細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、酵母に導入する。結果として生じたトランスジェニック細胞は、含油量が増加する。遺伝子はまた、含油量を増加させるために、油脂性酵母（ヤロウィア・リポリティカ）にも導入される。
藻類細胞クラミドモナス・ラインハーディにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、安定的に藻類細胞を形質転換する。ＭＧＡＴ１コード領域を、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターカセットおよびＣ．ラインハーディＲＢＣＳ２プロモーターによって発現するパロモマイシン耐性遺伝子（アミノグリコシド－Ｏ－ホスホトランスフェラーゼVIII）を含むクローニングベクターの中にクローン化することによって、３５Ｓ：ＭＧＡＴ１と命名した遺伝的構築物を作製する。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１を、改変したガラスビーズ法（Ｋｉｎｄｌｅ，１９９０）によって、５×１０７の対数的培養物ｃｃ５０３（クラミドモナス・ラインハーディの細胞壁欠損株）の中に別々に導入する。双方のベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子としてＢＬＥ耐性遺伝子も含む。簡潔には、非形質転換細胞の群体を、ＴＡＰ寒天培地プレート上で４日間にわたって約２４℃に保ち、１ｍＬあたり約５×１０６個の細胞まで成長させ、結果として生じた細胞を、室温で３分間、３０００ｇでペレット化し、再懸濁して３００μＬのＴＡＰ培地中に５×１０７個の細胞を生成する。３００μＬの直径０．６ｍｍのガラスビーズ、５μＬ中０．６μｇのプラスミド、および１００μＬの２０％のＰＥＧ ＭＷ８０００を添加し、混合物を、最高速度で３０秒間ボルテックスし、次いで、１０ｍＬのＴＡＰに移し、暗所で振盪しながら１６時間インキュベートする。細胞をペレット化し、２００μＬのＴＡＰ中に再懸濁し、次いで、５ｍｇ／Ｌのゼオシンを含むＴＡＰプレート上で平板培養し、暗所で３週間インキュベートする。形質転換された群体を、新鮮なＴＡＰ＋５ｍｇ／Ｌのゼオシンプレートに二次培養し、その後に、ゼオシン選択を伴う標準的な培地条件下で成長させる。遠心分離による収穫の後に、細胞ペレットを水で洗浄し、その後に、実施例１で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥する。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１プロモーターは、形質転換された藻細胞において構成的に発現する。細胞の含油量は、大幅に増加する。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、クラミドモナスに導入する。結果として生じたトランスジェニック細胞の含油量は、大幅に増加する。
安定的に形質転換したルピナス・アングスティフォリウスにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、ルピナス・アングスティフォリウス（マメ科の植物）を形質転換する。アグロバクテリウム中のキメラベクター３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を使用して、Ｐｉｇｅａｉｒｅ他（１９９７）によって説明されるようにＬ．アングスティフォリウスを形質転換する。簡潔には、茎頂外植体をトランスジェニックアグロバクテリウムとともに共培養し、その後に、ＰＰＴ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）で完全に湿潤し、ＰＰＴを含まない再生培地上に移す。茎頂から発育した複数の腋芽を、２０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含む培地上に摘出し、生存している芽を、２０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含む新鮮な培地上に移す。次いで、健康な芽を土壌に移す。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。種子特異的プロモーターは、トランスジェニックルピナス種子の含油量をさらに増加させるために使用される。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、ルピナスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子および栄養組織は、含油量が増加する。
ソルガム・バイカラーの安定的に形質転換した細胞におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１を含むキメラベクターを使用して、安定的にソルガム・バイカラーを形質転換する。Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１中のＵｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１を使用して、Ｇｕｒｅｌ他（２００９）によって説明されるように、ソルガム・バイカラーを形質転換する。最初に、アグロバクテリウムを、４℃で５分間、５，０００ｒｐｍで遠心分離し、液体共培養培地でＯＤ５５０＝０．４に希釈する。次いで、事前に単離した未成熟胚を、１５分間アグロバクテリウム懸濁液に完全に浸し、次いで、２４℃で２日間、暗所の共培養培地上で、胚盤側を上にして培養する。次いで、未成熟胚を、１００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを伴うカルス誘導培地（ＣＩＭ）に移してアグロバクテリウムの成長を阻害し、４週間そのままにする。次いで、組織を、再生培地に移して、発芽および発根させる。Ｕｂｉプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、少なくとも栄養組織における含油量が増加する。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、ソルガムに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織は、含油量が増加する。
グリシネ・マクの安定的に形質転換された植物におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、グリシネ・マク（油の生成に使用され得る別のマメ科植物）を安定的に形質転換する。アグロバクテリウム中の３５Ｓ：ＭＧＡＴ１を使用して、Ｚｈａｎｇ他（１９９９）によって説明されるように、Ｇ．マクを形質転換する。アグロバクテリウムを、５日目の苗木由来の子葉外植体とともに３日間共培養する。次いで、外植体を、１．６７ｍｇ／ＬのＢＡＰおよび５．０ｍｇ／Ｌのグルホシネートを補充したＧａｍｂｏｒｇのＢ５培地上で４週間培養し、その後に、外植体を、ＭＳ主要塩および副次塩、ならびに１．０ｍｇ／Ｌのゼアチンリボシド、０．５ｍｇ／ＬのＧＡ３、および１．７ｍｇ／Ｌまたは２．０ｍｇ／Ｌのグルホシネートで修正した０．１ｍｇ／ＬのＩＡＡを補充したＢ５ビタミン（ＭＳ／Ｂ５）を含む培地に二次培養する。延びた芽を、さらなるグルホシネート選択を伴わずに、０．５ｍｇ／ＬのＮＡＡを補充したＭＳ／Ｂ５発根培地上で発根させる。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、グリシンに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織および種子は、含油量が増加する。
安定的に形質転換したゼア・マイスにおけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、ゼア・マイスを安定的に形質転換する。３５Ｓ：ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を構成するベクターを使用して、Ｇｏｕｌｄ他（１９９１）によって説明されるように、ゼア・マイスを形質転換する。簡潔には、茎頂外植体を２日間トランスジェニックアグロバクテリウムとともに共培養し、その後に、カナマイシンおよびカルベニシリンを含むＭＳ塩培地上に移す。数回の継代培養の後に、形質転換された芽および根を自発的に形成させて、土壌に移植する。３５Ｓプロモーターは、形質転換された植物の細胞において発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、ゼア・マイスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の栄養組織および種子は、含油量が増加する。代替として、種子における増加した発現および増加した含油量のために、ゼインプロモーター等の胚乳特異的プロモーターまたは単子葉植物の植物から得られる胚の特異的プロモーターの制御下で、ＭＧＡＴコード領域を発現させる。Ａ．サリアナＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６等の、ホスファターゼ活性を伴うＧＰＡＴをコードするさらなるキメラ遺伝子を、ＭＧＡＴと組み合わせてゼア・マイスに導入すると、トウモロコシ種子における含油量がさらに増加する。
安定的に形質転換したエラエイス・ギネエンシス（パーム油）におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、エラエイス・ギネエンシスを安定的に形質転換する。アグロバクテリウム中のＵｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１と命名したキメラベクターを使用する。４８時間の活発な培養に続いて、細胞を使用してＩｚａｗａｔｉ他（２００９）によって説明されるようにエラエイス・ギネエンシスを形質転換する。Ｕｂｉプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、少なくとも果実および種子における含油量が増加し、油を得るために使用してもよい。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、エラエイスに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子は、含油量が増加する。
安定的に形質転換されたＡｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（オート麦）におけるＭＧＡＴの発現
Ｍ．マスクルスＭＧＡＴ１をコードするキメラ遺伝子を使用して、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ（別の単子葉植物）を安定的に形質転換する。上で説明したように、どちらもＵｂｉ：ＢＡＲ選択可能なマーカーを含むＵｂｉ：ＭＧＡＴ１およびＵｂｉ：ＤＧＡＴ１と命名したキメラベクターを使用して、Ｚｈａｎｇ（１９９９）によって説明されるように、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａを形質転換する。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域、植物細胞における発現を最適化したコドンを、前述した構築物のＭＧＡＴ１と置換し、Ａｖｅｎａに導入する。結果として生じたトランスジェニック植物由来の種子は、含油量が増加する。
実施例７．ＤＧＡＴ活性を伴うＭＧＡＴの操作
変化したＤＧＡＴ活性を伴うＭＧＡＴ、特にＤＧＡＴ活性の増加およびＭＧＡＴ活性の潜在的増加を、関心のＭＧＡＴ遺伝子に対してランダムな変異誘発、標的変異誘発、もしくは飽和変異誘発を行うことによって、または異なるＭＧＡＴおよび／もしくはＤＧＡＴ遺伝子をＤＮＡシャフリングに供することによって操作してもよい。ＤＧＡＴ機能は、例えば、４つの遺伝子（ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２）における変異を含むＨ１２４６株等の遊離脂肪酸を供給したときのＴＡＧ合成の相補に対する絶対要件を有する酵母株を使用することによって、陽性的にスクリーニングすることができる。そのような株におけるＭＧＡＴ変異形を形質転換し、次いで、野生型ＭＧＡＴ遺伝子によって相補を防止する遊離脂肪酸の濃度で、形質転換された酵母を供給することで、改善されたＤＧＡＴ活性により増加したＴＡＧ合成能力を伴う変異形の成長だけを可能にする。これらの変異した遺伝子のＭＧＡＴ活性は、標識したｓｎ－１またはｓｎ－２－ＭＡＧを供給し、標識したＤＡＧの生成を定量することによって判定することができる。合理的なタンパク質設計と組み合わせた数回の指向性進化は、類似したＭＧＡＴおよびＤＧＡＴ活性を伴う新しいＭＧＡＴ遺伝子の生成をもたらすであろう。
Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、０．１５ｍＭ ＭｎＣｌ２の存在下、ランダム変異を導入するために、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いたエラープローン（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲに供した。次いで、ランダム化コード領域を目がプライマーとして用いて、ハイ・フィデリティ（ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲ反応条件を用いて、酵母発現ベクター全体を増幅させた。回収された、変異ＤＮＡの９０９９ｂｐの配列解析により、変異頻度は約０．８％（８変異／遺伝子に相当、または、平均して５．３アミノ酸置換／ポリペプチド）であることが明らかとなった。変異ライブラリ全体を、－８０℃での保存およびプラスミド調製のために大腸菌ＤＨ５αへと形質転換した。ＭＧＡＴ１ライブラリのサイズは、３．８３５６Ｅ６クローンで推定された。ＭＧＡＴ１ライブラリのコピーを、酵母Ｈ１２４６株へと形質転換し、３Ｅ６クローンのライブラリサイズを得た。ＭＧＡＴ１ライブラリならびにｐＹＥＳ２陰性対照を、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨ１２４６へと形質転換し、それぞれ、最終濃度１ｍＭのＣ１８：１遊離脂肪酸の存在下、最小誘導培地（１％ラフィノース＋２％ガラクトース；ＯＤ６００＝０．３５－０．７まで希釈）中の希釈（再希釈）培養からなる、８ラウンドの選択に供した。陰性対照は、グルコース（２％）を含む最小培地、およびＣ１８：１遊離脂肪酸の存在下で、同時に増殖させた同一の培養からなる。８回の選択ラウンドの後、選択されたＭＧＡＴ１ライブラリのアリコートを、グルコース（２％）を含む最小培地に静置した。トータルで１２０のコロニーを、９６マイクロタイタープレート中、２４０μｌの最小誘導培地中で増殖させ、Siloto et al. (2009)により記述されるように、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ蛍光アッセイを用いて、中性脂質の産生量に対して分析した。プラスミドミニプレップは、最も高いＴＡＧレベルを示した１１３のクローン（＝トップ６％）から調製された。
選択されたクローンのＭＧＡＴ１コード領域全体を配列解析して、一意の突然変異体の数および、選択された変異の性質を特定する。一意のＭＧＡＴ１突然変異体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭＧＡＴおよびＤＧＡＴアッセイ（それぞれ、標識化ＭＡＧおよびＣ１８：１基質を用いる）のために、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＨ１２４６へと再度形質転換される（実施例５を参照のこと）。選択されたＭＧＡＴ１変異体は、野生型アシルトランスフェラーゼと比較して、ＤＧＡＴ活性の増加を示しつつ、ＭＧＡＴ活性もおそらく同様に増加することが見出される。
ＭＧＡＴおよび／またはＤＧＡＴ活性の増加を示すＭＧＡＴ１変異体を、ＤＮＡシャッフリング反応での母体として用いる。得られたライブラリを、上述と類似の選択システムに供し、アシルトランスフェラーゼ活性全体のさらなる改善が得られる。さらに、Ｃ１８：１以外の遊離脂肪酸を増殖培地へと添加し、変化したアシル－ドナー選択性を示すＭＧＡＴ１変異体を選択する。
実施例８．植物におけるＡ．サリアナ・ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ２の構成的発現
酵母（Ｗｅｓｅｌａｋｅ，２００９）、および昆虫細胞（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ，２００１）におけるＡ．サリアナＤＧＡＴ２の発現は、ＤＧＡＴ活性を示さなかった。同様に、ＤＧＡＴ２は、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１ノックアウト（Ｗｅｓｅｌａｋｅ他，２００９）を相補することができなかった。葉組織におけるＡ．サリアナＤＧＡＴ２の酵素活性は、実施例１において説明されるように、Ｎ．ベンサミアナ一過性発現系を使用して決定した。Ａ．サリアナＤＧＡＴ２（登録番号Ｑ９ＡＳＵ１）を、ゲノムＰＣＲによって得て、３５Ｓプロモーターの制御下で、バイナリー発現ベクターの中にクローン化して、３５Ｓ：ＤＧＡＴ２を生成した。このキメラベクターを、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１の中に導入し、これらの培養物由来の細胞を、対照として３５Ｓ：ＤＧＡＴ１を使用して、２４℃の成長室においてＮ．ベンサミアナ植物の葉組織に浸潤させた。いくつかの直接比較物に、比較する試料を浸潤させて、同じ葉の両側に置いた。実験は、３つ組で行った。浸潤の後、植物をさらに５日間成長させ、葉片を取り出し、その後に、実施例１で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥した。この分析は、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２がどちらも、ニコチアナ・ベンサミアナにおける葉油レベルを増加させるように機能していることを明らかにした（表８）。
３５Ｓ：ｐ１９構築物（陰性対照）で形質転換した葉組織は、乾燥葉重量１００ｍｇあたり平均２５μｇのＴＡＧを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築物（陽性対照）で形質転換した葉組織は、乾燥葉重量１００ｍｇあたり平均２４１μｇのＴＡＧを含んでいた。３５Ｓ：ｐ１９および３５Ｓ：ＤＧＡＴ２構築物で形質転換した葉組織は、乾燥葉重量１００ｍｇあたり平均５５１μｇのＴＡＧ由来の遊離脂肪酸を含んでいた。
上で説明したデータは、Ａ．サリアナＤＧＡＴ２酵素が、葉組織におけるＴＡＧの蓄積の促進において、Ａ．サリアナＤＧＡＴ１酵素よりも活性であることを示す。ＤＧＡＴ２遺伝子の発現は、ＤＧＡＴ１過剰発現株由来のＴＡＧ量が相対１００％として設定されたときと比較して、２２９％も多い葉組織におけるＴＡＧの蓄積をもたらした（図９）。
ｐ１９単独（対照）、またはＡｔＤＧＡＴ１もしくはＡｔＤＧＡＴ２のいずれかを伴うＰ１９を発現する、一過性に形質転換されたＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織をまた用いて、酵素活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのためのミクロソームを調製した。ＤＧＡＴ生化学アッセイは、５０μｇタンパク質に相当するミクロソームを用いて、ならびに、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した１０ｎｍｏｌｅの［１４］Ｃ６：０－ＤＡＧおよび５ｎｍｏｌｅのアシル－ＣｏＡ、ならびに最終体積１００μＬの１％ＢＳＡを各アッセイに対して添加することにより実施された。アッセイは、３０分間、３０℃で行われた。各アッセイからの総脂質が抽出され、ＴＬＣプレート上に試料をロードし、ヘキサン：ＤＥＥ：Ｈａｃ溶媒（７０：３０：１ ｖｏｌ：ｖｏｌ：ｖｏｌ）を用いて展開された。ＤＡＧおよびＴＡＧスポットの放射能の量を、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅ測定により定量した。ＴＡＧに転換されたＤＡＧのパーセンテージは、各ミクロソーム調製物に対して算出された。
Ｐ１９対照アッセイが低レベルのＴＡＧ産生を示したので、いくらかの内因性ＤＧＡＴ活性が、Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉において検出された。ＡｔＤＧＡＴ１の発現は、Ｐ１９対照と比較して、アッセイにＣ１８：１－ＣｏＡまたはＣ１８：２－ＣｏＡのいずれかを補った場合には、ＤＧＡＴ活性の増加を生じさせたが、Ｃ１８：３－ＣｏＡを補った場合には生じさせず、Ｐ1９対照とＡｔＤＧＡＴ１のＴＡＧレベルは同じものであった。しかしながら、ＡｔＤＧＡＴ２を葉組織で発現させた場合には、すべてのミクロソームアッセイにおいて、ＡｔＤＧＡＴ１ミクロソームと比較して、ＤＧＡＴ活性のレベル増加（ＴＡＧ産生）が観察された。Ｃ１８：１－ＣｏＡと比較して、Ｃ１８：２－ＣｏＡまたはＣ１８：３－ＣｏＡのいずれかをミクロソームに補った場合に、高いレベルのＴＡＧ産生が観察された（図１０）。このことより、ＤＧＡＴ２は、ＤＧＡＴ１よりも、異なる基質、特にＣ１８：３－ＣｏＡ（ＡＬＡ）に対するの優先傾向を有していることが示唆された。
実施例９．トランスジェニック種子におけるＭＧＡＴおよびＧＰＡＴの共発現
Ｙａｎｇ他（２０１０）は、Ａ．サリアナ由来の２つのグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６）がどちらも、Ｇ－３－Ｐからｓｎ－２－ＭＡＧを生成することができる、ｓｎ－２選好（すなわち、ｓｎ－１／３－ＭＡＧよりも選好的にｓｎ－２－ＭＡＧを形成する）およびホスファターゼ活性を有することを説明した（図１）。これらの酵素は、クチン合成経路の一部であることが提案された。ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６は、種子組織において高度に発現しなかった。そのような二機能性ＧＰＡＴ／ホスファターゼをＭＧＡＴと組み合わせることで、植物（特に油料種子）または他の細胞におけるＤＡＧ合成のための典型的なケネディ経路を置換または補充することができる基質としてＧ－３－Ｐを使用して、新しいＤＡＧ合成経路を生み出し、その結果、増加した含油量、特にＴＡＧレベルをもたらす。
植物種子における発現のためのＭ．マスクルスＭＧＡＴ２とともに、Ａ．サリアナＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６をコードする、それぞれ、ｐＪＰ３３８２およびｐＪＰ３３８３と命名したキメラＤＮＡを、ｐＪＰ３３７８を生ずるように、最初に、ＳｗａＩ断片内に含まれるＭＧＡＴ２コード領域全体をＳｍａＩ部位のｐＪＰ３３６２の中に挿入することによって作製した。ｐＪＰ３３６２は、選択可能なマーカーとして空のＦＡＥ１およびＦＰ１発現カセットならびにカナマイシン耐性遺伝子を含む、バイナリー発現ベクターであった。Ａ．サリアナＧＰＡＴ４を、ｃＤＮＡから増幅し、ＮｏｔＩ部位のｐＪＰ３３７８の中にクローン化して、短縮したナピンプロモーターＦＰ１によってＧＰＡＴ４が発現し、Ａ．サリアナＦＡＥ１プロモーターによってＭＧＡＴ２が発現する、ｐＪＰ３３８２を生じさせた。同様に、Ａ．サリアナＧＰＡＴ６を、ｃＤＮＡから増幅し、ＮｏｔＩ部位のｐＪＰ３３７８の中にクローン化して、ＧＰＡＴ６が短縮したナピンプロモーターＦＰ１に動作可能に連結され、Ａ．サリアナＦＡＥ１プロモーターによってＭＧＡＴ２が発現する、ｐＪＰ３３８４を生じさせた。ｐＪＰ３３８２およびｐＪＰ３３８３を、フローラルディップ法によって、Ａ．サリアナ（生態型コロンビア）に形質転換した。処理済みの植物由来の種子を、抗生物質（カナマイシン）を含む媒体上で平板培養して、形質転換された子孫植物（Ｔ１植物）を選択した。トランスジェニック苗木を、土壌に移して、温室で成長させた。発育胚における導入遺伝子の発現を判定した。最高レベルの発現を伴い、系統あたりのトランスジェニック：非トランスジェニックの比率が３：１を示し、単一座の導入遺伝子の挿入を示すトランスジェニック植物を選択し、成熟期まで成長させる。これらの植物（Ｔ２）から、一部が導入遺伝子に対してホモ接合性である種子を得た。各系統由来の３０～３２（Ｔ２植物）を、対照植物と共に、温室内にランダム配置した土壌ポッド中で成長させ、結果として生じた種子の脂質含量、ＴＡＧ含量、および脂肪酸組成を判定した。ＭＧＡＴおよび、ＧＰＡＴ４またはＧＰＡＴ６の両方を含む種子の総脂肪酸含量（総ＦＡＭＥから判定される）、特にＴＡＧ含量が、対照を超えて、３％近く（絶対値）または約９％（相対増加）まで、実質的に、および著しく増加し、および、ＭＧＡＴ単独、またはＡ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１単独を含む種子と比較して、増加していた（図１１）。
マウスＭＧＡＴ２遺伝子のコード領域（植物細胞での発現に最適化されたコドン）を、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＧＰＡＴ４をコードするキメラ遺伝子と共に、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓへと導入した。得られたトランスジェニック植物由来の種子を回収し、一部を分析した。これらの予備的分析から得られたデータより、油含量および脂肪酸組成においてばらつきがあることが示されたが、おそらく異なる時間、および異なる環境条件下で植物が成長したことが原因であると推測される。種子を植え、子孫植物を産生し、子孫種子を採取した。
実施例１０．GＰＡＴサイレンシングおよび変異によるＭＧＡＴ媒介ＴＡＧの増加に対するＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６の効果の試験
ＧＰＡＴファミリーは大きく、全ての既知のメンバーは、２つの保存されたドメイン、すなわち、ｐｌｓＣアシルトランスフェラーゼドメインおよびＨＡＤ様ヒドロラーゼスーパーファミリードメインを含む。これに加えて、Ａ．サリアナＧＰＡＴ４～８は全て、ホスホセリンホスファターゼドメインに相同的なＮ末端領域を含む。Ａ．サリアナＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ６はどちらも、ホスファターゼ活性に重要であることが知られている保存された残基を含む（Ｙａｎｇ他，２０１０）。
保存されたアミノ酸配列ＧＤＬＶＩＣＰＥＧＴＴＣＲＥＰ（配列番号２２８）に基づく縮重プライマーを、葉組織において発現するＮ．ベンサミアナＧＰＡＴ上の断片を増幅するように設計した。３’のＲＡＣＥを、これらのプライマー、およびＮ．ベンサミアナの葉組織から単離されるＲＮＡ上のオリゴ－ｄＴリバースプライマーを使用して行う。ホスファターゼ活性を伴うＧＰＡＴ（すなわち、ＧＰＡＴ４／６様）を、上で説明したＮ末端ホスホセリンホスファターゼのドメイン領域との相同性によって特定する。これらの遺伝子を標的とする３５Ｓ駆動ＲＮＡｉ構築物を、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１において生成させ、形質転換する。同様に、Ｖ２ウイルスサイレンシングサプレッサータンパク質を含む３５Ｓ：Ｖ２構築物を、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１において形質転換する。Ｖ２は、天然の植物サイレンシング機構を抑制して、有効な一過性発現を可能にするだけでなく、ＲＮＡｉに基づく遺伝子サイレンシングも機能させることが知られている。
次いで、ＴＡＧの蓄積を、以下の株混合物で浸潤した一過性に形質転換された葉の試料間で比較する。１）３５Ｓ：Ｖ２（陰性対照）、２）３５Ｓ：Ｖ２＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２（陽性対照）、３）３５Ｓ：Ｖ２＋ＧＰＡＴ－ＲＮＡｉ、４）３５Ｓ：Ｖ２＋ＧＰＡＴ－ＲＮＡｉ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２。３５Ｓ：Ｖ２＋ＧＰＡＴ－ＲＮＡｉ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２混合物は、ＧＰＡＴサイレンシングに起因して遮断されたｓｎ－２－ＭＡＧ合成のため、３５Ｓ：Ｖ２＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料よりもＴＡＧの蓄積が少なくなると予想される。
類似した実験を、ホスファターゼ活性に重要であることが知られている保存された残基（Ｙａｎｇ他，２０１０）を除去するように変異させた、Ａ．サリアナおよびＮ．ベンサミアナＧＰＡＴ４／６様配列を使用して行う。次いで、これらの変異させた遺伝子（集合的にＧＰＡＴ４／６－デルタとして知られる）を、３５Ｓ駆動発現バイナリベクターの中にクローン化し、Ａ．ツメファシエンスにおいて形質転換させる。次いで、ＴＡＧの蓄積を、以下の株混合物で浸潤した一過性に形質転換された葉の試料間で比較する。１）３５Ｓ：ｐ１９（陰性対照）、２）３５Ｓ：ｐ１９＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２（陽性対照）、３）３５Ｓ：ｐ１９＋ＧＰＡＴ４／６－デルタ、４）３５Ｓ：ｐ１９＋ＧＰＡＴ４／６－デルタ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２。３５Ｓ：ｐ１９＋ＧＰＡＴ４／６－デルタ＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２混合物は、ＧＰＡＴ変異に起因して遮断されたｓｎ－２－ＭＡＧ合成のため、３５Ｓ：ｐ１９＋３５Ｓ：ＭＧＡＴ２試料よりもＴＡＧの蓄積が少なくなると予想される。天然のＮ．ベンサミアナＧＰＡＴ４／６様遺伝子が存在することになるが、この実験では、ＧＰＡＴ４／６－デルタ構築物の高レベルの発現が、Ｇ－３－Ｐ基質を利用する内因性遺伝子に勝ることが予想される。
実施例１１．植物細胞におけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよびＷＲＩ１転写因子の構造的発現
３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４と指定されるベクターを、３５Ｓプロモーターを含むＰｓｔＩ断片を、末端を平滑化するためのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理の後、ベクターｐＯＲＥ０４のＳｆｏＩ部位へと挿入することにより作製した（Coutu et al., 2007）。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＤＧＡＴ１をコードする遺伝的構築物３５Ｓ：Ａｒａｔｈ－ＤＧＡＴ１（Bouvier-Nave et al., 2000）を作製した。ＷＯ２００９／１２９５８２の実施例３において、ｐＸＺＰ１６３におけるＡｔＤＧＡＴ１の構築が記載されている。ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶ末端を有するＰＣＲ増幅断片を、ｐＸＺＰ１６３から作製し、ｐＥＮＴＲ１１へと挿入して、ｐＸＺＰ５１３Ｅを作製した。ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＶ断片内に含有されているｐＸＺＰ５１３ＥのＡｔＤＧＡＴ１コード領域全体を、ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＶ部位で、３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４へと挿入し、ｐＪＰ２０７８を作製した。ＥｃｏＲＩ制限酵素部位に隣接し、Ｂ．ｎａｐｕｓに対して最適化されたコドンの、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１転写因子をコードする合成断片、Ａｒａｔｈ－ＷＲＩ１（Cernac and Benning, 2004）を合成した。３５Ｓ：Ａｒａｔｈ－ＷＲＩ１と指定される遺伝的構築物を、ＥｃｏＲＩ部位に隣接しているＡｒａｔｈ－ＷＲＩ１のコード領域全体を、ＥｃｏＲＩ部位で３５Ｓ－ｐＯＲＥ０４内へとクローニングすることにより作製し、ｐＪＰ３４１４を作製した。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織における遺伝子の発現は、実施例１に記述される一時的な発現系に従い、実施された。
Ｉａｔｒｏｓｃａｎによる、浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＴＡＧレベルの定量により、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１遺伝子の組み合わせ発現により、ＷＲＩ１およびＶ２陰性対照の発現と比較して、それぞれ、ＴＡＧ含量の４．５倍、１４．３倍の増加がもたらされたことが明らかとなった（表９）。これは、乾燥葉重量当たりの平均および最大ＴＡＧ産生量で観察されたものと一致しており、それぞれ、５．７％と６．５１％であった（表９および図１２）。葉油における増加は、単に、過剰発現されたＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼの活性によるものだけではなく、ＷＲＩ１が組み合わせから除外された場合にも、ＴＡＧレベルの減少が明白であった。さらに、総ＴＡＧ増加の４８％を占める、相乗効果が観察された。
ＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１構築物の両方がまた、浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＴＡＧ分画において、リノール酸を犠牲にした、オレイン酸のレベルの増加がもたらされた（表１０）。これらの結果より、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼで形質転換された、トランスジェニックタバコ植物のＴＡＧ、リン脂質およびＴＦＡ脂質分画における同様のシフトを報告した、Andrianov et al. (2010)による最近の発見が裏付けられる。しかしながら、ＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１遺伝子を共発現させた場合、相乗効果が、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のオレイン酸の蓄積に認められ、この相乗効果は、推定で、両方の遺伝子が発現された場合の総オレイン酸含量の５２％を構成する。トランスジェニックＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉における、ＴＡＧ蓄積およびオレイン酸レベルの両方に対する予想外の相乗効果から、生育組織中の脂肪酸生合成および非極性脂質（たとえば、ＴＡＧ）へのアシル取込の、発達中の油糧種子中で高度に活性化されている、２つの代謝過程を同時に亢進させる可能性が示された。
Ｖ２サプレッサーが置換されたＰ１９ウイルスサイレンシングサプレッサーを除いて、一時的な発現の実験を繰り返し、任意の葉間のばらつきを避けるために、同じ葉の試料を注意深く観察した。このため、トマトブッシースタントウイルス（ｔｏｍａｔｏ ｂｕｓｈｙ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓ）Ｐ１９ウイルスサイレンシングサプレッサータンパク質（Wood et al., 2009）の発現のためのキメラ３５Ｓ：Ｐ１９構築物を、共浸潤のために、別々に、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＧＶ３１０１へと導入した。
本実験における、Ｉａｔｒｏｓｃａｎによる浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＴＡＧレベルの定量により、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１遺伝子の同時の一時的発現により、Ｐ１９陰性対照と比較して、１４１倍のＴＡＧ含量の増加がもたらされることが明らかとなった（図１３）。同じ葉で、ＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１遺伝子が別々に発現する場合と比較すると、同時浸潤により、それぞれ、１７倍、および５倍、ＴＡＧレベルが増加した。再び、両方の遺伝子の共発現により、総ＴＡＧ増加の７３％を占める、相乗的成分の葉油蓄積の相乗効果（付加的効果よりも大きい）があった。以前の実験（１４．３倍）と比較して、本実験のＴＡＧ含量のより大きい増加の程度は（１４１倍）、Ｖ２ではなくＰ１９サイレンシングサプレッサーを使用し、ゆえに導入遺伝子からの遺伝子発現が増加した可能性がある。
表１１において、ＴＡＧの脂肪酸組成を示す。ＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１遺伝子がＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａで共発現された際、葉ＴＡＧ分画におけるオレイン酸蓄積のレベルに対する相乗効果が再び観察された。この増加は、中間鎖不飽和脂肪酸パルミチン酸およびステアリン酸を犠牲にして、より大きかった（表１１）。リノール酸もまた増加したが、内因性ＦＡＤ２ Δ１２－デサチュラーゼに利用可能なオレイン酸基質レベルが高いことにより説明できる。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１の個々の発現により、オレイン酸の大きな増加を伴わずにＴＡＧプロファイルにおける中間の変化がもたらされた。さらに、最初の実験とは対照的であるが、αリノレン酸（ＡＬＡ）が高いレベルで検出された一方で、葉組織でのＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１の共発現では、これはより低い程度で観察された。
ＴＡＧ生合成に対するＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１発現の観察された相乗効果が、同じ葉の中で、対照としてのＰ１９遺伝子単独の導入と比較して、両遺伝子を個々に、または組み合わせて、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａへと導入した効果を比較することにより、より詳細に確認された。これは、葉間のばらつきの減少に有益であった。さらに、反復の回数を５回まで増加させ、データの質を改善するために、同じ植物由来の異なる各葉で、試料をプールした。結果を表１２に示す。

表８ ３５Ｓ：ｐ１９、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１および３５Ｓ：ＤＧＡＴ２構築物で一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織における、ＴＡＧの脂肪酸プロファイルおよび定量。
Figure 0007097805000009
表９ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１および３５Ｓ：ＷＲＩ１で一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織における、ＴＡＧレベル
Figure 0007097805000010
表１０ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１および３５Ｓ：ＷＲＩ１で一過性に形質転換されたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織において生成されたＴＡＧの脂肪酸組成（３つ組浸潤からのデータ）
Figure 0007097805000011
表１１ ３５Ｓ：Ｐ１９（対照）、３５Ｓ：ＷＲＩ１および／または３５Ｓ：ＤＧＡＴ１構築物で一過性に形質転換されたＮ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉組織において生成されたＴＡＧの脂肪酸組成
Figure 0007097805000012
表１２ 単一遺伝子と共に、ＷＲＩ１＋ＤＧＡＴ１の比較
Figure 0007097805000013
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける発現に対する、ＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１遺伝子両方の個々の効果に基づくと、単なる付加的な効果で（いずれの相乗効果も無い）、本発明から、Ｐ１９陰性対照と比較して、約０．３５～３５倍のＴＡＧレベルの増加が期待される。しかしながら、両遺伝子の導入により、Ｐ１９対照よりも１２９倍高いＴＡＧレベルがもたらされた。これらの結果に基づくと、本発明者らは、ＴＡＧ蓄積に対する付加的な効果と相乗的な効果は、それぞれ、２６．９％と７３．１％であると推定した。さらに、葉試料中の総脂質の脂肪酸組成をＧＣで分析した際、ＷＲＩ１およびＤＧＡＴ１で浸潤されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＴＡＧ分画のＣ１８：１Δ９のレベルに対する相乗的な効果が観察された（各々３回繰り返し）。データを表１１に示す。
ＷＲＩ１＋ＤＧＡＴ１の組み合わせの種子特異的発現に対し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａを、ｐＦＡＥ１：：ＷＲＩ１およびｐＣｌｎ２：：ＤＧＡＴ１遺伝子の両方を有するキメラＤＮＡを有するバイナリーベクター構築物、または、比較のために、ｐＦＡＥ１：：ＷＲＩ１または、ｐＣｌｎ２：：ＤＧＡＴ１の単一遺伝子を有するキメラＤＮＡを含むバイナリーベクター構築物で形質転換した。Ｔ１種子を、植物から採取した。種子の油含量を測定する。種子は、油含量が増加している。
実施例１２．植物細胞における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよびＷＲＩ１転写因子の構造的発現
Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２（Cao et al., 2003; Yen and Farese, 2003）をコードし、およびＢ．ｎａｐｕｓに対しコドン最適化されたキメラＤＮＡを、Ｇｅｎｅａｒｔにより合成した。３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２と指定される遺伝的構築物を、ＥｃｏＲＩ断片内含有される、１０２２３４１＿ＭｕｓｍｕＭＧＡＴ２のコード領域全体を、ｐＪＰ３３４３のＥｃｏＲＩ部位で挿入することにより作製し、ｐＪＰ３３４７を作製した。３５Ｓ：Ａｒａｔｈ－ＷＲＩ１構築物のクローニングは、実施例１１に記述されている。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織における一過性の発現は、実施例１に記述されるように実施した。
マウスＭＧＡＴ２およびＡ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１転写ベクターを共発現した際、平均Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉ＴＡＧレベルは、ＷＲＩ１単独の発現と比較して、３．３倍、増加した（表１３）。さらに、２つの遺伝子の発現により、葉ＴＡＧの蓄積に対し、わずかな（２９％）相乗効果がもたらされた。ＷＲＩ１の存在下でのＭＧＡＴ２遺伝子で得られたＴＡＧレベルは、３．７８％（Ｉａｔｒｏｓｃａｎにより定量）であった（図１２）。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１との組み合わせで、動物ＭＧＡＴ２および植物ＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼと得られた結果も類似していることから、相乗効果は、ＷＲＩおよびアシルトランスフェラーゼが、非油蓄積生育植物組織において過剰発現される際の一般的な現象であろうことが示唆される。
２つの各植物に対し、同じ植物由来の３つの葉全体にわたる浸潤葉試料がプールされるように、実験を繰り返して、Ｖ２＋ＭＧＡＴ２＋ＷＲＩ１と比較して、Ｖ２＋ＭＧＡＴ２を発現する構築物を導入した。全体で、各組合せで、６つの反復浸潤を行った。これにより、最初の実験で行われた異なる植物間の葉試料プールよりも、標準偏差が小さくなった。この実験のデータを表１４に示す。初期の結果（表１３）が裏付けられた。絶対ＴＡＧレベルは異なるが（Ｂｅｎｔｈ分析に固有であり、また試料のプールも異なる）、ＷＲＩ１がＶ２＋ＭＧＡＴ２と共発現する場合のＴＡＧの相対増加は類似している（２．４５～２．６５倍）。
実施例１３．植物細胞における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよび、ＷＲＩ１転写因子の構造的発現
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＤＧＡＴ１、マウスモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＭＧＡＴ２、およびＡ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１をコードする遺伝子を、実施例１に記述される一過性の発現システムに従い、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中で、異なる組み合わせで発現させた。異なる構築物の詳細な記述については、実施例１１および１２において記述されている。
ＤＧＡＴ１、ＷＲＩ１およびＭＧＡＴ２遺伝子の組み合わせ発現により、後者２つの発現と比較して、ほぼ３倍の平均ＴＡＧのさらなる増加がもたらされた（表１５）。ＴＡＧ産生量の得られた最大の結果は、７．２８％であった（Ｉａｔｒｏｓｃａｎにより定量）（図１２）。葉ＴＡＧレベルは、マウスＭＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼの遺伝子がこの組み合わせから除外された場合には、それほど影響を受けなかった。しかしながら、実施例１６に記述される結果から、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１およびＳｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍオレオシンタンパク質との組み合わせで発現された場合には、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉中の中性脂質の生合成に対するマウスＭＧＡＴ２の正の効果がはっきりと示された。

表１３ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２および３５Ｓ：ＷＲＩ１で一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧレベル
Figure 0007097805000014
 表１４ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料のＴＡＧ含量
Figure 0007097805000015
 表１５ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２および３５Ｓ：ＤＧＡＴ１および３５Ｓ：ＷＲＩ１で一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧレベル
Figure 0007097805000016
付加的なデータは、葉試料が、同じ植物中の葉全体にわたるプールである（それぞれ、６回反復）、さらなる実験から得られた。データを表１６に示す。
表１６ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料のＴＡＧ含量
Figure 0007097805000017
実施例１４．植物細胞における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ジアシセロールアシルトランスフェラーゼ、ＷＲＩ１転写因子、およびグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼの構造的発現
３５Ｓ：ＧＰＡＴ４遺伝的構築物を、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＧＰＡＴ４遺伝子（Zheng et al., 2003）を発達中の長角果から単離されたトータルＲＮＡからクローニングすることにより作製し、次いで、ＥｃｏＲＩ断片としてｐＪＰ３３４３に挿入することにより、ｐＪＰ３３４４を得た。他の構築物は、実施例１１および１２に記述されている。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織における一過性の発現は、実施例１に記述されるように行った。
ＭＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１およびＷＲＩ１と組み合わせた、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＧＰＡＴ４アシルトランスフェラーゼの一過性の発現により、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉ＴＡＧ含量におけるわずかな減少がもたらされた（Ｉａｔｒｏｓｃａｎで定量）（表１７）。ＧＰＡＴ４が浸潤混合物に含まれる場合もまた、ＴＡＧレベル（５．７８％）が低くなることが見出された（図１２）。しかしながら、この発見は、ＧＰＡＴ４アシルトランスフェラーゼにより触媒される、Ｇ３Ｐからのｓｎ２－ＭＡＧ合成の生合成という仮説を除外しない。むしろ、この触媒ステップは、内因性ＧＰＡＴ４遺伝子の高度な発現レベルによって、葉組織中で律速段階となっている可能性は低いことが示唆される（Li et al., 2007）。さらに、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＧＰＡＴ８アシルトランスフェラーゼは、ＧＰＡＴ４と類似の発現プロファイルを示し、重複する機能を示すことが判明している（Li et al., 2007）。発達中の種子中で、ＧＰＡＴ４およびＧＰＡＴ８の発現レベルは低い。結果として、種子環境中でのＧＰＡＴ４の共発現が、異種発現ＭＧＡＴアシルトランスフェラーゼに対する十分量のｓｎ２－ＭＡＧ基質を確保するために極めて重要である可能性がある。

表１７ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：ＧＰＡＴ４で一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧレベル
Figure 0007097805000018
追加のデータが、葉試料が、同じ植物中の葉全体にわたるプールである（それぞれ、６回反復）、さらなる実験から得られた。データを表１８に示す。
表１８ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料のＴＡＧ含量
Figure 0007097805000019
 ┌──────────────┬────────────┬───────────┐
遺伝子の組み合わせ │TAG (乾重量％) 比率 │
├──────────────┼────────────┼───────────┤
V2+MGAT2+DGAT1 │1.54 ± 0.36 1.01 │
├──────────────┼────────────┤ │
V2+MGAT2+DGAT1+GPAT4 │1.56 ± 0.18 │ │
└──────────────┴────────────┴───────────┘
実施例１５．植物細胞における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ジアシセロールアシルトランスフェラーゼ、ＷＲＩ１転写因子およびＡＧＰａｓｅ－ｈｐＲＮＡｉサイレンシング構築物の構造的発現
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍＡＧＰａｓｅ小サブユニット（ＤＱ３９９９１５）(Kwak et al., 2007)をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド５９５～１１８７に対応するＤＮＡ断片を合成した。５９３ｂｐ １１１８５０１＿ＮｔＡＧＰ断片を、最初に、ＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理し、５´平滑末端を作製し、最後に、ＸｈｏＩで制限酵素消化した。同様に、ｐＥＮＴＲ１１－ＮＣＯＩエントリーベクターを、最初にＢａｍＨＩで制限酵素消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理し、そしてＸｈｏＩで切断した。ｐＥＮＴＲ１１－ＮＣＯＩへの１１１８５０１＿ＮｔＡＧＰインサートのライゲーションにより、ｐＥＮＴＲ１１－ＮＣＯＩ－ＮｔＡＧＰエントリークローンが作製された。ｐＥＮＴＲ１１－ＮＣＯＩ－ＮｔＡＧＰエントリークローンとｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ１２デスティネーションベクターの間のＬＲ組換えにより、３５Ｓプロモーターの制御下で、ＮｔＡＧＰａｓｅ ＲＮＡｉカセットを含むバイナリーベクターである、ｐＴＶ３５が作製された。他の構築物は、実施例１１および１２に記述される。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織における一過性の発現は、実施例１に記述されるように実施された。
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍＡＧＰａｓｅサイレンシング構築物と、ＭＧＡＴ２およびＷＲＩをコードする遺伝子の共発現により、葉ＴＡＧレベルの１．７倍の増加がもたらされた（Ｉａｔｒｏｓｃａｎにより定量）（表１９）。ＭＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼ、の非存在下では、ＴＡＧレベルはおよそ３倍にまで落ちた。それゆえ、観察されたＴＡＧの増加は、内因性のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＡＧＰａｓｅ遺伝子のサイレンシングのみに起因するものであり得ない。驚いたことに、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１をＭＧＡＴ２で置換しても、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍＡＧＰａｓｅサイレンシング構築物との組み合わせで、浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＴＡＧレベルは変化しなかった。それゆえ、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＡＧＰａｓｅのサイレンシングは、ＭＧＡＴおよびＤＧＡＴアシルトランスフェラーゼに対し異なる代謝効果を有していると思われる。同様の差異がまた、ＭＧＡＴ２またはＤＧＡＴ１と組み合わせたＷＲＩ１およびＡＧＰａｓｅサイレンシング構築物での最大観察ＴＡＧレベルにおいて観察される（それぞれ、６．１６％および５．５１％葉油を産生）（図１２）。

表１９ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：ＡＧＰａｓｅ－ｈｐＲＮＡｉで一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧレベル
Figure 0007097805000020
ＡＧＰａｓｅサイレンシングと組み合わせたＷＲＩ１およびＭＧＡＴの過剰発現は、デンプン蓄積組織中における油の産生量の増加を特に期待させる。例としては、たとえばジャガイモの茎、および穀草類の内胚乳が挙げられ、穀藻類の穀物の油含量増加をもたらす可能性がある（Barthole et al., 2011）。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍおよびＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＡＧＰａｓｅ遺伝子は有意な配列同一を有する可能性がありそうだが、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＡＧＰａｓｅ－ｈｐＲＮＡｉ構築物は、サイレンシング効率の改善により、さらにＴＡＧ産生量を増加させる可能性がある。
追加のデータが、葉試料が、同じ植物中の葉全体にわたるプールである（それぞれ、６回反復）、さらなる実験から得られた。データを表１９および２０に示す。
表２０ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料のＴＡＧ含量
Figure 0007097805000021
実施例１６．植物細胞における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ジアシセロールアシルトランスフェラーゼ、ＷＲＩ１転写因子およびオレオシンタンパク質の構造的発現
３５Ｓプロモーターの制御下、Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ種子オレオシン（Scott et al., 2010）をコードする遺伝子を含むｐＲＳｈ１バイナリーベクターが、Ｎ．Ｒｏｂｅｒｔｓ博士（ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）から提供された。他の構築物は、実施例１１および１２に記述される。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織における一過性発現は、実施例１に記述されるように実施した。
ゴマオレオシンタンパク質を、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ転写因子およびＭ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２トランスフェラーぜと共に発現した際、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＴＡＧレベル（Ｉａｔｒｏｓｃａｎで定量）は、２．２倍増加したことが判明した（表２１）。葉ＴＡＧ脂肪酸プロファイルにおける有意な変化は検出されなかった（表２２）。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼが含まれた場合、ＴＡＧにおけるわずかな増加がまた、観察された。Ｖ２陰性対照と比較して、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１およびゴマオレオシンタンパク質の組み合わせ発現により、３倍のＴＡＧ増加と、７．７２％の最大観察ＴＡＧレベルがもたらされた（表２１および図１２）。葉のＴＡＧレベルは、ＭＧＡＴ２アシルトランスフェラーゼを含むことで、さらに２．５倍増加した。これは、乾重量ベースで、平均５．７％、最大観察の１８．８％のＴＡＧに対応する。ＭＧＡＴ２が含まれる場合の葉ＴＡＧのさらなる増加により、トランスジェニック葉組織の中性脂質の生合成および蓄積に対する、このアシルトランスフェラーゼの正の効果が明確に示されている。
Ｖ２およびＶ２＋ＭＧＡＴ２＋ＤＧＡＴ１＋ＷＲＩ１＋オレオシンを発現する遺伝子の組み合わせで実験が繰り返され、異なるＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において、同じ植物由来の葉全体にわたりプールされた試料で、それぞれ、１２回の反復浸潤で検証された。データを表２３に示す。反復サンプルも、同じ植物由来の葉全体にわたりプールされた（各浸潤に対し６回の繰り返し）：データを表２４および表２５に示す。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の浸潤により、葉油（ＴＡＧ）のレベル増加がもたらされたが、総脂質含量の有意な増加は検出されず、このことから、異なる脂質プールからＴＡＧへの脂肪酸の再分配が発生したことが示唆される。対照的に、ＭＧＡＴ２遺伝子がＤＧＡＴ１、ＷＲＩ１およびオレオシン遺伝子と共発現された場合、総脂質は、２．２１倍増加し、このことから、葉脂質の合成における、純増加が示される。
実施例１７．植物細胞における、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ＷＲＩ１転写因子およびＦＡＤ２－ｈｐＲＮＡｉサイレンシング構築物の構造的発現
３５Ｓプロモーター制御下の、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＦＡＤ２ ＲＮＡｉカセットを、ベクターｐＦＮ０３３を作製するために、ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ８デスティネーションベクターへのＬＲ組換えにより得た。他の構築物は、実施例１１および１２に記述される。

表２１ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：オレオシンで一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧレベル
Figure 0007097805000022
 表２２ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：オレオシンで一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧ脂肪酸プロファイル
Figure 0007097805000023
 表２３ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料のＴＡＧ含量
Figure 0007097805000024
 表２４ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料のＴＡＧ含量
Figure 0007097805000025
 表２５ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料の総脂肪酸含量
Figure 0007097805000026
マウスのモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＭＧＡＴ２、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼＤＧＡＴ１、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１および、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａＦＡＤ２ Δ１２－脂肪酸デサチュラーゼヘアピンＲＮＡｉ構築物（Wood et al.、出版準備中の原稿）をコードする遺伝子を、実施例１に記述される、一過性の発現系を用いて、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中で、組み合わせで発現した。
同様の変化が、ＷＲＩ１、ＭＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１およびＦａｄ２サイレンシング構築物で浸潤されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のＴＡＧ、極性脂質およびＴＦＡの脂肪酸組成において、観察された（表２６～２８）。３つすべての脂質分画において、オレイン酸のレベルがさらに増加し、極性脂質のほぼ２０％、ＴＦＡの４０％、およびＴＡＧの５５％超にまで達した。この増加は、主に、小胞体ＦＡＤ２ Δ１２－デサチュラーゼに対するサイレンシング効果を反映する、リノール酸の消費から来ていた。ＴＦＡおよび極性脂質のレベルが影響を受けなかった一方で、葉ＴＡＧもまた、含有されるαリノレン酸が少なかった。
これらの実験は繰り返され、ＴＡＧ、極性脂質および総脂質に対し、脂肪酸組成が測定され、その結果（表２９）は、最初の実験と一致していた。

表２６ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：ＦＡＤ２－ｈｐＲＮＡｉで一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織中のＴＡＧ脂肪酸プロファイル
Figure 0007097805000027
 表２７ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：ＦＡＤ２－ｈｐＲＮＡｉで一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織から単離された、極性脂質の脂肪酸プロファイル
Figure 0007097805000028
 表２８ ３５Ｓ：Ｖ２、３５Ｓ：ＭＧＡＴ２、３５Ｓ：ＤＧＡＴ１、３５Ｓ：ＷＲＩ１および３５Ｓ：ＦＡＤ２－ｈｐＲＮＡｉで一過性に形質転換された３つ組のＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織から単離された、総脂質の脂肪酸プロファイル
Figure 0007097805000029
 表２９ 浸潤Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉試料中のＴＡＧ、極性脂質および総脂質の脂肪酸組成
Figure 0007097805000030
Figure 0007097805000031
実施例１８．安定的な形質転換による、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞中のＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２の発現
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける構造的発現
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２の酵素活性が、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて、実証された。キメラベクターである、３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２を、標準的なエレクトロポレーション法を介して、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１へと導入し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充した固形ＬＢ培地上で増殖させ、２日間、２８度でインキュベートした。単一コロニーを用いて、新たな培養を開始した。十分な通気で４８時間培養した後、細胞を２０００ｘｇの遠心により回収し、上清を除去した。細胞を新たな溶液（５０％ＬＢおよび５０％ＭＳ培地を含有）中で、ＯＤ６００＝０．５の密度で再懸濁した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、無菌で成長させたＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物の葉試料を、切り取り、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ溶液に浸しながら、鋭利なメスで、約０．５～１ｃｍ２のサイズの正方形断片に切断した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに浸された、傷ついたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉の一片を、１０分間、室温で静置させ、その後、無菌のろ紙上で、乾燥させてブロットし、補充を行うことなくＭＳプレート上にトランスファーした。２４℃で２日間、共培養した後、外殖片を滅菌ＭＳ培地液で３回洗浄し、最後に、滅菌ろ紙で乾燥させてブロットし、選択寒天凝固ＭＳ培地（１．０ｍｇ／Ｌのベンシルアミノプリン（ｂｅｃｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ、ＢＡＰ）、０．２５ｍｇ／Ｌのインドール酢酸（ＩＡＡ）、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充）上に静置し、２週間、２４℃でインキュベートし、形質転換されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉ディスクから、若枝を発達させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスジェニック植物を確立するために、健康な緑の若枝を切断し、新しい２００ｍＬの組織培養ポット（２５μｇ／Ｌ ＩＡＡおよび５０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムを補充した寒天凝固ＭＳ培地を含有）へと移した。
ＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２導入遺伝子の発現を、リアルタイムＰＣＲにより決定した。高度に発現している株を選択し、その種子を採取した。個の種子を、直接、土壌に植え、４週間後、苗の隔離群を採取した。高度に発現している事象を選択し、土壌へ直接植え付けられ、３０の苗の隔離群が得られたものから種子が産生された。３週間後、ＤＮＡ抽出のために葉のディスクを各苗から採取し、次いで、ＰＣＲを行い、どの株が導入遺伝子に対してトランスジェニックであり、およびヌルであるかを決定した。次いで、土壌を洗い、凍結乾燥された各苗から得た空中の組織全体と共に、群を採取した。各試料の乾重量および単離された総脂質を記録した。これらの総脂質試料中のＴＡＧは、ＴＬＣ－ＦＩＤおよびで定量化し、各試料中の内部標準（ＤＡＧＥ）に対するＴＡＧの比率を測定した（図１４）。３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２株３３４７－１９のトランスジェニック苗木中の平均ＴＡＧレベルは、ヌルの苗木中の平均ＴＡＧレベルよりも、４．１倍高いことが判明した。最も大きなＴＡＧの増加を有する事象は、ヌルイベントの平均よりも、７．３倍高いＴＡＧを有していた。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおける構造的発現
Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ１およびＭＧＡＴ２の酵素活性が、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａにおいて示された。キメラベクターである、３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ１および３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２と共に、空ベクター対照ｐＯＲＥ０４を、フローラルディップ（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ）法により、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａに形質転換し、初代形質転換体由来の種子が、カナマイシン培地上で選択された。これらのＴ１植物由来のＴ２種子を採取し、各植物由来の種子のＴＦＡを決定した（図１５）。平均ＴＦＡ ｍｇ／種子 ｇは、対照のｐＯＲＥ０４株については、１３９±１３（中央値は１３６．０）、３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ１株については、１５２±１４（中央値は１５５．１）、そして３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２については１５５±１１（中央値は１５４．７）であった。このことより、対照と比較して、３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ１は９．７％、３５Ｓ：Ｍｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２は１２．１％、平均ＴＦＡが増加したことが示された。
実施例１９．追加の遺伝子
油のさらなる増加
付加的な遺伝子を、上述の組み合わせと並行して検証し、さらなる油の増加が得られるかどうかを決定する。これらには、以下が含まれる：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇｅｎｅｓ：ＡＴ４Ｇ０２２８０、スクロースシンターゼＳＵＳ３；ＡＴ２Ｇ３６１９０、インベルターゼＣＷＩＮＶ４；ＡＴ３Ｇ１３７９０、インベルターゼＣＷＩＮＶ１；ＡＴ１Ｇ６１８００、グルコース６リン酸：リン酸トランスロケーターＧＰＴ２；ＡＴ５Ｇ３３３２０、ホスホエノールピルビン酸トランスポーターＰＰＴ１；ＡＴ４Ｇ１５５３０、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ プラスチド－ＰＰＤＫ；ＡＴ５Ｇ５２９２０、ピルビン酸キナーゼｐＰＫ－β１。これらの酵素をコードする遺伝子を合成し、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける検証のために、ＥｃｏＲＩ断片として、構造的バイナリー発現ベクターｐＪＰ３３４３へとクローニングする。
ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１、ＭＧＡＴ２およびオレオシンの組み合わせにいくつかの遺伝子が追加され、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉で発現された際、ＴＡＧレベルの付加的な増加は観察されなかった：すなわち、サフラワーＰＤＡＴ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＤＡＴ１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＧＡＴ２、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ カレオシン、ピーナッツオレオシン、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ヘモグロビン２、ホモサピエンスｉＰＬＡｈ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＧＰＡＴ４、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｇ３Ｐデヒドロゲナーゼ、酵母Ｇ３Ｐデヒドロゲナーゼ、ｃａｓｔｏｒ ＬＰＡＡＴ２、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ベータ－フルクトフラノシダーゼ（ＡＴＢＦＲＵＣＴ１、ＮＭ＿１１２２３２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ベータ－フルクトフラノシダーゼ（ｃｗＩＮＶ４、ＮＭ＿１２９１７７）であり、このことから、これらの酵素活性は、一過性に発現された際のＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける律速段階ではなかったことが示唆される。このことからは、安定的に形質転換された植物、たとえば、種子中、または他の生物中で、これらの効果が無いとは示唆されない
相加的、または相乗的な油増加活性に対して、さらに追加の遺伝子を検証した。これらには、以下のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ遺伝子モデル、またはそれらのコードされたタンパク質、および他の種由来のホモログ（推定機能によりグループ化され、従前に、組織中で、油含量を増加させながら発現上昇されることが示されている）が含まれる。スクロース分解に関与する遺伝子／タンパク質：ＡＴ１Ｇ７３３７０、ＡＴ３Ｇ４３１９０、ＡＴ４Ｇ０２２８０、ＡＴ５Ｇ２０８３０、ＡＴ５Ｇ３７１８０、ＡＴ５Ｇ４９１９０、ＡＴ２Ｇ３６１９０、ＡＴ３Ｇ１３７８４、ＡＴ３Ｇ１３７９０、ＡＴ３Ｇ５２６００。酸化ペントースリン酸経路に関与する遺伝子／タンパク質：ＡＴ３Ｇ２７３００、ＡＴ５Ｇ４０７６０、ＡＴ１Ｇ０９４２０、ＡＴ１Ｇ２４２８０、ＡＴ５Ｇ１３１１０、ＡＴ５Ｇ３５７９０、ＡＴ３Ｇ０２３６０、ＡＴ５Ｇ４１６７０、ＡＴ１Ｇ６４１９０、ＡＴ２Ｇ４５２９０、ＡＴ３Ｇ６０７５０、ＡＴ１Ｇ１２２３０、ＡＴ５Ｇ１３４２０、ＡＴ１Ｇ１３７００、ＡＴ５Ｇ２４４１０、ＡＴ５Ｇ２４４２０、ＡＴ５Ｇ２４４００、ＡＴ１Ｇ６３２９０、ＡＴ３Ｇ０１８５０、ＡＴ５Ｇ６１４１０、ＡＴ１Ｇ７１１００、ＡＴ２Ｇ０１２９０、ＡＴ３Ｇ０４７９０、ＡＴ５Ｇ４４５２０、ＡＴ４Ｇ２６２７０、ＡＴ４Ｇ２９２２０、ＡＴ４Ｇ３２８４０、ＡＴ５Ｇ４７８１０、ＡＴ５Ｇ５６６３０、ＡＴ２Ｇ２２４８０、ＡＴ５Ｇ６１５８０、ＡＴ１Ｇ１８２７０、ＡＴ２Ｇ３６４６０、ＡＴ３Ｇ５２９３０、ＡＴ４Ｇ２６５３０、ＡＴ２Ｇ０１１４０、ＡＴ２Ｇ２１３３０、ＡＴ４Ｇ３８９７０、ＡＴ３Ｇ５５４４０、ＡＴ２Ｇ２１１７０。解糖系に関与する遺伝子／タンパク質：ＡＴ１Ｇ１３４４０、ＡＴ３Ｇ０４１２０、ＡＴ１Ｇ１６３００、ＡＴ１Ｇ７９５３０、ＡＴ１Ｇ７９５５０、ＡＴ３Ｇ４５０９０、ＡＴ５Ｇ６０７６０、ＡＴ１Ｇ５６１９０、ＡＴ３Ｇ１２７８０、ＡＴ５Ｇ６１４５０、ＡＴ１Ｇ０９７８０、ＡＴ３Ｇ０８５９０、ＡＴ３Ｇ３０８４１、ＡＴ４Ｇ０９５２０、ＡＴ１Ｇ２２１７０、ＡＴ１Ｇ７８０５０、ＡＴ２Ｇ３６５３０、ＡＴ１Ｇ７４０３０。プラスチドトランスポーターとして機能する遺伝子／タンパク質：ＡＴ１Ｇ６１８００、ＡＴ５Ｇ１６１５０、ＡＴ５Ｇ３３３２０、ＡＴ５Ｇ４６１１０、ＡＴ４Ｇ１５５３０、ＡＴ２Ｇ３６５８０、ＡＴ３Ｇ５２９９０、ＡＴ３Ｇ５５６５０、ＡＴ３Ｇ５５８１０、ＡＴ４Ｇ２６３９０、ＡＴ５Ｇ０８５７０、ＡＴ５Ｇ５６３５０、ＡＴ５Ｇ６３６８０、ＡＴ１Ｇ３２４４０、ＡＴ３Ｇ２２９６０、ＡＴ３Ｇ４９１６０、ＡＴ５Ｇ５２９２０。りんご酸塩およびピルビン酸塩の代謝に関与する遺伝子／タンパク質：ＡＴ１Ｇ０４４１０、ＡＴ５Ｇ４３３３０、ＡＴ５Ｇ５６７２０、ＡＴ１Ｇ５３２４０、ＡＴ３Ｇ１５０２０、ＡＴ２Ｇ２２７８０、ＡＴ５Ｇ０９６６０、ＡＴ３Ｇ４７５２０、ＡＴ５Ｇ５８３３０、ＡＴ２Ｇ１９９００、ＡＴ５Ｇ１１６７０、ＡＴ５Ｇ２５８８０、ＡＴ２Ｇ１３５６０、ＡＴ４Ｇ００５７０。
これらの候補タンパク質をコードする配列を含む構築物が調製され、上述の実験のように、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉へと浸潤され、脂肪酸含量および組成が分析される。非極性脂質含量の増加に役立つ遺伝子を、上述の他の遺伝子（主に、ＭＧＡＴ、Ｗｒｉ１、ＤＧＡＴ１およびオレオシンをコードするもの）と組み合わせ、植物細胞の形質転換に用いる。
異常な脂肪酸の増加
上述の組み合わせと並行して、異常な脂肪酸の増加が得られるかどうかを測定するために、追加の遺伝子を検証する。これらには、推定機能によりグループ化され、他種由来のホモログである、以下の遺伝子が含まれる（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を提供）。デルタ－１２アセチレナーゼ（ａｃｅｔｙｌｅｎａｓｅｓ）ＡＢＣ００７６９、ＣＡＡ７６１５８、ＡＡＯ３８０３６、ＡＡＯ３８０３２；デルタ－１２コンジュガーゼＡＡＧ４２２５９、ＡＡＧ４２２６０、ＡＡＮ８７５７４；デルタ－１２デサチュラーゼＰ４６３１３、ＡＢＳ１８７１６、ＡＡＳ５７５７７、ＡＡＬ６１８２５、ＡＡＦ０４０９３、ＡＡＦ０４０９４；デルタ－１２エポキシゲナーゼＸＰ＿００１８４０１２７、ＣＡＡ７６１５６、ＡＡＲ２３８１５；デルタ－１２ヒドロキシラーゼＡＣＦ３７０７０、ＡＡＣ３２７５５、ＡＢＱ０１４５８、ＡＡＣ４９０１０；および、デルタ－１２ Ｐ４５０酵素（たとえば、ＡＦ４０６７３２）。
これらの候補タンパク質をコードする配列を含む構築物が調製され、上述の実験のように、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉へと浸潤され、脂肪酸含量および組成が分析される。コード領域のヌクレオチド配列は、対照の宿主の種にコドン－最適化されたものであっても良い。異常な脂肪酸含量を増加させるのに役立つ遺伝子を、上述の他の遺伝子（主に、ＭＧＡＴ、ＷＲＩ１、ＤＧＡＴ１およびオレオシンをコードするもの）と組み合わせ、植物細胞の形質転換に用いる。
実施例２０．油を増加させる遺伝子の組み合わせでの、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍを含む植物の安定的な形質転換
ＮＰＴＩＩカナマイシン抵抗性遺伝子および３つの遺伝子発現カセットを発現させる、二重のエンハンサー領域３５Ｓプロモーターを含んだ、既存のバイナリー発現ベクター、ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ（米国仮特許出願第６１／６６０３９２号）を、開始ベクターとして用いて、それぞれ、植物の安定的形質転換のための遺伝子の組み合わせを含有するいくつかの構築物を調製した。このベクターを、以下のように、発現遺伝子を油増加遺伝子と交換することにより、改変した。ベクターｐＲＳｈ１－ＰＳＰ１由来の、ＮｏｔＩ部位に隣接するイントロン－中断ゴマオレオシン遺伝子を、ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ ＮｏｔＩ部位へと挿入することにより、ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣを最初に改変し、ｐＪＰ３５００を作製した。ｐＪＰ３５００を、次いで、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＬ１遺伝子をコードするコドン最適化ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ部位へと挿入することにより改変し、ｐＪＰ３５０１を作製した。ｐＪＰ３５０１をさらに、ＡｓｉＳＩ部位に隣接する野生型Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１コード領域をコードするＤＮＡ断片を、ＡｓｉＳＩ部位へと挿入することにより改変し、ｐＪＰ３５０２を作製した（配列番号４０９）。ＳｔｕＩ－ＺｒａＩ断片として、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードするコード領域を発現する、二重のエンハンサー領域３５Ｓプロモーターからなる、他の発現カセットを、ｐＪＰ３５０２のＳｆｏＩ部位へと挿入することにより最後の改変が行われ、ｐＪＰ３５０３が作製された（配列番号４１０）。ＭＧＡＴ２発現カセットは、ＳｔｕＩ＋ＺｒａＩ部位で、ｐＪＰ３３４７から切り出された。ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３の両方が、以下に記述されるように、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの安定的形質転換のために用いられた。これらの構築物により、ｐＪＰ３５０２は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＬ１およびＤＧＡＴ１コード領域を包含し、それらは各々、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター（ＳＳＵ）および、二重のエンハンサー領域３５Ｓプロモーターにより発現され、ならびに、ＳＳＵ：ゴマオレオシンカセットにより発現された。この構築物のＴ－ＤＮＡ領域を、図１６に図示する。ベクターｐＪＰ３５０３はさらに、ｅ３５Ｓ：：ＭＧＡＴ２カセットを包含した。この構築物を、図１７に図示する。構築物ｐＪＰ３５０３のＴ－ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列が、配列番号４１２に示される。
組み合わせ遺伝子でのＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの安定的形質転換
バイナリーベクターｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３を、標準的なエレクトロポレーション法により、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１へと、別々に導入した。形質転換細胞を選択し、カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）およびリファンピシン（２５ｍｇ／ｌ）を補充したＬＢ寒天培地上で増殖させ、２日間、２８℃でインキュベートした。各々の単一コロニーを用いて、ＬＢブロス中で新たな培養を開始した。十分な通気で４８時間インキュベートした後、細胞を、２０００ｇの遠心で回収し、上清を除去した。細胞を、５０％ＬＢおよび５０％ＭＳ培地からなる新たな培地中に、ＯＤ６００＝０．５で再懸濁した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで、無菌増殖させた、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ栽培品種Ｗ３８の葉試料を、外科用メスで切り出し、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁液に浸しながら、約０．５～１ｃｍ２のサイズの小片に切断した。カットされた葉の小片を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁液中に、室温で１５分間、置き、次いで、滅菌ろ紙上で乾燥させながらブロットし、抗生物質の補充無く、ＭＳプレート上に移した。２４℃、２日間の共培養の後、外殖片を、滅菌された液体ＭＳ培地で３回洗浄し、次いで、滅菌ろ紙上で乾燥させながらブロットし、１．０ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．５ｍｇ／Ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび２００ｍｇ／Ｌセフォタキシムを補充した選択ＭＳ寒天培地上に置いた。プレートを２週間、２４℃でインキュベートし、形質転換されたＮ．ｔａｂａｃｕｍ葉小片から若枝を発達させた。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで根を張ったトランスジェニック植物を確立するために、健康な緑の若枝を切断し、２５μｇ／ＬのＩＡＡ、１００ｍｇ／Ｌのカナマイシン、および２００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを補充したＭＳ寒天培地に移した。根が発達した後、個々の植物を土壌に写し、温室内で成長させた。葉試料を、食粒発達の異なる段階（開花前および開花中を含む）で採取した。総脂肪酸、極性脂質およびＴＡＧを定量し、それらの脂肪酸プロファイルを、実施例１に記述されるように、ＴＬＣ／ＧＣにより決定した。
ｐＪＰ３５０３形質転換体の分析
ｐＪＰ３５０５との形質転換（４－遺伝子構築物）のために、花がつぼみを付ける前に、約１ｃｍ２の葉試料を、３０の初代形質転換体から採取し、試料中のＴＡＧレベルをＩａｔｒｏｓｃａｎにより定量した。７つの植物を、さらなる分析のために選択し、そのうち５つが、葉油レベルの上昇を示し、２つが、本質的に野生型植物と同じ油レベルを示した。これらの植物由来の凍結乾燥葉試料を、総脂質含量およびＴＡＧ含量および脂肪酸組成に対して、ＴＬＣおよびＧＣにより分析した。４および２９の番号を割り当てられた形質転換植物が、野生型と比較して葉油のレベルがかなり上昇していることが判明した一方で、２１番の植物は、本質的に野生型のレベルと同じ、最も低いＴＡＧレベルを示した（表３０）。１１番、１５番および２７番の植物は、葉油のレベルが中間であった。ＴＡＧ中のオレイン酸のレベルは、ＴＡＧ産生量と逆に相関していることが判明し、これは、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａでの早期の一過性発現実験の結果と一致している。
４番および２９番の形質転換植物において、葉油含量（乾重量のパーセンテージ）は、開花期の時点でかなり上昇することが判明した（表３１）。表３１のデータから、４番および２９番の植物それぞれで、少なくとも１．７倍、および２．４倍の増加であった。野生型対照と類似のＴＡＧレベルを有する２１番の植物ではそのような変化は観察されなかった。各試料から単離されたＴＡＧ分画中のオレイン酸レベルも、類似のパターンを示した。この脂肪酸は、４番および２９番の植物由来のＴＡＧ中の脂肪酸の２２．１％にまで蓄積し、２１番の植物および野生型と比較して、１７～１８倍の増加であった。オレイン酸の増加は、２１番植物および野生型対照と比較した場合の、αリノレン酸レベルが８倍低下した一方で、リノール酸およびパルミチン酸のレベルの増加を伴った。ＴＡＧとは異なり、極性脂質レベルは、３系統で、開花期段階で、やや減少した（表３２）。３系統の極性脂質分画中の、Ｃ１８一価不飽和脂肪酸および多価不飽和脂肪酸のレベルは、そのＴＡＧ組成における変化と類似していたが、オレイン酸およびリノール酸の変化はそれほど際立ってはいなかった。総葉脂質の有意な増加が、開花中の系統４および２９に対して観察され、そのレベルは乾重量の１０％を超えるまでに達した（表３３）。開花前および開花中の植物２１における総葉脂質レベルは、同様の段階で野生型植物において観察されたレベルに類似していた（表３３および３５）。３つすべての植物の総脂肪酸組成の変化は、各ＴＡＧ脂肪酸組成に類似していた。結実中の植物４における葉油は、葉の白化が発現すると、さらに上昇することが判明した。この段階で検出された最も高い葉ＴＡＧレベルは、結実中の植物２１における、類似の老化葉と比較して、６５倍の増加に相当し、開花期の野生型植物の類似の葉と比較して、１３０倍の増加に相当した（表３４、図１８）。
この植物におけるＴＡＧの増加は、オレイン酸レベルの増加と同時に発生した。植物４とは異なり、開花期の後、および白化の間、他の２つの初代形質転換体および野生型タバコ中の葉ＴＡＧレベルは増加せず、またはわずかに増加したのみであった。植物４よび２９の低い部分の葉は、老化によりＴＡＧレベルの減少を示した。全ての植物において、αリノレン酸レベルが、葉の齢が進むにつれて増加した一方で、リノール酸のレベルは低下した。
ＴＡＧレベルの増加と一致して、結実中の植物４および２９の葉の総脂質レベルは、開花期中の両植物の類似の葉と比較して、さらに上昇した（表３３および３５）。植物４において検出された最も高い脂質レベル（乾重量ベース）は、１５．８％であり、植物２１および野生型植物の類似の葉と比較して、それぞれ７．６倍および１１．２倍の増加と等しかった。野生型植物および植物２１の葉における総脂質の脂肪酸組成は類似していた一方で、植物４および２９では有意差が観察された。これらの変化は、両方の初代形質転換体のＴＡＧにおいて見出された変化と酷似していた。
興味深いことに、結実前および結実中の植物４および２９は、光沢のある表面という特徴を有しており、このことから、視覚的に容易にスコア化でき、最大油含量で採取するタイミングを計るのに役立つ表現型として使用することができる表現型の変化が示される。
要約すると、植物４および２９の葉は、開花期の間から結実までに急速にＴＡＧを蓄積した。後半の段階では、葉の大部分は、系統２１の０．１％～０．２％と比較して、乾重量ベースで７％～１３％の間のＴＡＧレベルを示した。これらの観察されたＴＡＧレベルおよび総脂質レベルは、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１の構造的発現、およびＡ．ｔｈａｌｉａｎａＬＥＣ２遺伝子の誘導発現で、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの葉において、最大で５．８％および６．８％のＴＡＧが得られたと報告した、Andrianov et al., (2010)のレベルをはるかに超えている。
表３０ ｐＪＰ３５０３で形質転換された選択初代タバコ植物の葉から単離されたＴＡＧの、ＴＡＧパーセンテージ（葉乾重量の重量％）およびオレイン酸レベル（総脂肪酸の％）。
Figure 0007097805000032
表３１ 開花の前、および開花中の、ｐＪＰ３５０３で形質転換された３つの選択タバコ植物および野生型から単離されたＴＡＧのＴＡＧレベル（葉乾重量の重量％）および脂肪酸組成。示されるデータは２～３の独立した反復実験の平均および標準偏差である。
Figure 0007097805000033
Figure 0007097805000034
 表３２ 開花の前、および開花中の、ｐＪＰ３５０３で形質転換された選択タバコ植物由来の葉組織の極性脂質レベル（葉乾重量の重量％）および極性脂質の脂肪酸組成。示されるデータは２～３の独立した反復実験の平均および標準偏差である（植物２１を除く。開花期の前）。
Figure 0007097805000035
Figure 0007097805000036
 表３３ 開花の直前、および開花中の、ｐＪＰ３５０３で形質転換されたタバコ植物由来の葉の極性脂質レベル（葉乾重量の重量％）および極性脂質の脂肪酸組成。示されるデータは２～３の葉試料の平均である。
Figure 0007097805000037
Figure 0007097805000038
 表３４ ｐＪＰ３５０３で形質転換された３つの選択タバコ植物の、異なる齢の葉（開花の後）から単離されたＴＡＧのＴＡＧレベル（葉乾重量の重量％）および脂肪酸組成。
Figure 0007097805000039
Figure 0007097805000040
 表３５ ｐＪＰ３５０３で形質転換された３つの選択タバコ植物および野生型の、異なる齢の葉から単離された総脂質産生量（葉乾重量の重量％）および総脂質の脂肪酸組成。
Figure 0007097805000041
Figure 0007097805000042
ｐＪＰ３５０２で形質転換されたタバコ植物の分析
ｐＪＰ３５０２の形質転換体に対して（３遺伝子構築物）ＭＳ寒天培地中のスクロースレベルを、十分なカルスが形成されるまで、標準レベルの半分まで減少させ、ＷＲＩ１を発現する形質転換体の回収を補助した。４１の初代形質転換体を、ｐＪＰ３５０２形質転換体から得て、温室へと移した。異なる齢の葉試料を、開花段階または結実段階のいずれかで採取した（表３６）。形質転換手順での同じカルスから由来し、ゆえに同じ形質転換イベント由来のものである可能性がある、３つの形質転換体を除き（それらは、やや小さく、ｐＪＰ３５０３を有する植物４（上述）で観察されたものと似た、光沢のある葉の表現型を示したが、程度は小さい）、植物は、表現型的には正常であるように見える。
初代形質転換体の葉のディスク試料を、開花期の間に採取し、ＴＡＧを、ＴＬＣの後のヨード染色により可視化して、定量した。野生型対照と比較してＴＡＧレベルの増加を示す選択トランスジェニック植物を、ＴＬＣおよびＧＣで、より詳細にさらに分析した。若い緑の葉において最も高いＴＡＧレベルは、系統８．１で検出され、乾重量ベースで８．３％のＴＡＧに相当し、または、同じ齢の野生型の葉と比較しておよそ８３倍の増加であった（表３６）。黄緑の葉は、多くの場合、若い緑の葉と比較して、より高い油含量を含み、最大ＴＡＧレベルは、系統１４．１で観察された（乾重量ベースで１７．３％のＴＡＧ）。葉の総脂質含量および総脂質の脂肪酸組成をまた、定量した（表３７）。
種子（Ｔ１種子）を、種子が成熟した段階で、初代形質転換体から採取し、一部を蒔き、Ｔ１植物を成育した。これらの植物は、導入遺伝子に対して分離系であることが予測され、ゆえに、いくつかの分離ヌル個体がＴ１群中に期待され、それらは同じ時間、同じ条件下で成長させた既知の野生型植物に加え、適切な陰性対照として役立つことができた。初代形質転換体１４．１（単一コピーのＴ－ＤＮＡ挿入を有していた）由来の５１のＴ１植物（６～８週齢で、高さが１０～２５ｃｍ）を、１２の野生型植物と共に分析した。植物は表現型的に正常（緑色で健康）に見え、対応する野生型植物よりも小さくは見えなかった。約１ｃｍ直径の葉試料を、完全に広がった緑の葉から採取した。Ｔ１植物のうち３０が、葉においてＴＡＧレベルの増加を示し、そのうち８つの植物が、高いＴＡＧレベル（植物の成長の同じ団塊にある、初代形質転換体１４．１と比較して、約２倍のＴＡＧレベル）を示した。これら後者の植物は、導入遺伝子がホモ接合性である可能性がある。選択Ｔ１植物の葉のＴＡＧのレベルおよびＴＡＧ脂肪酸組成を、葉組織の約５ｍｇ（乾重量）から単離された脂質を、各ＴＬＣレーン上にロードすることにより測定し、そのデータを表３８に示す。

表３６ ｐＪＰ３５０２で形質転換された１０の選択タバコ由来の緑の葉から単離されたＴＡＧのＴＡＧレベル（葉乾重量の重量％）および脂肪酸組成。
Figure 0007097805000043
Figure 0007097805000044
 表３７ ｐＪＰ３５０２（ＤＧＡＴ１＋ＷＲＩ１＋オレオシン）で形質転換された選択タバコ植物由来の黄色い葉から抽出された総脂質および総脂質の脂肪酸組成。
Figure 0007097805000045
 表３８ ｐＪＰ３５０２で形質転換された選択タバコＴ１植物由来の緑色の葉から単離されたＴＡＧのＴＡＧレベル（葉乾重量の重量％）およびＴＡＧの脂肪酸組成。
Figure 0007097805000046
Figure 0007097805000047
単子葉の植物の形質転換に適した遺伝的構築物が、単子葉植物でより活性なプロモーターと、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、単子葉ウイルス由来の構造性ウイルスプロモーター、または単子葉植物種におけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター（たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）Ｕｂｉプロモーター等）が挙げられる。同様に、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターは、単子葉植物種でより活性のあるプロモーターと交換される。これらの構築物は、小麦、大麦、およびトウモロコシへ、標準的な方法を用いて形質転換される。
ススキ（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）種
ススキの形質転換に対する遺伝的構築物が、ススキでより活性的なプロモーターで、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、ユビキチンプロモーター（Christensen et al., 1996）、またはススキにおけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーターが挙げられる。同様に、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターは、ススキでより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Wang et al.,2011に記述されるものと同様に、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）介在法によりススキに形質転換される。
スイッチグラス（Ｓｗｉｔｃｈｇｒａｓｓ、Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）
スイッチグラスの形質転換に対する遺伝的構築物が、スイッチグラスでより活性的なプロモーターで、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはスイッチグラスにおけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター（たとえば、Mann et al., 2011等）が挙げられる。同様に、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターが、スイッチグラスでより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Chen et al., 2010および、Ramamoorthy and Kumar, 2012に記述されるものと同様に、アグロバクテリウム介在法により、スイッチグラスに形質転換される。
サトウキビ（Ｓｕｇａｒｃａｎｅ）
サトウキビの形質転換に対する遺伝的構築物が、サトウキビでより活性的なプロモーターで、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはサトウキビにおけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター（たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）Ｕｂｉプロモーター等）が挙げられる。同様に、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターは、サトウキビでより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Bower et al.,1996に記述されるものと同様に、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）介在法によりサトウキビに形質転換される。
チカラシバ（Ｅｌｅｐｈａｎｔ ｇｒａｓｓ）
Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍの形質転換に対する遺伝的構築物が、チカラシバでより活性的なプロモーターで、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ種（たとえば、Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ等）におけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター（たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）Ｕｂｉプロモーター等）が挙げられる。同様に、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターが、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ種でより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物が、Girgi et al., 2002に記述されるものと同様に、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）介在法によりＰ．ｐｕｒｐｕｒｅｕｍに形質転換される。
ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ）
Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅおよび他のライグラス種の形質転換に対する遺伝的構築物が、ライグラスでより活性的なプロモーターで、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはライグラス種におけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター（たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）Ｕｂｉプロモーター等）が挙げられる。同様に、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５Ｓプロモーターが、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ種でより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Dalton et al.,2002に記述されるものと同様に、シリコン炭化カルシウム介在法により、または、Bettany et al., 2003に記述されるものと同様に、アグロバクテリウム介在法により、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅに形質転換される。
ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３が、ＣａＭＶ－３５ＳおよびＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーター（選択可能なマーカーカセットを除く）を、標的種で活性な種特異的プロモーターと交換することにより、種特異的な発現遺伝的構築物へと改変される。
カノーラ（Ｃａｎｏｌａ）
Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓの形質転換に対する遺伝的構築物が、ｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３のＣａＭＶ－３５ＳおよびＡｒａｔｈ－ＳＳＵプロモーターを、カノーラでより活性的なプロモーターと交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓにおけるトランスジェニックな環境中で機能することが従前に実証されているプロモーターが挙げられる（たとえば、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＦＡＥ１プロモーター、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓナピン（ｎａｐｉｎ）プロモーター、Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍコンリニン（ｃｏｎｌｉｎｉｎ）１およびコンリニン２プロモーター等）。新たな構築物が、Ｂ．ｎａｐｕｓに、前述のように形質転換される。
大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）
遺伝的構築物が、配列番号４１５（大豆相乗的挿入；図１９Ａ）に示されるヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ断片から、ＰｓｐＯＭＩ断片を、たとえばｐＯＲＥ０４等のバイナリーベクターへ、ＮｏｔＩ部位でクローニングすることにより作製される。この断片には、Ａｒａｔｈ－ＦＡＥ１プロモーターで発現されるＡｒａｔｈ－ＷＲＩ１、Ｌｉｎｕｓ－Ｃｎｌ２プロモーターで発現されるＡｒａｔｈ－ＤＧＡＴ１、Ｌｉｎｕｓ－Ｃｎｌ１で発現されるＭｕｓｍｕ－ＭＧＡＴ２、およびＬｉｎｕｓ－Ｃｎｌ１で発現されるＡｒａｔｈ－ＧＰＡＴ４が含まれる。さらなる遺伝的構築物が、ＧＰＡＴコード領域を、オレオシンコード領域で交換することにより作製される。さらなる遺伝的構築物が、ＭＧＡＴ発現カセットを削除することにより作製される。
遺伝的構築物であるｐＪＰ３５６９（図２１）が、配列番号４１５に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子から、ＳｂｆＩ－ＰｓｔＩ断片を、ｐＯＲＥ０４のＰｓｔＩ部位へとクローニングすることにより作製された。この構築物には、（ｉ）Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１転写因子をコードするコード領域（Ｇ．ｍａｘ発現に最適化されたコドン、および、Ｇ．ｍａｘ ｋｕｎｉｔｚトリプシンインヒビター３（Ｇｌｙｍａ－ＫＴｉ３）プロモーターから発現される）、（ｉｉ）Ｕｍｂｅｌｏｐｓｉｓ ｒａｍａｎｎｉａｎａＤＧＡＴ２Ａをコードするコード領域 (Lardizabal et al., 2008に記述されるようにコード最適化)、およびＧ．ｍａｘアルファ－サブユニット ベータ－コングリシニン（Ｇｌｙｍａ－ｂ－コングリシニン）プロモーターから発現される、および（ｉｉｉ）Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードするコード領域（Ｇ．ｍａｘ発現に最適化されたコドン）、が含まれた。第二の遺伝的構築物（ｐＪＰ３５７０）が、配列番号４１５に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子のＳｂｆＩ－Ｓｗａ断片を、ｐＯＲＥ０４へ、ＥｃｏＲＶ－ＰｓｔＩ部位でクローニングすることにより作製され、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１転写因子およびＵ．ｒａｍａｎｎｉａｎａＤＧＡＴ２Ａ酵素を発現する遺伝子を含むバイナリーベクターが産生された。同様に、第三の遺伝的構築物（ｐＪＰ３５７１）が、配列番号４１５に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子のＡｓｉＳＩ断片を、ｐＯＲＥ０４のＡｓｉＳＩ部位へとクローニングすることにより作製され、Ｕ．ｒａｍａｎｎｉａｎａＤＧＡＴ２Ａ酵素をコードする遺伝子を含むバイナリーベクターが産生された。第四の遺伝的構築物（ｐＪＰ３５７２）が、配列番号４１５に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子のＮｏｔＩ断片を、ｐＯＲＥ０４へ、ＮｏｔＩ部位でクローニングすることにより作製され、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１転写因子を発現する遺伝子を含むバイナリーベクターが産生された。第五の遺伝的構築物（ｐＪＰ３５７３）が、配列番号４１５に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子のＳｗａＩ断片を、ｐＯＲＥ０４へ、ＥｃｏＲＩ部位でクローニングすることにより作製され、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードする遺伝子を含むバイナリーベクターが産生された。
第六の遺伝的構築部（ｐＪＰ３５８０）が、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２と、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍオレオシン遺伝子とを置き換えることにより作製される。
これらの６つの構築物のそれぞれを用いて、実施例６に記述される方法を用いて、大豆を形質転換する。各構築物（特にｐＪＰ３５６９）での形質転換により作製されたトランスジェニック植物は、油含量の増加した種子を産生する。
サトウダイコン（Ｓｕｇａｒｂｅｅｔ）
タバコの形質転換に用いられたように、ベクターｐＪＰ３５０２およびｐＪＰ３５０３（上述を参照）を用いて、Lindsey & Gallois (1990)に記述されるように、アグロバクテリウム介在形質転換により、サトウダイコン（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の植物を形質転換する。上述で作製されたタバコ植物と同程度に、その植物は、その葉において、ＴＡＧのレベルが大きく増加している。トランスジェニックサトウダイコン植物は、枯れ始める直前または、成長工程の初期（すなわち、大根の糖含量が高レベルにあり、葉へのＴＡＧの蓄積が為された後の間）の、葉がまだ緑色であるか、好ましくは緑色／黄色である間に、採取される。これにより、大根から糖を、葉から脂質の両方を産生させるために適切な、二重の目的のサトウダイコンの作製ができ、その脂質は、葉を破砕し、得られた物質を遠心して油分画を分離させることによりバイオディーゼル燃料へと直接的に転換され得、または、葉の物質の熱分解により炭化水素の直接的な産生が可能となる。
サトウダイコンの根（塊茎）で活性なプロモーターをまた、塊茎における導入遺伝子の発現のために用いる。
実施例２１．ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の油増加遺伝子での安定的な形質転換
最初にＡｓｃＩ＋ＮｃｏＩ制限酵素消化により１つのＳＳＵプロモーターを切り出し、それをＡｓｃＩおよびＮｃｏＩに隣接しているジャガイモＢ３３プロモーターで置き換えることにより、ｐＪＰ３５０２（上述の実施例で説明されている、中間バイナリー発現ベクター）を改変して、ｐＪＰ３５０４を作製した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＬ１遺伝子と共に、ｐＪＰ３５０４のＳＳＵプロモーターを、ＰｓｐＯＭＩ部位で、同じＡ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＬ１遺伝子断片（ＮｏｔＩ－ＰｓｐＯＭＩに隣接している）を有するジャガイモＢ３３プロモーターにより置き換え、ｐＪＰ３５０６を作製した。上述の実施例に説明されるように、ｐＪＰ３３４７をｐＪＰ３５０６に加え、ｐＪＰ３５０７を作製した。この構築物を、図２０に図示する。その配列は、配列番号４１３に示される。その構築物を用いて、塊茎の油含量を増加させるようにジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）を形質転換する。
実施例２２．ＧＰＡＴ－ＭＧＡＴ融合酵素
ＧＰＡＴ－ＭＧＡＴ酵素融合物の酵素活性を検証し、これにより、ＧＰＡＴ誘導性ＭＡＧの、ＭＧＡＴ活性のための可触性が増加するかどうかを判定した。適切なリンカー領域を最初に合成して、クローニングベクターにクローニングした。このリンカーは、Ｎ末端（ＥｃｏＲＩ－ＺｒａＩ）およびＣ末端コード領域（ＮｄｅＩ－ＳｍａＩまたはＮｄｅＩ－ＰｓｔＩ）のクローニングのための適切な部位を含有していた。

ａｔｔｔａａａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｔｔｇａｇｇａｃｇｔｃｃｃｔａｃｔａｇａｃｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔａｃｔｔａｃｔａｃｇａｔｔｃｔｃｔｃｇｃｔｇｔｇｃａｔａｔｇｇｔｃａｇｔｃａｔｇｃｃｃｇｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｇｇｃｃｇｃａｔｔｔａａａｔ （配列番号４１４）
ＧＰＡＴ４－ＭＧＡＴ２融合物（ＧＰＡＴ４のＮ末端およびＭＧＡＴ２のＣ末端）を、最初に、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＧＰＡＴ４をコードするＤＮＡ断片（ＭｆｅＩおよびＺｒａＩ部位に隣接し、Ｃ末端終止コドンを有していない）を、ＥｃｏＲＩ－ＺｒａＩ部位へとクローニングすることにより作製した。Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードするＤＮＡ断片（ＮｄｅＩ－ＰｓｔＩに隣接）を、次いで、ＮｄｅＩ－ＰｓｔＩ部位へとクローニングし、単一のＧＰＡＴ４－ＭＧＡＴ２コード配列を作製した。融合コード配列を、次いで、ＮｏｔＩ断片として、ｐＹＥＳ２へとクローニングし、ｐＹＥＳ２：：ＧＰＡＴ４－ＭＧＡＴ２を作製し、および、構造性バイナリー発現ベクターｐＪＰ３３４３へとクローニングし、ｐＪＰ３３４３：：ＧＰＡＴ４－ＭＧＡＴ２を作製した。
同様に、ＭＧＡＴ２－ＧＰＡＴ４融合物（ＭＧＡＴ２のＮ末端およびＧＰＡＴ４のＣ末端）を、最初に、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２をコードするＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩおよびＺｒａＩ部位に隣接し、Ｃ末端終止コドンを有していない）を、ＥｃｏＲＩ－ＺｒａＩ部位へとクローニングすることにより作製した。Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＧＰＡＴ４をコードするＤＮＡ断片（ＮｄｅＩ－ＰｓｔＩに隣接）を、次いで、ＮｄｅＩ－ＰｓｔＩ部位へとクローニングし、単一のＭＧＡＴ２－ＧＰＡＴ４コード配列を作製した。融合コード配列を、次いで、ＮｏｔＩ断片として、ｐＹＥＳ２へとクローニングし、ｐＹＥＳ２：：ＭＧＡＴ２－ＧＰＡＴ４を作製し、および、構造性バイナリー発現ベクターｐＪＰ３３４３へとクローニングし、ｐＪＰ３３４３：：ＭＧＡＴ２－ＧＰＡＴ４を作製した。
酵母発現ベクターを、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で検証し、バイナリーベクターを、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ中で検証し、単一コード領域対照と、油含量および組成について比較する。
実施例２３．新規ＷＲＬ１配列の発見
３つの新規ＷＲＬ１配列を、ｐＪＰ３３４および他の適切なバイナリー構造性発現ベクターへとクローニングし、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいて検証する。これらには、Ｓｏｒｂｉ－ＷＲＬ１（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ由来；配列番号３３４）， Ｌｕｐａｎ－ＷＲＬ１（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ由来；配列番号３３５）および、Ｒｉｃｃｏ－ＷＲＬ１ （Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来；配列番号３３６）をコードする遺伝子が含まれる。これらの構築物を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉のアッセイにおいて、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＷＲＩ１コード遺伝子との比較で検証する。
手順の最初のステップとして、ＷＲＬ１に相当する部分的なｃＤＮＡ断片を、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ（ＮＡ－０８０８１８＿Ｐｌａｔｅ１４ｆ０６．ｂ１、配列番号２７７）の発育中の種子ＥＳＴデータベースにおいて特定した。全長ｃＤＮＡ（配列番号２７８）を次いで、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーおよび、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓの発育中の種子から単離されたｃＤＮＡを用いて、５´および３´ＲＡＣＥ ＰＣＲを実施することにより回収した。全長ｃＤＮＡは１７２９ｂｐの長さであり、４２８アミノ酸の予測ポリペプチド（配列番号３３７）をコードする１２８４ｂｐのタンパク質コード配列を含んでいた。全長ルピナス（ｌｕｐｉｎ）ＷＲＬ１ ｃＤＮＡの全コード領域を、次いで、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（両方とも、センス方向における、３５Ｓプロモーターの制御下での、ｐＪＰ３３４３ベクターへのクローニングを促進するための、ＥｃｏＲＩ制限酵素部位が組み込まれている）を用いてＰＣＲ増幅した。ｐＪＰ３３４３－Ｌｕａｎｇ ＷＲＬ１を有するＡ． ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１を、実施例１に記述されるように、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉組織に浸潤させた。次いで、一過性にｐＪＰ３３４３－Ｌｕａｎｇ ＷＲＬ１を発現する葉ディスクを採取し、油含量を分析した。
実施例２４．Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおけるＧＣＩ－５８ホモログのサイレンシング
James et al. (2010)が、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＣＧＩ－５８ホモログのサイレンシングにより、葉において、１０倍のＴＡＧ蓄積（主には、細胞質の脂質滴として）がもたらされることを報告している。また、ガラクト脂質も上昇することが判明した一方で、ほとんどの主要なリン脂質種のレベルは変化しないままであった。面白いことに、種子におけるＴＡＧのレベルは影響を受けず、他のＴＡＧ分解変異体とは異なり、種子発芽におけるネガティブな影響は観察されなかった。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａＣＧＩ－５８遺伝子との相同性を示す３つの全長転写物、および２つの部分的な転写物が、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａトランスクリプトームにおいて見いだされた。５つすべての転写物中に存在する４３４ｂｐの領域を、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ単離葉ＲＮＡから増幅し、ＬＲクローニング（Ｇａｔｅｗａｙ）を介して、ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ１２デスティネーションベクターへとクローニングした。得られた発現ベクター（ｐＴＶ４６と指定される）は、ＣＧＩ－５８のホモログをコードするタバコ遺伝子の発現を減少させるための、ヘアピンＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をコードし、実施例１に記述されるように、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍに形質転換するために使用され、５２の初代形質転換体を産生した。
その生育組織において、ＴＡＧレベルの増加を示す初代形質転換体を、実施例２０に記述されるように、ホモ接合体株と交配させる。
実施例２５．Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ ＡＤＰ－グルコース ピロホスホリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）小サブユニットのサイレンシング
Sanjaya et al.,(2011)により、ＷＲＩ過剰発現と組み合わせたＡＧＰａｓｅ小サブユニットのサイレンシングにより、デンプンレベルを減少させたまま、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの種子中のＴＡＧ蓄積をさらに増加させることが実証されていた。ＡＧＰａｓｅ小サブユニットが、花のつぼみからクローニングされている（Kwak et al.,2007）。推定アミノ酸配列は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ ＡＧＰａｓｅと８７％の同一性を示した。５９３ｂｐの断片を合成し、ＬＲクローニング（Ｇａｔｅｗａｙ）を介して、ｐＨＥＬＬＳＧＡＴＥ１２へとクローニングし、バイナリーベクターｐＴＶ３５を得た。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍの形質転換は、実施例１に記述されるように行い、４３の初代形質転換体を得た。
葉の総デンプンレベルにおける減少を示す初代形質転換体を、実施例２０および２１に記述されるホモ接合体と交配させる。さらに、初代形質転換体を、、実施例２０および２１に記述される、系統交配の結果生じるホモ接合体の系統と交配させる。
実施例２６．誘導可能なプロモーターを含む遺伝子組み合わせのための構築物の製造および使用
さらなる遺伝的構築物を、上述の遺伝子の組み合わせ（特に、ｐＪＰ３５０３およびｐＪＰ３５０２）における、少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導する、誘導可能なプロモーター系を用いて作製する。改変構築物において、ＷＲＩ１遺伝子は、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｌｃＲ遺伝子発現の存在下での、Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｌｃＡプロモーター等の、誘導可能なプロモーターにより、発現される。あるいは、ＤＧＡＴは、誘導可能なプロモーターを用いて発現される。これは、最大のＴＡＧ蓄積が、成長中のすべての時点で望まれない場合に有益である。誘導可能なプロモーターシステムまたは、成長の中で制御されるプロモーターシステム（好ましくは、たとえばＷＲＩ１等の転写因子を誘導する）により、成長の間の適切な時点で、高いＴＡＧの表現型を誘導することができ、引いては、高いレベルでＴＡＧが蓄積される。
さらに、たとえばＬＥＣ２またはＢＡＢＹ ＢＯＯＭ（ＢＢＭ、Srinivasan et al., 2007）等の胚発生転写因子を含む、転写因子の共発現により、ＴＡＧを増加させることができる。これらは、上述のように誘導可能なプロモーターの制御下で発現され、トランスジェニック系統のスーパー形質転換体またはＷＲＩおよびＤＧＡＴとの共形質転換体である。
ｐＪＰ３５９０は、ＡａｔＩＩ断片としてＭＡＲスペーサーをｐＯＲＥ０４のＡａｔＩＩ部位へとクローニングすることにより作製される。ｐＪＰ３５９１は、ＫｐｎＩ断片を、第二のＭＡＲスペーサーとして、ｐＪＰ３５９０のＫｐｎＩ部位へとクローニングすることにより作製される。ｐＪＰ３５９２は、配列番号４１６（１２ＡＢＦＪＹＣ＿ｐＪＰ３５６９＿ｉｎｓｅｒｔ；図１９Ｂ）に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子のＡｓｉＳＩ－ＳｍａＩ断片を、ｐＪＰ３５９１のＡｓｉＳＩ－ＥｃｏＲＶ部位へとクローニングすることにより作製される。ｐＪＰ３５９６は、Ｍ．ｍｕｃｕｌｕｓＭＧＡＴ２を発現するａｌｃＡプロモーターおよびＧｌｙｃｉｎｅ ｍａｘレクチンポリアデニル化シグナルを含む、ＰｓｔＩに隣接する誘導可能な発現カセットを、ｐＪＰ３５９２のＳｂｆＩ導入部位へとクローニングすることにより作製される。ｐＪＰ３５９２およびｐＪＰ３５９６の両方（それぞれ、ｐＪＰ３５９８およびｐＪＰ３５９７）のハイグロマイシン抵抗性バージョンは、ＮＰＴＩＩ選択可能マーカー遺伝子を、ＦｓｅＩ－ＡｓｃＩ部位で、ＨＰＨ隣接遺伝子で置き換えることにより作製される。
これらの構築物を用いて、実施例２０に記述されるように、同じ植物種を形質転換する。誘導可能なプロモーターからの発現は、トランスジェニック植物がしっかりと成長した後で、そのトランスジェニック植物のインデューサーで処理することにより、増加され、植物は増加したレベルのＴＡＧを蓄積する。これらの構築物はまた、３つの遺伝子または４つの遺伝子ＴＤＮＡ領域（それぞれ、配列番号４１１および配列番号４１２）を含む、油増加構築物を既に含有する、安定的に形質転換された構築物中に、スーパー形質転換される。あるいは、３つの遺伝子または４つの遺伝子構築物由来の遺伝子発現カセットを、ｐＪＰ３５９７およびｐＪＰ３５９８のＮｏｔＩ部位へとクローニングすることにより、高度脂肪酸およびＴＡＧ合成、蓄積および貯蔵のための、混合構造的かつ誘導可能なベクターシステムが産生される。
他の誘導可能なプロモーターに加え、特定の組織中でのみ、または特定の成長期間の間でのみ、活性化となるプロモーターを用いて、時間的に、および空間的に制限される遺伝子発現も、替わりとなる。内因性の化学的に誘導可能なプロモーターもまた、特定の成長段階に限定される発現に用いることができる。
当業者であれば、広く説明される本発明の範囲および精神から逸脱することなく、特定の実施形態において示されている本発明に対し、多くの変化および／または改変が為されうることを認識するであろう。それゆえ、本実施形態は、全ての点において、例示のためであり、限定ではないとみなされる。
本出願は、２０１１年１２月２７日に出願された米国特許出願第６１／５８０５９０号および、２０１２年１０月２５日に出願された米国特許出願第６１／７１８，５６３号の優先権を主張し、それら両方の全内容が、参照により本明細書に援用される。
本明細書において考察される、および／または参照されるすべての公表文献は、その全体で本明細書に援用される。
本明細書に含まれている文献、行為、材料、機器、物品等の考察は、いずれも単に本発明の背景を提供するためのものである。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成するものであること、または本出願の各請求項の優先日以前に存在していたので本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことを承認するものとして解釈されるべきではない。
参照文献
Abdullah et al. (1986) Biotech. 4:1087.
Al-Mariri et al. (2002) Infect. Immun. 70:1915-1923.
Alemanno et al. (2008) Planta 227:853-866.
Almeida and Allshire (2005) TRENDS Cell Biol. 15:251-258.
Alonso et al. (2010) Green Chem. 12:1493-1513.
Alvarez et al. (2000) Theor. Appl. Genet. 100:319-327.
Andrianov et al. (2010) Plant Biotech. J. 8:277-287.
Barthole et al. (2011) Plant Sci. 185-186:33-39.
Bartlett et al. (2008) Plant Methods 4:22.
Baud et al. (2007) Plant J. 50:825-838.
Baumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:459-467.
Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239.
Benghezal et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:30845-30855.
Bettany et al. (2003) Plant Cell Rep. 21:437-444.
Bligh and Dyer (1959) Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37:911-917.
Bohner et al. (1999) Plant J. 19:87-95.
Bourque (1995) Plant Sci. 105:125-149.
Boutilier et al. (2002) Plant Cell 14:1737-1749.
Bouvier-Nave et al. (2000) European Journal of Biochemistry / FEBS 267:85-96.
Bower et al. (1996) Mol. Breed. 2: 239-249.
Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254.
Broothaerts et al. (2005) Nature 433:629-633.
Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.
Bruce et al. (2000) P. Plant Cell 12:65-80.
Buchanan-Wollaston (1994) Plant Physiol. 105:839-846.
Busk et al. (1997) Plant J. 11:1285-1295.
Cadwell and Joyce (1992) PCR Methods Appl. 2:28-33.
Cao et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:13860-13866.
Cao et al. (2007) J. Lipid Res. 48:583-591.
Capuano et al. (2007) Biotechnol. Adv. 25:203-206.
Cernac and Benning (2004) Plant J. 40:575-585
Chen et al. (2010) Biotechnol. for Biofuels. 3:9.
Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.
Cheng et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 13611-13614.
Chikwamba et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:11127-11132.
Christensen and Quail (1996) Transgenic Res. 5:213-218.
Christie (1993) Advances in Lipid Methodology - Two, Oily Press, Dundee, pages 195-213.
Chung et al. (2006) BMC Genomics 7:120.
Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-743.
Coco et al. (2001) Nature Biotechnology 19:354-359.
Coco et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1246-1250.
Comai et al. (2004) Plant J 37: 778-786.
Corrado and Karali (2009) Biotechnol. Adv. 27:733-743.
Courvalin et al. (1995) Life Sci. 318:1207-1212.
Coutu et al. (2007) Transgenic Res. 16:771-781.
Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291.
Dalton et al. (1998) Plant Science 132:31-43.
Dandik and Aksoy (1998) Fuel Process Technol. 57: 81-92.
Darji et al. (1997) Cell 91:765-775.
Dauk et al (2007) Plant Sci. 173:43-49.
Deshpande (1992) Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227-234.
Dhadialla et al. (1998) Annu. Rev. Entomol. 43:545-569.
Dietrich et al. (1998) Nature Biotech. 18:181-185.
Dulermo and Nicaud (2011) Metab. Eng. 13:482-491.
Durrett et al. (2008) Plant J. 54:593-607.
Dyer et al. (2002) Plant Physiol. 130:2027-2038.
Eggert et al. (2005) Chembiochem 6:1062-1067.
Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027.
Endalew et al. (2011) Biomass and Bioenergy 35:3787-3809.
Felenbok (1991) J. Biotechnol. 17:11-17.
Fennelly et al. (1999) J. Immunol. 162:1603-1610.
Froissard et al. (2009) FEMS Yeast Res 9:428-438.
Fujimura et al. (1985) Plant Tissue Culture Lett. 2:74.
Gan (1995) Molecular characterization and genetic manipulation
of plant senescence. PhD thesis. University of Wisconsin, Madison.
Gan and Amasino (1995) Science 270:1986-1988
Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108.
Ghosal et al. (2007) Biochimica et Biophysica Acta 1771:1457-1463.
Ghosh et al. (2009) Plant Physiol. 151:869-881.
Girgi et al. (2002) Molecular Breeding 10:243-252.
Glevin et al. (2003) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:16-37.
Goffman et al. (2005) Plant Physiol. 138:2269-2279.
Gong and Jiang (2011) Biotechnol. Lett. 33:1269-1284.
Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434.
Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258.
Greenwell et al. (2010) J. R. Soc. Interface 7:703-726.
Grillot-Courvalin et al. (1999) Curr. Opin. Biotech. 10(5):477-481.
Grillot-Courvalin et al. (1998) Nature Biotech. 16:862-866.
Gurel et al. (2009) Plant Cell Rep. 28:429-444.
Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16: 76-82.
Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591.
Hellinga (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:10015-10017.
Henikoff et al. (2004) Plant Physiol 135: 630-636.
Hense et al. (2001) Cell Microbiol. 3:599-609.
Hershey and Stoner (1991) Plant Mol. Biol. 17:679-690.
Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922.
Hirayama and Hujii (1965) Agricultural and Biological Chemistry 29:1-6.
Horvath et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:1914-1919.
Huang (1996) Plant Physiol. 110:1055-1061.
Iwabuchi et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:4603-4610.
Izawati et al. (2009) J. Oil Palm Res. 21:643-652.
James et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:17833-17838.
Jepson et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1855-1866.
Jezequel et al. (2008) Biotechniques 45:523-532.
Joviet et al. (2004) Plant Physiol. Biochem. 42:501-509.
Karmakar et al. (2010) Bioresource Technology 101:7201-7210.
Kindle (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1228-1232.
Klein et al. (1998) Exp. Neurol. 150:183-194.
Knothe (2005) Fuel Process. Technol. 86:1059-1070.
Knothe and Steidley (2005) Fuel 84:1059-1065.
Koziel et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:393-405.
Kuhn et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:34092-102.
Kunik et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1871-1876.
Kwak et al. (2007) Plant Physiol. 145:277-289.
Lacroix et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 105: 15429-15434.
Lakshminarayana et al. (1984) JAOCS 61:1249-1253.
Lam et al. (2010) Biotechnol. Adv. 28:500-18.
Lardizabal et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:38862-38869.
Lardizabal et al. (2008) Plant Physiol. 148: 89-96.
Larkin et al. (1996) Transgenic Res. 5:325-335.
Lee et al. (1998) Science 280:915-918.
Leung et al. (1989) Technique 1:11-15.
Li et al. (1996) FEBS Lett. 379:117-121.
Li et al. (2006) Phytochemistry 67: 904-915.
Li et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104:18339-44.
Lin et al. (2005) Plant Physiol. Biochem. 43:770-776.
Lindsey and Gallois (1990) Journal of Experimental Botany 41:529-536.
Liu et al. (2010a) Fuel 89:2735-2740.
Liu et al. (2010b) Plant Physiol. Biochem. 48: 9-15.
Lui et al. (2009) J. Agric. Food Chem. 57: 2308-2313.
Maher and Bressler (2007) Bioresource Technology 98:2351-2368.
Mann et al. (2011) BMC Biotechnol. 11:74.
Martinez and Jepson, Ecdysteroid agonist-inducible control of gene expression in plants. In Inducible Gene Expression in Plants. Edited by Reynolds PHS. New York: CABI Publishing; 1999:23-41.
Martinez et al. (1999) Plant J. 19:97-106.
Matsuoka et al. (1994) Plant J. 6:311-319.
Meier et al. (1997) FEBS Lett. 415:91-95.
Mett et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4567-4571.
Millar and Waterhouse (2005). Funct Integr Genomics 5:129-135.
Murashige and Skoog (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497.
Needleman and Wunsch (1970) J. Mol Biol. 45: 443-453
Ness et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1251-1255.
Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406.
Ostermeier et al. (1999) Nature Biotechnology 17:1205-1209.
Ow et al. (1986) Science 234:856-859.
Padidam (2003) Curr. Opin. Plant Biol. 6:169-77.
Padidam et al. (2003) Transgenic Res. 12:101-9.
Panekina (1978) Chemistry of Natural Compounds 14:33-36.
Parthibane et al. (2012) J. Biol. Chem. 287:1946-54.
Pasquinelli et al. (2005). Curr Opin Genet Develop 15:200-205.
Perez-Vich et al. (1998) JAOCS 75:547-555
Perriman et al. (1992) Gene 113:157-163.
Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.
Perry and Harwood (1993) Phytochemistry 33:329-333.
Phillips et al. (2002) Journal of Food Composition and Analysis 12:123-142.
Picard (1994) Cur. Top. Biotech. 5:511-515.
Pigeaire et al. (1997) Mol. Breed. 3:341-349.
Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 40:1-22.
Powell et al. (1996) Vaccines 183, Abstract.
Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 127:31-36.
Qiu et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:31561-3156
Ramamoorthy and Kumar (2012) Plant Cell Rep. 31:1923-1931.
Riddiford et al. (2000) Vitam. Horm. 60:1-73.
Rossell and Pritchard (1991) Analysis of Oilseeds, Fats and Fatty Foods. Elsevier
Ruuska et al. (2002) Plant Cell 14:1191-1206.
Ryan et al. (1984) J. Am. Oil Chem. Soc. 61:1610-1619.
Saha et al. (2006) Plant Physiol. 141:1533-1543.
Sanjaya et al. (2011) Plant Biotech. J. 9:874-883.
Schaffner (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:2163-2167.
Science Publishers Ltd: London (Chapter 2, pp.48-53).
Scott et al. (2010) Plant Biotechnol. J. 8(8):912-27
Semwal et al. (2011) Bioresource Technology 102:2151-2161.
Senior (1998) Biotech. Genet. Engin. Revs. 15:79-119.
Shiau et al. (2001) Vaccine 19:3947-3956.
Shiina et al. (1997) Plant Physiol. 115:477-483.
Shimada and Hara-Nishimura (2010) Biol. Pharm. Bull. 33:360-363.
Shippy et al., (1999) Mol. Biotech. 12:117-129.
Sieber et al. (2001) Nature Biotechnology 19:456-460.
Siloto et al. (2009) Lipids 44:963-973.
Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302.
Slade and Knauf (2005) Transgenic Res. 14: 109-115.
Smith et al. (2000) Nature 407:319-320.
Srinivasan et al. (2007) Planta 225:341-51.
Stalker et al. 1988 Science 242: 419-423.
Stemmer (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751.
Stemmer (1994b) Nature 370(6488):389-391.
Stobart et al. (1997) Planta 203:58-66.
Tan et al. (2011) Plant Physiol. 156:1577-1588.
Taylor (1997) The Plant Cell 9:1245-1249.
Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem 263:12500-12508.
Tingay et al. (1997) Plant J. 11:1369-1376.
Toriyama et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 73:16-19.
Tumaney et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:10847-10852.
Tzfira and Citovsky (2006) Curr. Opin. Biotech. 17:147-154.
Ulmasov et al. (1995) Plant Physiol. 108:919-927.
Unger et al. (2002) Transgenic Res. 11:455-465.
van de Loo et al. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A. 92:6743-6747.
Voinnet et al. (2003) Plant J. 33:949-956.
Volkov et al. (1999) Nucleic Acids Research 27(18):e18.
Wang et al. (2011) J. Agric. Food Chem. 60:144-52.
Waterhouse et al. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964.
Weinmann et al. (1994) Plant J. 5:559-569.
Weiss (2003) Int. J. Med. Microbiol. 293:95-106.
Weselake et al. (2009) Biotechnology Advances 27:866-878.
Winans et al. (1988) Journal of Bacteriology 170:4047-4054.
Wood et al. (2009). Plant Biotech. J. 7: 914-924.
Wood et al., manuscript in preparation
Yang et al. (2003) Planta 216:597-603.
Yang et al. (2010) PNAS 107:12040-12045.
Yen and Farese (2003) J. Biol. Chem. 278:18532-18537.
Yen et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8512-8517.
Yen et al. (2005) J. Lipid Res. 46: 1502-1511.
Zhang et al. (1999a) Plant Cell Reports 18:959-966.
Zhang et al. (1999b) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 56:37-46.
Zhao et al. (1998) Nature Biotechnology 16:258-261.
Zheng et al. (2003) The Plant Cell 15:1872-1887.
Zolotukhin et al. (1996) J. Virol. 70:4646-4654.

Claims (18)

  1. １以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、前記１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類と比較し、１以上の非極性脂質のレベルが増加している、植物またはその一部または藻類であり、ここで、前記１以上の各外因性ポリヌクレオチドは、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である第一の脂肪酸アシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、及び以下の一つ以上：
    （ｉ）脂質の分解に関与する、および／または、脂質含量を減少させる、ＳＵＧＡＲ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼであるリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子、
    （ｉｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子ポリペプチド、
    （ｉｉｉ）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）またはグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である第二の脂肪酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド
    をコードする１以上の更なる外因性ポリヌクレオチドを含み、
    前記ＷＲＩ１転写因子ポリペプチドが存在するのであれば、植物またはその一部または藻類における前記第一の脂肪酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド及び前記ＷＲＩ１転写因子ポリペプチドの発現は、各ポリペプチド単独の個々の効果の相加効果よりも大きい、植物またはその一部または藻類における非極性脂質の蓄積に対する効果を有する、植物またはその一部または藻類。
  2. 植物またはその一部または藻類は、前記（ｉ）のＲＮＡ分子及び前記（ｉｉ）のＷＲＩ１転写因子ポリペプチドを含む、請求項１に記載の植物またはその一部または藻類。
  3. １以上またはすべての以下の特長（ｉ）～（ｘｉｉｉ）が該当する、請求項１または２に記載の植物またはその一部または藻類：
    （ｉ）前記植物またはその一部または藻類の非極性脂質中の総脂肪酸含量が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類中の非極性脂質よりも、少なくとも２％多いオレイン酸、および／または、少なくとも２％少ないパルミチン酸、を含む、
    （ｉｉ）前記非極性脂質（複数含む）が、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素－炭素結合、三重炭素－炭素結合、共役二重結合、分枝鎖、またはそれらの２以上の組み合わせ、または、上述の基、結合または分枝鎖の任意の２、３、４、５または６つを含む脂肪酸を含む、
    （ｉｉｉ）前記植物またはその一部または藻類が、その脂質中で、エステル化形態またはエステル化していない形態で、オレイン酸を含んでおり、ここで、前記植物またはその一部または藻類の脂質中の総脂肪酸の少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である、
    （ｉｖ）前記植物またはその一部または藻類が、その非極性脂質中で、エステル化形態で、オレイン酸を含んでおり、ここで、前記植物または植物の育成部分または藻類の前記非極性脂質の総脂肪酸の、少なくとも２０％（ｍｏｌ％）、少なくとも２２％（ｍｏｌ％）、少なくとも３０％（ｍｏｌ％）、少なくとも４０％（ｍｏｌ％）、少なくとも５０％（ｍｏｌ％）、少なくとも６０％（ｍｏｌ％）、少なくとも６５％（ｍｏｌ％）、または少なくとも６６％（ｍｏｌ％）が、オレイン酸である、
    （ｖ）前記植物またはその一部または藻類の脂質中の総脂肪酸含量が、１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類中の脂質よりも、少なくとも２％多いオレイン酸、および／または、少なくとも２％少ないパルミチン酸、を含む、
    （ｖｉ）前記非極性脂質（複数含む）が、総ステロール、遊離ステロール、ステロイルエステルおよび／またはステロイルグリコシド、の改変レベルを含む、
    （ｖｉｉ）前記非極性脂質（複数含む）が、ワックスおよび／またはワックスエステルを含む、
    （ｖｉｉｉ）前記植物またはその一部が、少なくとも１０００のそのような植物またはその一部の、群またはコレクションの一員である、
    （ｉｘ）植物の生育部分が、少なくとも１０％の総非極性脂質含量を有する、
    （ｘ）１以上の更なる外因性ポリヌクレオチドが、サイレンシングサプレッサーポリペプチドをコードする、
    （ｘｉ）前記植物の一部が、種子、果実、または、植物の生育部分である、
    （ｘｉｉ）前記植物またはその一部または藻類が、前記１以上の非極性脂質を安定化させるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを更に含む、
    （ｘｉｉｉ）前記植物またはその一部または藻類が、デンプン生合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
  4. 前記藻類が、珪藻植物（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔｅｓ）、緑藻類（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、青緑藻類（ｃｙａｎｏｐｈｙｔｅｓ）、金茶藻類（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔｅｓ）、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類（ｈｅｔｅｒｏｋｏｎｔ ａｌｇａｅ）からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の藻類。
  5. 前記非極性脂質の総ステロール含量および／または組成が、前記１以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類の非極性脂質の総ステロール含量および／または組成と、有意に異なる、請求項１から４のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類。
  6. １以上の非極性脂質の増加レベルが、以下の特長のうちの１以上またはすべてが該当するものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類：
    （ｉ）前記レベルは、対応する植物またはその一部または藻類のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも０．５％大きい、
    （ｉｉ）前記レベルは、対応する植物またはその一部または藻類のレベルよりも、相対ベースで、少なくとも１％大きい、
    （ｉｉｉ）前記植物またはその一部または藻類の総非極性脂質含量は、対応する植物またはその一部または藻類の含量よりも、それぞれ、重量ベースで、少なくとも０．５％大きい、
    （ｉｖ）前記植物またはその一部または藻類の総非極性脂質含量は、対応する植物またはその一部または藻類の含量よりも、それぞれ、相対ベースで、少なくとも１％大きい、
    （ｖ）前記植物またはその一部または藻類の１以上の非極性脂質のレベル及び／または総非極性脂質含量が、１以上の外因性ポリヌクレオチド有していないが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａＤＧＡＴ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む対応する植物またはその一部または藻類のものと比較した際に、それぞれ重量ベースで少なくとも０．５％大きい、及び／または相対ベースで少なくとも１％大きい。
  7. 以下を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類：
    （ｉ）対応する植物またはその一部または藻類のＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量よりも、相対ベースで少なくとも１０％大きい、ＴＡＧ、ＤＡＧ、ＴＡＧおよびＤＡＧ、またはＭＡＧ含量、および／または
    （ｉｉ）対応する植物またはその一部または藻類の総多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含量と比較して増加または減少している、総ＰＵＦＡ含量。
  8. 前記１以上の外因性ポリヌクレオチドは以下をコードする、請求項１から７のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類：
    （ｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子およびＤＧＡＴ、
    （ｉｉ）ＷＲＩ１転写因子およびＤＧＡＴおよびオレオシン、
    （ｉｉｉ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴおよびオレオシン、
    （ｉｖ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴおよびＭＧＡＴ、または
    （ｖ）ＷＲＩ１転写因子、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、オレオシンおよびＧＰＡＴ。
  9. 前記１以上の非極性脂質を安定化するポリペプチドが、オレオシンであり、前記植物またはその一部または藻類が、以下の特長のうちの１以上、またはすべてを有している、請求項３から８のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類：
    （ｉ）少なくとも１０％、少なくとも１２．５％、少なくとも１５％、または少なくとも１７％（乾重量の重量％）の総ＴＡＧ含量、
    （ｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類と比較して、前記植物またはその一部または藻類の総ＴＡＧ含量が、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも１００倍、高い、
    （ｉｉｉ）オレイン酸が、前記ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも１９％、少なくとも２２％、または少なくとも２５％（重量％）を構成する、
    （ｉｖ）パルミチン酸が、前記ＴＡＧ中の脂肪酸の少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも２８％（重量％）を構成する、
    （ｖ）前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類と比較して、前記植物またはその一部または藻類のＴＡＧ中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも１．２５倍高い、
    （ｖｉ）リノール酸が、前記ＴＡＧ中の脂肪酸の、少なくとも１５％、または少なくとも２０％（重量％）を構成する、
    （ｖｉｉ）αリノレン酸が、前記ＴＡＧ中の脂肪酸の、１５％未満、１１％未満、または８％未満（重量％）を構成する、および、
    （ｖｉｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類と比較して、前記植物またはその一部または藻類のＴＡＧ中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも５倍、または少なくとも８倍、低い。
  10. 以下の一つ以上：
    （ｉ）脂質の分解に関与する、および／または、脂質含量を減少させる、ＳＵＧＡＲ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴ１トリアシルグリセロールリパーゼであるリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するＲＮＡ分子、
    （ｉｉ）Ｗｒｉｎｋｌｅｄ１（ＷＲＩ１）転写因子ポリペプチド、
    （ｉｉｉ）モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）またはグリセロール－３－リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）である第二の脂肪酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド
    をコードする１以上の更なる外因性ポリヌクレオチド、及び、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）である第一の脂肪酸アシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドの、前記ポリヌクレオチドを有していない対応する植物またはその一部または藻類に比較して、１以上の非極性脂質を生産する増大した能力を有する植物またはその一部または藻類の生産のための使用であって、
    前記ポリヌクレオチドが、植物またはその一部または藻類に対して外因性であり、それぞれトランスジェニック植物またはその一部または藻類中の前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、
    前記ＷＲＩ１転写因子ポリペプチドが存在するのであれば、植物またはその一部または藻類における前記第一の脂肪酸アシルトランスフェラーゼポリペプチド及び前記ＷＲＩ１転写因子ポリペプチドの発現は、各ポリヌクレオチド単独の個々の効果の相加効果よりも大きい、植物またはその一部または藻類における非極性脂質の蓄積に対する効果を有する、使用。
  11. 脂肪酸エステル、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、アルカン、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、エタノール、プロパノール、ブタノール、またはバイオ炭を含む炭化水素製品の製造のための、請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類の使用。
  12. 工業製品を製造する方法であって、以下のステップ：
    （ｉ）請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類を得ること、および、
    （ｉｉ）任意選択的にステップ（ｉ）の前記植物またはその一部または藻類を物理的に処理すること、および
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記植物またはその一部または藻類の、またはステップ（ｉｉ）によって得られた処理された植物またはその一部または藻類の、前記脂質の少なくとも一部を、熱、化学的手段または酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを、前記ステップ（ｉ）の前記植物またはその一部または藻類の、またはステップ（ｉｉ）によって得られた処理された植物またはその一部または藻類の脂質に、ｉｎ ｓｉｔｕで適用することにより、工業製品へと転換すること、および、
    （ｉｖ）前記工業製品を回収すること
    を含み、それによって工業製品を製造する方法。
  13. 抽出脂質の製造方法であって、以下のステップを含む方法：
    （ｉ）請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類を得ること、
    （ｉｉ）前記植物またはその一部または藻類から脂質を抽出すること、および、
    （ｉｉｉ）前記抽出された脂質を回収すること。
  14. （ｉ）請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類から脂質を抽出または回収する工程、
    （ｉｉ）任意選択的に触媒の存在下で、前記脂質とアルコールを反応させ、アルキルエステルを産生すること、および、
    （ｉｉｉ）任意選択的にアルキルエステルと石油ベースの燃料とを混合させること、
    を含む、燃料を製造する工程。
  15. （ｉ）請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類において、ｉｎ ｓｉｔｕで脂質をガス化により合成ガスへと転換すること、および、
    （ｉｉ）前記合成ガスを、金属触媒または微生物触媒を用いて、バイオ燃料へと転換すること、
    を含む、合成ディーゼル燃料を製造する方法。
  16. 請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類において、ｉｎ ｓｉｔｕで脂質を熱分解によりバイオ－油へと転換すること、発酵によりバイオアルコールへと転換すること、またはガス化若しくは嫌気性消化によりバイオガスへと転換することを含む、バイオ燃料を製造する方法。
  17. 請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類を含む、飼料、化粧品または化学薬品。
  18. 請求項１から９のいずれか１項に記載の植物またはその一部または藻類、あるいは請求項１７に記載の飼料をヒト以外の動物に提供することを含む、ヒト以外の動物の食餌方法。
JP2018242706A 2011-12-27 2018-12-26 脂質製造のための工程 Active JP7097805B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161580590P 2011-12-27 2011-12-27
US61/580,590 2011-12-27
US201261718563P 2012-10-25 2012-10-25
US61/718,563 2012-10-25

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014549274A Division JP6461604B2 (ja) 2011-12-27 2012-12-21 脂質製造のための工程

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019088285A JP2019088285A (ja) 2019-06-13
JP7097805B2 true JP7097805B2 (ja) 2022-07-08

Family

ID=48654931

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014549274A Active JP6461604B2 (ja) 2011-12-27 2012-12-21 脂質製造のための工程
JP2018242706A Active JP7097805B2 (ja) 2011-12-27 2018-12-26 脂質製造のための工程

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014549274A Active JP6461604B2 (ja) 2011-12-27 2012-12-21 脂質製造のための工程

Country Status (15)

Country Link
US (6) US8735111B2 (ja)
EP (1) EP2798066A4 (ja)
JP (2) JP6461604B2 (ja)
CN (2) CN104271743B (ja)
AR (1) AR089442A1 (ja)
AU (1) AU2012324024B2 (ja)
BR (1) BR112014015921A2 (ja)
CA (2) CA3203397A1 (ja)
CL (1) CL2014001715A1 (ja)
MX (2) MX2014007964A (ja)
MY (2) MY196561A (ja)
PH (1) PH12014501474A1 (ja)
RU (1) RU2656996C2 (ja)
UA (1) UA119739C2 (ja)
WO (1) WO2013096993A1 (ja)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105123532B (zh) 2006-07-14 2018-12-18 联邦科学技术研究组织 改变水稻的脂肪酸组成
AU2009240794A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
AU2009273755A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
US8772004B2 (en) * 2009-06-25 2014-07-08 Old Dominion University Research Foundation System and method for high-voltage pulse assisted aggregation of algae
CA2804025C (en) 2010-06-28 2023-02-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of producing lipids
AU2012294369A1 (en) * 2011-08-09 2014-02-20 Sapphire Energy, Inc. Compositions of matter comprising extracted algae oil
US8735111B2 (en) * 2011-12-27 2014-05-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing hydrocarbon products
US8809026B2 (en) 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
US11639507B2 (en) 2011-12-27 2023-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
AU2013252489B2 (en) 2012-04-25 2018-04-26 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High oleic acid oils
CN104684389A (zh) 2012-05-10 2015-06-03 索卢泰克斯Na有限责任公司 含有天然专门促消退介质及其前体的具有抗炎活性的油
US9657304B2 (en) * 2012-07-10 2017-05-23 Board Of Trustees Of Michigan State University Genetically engineered plants with increased vegetative oil content
US8673154B2 (en) * 2012-07-12 2014-03-18 Heliae Development, Llc Tunable electrical field for aggregating microorganisms
US8668827B2 (en) * 2012-07-12 2014-03-11 Heliae Development, Llc Rectangular channel electro-acoustic aggregation device
US8709258B2 (en) * 2012-07-12 2014-04-29 Heliae Development, Llc Patterned electrical pulse microorganism aggregation
US8702991B2 (en) * 2012-07-12 2014-04-22 Heliae Development, Llc Electrical microorganism aggregation methods
US8709250B2 (en) * 2012-07-12 2014-04-29 Heliae Development, Llc Tubular electro-acoustic aggregation device
US10253325B2 (en) * 2012-12-19 2019-04-09 Boston Medical Center Corporation Methods for elevating fat/oil content in plants
CN105247038B (zh) 2013-03-15 2021-08-27 小利兰·斯坦福大学托管委员会 产生苄基异喹啉生物碱(bia)的微生物及其制备和使用方法
ES2663596T3 (es) * 2013-07-19 2018-04-16 Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.) Cepa de algas modificada y método de acumulación de triacilglicerol utilizando dicha cepa
CN105636974A (zh) 2013-08-14 2016-06-01 堪萨斯州立大学研究基金会 热稳定性淀粉合成酶基因的表达提高在热应力下的产量
US9957514B2 (en) * 2013-08-21 2018-05-01 Cold Spring Harbor Laboratory Transformation of duckweed and uses thereof
US9394503B2 (en) * 2013-10-15 2016-07-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Separation process of oil and sugars from biomass
CA2965469A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Benzylisoquinoline alkaloid (bia) precursor producing microbes, and methods of making and using the same
US9365780B2 (en) * 2014-02-19 2016-06-14 King Abdulaziz City For Science And Technology Cold process for removal of sulfur in straight run diesel by ozone and tert-butyl hydroperoxide
US20150322468A1 (en) * 2014-05-07 2015-11-12 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Method of producing biofuel using microalgae cultures
PT107637A (pt) * 2014-05-15 2015-11-16 Inst Superior Técnico Produção de combustíveis utilizando glicolípidos microbianos com cadeias lipídicas compostas por 6 a 14 carbonos
US9593344B2 (en) * 2014-07-03 2017-03-14 Brookhaven Science Associates, Llc Enhanced triacylglycerol accumulation in vegetative tissues of plants
WO2016004473A1 (en) * 2014-07-07 2016-01-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing industrial products from plant lipids
US9643163B2 (en) 2014-10-10 2017-05-09 Crystaphase Products, Inc. Heterogeneous catalyst for transesterification and method of preparing same
CN105092771B (zh) * 2015-03-23 2017-04-26 广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院） 一种石柑子的薄层色谱快速鉴别方法
US10144696B2 (en) 2015-04-17 2018-12-04 Crystaphase Products, Inc. Heterogeneous catalyst for transesterification and method of preparing same
CN107614688B (zh) 2015-05-04 2023-02-28 小利兰·斯坦福大学托管委员会 产生苄基异喹啉生物碱(bia)前体的微生物及其制备和使用方法
DK3294865T3 (da) 2015-05-08 2023-05-08 Univ Leland Stanford Junior Fremgangsmåder til fremstilling af epimeraser og benzylisoquinolinalkaloider
ES2873198T3 (es) * 2015-07-14 2021-11-03 Synthetic Genomics Inc Microorganismos que tienen un aumento en la productividad de lípidos
US10653703B2 (en) 2015-09-03 2020-05-19 Solutex Na Llc Compositions comprising omega-3 fatty acids, 17-HDHA and 18-HEPE and methods of using same
AU2017204957B2 (en) * 2016-01-07 2023-05-18 Nuseed Global Innovation Ltd Plants with modified traits
KR101743117B1 (ko) * 2016-02-03 2017-06-02 전남대학교산학협력단 카멜리나 식물의 종자 무게, 크기 및 저장 오일 함량을 증가시키는 애기장대 유래 AtWRI1 유전자 및 이의 용도
US10328361B2 (en) 2016-02-25 2019-06-25 Jeffrey M. Skell Extracting substances from botanical matter
US20190045735A1 (en) * 2016-02-26 2019-02-14 Nathan Golas High alpha linolenic acid flax
CN110218712B (zh) * 2016-06-02 2021-08-03 天津科技大学 磷脂酶d突变体及其在制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸中的应用
FR3052459B1 (fr) * 2016-06-13 2020-01-24 Bio-Think Melange destine a alimenter une chaudiere ou un moteur diesel comprenant des esters et des alcanes particuliers
EP3507370A4 (en) * 2016-09-02 2020-06-24 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation PLANTS WITH MODIFIED TRAITS
CN106676083B (zh) * 2016-11-14 2020-06-16 浙江大学 一种脂肪酶提取方法
CN108265090B (zh) * 2016-12-30 2021-06-15 中粮集团有限公司 南极磷虾油替代物的制备方法
BR112020002050A2 (pt) 2017-08-03 2020-09-08 Antheia, Inc. epimerases engenheiradas alcaloides benzilisoquinolina e métodos de produção de alcaloides benzilisoquinolina
CN109722451A (zh) * 2017-10-27 2019-05-07 西北农林科技大学 生物炭介导的固体生物膜厌氧消化促进剂及其制备方法
CN108070603B (zh) * 2017-12-28 2021-06-08 洛阳健特药业有限公司 一种提高油用牡丹籽含油率的转基因方法
US11913006B2 (en) * 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
CN108342349A (zh) * 2018-03-20 2018-07-31 中国科学院烟台海岸带研究所 利用多种植物激素诱导三角褐指藻大量积累油脂的方法
JP2021521864A (ja) * 2018-05-01 2021-08-30 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ ホルモンフリーの植物再生のための遺伝子
CN108587916B (zh) * 2018-05-23 2021-09-14 昆明理工大学 一种共培养单针藻在中性条件下快速絮凝的方法
CN108728448B (zh) * 2018-06-04 2020-06-09 青岛农业大学 一种花生油脂合成相关基因及其应用
CN108802245B (zh) * 2018-06-06 2021-06-22 四川新绿色药业科技发展有限公司 一种天花粉或含天花粉为原料制备的药物的检测方法
BR112021007367A2 (pt) * 2018-10-17 2021-08-10 Perfect Day, Inc componentes e composições recombinantes para uso em produtos alimentares
CN110106019A (zh) * 2019-05-20 2019-08-09 无限极（中国）有限公司 一种利用裂壶藻生产复合型多不饱和脂肪酸油脂的方法
CN110295153A (zh) * 2019-07-05 2019-10-01 中国农业大学 一种甘油-3-磷酸酰基转移酶的编码基因及其应用
CN112239493B (zh) * 2020-11-17 2022-04-08 西南大学 蜡梅CpWRI-L4基因及其编码的蛋白与应用
CN114516906B (zh) * 2020-11-19 2023-11-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 玉米与菌根真菌共生相关蛋白及其编码基因与应用
CN113186244B (zh) * 2021-04-12 2023-05-09 河南农业大学 一种酸性环境中的光合生物制氢方法
WO2023212654A2 (en) * 2022-04-27 2023-11-02 The Regents Of The University Of Colorado A Body Corporate Non-endogenous protein production in plant systems

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008157226A2 (en) 2007-06-15 2008-12-24 Hilary Koprowski Engineered plant biomass with increased oil production

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4102938A (en) 1977-03-02 1978-07-25 Kalur Vijaya Chandra Rao Production of hydrocarbons by thermolysis of vegetable oils
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
WO1984002913A1 (en) 1983-01-17 1984-08-02 Monsanto Co Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
CA1338902C (en) 1986-02-27 1997-02-11 Howard M. Goodman Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
MA20977A1 (fr) 1986-05-19 1987-12-31 Ciba Geigy Ag Plantes tolerant les herbicides contenant le gene de gluthathione S-Transferase
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
US4948811A (en) 1988-01-26 1990-08-14 The Procter & Gamble Company Salad/cooking oil balanced for health benefits
US4992605A (en) 1988-02-16 1991-02-12 Craig Wayne K Production of hydrocarbons with a relatively high cetane rating
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
DE69031711T2 (de) 1989-08-09 1998-04-09 Dekalb Genetics Corp Methoden und zusammensetzungen für die herstellung von stabil transformierten, fruchtbaren mais pflanzen und zellen dafür
GB2237815B (en) 1989-11-06 1994-01-05 Univ Singapore Production of synthetic crude petroleum
ES2163392T3 (es) 1990-03-16 2002-02-01 Calgene Llc Nuevas secuencias expresadas preferentemente en el desarrollo de semillas precoces, y procedimientos relacionados con las mismas.
US5877402A (en) 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
DE69207749T2 (de) * 1991-01-16 1996-06-13 Kirin Brewery Kälteresistente pflanzen und ihre herstellung
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
AU3073592A (en) 1991-11-15 1993-06-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Beta -ketoacyl-acp synthetase ii genes from plants
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
WO1994019930A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 National Research Council Of Canada Enhanced regeneration system for cereals
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
DE4433307A1 (de) * 1994-09-19 1996-03-21 Norddeutsche Pflanzenzucht Han Ein isoliertes Nuckleinsäurefragment und daraus abgeleitete Produkte
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
GB9510927D0 (en) * 1995-05-31 1995-07-26 Ca Nat Research Council Plant and seed oil modification
US5939288A (en) 1995-06-07 1999-08-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant secretory signal peptides and nectarins
GB9524938D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Zeneca Ltd Modification of starch synthesis in plants
CZ86798A3 (cs) 1996-06-21 1999-03-17 Monsanto Company Fertilní transgenní rostlina pšenice, způsob její přípravy, buňky a semena této rostliny
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
DK0975765T3 (da) 1997-04-15 2007-02-19 Commw Scient Ind Res Org Plantefedtsyre-epoxygenase-gener og anvendelse deraf
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
EP1003882A1 (en) 1997-06-05 2000-05-31 Calgene LLC Diacylglycerol acyl transferase proteins
AU8583798A (en) 1997-07-23 1999-02-16 Centro De Investigacion Y De Estudios Avanzados Del I.P.N. Improved plastid transformation of higher plants and production of trans genic plants with herbicide resistance
JP2001516575A (ja) 1997-09-12 2001-10-02 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼイション 植物における遺伝子発現の調節
EP1019517B2 (en) 1997-09-30 2014-05-21 The Regents of The University of California Production of proteins in plant seeds
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
CA2487328A1 (en) 1998-03-20 1999-09-30 Benitec Australia Ltd. Sirna for control of gene expression
PT1064387E (pt) 1998-03-20 2008-09-15 Du Pont Genes de óleo de limanthes
CN1202246C (zh) 1998-04-08 2005-05-18 联邦科学和工业研究组织 获得修饰表型的方法和措施
WO1999067268A1 (en) 1998-06-24 1999-12-29 The Regents Of The University Of California Diacylglycerol o-acyltransferase
US6344548B1 (en) 1998-06-24 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Diacylglycerol o-acyltransferase
US7135617B2 (en) 1998-07-02 2006-11-14 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
DE69941390D1 (de) 1998-07-02 2009-10-22 Calgene Llc Diacylglyzerin-acyltransferase proteine
EP1105486B1 (en) 1998-08-20 2011-04-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for plant fatty acid modifying enzymes associated with conjugated double bond formation
US6100077A (en) 1998-10-01 2000-08-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of a gene encoding diacylglycerol acyltransferase
CA2851896C (en) 1998-12-02 2016-05-17 Karlene H. Butler Plant diacylglycerol acyltransferases
AU2166400A (en) 1998-12-04 2000-06-19 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
ATE340861T1 (de) 1998-12-17 2006-10-15 Ca Nat Research Council Diacylglyzerin-acyltransferase gen aus pflanzen
UA75041C2 (en) 1999-04-01 2006-03-15 Basf Plant Science Gmbh Use of ferment of phospholipiddiacyglycerintransferase as catalyst in the process of biosynthetic producing triacylglycerin
AU784352B2 (en) 1999-05-04 2006-03-16 Cargill Incorporated Plant acyltransferases
DE19941609A1 (de) * 1999-09-01 2001-03-08 Inst Pflanzenbiochemie Ipb Fettsäure-Desaturase-Gen aus Pflanzen
DE19950589A1 (de) 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
ATE476514T1 (de) 2000-04-18 2010-08-15 Commw Scient Ind Res Org Verfahren zur modifizierung des baumwollölgehaltes
US20030161831A1 (en) 2001-02-23 2003-08-28 Sylvaine Cases Mono-and diacylglycerol acyltransferases and methods of use thereof
US7045326B2 (en) 2001-02-23 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Mono- and diacylglycerol acyltransferases and methods of use thereof
EP1423521B1 (en) 2001-06-06 2008-08-13 Bioriginal Food & Science Corp. Flax (linum usitatissimum l.) seed-specific sequences
CA2470061A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Xiaoming Bao Plant cyclopropane fatty acid synthase genes, proteins and uses thereof
DE60335708D1 (de) 2002-03-16 2011-02-24 Univ York E exprimieren
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
WO2004000871A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Monsanto Technology Llc Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods
WO2004011671A2 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Monsanto Technology, Llc Diacylglycerol acyltransferase nucleic acid sequences and associated products
BR0313722A (pt) 2002-08-12 2007-08-14 Monsanto Technology Llc método para aumentar os nìveis totais de óleos em plantas
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
WO2005063988A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of oil traits in plants
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
CA3023314C (en) 2004-04-22 2019-12-10 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
UA89960C2 (ru) * 2004-06-16 2010-03-25 Басф Плант Саенс Гмбх Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют wrinkled1-подобные полипептиды
CA2580736A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 Basf Plant Science Gmbh Arabidopsis genes encoding proteins involved in sugar and lipid metabolism and methods of use
US8685679B2 (en) * 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
EP1806398A1 (en) 2006-01-04 2007-07-11 Monsanto S.A.S. Fad-2 mutants and high oleic plants
AU2007223426B2 (en) 2006-03-01 2013-05-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compositions related to the quantitative trait locus 6 (QTL6) in maize and methods of use
GB2436068A (en) 2006-03-18 2007-09-19 Ernest Mark Talbot Surgical contact lens
EP1837397A1 (en) 2006-03-21 2007-09-26 Monsanto S.A.S. FAD-2 mutants and high oleic plants
AU2007272257B2 (en) * 2006-07-13 2013-03-21 National Research Council Of Canada Acyl-CoA-dependent diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1 ) gene from Tropaeolum majus, protein encoded thereby and uses thereof
CN105123532B (zh) 2006-07-14 2018-12-18 联邦科学技术研究组织 改变水稻的脂肪酸组成
WO2008025068A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
US20090061492A1 (en) * 2006-11-15 2009-03-05 The Board Of Trustees For Michigan State University System Method for producing biodiesel
EP1944375A1 (en) 2007-01-11 2008-07-16 Monsanto S.A.S. FAD2 mutants and high oleic acid plants
BRPI0720801A2 (pt) * 2007-01-25 2014-09-16 Dupont Nutrition Biosci Aps Produção de um lipídio aciltranfersase a partir de células transformadas de bacillus licheniformis.
NZ554114A (en) 2007-04-23 2010-01-29 Agres Ltd Plants with an increased ratio of oleosin to TAG synthesising enzymes
WO2008157827A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Michigan State University Modified composition of plant extracellular lipids using acyltransferases and fatty acid omega-oxidases
WO2009027335A2 (en) 2007-08-28 2009-03-05 Basf Plant Science Gmbh Polypeptides, such as lipases, capable of altering the seed storage content in transgenic plants
WO2009073822A2 (en) 2007-12-04 2009-06-11 The Ohio State University Research Foundation Molecular approaches for the optimization of biofuel production
JP5299886B2 (ja) * 2008-03-04 2013-09-25 トヨタ自動車株式会社 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法
AU2009240794A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
AU2009240795B2 (en) 2008-04-25 2014-03-20 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant cells and methods for hydroxylating fatty acids
CA2722458C (en) * 2008-05-23 2018-03-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Dgat genes from yarrowia lipolytica combined with plastidic phosphoglucomutase down regulation for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants
CA2723427C (en) 2008-05-23 2018-01-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Novel dgat genes for increased seed storage lipid production and altered fatty acid profiles in oilseed plants
CN101597329B (zh) * 2008-06-06 2012-05-02 中国科学院遗传与发育生物学研究所 与植物脂肪酸和油脂代谢相关的转录因子及其编码基因与应用
AU2009273755A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
EP3260544A1 (en) 2008-11-18 2017-12-27 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
CN101747417B (zh) * 2008-12-22 2012-12-26 浙江省农业科学院 调节植物光能利用及油脂积累的基因及其应用
WO2010088426A1 (en) * 2009-01-31 2010-08-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Engineering lipids in vegetative tissues of plants
NZ599429A (en) * 2009-10-30 2014-06-27 Agres Ltd Modified oil encapsulating proteins and uses thereof
CA2780527C (en) * 2009-11-23 2020-12-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sucrose transporter genes for increasing plant seed lipids
CN102070706B (zh) * 2009-11-24 2013-01-23 中国科学院遗传与发育生物学研究所 与种子脂肪酸合成相关的蛋白AtL1L及其编码基因与应用
CN102071193B (zh) * 2009-11-24 2012-11-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 来源于甘蓝油菜的启动子及其应用
CA2787947A1 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Syngenta Participations Ag Systems and processes for producing biofuels from biomass
CN102268441B (zh) * 2010-06-04 2012-12-12 中国农业科学院油料作物研究所 油菜生长调节因子基因grf2及应用
CA2804025C (en) 2010-06-28 2023-02-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of producing lipids
US8657999B2 (en) * 2010-07-28 2014-02-25 General Electric Company Methods for preparing fuel compositions from renewable sources, and related systems
BR112014002748A2 (pt) 2011-08-05 2017-02-21 Agresearch Ltd métodos para aumento de assimilação de co2 e produção de óleo em organismos fotossintéticos
US8735111B2 (en) 2011-12-27 2014-05-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing hydrocarbon products
CA2860416C (en) 2011-12-27 2024-04-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
US8809026B2 (en) 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008157226A2 (en) 2007-06-15 2008-12-24 Hilary Koprowski Engineered plant biomass with increased oil production

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Plant Biotechnol. J.，2010年，vol.8, no.3，pp.277-287
Plant J.，2004年，vol.40, no.4，pp.575-585
Plant Physiol.，2001年，vol.126, no.2，pp.861-874
Plant Physiol.，2010年，vol.153, no.3，pp.980-987
Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2010年，vol.107, no.41，pp.17833-17838

Also Published As

Publication number Publication date
RU2018116488A (ru) 2018-10-23
JP6461604B2 (ja) 2019-01-30
US8735111B2 (en) 2014-05-27
UA119739C2 (uk) 2019-08-12
RU2018116488A3 (ja) 2021-12-28
EP2798066A4 (en) 2016-02-24
BR112014015921A2 (pt) 2021-05-25
CN104271743B (zh) 2019-11-05
RU2014131059A (ru) 2016-02-20
US9512438B2 (en) 2016-12-06
US20190203125A1 (en) 2019-07-04
BR112014015921A8 (pt) 2017-07-04
CA3203397A1 (en) 2013-07-04
US20150267216A1 (en) 2015-09-24
CA2860434C (en) 2023-08-08
JP2015511118A (ja) 2015-04-16
US20130164798A1 (en) 2013-06-27
MX2014007964A (es) 2014-10-06
AU2012324024A1 (en) 2013-07-11
CN104271743A (zh) 2015-01-07
CN110951769A (zh) 2020-04-03
US20170037320A1 (en) 2017-02-09
AU2012324024B2 (en) 2016-06-16
CA2860434A1 (en) 2013-07-04
US10246641B2 (en) 2019-04-02
PH12014501474A1 (en) 2014-10-08
CL2014001715A1 (es) 2015-04-24
US20230058089A1 (en) 2023-02-23
MY196561A (en) 2023-04-19
MX2019005692A (es) 2019-09-05
MY188956A (en) 2022-01-14
NZ627107A (en) 2016-12-23
US20140256006A1 (en) 2014-09-11
JP2019088285A (ja) 2019-06-13
RU2656996C2 (ru) 2018-06-07
AR089442A1 (es) 2014-08-20
WO2013096993A1 (en) 2013-07-04
US9061992B2 (en) 2015-06-23
EP2798066A1 (en) 2014-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7097805B2 (ja) 脂質製造のための工程
JP7410080B2 (ja) 植物脂質から工業製品を製造する工程
US10246718B2 (en) Processes for producing lipids
US20230399653A1 (en) Process for producing lipids
AU2021240309A1 (en) Processes for producing lipids
RU2804627C2 (ru) Способ получения липидов
NZ627107B2 (en) Processes for producing lipids

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181227

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181227

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200114

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200408

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200710

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201214

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210311

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210614

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20211115

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20220214

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220513

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220530

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220628

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7097805

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350