JP2019088285A - 脂質製造のための工程 - Google Patents
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Abstract
Description
トリアシルグリセロール類(TAG)は、種子中の脂質の主形態を構成し、エステル化されグリセロール主鎖となる3つのアシル鎖から構成される。脂肪酸は、アシル−アシル担体タンパク質(ACP)中間体として、最初の不飽和化触媒を受けることができる色素体中で合成される。この反応は、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ(不飽和化酵素)により触媒され、オレイン酸(C18:1Δ9)を生成する。次いで、アシル鎖は、アシル−コエンザイム(CoA)エステルとして細胞質および小胞体(ER)へと移送される。主要なTAG生合成経路(Kennedy経路またはグリセロール3リン酸(G3P)経路としてもまた知られる)に入る前に、アシル鎖は、通常、ER膜のリン脂質へと組み込まれ、さらなる不飽和化を受けることができる。多価不飽和脂肪酸の産生における2つの重要な酵素は、膜結合FAD2およびFAD3デサチュラーゼであり、それらは、それぞれ、リノール酸(C18:2Δ9、12)およびαリノレン酸(C18:3Δ9、12、15)を産生する。
i)少なくとも約3%、好ましくは少なくとも約5%、または少なくとも約7%(w/w乾重量)の非極性脂質総含量を有する生育植物部分を得ること、
ii)加熱手段、化学的手段もしくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせにより、生育植物部位の脂質の少なくとも一部を、in situで工業製品に転換すること、および、
iii)当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
i)少なくとも約3%、好ましくは少なくとも約5%、または少なくとも約7%(w/w乾重量)の非極性脂質総含量を有する生育植物部位を得ること、
ii)ステップi)の植物部位を物理的に処理すること、
iii)加熱手段、化学的手段、もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを、当該処理された生育植物部位中の脂質に与えることにより、当該処理された生育植物部位の脂質の少なくとも一部を工業製品へと転換すること、および、
iv)当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
i)1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、非ヒト生物またはその一部を得ることであって、ここで、1以上の外因性ポリヌクレオチドの各々は、非ヒト生物またはその一部において、当該ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターと動作可能に連結され、および、当該非ヒト生物またはその一部は、当該1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加していること、および、
ii)加熱手段、化学的手段もしくは酵素的手段またはそれらの任意の組み合わせにより、非ヒト生物またはその一部の、少なくとも一部の脂質をin situで、工業製品へと転換すること、および、
iii)当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
i)1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む非ヒト生物またはその一部を得ることであって、ここで、当該非ヒト生物またはその一部は、当該1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加していること、
ii)ステップi)の非ヒト生物またはその一部を物理的に処理すること、
iii)当該処理された非ヒト生物またはその一部の、少なくとも一部の脂質を、加熱手段、化学的手段もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを当該処理された非ヒト生物またはその一部の脂質へと適用することにより、工業製品へと転換すること、
iv)当該工業製品を回収すること、それによって、当該工業製品を製造すること。
(a)生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の非極性脂質含有物の少なくとも一部を、非極性脂質として、抽出すること、および、
(b)当該抽出された非極性脂質を回収すること、
のステップを含み、
(a)および(b)のステップは、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部中の脂質の少なくとも一部を工業製品へと転換させるステップの前に実施される。最初に抽出される非極性脂質の割合は、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部中の総非極性脂質の、50%未満、または50%超、または好ましくは少なくとも75%であり得る。この実施形態において、抽出される非極性脂質は、トリアシルグリセロールを含み、ここで、当該トリアシルグリセロールは、抽出された脂質の少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%を構成する。抽出された脂質は、それ自体、それ自体の脂質以外(たとえばトランスエステル化により脂肪酸エステル等)の工業製品へと、転換されても良い。
i)1以上の外因性ポリヌクレオチドおよび、それぞれに1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、高いレベルの1以上の非極性脂質を含む非ヒト生物またはその一部を得ること、
ii)非ヒト生物またはその一部から脂質を抽出すること、および、
iii)当該抽出脂質を回収すること、
それにより、抽出脂質を製造するであって、ここで、各1以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部において、当該ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、および、以下の特長の1つ以上またはすべてが該当する:
(a)1以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部において、1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNAまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
(b)もし非ヒト生物が植物である場合、植物の生育部分が、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも約5%、好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量)の総非極性脂質含量を有している、
(c)非ヒト生物が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類からなる群から選択される藻類である、
(d)1以上の非極性脂質は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)またはそれらの2以上の組み合わせ、または、前述の基、結合もしくは鎖の任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸を含む、
(e)非極性脂質(複数含む)の総脂肪酸含有量が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の非極性脂質(複数含む)よりも、少なくとも2%多いオレイン酸および/または少なくとも2%少ないパルミチン酸を含む、
(f)非極性脂質(複数含む)が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の非極性脂質(複数含む)と比較して、改変レベルの総ステロール類(好ましくは遊離(非エステル化)ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド)を含む、
(g)非極性脂質(複数含む)が、ワックスおよび/またはワックスエステルを含む、
(h)非ヒト生物またはその一部は、それぞれ、脂質が抽出される、少なくとも1000のそのような非ヒト生物もしくはその一部の、プールされた群またはコレクションの一員である。
i)重量ベースで少なくとも45%の種子油を含むカノーラ(菜種、canola seed)の種を得ること、
ii)当該カノーラの種より油を抽出すること、および、
iii)当該油を回収することであって、当該回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含むこと、それにより、カノーラ油が製造される。好ましい実施形態において、カノーラの種は、重量ベースで少なくとも46%、少なくとも47%、少なくとも48%、少なくとも49%、少なくとも50%、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、少なくとも55%、または少なくとも56%の油含量を有する。油含量は、通常通り採取され脱穀された種から抽出される油の量を測定することにより測定することができ、種の重量のパーセンテージ、すなわち、%(w/w)として、算出される。カノーラの種の含水量は、5%と15%の間であり、好ましくは約8.5%である。1つの実施形態において、オレイン酸含量は、カノーラ油中の総脂肪酸の約58%と62%の間であり、好ましくは少なくとも63%であり、および、パルミチン酸含量は、カノーラ油中の総脂肪酸の約4%〜約6%である。好ましいカノーラ油は、110〜120のヨード価および、30ppm未満のクロロフィルレベルを有する。
i)重量ベースで少なくとも5%の種子油を含むトウモロコシの種子を得ること、
ii)当該トウモロコシの種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、または少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、トウモロコシ種子油を製造する。好ましい実施形態において、トウモロコシの種子は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、または少なくとも13%の油含量を有する。トウモロコシ種子の含水量は、約13%〜約17%であり、好ましくは約15%である。好ましいトウモロコシ油は、約0.1%のトコフェロールを含む。
i)重量ベースで少なくとも20%の種子油を含む大豆の種子を得ること、
ii)当該大豆の種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、大豆油を製造する。好ましい実施形態において、大豆の種子は、種の重量ベース(w/w)で、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、少なくとも29%、少なくとも30%、または少なくとも31%の油含量を有する。1つの実施形態において、オレイン酸含量は、大豆油中の総脂肪酸の約20%〜約25%の間であり、好ましくは少なくとも30%、リノール酸含量は、約45%〜約57%の間であり、好ましくは45%未満、および、パルミチン酸含量は、大豆油中の総脂肪酸の約10%〜約15%であり、好ましくは10%未満である。好ましくは、大豆種子のタンパク質含量は、乾重量ベースで約40%であり、大豆種子の含水量は、約10%〜約16%であり、好ましくは約13%である。
i)重量ベースで少なくとも10%の種子油を含むルピナスの種子を得ること、
ii)当該ルピナスの種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、ルピナス種子油を製造する。好ましい実施形態において、ルピナスの種子は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、または少なくとも16%の油含量を有する。
i)重量ベースで少なくとも50%の種子油を含むピーナッツを得ること、
ii)当該ピーナッツから油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、ピーナッツ油を製造する。好ましい実施形態において、ピーナッツの種子(ピーナッツ)は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、少なくとも55%、または少なくとも56%の油含量を有する。1つの実施形態において、オレイン酸含量は、ピーナッツ油の総脂肪酸の約38%〜59%の間であり、好ましくは少なくとも60%、およびパルミチン酸含量は、ピーナッツ油中の総脂肪酸の約9%〜約13%であり、好ましくは9%未満である。
i)重量ベースで少なくとも50%の種子油を含むヒマワリの種子を得ること、
ii)当該ヒマワリの種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、ヒマワリ油を製造する。好ましい実施形態において、ヒマワリの種子は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも51%、少なくとも52%、少なくとも53%、少なくとも54%、または少なくとも55%の油含量を有する。
i)重量ベースで少なくとも41%の種子油を含む綿実を得ること、
ii)当該綿実から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、綿実油を生製造する。好ましい実施形態において、綿実は、種の重量ベース(w/w)で、少なくとも42%、少なくとも43%、少なくとも44%、少なくとも45%、少なくとも46%、少なくとも47%、少なくとも48%、少なくとも49%、または少なくとも50%の油含量を有する。1つの実施形態において、オレイン酸含量は、綿実油中の総脂肪酸の約15%〜22%の間であり、好ましくは少なくとも22%、リノール酸含量は、約45%〜約57%の間であり、好ましくは45%未満、およびパルミチン酸含量は、綿実油中の総脂肪酸の約20%〜約26%であり、好ましくは18%未満である。1つの実施形態において、綿実油はまた、シクロプロパン化脂肪酸(たとえば、ステルクリン酸およびマルバリン酸)を含み、および、少量のゴシポールを含有しても良い。
i)重量ベースで少なくとも35%の種子油を含むサフラワーの種子を得ること、
ii)当該サフラワーの種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、サフラワー油を製造する。好ましい実施形態において、サフラワーの種子は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも36%、少なくとも37%、少なくとも38%、少なくとも39%、少なくとも40%、少なくとも41%、少なくとも42%、少なくとも43%、少なくとも44%、または少なくとも45%の油含量を有する。
i)重量ベースで少なくとも36%の種子油を含む亜麻の種子を得ること、
ii)当該亜麻の種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、亜麻仁油を製造する。好ましい実施形態において、亜麻の種子は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも37%、少なくとも38%、少なくとも39%、または少なくとも40%の油含量を有する。
i)重量ベースで少なくとも36%の種子油を含むCamelina sativaの種子を得ること、
ii)当該Camelina sativaの種子から油を抽出すること、
iii)油を回収し、ここで、当該回収された油が、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、それによって、カメリナ油を製造する。好ましい実施形態において、Camelina sativaの種子は、種子の重量ベース(w/w)で、少なくとも37%、少なくとも38%、少なくとも39%、少なくとも40%、少なくとも41%、少なくとも42%、少なくとも43%、少なくとも44%、または少なくとも45%の油含量を有する。
(i)トリアシルグリセロールが、抽出脂質または抽出油の少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%または96%を構成する、
(ii)抽出脂質または抽出油は、遊離ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド、ワックスもしくはワックスエステル、またはそれらの任意の組み合わせを含む、および、
(iii)抽出脂質または抽出油中の総ステロール含量および/または組成は、対応する非ヒト生物もしくはその一部または種から製造された抽出脂質または抽出油中のステロール含量および/または組成とは明らかに異なる。
ここで、第三の、またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチド(複数含む)は、それぞれ、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチド(複数含む)の発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
i)Wrinkled1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン、
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、ならびに、
xiv)任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
ここで、1以上の外因性ポリヌクレオチドの各々は、それぞれ、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中で、ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。好ましくは、1以上の外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子のゲノム中に安定に組み込まれており、および、より好ましくは、ホモ接合性の状態で存在する。ポリヌクレオチドは、たとえば、植物、酵母または動物起源の天然酵素と同じ配列である、アミノ酸配列を有する酵素をコードし得る。さらに、ポリヌクレオチドは、天然酵素と比較した場合に、1以上の保存的変異を有する酵素をコードしても良い。
(i)GPATはまた、MAGを産生するホスファターゼ活性を有し、たとえば、Arabidopsis GPAT4またはGPAT6のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、および/または、
(ii)DGATは、DGAT1またはDGAT2であり、および/または、
(iii)MGATは、MGAT1またはMGAT2である。
i)少なくとも8%、少なくとも10%、少なくとも12%、少なくとも14%、または少なくとも15.5%(重量%)の総脂質含量、
ii)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、生育植物部分、または非ヒト生物中の総脂質含量が、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍、高い、
iii)少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも6.5%、または少なくとも7%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
iv)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い総TAG含量、
v)オレイン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも15%、少なくとも19%または少なくとも22%(重量%)を構成する、
vi)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、または少なくとも17倍、高い、
vii)パルミチン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%または少なくとも33%(重量%)を構成する、
viii)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.5倍、高い、
ix)リノール酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも22%、少なくとも25%、少なくとも30%または少なくとも34%(重量%)を構成する、
x)αリノレン酸が、TAG中の脂肪酸の20%未満、15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
xi)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。この実施形態において、好ましくは、少なくとも生育植物部分は、i)、ii)、iii)、iv)、i)およびii)、i)およびiii)、i)およびiv)、i)〜iii)、i)、iii)およびiv)、i)〜iv)、ii)およびiii)、ii)およびiv)、ii)〜iv)、またはiii)およびiv)の特長(複数含む)を有する。1つの実施形態において、乾重量%は、葉の乾重量%である。
i)少なくとも10%、少なくとも12.5%、少なくとも15%、または少なくとも17%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
ii)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分またはヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中の総TAG含量が、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
iii)オレイン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも19%、少なくとも22%、または少なくとも25%(重量%)を構成する、
iv)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のTAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも17倍、または少なくとも19倍、高い、
v)パルミチン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、または少なくとも28%(重量%)を構成する、
vi)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のTAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.25倍、高い、
vii)リノール酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも15%、または少なくとも20%(重量%)を構成する、
viii)αリノレン酸が、TAG中の脂肪酸の15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
ix)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のTAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。この実施形態において、好ましくは、生育植物部分は少なくとも、特長i)、ii)、またはi)およびii)を有する。1つの実施形態において、乾重量%は、葉の乾重量%である。
i)配列番号231〜278の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号279〜337の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号204〜211、338〜346の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号83、212〜219、347〜355の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号1〜44の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号45〜82の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号84〜143の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号144〜203の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号204〜211の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号212〜219の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号389〜408の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号362〜388の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号422〜428の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号429〜436の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号437〜439の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号442〜444の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)配列番号440〜441の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号445〜446の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。
i)植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素をコードする遺伝子中に、1以上の導入変異、または、
ii)植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素の産生および/または活性を下方制御する外因性ポリヌクレオチド、
ここで、各内因性酵素は、たとえばDGAT等の脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、sn−1グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(sn−1 GPAT)、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、アシル−CoA:リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、たとえば(ADP)−グルコースピロホスホリラーゼ(AGPase)等のデンプン生合成に関与する酵素、たとえばΔ12脂肪酸デサチュラーゼ(FAD2)等の脂肪酸デサチュラーゼ、脂質分解に関与するポリペプチドおよび/または脂質含有量を減少させるポリペプチド(たとえばCGi58ポリペプチドもしくはSUGAR−DEPENDENT1トリアシルグリセロールリパーゼ等のリパーゼ等)、またはそれらの2以上の組み合わせ、からなる群から選択される。1つの実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒性ポリヌクレオチド、マイクロRNA、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二重鎖RNA分子または、それらから誘導されたプロセッシングされたRNA分子からなる群から選択される。1つの実施形態において、AGPaseの産生を下方制御する外因性ポリヌクレオチドは、Sanjaya et al. (2011)に開示されているポリヌクレオチドではない。1つの実施形態において、生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の外因性ポリヌクレオチドは、WRI1をコードする外因性ポリヌクレオチド、および、AGPaseをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードするポリヌクレオチドから構成されない。
(i)TAG、DAG、TAGおよびDAGまたはMAGである、非極性脂質、および、
(ii)EDA、ARA、SDA、ETE、ETA、EPA、DPA、DHAである特定のPUFA(前記特定のPUFAは、非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも1%のレベルである)、もしくは、特定のPUFAの2以上の組み合わせ、または、
(iii)非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも1%のレベルで存在し、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)もしくはそれらの2以上の組み合わせ、または、前述の基、結合、分枝鎖のうちの任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸。
(i)エステル化した形態、またはエステル化していない形態のオレイン酸である、当該植物の生育部分または種子中のオレイン酸であり、ここで、当該生育部分または種子の脂質含量中の総脂肪酸の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である。
(ii)非極性脂質でのエステル化した形態のオレイン酸である、当該植物の生育植物部分または種子中のオレイン酸であり、ここで、当該生育部分または種子の非極性脂質含量の総脂肪酸の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である。
(iii)エステル化した形態、またはエステル化していない形態、好ましくは生育部分または種子の非極性脂質のエステル化した形態の改変脂肪酸である、当該植物の生育部分または種子の改変脂肪酸であり、ここで、当該改変脂肪酸は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)、またはそれらの2以上の組み合わせ、または前述の基、結合、もしくは分枝鎖の任意の2、3、4、5または6つを含み、および、
(iv)植物の生育部分または種子の非極性脂質中のワックスおよび/またはワックスエステル。
(i)1以上の外因性ポリヌクレオチドが、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNAまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
(ii)もし非ヒト生物が植物である場合、当該植物の生育部分は、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも約5%、好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量)の総非極性脂質含有量を有している、
(iii)非ヒト生物が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類(heterokont algae)からなる群から選択される藻類である、
(iv)非極性脂質(複数含む)が、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)またはそれらの2以上の組み合わせ、または、上述の基、結合もしくは分枝鎖の任意の2、3、4、5または6つを含む脂肪酸を含む、
(v)生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、その脂質中で、エステル化形態またはエステル化していない形態で、オレイン酸を含んでおり、ここで、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の脂質中の総脂肪酸の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である、
(vi)生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、その非極性脂質中にエステル化された形態でオレイン酸を含んでおり、ここで、当該生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の非極性脂質の総脂肪酸の、少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である、
(vii)生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の脂質中の総脂肪酸含量が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質よりも、少なくとも2%多いオレイン酸、および/または、少なくとも2%少ないパルミチン酸、を含む、および/または、
(viii)生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の非極性脂質中の総脂肪酸含量が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質よりも、少なくとも2%多いオレイン酸、および/または、少なくとも2%少ないパルミチン酸、を含む、
(ix)非極性脂質(複数含む)が、総ステロール、好ましくは遊離ステロール、ステロールエステルおよび/またはステロールグリコシド、の改変レベルを含む、
(x)非極性脂質(複数含む)が、ワックスおよび/またはワックスエステルを含む、および、
(xi)非ヒト生物またはその一部が、少なくとも約1000のそのような非ヒト生物もしくはその一部の群またはコレクションの一員である。
i)Wrinkled 1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、および、
xiv)任意選択的に、サイレンシング サプレッサー ポリペプチド、
ここで、各外因性ポリヌクレオチドは、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれのポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。1以上の外因性ポリヌクレオチドが、本明細書に定義される配列を有するヌクレオチドを含有してもよい。好ましくは、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、1以上の外因性ポリヌクレオチドに対して、ホモ接合性である。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のゲノムに組み込まれている。1以上のポリヌクレオチドが、別々の分子として提供されてもよく、または連続した単一分子として提供されてもよい。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、単一遺伝子座または遺伝的に関連のある遺伝子座で、より好ましくはホモ接合性の状態で、植物または生物のゲノムに組み込まれている。より好ましくは、組み込まれた外因性ポリヌクレオチドは、たとえば除草剤耐性遺伝子等の選択可能マーカー遺伝子と遺伝的に結び付けられている。
i)少なくとも8%、少なくとも10%、少なくとも12%、少なくとも14%、または少なくとも15.5%(乾重量または種子重量の重量%)の総脂質含量、
ii)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、生育植物部分、または非ヒト生物中の総脂質含量が、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍、高い、
iii)少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも6.5%、または少なくとも7%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
iv)総TAG含量が、外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
v)オレイン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも15%、少なくとも19%または少なくとも22%(重量%)を構成する、
vi)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、または少なくとも17倍、高い、
vii)パルミチン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%または少なくとも33%(重量%)を構成する、
viii)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.5倍、高い、
ix)リノール酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも22%、少なくとも25%、少なくとも30%または少なくとも34%(重量%)を構成する、
x)αリノレン酸が、TAG中の脂肪酸の20%未満、15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
xi)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。この実施形態において、好ましくは、生育植物部分は、少なくとも、i)、ii)、iii)、iv)、i)およびii)、i)およびiii)、i)およびiv)、i)〜iii)、i)、iii)およびiv)、i)〜iv)、ii)およびiii)、ii)およびiv)、ii)〜iv)、またはiii)およびiv)の特長(複数含む)を有する。1つの実施形態において、乾重量%は、葉の乾重量%である。
i)少なくとも10%、少なくとも12.5%、少なくとも15%、または少なくとも17%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
ii)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分またはヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中の総TAG含量が、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
iii)オレイン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも19%、少なくとも22%、または少なくとも25%(重量%)を構成する、
iv)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のTAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも17倍、または少なくとも19倍、高い、
v)パルミチン酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、または少なくとも28%(重量%)を構成する、
vi)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のTAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.25倍、高い、
vii)リノール酸が、TAG中の脂肪酸の少なくとも15%、または少なくとも20%(重量%)を構成する、
viii)αリノレン酸が、TAG中の脂肪酸の15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
ix)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分または非ヒト生物と比較して、生育植物部分または非ヒト生物中のTAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。この実施形態において、好ましくは、生育植物部分は少なくとも、特長i)、ii)、またはi)およびii)を有する。1つの実施形態において、乾重量%は、葉の乾重量%である。
a)細胞に1以上の外因性ポリヌクレオチドを導入すること、
b)細胞またはその子孫細胞中で、当該1以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させること、
c)当該細胞または子孫細胞の脂質含量を分析すること、
d)外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞または子孫細胞と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加している細胞または子孫細胞を選択すること、
ここで、当該1以上の外因性ポリヌクレオチドは、
i)Wrinkled1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン、
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、ならびに、
xiv)任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
をコードし、
ここで、各外因性ポリヌクレオチドは、当該細胞または子孫細胞中で当該外因性ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
i)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、
ii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、
iii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
iv)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびLEC2またはBBMをコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
v)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびLEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
vi)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
vii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびLEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
viii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、または、
ix)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第六の外因性ポリヌクレオチド、
を含む。
i)Wrinkled 1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、および、
xiv)任意選択的に、サイレンシング サプレッサー ポリペプチド、
ここで、1以上の各ポリヌクレオチドは、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。
i)本発明による、植物、複数の植物、または非ヒト生物を成長させること、および、
ii)当該植物、(複数含む)または非ヒト生物から種子を採取すること。
i)発酵に適している本発明の非ヒト生物、ならびに発酵および脂肪酸生合成に必要な構成要素を含む液体組成物を含有する容器を提供すること、
ii)当該容器中に含まれる液体組成物の発酵をもたらす条件を提供すること。
i)任意選択的に触媒の存在下で、本発明の脂質とアルコールを反応させ、アルキルエステルを産生すること、および、
ii)任意選択的にアルキルエステルと石油ベースの燃料とを混合させること。アルキルエステルは好ましくはメチルエステルである。本工程により製造される燃料は、本発明の脂質またはそれらから製造された炭化水素製品を最小限レベル、たとえば体積の少なくとも10%、少なくとも20%または少なくとも30%で含有し得る。
i)本発明の生育植物、非ヒト生物もしくはその一部の脂質を、ガス化により合成ガスへと転換すること、および、
ii)合成ガスを、金属触媒または微生物触媒を用いて、バイオ燃料へと転換すること。
ここで、1以上の各外因性ポリヌクレオチドは、細胞中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、ここで、以下の特長の1つ以上またはすべてが該当する:
(a)当該1以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物もしくはその一部の1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNAまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
(b)もし当該細胞が、植物の生育部分の細胞である場合、当該細胞は、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも5%、好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w)の総非極性脂質含量を有する、
(c)当該細胞が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類からなる群から選択される藻類である、
(d)当該1以上の非極性脂質は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)またはそれらの2以上の組み合わせ、または前述の基、結合もしくは鎖の任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸を含む、
(e)非極性脂質(複数含む)の総脂肪酸含有量が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞中の非極性脂質(複数含む)よりも、少なくとも2%多いオレイン酸および/または少なくとも2%少ないパルミチン酸を含む、
(f)非極性脂質(複数含む)が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞中の非極性脂質(複数含む)と比較して、改変レベルの総ステロール類(好ましくは遊離(非エステル化)ステロール)、ステロールエステル、ステロールグリコシド)を含む、
(g)非極性脂質(複数含む)が、ワックスおよび/またはエステルワックスを含む、および、
(h)当該細胞は、少なくとも約1000のそのような細胞の、群またはコレクションの一員である。
i)生育組織の光沢を計測すること、
ii)前もって計測された最小光沢度レベルと、当該測定結果を比較すること、
iii)任意選択的に、当該植物を採取すること。
i)植物を栽培すること、
ii)当該植物から植物部分を採取すること、
iii)当該植物またはその一部を保存すること、または、
iv)当該植物またはその一部を異なる場所へ移送すること。
a)本発明の細胞を含む植物部分を、植物から植物部分を回収することにより、または、植物の他の部分から植物部分を分離することにより、採取すること、
b)任意選択的に、採取された植物部分を選別および/または保存すること、ならびに、
c)a)の植物部分または、b)の選択されたおよび/または保存された植物部分を、容器内へと入れ、それにより、植物部分の入った容器を作製すること。
配列番号1:マス・マスクルスのコドンを最適化したMGAT1
配列番号2:マス・マスクルスのコドンを最適化したMGAT2
配列番号3:シオナ・インテスチナリスのコドンを最適化したMGAT1
配列番号4:トリボリウム・カスタネウムのコドンを最適化したMGAT1
配列番号5:ダニオ・レリオのコドンを最適化したMGAT1
配列番号6:ダニオ・レリオのコドンを最適化したMGAT2
配列番号7:ホモ・サピエンスのMGAT1ポリヌクレオチド(AF384163)
配列番号8:マス・マスクルスのMGAT1ポリヌクレオチド(AF384162)
配列番号9:パン・トログロデュテスのMGAT1ポリヌクレオチド転写物変異形(XM_001166055)
配列番号10:パン・トログロデュテスのMGAT1ポリヌクレオチド転写物変異形2(XM_0526044.2)
配列番号11:カニス・ファミリアリスのMGAT1ポリヌクレオチド(XM_545667.2)
配列番号12:ボス・タウルスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_001001153.2)
配列番号13:ラッタス・ノルベギカスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_001108803.1)
配列番号14:ダニオ・レリオのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_001122623.1)
配列番号15:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_073012.4)
配列番号16:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_182380.5)
配列番号17:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_065258.3)
配列番号18:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_075068.3)
配列番号19:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_072248.3)
配列番号20:クライベロマイセス・ラクティスのMGAT1ポリヌクレオチド(XM_455588.1)
配列番号21:アシビア・ゴシピイのMGAT1ポリヌクレオチド(NM_208895.1)
配列番号22:マグナポルテ・オリザエのMGAT1ポリヌクレオチド(XM_368741.1)
配列番号23:シオナ・インテスチナリスのMGAT1ポリヌクレオチド(XM_002120843.1)
配列番号24:ホモ・サピエンスのMGAT2ポリヌクレオチド(AY157608)
配列番号25:マス・マスクルスのMGAT2ポリヌクレオチド(AY157609)
配列番号26:パン・トログロデュテスの予測MGAT2ポリヌクレオチド(XM_522112.2)
配列番号27:カニス・ファミリアリスのMGAT2ポリヌクレオチド(XM_542304.1)
配列番号28:ボス・タウルスのMGAT2ポリヌクレオチド(NM_001099136.1)
配列番号29:ラッタス・ノルベギカスのMGAT2ポリヌクレオチド(NM_001109436.2)
配列番号30:ガッルス・ガッルスのMGAT2ポリヌクレオチド(XM_424082.2)
配列番号31:ダニオ・レリオのMGAT2ポリヌクレオチド(NM_001006083.1)
配列番号32:ドロソフィラ・メラノガスターのMGAT2ポリヌクレオチド(NM_136474.2)
配列番号33:ドロソフィラ・メラノガスターのMGAT2ポリヌクレオチド(NM_136473.2)
配列番号34ドロソフィラ・メラノガスターのMGAT2ポリヌクレオチド(NM_136475.2)
配列番号35:アノフェレス・ガンビェのMGAT2ポリヌクレオチド(XM_001688709.1)
配列番号36:アノフェレス・ガンビェのMGAT2ポリヌクレオチド(XM_315985)
配列番号37:トリボリウム・カスタネウムのMGAT2ポリヌクレオチド(XM_970053.1)
配列番号38:ホモ・サピエンスのMGAT3ポリヌクレオチド(AY229854)
配列番号39:パン・トログロデュテスのMGAT3ポリヌクレオチド転写物変異形1(XM_001154107.1)
配列番号40:パン・トログロデュテスのMGAT3ポリヌクレオチド転写物変異形2(XM_001154171.1)
配列番号41:パン・トログロデュテスのMGAT3ポリヌクレオチド転写物変異形3(XM_527842.2)
配列番号42:カニス・ファミリアリスのMGAT3ポリヌクレオチド(XM_845212.1)
配列番号43:ボス・タウルスのMGAT3ポリヌクレオチド(XM_870406.4)
配列番号44:ダニオ・レリオのMGAT3ポリヌクレオチド(XM_688413.4)
配列番号45:ホモ・サピエンスのMGAT1ポリペプチド(AAK84178.1)
配列番号46:マス・マスクルスのMGAT1ポリペプチド(AAK84177.1)
配列番号47:パン・トログロデュテスのMGAT1ポリペプチドアイソフォーム1(XP_001166055.1)
配列番号48:パン・トログロデュテスのMGAT1ポリペプチドアイソフォーム2(XP_526044.2)
配列番号49:カニス・ファミリアリスのMGAT1ポリペプチド(XP_545667.2)
配列番号50:ボス・タウルスのMGAT1ポリペプチド(NP_001001153.1)
配列番号51:ラッタス・ノルベギカスのMGAT1ポリペプチド(NP_001102273.1)
配列番号52:ダニオ・レリオのMGAT1ポリペプチド(NP_001116095.1)
配列番号53:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリペプチド(NP_505413.1)
配列番号54:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリペプチド(NP_872180.1)
配列番号55:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリペプチド(NP_497659.1)
配列番号56:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリペプチド(NP_507469.1)
配列番号57:カエノラブディティス・エレガンスのMGAT1ポリペプチド(NP_504649.1)
配列番号58:クライベロマイセス・ラクティスのMGAT1ポリペプチド(XP_455588.1)
配列番号59:アシビア・ゴシピイのMGAT1ポリペプチド(NP_983542.1)
配列番号60:マグナポルテ・オリザエのMGAT1ポリペプチド(XP_368741.1)
配列番号61:シオナ・インテスチナリスのMGAT1ポリペプチド(XP_002120879)
配列番号62:ホモ・サピエンスのMGAT2ポリペプチド(AA023672.1)
配列番号63:マス・マスクルスのMGAT2ポリペプチド(AA023673.1)
配列番号64:パン・トログロデュテスのMGAT2ポリペプチド(XP_522112.2)
配列番号65:カニス・ファミリアリスのMGAT2ポリペプチド(XP_542304.1)
配列番号66:ボス・タウルスのMGAT2ポリペプチド(NP_001092606.1)
配列番号67:ラッタス・ノルベギカスのMGAT2ポリペプチド(NP_001102906.2)
配列番号68:ガッルス・ガッルスのMGAT2ポリペプチド(XP_424082.2)
配列番号69:ダニオ・レリオのMGAT2ポリペプチド(NP_001006083.1)
配列番号70:ドロソフィラ・メラノガスターのMGAT2ポリペプチド(NP_610318.1)
配列番号71:ドロソフィラ・メラノガスターのMGAT2ポリペプチド(NP_610317.1)
配列番号72:ドロソフィラ・メラノガスターのMGAT2ポリペプチド(NP_610319.2)
配列番号73:アノフェレス・ガンビェのMGAT2ポリペプチド(XP_001688761)
配列番号74:アノフェレス・ガンビェのMGAT2ポリペプチド(XP_315985.3)
配列番号75:トリボリウム・カスタネウムのMGAT2ポリペプチド(XP_975146)
配列番号76 :ホモ・サピエンスのMGAT3ポリペプチド(AA063579.1)
配列番号77:パン・トログロデュテスのMGAT3ポリペプチドアイソフォーム1(XP_001154107.1)
配列番号78:パン・トログロデュテスのMGAT3ポリペプチドアイソフォーム2(XP_001154171.1)
配列番号79:パン・トログロデュテスのMGAT3アイソフォーム3(XP_527842.2)
配列番号80:カニス・ファミリアリスのMGAT3ポリペプチド(XP_850305.1)
配列番号81:ボス・タウルスのMGAT3ポリペプチド(XP_875499.3)
配列番号82:ダニオ・レリオのMGAT3ポリペプチド(XP_693505.1)
配列番号83:アラビドプシス・サリアナのDGAT1ポリペプチド(CAB44774.1)
配列番号84:アラビドプシス・サリアナのGPAT4ポリヌクレオチド(NM_100043.4)
配列番号85:アラビドプシス・サリアナのGPAT6ポリヌクレオチド(NM_129367.3)
配列番号86:アラビドプシス・サリアナのGPATポリヌクレオチド(AF195115.1)
配列番号87:アラビドプシス・サリアナのGPATポリヌクレオチド(AY062466.1)
配列番号88:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(AC118133.4)
配列番号89:ピセア・シトケンシスのGPATポリヌクレオチド(EF086095.1)
配列番号90:ゼア・マイスのGPATポリヌクレオチド(BT067649.1)
配列番号91:アラビドプシス・サリアナのGPATポリヌクレオチド(AK228870.1)
配列番号92オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(AK241033.1)
配列番号93:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(CM000127.1)
配列番号94:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(CM000130.1)
配列番号95:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(CM000139.1)
配列番号96:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(CM000126.1)
配列番号97:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(CM000128.1)
配列番号98:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(CM000140.1)
配列番号99:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377667.1)
配列番号100:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377667.1)
配列番号101:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377648.1)
配列番号102:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377622.1)
配列番号103:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377590.1)
配列番号104:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377576.1)
配列番号105:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリヌクレオチド(GL377576.1)
配列番号106:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(NM_001051374.2)
配列番号107:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(NM_001052203.1)
配列番号108:ゼア・マイスのGPAT8ポリヌクレオチド(NM_001153970.1)
配列番号109:ゼア・マイスのGPATポリヌクレオチド(NM_001155835.1)
配列番号110:ゼア・マイスのGPATポリヌクレオチド(NM_001174880.1)
配列番号111:Brassica napus(アブラナ)のGPAT4ポリヌクレオチド(JQ666202.1)
配列番号112:アラビドプシス・サリアナのGPAT8ポリヌクレオチド(NM_116264.5)
配列番号113:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリヌクレオチド(XM_001764949.1)
配列番号114:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリヌクレオチド(XM_001769619.1)
配列番号115:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリヌクレオチド(XM_001769672.1)
配列番号116:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリヌクレオチド(XM_001771134.1)
配列番号117:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリヌクレオチドXM_001780481.1)
配列番号118:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリヌクレオチド(XM_002268477.1)
配列番号119:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリヌクレオチド(XM_002275312.1)
配列番号120:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリヌクレオチド(XM_002275996.1)
配列番号121:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリヌクレオチド(XM_002279055.1)
配列番号122:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリヌクレオチド(XM_002309088.1)
配列番号123:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリヌクレオチド(XM_002309240.1)
配列番号124:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリヌクレオチド(XM_002322716.1)
配列番号125:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリヌクレオチド(XM_002323527.1)
配列番号126:ソルガム・バイカラーのGPATポリヌクレオチド(XM_002439842.1)
配列番号127:ソルガム・バイカラーのGPATポリヌクレオチド(XM_002458741.1)
配列番号128:ソルガム・バイカラーのGPATポリヌクレオチド(XM_002463871.1)
配列番号129:ソルガム・バイカラーのGPATポリヌクレオチド(XM_002464585.1)
配列番号130:リシナス・コムニスのGPATポリヌクレオチド(XM_002511827.1)
配列番号131:リシナス・コムニスのGPATポリヌクレオチド(XM_002517392.1)
配列番号132:リシナス・コムニスのGPATポリヌクレオチド(XM_002520125.1)
配列番号133:アラビドプシス・lyrataのGPATポリヌクレオチド(XM_002872909.1)
配列番号134:アラビドプシス・lyrataのGPAT6ポリヌクレオチド(XM_002881518.1)
配列番号135:ベルニシア・フォルジイの推定GPAT8ポリヌクレオチド(FJ479753.1)
配列番号136:オリザ・サティバのGPATポリヌクレオチド(NM_001057724.1)
配列番号137:Brassica napusのGPAT4ポリヌクレオチド(JQ666203.1)
配列番号138:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリヌクレオチド(XM_002320102.1)
配列番号139:ソルガム・バイカラーのGPATポリヌクレオチド(XM_002451332.1)
配列番号140:リシナス・コムニスのGPATポリヌクレオチド(XM_002531304.1)
配列番号141:アラビドプシス・lyrataのGPAT4ポリヌクレオチド(XM_002889315.1)
配列番号142:アラビドプシス・サリアナのGPAT1ポリヌクレオチド(NM_100531.2)
配列番号143:アラビドプシス・サリアナのGPAT3ポリヌクレオチド(NM_116426.2)
配列番号144:アラビドプシス・サリアナのGPAT4ポリペプチド(NP_171667.1)
配列番号145:アラビドプシス・サリアナのGPAT6ポリペプチド(NP_181346.1)
配列番号146:アラビドプシス・サリアナのGPATポリペプチド(AAF02784.1)
配列番号147:アラビドプシス・サリアナのGPATポリペプチド(AAL32544.1)
配列番号148:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(AAP03413.1)
配列番号149:ピセア・シトケンシスのGPATポリペプチド(ABK25381.1)
配列番号150:ゼア・マイスのGPATポリペプチド(ACN34546.1)
配列番号151:アラビドプシス・サリアナのGPATポリペプチド(BAF00762.1)
配列番号152:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(BAH00933.1)
配列番号153:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(EAY84189.1)
配列番号154:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(EAY98245.1)
配列番号155:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(EAZ21484.1)
配列番号156:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(EEC71826.1)
配列番号157:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(EEC76137.1)
配列番号158:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(EEE59882.1)
配列番号159:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ08963.1)
配列番号160:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ08964.1)
配列番号161:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ11200.1)
配列番号162:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ15664.1)
配列番号163:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ24086.1)
配列番号164:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ29816.1)
配列番号165:セラギネラ・moellendorffiiのGPATポリペプチド(EFJ29817.1)
配列番号166:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(NP_001044839.1)
配列番号167:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(NP_001045668.1)
配列番号168:ゼア・マイスのGPAT8ポリペプチド(NP_001147442.1)
配列番号169:ゼア・マイスのGPATポリペプチド(NP_001149307.1)
配列番号170:ゼア・マイスのGPATポリペプチド(NP_001168351.1)
配列番号171:Brassica napusのGPAT4ポリペプチド(AFH02724.1)
配列番号172:アラビドプシス・サリアナのGPAT8ポリペプチド(NP_191950.2)
配列番号173:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリペプチド(XP_001765001.1)
配列番号174:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリペプチド(XP_001769671.1)
配列番号175:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリペプチド(XP_001769724.1)
配列番号176:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリペプチド(XP_001771186.1)
配列番号177:フィスコミトレラ・パテンスのGPATポリペプチド(XP_001780533.1)
配列番号178:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリペプチド(XP_002268513.1)
配列番号179:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリペプチド(XP_002275348.1)
配列番号180:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリペプチド(XP_002276032.1)
配列番号181:ヴィティス・ヴィニフェラのGPATポリペプチド(XP_002279091.1)
配列番号182:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリペプチド(XP_002309124.1)
配列番号183:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリペプチド(XP_002309276.1)
配列番号184:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリペプチド(XP_002322752.1)
配列番号185:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリペプチド(XP_002323563.1)
配列番号186:ソルガム・バイカラーのGPATポリペプチド(XP_002439887.1)
配列番号187:ソルガム・バイカラーのGPATポリペプチド(XP_002458786.1)
配列番号188:ソルガム・バイカラーのGPATポリペプチド(XP_002463916.1)
配列番号189:ソルガム・バイカラーのGPATポリペプチド(XP_002464630.1)
配列番号190:リシナス・コムニスのGPATポリペプチド(XP_002511873.1)
配列番号191:リシナス・コムニスのGPATポリペプチド(XP_002517438.1)
配列番号192:リシナス・コムニスのGPATポリペプチド(XP_002520171.1)
配列番号193:アラビドプシス・lyrataのGPATポリペプチド(XP_002872955.1)
配列番号194:アラビドプシス・lyrataのGPAT6ポリペプチド(XP_002881564.1)
配列番号195:ベルニシア・フォルジイのGPATポリペプチド(ACT32032.1)
配列番号196:オリザ・サティバのGPATポリペプチド(NP_001051189.1)
配列番号197:Brassica napusのGPAT4ポリペプチド(AFH02725.1)
配列番号198:ポピュラス・トリコカルパのGPATポリペプチド(XP_002320138.1)
配列番号199:ソルガム・バイカラーのGPATポリペプチド(XP_002451377.1)
配列番号200:リシナス・コムニスのGPATポリペプチド(XP_002531350.1)
配列番号201:アラビドプシス・lyrataのGPAT4ポリペプチド(XP_002889361.1)
配列番号202:アラビドプシス・サリアナのGPAT1ポリペプチド(NP_563768.1)
配列番号203:アラビドプシス・サリアナのGPAT3ポリペプチド(NP_192104.1)
配列番号204:アラビドプシス・サリアナのDGAT2ポリヌクレオチド(NM_115011.3)
配列番号205:リシナス・コムニスのDGAT2ポリヌクレオチド(AY916129.1)
配列番号206:ベルニシア・フォルジイのDGAT2ポリヌクレオチド(DQ356682.1)
配列番号207:モルティエレラ・ラマニアナのDGAT2ポリヌクレオチド(AF391089.1)
配列番号208:ホモ・サピエンスのDGAT2ポリヌクレオチド(NM_032564.1)
配列番号209:ホモ・サピエンスのDGAT2ポリヌクレオチド(NM_001013579.2)
配列番号210:ボス・タウルスのDGAT2ポリヌクレオチド(NM_205793.2)
配列番号211:マス・マスクルスのDGAT2ポリヌクレオチド(AF384160.1)
配列番号212:アラビドプシス・サリアナのDGAT2ポリペプチド(NP_566952.1)
配列番号213:リシナス・コムニスのDGAT2ポリペプチド(AAY16324.1)
配列番号214 :ベルニシア・フォルジイのDGAT2ポリペプチド(ABC94474.1)
配列番号215:モルティエレラ・ラマニアナのDGAT2ポリペプチド(AAK84179.1)
配列番号216:ホモ・サピエンスのDGAT2ポリペプチド(Q96PD7.2)
配列番号217:ホモ・サピエンスのDGAT2ポリペプチド(Q58HT5.1)
配列番号218:ボス・タウルスのDGAT2ポリペプチド(Q70VZ8.1)
配列番号219:マス・マスクルスのDGAT2ポリペプチド(AAK84175.1)
配列番号220:YFPトリペプチド−保存DGAT2および/またはMGAT1/2配列モチーフ
配列番号221:HPHGテトラペプチド−保存DGAT2またはMGAT1/2配列モチーフ
配列番号222:EPHSテトラペプチド−保存植物DGAT2配列モチーフ
配列番号223:RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)−推定グリセロールリン脂質ドメインの一部であるDGAT2の長い保存配列モチーフ
配列番号224:FLXLXXXN−マウスDGAT2の保存配列モチーフおよび推定中性脂質結合ドメインであるMGAT1/2
配列番号225:GPATのplsCアシルトランスフェラーゼドメイン(PF01553)
配列番号226:GPATのHAD様ヒドロラーゼ(PF12710)スーパーファミリードメイン
配列番号227ホスホセリンホスファターゼドメイン(PF00702)。GPAT4〜8は、このドメインに相同のN末端領域を含む。
配列番号228:保存GPATアミノ酸配列GDLVICPEGTTCREP
配列番号229:保存GPAT/ホスファターゼアミノ酸配列(モチーフI)
配列番号230:保存GPAT/ホスファターゼアミノ酸配列(モチーフIII)
配列番号231:アラビドプシス・サリアナのWRI1ポリヌクレオチド(NM_202701.2)
配列番号232:アラビドプシス・サリアナWRI1ポリヌクレオチド(NM_001035780.2)
配列番号233:アラビドプシス・サリアナWRI1ポリヌクレオチド(NM_115292.4)
配列番号234:アラビドプシス lyrata亜種 lyrata ポリヌクレオチド(XM_002876205.1)
配列番号235:Brassica napus WRI1ポリヌクレオチド(DQ370141.1)
配列番号236:Brassica napus WRI1ポリヌクレオチド(HM370542.1)
配列番号237:Glycine max(ダイズ) WRI1ポリヌクレオチド (XM_003530322.1)
配列番号238:Jatropha curcas(ナンヨウアブラギリ) WRI1 ポリヌクレオチド (JF703666.1)
配列番号239:リシナス・コムニス WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002525259.1)
配列番号240:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002316423.1)
配列番号241:Brachypodium distachyon(ヤマカモジグサ) WRI1ポリヌクレオチド (XM_003578949.1)
配列番号242:Hordeum vulgare(オオムギ) 亜種 vulgare WRI1 ポリヌクレオチド (AK355408.1)
配列番号243:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002450149.1)
配列番号244:ゼア・マイス WRI1 ポリヌクレオチド (EU960249.1)
配列番号245:Brachypodium distachyon WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003561141.1)
配列番号246:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002437774.1)
配列番号247:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002441399.1)
配列番号248:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003530638.1)
配列番号249:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003553155.1)
配列番号250:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002315758.1)
配列番号251:Vitis vinifera(ブドウ) WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002270113.1)
配列番号252:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003533500.1)
配列番号253:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003551675.1)
配列番号254:Medicago truncatula(タルウマゴヤシ) WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003621069.1)
配列番号255:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002323800.1)
配列番号256:リシナス・コムニス WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002517428.1)
配列番号257:Brachypodium distachyon WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003572188.1)
配列番号258:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002444384.1)
配列番号259:ゼア・マイス WRI1 ポリヌクレオチド (NM_001176888.1)
配列番号260:アラビドプシス lyrata 亜種 lyrata WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002889219.1)
配列番号261:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリヌクレオチド (NM_106619.3)
配列番号262:アラビドプシス lyrata 亜種 lyrata WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002890099.1)
配列番号263:Thellungiella halophila WRI1 ポリヌクレオチド (AK352786.1)
配列番号264:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリヌクレオチド (NM_101474.2)
配列番号265:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003530302.1)
配列番号266:Brachypodium distachyon WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003578094.1)
配列番号267:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002460191.1)
配列番号268:ゼア・マイス WRI1 ポリヌクレオチド (NM_001152866.1)
配列番号269:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003519119.1)
配列番号270:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003550628.1)
配列番号271:Medicago truncatula WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003610213.1)
配列番号272:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003523982.1)
配列番号273:Glycine max WRI1 ポリヌクレオチド (XM_003525901.1)
配列番号274:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002325075.1)
配列番号275:Vitis vinifera WRI1 ポリヌクレオチド (XM_002273010.2)
配列番号276:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリヌクレオチド ( XM_002303830.1)
配列番号277:Lupinis angustifolius WRI1 ポリヌクレオチド、部分配列(NA−080818_Plate14f06.b1)
配列番号278:Lupinis angustifolius WRI1 ポリヌクレオチド
配列番号279:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリペプチド (A8MS57)
配列番号280:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリペプチド (Q6X5Y6)
配列番号281:アラビドプシス lyrata 亜種 lyrata WRI1 ポリペプチド (XP_002876251.1)
配列番号282:Brassica napus WRI1ポリペプチド(ABD16282.1)
配列番号283:Brassica napus WRI1ポリペプチド(ADO16346.1)
配列番号284:Glycine max WRI1ポリペプチド (XP_003530370.1)
配列番号285:Jatropha curcas WRI1ポリペプチド (AEO22131.1)
配列番号286:リシナス・コムニス WRI1 ポリペプチド (XP_002525305.1)
配列番号287:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリペプチド (XP_002316459.1)
配列番号288:Vitis vinifera WRI1 ポリペプチド (CBI29147.3)
配列番号289:Brachypodium distachyon WRI1 ポリペプチド (XP_003578997.1)
配列番号290:Hordeum vulgare subsp. vulgare WRI1 ポリペプチド (BAJ86627.1)
配列番号291:Oryza sativa(イネ) WRI1 ポリペプチド (EAY79792.1)
配列番号292:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリペプチド (XP_002450194.1)
配列番号293:ゼア・マイス WRI1 ポリペプチド (ACG32367.1)
配列番号294:Brachypodium distachyon WRI1 ポリペプチド (XP_003561189.1)
配列番号295:Brachypodium sylvaticum WRI1 ポリペプチド (ABL85061.1)
配列番号296:Oryza sativa WRI1 ポリペプチド (BAD68417.1)
配列番号297:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリペプチド(XP_002437819.1)
配列番号298:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリペプチド(XP_002441444.1)
配列番号299:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003530686.1)
配列番号300:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003553203.1)
配列番号301:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリペプチド(XP_002315794.1)
配列番号302:Vitis vinifera WRI1 ポリペプチド (XP_002270149.1)
配列番号303:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003533548.1)
配列番号304:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003551723.1)
配列番号305:Medicago truncatula WRI1 ポリペプチド(XP_003621117.1)
配列番号306:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリペプチド (XP_002323836.1)
配列番号307:リシナス・コムニス WRI1 ポリペプチド(XP_002517474.1)
配列番号308:Vitis vinifera WRI1 ポリペプチド (CAN79925.1)
配列番号309:Brachypodium distachyon WRI1 ポリペプチド (XP_003572236.1)
配列番号310:Oryza sativa WRI1 ポリペプチド(BAD10030.1)
配列番号311:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリペプチド(XP_002444429.1)
配列番号312:ゼア・マイス WRI1 ポリペプチド(NP_001170359.1)
配列番号313:アラビドプシス lyrata 亜種 lyrata WRI1 ポリペプチド(XP_002889265.1)
配列番号314:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリペプチド(AAF68121.1)
配列番号315:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリペプチド(NP_178088.2)
配列番号316:アラビドプシス lyrata 亜種 lyrata WRI1 ポリペプチド(XP_002890145.1)
配列番号317:Thellungiella halophila WRI1 ポリペプチド(BAJ33872.1)
配列番号318:アラビドプシス・サリアナ WRI1 ポリペプチド(NP_563990.1)
配列番号319:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003530350.1)
配列番号320:Brachypodium distachyon WRI1 ポリペプチド(XP_003578142.1)
配列番号321:Oryza sativa WRI1 ポリペプチド(EAZ09147.1)
配列番号322:ソルガム・バイカラー WRI1 ポリペプチド(XP_002460236.1)
配列番号323:ゼア・マイス WRI1 ポリペプチド(NP_001146338.1)
配列番号324:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003519167.1)
配列番号325:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003550676.1)
配列番号326:Medicago truncatula WRI1 ポリペプチド (XP_003610261.1)
配列番号327:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003524030.1)
配列番号328:Glycine max WRI1 ポリペプチド(XP_003525949.1)
配列番号329:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリペプチド(XP_002325111.1)
配列番号330:Vitis vinifera WRI1 ポリペプチド (CBI36586.3)
配列番号331:Vitis vinifera WRI1 ポリペプチド (XP_002273046.2)
配列番号332:ポピュラス・トリコカルパ WRI1 ポリペプチド (XP_002303866.1)
配列番号333:Vitis vinifera WRI1 ポリペプチド (CBI25261.3)
配列番号334:Sorbi−WRL1
配列番号335:Lupan−WRL1
配列番号336:Ricco−WRL1
配列番号337:Lupin angustifolius WRI1 ポリペプチド
配列番号338:Aspergillus fumigatus DGAT ポリヌクレオチド (XM_750079.1)
配列番号339:リシナス・コムニス DGAT ポリヌクレオチド (AY366496.1)
配列番号340:Vernicia fordii DGAT1 ポリヌクレオチド (DQ356680.1)
配列番号341:Vernonia galamensis DGAT1 ポリヌクレオチド (EF653276.1)
配列番号342:Vernonia galamensis DGAT1 ポリヌクレオチド (EF653277.1)
配列番号343:Euonymus alatus(ニシキギ) DGAT1 ポリヌクレオチド (AY751297.1)
配列番号344:Caenorhabditis elegans(線虫) DGAT1 ポリヌクレオチド (AF221132.1)
配列番号345:Rattus norvegicus(ドブネズミ) DGAT1 ポリヌクレオチド (NM_053437.1)
配列番号346:ホモ・サピエンス DGAT1ポリヌクレオチド (NM_012079.4)
配列番号347:Aspergillus fumigatus(アスペルギルス フミガーツス) DGAT1 ポリペプチド (XP_755172.1)
配列番号348:リシナス・コムニス DGAT1 ポリペプチド (AAR11479.1)
配列番号349:Vernicia fordii DGAT1 ポリペプチド (ABC94472.1)
配列番号350:Vernonia galamensis DGAT1 ポリペプチド (ABV21945.1)
配列番号351:Vernonia galamensis DGAT1 ポリペプチド (ABV21946.1)
配列番号352:Euonymus alatus DGAT1 ポリペプチド (AAV31083.1)
配列番号353:Caenorhabditis elegans DGAT1 ポリペプチド (AAF82410.1)
配列番号354:Rattus norvegicus DGAT1 ポリペプチド (NP_445889.1)
配列番号355:ホモ・サピエンス DGAT1 ポリペプチド (NP_036211.2)
配列番号356:WRI1モチーフ(R G V T/S R H R W T G R)
配列番号357:WRI1モチーフ(F/Y E A H L W D K)
配列番号358:WRI1モチーフ(D L A A L K Y W G)
配列番号359:WRI1モチーフ(S X G F S/A R G X)
配列番号360:WRI1モチーフ(H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V)
配列番号361:WRI1モチーフ(Q E E A A A X Y D)
配列番号362:Brassica napus オレオシン ポリペプチド (CAA57545.1)
配列番号363:Brassica napus オレオシン S1−1 ポリペプチド (ACG69504.1)
配列番号364:Brassica napus オレオシン S2−1 ポリペプチド (ACG69503.1)
配列番号365:Brassica napus オレオシン S3−1 ポリペプチド (ACG69513.1)
配列番号366:Brassica napus オレオシン S4−1 ポリペプチド (ACG69507.1)
配列番号367:Brassica napus オレオシン S5−1 ポリペプチド (ACG69511.1)
配列番号368:Arachis hypogaea(ラッカセイ) オレオシン 1 ポリペプチド (AAZ20276.1)
配列番号369:Arachis hypogaea オレオシン 2 ポリペプチド (AAU21500.1)
配列番号370:Arachis hypogaea オレオシン 3 ポリペプチド (AAU21501.1)
配列番号371:Arachis hypogaea オレオシン 5 ポリペプチド (ABC96763.1)
配列番号372:リシナス・コムニス オレオシン 1 ポリペプチド (EEF40948.1)
配列番号373:リシナス・コムニス オレオシン 2 ポリペプチド (EEF51616.1)
配列番号374:Glycine max オレオシン アイソフォームa ポリペプチド (P29530.2)
配列番号375:Glycine max オレオシン アイソフォームb ポリペプチド (P29531.1)
配列番号376:Linum usitatissimum(亜麻) オレオシン低分子量アイソフォームポリペプチド (ABB01622.1)
配列番号377:Linum usitatissimumのオレオシン高分子量アイソフォームポリペプチドのアミノ酸配列(ABB01624.1)
配列番号378:Helianthus annuus(ヒマワリ)オレオシン ポリペプチド(CAA44224.1)
配列番号379:ゼア・マイス オレオシン ポリペプチド (NP_001105338.1)
配列番号380:Brassica napus ステロレオシン ポリペプチド (ABM30178.1)
配列番号381:Brassica napus ステロレオシン SLO1−1 ポリペプチド (ACG69522.1)
配列番号382:Brassica napus ステロレオシン SLO2−1 ポリペプチド (ACG69525.1)
配列番号383:Sesamum indicum(ゴマ) ステロレオシン ポリペプチド (AAL13315.1)
配列番号384:ゼア・マイス ステロレオシン ポリペプチド (NP_001152614.1)
配列番号385:Brassica napus カレオシン CLO−1 ポリペプチド (ACG69529.1)
配列番号386:Brassica napus カレオシン CLO−3 ポリペプチド (ACG69527.1)
配列番号387:Sesamum indicum カレオシン ポリペプチド (AAF13743.1)
配列番号388:ゼア・マイス カレオシン ポリペプチド (NP_001151906.1)
配列番号389:Brassica napus オレオシン ポリヌクレオチド (X82020.1)
配列番号390:Brassica napus オレオシン S1−1 ポリヌクレオチド (EU678256.1)
配列番号391:Brassica napus オレオシン S2−1 ポリヌクレオチド (EU678255.1)
配列番号392:Brassica napus オレオシン S3−1 ポリヌクレオチド (EU678265.1)
配列番号393:Brassica napus オレオシン S4−1 ポリヌクレオチド (EU678259.1)
配列番号394:Brassica napus オレオシン S5−1 ポリヌクレオチド (EU678263.1)
配列番号395:Arachis hypogaea オレオシン 1 ポリヌクレオチド (DQ097716.1)
配列番号396:Arachis hypogaea オレオシン 2 ポリヌクレオチド (AY722695.1)
配列番号397:Arachis hypogaea オレオシン 3 ポリヌクレオチド (AY722696.1)
配列番号398:Arachis hypogaea オレオシン 5 ポリヌクレオチド (DQ368496.1)
配列番号399:Helianthus annuus オレオシン ポリヌクレオチド (X62352.1)
配列番号400:ゼア・マイス オレオシン ポリヌクレオチド (NM_001111868.1)
配列番号401:Brassica napus ステロレオシン ポリヌクレオチド (EF143915.1)
配列番号402:Brassica napus ステロレオシン SLO1−1 ポリヌクレオチド (EU678274.1)
配列番号403:Brassica napus ステロレオシン SLO2−1 ポリヌクレオチド (EU678277.1)
配列番号404:ゼア・マイス ステロレオシン ポリヌクレオチド (NM_001159142.1)
配列番号405:Brassica napus カレオシン CLO−1 ポリヌクレオチド (EU678281.1)
配列番号406:Brassica napus カレオシン CLO−3 ポリヌクレオチド (EU678279.1)
配列番号407:Sesamum indicum カレオシン ポリヌクレオチド(AF109921.1)
配列番号408:ゼア・マイス カレオシン ポリヌクレオチド (NM_001158434.1)
配列番号409:pJP3502全ベクター配列(3遺伝子)
配列番号410:pJP3503全ベクター配列(4遺伝子)
配列番号411:pJP3502 TDNA(ゲノムへと挿入)配列
配列番号412:pJP3503 TDNA(ゲノムへと挿入)配列
配列番号413:pJP3507ベクター配列
配列番号414:リンカー配列
配列番号415:Glycine max Synergy
配列番号416:12ABFJYC_pJP3569_insert
配列番号417:hpRNAiサイレンシングのために選択された部分N. benthamiana CGI−58配列(pTV46)
配列番号418:hpRNAiサイレンシングのために選択された部分N. tabacum AGPase配列(pTV35)
配列番号419:GXSXGリパーゼモチーフ
配列番号420:HX(4)D アシルトランスフェラーゼモチーフ
配列番号421:VX(3)HGF 推定脂質結合モチーフ
配列番号422:アラビドプシス・サリアナ CGi58 ポリヌクレオチド (NM_118548.1)
配列番号423:Brachypodium distachyon CGi58 ポリヌクレオチド (XM_003578402.1)
配列番号424:Glycine max CGi58 ポリヌクレオチド (XM_003523590.1)
配列番号425:ゼア・マイス CGi58 ポリヌクレオチド (NM_001155541.1)
配列番号426:ソルガム・バイカラー CGi58 ポリヌクレオチド (XM_002460493.1)
配列番号427:リシナス・コムニス CGi58 ポリヌクレオチド (XM_002510439.1)
配列番号428:Medicago truncatula CGi58 ポリヌクレオチド (XM_003603685.1)
配列番号429:アラビドプシス・サリアナ CGi58 ポリペプチド (NP_194147.2)
配列番号430:Brachypodium distachyon CGi58 ポリペプチド (XP_003578450.1)
配列番号431:Glycine max CGi58 ポリペプチド (XP_003523638.1)
配列番号432:ゼア・マイス CGi58 ポリペプチド (NP_001149013.1)
配列番号433:ソルガム・バイカラー CGi58 ポリペプチド (XP_002460538.1)
配列番号434:リシナス・コムニス CGi58 ポリペプチド (XP_002510485.1)
配列番号435:Medicago truncatula CGi58 ポリペプチド (XP_003603733.1)
配列番号436:Oryza sativa CGi58 ポリペプチド (EAZ09782.1)
配列番号437:アラビドプシス・サリアナ LEC2 ポリヌクレオチド (NM_102595.2)
配列番号438:Medicago truncatula LEC2 ポリヌクレオチド (X60387.1)
配列番号439:Brassica napus LEC2 ポリヌクレオチド (HM370539.1)
配列番号440:アラビドプシス・サリアナ BBM ポリヌクレオチド (NM_121749.2)
配列番号441:Medicago truncatula BBM ポリヌクレオチド (AY899909.1)
配列番号442:アラビドプシス・サリアナ LEC2 ポリペプチド (NP_564304.1)
配列番号443:Medicago truncatula LEC2 ポリペプチド (CAA42938.1)
配列番号444:Brassica napus LEC2 ポリペプチド (ADO16343.1)
配列番号445:アラビドプシス・サリアナ BBM ポリペプチド (NP_197245.2)
配列番号446:Medicago truncatula BBM ポリペプチド (AAW82334.1)
配列番号447:誘導可能なAspergilus niger alcA プロモーター
配列番号448:エタノールの存在下でAlcAプロモーターを活性化する、AlcRインデューサー
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、(例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、脂質および脂肪酸化学、バイオ燃料生成、ならびに生化学において)当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有するものと解釈されるものとする。
「トランスジェニック非ヒト生物」という用語は、例えば、外因性ポリヌクレオチド(導入遺伝子)または外因性ポリペプチドを含む、植物、藻類、非ヒト動物、または酵母もしくは真菌等の発酵に好適な生物全体を指す。ある実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、動物またはその一部ではない。一実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、日光からエネルギーを得て、栄養のための有機化合物を合成することができる、光合成生物(例えば、植物または藻類)である。別の実施形態において、トランスジェニック非ヒト生物は、光合成細菌である。
1.R G V T/S R H R W T G R (配列番号356)。
2.F/Y E A H L W D K (配列番号357)。
3.D L A A L K Y W G (配列番号358)。
4.S X G F S/A R G X (配列番号359)。
5.H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V (配列番号360)。
6.Q E E A A A X Y D (配列番号361)。
一実施形態において、本発明の生育植物部分、トランスジェニック非ヒト生物またはその一部は、対応する生育植物部分、非ヒト生物またはその一部よりも高いレベルの、DAGまたはTAG等の、好ましくは双方の非極性脂質を生成する。一実施例において、本発明のトランスジェニック植物は、対応する種子、葉、表面積が少なくとも1cm2の葉の部分、茎および/または塊茎と比較したときに、DAGまたはTAG等の、好ましくは双方の増加した非極性脂質含量を有する種子、葉、表面積が少なくとも1cm2の葉の部分、茎および/または塊茎を生成する。生育植物部分、非ヒト生物またはその一部の非極性脂質含量は、対応する非ヒト生物またはその一部と比較したときに、重量基準で0.5%大きいか、または特長(i)にさらに定義されるものである。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、同じ意味で使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体である、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、半合成もしくは合成起源、2本鎖もしくは1本鎖のものであってもよく、また、その起源または操作によって、(1)自然界で伴うポリヌクレオチドの全部または一部を伴わない、(2)自然界で連結されるもの以外のポリヌクレオチドに連結する、または(3)自然界で生じない。ポリヌクレオチドの限定的でない例としては、遺伝子または遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連結分析から定義される座(単数または複数)、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、リボザイム、cDNA、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、任意の配列のキメラDNA、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合前または集合後に与えられてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識化成分との複合体化等によって、重合後にさらに修飾することができる。
RNA干渉
RNA干渉(RNAi)は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するのに特に有用である。理論に限定されることを望まないが、Waterhouse et al. (1998)により、dsRNA(二本鎖RNA)を用いてタンパク質産生を減少させることができる機序のモデルが提唱されている。この技術は、対照の遺伝子またはその一部のmRNAと本質的に同一である配列を含むdsRNA分子の存在に依存している。便利なことに、dsRNAは、センス配列とアンチセンス配列が関連の無い配列によって隣り合っており、それにより、センス鎖とアンチセンス鎖がハイブリダイズし、ループ構造を形成する非関連配列を有するdsRNAを形成することができる、組換えベクターまたは宿主細胞中の1つのプロモーターから産生することができる。適切なdsRNA分子の設計および製造は、当業者の能力の範囲内であり、具体的には、Waterhouse et al. (1998)、Smith et al. (2000)、WO99/32619、WO99/53050、WO99/49029およびWO01/34815を考慮のこと。
マイクロRNA(略語は、miRNA)は、一般的には、不完全なステムループ構造を形成する大きな前駆体から誘導される、19〜25ヌクレオチド(通常、植物においては約20〜24ヌクレオチド)の非コーディングRNA分子である。
遺伝子は、関連内因性遺伝子および/またはゲノム中に既に存在している導入遺伝子の発現を抑制することができ、その現象は、相同性依存遺伝子サイレンシング(homology−dependent gene silencing)と呼称される。相同性依存遺伝子サイレンシングの例のほとんどは、2つに分類され、一つは、導入遺伝子の転写レベルでの機能するものであり、もう1つは、転写後に操作するものである。
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、内因性ポリペプチドをコードする特定のmRNAと少なくとも一部で相補的であり、たとえばmRNA翻訳等の転写後事象に干渉することができる分子である、DNAもしくはRNA、またはそれらの組み合わせを意味すると捉えられる。アンチセンス法の使用は当分野に公知である(たとえば、G. Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)を、参照のこと)。植物におけるアンチセンス技法の使用は、Bourque (1995)および、Senior (1998)により概説されている。Bourque (1995)は、植物システムにおいてどのようにアンチセンス配列を、遺伝子不活化の方法として利用するかについての多くの例をリストアップしている。Bourqueはまた、部分阻害により、高い確率で、システム中で測定可能な変化がもたらされ得るので、任意の酵素活性の100%阻害を達成することは必ずしも必要ではないと述べている。Senior (1998)は、アンチセンス法は、現在、非常によく確立された、遺伝子発現の操作に対する技術であることを述べている。
「触媒ヌクレオチド」という用語は、個別の基質を特異的に認識し、この基質の化学的修飾を触媒する、DNA分子もしくは分子を含むDNA(当分野では「デオキシリボザイム」としてもまた知られる)、または、RNAもしくは分子を含むRNA(「リボザイム」としてもまた知られる)を指す。触媒核酸中の核酸塩基は、塩基A、C、G、T(および、RNAに対してはU)であっても良い。
本発明の一実施形態は、組み換えベクターを含み、該組み換えベクターは、本明細書で定義される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる。組み換えベクターとしては、発現ベクターが挙げられる。組み換えベクターは、異種ポリヌクレオチド配列、すなわち、自然には見出されず、本明細書で定義されるポリヌクレオチドに隣接し、好ましくは、異なる種に由来する、ポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかとすることができ、典型的に、ウイルスに由来するウイルスベクター、またはプラスミドである。プラスミドベクターは、典型的に、原核生物細胞、例えば、pUC由来のベクター、pSK由来のベクター、pGEM由来のベクター、pSP由来のベクター、pBS由来のベクター、または1つ以上のT−DNA領域を含むバイナリーベクターにおける容易な発現カセットの選択、増幅、および形質転換を提供する、付加的な核酸配列を含む。付加的な核酸配列は、ベクターの自律複製を提供する複製の起源、好ましくは、抗生物質または除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸配列または核酸構築物にコードされる遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する一意の多重クローニング部位、ならびに原核生物および真核生物(特に植物)細胞の形質転換を増強する配列を含む。
本明細書で使用される「発現ベクター」は、宿主細胞を形質転換すること、および1個以上の特定のポリヌクレオチドの発現を生じさせることができる、DNAまたはRNAベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性とすることができ、典型的に、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターとしては、細菌、真菌、内寄生性生物、節足動物、動物、藻類、および植物細胞を含む、本発明の宿主細胞において機能する(すなわち、遺伝子発現を指令する)、あらゆるベクターが挙げられる。本発明の特に好ましい発現ベクターは、酵母、藻類、および/または植物細胞の遺伝子発現を指令することができる。
転移核酸は、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用することができ、1つ、好ましくは2つの境界配列と、関心のポリヌクレオチドとを含む。転移核酸は、選択可能なマーカーをコードしてもよく、またはコードしなくてもよい。好ましくは、転移核酸は、細菌においてバイナリーベクターの一部を形成し、バイナリーベクターは、細菌におけるベクターの複製を可能にするか、またはベクターを含む細菌細胞の選択もしくは維持を可能にする要素をさらに含む。真核細胞へ転移すると、バイナリーベクターの転移核酸成分は、真核細胞をゲノムに組み込むことができる。
本発明はまた、本明細書で定義される1つ以上のポリヌクレオチドもしくはベクター、またはその組み合わせで形質転換される宿主細胞である、組み換え細胞、例えば、組み換え植物細胞も提供する。本明細書では、「組み換え細胞」という用語は、「トランスジェニック細胞」という用語と同じ意味で使用される。本発明の好適な細胞としては、例えば本明細書で説明されるポリペプチドまたは酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドまたは組み換えベクターで形質転換することができる、あらゆる細胞が挙げられる。細胞は、好ましくは、それによって、脂質を生成するために使用することができる細胞である。組み換え細胞は、培養物中の細胞、インビトロの細胞、または例えば植物等の生物中の細胞、または例えば種子もしくは葉等の器官中の細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、植物中にあり、より好ましくは、植物の種子中にある。1つの実施形態においては、組換え細胞は、非ヒト細胞である。
本発明はまた、本発明の外因性ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、本発明の細胞、本発明のベクター、またはこれらの組み合わせを含む植物も提供する。「植物」という用語は、全植物を指すが、「その一部」という用語は、植物器官(例えば、葉、茎、根、花、果実)、単一の細胞(例えば、花粉)、種子、胚、胚乳、胚盤、または種皮等の種子部、脈管組織等の植物組織、植物細胞、およびその子孫を指す。本明細書で使用される植物部は、植物細胞を含む。
トランスジェニック植物は、Slater et al.,Plant Biotechnology−The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)、およびP.Christou and H.Klee、Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)で一般に説明されているもの等の、当技術分野で知られている手法を使用して生成することができる。
一実施形態において、TILLING法(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)は、内因性遺伝子、例えば、DGAT、sn−1−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、アシルCoA:リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、またはその二つ以上の組み合わせをコードする遺伝子がノックアウトされる植物を生成するために使用することができる。
転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)は、細胞性mRNAおよびウイルス性mRNAの両方を分解の標的とすることができる、ヌクレオチド配列特異的な防御メカニズムである。PTGSは、組換えポリヌクレオチド(複数含む)で一過性に形質転換させた、または安定的に形質転換させた植物または菌類で発生し、導入されたポリヌクレオチドに対する配列類似性を有するRNA分子の蓄積の減少をもたらす。「転写後」とは、少なくとも部分的に、しかし必ずしも完全である必要は無く、最初のRNA転写物の産生後、たとえば最初のRNA転写物のプロセッシングの間に、またはRNAのスプライシングもしくは細胞質へのRNAの輸送と同時に、またはArgonauteタンパク質に関連した複合体により細胞質内での、作用機序を指す。
植物バイオマスの総脂質含量の増加は、エネルギー含量が大きくなることと同じであり、バイオ燃料の産生におけるその使用が、より経済的なものとなる。
燃焼は、可燃性の物質を、空気または酸素の存在下で、熱の放出と共に燃やさせる方法である。基本的な方法は、酸化である。燃焼は、バイオマスをエネルギーに用いることができるようにする最も単純な方法であり、熱を提供するために用いられている。この熱は、それ自身、多くの方法で用いることができる:1)空間を加熱、2)セントラル暖房もしくは地域暖房またはプロセス加熱のために、水(または他の液体)を加熱、3)電力産生または原動力のためのスチーム発生。可燃性燃料物質がバイオマスの形態である場合、酸化は主に、セルロース、ヘミセルロース、リグニンおよび存在する他の分子中の炭素(C)および水素(H)による、二酸化炭素(CO2)および水(H2O)形成である。
ガス化は、部分的な酸化方法であり、これにより、たとえば植物バイオマス等の炭素源を、一酸化炭素(CO)および水素(H2)そして二酸化炭素(CO2)、および、場合によっては、たとえばメタン(CH4)等の炭化水素分子へと分解する。もしガス化が比較的低い温度(たとえば、700℃〜1000℃)で発生する場合、ガス産物は、高い温度でのガス化と比較して、比較的高レベルの炭化水素を有する。結果として、それは、電力産生のための内部燃焼エンジンの稼働のために、適切なガスの清浄化とともに、スチームタービンを介した熱産生または電力産生のために、燃焼して直接的に使用されうる。単純なボイラーのための燃焼チャンバは、ガス化装置に連結されて閉鎖されていても良く、または、発生炉ガスは、長鎖炭化水素(タール)が清浄化され、輸送され、保存および遠隔操作で燃焼されるものであってもよい。ガス化システムは、電力産生のための複合サイクルガスタービン(combined cycle gas turbine)と、しっかりと結合されていてもよい(IGCC−石炭ガス化複合発電(integrated gasification combined cycle))。高い温度(1200℃〜1600℃)でのガス化により、ガス製品中の炭化水素が少なくなり、COおよびH2の比率が高くなる。これは、たとえばFischer−Tropsch(FT)合成等の技術を用いた長鎖炭化水素の合成に用いることが出来るので、合成ガス(合成ガスまたはバイオ合成ガス)として知られている。もしCOに対するH2の比率が、正しい(2:1)ものであれば、FT合成を用いて、合成ガスを、従来の化石ディーゼルおよびディーゼルエンジンとの互換性、適合性がある高品質の合成ディーゼルバイオ燃料へと転換することができる。
本明細書において、「熱分解」という用語は、酸素の非存在下でゆっくりと加熱し、バイオマスからガス製品、油製品、および炭化製品を製造する方法を意味する。熱分解は、脂質ベース、特にトリグリセリドベースの物質の熱転換または熱−化学転換である。熱分解の製品には、ガス、液体および固体炭が含まれ、それぞれの比率は当該方法のパラメータに依存する。低い温度(約400℃)では、より固形の炭が製造される傾向があり(ゆっくりとした熱分解)、一方で、いくらか高い温度(約500℃)では、気化ガス居留時間が、およそ1秒かそれ以下まで下がり続けるとすれば、液体(バイオ油)の比率がより高い製品が製造される。この後、第二の反応が発生し、ガス産生量が増加する。早い(高い温度)の熱分解により製造されたバイオ油は、従来の燃料油よりもおよそ半分の発熱量を有する、暗褐色で、流動性の液体である。これは直接燃焼するか、共燃成するか、他の燃料にアップグレードするか、またはガス化することができる。
本明細書において、「トランスエステル化」は、たとえばアルカリまたは酸触媒の存在下での、短鎖アルコール(たとえば、メタノールまたはエタノール)を用いた、脂質(主にはトリアシルグリセロール)の脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルへの、転換である。低コストおよび入手の容易さにより、メタノールがより一般的に用いられている。触媒は、同種触媒、異種触媒、または酵素触媒であっても良い。同種触媒には、硫酸鉄、次いでKOHが挙げられる。異種触媒には、CaO、K3PO4およびWO3/ZrO2が挙げられる。酵素触媒には、Candida antarcticaから産生されるNovozyme435が挙げられる。
嫌気的消化は、空気の非存在下で、細菌が有機物質に分解される過程であり、それによりメタンを含むバイオガスが産生される。この過程の生成物は、バイオガス(主にはメタン(CH4)および二酸化炭素(CO2))、たい肥に似た(しかし同一ではない)固形残渣(繊維または消化物)および、肥料として用いることができる液体の蒸留酒(liquid liquor)がある。メタンは、熱産生または電力産生のために燃焼させることができる。嫌気的消化方法の固形残渣は、土壌改良剤として用いることができ、あるいは、燃料として燃焼させることができ、またはガス化することができる。
バイオアルコール産生のための従来的な発酵方法は、作物植物のデンプンおよび糖成分を使用する。第二世代のバイオアルコールは、これに先行し、ヘミセルロースおよびセルロースの、発酵性のサッカリドへの酸加水分解および/または酵素加水分解を伴い、利用可能なバイオマスをより高い比率で使用できるようにする。詳細は、「脂質産生のための発酵方法」の項目以下に提供される。
たい肥化は、微生物による有機物質の嫌気的分解である。通常、スラリーではなく比較的乾燥した材料で行われる。放出される可燃性バイオガスを採集する代わりに、あるいは採集することに加え、通常はヒートポンプを用いて、たい肥化法の発熱状態を利用、および産生された熱を使用することができる。
当技術分野で日常的に行われている手法を使用して、本発明の細胞、生物、またはその一部によって生成される非極性脂質を抽出、処理、精製、および分析することができる。そのような手法は、FereidoonShahidi,CurrentProtocolsinFoodAnalyticalChemistry,JohnWiley&Sons,Inc.(2001)D1.1.1−D1.1.11、およびPerez−Vich他(1998)等の出展の文献全体を通して記載および説明されている。
典型的に、植物種子は、粗製種子油を生成するために調理、圧搾、および/または抽出され、次いで、脱ガムされ、精製され、消色され、そして、消臭される。一般に、種子を破砕するための手法は、当技術分野で知られている。例えば、油料種子は、水を噴霧することによって、例えば8.5%まで含水量を増加させることによって柔らかくし、そして、滑らかなローラーを使用して0.23〜0.27mmの間隙設定でフレーク状にすることができる。種子の種類によっては、破砕する前に水を加えなくてもよい。熱の適用は、酵素を不活性化し、さらなる細胞の破裂を促進し、脂質液滴を癒合させ、タンパク質粒子を塊にし、これらの全てが、抽出工程を容易にする。
脱ガムは、油精製の早期ステップであり、その主な目的は、油からリン脂質(総抽出脂質のおよそ1〜2%で存在しうる)の大部分を除去することである。典型的には、リン酸を含む約2%の水を70〜80℃で原油に添加することにより、微量の金属および色素と共にリン脂質の大部分が分離される。除去される不溶性金属は主にリン脂質とトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしてもまた知られている。脱ガムは、濃縮したリン酸を粗種子油に添加して非水和性リン脂質を水和可能な形態に変換し、存在する少量の金属をキレート化することによって行うことができる。ガムは、遠心分離によって種子油から分離される。種子油は、十分な量の水酸化ナトリウム溶液を添加して全ての脂肪酸を滴定し、それにより形成された石鹸を除去することによって精製することができる。
アルカリ精製は、原油を処理するための精製工程の一つであり、中和ともまた呼称されることがある。通常、脱色の前、脱ガムの後に行われる。脱ガムの後、種子油は、全ての脂肪酸およびリン酸を滴定するために十分な量のアルカリ溶液が添加され、それにより形成される石鹸を除去することにより、処理することができる。適切なアルカリ性物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび水酸化アンモニウムが挙げられる。この方法は通常、室温で行われ、遊離脂肪酸分画を除去する。石鹸は、遠心または、石鹸に対する溶媒中への抽出により除去され、中和された油は水で洗浄される。もし必要であれば、油中の任意の過剰量のアルカリを、適切な酸(たとえば、塩酸または硫酸)で中和してもよい。
脱色は、脱色土の存在下(0.2〜2.0%)、および酸素の非存在下で、窒素またはスチームで行うことにより、または真空中で行うことにより、10〜30分、90〜120℃で油を加熱する精製工程の1つである。油処理のこのステップは、望ましくない色素(カロテノイド類、クロロフィル、ゴシポール等)の除去を目的としており、当該方法により、酸化産物微量金属、硫黄化合物および石鹸の痕跡もまた除去される。
脱臭は、高温(200〜260℃)および低圧(0.1〜1mmHg)での油および脂質の処理である。これは通常、約0.1ml/分/種子油100mlの比率で、スチームを種子油に導入することにより行われる。脱臭は、真空下で種子油を260℃に加熱し、種子油100mLあたり約0.1mL/分の速度で蒸気を種子油の中に緩やかに導入することによって行うことができる。約30分スパージした後に、種子油を真空下で冷却させる。種子油は、典型的には、ガラス容器に移され、アルゴンでフラッシングされ、その後に、冷凍下で貯蔵される。種子油の量が限られている場合、種子油は、真空下で、例えばParr反応器中に置いて、脱臭にかかったとされる時間と同じ長さで260℃に加熱することができる。この処理は、種子油の色を改善し、大半の揮発性物質または任意の残留脂肪酸、モノアシルグリセロールおよび酸化産物を含む臭気化合物を除去する。
脱ろうは、油および脂質の、大気温度下での結晶化による、固体(ステアリン)および液体(オレイン)分画への分離のための、市販の油製品に時折用いられる工程である。元々は、固形分の無い製品を製造するために綿実油に適用されていた。典型的には、油の飽和脂肪酸含量を減少させるために用いられる。
光合成に関与する植物の一部(例えば、より高度な植物の茎および葉、ならびに藻類等の水生植物)も、脂質を生成するために使用することができる。植物の種類とは関係なく、グリーンバイオマスから脂質を抽出するためのいくつかの方法がある。1つの方法は、物理的抽出であるが、これは、しばしば、溶媒抽出を使用しない。これは、いくつかの異なる種類の機械的抽出を使用した「従来の」方法である。搾油機で圧搾する抽出は一般的な種類であり、スクリュー圧搾機およびラム圧搾機による抽出方法も同様である。これらの方法を使用して抽出される脂質の量は、用いた植物材料および機械的工程によって大幅に変動する。機械的抽出は、典型的に、下記で説明される溶媒抽出よりも非効率的である。
藻類は、陸生植物よりも、年に10〜100倍も大きい質量を産生することができる。多産生生物であることに加え、藻類は、バイオ燃料へと転換することができる油およびデンプンを産生することもできる。
本明細書で使用される「発酵工程」という用語は、いかなる発酵工程、または発酵ステップをむいかなる工程をも指す。発酵工程としては、アルコール(例えば、エタノール、メタノール、ブタノール)、有機酸(例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸)、ケトン(例えば、アセトン)、アミノ酸(例えば、グルタミン酸)、ガス(例えば、H2およびCO2)、抗生物質(例えば、ペニシリンおよびテトラサイクリン)、酵素類、ビタミン類(例えば、リボフラビン、ベータカロテン)およびホルモン類を生成するために使用される発酵工程が挙げられるが、これらに限定されない。発酵工程はまた、消費アルコール業界(例えば、ビールおよびワイン)、酪農業界(例えば、発酵酪農製品)、革製品業界、およびタバコ業界で使用される発酵工程も含む。好ましい発酵工程としては、当技術分野でよく知られているようなアルコール発酵工程が挙げられる。好ましい発酵工程は、当技術分野でよく知られているような嫌気性発酵工程である。好適な発酵性細胞は、典型的に、発酵させることが可能である、すなわち、グルコースまたはマルトース等の糖を所望の発酵産物に直接的または間接的に変換することが可能である微生物である。
説明される方法によって生成される脂質は、種々の用途を有する。いくつかの実施形態において、脂質は、食物油として使用される。他の実施形態において、脂質は、精製されて、潤滑剤として、またはプラスチックの合成等の他の工業的用途に使用される。いくつかの好適な実施形態において、脂質は、バイオディーゼルを生成するために精製される。
本明細書において、「バイオ燃料」という用語には、バイオディーゼルおよびバイオアルコールが含まれる。バイオディーゼルは、植物、藻類および菌類から誘導された油から製造することができる。バイオアルコールは、糖の発酵から製造することができる。この糖は、植物(たとえば、サトウキビ)から直接抽出することができ、植物デンプン(たとえば、トウモロコシまたは小麦)から誘導することができ、またはセルロース(たとえば、木質、葉または茎)から生成することができる。
生物学的に製造される、たとえば、エタノール、プロパノールおよびブタノール等のアルコールの製造は、公知である。エタノールは最も一般的なバイオアルコールである。
バイオアルコールは、糖類の微生物発酵により生成される。微生物発酵は、現在のところ、糖類とのみ直接的に機能する。2つの主な植物の構成成分であるデンプンとセルロースは共に、糖類から構成されており、原理上、発酵のために糖類に転換することができる。
エタノールが燃料として使用可能となるためには、大部分の水を除去しなければならない。水の大部分は蒸留により除去されるが、低沸点の水−エタノール共沸混合物の形成のために、純度は95〜96%に制限され、最大で(95.6% m/m(96.5% v/v)エタノールおよび、4.4% m/m (3.5% v/v)水)である。この混合物は、水和エタノールと呼ばれ、単独で燃料として用いることができるが、無水エタノールとは異なり、水和エタノールはガソリンと全ての比率で混ざり合うことは無く、そのため、ガソリンエンジンでガソリンと組み合わせて燃焼させるために、通常、さらなる処理で水分画を除去する。
水は、エタノール/水の共沸混合物から、脱水により除去することができる。多くの早期燃料エタノールプラントにおいて用いられている共沸混合物蒸留は、混合物にベンゼンまたはシクロヘキサンを添加することからなる。これらの化合物が混合物に添加されると、蒸気−液体−液体平衡の異種共沸混合物を形成し、それは蒸留されると、カラムの底に無水エタノール、および水とシクロヘキサン/ベンゼンの上記混合物を生成する。濃縮されると、これは二相性の液体混合物となる。抽出蒸留と呼ばれる他の早期方法は、エタノールの相対揮発度を上げる三元成分の添加からなる。三元混合物が蒸留されると、カラムのトップストリーム上に、無水エタノールを生成する。
バイオディーゼルまたはアルキルエステルの生成は、よく知られている。脂質からのエステル生成には、次の3つの基本的な経路がある。すなわち、1)アルコールによる、脂質の塩基触媒エステル交換、2)メタノールによる脂質の直接的な酸触媒エステル化、および3)脂質の脂肪酸への変換、その後の、酸触媒によるアルキルエステルへの変換、である。
バイオ燃料生成のための植物トリアシルグリセロールの使用は、Durrett et al. (2008)に概要が記述されている。簡潔に述べると、植物油は主に、グリセロールにエステル化された三脂肪酸鎖(通常、18または16炭素長)からなる分子である、様々なトリアシルグリセロール(TAG)から構成される。脂肪酸鎖は、ガソリンおよびディーゼル中に見いだされる分子のほとんどを構成する脂肪族炭化水素と化学的に類似している。ガソリン中の炭化水素は、一分子あたり5〜12の炭素原子を含んでおり、この揮発性燃料は、空気と混合され、従来的なエンジン中で火花と共に発火する。対照的に、ディーゼル燃焼成分は、通常、一分子あたり10〜15の炭素原子を有し、ディーゼルエンジン中で得られる非常に高い圧縮により発火する。しかしながら、ほとんどの植物TAGは、従来的なディーゼルよりも非常に高い粘度範囲を有しており、それぞれ、1.9〜4.1 mm2s−1と比較して、17.3〜32.9 mm2s−1である(ASTM D975; Knothe and Steidley, 2005)。この高い粘度により、最新型のディーゼルエンジン中ではわずかしか燃料が微粒化せず、それにより、たとえば炭素析出およびコーキング等の不完全燃焼から生じる問題が発生する(Ryan et al., 1984)。この問題を克服するために、TAGを、第1級アルコール(最も普遍的なのはメタノール)でエステル化することにより、より低い粘度の脂肪酸エステルへと転換する。得られる燃料は、一般に、バイオディーゼルと呼ばれ、1.9〜6.0 mm2s−1の粘度ダイナミックレンジを有している (ASTM D6751)。バイオディーゼル中に見いだされる脂肪酸メチルエステル(FAME)は、高い燃焼熱に反映されるように、高いエネルギー密度を有しており、従来的なディーゼルのそれと、大きくは無くとも、類似である(Knothe, 2005)。同様に、バイオディーゼル中に見いだされるFAMEのセタン数(ディーゼル発火性の測定値)は、従来的なディーゼルのそれを超える(Knothe, 2005)。
藻類は、細胞体の内側、常にではないが時に小胞体中に油を貯蔵している。この油は、溶媒、加熱および/または圧力を含む、比較的単純ないくつかの方法で回収することができる。しかしながら、これらの方法は通常、貯蔵油の約80%〜90%のみを回収する。貯蔵油を低いコストで、ほぼ100%近くまで回収することができる、より有効的な油抽出法である工程が当分野には知られている。これらの工程には、脱重合(たとえば、生物学的に藻類細胞の壁および/またはもし存在すれば油小胞体を壊し、油産生藻類から油を放出させる)を含む、またはからなる。
本発明は、飼料として使用することができる組成物を含む。本発明の目的について、「飼料」としては、体内に取り込んだときに、(1)組織に栄養分を与える、もしくは組織を作り上げる、またはエネルギーを供給する役目をする、および/または(2)十分な栄養状態もしくは代謝機能を維持する、回復させる、もしくは支援する、(経腸および/もしくは腸管外摂取を含む)ヒトまたは動物の摂取のためのあらゆる食品または調製物が挙げられる。本発明の飼料は、乳児および/または幼児のための栄養組成物を含む。
本発明はまた、本発明の方法を使用して生成される1つ以上の脂質を含む、組成物、特に医薬組成物も包含する。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、一般に、同じ意味で使用される。
指向性進化では、ランダムな変異誘発がタンパク質に適用され、所望の品質、例えば増加した脂肪酸アシルトランスフェラーゼ活性を有する変異形を選択するために、選択レジームが使用される。次いで、さらなる一連の変異および選択が適用される。典型的な指向性進化方策は、次の3つのステップを伴う。すなわち、
タンパク質は、タンパク質構造および折り畳みに関する既知の情報に基づいて、合理的に設計することができる。これは、ゼロからの設計(デノボ設計)によって、または天然の足場に基づく再設計(例えば、Hellinga,1997、およびLu and Berry,Protein Structure Design and Engineering,Handbook of Proteins 2,1153−1157(2007)を参照されたい)によって達成することができる。タンパク質設計は、典型的に、所与または標的の構造に折り畳む配列を特定することを伴い、コンピュータモデルを使用して達成することができる。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、標的構造に折り畳んだときにエネルギーが低い配列について配列−配座空間を検索する。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、どのくらいの変異がタンパク質の構造および機能に影響を及ぼすのかを評価するために、タンパク質エネルギー学のモデルを使用する。これらのエネルギー関数は、典型的に、分子力学、統計学(すなわち知識に基づくもの)、および他の経験項を含む。好適な、入手可能なソフトウェアとしては、IPRO(Interative Protein Redesign and Optimization)、EGAD(AGenetic Algorithm for Protein Design)、Rosetta Design、Sharpen、およびAbalone.が挙げられる。
一態様において、本発明は、細胞においてMAG、DAG、および/またはTAGを生成する増加した能力を有する脂肪酸アシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を特定するための方法を提供する。
本発明のある特定の態様は、生育物質の光沢度を、物質中の脂質レベルに対するマーカーとして測定することに関連し、高レベルの光沢度は、高レベルの脂質と関連する。
一過性発現系での植物細胞における遺伝子の発現
遺伝子は、基本的に、Voinnet他(2003)およびWood他(2009)によって説明されるような一過性発現系を使用して発現させた。複製したエンハンサー領域を含む強力な構成的e35Sプロモーターによって発現するコード領域を含むバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株AGL1に導入した。p19ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現するためのキメラバイナリーベクター35S:p19を、国際特許公開第WO2010/057246号で説明されるように、AGL1に別々に導入した。V2ウイルスサイレンシングサプレッサーを発現させるためのキメラバイナリーベクター35S:V2を、AGL1に別々に導入した。組み換え細胞を、50mg/Lのカナマイシンおよび50mg/Lのリファンビシンを補充したLBブロスにおいて、28℃で静止期まで成長させた。次いで、細菌を、5000gで、室温における5分間の遠心分離によってペレット化し、その後に、10mMのMES、pH5.7、10mMのMgCl2、および100μMのアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液中に、OD600=1.0になるように再懸濁した。次いで、細胞を、28℃で3時間振盪しながらインキュベートし、その後に、OD600を測定し、OD600=0.125という最終濃度に到達させるために必要とされる量の、ウイルスサプレッサー構築物35S:p19または35S:V2を含む各培養物を新鮮な管に加えた。最終的な体積は、前述の緩衝剤で補った。次いで、培養物混合物を葉に浸潤させ、浸潤後さらに3〜5日間植物を成長させ、その後、精製した細胞溶解物調製物または総脂質単離のために葉片を回収した。
上で説明したように事前に浸潤させたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織を、ガラスホモジナイザを使用して、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)および0.33Mのスクロースを含む溶液中ですりつぶした。葉ホモジェネートを、4℃、20,000gで45分間遠心分離し、その後に、各上清を採集した。各上清中のタンパク含有量を、Wallac1420マルチレベルカウンタおよびBio−Rad Protein Assay色素試薬(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CAUSA)を使用して、Bradford(1976)に従って測定した。アシルトランスフェラーゼアッセイでは、いくつかの改変を伴って、Cao他(2007)に従って、100μgのタンパク質を使用した。反応培地は、100mMのHCl(pH7.0)、5mMのMgCl2、1mg/mLのBSA(脂肪酸含まず)、200mMのスクロース、40mMの低温オレオイル−CoA、16.4μMのsn−2−モノオレオイルグリセロール[14C](55mCi/mmol、American Radiochemicals,Saint Louis,MOUSA)、または6.0μMの[14C]グリセロール−3−リン酸(G−3−P)ジナトリウム塩(150mCi/mmol、American Radiochemicals)を含めた。アッセイは、7.5分、15分、または30分にわたって行った。
要約すると、種子または生育組織中の脂質を分析するために用いられた方法は、以下である。
(i)脂肪酸組成−種子を破砕することなく、種子中の脂肪酸の直接的なメチル化
(ii)総脂肪酸またはTAG定量−17:0TAG標準の使用を伴い、種子を破砕することなく、種子中の脂肪酸の直接的なメチル化
(i)単一種子脂肪酸組成−種皮を破壊した後の、種子中の脂肪酸の直接的なメチル化
(ii)プールされた種子−総抽出脂質の脂肪酸組成−CHCl3/ MeOH中での種子の破砕および抽出脂質のアリコートのメチル化
(iii)プールされた種子−総脂質含量(種子油含量)−種子破砕後の種子脂質の完全な回収のための、乾燥した既知量の種子からの、2度の脂質抽出(内部標準としての17:0脂肪酸と共に、既知量の種子からの、脂質のメチル化を伴う)
(iv)プールされた種子−精製されたTAG定量−種子破砕後の種子脂質の完全な回収のための、乾燥した既知量の種子からの、2度の脂質抽出、TLCを用いた脂質由来のTAG分画化、および内部標準として17:0TAGを用いた、TAGのin silicaの直接的なメチル化。
(i)総脂質の脂肪酸組成−凍結乾燥試料中の脂肪酸の直接的なメチル化
(ii)総脂質定量−17:0 FFAを伴う、凍結乾燥試料の既知重量中の脂肪酸の直接的なメチル化
(iii)TAG定量−葉の中にはかなりの量の極性脂質が存在するため、TAGを、抽出総脂質からTLCにより分画化させ、17:0TAG内部標準の存在下でメチル化した。ステップ:試料の凍結乾燥、計量、脂質抽出、既知量の総脂質からのTAG分画化、内部標準としての17:0TAGと共に、in silicaのTAGの直接的なメチル化。
種子油含量が、たとえばアラビドプシス種子等の小さな種子で計測される場合、種子は、デシケーター中で24時間、乾燥させ、およそ4mgの種子を、テフロン加工のねじ蓋を含む2mlのガラスバイアルに移した。0.1mlのトルエンに溶解した0.05mgのトリヘプタデカノイン(triheptadecanoin)を、内部標準としてバイアルに添加した。種子FAMEは、0.7mlの1NのメタノールHCl(Supelco)を、種子物質を含むバイアルに添加することにより調製した。種子の破砕は、たとえばアラビドプシス種子糖の小さな種子には必要は無かった。混合物を短時間、ボルテックスし、2時間、80℃でインキュベートした。室温にまで冷却した後、0.3mlの0.9% NaCl(w/v)および0.1mlのヘキサンをバイアルに添加し、10分間、Heidolph Vibramax 110中で良く混合した。FAMEを、0.3mlのガラスインサート中へ回収し、上述のように、水素炎イオン化検出器で、GCにより分析した。
植物が十分に成長した時点での採取の後、カメリナまたはカノーラ種子を、乾燥剤としてシリカゲルを含むデシケーター中、室温で24時間種子を保存することにより、乾燥させた。種子の含水量は、大体6〜8%である。Reicht組織ライザー(tissue lyser)(22頻度/秒、3分間)および金属球を用いて、エッペンドルフチューブ中、クロロホルムとメタノール(2/1 v/v)の混合物を用いて種子を破砕することにより、既知量の乾燥種子から、総脂質を抽出した。1体積の0.1M KClを添加し、混合物を10分間、振盪させた。3000rpm、5分間の混合物の遠心の後、非極性低層を回収した。残りの上層(水性)を、2体積のクロロホルムで、10分間、混合することにより洗浄した。第二の非極性層をまた回収し、第一のものと共にプールした。窒素フロー下、抽出物中の脂質から溶媒を蒸発させ、総乾燥脂質を、既知量のクロロホルム中に溶解させた。
溶解物アッセイによる脂質を、クロロホルム:メタノール:0.1MのKCl(2:1:1)を使用して抽出して、回収した。試料中の異なる脂質クラスを、10%のホウ酸を含浸させたSilica Gel60薄層クロマトグラフィ(TLC)プレート(Merck,Dermstadt,Germany)上で分離した。脂質抽出物からTAGを分画するために使用した溶媒系は、クロロホルム/アセトン(90/10 v/v)で構成した。個々の脂質クラスを、プレートをヨウ素蒸気に露出することによって視覚化し、同じTLCプレート上で真正標準を並列に実行することによって特定した。プレートを、蛍光体撮像スクリーンに一晩露出し、DPMで定量化するために、液体シンチレーション計数の前にFujifilm FLA−5000 Phosphorimagerによって分析した。
葉試料を含む組織を凍結乾燥させ、計量し(乾重量)、および総脂質を、Bligh and Dyer (1959)に記述されるように、または溶媒としてクロロホルム:メタノール:0.1M KCl(CMK;2:1:1)を用いることにより抽出した。総脂質は、凍結乾燥後、クロロホルム/メタノール(2/1 v/v)混合物を、葉試料1cm直径あたり、900μLで添加することにより、N. benthamiana葉試料から抽出された。TLC−FID分析が実施された場合、内部標準として乾燥葉重量0.5mg当たり、0.8μgのDAGEを添加した。試料を、IKA ultra−turrax組織ライザーを用いてホモジナイズし、その後、500μLの0.1M KClを添加した。試料をボルテックスして、5分間遠心し、低層を回収した。残りの上層は、600μLのクロロホルムを添加し、ボルテックスを行い、および5分間遠心することにより、2度、抽出された。低層を回収し、前述の回収物へプールされた。脂質を窒素フロー下で乾燥させ、2μLクロロホルム/mg葉乾重量で再懸濁した。N. tabacumの総脂質または葉試料は、一部改変を加えて、上述のように抽出した。もし4〜6の葉ディスク(各々はおよそ1cm2の表面積)を組み合わせた場合、1.6mlのCMK溶媒を使用し、一方、もし3以下の葉ディスクを組み合わせた場合、1.2mlのCMKを用いた。凍結乾燥させた葉組織を、Reicht tissue lyser(Qiagen)を用いて3分間、20頻度/秒で、金属球を含むエッペンドルフチューブ内でホモジナイズした。
既知体積の葉抽出物(たとえば、30μL)を、TLCシリカゲル60プレート(1x20cm)(Merck KGaA, Germany)上にロードした。中性脂質は、ヘキサン/DEE/酢酸(70/30/1 v/v/v)溶媒システムを含む平衡化展開タンクでTLCを介して分離された。TAGのバンドは、ヨウ素ガスにより可視化され、TLCプレートからこすり取り、2mLのGCバイアルへと写し、N2で乾燥させた。750μLの1NのメタノールHCl(Supelco analytical, USA)を、既知量のC17:0TAG(たとえば、定量に対する内部標準として30μg)と共に各バイアルに添加した。
FAMEは、SGE BPX70 (70% シアノプロピル ポリシルフェニレン−シロキサン)カラム(30m x 0.25mm i.d.,0.25μmのフィルムの厚さ)、FID、スプリット/スプリットレス インジェクターおよび、Agilent Technologies 7693 Seriesオートサンプラ―およびインジェクター、を備えた、Agilent Technologies 7890A GC (Palo Alto, California, USA)を用いて、GCにより分析された。ヘリウムを、キャリアガスとして用いた。試料は、スプリットモード(50:1の比率)で、150℃のオーブンの温度で注入された。注入後、オーブンの温度は1分間、150℃で維持され、次いで、3℃/分-1で210℃まで上げ、最後に、50℃/分-1で240℃まで上げた。ピークは、既知量の外部標準GLC−411(Nucheck)およびC17:0−Me内部標準の応答に基づき、Agilent Technologies ChemStation ソフトウェア(Rev B.04.03 (16)、Palo Alto、California、USA)で定量化された。
1μLの脂質抽出物を、TLC−FID Iatroscan(登録商標)(Mitsubishi Chemical Medience Corporation−Japan)に対する1つのChromarod−SII上にロードした。Chromarodのラックを、次いで、70mLのヘキサン/CHCl3/2−プロパノール/ギ酸(85/10.716/0.567/0.0567 v/v/v/v)溶媒システムを含む平衡化展開タンクへと移した。30分のインキュベーション後、Chromarodラックを100℃で3分間、乾燥させ、ただちに、Iatroscan MK−6s TLC−FID 分析器(Mitsubishi Chemical Medience Corporation−Japan)上でスキャンした。DAGE内部標準およびTAGのピーク領域は、SIC−480II統合ソフトウェア(Version:7.0−E SIC System instruments Co., LTD−Japan)を用いて統合された。
個々のFAMEのピーク領域は、最初に、市販の標準GLC−411(NU−CHEK PREP, Inc., USA)中に存在する、既知量の同じFAMEのピーク領域応答に基づき、補正された。補正された領域を用いて、内部標準と比較することにより、試料中の各FAMEの質量を算出した。油は主にTAGの形態で貯蔵されているため、油の量は、各試料中のFAMEの量に基づき算出された。グリセロールの総モルは、FAMEのモル数を算出し、FAMEの総モルを3で割ることにより決定された。TAGの量は、式:油重量%=100x((41x総モルFAME/3)+(総FAMEg−(15x総モルFAME)))/葉乾重量g(ここで、41および15は、それぞれ、グリセロール部分およびメチル基の分子量である)を用いて、グリセロールおよび脂肪アシル部分の総和として算出された。
サッカロミセス・セレビシエ株H1246は、DGAT活性が全くなく、かつ4つの遺伝子(DGA1、LRO1、ARE1、ARE2)におけるノックアウト変異の結果として、TAGおよびステロールエステルが欠如している。H1246成長媒体への遊離脂肪酸の添加(例えば、1mM、18:1Δ9)は、DGAT活性がない場合に有毒である。したがって、そのような培地での成長は、この酵母株におけるDGAT活性の存在についての指標または選択肢として使用することができる。
・ YNBD:ウラシルを含まず、2%のグルコース、0.01%のNP40、および100μLのエタノールを含む、最小限のドロップアウト培地。
・ YNBG:ウラシルを含まず、2%のガラクトース、1%のラフィノース、0.01%のNP40、および100μLのエタノールを含む、最小限のドロップアウト培地。
・ YNBG+FA:ウラシルを含まず、2%のガラクトース、1%のラフィノース、0.01%のNP40、および100μLのエタノールに溶解させた1mMC18:1Δ9を含む、最小限のドロップアウト培地。
MGAT1
M.musculus由来の遺伝子によってコードしたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1(MGAT1)(Yen他,2002)、およびここでMGAT1との比較として使用した、A.サリアナのジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT1)(Bouvier−Nave他,2000)の酵素活性を、実施例1で説明されるように一過性発現系を使用して、N.ベンサミアナの葉組織において実証した。
EcoRI断片内に含まれるMGAT2コード領域全体をEcoRI部位の35S−pORE04に挿入することによって、35S:MGAT2と命名した、植物細胞における発現のためのM.マスクルMGAT2をコードするキメラDNAを作製した。M.musculus由来の遺伝子によってコードしたモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(MGAT2)(Yen,2003)(GenBank登録番号Q80W94)、およびMGAT2との比較として使用したA.サリアナのDGAT1(Bouvier−Nave et al., 2000)の酵素活性は、実施例1で説明した一過性発現系を使用した、N.ベンサミアナの葉組織においても示された。
本発明者らは、驚くべきことに、MGAT遺伝子のトランスジェニック発現が、植物細胞における脂質収量のかなりの増加をもたらすことを実証した。本発明者らは、Tumaney他が、一部のMGAT活性によってDGATを単離したこと、およびTumaney他が、本明細書で定義されるように、MGATをコードする遺伝子のクローン化する試みに成功しなかったことを理解している。Tumaney他(2001)は、ピーナッツにおけるMGAT活性を報告し、この活性の原因となる酵素を単離した。しかしながら、Tumaney他は、DGAT活性についての試験結果を公表せず、したがって、報告した酵素は、いくつかのMGAT活性を伴うDGATであったと考えられる。実際に、以前の研究では、他の種においていかなるMGAT活性も特定できなかった(Stobart他,1997)。さらに、意外なことに、Tumaney他が単離した酵素は、膜結合酵素ではなく、可溶性のサイトゾル酵素であった。
実施例1に記載されるように、35S:MGAT1、35S:MGAT2、35S:DGAT1を浸潤させたN.ベンサミアナの葉組織から細胞溶解物を作製した。35S:p19構築物だけしか含まない株(陰性対照)、35S:p19株を伴う35S:MGAT2株、ならびに35S:p19株を伴う35S:MGAT2株および35S:DGAT1アグロバクテリウム株の混合物について、それぞれ3つ組で、別々の葉浸潤を行った。3日後に3つ組の試料を採取し、精製した細胞溶解物を、機械的組織溶解および遠心分離によって調製した。実施例1で説明されるように[14C]MAGを溶解物に供給することによって、精製した細胞溶解物のMGAT活性を比較した。データを図4に示す。
葉溶解物を使用した実施例3で説明されるインビトロのアッセイでは、基質(sn−2−MAGおよびオレオイル−CoA)を外因的に供給したのに対して、無傷の植物組織におけるインビボのMGAT活性では、これらの基質が天然に存在することを必要とするであろう。種々の植物組織における低レベルのMAGの存在は、既に報告されている(HirayamaおよびHujii,1965、Panekina他,1978、Lakshminarayana他,1984、PerryおよびHarwood,1993)。MGAT2が天然の植物経路によって生成されたMAGを利用できるかどうかを試験するために、前述の実験を繰り返すが、ここでは、[14C]G−3−Pを溶解物に供給した。結果として生じたデータを図5に概略的に示す。
pYES2:DGAT1、pYES2:MGAT1、およびpYES2:MGAT2を生ずるように、A.サリアナDGAT1、M.musculusMGAT1、およびM.musculusMGAT2をコードする遺伝子をpYES2ベクターに挿入することによって、キメラ酵母発現ベクターを構成した。これらの構成体を、DGAT活性が全くなく、かつ4つの遺伝子(DGA1、LRO1、ARE1、ARE2)におけるノックアウト変異の結果として、TAGおよびステロールエステルが欠如している、サッカロミセス・セレビシエ株H1246において形質転換した。酵母株H1246は、外因的に添加した脂肪酸からDAGを合成することができるが、ノックアウト変異のため、DAGをTAGに変換することができない。形質転換した酵母培養物に、[14C]18:1Δ9を供給し、その後に、実施例1で説明されるように全ての脂質を抽出して、TLCによって分画した。代表的なTLCプレートのオートラジオグラムを図6に示す。
アラビドプシス・サリアナ種子におけるMGAT1の発現
M.マスクルスMGAT1をコードし、種子特異的プロモーター(FP1、切断したブラシカ・ナパス・ナピン・プロモーター)の制御下にある遺伝子を使用して、安定的に形質転換したA.サリアナおよび子孫種子を生成した。FP1プロモーターおよびグリシネ・マクのレクチンポリアデニル化シグナルが側面に並ぶEcoRI部位を含むSalI断片をベクターpCW141のSalI−XhoI部位に挿入することによって、pJP3174と命名したベクターを作製した。pCW141ベクターはまた、スクリーニング可能なマーカー遺伝子としてFP1駆動、イントロン中断、種子分泌のGFPも含んだ。EcoRI断片内に含まれる構築物0954364_MGAT_pMAのコード領域全体を、pJP3179を生成するEcoRI部位のpJP3174に挿入することによって、FP1:MGAT1−GFPと命名したキメラ遺伝子を作製した。このキメラベクターを、A.ツメファシエンス株AGL1に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物由来の細胞を使用して、形質転換のためのフローラルディップ法(CloughおよびBent,1998)を使用してA.サリアナ(生態型コロンビア)植物を処理した。成熟後に、処理した植物に由来する種子を、LeicaMZFLIII解剖顕微鏡およびebq100水銀ランプの下で観察した。15個のトランスジェニック種子(強いGFP陽性)および15個の非トランスジェニック(GFP陰性)種子を、単離して、それぞれプールした。GFP陽性プールおよびGFP陰性プールを、実施例1で説明されるように、総脂肪酸含量について分析した。この分析は、MGAT構築物で形質転換した種子について平均的な脂肪酸含量および組成物を提供したが、ヘミ接合性およびホモ接合性双方の形質転換された種子を含んだかもしれない集団におけるものであった。
表2 種子の脂肪酸組成に対するMGAT発現の影響
表3 アラビドプシス・サリアナT2FP1:MGAT1トランスジェニック種子および親対照種子の、脂肪酸プロファイルおよび総脂肪酸の定量
表4 未形質転換対照種子と比較した、MGAT2を発現しているArabidopsis thalianaT2およびT3種子から抽出されたTAGレベルおよびTAG中の脂肪酸組成
アラビドプシス・サリアナ種子のM.マスクルスMGAT1の発現に使用されるベクターFP1:MGAT1を使用して、形質転換されたB.ナパス植物を生成した。標準的な電気穿孔手順を介して、ベクターをA.ツメファシエンス株AGL1に導入した。培養物を、150rpmで攪拌しながら、LB培地中で、28℃で一晩成長させた。細菌細胞を、4000rpmで5分間の遠心分離によって採集し、WinansのAB(Winans、1988)で洗浄し、10mLのWinansのAB培地(pH5.2)中に再懸濁し、そして100μMのアセトシリンゴンを添加しながら、カナマイシン(50mg/L)およびリファンビシン(25mg/L)で一晩成長させた。ブラッシカ細胞を感染させる2時間前に、スペルミジン(120mg/L)を添加し、細菌の最終的な密度を、新鮮なAB媒体で0.3〜0.4のOD600nmに調整した。1/2MS(Murashige−Skoog,1962)上で成長させた8日目のB.ナパス苗木由来の新鮮に単離した子葉柄、またはMS培地上で3〜4日目までに1mg/Lチジアズロン(TDZ)+0.1mg/Lのアルファ−ナフタレン酢酸(NAA)で予め調整した胚軸セグメントを、10mLのアグロバクテリウム培養物で5分間感染させた。次いで、アグロバクテリウムを感染させた外植体(子葉柄および胚軸)を、滅菌濾紙で吸い取って余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤(50mg/LのL−システインおよび15mg/Lのアスコルビン)を補充した、または補充しない、共培養媒体(1mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+100μMアセトシリンゴンを伴うMS媒体)に移した。全てのプレートを、パラフィルムで密閉し、暗所において23〜24℃で48時間インキュベートした。
アラビドプシス・サリアナ種子のM.マスクルスMGAT1の発現に使用したものと同じ種子特異的キメラ遺伝子を使用して、形質転換されたゴシピウム・ヒルスツム植物を生成した。FP1:MGAT1と命名したベクターを、標準的な電気穿孔手順を介してA.ツメファシエンス株AGL1に導入し、アグロバクテリウム培養物由来の細胞を使用して、キメラDNAをゴシピウム・ヒルスツム(変種Coker315)の細胞に導入した。10日目の綿苗木から切除した子葉を外植体として使用し、A.ツメファシエンスに感染させて2日間にわたって共培養した。この後に、0.1mg/Lの2,4−D、0.1mg/Lのカイネチン、50mg/Lの硫酸カナマイシン、および25mg/Lのセフォタキシムを含むMS培地(MurashigeおよびSkoog,1962)に対する6週間選択が続いた。子葉外植体由来の健康なカルスを、28℃で第2の6週間にわたって、5mg/Lの6−(γ、γ−ジメチルアリルアミノ)−プリン(2ip)、0.1mg/Lのナフタレン酢酸(NAA)、25mg/Lのカナマイシン、および250mg/Lのセフォタキシムを含むMS媒体に移した。インキュベーションの約6〜10週後に形成される体細胞胚を、同じ培地であるが植物ホルモンまたは抗生物質を添加していない培地上で発芽させて維持した。体細胞胚から発育した小植物を、土壌に移し、葉および根が発育した時点で、28℃/20℃(昼/夜)の成長温度で、温室において維持した。FP1−MGAT1構築物を含む10の独立した最初のトランスジェニック植物(T0)を、温室において成長させ、開花させ、種子を含む莢を生成させた。種子は、成熟期に採取した。油含量分析の信頼性を上げるために、5つの植物を、10の最初の各トランスジェニック植物から確立させ、そして成熟T2種子を油含量の分析に供する。MGAT1の種子特異的発現は、含油量を増加させ、綿種子油における多価不飽和脂肪酸の割合を増加させる。
N.ベンサミアナを、実施例2で説明される35S:MGAT1構築物で安定的に形質転換した。35S:MGAT1を、標準的な電気穿孔手順を介して、A.ツメファシエンス株AGL1に導入した。形質転換された細胞を、カナマイシン(50mg/L)およびリファンビシン(25mg/L)を補充した個体LB培地上で成長させ、28℃で2日間インキュベートした。単一の群体を使用して、新鮮な培養を開始した。48時間の活発な培養に続いて、細胞を2,000xgの遠心分離によって採集し、上清を除去した。OD600=0.5の密度で、50%のLBおよび50%のMS培地を含む新鮮な溶液中に細胞を再懸濁した。
表5 35S:MGAT1構築物で安定的に形質転換されたニコチアナ・ベンサミアナの葉組織におけるTAGの脂肪酸プロファイルおよび定量化。試料「M」は、35S:MGAT1であり、試料「C」は、親対照植物である。
M.マスクルスMGAT1をコードするキメラ遺伝子を使用して、トリフォリウム・レペンス(別の双子葉植物)を形質転換した。キメラ遺伝子35S:MGAT1および35S:DGAT1を含むベクターを、標準的な電気穿孔手順を介して、A.ツメファシエンスに導入した。双方のベクターはまた、35S:BAR選択可能なマーカー遺伝子も含む。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン(50mg/L)およびリファンビシン(25mg/L)を補充した固体LB培地上で成長させ、28℃で2日間インキュベートした。単一の群体を使用して、各構築物のための新鮮な培養を開始した。48時間の活発な培養に続いて、アグロバクテリウム培養物を使用して、Larkin他(1996)によって説明されるように、給水種子から解離したT.レペンス(cv.Haifa)子葉を処理した。3日間の共培養に続いて、外植体を、5mg/LのPPTに露出して、形質転換された芽を選択し、次いで、発根培地に移して根を形成させ、その後に、土壌に移した。MGAT1を含む形質転換された植物を得た。35Sプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現する。含油量は、少なくとも葉等の栄養組織において増加する。
M.マスクルスMGAT1を含むキメラベクターを使用して、安定的に形質転換されたホルデウム・ブルガレ(単子葉植物の植物)を生成した。キメラ遺伝子Ubi:MGAT1およびUbi:DGAT1を含むベクターを、M.マスクルスMGAT1およびA.サリアナDGAT1コード領域全体を、それぞれ、pWVEC8−Ubiの中にクローン化することによって構築した。キメラ遺伝子Ubi:MGAT1およびUbi:DGAT1を含むベクターを、標準的な電気穿孔手順を介して、A.ツメファシエンス株AGL1に導入した。形質転換されたアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン(50mg/L)およびリファンビシン(25mg/L)を補充した個体LB培地上で成長させ、プレートを、28℃で2日間インキュベートした。それぞれの単一の群体を使用して、新鮮な培養を開始した。
M.マスクルスMGAT1を含むキメラベクターを使用して、酵母(この実施例では、サッカロミセス・セレビシエ、すなわち、発酵による油の生成に好適な真菌微生物)を形質転換した。遺伝的構築物Gal1:MGAT1は、EcoRI断片内に含まれる0954364_MGAT_pMAと命名した構築物のコード領域全体を、pJP3301を生成するEcoRI部位のpYES2に挿入することによって作製した。同様に、ここでは比較として使用される、酵素A.サリアナDGAT1を別々にコードする遺伝的構築物Gal1:DGAT1を、A.サリアナDGAT1コード領域全体をpYES2に挿入することによって作製した。これらのキメラベクターを、熱衝撃によってS.セレビシエ株S288Cに導入し、形質転換体を、唯一の炭素源として2%のラフィノースを含む酵母最小培地(YMM)プレート上に選択した。クローンの接種原培養物を、唯一の炭素源として2%のラフィノースを伴う液体YMMにおいて確立した。この培養物からの実験培養物を、初期のOD600が約0.3になるように、1%のNP−40を含むYMM培地中に接種した。培養物を、OD600が約1.0になるまで、振盪(約100rpm)しながら28℃で成長させた。この時点で、2%(w/v)の最終濃度になるように、ガラクトースを添加した。遠心分離によって収穫する前に、培養物を、振盪しながらさらに25℃で48時間インキュベートした。細胞ペレットを水で洗浄し、その後に、実施例1で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥した。Galプロモーターは、形質転換された酵母細胞において誘導的に発現し、細胞における含油量が増加する。
M.マスクルスMGAT1を含むキメラベクターを使用して、安定的に藻類細胞を形質転換する。MGAT1コード領域を、カリフラワーモザイクウイルス35SプロモーターカセットおよびC.ラインハーディRBCS2プロモーターによって発現するパロモマイシン耐性遺伝子(アミノグリコシド−O−ホスホトランスフェラーゼVIII)を含むクローニングベクターの中にクローン化することによって、35S:MGAT1と命名した遺伝的構築物を作製する。35S:MGAT1を、改変したガラスビーズ法(Kindle,1990)によって、5×107の対数的培養物cc503(クラミドモナス・ラインハーディの細胞壁欠損株)の中に別々に導入する。双方のベクターはまた、選択可能なマーカー遺伝子としてBLE耐性遺伝子も含む。簡潔には、非形質転換細胞の群体を、TAP寒天培地プレート上で4日間にわたって約24℃に保ち、1mLあたり約5×106個の細胞まで成長させ、結果として生じた細胞を、室温で3分間、3000gでペレット化し、再懸濁して300μLのTAP培地中に5×107個の細胞を生成する。300μLの直径0.6mmのガラスビーズ、5μL中0.6μgのプラスミド、および100μLの20%のPEG MW8000を添加し、混合物を、最高速度で30秒間ボルテックスし、次いで、10mLのTAPに移し、暗所で振盪しながら16時間インキュベートする。細胞をペレット化し、200μLのTAP中に再懸濁し、次いで、5mg/Lのゼオシンを含むTAPプレート上で平板培養し、暗所で3週間インキュベートする。形質転換された群体を、新鮮なTAP+5mg/Lのゼオシンプレートに二次培養し、その後に、ゼオシン選択を伴う標準的な培地条件下で成長させる。遠心分離による収穫の後に、細胞ペレットを水で洗浄し、その後に、実施例1で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥する。35S:MGAT1プロモーターは、形質転換された藻細胞において構成的に発現する。細胞の含油量は、大幅に増加する。
M.マスクルスMGAT1を含むキメラベクターを使用して、ルピナス・アングスティフォリウス(マメ科の植物)を形質転換する。アグロバクテリウム中のキメラベクター35S:MGAT1および35S:DGAT1を使用して、Pigeaire他(1997)によって説明されるようにL.アングスティフォリウスを形質転換する。簡潔には、茎頂外植体をトランスジェニックアグロバクテリウムとともに共培養し、その後に、PPT溶液(2mg/mL)で完全に湿潤し、PPTを含まない再生培地上に移す。茎頂から発育した複数の腋芽を、20mg/LのPPTを含む培地上に摘出し、生存している芽を、20mg/LのPPTを含む新鮮な培地上に移す。次いで、健康な芽を土壌に移す。35Sプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。種子特異的プロモーターは、トランスジェニックルピナス種子の含油量をさらに増加させるために使用される。
M.マスクルスMGAT1を含むキメラベクターを使用して、安定的にソルガム・バイカラーを形質転換する。A.ツメファシエンス株AGL1中のUbi:MGAT1およびUbi:DGAT1を使用して、Gurel他(2009)によって説明されるように、ソルガム・バイカラーを形質転換する。最初に、アグロバクテリウムを、4℃で5分間、5,000rpmで遠心分離し、液体共培養培地でOD550=0.4に希釈する。次いで、事前に単離した未成熟胚を、15分間アグロバクテリウム懸濁液に完全に浸し、次いで、24℃で2日間、暗所の共培養培地上で、胚盤側を上にして培養する。次いで、未成熟胚を、100mg/Lカルベニシリンを伴うカルス誘導培地(CIM)に移してアグロバクテリウムの成長を阻害し、4週間そのままにする。次いで、組織を、再生培地に移して、発芽および発根させる。Ubiプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、少なくとも栄養組織における含油量が増加する。
M.マスクルスMGAT1をコードするキメラ遺伝子を使用して、グリシネ・マク(油の生成に使用され得る別のマメ科植物)を安定的に形質転換する。アグロバクテリウム中の35S:MGAT1を使用して、Zhang他(1999)によって説明されるように、G.マクを形質転換する。アグロバクテリウムを、5日目の苗木由来の子葉外植体とともに3日間共培養する。次いで、外植体を、1.67mg/LのBAPおよび5.0mg/Lのグルホシネートを補充したGamborgのB5培地上で4週間培養し、その後に、外植体を、MS主要塩および副次塩、ならびに1.0mg/Lのゼアチンリボシド、0.5mg/LのGA3、および1.7mg/Lまたは2.0mg/Lのグルホシネートで修正した0.1mg/LのIAAを補充したB5ビタミン(MS/B5)を含む培地に二次培養する。延びた芽を、さらなるグルホシネート選択を伴わずに、0.5mg/LのNAAを補充したMS/B5発根培地上で発根させる。35Sプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。
M.マスクルスMGAT1をコードするキメラ遺伝子を使用して、ゼア・マイスを安定的に形質転換する。35S:MGAT1および35S:DGAT1を構成するベクターを使用して、Gould他(1991)によって説明されるように、ゼア・マイスを形質転換する。簡潔には、茎頂外植体を2日間トランスジェニックアグロバクテリウムとともに共培養し、その後に、カナマイシンおよびカルベニシリンを含むMS塩培地上に移す。数回の継代培養の後に、形質転換された芽および根を自発的に形成させて、土壌に移植する。35Sプロモーターは、形質転換された植物の細胞において発現し、栄養組織および種子における含油量が増加する。
M.マスクルスMGAT1をコードするキメラ遺伝子を使用して、エラエイス・ギネエンシスを安定的に形質転換する。アグロバクテリウム中のUbi:MGAT1およびUbi:DGAT1と命名したキメラベクターを使用する。48時間の活発な培養に続いて、細胞を使用してIzawati他(2009)によって説明されるようにエラエイス・ギネエンシスを形質転換する。Ubiプロモーターは、形質転換された植物の細胞において構成的に発現し、少なくとも果実および種子における含油量が増加し、油を得るために使用してもよい。
M.マスクルスMGAT1をコードするキメラ遺伝子を使用して、Avena sativa(別の単子葉植物)を安定的に形質転換する。上で説明したように、どちらもUbi:BAR選択可能なマーカーを含むUbi:MGAT1およびUbi:DGAT1と命名したキメラベクターを使用して、Zhang(1999)によって説明されるように、Avena sativaを形質転換する。
変化したDGAT活性を伴うMGAT、特にDGAT活性の増加およびMGAT活性の潜在的増加を、関心のMGAT遺伝子に対してランダムな変異誘発、標的変異誘発、もしくは飽和変異誘発を行うことによって、または異なるMGATおよび/もしくはDGAT遺伝子をDNAシャフリングに供することによって操作してもよい。DGAT機能は、例えば、4つの遺伝子(DGA1、LRO1、ARE1、ARE2)における変異を含むH1246株等の遊離脂肪酸を供給したときのTAG合成の相補に対する絶対要件を有する酵母株を使用することによって、陽性的にスクリーニングすることができる。そのような株におけるMGAT変異形を形質転換し、次いで、野生型MGAT遺伝子によって相補を防止する遊離脂肪酸の濃度で、形質転換された酵母を供給することで、改善されたDGAT活性により増加したTAG合成能力を伴う変異形の成長だけを可能にする。これらの変異した遺伝子のMGAT活性は、標識したsn−1またはsn−2−MAGを供給し、標識したDAGの生成を定量することによって判定することができる。合理的なタンパク質設計と組み合わせた数回の指向性進化は、類似したMGATおよびDGAT活性を伴う新しいMGAT遺伝子の生成をもたらすであろう。
酵母(Weselake,2009)、および昆虫細胞(Lardizabal,2001)におけるA.サリアナDGAT2の発現は、DGAT活性を示さなかった。同様に、DGAT2は、A.サリアナDGAT1ノックアウト(Weselake他,2009)を相補することができなかった。葉組織におけるA.サリアナDGAT2の酵素活性は、実施例1において説明されるように、N.ベンサミアナ一過性発現系を使用して決定した。A.サリアナDGAT2(登録番号Q9ASU1)を、ゲノムPCRによって得て、35Sプロモーターの制御下で、バイナリー発現ベクターの中にクローン化して、35S:DGAT2を生成した。このキメラベクターを、A.ツメファシエンス株AGL1の中に導入し、これらの培養物由来の細胞を、対照として35S:DGAT1を使用して、24℃の成長室においてN.ベンサミアナ植物の葉組織に浸潤させた。いくつかの直接比較物に、比較する試料を浸潤させて、同じ葉の両側に置いた。実験は、3つ組で行った。浸潤の後、植物をさらに5日間成長させ、葉片を取り出し、その後に、実施例1で説明されるように、脂質クラス分画および定量化分析のために凍結乾燥した。この分析は、DGAT1およびDGAT2がどちらも、ニコチアナ・ベンサミアナにおける葉油レベルを増加させるように機能していることを明らかにした(表8)。
Yang他(2010)は、A.サリアナ由来の2つのグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT4およびGPAT6)がどちらも、G−3−Pからsn−2−MAGを生成することができる、sn−2選好(すなわち、sn−1/3−MAGよりも選好的にsn−2−MAGを形成する)およびホスファターゼ活性を有することを説明した(図1)。これらの酵素は、クチン合成経路の一部であることが提案された。GPAT4およびGPAT6は、種子組織において高度に発現しなかった。そのような二機能性GPAT/ホスファターゼをMGATと組み合わせることで、植物(特に油料種子)または他の細胞におけるDAG合成のための典型的なケネディ経路を置換または補充することができる基質としてG−3−Pを使用して、新しいDAG合成経路を生み出し、その結果、増加した含油量、特にTAGレベルをもたらす。
GPATファミリーは大きく、全ての既知のメンバーは、2つの保存されたドメイン、すなわち、plsCアシルトランスフェラーゼドメインおよびHAD様ヒドロラーゼスーパーファミリードメインを含む。これに加えて、A.サリアナGPAT4〜8は全て、ホスホセリンホスファターゼドメインに相同的なN末端領域を含む。A.サリアナGPAT4およびGPAT6はどちらも、ホスファターゼ活性に重要であることが知られている保存された残基を含む(Yang他,2010)。
35S−pORE04と指定されるベクターを、35Sプロモーターを含むPstI断片を、末端を平滑化するためのT4DNAポリメラーゼ処理の後、ベクターpORE04のSfoI部位へと挿入することにより作製した(Coutu et al., 2007)。A.thalianaジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼDGAT1をコードする遺伝的構築物35S:Arath−DGAT1(Bouvier-Nave et al., 2000)を作製した。WO2009/129582の実施例3において、pXZP163におけるAtDGAT1の構築が記載されている。KpnIおよびEcoRV末端を有するPCR増幅断片を、pXZP163から作製し、pENTR11へと挿入して、pXZP513Eを作製した。BamHI−EcoRV断片内に含有されているpXZP513EのAtDGAT1コード領域全体を、BamHI−EcoRV部位で、35S−pORE04へと挿入し、pJP2078を作製した。EcoRI制限酵素部位に隣接し、B.napusに対して最適化されたコドンの、A.thalianaWRI1転写因子をコードする合成断片、Arath−WRI1(Cernac and Benning, 2004)を合成した。35S:Arath−WRI1と指定される遺伝的構築物を、EcoRI部位に隣接しているArath−WRI1のコード領域全体を、EcoRI部位で35S−pORE04内へとクローニングすることにより作製し、pJP3414を作製した。N.benthamiana葉組織における遺伝子の発現は、実施例1に記述される一時的な発現系に従い、実施された。
表8 35S:p19、35S:DGAT1および35S:DGAT2構築物で一過性に形質転換された3つ組のNicotiana benthamianaの葉組織における、TAGの脂肪酸プロファイルおよび定量。
Mus musculusMGAT2(Cao et al., 2003; Yen and Farese, 2003)をコードし、およびB.napusに対しコドン最適化されたキメラDNAを、Geneartにより合成した。35S:Musmu−MGAT2と指定される遺伝的構築物を、EcoRI断片内含有される、1022341_MusmuMGAT2のコード領域全体を、pJP3343のEcoRI部位で挿入することにより作製し、pJP3347を作製した。35S:Arath−WRI1構築物のクローニングは、実施例11に記述されている。N.benthamiana葉組織における一過性の発現は、実施例1に記述されるように実施した。
A.thalianaジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼDGAT1、マウスモノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼMGAT2、およびA.thalianaWRI1をコードする遺伝子を、実施例1に記述される一過性の発現システムに従い、N.benthamiana葉組織中で、異なる組み合わせで発現させた。異なる構築物の詳細な記述については、実施例11および12において記述されている。
表13 35S:V2、35S:MGAT2および35S:WRI1で一過性に形質転換された3つ組のNicotiana benthamiana葉組織中のTAGレベル
表16 浸潤N.benthamiana葉試料のTAG含量
35S:GPAT4遺伝的構築物を、A.thalianaGPAT4遺伝子(Zheng et al., 2003)を発達中の長角果から単離されたトータルRNAからクローニングすることにより作製し、次いで、EcoRI断片としてpJP3343に挿入することにより、pJP3344を得た。他の構築物は、実施例11および12に記述されている。N.benthamiana葉組織における一過性の発現は、実施例1に記述されるように行った。
表17 35S:V2、35S:MGAT2、35S:DGAT1、35S:WRI1および35S:GPAT4で一過性に形質転換された3つ組のNicotiana benthamiana葉組織中のTAGレベル
表18 浸潤N.benthamiana葉試料のTAG含量
遺伝子の組み合わせ │TAG (乾重量%) 比率 │
├──────────────┼────────────┼───────────┤
V2+MGAT2+DGAT1 │1.54 ± 0.36 1.01 │
├──────────────┼────────────┤ │
V2+MGAT2+DGAT1+GPAT4 │1.56 ± 0.18 │ │
└──────────────┴────────────┴───────────┘
Nicotiana tabacumAGPase小サブユニット(DQ399915)(Kwak et al., 2007)をコードするmRNAのヌクレオチド595〜1187に対応するDNA断片を合成した。593bp 1118501_NtAGP断片を、最初に、NcoIで切断し、DNAポリメラーゼIラージ(Klenow)断片で処理し、5´平滑末端を作製し、最後に、XhoIで制限酵素消化した。同様に、pENTR11−NCOIエントリーベクターを、最初にBamHIで制限酵素消化し、DNAポリメラーゼIラージ(Klenow)断片で処理し、そしてXhoIで切断した。pENTR11−NCOIへの1118501_NtAGPインサートのライゲーションにより、pENTR11−NCOI−NtAGPエントリークローンが作製された。pENTR11−NCOI−NtAGPエントリークローンとpHELLSGATE12デスティネーションベクターの間のLR組換えにより、35Sプロモーターの制御下で、NtAGPase RNAiカセットを含むバイナリーベクターである、pTV35が作製された。他の構築物は、実施例11および12に記述される。N.benthamiana葉組織における一過性の発現は、実施例1に記述されるように実施された。
表19 35S:V2、35S:MGAT2、35S:DGAT1、35S:WRI1および35S:AGPase−hpRNAiで一過性に形質転換された3つ組のNicotiana benthamiana葉組織中のTAGレベル
表20 浸潤N.benthamiana葉試料のTAG含量
35Sプロモーターの制御下、S.indicum種子オレオシン(Scott et al., 2010)をコードする遺伝子を含むpRSh1バイナリーベクターが、N.Roberts博士(AgResearch Limited, New Zealand)から提供された。他の構築物は、実施例11および12に記述される。N.benthamiana葉組織における一過性発現は、実施例1に記述されるように実施した。
35Sプロモーター制御下の、N.benthamianaFAD2 RNAiカセットを、ベクターpFN033を作製するために、pHELLSGATE8デスティネーションベクターへのLR組換えにより得た。他の構築物は、実施例11および12に記述される。
表21 35S:V2、35S:MGAT2、35S:DGAT1、35S:WRI1および35S:オレオシンで一過性に形質転換された3つ組のNicotiana benthamiana葉組織中のTAGレベル
表26 35S:V2、35S:MGAT2、35S:DGAT1、35S:WRI1および35S:FAD2−hpRNAiで一過性に形質転換された3つ組のNicotiana benthamiana葉組織中のTAG脂肪酸プロファイル
N.benthamianaにおける構造的発現
M.musculusMGAT1およびMGAT2の酵素活性が、Nicotiana benthamianaにおいて、実証された。キメラベクターである、35S:Musmu−MGAT1および35S:Musmu−MGAT2を、標準的なエレクトロポレーション法を介して、A.tumefaciens株AGL1へと導入し、カナマイシン(50mg/L)およびリファンピシン(25mg/l)を補充した固形LB培地上で増殖させ、2日間、28度でインキュベートした。単一コロニーを用いて、新たな培養を開始した。十分な通気で48時間培養した後、細胞を2000xgの遠心により回収し、上清を除去した。細胞を新たな溶液(50%LBおよび50%MS培地を含有)中で、OD600=0.5の密度で再懸濁した。in vitroで、無菌で成長させたNicotiana benthamiana植物の葉試料を、切り取り、A.tumefaciens溶液に浸しながら、鋭利なメスで、約0.5〜1cm2のサイズの正方形断片に切断した。A.tumefaciensに浸された、傷ついたN.benthamiana葉の一片を、10分間、室温で静置させ、その後、無菌のろ紙上で、乾燥させてブロットし、補充を行うことなくMSプレート上にトランスファーした。24℃で2日間、共培養した後、外殖片を滅菌MS培地液で3回洗浄し、最後に、滅菌ろ紙で乾燥させてブロットし、選択寒天凝固MS培地(1.0mg/Lのベンシルアミノプリン(becylaminopurine、BAP)、0.25mg/Lのインドール酢酸(IAA)、50mg/Lのカナマイシン、および250mg/Lのセフォタキシムを補充)上に静置し、2週間、24℃でインキュベートし、形質転換されたN.benthamiana葉ディスクから、若枝を発達させた。in vitroでトランスジェニック植物を確立するために、健康な緑の若枝を切断し、新しい200mLの組織培養ポット(25μg/L IAAおよび50mg/Lカナマイシンおよび250mg/Lセフォタキシムを補充した寒天凝固MS培地を含有)へと移した。
M.musculusMGAT1およびMGAT2の酵素活性が、A.thalianaにおいて示された。キメラベクターである、35S:Musmu−MGAT1および35S:Musmu−MGAT2と共に、空ベクター対照pORE04を、フローラルディップ(floral dip)法により、A.thalianaに形質転換し、初代形質転換体由来の種子が、カナマイシン培地上で選択された。これらのT1植物由来のT2種子を採取し、各植物由来の種子のTFAを決定した(図15)。平均TFA mg/種子 gは、対照のpORE04株については、139±13(中央値は136.0)、35S:Musmu−MGAT1株については、152±14(中央値は155.1)、そして35S:Musmu−MGAT2については155±11(中央値は154.7)であった。このことより、対照と比較して、35S:Musmu−MGAT1は9.7%、35S:Musmu−MGAT2は12.1%、平均TFAが増加したことが示された。
油のさらなる増加
付加的な遺伝子を、上述の組み合わせと並行して検証し、さらなる油の増加が得られるかどうかを決定する。これらには、以下が含まれる:Arabidopsis genes:AT4G02280、スクロースシンターゼSUS3;AT2G36190、インベルターゼCWINV4;AT3G13790、インベルターゼCWINV1;AT1G61800、グルコース6リン酸:リン酸トランスロケーターGPT2;AT5G33320、ホスホエノールピルビン酸トランスポーターPPT1;AT4G15530、ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ プラスチド−PPDK;AT5G52920、ピルビン酸キナーゼpPK−β1。これらの酵素をコードする遺伝子を合成し、N.benthamianaにおける検証のために、EcoRI断片として、構造的バイナリー発現ベクターpJP3343へとクローニングする。
上述の組み合わせと並行して、異常な脂肪酸の増加が得られるかどうかを測定するために、追加の遺伝子を検証する。これらには、推定機能によりグループ化され、他種由来のホモログである、以下の遺伝子が含まれる(GenBankアクセッション番号を提供)。デルタ−12アセチレナーゼ(acetylenases)ABC00769、CAA76158、AAO38036、AAO38032;デルタ−12コンジュガーゼAAG42259、AAG42260、AAN87574;デルタ−12デサチュラーゼP46313、ABS18716、AAS57577、AAL61825、AAF04093、AAF04094;デルタ−12エポキシゲナーゼXP_001840127、CAA76156、AAR23815;デルタ−12ヒドロキシラーゼACF37070、AAC32755、ABQ01458、AAC49010;および、デルタ−12 P450酵素(たとえば、AF406732)。
NPTIIカナマイシン抵抗性遺伝子および3つの遺伝子発現カセットを発現させる、二重のエンハンサー領域35Sプロモーターを含んだ、既存のバイナリー発現ベクター、pORE04+11ABGBEC(米国仮特許出願第61/660392号)を、開始ベクターとして用いて、それぞれ、植物の安定的形質転換のための遺伝子の組み合わせを含有するいくつかの構築物を調製した。このベクターを、以下のように、発現遺伝子を油増加遺伝子と交換することにより、改変した。ベクターpRSh1−PSP1由来の、NotI部位に隣接するイントロン−中断ゴマオレオシン遺伝子を、pORE04+11ABGBEC NotI部位へと挿入することにより、pORE04+11ABGBECを最初に改変し、pJP3500を作製した。pJP3500を、次いで、A.thalianaWRL1遺伝子をコードするコドン最適化DNA断片を、EcoRI部位へと挿入することにより改変し、pJP3501を作製した。pJP3501をさらに、AsiSI部位に隣接する野生型A.thalianaDGAT1コード領域をコードするDNA断片を、AsiSI部位へと挿入することにより改変し、pJP3502を作製した(配列番号409)。StuI−ZraI断片として、M.musculusMGAT2をコードするコード領域を発現する、二重のエンハンサー領域35Sプロモーターからなる、他の発現カセットを、pJP3502のSfoI部位へと挿入することにより最後の改変が行われ、pJP3503が作製された(配列番号410)。MGAT2発現カセットは、StuI+ZraI部位で、pJP3347から切り出された。pJP3502およびpJP3503の両方が、以下に記述されるように、N.tabacumの安定的形質転換のために用いられた。これらの構築物により、pJP3502は、A.thalianaWRL1およびDGAT1コード領域を包含し、それらは各々、A.thaliana Rubisco小サブユニットプロモーター(SSU)および、二重のエンハンサー領域35Sプロモーターにより発現され、ならびに、SSU:ゴマオレオシンカセットにより発現された。この構築物のT−DNA領域を、図16に図示する。ベクターpJP3503はさらに、e35S::MGAT2カセットを包含した。この構築物を、図17に図示する。構築物pJP3503のT−DNA領域のヌクレオチド配列が、配列番号412に示される。
バイナリーベクターpJP3502およびpJP3503を、標準的なエレクトロポレーション法により、A.tumefaciens株AGL1へと、別々に導入した。形質転換細胞を選択し、カナマイシン(50mg/l)およびリファンピシン(25mg/l)を補充したLB寒天培地上で増殖させ、2日間、28℃でインキュベートした。各々の単一コロニーを用いて、LBブロス中で新たな培養を開始した。十分な通気で48時間インキュベートした後、細胞を、2000gの遠心で回収し、上清を除去した。細胞を、50%LBおよび50%MS培地からなる新たな培地中に、OD600=0.5で再懸濁した。
pJP3505との形質転換(4−遺伝子構築物)のために、花がつぼみを付ける前に、約1cm2の葉試料を、30の初代形質転換体から採取し、試料中のTAGレベルをIatroscanにより定量した。7つの植物を、さらなる分析のために選択し、そのうち5つが、葉油レベルの上昇を示し、2つが、本質的に野生型植物と同じ油レベルを示した。これらの植物由来の凍結乾燥葉試料を、総脂質含量およびTAG含量および脂肪酸組成に対して、TLCおよびGCにより分析した。4および29の番号を割り当てられた形質転換植物が、野生型と比較して葉油のレベルがかなり上昇していることが判明した一方で、21番の植物は、本質的に野生型のレベルと同じ、最も低いTAGレベルを示した(表30)。11番、15番および27番の植物は、葉油のレベルが中間であった。TAG中のオレイン酸のレベルは、TAG産生量と逆に相関していることが判明し、これは、N.benthamianaでの早期の一過性発現実験の結果と一致している。
表30 pJP3503で形質転換された選択初代タバコ植物の葉から単離されたTAGの、TAGパーセンテージ(葉乾重量の重量%)およびオレイン酸レベル(総脂肪酸の%)。
pJP3502の形質転換体に対して(3遺伝子構築物)MS寒天培地中のスクロースレベルを、十分なカルスが形成されるまで、標準レベルの半分まで減少させ、WRI1を発現する形質転換体の回収を補助した。41の初代形質転換体を、pJP3502形質転換体から得て、温室へと移した。異なる齢の葉試料を、開花段階または結実段階のいずれかで採取した(表36)。形質転換手順での同じカルスから由来し、ゆえに同じ形質転換イベント由来のものである可能性がある、3つの形質転換体を除き(それらは、やや小さく、pJP3503を有する植物4(上述)で観察されたものと似た、光沢のある葉の表現型を示したが、程度は小さい)、植物は、表現型的には正常であるように見える。
表36 pJP3502で形質転換された10の選択タバコ由来の緑の葉から単離されたTAGのTAGレベル(葉乾重量の重量%)および脂肪酸組成。
ススキの形質転換に対する遺伝的構築物が、ススキでより活性的なプロモーターで、pJP3502およびpJP3503のArath−SSUプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、ユビキチンプロモーター(Christensen et al., 1996)、またはススキにおけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーターが挙げられる。同様に、pJP3502およびpJP3503のCaMV−35Sプロモーターは、ススキでより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Wang et al.,2011に記述されるものと同様に、マイクロプロジェクタイル(microprojectile)介在法によりススキに形質転換される。
スイッチグラスの形質転換に対する遺伝的構築物が、スイッチグラスでより活性的なプロモーターで、pJP3502およびpJP3503のArath−SSUプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはスイッチグラスにおけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター(たとえば、Mann et al., 2011等)が挙げられる。同様に、pJP3502およびpJP3503のCaMV−35Sプロモーターが、スイッチグラスでより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Chen et al., 2010および、Ramamoorthy and Kumar, 2012に記述されるものと同様に、アグロバクテリウム介在法により、スイッチグラスに形質転換される。
サトウキビの形質転換に対する遺伝的構築物が、サトウキビでより活性的なプロモーターで、pJP3502およびpJP3503のArath−SSUプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはサトウキビにおけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター(たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ(maize)Ubiプロモーター等)が挙げられる。同様に、pJP3502およびpJP3503のCaMV−35Sプロモーターは、サトウキビでより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Bower et al.,1996に記述されるものと同様に、マイクロプロジェクタイル(microprojectile)介在法によりサトウキビに形質転換される。
Pennisetum purpureumの形質転換に対する遺伝的構築物が、チカラシバでより活性的なプロモーターで、pJP3502およびpJP3503のArath−SSUプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはPennisetum種(たとえば、P.glaucum等)におけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター(たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ(maize)Ubiプロモーター等)が挙げられる。同様に、pJP3502およびpJP3503のCaMV−35Sプロモーターが、Pennisetum種でより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物が、Girgi et al., 2002に記述されるものと同様に、マイクロプロジェクタイル(microprojectile)介在法によりP.purpureumに形質転換される。
Lolium perenneおよび他のライグラス種の形質転換に対する遺伝的構築物が、ライグラスでより活性的なプロモーターで、pJP3502およびpJP3503のArath−SSUプロモーターを交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、構造性ウイルスプロモーター、またはライグラス種におけるトランスジェニックの環境中で機能することが実証されているプロモーター(たとえば、Christensen et al., 1996に記述されるトウモロコシ(maize)Ubiプロモーター等)が挙げられる。同様に、pJP3502およびpJP3503のCaMV−35Sプロモーターが、Pennisetum種でより活性のあるプロモーターと交換される。新たな構築物は、Dalton et al.,2002に記述されるものと同様に、シリコン炭化カルシウム介在法により、または、Bettany et al., 2003に記述されるものと同様に、アグロバクテリウム介在法により、Lolium perenneに形質転換される。
Brassica napusの形質転換に対する遺伝的構築物が、pJP3502およびpJP3503のCaMV−35SおよびArath−SSUプロモーターを、カノーラでより活性的なプロモーターと交換することにより作製される。適切なプロモーターとしては、Brassica napusにおけるトランスジェニックな環境中で機能することが従前に実証されているプロモーターが挙げられる(たとえば、A.thalianaFAE1プロモーター、Brassica napusナピン(napin)プロモーター、Linum usitatissimumコンリニン(conlinin)1およびコンリニン2プロモーター等)。新たな構築物が、B.napusに、前述のように形質転換される。
遺伝的構築物が、配列番号415(大豆相乗的挿入;図19A)に示されるヌクレオチド配列を有する合成DNA断片から、PspOMI断片を、たとえばpORE04等のバイナリーベクターへ、NotI部位でクローニングすることにより作製される。この断片には、Arath−FAE1プロモーターで発現されるArath−WRI1、Linus−Cnl2プロモーターで発現されるArath−DGAT1、Linus−Cnl1で発現されるMusmu−MGAT2、およびLinus−Cnl1で発現されるArath−GPAT4が含まれる。さらなる遺伝的構築物が、GPATコード領域を、オレオシンコード領域で交換することにより作製される。さらなる遺伝的構築物が、MGAT発現カセットを削除することにより作製される。
タバコの形質転換に用いられたように、ベクターpJP3502およびpJP3503(上述を参照)を用いて、Lindsey & Gallois (1990)に記述されるように、アグロバクテリウム介在形質転換により、サトウダイコン(Beta vulgaris)の植物を形質転換する。上述で作製されたタバコ植物と同程度に、その植物は、その葉において、TAGのレベルが大きく増加している。トランスジェニックサトウダイコン植物は、枯れ始める直前または、成長工程の初期(すなわち、大根の糖含量が高レベルにあり、葉へのTAGの蓄積が為された後の間)の、葉がまだ緑色であるか、好ましくは緑色/黄色である間に、採取される。これにより、大根から糖を、葉から脂質の両方を産生させるために適切な、二重の目的のサトウダイコンの作製ができ、その脂質は、葉を破砕し、得られた物質を遠心して油分画を分離させることによりバイオディーゼル燃料へと直接的に転換され得、または、葉の物質の熱分解により炭化水素の直接的な産生が可能となる。
最初にAscI+NcoI制限酵素消化により1つのSSUプロモーターを切り出し、それをAscIおよびNcoIに隣接しているジャガイモB33プロモーターで置き換えることにより、pJP3502(上述の実施例で説明されている、中間バイナリー発現ベクター)を改変して、pJP3504を作製した。A.thalianaWRL1遺伝子と共に、pJP3504のSSUプロモーターを、PspOMI部位で、同じA.thalianaWRL1遺伝子断片(NotI−PspOMIに隣接している)を有するジャガイモB33プロモーターにより置き換え、pJP3506を作製した。上述の実施例に説明されるように、pJP3347をpJP3506に加え、pJP3507を作製した。この構築物を、図20に図示する。その配列は、配列番号413に示される。その構築物を用いて、塊茎の油含量を増加させるようにジャガイモ(Solanum tuberosum)を形質転換する。
GPAT−MGAT酵素融合物の酵素活性を検証し、これにより、GPAT誘導性MAGの、MGAT活性のための可触性が増加するかどうかを判定した。適切なリンカー領域を最初に合成して、クローニングベクターにクローニングした。このリンカーは、N末端(EcoRI−ZraI)およびC末端コード領域(NdeI−SmaIまたはNdeI−PstI)のクローニングのための適切な部位を含有していた。
atttaaatgcggccgcgaattcgtcgattgaggacgtccctactagacctgctggacctcctcctgctacttactacgattctctcgctgtgcatatggtcagtcatgcccgggcctgcaggcggccgcatttaaat (配列番号414)
3つの新規WRL1配列を、pJP334および他の適切なバイナリー構造性発現ベクターへとクローニングし、N.benthamianaにおいて検証する。これらには、Sorbi−WRL1(Sorghum bicolor由来;配列番号334), Lupan−WRL1(Lupinus angustifolius由来;配列番号335)および、Ricco−WRL1 (Ricinus communis由来;配列番号336)をコードする遺伝子が含まれる。これらの構築物を、N.benthamiana葉のアッセイにおいて、A.thalianaWRI1コード遺伝子との比較で検証する。
James et al. (2010)が、A.thalianaCGI−58ホモログのサイレンシングにより、葉において、10倍のTAG蓄積(主には、細胞質の脂質滴として)がもたらされることを報告している。また、ガラクト脂質も上昇することが判明した一方で、ほとんどの主要なリン脂質種のレベルは変化しないままであった。面白いことに、種子におけるTAGのレベルは影響を受けず、他のTAG分解変異体とは異なり、種子発芽におけるネガティブな影響は観察されなかった。
Sanjaya et al.,(2011)により、WRI過剰発現と組み合わせたAGPase小サブユニットのサイレンシングにより、デンプンレベルを減少させたまま、A.thalianaの種子中のTAG蓄積をさらに増加させることが実証されていた。AGPase小サブユニットが、花のつぼみからクローニングされている(Kwak et al.,2007)。推定アミノ酸配列は、A.thaliana AGPaseと87%の同一性を示した。593bpの断片を合成し、LRクローニング(Gateway)を介して、pHELLSGATE12へとクローニングし、バイナリーベクターpTV35を得た。N.tabacumの形質転換は、実施例1に記述されるように行い、43の初代形質転換体を得た。
さらなる遺伝的構築物を、上述の遺伝子の組み合わせ(特に、pJP3503およびpJP3502)における、少なくとも1つの遺伝子の発現を誘導する、誘導可能なプロモーター系を用いて作製する。改変構築物において、WRI1遺伝子は、たとえば、Aspergilus niger alcR遺伝子発現の存在下での、Aspergilus niger alcAプロモーター等の、誘導可能なプロモーターにより、発現される。あるいは、DGATは、誘導可能なプロモーターを用いて発現される。これは、最大のTAG蓄積が、成長中のすべての時点で望まれない場合に有益である。誘導可能なプロモーターシステムまたは、成長の中で制御されるプロモーターシステム(好ましくは、たとえばWRI1等の転写因子を誘導する)により、成長の間の適切な時点で、高いTAGの表現型を誘導することができ、引いては、高いレベルでTAGが蓄積される。
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Claims (145)
- 工業製品を製造する工程であって、以下のステップを含む、方法:
i)少なくとも約3%、好ましくは少なくとも約5%、または少なくとも約7%(w/w乾重量)の総非極性脂質含量を有する生育植物部分を得ること、
ii)前記生育植物部分の脂質の少なくとも一部を、熱、化学的手段もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを前記生育植物部分の脂質にin situで適用することにより、工業製品へと転換し、および、
iii)前記工業製品を回収すること、
それによって、前記工業製品を製造すること。 - 工業製品を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法:
i)少なくとも約3%、好ましくは少なくとも約5%、または少なくとも約7%(w/w乾重量)の総非極性脂質含量を有する生育植物部分を得ること、
ii)ステップi)の前記生育植物部分を物理的に処理すること、
iii)前記処理された生育植物部分の脂質の少なくとも一部を、熱、化学的手段もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを前記処理された生育植物部分の脂質に適用することにより、工業製品へと転換し、および、
iv)前記工業製品を回収すること、
それによって、前記工業製品を製造すること。 - 工業製品を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法:
i)1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、非ヒト生物またはその一部を得ることであって、ここで、前記1以上の各外因性ポリヌクレオチド(複数含む)は、非ヒト生物またはその一部で前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、および、ここで、前記非ヒト生物またはその一部は、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加していること、および、
ii)前記非ヒト生物またはその一部の前記脂質の少なくとも一部を、熱、化学的手段もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを、前記非ヒト生物またはその一部の脂質に、in situで適用することにより、工業製品へと転換し、および、
iii)前記工業製品を回収すること、
それによって、前記工業製品を製造すること。 - 工業製品を製造する方法であって、以下のステップを含む、方法:
i)1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、非ヒト生物またはその一部を得ることであって、ここで、前記1以上の各外因性ポリヌクレオチド(複数含む)は、ここで、前記非ヒト生物またはその一部は、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加していること、
ii)ステップi)の前記非ヒト生物またはその一部を物理的に処理すること、
iii)前記処理された非ヒト生物またはその一部の前記脂質の少なくとも一部を、熱、化学的手段もしくは酵素的手段、またはそれらの任意の組み合わせを、前記処理された非ヒト生物またはその一部の脂質に適用することにより、工業製品へと転換し、および、
iv)前記工業製品を回収すること、
それによって、前記工業製品を製造すること。 - 前記生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部を物理的に処理する前記ステップが、前記生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部を、回転、プレス、破砕または研削することのうち1つ以上を含む、請求項2または請求項4に記載の方法。
- 以下のステップをさらに含有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法:
(a)生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の非極性脂質含量の少なくとも一部を、非極性脂質として抽出すること、および、
(b)前記抽出された非極性脂質を回収することであって、
ここで、ステップ(a)および(b)は、前記生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部の前記脂質の少なくとも一部を前記工業製品へと転換するステップの前に実施されること。 - 前記抽出された非極性脂質が、トリアシルグリセロールを含み、ここで、前記トリアシルグリセロールは、前記抽出された脂質の少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%を構成する、請求項6に記載の方法。
- 前記工業製品が、たとえば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび/もしくは脂肪酸エチルエステル等の炭化水素製品、たとえばメタン、エタンもしくは長鎖アルカン等のアルカン、長鎖アルカンの混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素および/もしくは水素ガス、たとえばエタノール、プロパノールもしくはブタノール等のバイオアルコール、または、一酸化炭素、水素およびバイオ炭の組み合わせ、である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 抽出脂質の製造方法であって、以下のステップを含む方法:
i)それぞれ、1以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加している、非ヒト生物またはその一部を得ること、
ii)前記非ヒト生物またはその一部から脂質を抽出すること、および、
iii)前記抽出された脂質を回収すること、
それにより、前記抽出脂質を製造することであって、ここで、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部で前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、
ここで、以下の特長の1以上またはすべてが該当する:
(a)前記1以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部で、1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNA、または転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
(b)もし前記非ヒト生物が植物である場合、前記植物の生育部分は、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも約5%、好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量)の総非極性脂質含量を有している、
(c)前記非ヒト生物が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類からなる群から選択される藻類である、
(d)前記1以上の非極性脂質は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)またはそれらの2以上の組み合わせ、または前述の基、結合もしくは鎖の任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸を含む、
(e)前記非極性脂質(複数含む)の総脂肪酸含有量が、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の非極性脂質(複数含む)よりも、少なくとも2%多いオレイン酸および/または少なくとも2%少ないパルミチン酸を含む、
(f)前記非極性脂質(複数含む)が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の非極性脂質(複数含む)と比較して、改変レベルの総ステロール類(好ましくは遊離(非エステル化)ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド)を含む、
(g)前記非極性脂質(複数含む)が、ワックスおよび/またはワックスエステルを含む、
(h)前記非ヒト生物またはその一部は、それぞれ、脂質が抽出される、少なくとも約1000のそのような非ヒト生物もしくはその一部の、プールされた群またはコレクションの一員である。 - 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドが、前記第一の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、前記特長(b)〜(h)の1以上またはすべてが該当する、請求項9に記載の方法。
- (i)前記非ヒト生物が、植物、藻類または、たとえば菌類等の発酵に適した生物であるか、または、
(ii)前記非ヒト生物の一部は、種子、果実または植物の生育部分である、
請求項9または10に記載の方法。 - 前記部分が、植物の種子であり、前記抽出された脂質が種子油である、請求項11に記載の方法。
- 前記植物が以下からなる群から選択される種であるか、または、前記生育植物部分が以下からなる群から選択される種由来である、請求項9〜12のいずれか1項に記載の方法:
Acrocomia aculeata (macauba palm)、Arabidopsis thaliana(アラビドプシス・サリアナ)、Aracinis hypogaea(ピーナッツ)、Astrocaryum murumuru(murumuru)、Astrocaryum vulgare (tucuma)、Attalea geraensis (Indaia−rateiro)、Attalea humilis (American oil palm)、Attalea oleifera (andaia)、Attalea phalerata (uricuri)、Attalea speciosa (babassu)、Avena sativa(オーツ)、Beta vulgaris(サトウダイコン)、Brassica sp.(たとえばBrassica carinata、Brassica juncea、Brassica napobrassica、Brassica napus(カノーラ)、Camelina sativa (false flax)、Cannabis sativa (大麻)、Carthamus tinctorius(ベニバナ、サフラワー)、Caryocar brasiliense(pequi)、Cocos nucifera (ココナッツ)、Crambe abyssinica (Abyssinian kale)、Cucumis melo(メロン)、Elaeis guineensis (African palm)、Glycine max(大豆)、Gossypium hirsutum(綿)、Helianthus sp.たとえば、Helianthus annuus(ヒマワリ)、Hordeum vulgare(大麦)、Jatropha curcas (physic nut)、Joannesia princeps (arara nut−tree)、Lemna sp.(ウキクサ)(たとえばLemna aequinoctialis、Lemna disperma、Lemna ecuadoriensis、Lemna gibba(swollen duckweed)、Lemna japonica、Lemna minor、Lemna minuta、Lemna obscura、Lemna paucicostata、Lemna perpusilla、Lemna tenera、Lemna trisulca、Lemna turionifera、Lemna valdiviana、Lemna yungensis)、Licania rigida(オイチシカ)、Linum usitatissimum(亜麻)、Lupinus angustifolius (ルピナス)、Mauritia flexuosa(buriti palm)、Maximiliana maripa (inaja palm)、Miscanthus sp.(たとえばMiscanthus x giganteus および Miscanthus sinensis)、Nicotiana sp.(タバコ)(たとえば、Nicotiana tabacum または Nicotiana benthamiana)、Oenocarpus bacaba (bacaba−do−azeite)、Oenocarpus bataua (pataua)、Oenocarpus distichus (bacaba−de−leque),Oryza sp.(イネ)(たとえば、Oryza sativa および Oryza glaberrima)、Panicum virgatum (スイッチグラス)、Paraqueiba paraensis(mari)、Persea amencana(アボカド)、Pongamia pinnata (Indian beech)、Populus trichocarpa、Ricinus communis (castor)、Saccharum sp.(サトウキビ)、Sesamum indicum (ゴマ)、Solanum tuberosum (ジャガイモ)、Sorghum sp.(たとえば、Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、Theobroma grandiforum (cupuassu)、Trifolium sp.、Trithrinax brasiliensis (Brazilian needle palm)、Triticum sp.(小麦)(たとえば、Triticum aestivum)および、Zea mays(トウモロコシ)。 - 抽出されたカノーラ油を製造する工程であって、以下のステップを含む方法:
i)重量ベースで、少なくとも45%の種子油を含むカノーラ種子を得ること、
ii)前記カノーラ種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記カノーラ油を製造すること。 - 抽出されたトウモロコシ種子油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも5%の種子油を含むトウモロコシ種子を得ること、
ii)前記トウモロコシ種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記トウモロコシ種子油を製造すること。 - 抽出された大豆油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも20%の大豆油を含む大豆種子を得ること、
ii)前記大豆種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記大豆油を製造すること。 - 抽出されたルピナス種子油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも10%の種子油を含むルピナス種子を得ること、
ii)前記ルピナス種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記ルピナス種子油を製造すること。 - 抽出されたピーナツ油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも50%の種子油を含むピーナツを得ること、
ii)前記ピーナツから油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記ピーナツ油を製造すること。 - 抽出されたヒマワリ油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも50%の種子油を含むヒマワリ種子を得ること、
ii)前記ヒマワリ種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記ヒマワリ油を製造すること。 - 抽出された綿実油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも41%の種子油を含む綿実を得ること、
ii)前記綿実から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記綿実油を製造すること。 - 抽出されたサフラワー油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも35%の種子油を含むサフラワー種子を得ること、
ii)前記サフラワー種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記サフラワー油を製造すること。 - 抽出された亜麻仁油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも36%の種子油を含む亜麻仁を得ること、
ii)前記亜麻仁から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記亜麻仁油を製造すること。 - 抽出されたカメリナ油を製造する工程であって、以下のステップを含む工程:
i)重量ベースで、少なくとも36%の種子油を含むCamerina sativa種子を得ること、
ii)前記Camerina sativa種子から油を抽出すること、および、
iii)前記油を回収することであって、ここで、前記回収された油は、少なくとも90%(w/w)のトリアシルグリセロール(TAG)を含み、
それにより、前記カメリナ油を製造すること。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子を乾燥させる、回転させる、プレスする、破砕するまたは研削すること、および/または抽出された脂質または種子油を精製することのうち1つ以上を含む、請求項6〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む前記非ヒト生物が、油性菌類(たとえば、油性酵母等)である、請求項9〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記油を抽出するための抽出工程において、有機溶媒を用いる、請求項6〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抽出された脂質または油を、容器内にまとめることにより回収すること、および/または、前記抽出された脂質または油を、脱ガム、脱臭、脱色、乾燥、分画化することのうちの1つ以上、前記抽出された脂質または油から少なくとも一部のワックスおよび/またはワックスエステルを除去すること、または、前記抽出された脂質または油の脂肪酸組成を分析すること、を含む、請求項6〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抽出された脂質または油の体積が、少なくとも1リットルである、請求項6〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の特長のうち1つ以上またはすべてが該当する、請求項9〜28のいずれか1項に記載の方法:
(i)前記抽出された脂質または油がトリアシルグリセロールを含み、ここで、前記トリアシルグリセロールが、抽出された脂質または油の少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%または96%を構成する、
(ii)前記抽出された脂質または油は、遊離ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド、ワックスもしくはワックスエステル、またはそれらの任意の組み合わせを含む、および、
(iii)前記抽出された脂質または油中の前記総ステロール含量および/または組成は、対応する非ヒト生物もしくはその一部または種から製造された前記抽出された脂質または油中の前記ステロール含量および/または組成とは明らかに異なる。 - 前記方法が、前記抽出された脂質または油を、工業製品へと転換することをさらに含有する、請求項6〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工業製品が、たとえば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび/もしくは脂肪酸エチルエステル等の炭化水素製品、たとえばメタン、エタンもしくはより長い鎖のアルカン類等のアルカン、より長い鎖のアルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素、および/または、水素ガス、たとえばエタノール、プロパノール、もしくはブタノール等のバイオアルコール、バイオ炭(biochar)、または、一酸化炭素、水素およびバイオ炭の組み合わせ、である、請求項30に記載の方法。
- 前記生育植物部分または前記非ヒト生物の一部が、気生植物部分または、たとえば植物の茎もしくは葉等の緑色植物部分である、請求項1〜13または、24〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生育植物部分、非ヒト生物またはその一部を、好ましくは機械的な収穫機を用いて採集するステップを、または、たとえば培地のpHを調整すること等による、藻類もしくは菌類生物をろ過、遠心、沈殿、浮遊または凝集することを含む方法により採集するステップを、さらに含有する、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の特長のうち1以上またはすべてが該当する、請求項9〜13または24〜33のいずれか1項に記載の方法:
(i)前記生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の1以上の非極性脂質のレベルが、それぞれ、1以上の前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも0.5%大きい、
(ii)前記生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の1以上の非極性脂質のレベルが、それぞれ、1以上の前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも1%大きい、
(iii)前記生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の1以上の総非極性脂質が、それぞれ、1以上の前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも0.5%大きい、
(iv)前記生育植物部分または非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の1以上の総非極性脂質が、それぞれ、1以上の前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも1%大きい、
(v)前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の1以上の非極性脂質および/または総非極性脂質含量は、それぞれ、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有しておらず、そしてArabidopis thaliana DGAT1をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子よりも、重量ベースで、少なくとも0.5%大きい、および/または相対量ベースで少なくとも1%大きい、
(vi)前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質、および/または、それらから抽出された脂質中のTAG、DAG、TAGおよびDAG、またはMAG含量は、1以上の前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、または対応するそれらからの抽出脂質のそれぞれの中の脂質中のTAG、DAG、TAGおよびDAG、またはMAG含量よりも、相対量ベースで、少なくとも10%大きい、
(vii)前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の脂質中の総多価不飽和脂肪酸(PUFA)含量、またはそれらから抽出された脂質中のPUFA含量は、1以上の前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、または対応するそれらからの抽出脂質のそれぞれの中の脂質中の総PUFA含量と比較して、増加している、または減少している。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、および/または、それらから抽出された脂質中のPUFAのレベルは、それぞれ、対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または、対応するそれらから抽出された脂質と比較して、増加または減少しており、ここで、前記多価不飽和脂肪酸は、エイコサジエン酸、アラキドン酸(ARA)、αリノレン酸(ALA)、ステアリドン酸(SDA)、エイコサトリエン酸(ETE)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、またはそれらのうちの2つの組み合わせである、請求項9〜13、または請求項24〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対応する生育植物部分、非ヒト生物またはその一部が、それぞれ、非トランスジェニックの生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部である、請求項9または34に記載の方法。
- 以下の特長うち1つ以上、またはすべてが該当する、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法:
(i)オレイン酸は、前記生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の非極性脂質もしくは油の総脂肪酸含量の、少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)を構成する、
(ii)オレイン酸は、抽出された脂質または油中の総脂肪酸含量の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)を構成する、
(iii)前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の非極性脂質または油は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化またはヒドロキシル化分枝鎖)、またはそれらの2以上の組み合わせ、または、上述の基、結合、もしくは分枝鎖のうちの任意の2つ、3つ、4つ、5つ、または6つを含む、脂肪酸を含む、および、
(iv)前記抽出された脂質または油は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化またはヒドロキシル化分枝鎖)、またはそれらの2以上の組み合わせ、または、上述の基、結合、もしくは分枝鎖のうちの任意の2つ、3つ、4つ、5つ、または6つを含む、脂肪酸を含む。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、および/または、前記抽出された脂質もしくは油の脂質のレベルは、前記抽出された脂質または油から調製された脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いて分析することにより、決定することができる、請求項1〜37のいずれか1項に記載の工程。
- 前記方法が、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または植物由来の種子を採取することをさらに含む、請求項1〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、それぞれ、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、RNA、または、1以上の解糖系遺伝子もしくは脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを含み、そして、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、第一および第二の外因性ポリペプチドは、それぞれ、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに、各々が動作可能に連結されている、請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第一の外因性ポリヌクレオチドは、Wrinkled 1(WRI1)転写因子、Leafy Cotyledon 1(Lec1)転写因子、Leafy Cotyledon 2(LEC2)転写因子、Fus3転写因子、ABI3転写因子、Dof4転写因子、BABY BOOM(BBM)転写因子、またはDof11転写因子をコードする、請求項40に記載の方法。
- 第二の外因性ポリヌクレオチドは、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)活性および/もしくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)活性、または、グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)活性を有するポリペプチドをコードする、請求項40または41に記載の方法。
- 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下のうちの1つ以上または任意の組み合わせをコードする、第三の、またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチド(複数含む)、さらに含有する、請求項40〜42のいずれか1項に記載の方法:
i)非ヒト生物またはその一部の、1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、さらなるRNAまたは転写因子ポリペプチド、
ii)1以上の非極性脂質の生合成に関与する、さらなるRNAまたはポリペプチド、
iii)前記1以上の非極性脂質、好ましくはオレオシン(たとえば、ポリオレオシンまたはカレオシン)、より好ましくはポリオレオシンを安定化させるポリペプチド、
iv)たとえばAGPaseポリペプチド等のデンプン生合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子、
v)脂質の分解に関与し、および/または、脂質含量を減少させる、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼ等のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子、
vi)サイレンシングサプレッサーポリペプチドであって、
ここで、前記第三、またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチド(複数含む)は、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子で、それぞれ、ポリヌクレオチド(複数含む)の発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている、サイレンシングサプレッサーポリペプチド。 - 前記第三のポリヌクレオチドは、オレオシン(たとえばポリオレオシンまたはカレオシン)をコードする、請求項43に記載の方法。
- 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下をコードする1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法:
i)Wrinkled1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン、
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、ならびに、
xiv)任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
ここで、1以上の外因性ポリヌクレオチドの各々は、それぞれ、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中で、前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。 - (i)GPATはまた、MAGを産生するホスファターゼ活性を有し、たとえば、Arabidopsis GPAT4またはGPAT6のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、および/または、
(ii)DGATは、DGAT1またはDGAT2であり、および/または、
(iii)MGATは、MGAT1またはMGAT2である、
請求項42〜45のいずれか1項に記載の方法。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下を含む、請求項42〜45のいずれか1項に記載の方法:
i)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、
ii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、
iii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
iv)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
v)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
vi)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
vii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
viii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
ix)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第六の外因性ポリヌクレオチド。 - 以下の特長のうちの1以上が該当する、請求項47に記載の方法:
i)DGATおよびオレオシンをコードする外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、構造的なプロモーター、または、少なくとも開花期の前、および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態であるプロモーターに動作可能に連結されている、
ii)WRI1をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子は、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、構造的プロモーター、少なくとも開花期の前および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態であるプロモーター、または誘導プロモーターに、動作可能に連結されている、
iii)LEC2、BBMおよび/またはMGAT2をコードする外因性ポリヌクレオチドは、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる誘導プロモーターに動作可能に連結されている。 - 前記生育植物部分が、少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量)の総非極性脂質含量を含む、請求項1〜48のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生育植物部分が、少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、より好ましくは少なくとも約15%、またはより好ましくは少なくとも約17%(w/w乾重量)の総TAG含量を含む、請求項1〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分が、WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第四のポリヌクレオチドを含み、ここで、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下の特長のうちの1以上、またはすべてを有している、請求項1〜51のいずれか1項に記載の方法:
i)少なくとも8%、少なくとも10%、少なくとも12%、少なくとも14%、または少なくとも15.5%(乾重量または種子重量の重量%)の総脂質含量、
ii)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物の総脂質含量が、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍、高い、
iii)少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも6.5%、または少なくとも7%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、総TAG含量が、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
v)オレイン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも15%、少なくとも19%、または少なくとも22%(重量%)を構成する、
vi)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、または少なくとも17倍、高い、
vii)パルミチン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも33%(重量%)を構成する、
viii)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.5倍高い、
ix)リノール酸が、前記TAG中の脂肪酸の、少なくとも22%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも34%(重量%)を構成する、
x)αリノレン酸が、前記TAG中の脂肪酸の、20%未満、15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
xi)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分が、WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三のポリヌクレオチドを含み、ここで、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下の特長のうちの1以上、またはすべてを有している、請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法:
i)少なくとも10%、少なくとも12.5%、少なくとも15%、または少なくとも17%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
ii)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物の総TAG含量が、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
iii)オレイン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも19%、少なくとも22%、または少なくとも25%(重量%)を構成する、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分、または非ヒト生物のTAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも17倍、または少なくとも19倍、高い、
v)パルミチン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、または少なくとも28%(重量%)を構成する、
vi)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物のTAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.25倍高い、
vii)リノール酸が、前記TAG中の脂肪酸の、少なくとも15%、または少なくとも20%(重量%)を構成する、
viii)αリノレン酸が、前記TAG中の脂肪酸の、15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
ix)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物のTAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。 - WRI1をコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項41〜52のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号231〜278の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号279〜337の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、および、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - DGATをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項42〜53のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号204〜211、338〜346の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号83、212〜219、347〜355の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - MGATをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項42〜54のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号1〜44の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号45〜82の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - GPATをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項42〜54のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号84〜143の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号144〜203の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - DGAT2をコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項46〜56のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号204〜211の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号212〜219の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - オレオシンをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項44〜57のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号389〜408の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号362〜388の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - 前記CGi58ポリペプチドが以下の1以上を含む、請求項43〜58のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号422〜428の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号429〜436の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - LEC2をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが以下の1以上を含む、請求項41〜59のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号437〜439の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号442〜444の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - BBMをコードする前記外因性ポリヌクレオチドが以下の1以上を含む、請求項41〜60のいずれか1項に記載の方法:
i)配列番号440〜441の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号445〜446の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下の1以上を含む、請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法:
i)植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素をコードする遺伝子中に、1以上の導入変異、または、
ii)植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素の産生および/または活性を下方制御する外因性ポリヌクレオチド、
ここで、各内因性酵素は、たとえばDGAT、sn−1 グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(sn−1 GPAT)、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、アシル−CoA:リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、たとえば(ADP)−グルコースピロホスホリラーゼ(AGPase)等のデンプン生合成に関与する酵素、たとえばΔ12脂肪酸デサチュラーゼ(FAD2)等の脂肪酸デサチュラーゼ、脂質分解に関与するポリペプチドおよび/またはたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼ等の脂質含有量を減少させるポリペプチド、またはそれらの2以上の組み合わせ、からなる群から選択される。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒性ポリヌクレオチド、マイクロRNA、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二重鎖RNA分子または、それらから誘導されたプロセッシングされたRNA分子からなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記総非極性脂質、抽出された脂質または油が、以下を含む、請求項1〜63のいずれか1項に記載の方法:
(i)TAG、DAG、TAGおよびDAG、またはMAGである、非極性脂質、および、
(ii)EDA、ARA、SDA、ETA、EPA、DPA、DHAである特定のPUFA(前記特定のPUFAは、非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも1%のレベルである)、もしくは、特定のPUFAの2以上の組み合わせ、または、
(iii)非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも1%のレベルで存在し、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)もしくはそれらの2以上の組み合わせ、または、前述の基、結合、分枝鎖のうちの任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸。 - 生育部分を含む植物、またはその生育部分であり、前記生育部分が、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも約5%、より好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量)の総非極性脂質含有量を有し、ここで、前記非極性脂質は、少なくとも90%のトリアシルグリセロール(TAG)を含む、生育部分を含む植物、またはその生育部分。
- 重量ベースで油含量が少なくとも45%である、カノーラ種子を含むカノーラ植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも5%である、トウモロコシ種子を含むトウモロコシ植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも20%である、大豆種子を含む大豆植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも10%である、ルピナス種子を含むルピナス植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも50%である、ピーナツを含むピーナツ植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも50%である、ヒマワリ種子を含むヒマワリ植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも41%である、綿実を含む綿植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも35%である、サフラワー種子を含むサフラワー植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも36%である、亜麻仁を含む亜麻植物。
- 重量ベースで油含量が少なくとも36%である、Camelina sativa種子を含むCamelina sativa植物。
- 以下の特長のうちの1以上またはすべてを含む、請求項65〜75のいずれか1項に記載の植物、または、請求項65の生育植物部分:
(i)エステル化した形態、またはエステル化していない形態のオレイン酸である、前記植物の生育部分または種子中のオレイン酸であり、ここで、前記生育部分または種子の脂質含量中の総脂肪酸の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である。
(ii)非極性脂質でのエステル化した形態のオレイン酸である、前記植物の生育植物部分または種子中のオレイン酸であり、ここで、前記生育部分または種子の非極性脂質含量の総脂肪酸の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である。
(iii)エステル化した形態、またはエステル化していない形態、好ましくは前記生育部分または種子の非極性脂質のエステル化した形態の改変脂肪酸である、前記植物の生育部分または種子の改変脂肪酸であり、ここで、前記改変脂肪酸は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)、またはそれらの2以上の組み合わせ、または前述の基、結合、もしくは分枝鎖の任意の2、3、4、5または6つを含む、および、
(iv)前記植物の生育部分または種子の非極性脂質中のワックスおよび/またはワックスエステル。 - 請求項65〜76のいずれか1項に記載の植物、または、請求項65または請求項76に記載の生育植物部分であって、少なくとも約1000のそのような植物もしくは部分の群またはコレクションのメンバーである、植物または生育植物部分。
- 少なくとも約1000の植物の群であり、各植物は、野外で成長する、請求項65〜77のいずれか1項に記載の植物である、群。
- 少なくとも約1000の生育植物部分のコレクションであり、各コレクションは、請求項65、76または77のいずれか1項に記載の生育植物部分であり、前記生育植物部分は、野外で成長する植物から採取される、コレクション。
- 1以上の外因性ポリヌクレオチドを有し、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部と比較し、1以上の非極性脂質のレベルが増加している、非ヒト生物またはその一部であり、ここで、前記1以上の各外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、ここで、1以上またはすべての以下の特長が該当する:
(i)前記1以上の外因性ポリヌクレオチドが、非ヒト生物またはその一部の1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNAまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
(ii)もし非ヒト生物が植物である場合、前記植物の生育部分は、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも約5%、好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量)の総非極性脂質含有量を有している、
(iii)前記非ヒト生物が、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類(heterokont algae)からなる群から選択される藻類である、
(iv)前記非極性脂質(複数含む)が、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)またはそれらの2以上の組み合わせ、または、上述の基、結合もしくは分枝鎖の任意の2、3、4、5または6つを含む脂肪酸を含む、
(v)前記非ヒト生物またはその一部が、その脂質中で、エステル化形態またはエステル化していない形態で、オレイン酸を含んでおり、ここで、前記非ヒト生物またはその一部の脂質中の総脂肪酸の少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である、
(vi)前記非ヒト生物またはその一部が、その非極性脂質中で、エステル化形態で、オレイン酸を含んでおり、ここで、前記植物または生育植物部分の前記非極性脂質の総脂肪酸の、少なくとも20%(mol%)、少なくとも22%(mol%)、少なくとも30%(mol%)、少なくとも40%(mol%)、少なくとも50%(mol%)、または少なくとも60%(mol%)、好ましくは少なくとも65%(mol%)、または少なくとも66%(mol%)が、オレイン酸である、
(vii)前記非ヒト生物またはその一部の脂質中の総脂肪酸含量が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の脂質よりも、少なくとも2%多いオレイン酸、および/または、少なくとも2%少ないパルミチン酸、を含む、
(viii)前記非ヒト生物またはその一部の非極性脂質中の総脂肪酸含量が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部中の脂質よりも、少なくとも2%多いオレイン酸、および/または、少なくとも2%少ないパルミチン酸、を含む、
(ix)前記非極性脂質(複数含む)が、総ステロール、好ましくは遊離ステロール、ステロールエステルおよび/またはステロールグリコシド、の改変レベルを含む、
(x)前記非極性脂質(複数含む)が、ワックスおよび/またはワックスエステルを含む、および、
(xi)前記非ヒト生物またはその一部が、少なくとも約1000のそのような非ヒト生物もしくはその一部の、群またはコレクションの一員である。 - 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドが、第一の外因性ポリヌクレオチドおよび前記第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、前記特長(ii)〜(xi)のうちの1以上またはすべてが該当する、請求項80に記載の非ヒト生物またはその一部。
- 前記非ヒト生物が植物、藻類または、たとえば菌類等の、発酵に適した生物である、請求項80または81に記載の非ヒト生物またはその一部。
- 前記非ヒト生物の一部が、種子、果実、または、たとえば気生植物部分もしくは緑色部分(たとえば葉または茎)等の、植物の生育部分である、請求項80または81に記載の非ヒト生物またはその一部。
- 前記植物が、
Acrocomia aculeata (macauba palm)、Arabidopsis thaliana(アラビドプシス・サリアナ)、Aracinis hypogaea(ピーナッツ)、Astrocaryum murumuru(murumuru)、Astrocaryum vulgare (tucuma)、Attalea geraensis (Indaia−rateiro)、Attalea humilis (American oil palm)、Attalea oleifera (andaia)、Attalea phalerata (uricuri)、Attalea speciosa (babassu)、Avena sativa(オーツ)、Beta vulgaris(サトウダイコン)、Brassica sp.(たとえばBrassica carinata、Brassica juncea、Brassica napobrassica、Brassica napus(カノーラ)、Camelina sativa (false flax)、Cannabis sativa (大麻)、Carthamus tinctorius(ベニバナ、サフラワー)、Caryocar brasiliense(pequi)、Cocos nucifera (ココナッツ)、Crambe abyssinica (Abyssinian kale)、Cucumis melo(メロン)、Elaeis guineensis (African palm)、Glycine max(大豆)、Gossypium hirsutum(綿)、Helianthus sp.たとえば、Helianthus annuus(ヒマワリ)、Hordeum vulgare(大麦)、Jatropha curcas (physic nut)、Joannesia princeps (arara nut−tree)、Lemna sp.(ウキクサ)(たとえばLemna aequinoctialis、Lemna disperma、Lemna ecuadoriensis、Lemna gibba(swollen duckweed)、Lemna japonica、Lemna minor、Lemna minuta、Lemna obscura、Lemna paucicostata、Lemna perpusilla、Lemna tenera、Lemna trisulca、Lemna turionifera、Lemna valdiviana、Lemna yungensis)、Licania rigida(オイチシカ)、Linum usitatissimum(亜麻)、Lupinus angustifolius (ルピナス)、Mauritia flexuosa(buriti palm)、Maximiliana maripa (inaja palm)、Miscanthus sp.(たとえばMiscanthus x giganteus および Miscanthus sinensis)、Nicotiana sp.(タバコ)(たとえば、Nicotiana tabacum または Nicotiana benthamiana)、Oenocarpus bacaba (bacaba−do−azeite)、Oenocarpus bataua (pataua)、Oenocarpus distichus (bacaba−de−leque),Oryza sp.(イネ)(たとえば、Oryza sativa および Oryza glaberrima)、Panicum virgatum (スイッチグラス)、Paraqueiba paraensis(mari)、Persea amencana(アボカド)、Pongamia pinnata (Indian beech)、Populus trichocarpa、Ricinus communis (castor)、Saccharum sp.(サトウキビ)、Sesamum indicum (ゴマ)、Solanum tuberosum (ジャガイモ)、Sorghum sp.(たとえば、Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、Theobroma grandiforum (cupuassu)、Trifolium sp.、Trithrinax brasiliensis (Brazilian needle palm)、Triticum sp.(小麦)(たとえば、Triticum aestivum)および、Zea mays(トウモロコシ)、
である、請求項65〜77のいずれか1項に記載の植物、請求項65、76もしくは77に記載の生育植物部分、または、請求項80もしくは請求項81に記載の非ヒト生物またはその一部。 - 前記非ヒト生物が、菌類、好ましくは油性菌類(たとえば、油性酵母)である、請求項80もしくは81に記載の、非ヒト生物またはその一部。
- 前記非極性脂質の総ステロール含量および/または組成が、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部の非極性脂質の総ステロール含量および/または組成と、有意に異なる、請求項80〜85のいずれか1項に記載の非ヒト生物またはその一部。
- 1以上の非極性脂質の増加レベルが、以下の特長のうちの1以上またはすべてが該当するものである、請求項80〜86のいずれか1項に記載の非ヒト生物またはその一部:
(i)前記レベルは、対応する非ヒト生物またはその一部のレベルよりも、重量ベースで、少なくとも0.5%大きい、
(ii)前記レベルは、対応する非ヒト生物またはその一部のレベルよりも、相対ベースで、少なくとも1%大きい、
(iii)前記非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質は、対応する非ヒト生物またはその一部の含量よりも、それぞれ、重量ベースで、少なくとも0.5%大きい、
(iv)前記非ヒト生物またはその一部の総非極性脂質含量が、対応する非ヒト生物またはその一部の含量よりも、それぞれ、相対ベースで、少なくとも1%大きい、
(v)前記非ヒト生物もしくはその一部の、1以上の非極性脂質のレベルおよび/または、総非極性脂質の含量が、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有しておらず、および、Arabidopsis thalianaDGAT1をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む対応する非ヒト生物またはその一部よりも、それぞれ、重量ベースで少なくとも0.5%大きいか、および/または、相対ベースで少なくとも1%大きい。 - 以下を含む、請求項80〜87のいずれか1項に記載の非ヒト生物またはその一部:
(i)対応する非ヒト生物またはその一部のTAG、DAG、TAGおよびDAG、またはMAG含量よりも、相対ベースで、少なくとも10%大きい、TAG、DAG、TAGおよびDAG、またはMAG含量、および/または
(ii)対応する非ヒト生物またはその一部の総多価不飽和脂肪酸(PUFA)含量と比較して増加または減少している、総PUFA含量。 - 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する非ヒト生物またはその一部のPUFAのレベルと比較して増加したレベルのPUFAを含有している、請求項80〜88のいずれか1項に記載の非ヒト生物またはその一部であって、ここで、前記PUFAは、エイコサジエン酸、アラキドン酸(ARA)、αリノレン酸(ALA)、ステアリドン酸(SDA)、エイコサトリエン酸(ETE)、エイコサテトラエン酸(ETA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、ドコサペンタエン酸(DPA)、ドコサヘキサエン酸(DHA)、またはそれらの2以上の組み合わせである。
- 前記植物もしくはその生育植物部分の、総非極性脂質含量、または、1以上の非極性脂質、および/または、オレイン酸もしくはPUFAのレベルが、前記植物またはその生育部分から得られた脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いて分析することにより決定可能である、請求項65〜77、80〜84もしくは86〜89のいずれか1項に記載の植物、または請求項65、76、77、80〜83のいずれか1項に記載の生育部分。
- 前記非ヒト生物もしくはその一部の、総非極性脂質含量、または、1以上の非極性脂質、および/または、オレイン酸もしくはPUFAのレベルが、前記非ヒト生物またはその一部から得られた脂肪酸メチルエステルのガスクロマトグラフィーを用いて分析することにより決定可能である、請求項80〜89のいずれか1項に記載の非ヒト生物またはその一部。
- 植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子の、それぞれ1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNAまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、ここで、各外因性ポリヌクレオチドは、植物、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子の、それぞれ前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている、請求項65〜91のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- 前記第一の外因性ポリヌクレオチドは、Wrinkled 1(WRI1)転写因子、Leafy Cotyledon 1(Lec1)転写因子、Leafy Cotyledon 2(LEC2)転写因子、Fus3転写因子、ABI3転写因子、Dof4転写因子、BABY BOOM(BBM)転写因子、またはDof11転写因子をコードする、請求項92に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- 前記第二の外因性ポリヌクレオチドは、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)活性および/もしくはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)活性、または、グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)活性を有するポリペプチドをコードする、請求項92または請求項93に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- 前記植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下のうちの1つ以上または任意の組み合わせをコードする、第三の、またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチド(複数含む)、さらに含有する、請求項92〜94のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)非ヒト生物またはその一部の、1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させる、さらなるRNAまたは転写因子ポリペプチド、
ii)1以上の非極性脂質の生合成に関与する、さらなるRNAまたはポリペプチド、
iii)前記1以上の非極性脂質、好ましくはオレオシン(たとえば、ポリオレオシンまたはカレオシン)、より好ましくはポリオレオシンを安定化させるポリペプチド、
iv)たとえばAGPaseポリペプチド等のデンプン生合成に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子、
v)脂質の分解に関与する、および/または、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼ等の脂質含量を減少させる、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子、
vi)サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
ここで、前記第三、またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチド(複数含む)は、生育植物部分、または非ヒト生物もしくはその一部、または種子で、それぞれ、ポリヌクレオチド(複数含む)の発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。 - 前記第三のポリヌクレオチドは、オレオシン(たとえばポリオレオシンまたはカレオシン)をコードする、請求項95に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- 前記植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子は、以下をコードする1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項65〜96のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)Wrinkled1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン、
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、ならびに、
xiv)任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
ここで、1以上の外因性ポリヌクレオチドの各々は、それぞれ、植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中で、前記ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。 - (i)GPATはまた、MAGを産生するホスファターゼ活性を有し、たとえば、Arabidopsis GPAT4またはGPAT6のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、および/または、
(ii)DGATは、DGAT1またはDGAT2であり、および/または、
(iii)MGATは、MGAT1またはMGAT2である、
請求項97の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下を含む、請求項94〜98のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、
ii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、
iii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
iv)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
v)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
vi)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、および、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
vii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
viii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、および、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
ix)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第六の外因性ポリヌクレオチド。 - 以下の特長のうちの1以上が該当する、請求項99に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)DGATおよびオレオシンをコードする外因性ポリヌクレオチドは、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、構造的なプロモーター、または、少なくとも開花期の前、および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態であるプロモーターに動作可能に連結されている、
ii)WRI1をコードする外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子は、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる、構造的プロモーター、少なくとも開花期の前および開花期まで、植物の緑色組織中で活性状態であるプロモーター、または誘導プロモーターに、動作可能に連結されている、
iii)LEC2、BBMおよび/またはMGAT2をコードする外因性ポリヌクレオチドは、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができる誘導プロモーターに動作可能に連結されている。 - 前記生育植物部分が、少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w乾重量または種子重量)の総非極性脂質含量を含む、請求項65〜100のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- 前記生育植物部分が、少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、より好ましくは少なくとも約15%、またはより好ましくは少なくとも約17%(w/w乾重量または種子重量)の総TAG含量を含む、請求項65〜101のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第三のポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第四のポリヌクレオチドを含み、ここで、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下の特長のうちの1以上、またはすべてを有している、請求項65〜102のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)少なくとも8%、少なくとも10%、少なくとも12%、少なくとも14%、または少なくとも15.5%(重量%)の総脂質含量、
ii)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物の総脂質含量が、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、または少なくとも10倍、高い、
iii)少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも6.5%、または少なくとも7%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、総TAG含量が、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
v)オレイン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも15%、少なくとも19%、または少なくとも22%(乾重量または種子重量の重量%)を構成する、
vi)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、または少なくとも17倍、高い、
vii)パルミチン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも33%(重量%)を構成する、
viii)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.5倍高い、
ix)リノール酸が、前記TAG中の脂肪酸の、少なくとも22%、少なくとも25%、少なくとも30%、または少なくとも34%(重量%)を構成する、
x)αリノレン酸が、前記TAG中の脂肪酸の、20%未満、15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
xi)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、TAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。 - 前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子、好ましくは生育植物部分が、WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、DGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、オレオシンをコードする第三のポリヌクレオチドを含み、ここで、前記生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、以下の特長のうちの1以上、またはすべてを有している、請求項65〜102のいずれか1項に記載の方法:
i)少なくとも10%、少なくとも12.5%、少なくとも15%、または少なくとも17%(乾重量または種子重量の重量%)の総TAG含量、
ii)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物の総TAG含量が、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも100倍、高い、
iii)オレイン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも19%、少なくとも22%、または少なくとも25%(重量%)を構成する、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分、または非ヒト生物のTAG中のオレイン酸のレベルが、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも17倍、または少なくとも19倍、高い、
v)パルミチン酸が、前記TAG中の脂肪酸の少なくとも20%、少なくとも25%、または少なくとも28%(重量%)を構成する、
vi)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物のTAG中のパルミチン酸のレベルが、少なくとも1.25倍高い、
vii)リノール酸が、前記TAG中の脂肪酸の、少なくとも15%、または少なくとも20%(重量%)を構成する、
viii)αリノレン酸が、前記TAG中の脂肪酸の、15%未満、11%未満、または8%未満(重量%)を構成する、および、
ix)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する生育植物部分、または非ヒト生物と比較して、前記生育植物部分または非ヒト生物のTAG中のαリノレン酸のレベルが、少なくとも5倍、または少なくとも8倍、低い。 - WRI1をコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項93〜104のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)配列番号231〜278の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号279〜337の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、および、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - DGATをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項94〜105のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)配列番号204〜211、338〜346の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号83、212〜219、347〜355の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - MGATをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項94〜106のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)配列番号1〜44の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号45〜82の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - GPATをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項94〜107のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)配列番号84〜143の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号144〜203の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - DGAT2をコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項94〜108のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)配列番号204〜211の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号212〜219の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - オレオシンをコードする前記外因性ポリペプチドが、以下の1以上を含む、請求項95〜109のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)配列番号389〜408の内の任意の1つとして明記される配列を有するヌクレオチド、
ii)配列番号362〜388の内の任意の1つとして明記される配列を有するアミノ酸、またはその生物学的に活性な断片を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド、
iii)i)またはii)と少なくとも30%同一である、配列を有するヌクレオチド、
iv)ストリンジェントな条件下で、i)〜iii)の内の任意の1つとハイブリダイズするヌクレオチド。 - 以下を含む、請求項65〜110のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子:
i)植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素をコードする遺伝子中に、1以上の導入変異、および/または、
ii)植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のそれぞれの内因性酵素の産生および/または活性を下方制御する外因性ポリヌクレオチド、
であり、ここで、各内因性酵素は、DGAT、sn−1グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(sn−1 GPAT)、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、アシル−CoA:リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)、たとえば(ADP)−グルコースピロホスホリラーゼ(AGPase)等のデンプン生合成に関与する酵素、たとえばΔ12脂肪酸デサチュラーゼ(FAD2)等の脂肪酸デサチュラーゼ、脂質分解に関与するポリペプチドおよび/または脂質含有量を減少させるポリペプチド(たとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼ等)、またはそれらの2以上の組み合わせ、からなる群から選択される。 - 前記外因性ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒性ポリヌクレオチド、マイクロRNA、内因性酵素に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二重鎖RNA分子および、それらから誘導されたプロセッシングされたRNA分子からなる群から選択される、請求項111に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。
- 前記総非極性脂質が、
(i)TAG、DAG、TAGおよびDAG、またはMAGを含む、および、
(ii)EDA、ARA、SDA、ETA、EPA、DPA、またはDHAである特定のPUFA(前記特定のPUFAは、非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも1%のレベルである)、もしくは、それらの2以上の組み合わせを含む、または、
(iii)非極性脂質中の総脂肪酸含有量の少なくとも1%のレベルで存在し、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえば、メチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)もしくはそれらの2以上の組み合わせ、または、前述の基、結合、分枝鎖のうちの任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸を含む、
請求項65〜112のいずれか1項に記載の植物、生育植物部分、非ヒト生物もしくはその一部、または種子。 - 請求項65〜113のいずれか1項に記載の植物または非ヒト生物から得た種子。
- 請求項92〜110のいずれか1項で定義される1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む請求項114に記載の種子。
- 1以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加している、組み換え細胞であって、
ここで、前記1以上の各外因性ポリヌクレオチドは、細胞中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、および、ここで、以下の特長のうちの1以上またはすべてが該当する、組み換え細胞:
(a)前記1以上の外因性ポリヌクレオチドは、非ヒト生物またはその一部で、1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNA、または転写因子ポリペプチドをコードする第一の外因性ポリヌクレオチド、および、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二の外因性ポリヌクレオチドを含む、
(b)もし前記細胞が植物の生育部分の細胞である場合、前記細胞は、少なくとも約3%、より好ましくは少なくとも約5%、好ましくは少なくとも約7%、より好ましくは少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約11%、より好ましくは少なくとも約12%、より好ましくは少なくとも約13%、より好ましくは少なくとも約14%、またはより好ましくは少なくとも約15%(w/w)の総非極性脂質含量を有している、
(c)前記細胞は、珪藻植物(bacillariophytes)、緑藻類(chlorophytes)、青緑藻類(cyanophytes)、金茶藻類(chrysophytes)、ハプト藻、茶藻類および黄色藻類からなる群から選択される藻類である、
(d)前記1以上の非極性脂質は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)またはそれらの2以上の組み合わせ、または前述の基、結合もしくは鎖の任意の2、3、4、5もしくは6つを含む脂肪酸を含む、
(e)前記非極性脂質(複数含む)の総脂肪酸含有量が、対応する前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない細胞中の非極性脂質(複数含む)よりも、少なくとも2%多いオレイン酸および/または少なくとも2%少ないパルミチン酸を含む、
(f)前記非極性脂質(複数含む)が、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞中の非極性脂質(複数含む)と比較して、改変レベルの総ステロール類(好ましくは遊離(非エステル化)ステロール、ステロールエステル、ステロールグリコシド)を含む、
(g)前記非極性脂質(複数含む)が、ワックスおよび/またはワックスエステルを含む、
(h)前記細胞は、少なくとも約1000のそのような細胞の、群またはコレクションの一員である。 - 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドが、第一の外因性ポリヌクレオチドおよび第二の外因性ポリヌクレオチドを含み、および、ここで、前記特長の(b)〜(h)のうちの1以上またはすべてが該当する、請求項116に記載の細胞。
- 請求項82〜110のいずれか1項に定義される1以上の特長を含む、請求項116または117に記載の細胞。
- 1以上の非極性脂質を産生する能力が増強された細胞を得る工程であって、以下のステップを含む、工程:
i)細胞に1以上の外因性ポリヌクレオチドを導入すること、
ii)細胞またはその子孫細胞中で、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させること、
iii)前記細胞または子孫細胞の脂質含量を分析すること、
iv)前記外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞または子孫細胞と比較して、1以上の非極性脂質のレベルが増加している細胞または子孫細胞を選択すること、
ここで、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドは、
i)Wrinkled1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン、
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
x)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、ならびに、
xiv)任意選択的に、サイレンシングサプレッサーポリペプチド、
をコードし、
ここで、各外因性ポリヌクレオチドは、前記細胞または子孫細胞中で前記外因性ポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている。 - 前記選択された細胞または子孫細胞は、以下を含む、請求項119に記載の方法:
i)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、
ii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、
iii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
iv)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびLEC2またはBBMをコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
v)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびLEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
vi)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、
vii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、およびLEC2またはBBMをコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、
viii)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、または、
ix)WRI1をコードする第一の外因性ポリヌクレオチドおよびDGAT、好ましくはDGAT1をコードする第二の外因性ポリヌクレオチド、およびオレオシンをコードする第三の外因性ポリヌクレオチド、およびたとえばCGi58ポリペプチド等のリパーゼをコードする遺伝子の発現を阻害するRNA分子をコードする第四の外因性ポリヌクレオチド、MGAT、好ましくはMGAT2をコードする第五の外因性ポリヌクレオチド、および、LEC2またはBBMをコードする第六の外因性ポリヌクレオチド。 - 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドが、前記細胞または子孫細胞のゲノム内に、安定的に組み込まれている、請求項119または120に記載の方法。
- 前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む前記細胞または子孫細胞から、トランスジェニック植物を再生させるステップをさらに含有する、請求項121に記載の方法。
- トランスジェニック植物を再生させる前記ステップは、前記細胞またはその子孫細胞で前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを発現させるステップの前に実施される、および/または、前記細胞または子孫細胞の脂質含量を分析するステップの前に実施される、および/または、1以上の非極性脂質のレベルが増加している前記細胞または子孫細胞を選択するステップの前に行われる、請求項122に記載の方法。
- 前記トランスジェニック植物から種子または子孫植物を得るステップをさらに含み、ここで、前記種子または子孫植物は、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項122または123に記載の方法。
- 前記選択された細胞もしくはそれから再生された植物、または、前記再生された植物の生育植物部分もしくは種子が、請求項65〜113のいずれか1項に定義される特長の1以上を有する、請求項119〜124のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項119〜125のいずれか1項に記載の方法を用いて得られたトランスジェニック細胞もしくはトランスジェニック植物、または、それから得られた、前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、生育植物部分もしくは種子。
- 以下i)〜xiv)をコードする1以上のポリヌクレオチド、または以下i)〜xiv)をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝的構築物の、
前記1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、1以上の非極性脂質を産生する能力が増強されている、トランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子を産生するための、使用であって、
ここで、前記1以上の各ポリヌクレオチドは、前記細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、および、それぞれ、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている、使用:
i)Wrinkled 1(WRI1)転写因子およびDGAT、
ii)WRI1転写因子およびDGATおよびオレオシン
iii)WRI1転写因子、DGAT、MGATおよびオレオシン、
iv)モノアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ(MGAT)、
v)ジアシルグリセロール アシルトランスフェラーゼ2(DGAT2)、
vi)MGATおよびグリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、
vii)MGATおよびDGAT、
viii)MGAT、GPATおよびDGAT、
ix)WRI1転写因子およびMGAT、
x)WRI1転写因子、DGATおよびMGAT、
xi)WRI1転写因子、DGAT、MGAT、オレオシンおよびGPAT、
xii)DGATおよびオレオシン、または、
xiii)MGATおよびオレオシン、および、
xiv)任意選択的に、サイレンシング サプレッサー ポリペプチド。 - 細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中の、1以上の解糖系遺伝子または脂肪酸生合成遺伝子の発現を増加させるRNAまたは転写因子ポリペプチドをコードする第一のポリヌクレオチドの、1以上の非極性脂質の生合成に関与するRNAまたはポリペプチドをコードする第二のポリヌクレオチドとの、第一および第二のポリヌクレオチドを有していない対応する細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、1以上の非極性脂質を産生する能力が増強されているトランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子を産生するための使用であって、ここで、前記第一および第二のポリヌクレオチドは各々、前記細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、および、各々が、それぞれ、前記トランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されている、使用。
- 1以上のポリヌクレオチドの、1以上の外因性ポリヌクレオチドを有していない対応する細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子と比較して、1以上の非極性脂質を産生する能力が増強されているトランスジェニック細胞、トランスジェニック非ヒト生物もしくはその一部、またはトランスジェニック種子を産生するための使用であって、ここで、1以上の各ポリヌクレオチドは、前記細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子に対して外因性であり、および、それぞれ、細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子中のポリヌクレオチドの発現を指示することができるプロモーターに動作可能に連結されており、および、ここで、前記非極性脂質(複数含む)は、ヒドロキシル基、エポキシ基、シクロプロパン基、二重炭素−炭素結合、三重炭素−炭素結合、共役二重結合、分枝鎖(たとえばメチル化分枝鎖またはヒドロキシル化分枝鎖)、またはそれらの2以上の組み合わせ、または前述の基、結合もしくは分枝鎖の任意の2、3、4、5または6つを含む脂肪酸を含む、使用。
- 前記トランスジェニック細胞、非ヒト生物もしくはその一部、または種子が、請求項65〜113に定義される特長の1以上を含む、請求項127〜129のいずれか1項に記載の使用。
- 種子を産生させる工程であって、
i)請求項62〜82、84、86〜113のいずれか1項に記載の前記植物(複数含む)、または非ヒト生物を成長させること、および、
ii)前記植物(複数含む)または非ヒト生物から種子を採取すること、
を含む、工程。 - 少なくとも約1000の植物(各植物は、請求項65〜82、84、86〜113のいずれか1項に記載の植物である)の群を成長させること、および、前記植物の群から種子を採取することを含む、請求項131に記載の方法。
- 以下のステップを含む、発酵工程:
i)発酵に適している請求項80、81、85〜89または91〜113のいずれか1項に記載の非ヒト生物、ならびに発酵および脂肪酸生合成に必要な構成要素を含む液体組成物を含む容器を提供すること、および、
ii)前記管中に包含されている前記液体組成物の発酵をもたらす条件を提供すること。 - 請求項6〜64のいずれか1項に記載の方法により得ることができる、または、請求項65もしくは請求項76もしくは請求項77に記載の生育植物部分から得ることができる、回収された脂質もしくは抽出された脂質、請求項80〜89もしくは請求項91〜113のいずれか1項に記載の非ヒト生物またはその一部、請求項116〜118のいずれか1項に記載の細胞、請求項119〜125のいずれか1項に記載の方法により産生された細胞または子孫細胞またはトランスジェニック植物、または、請求項114もしくは請求項115に記載の種子。
- 請求項1〜8または請求項30〜64のいずれか1項に記載の方法により製造された工業製品であって、それらは炭化水素製品(たとえば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび/または脂肪酸エチルエステル、アルカン(たとえばメタン、エタンまたは長鎖アルカン)、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素および/または水素ガス、バイオアルコール(たとえば、エタノール、プロパノールまたはブタノール)、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等)である、工業製品。
- 工業製品の製造のための、65〜78、80〜84、86〜113のいずれか1項に記載の植物の使用、請求項65または請求項76または請求項77に記載の生育植物部分の使用、請求項80〜113のいずれか1項に記載の非ヒト生物もしくはその一部の使用、請求項116〜118のいずれか1項に記載の細胞の使用、請求項119〜125のいずれか1項に記載の方法により産生された細胞、子孫細胞もしくはトランスジェニック細胞の使用、請求項114または請求項115に記載の種子の使用、または、請求項134に記載の回収された脂質もしくは抽出された脂質の使用。
- 前記工業製品が、炭化水素製品(たとえば脂肪酸エステル、好ましくは脂肪酸メチルエステルおよび/または脂肪酸エチルエステル、アルカン(たとえばメタン、エタンまたは長鎖アルカン)、長鎖アルカン類の混合物、アルケン、バイオ燃料、一酸化炭素および/または水素ガス、バイオアルコール(たとえば、エタノール、プロパノールまたはブタノール)、バイオ炭、または一酸化炭素、水素およびバイオ炭の混合物等)である、請求項136に記載の使用。
- i)任意選択的に触媒の存在下で、請求項134に記載の脂質とアルコールを反応させ、アルキルエステルを産生すること、および、
ii)任意選択的にアルキルエステルと石油ベースの燃料とを混合させること、
を含む、燃料を製造する工程。 - 前記アルキルエステルは、メチルエステルである、請求項138に記載の方法。
- i)請求項65または請求項76または請求項77に記載の生育植物部分の脂質、または請求項80〜116のいずれか1項に記載の非ヒト生物もしくはその一部の脂質を、ガス化により合成ガスへと転換すること、および、
ii)前記合成ガスを、金属触媒または微生物触媒を用いて、バイオ燃料へと転換すること、
を含む、合成ディーゼル燃料を製造する工程。 - 請求項65または請求項76または請求項77に記載の生育植物部分の脂質、または請求項80〜113のいずれか1項に記載の非ヒト生物もしくはその一部の脂質を、熱分解によりバイオ−油へと転換すること、発酵によりバイオアルコールへと転換すること、またはガス化もしくは嫌気性消化によりバイオガスへと転換することを含む、バイオ燃料を製造する工程。
- 請求項65〜77、80〜84、86〜113のいずれか1項に記載の植物、請求項65または請求項76または請求項77に記載の生育植物部分、請求項80〜113のいずれか1項に記載の非ヒト生物もしくはその一部、請求項116〜118のいずれか1項に記載の細胞、請求項119〜125のいずれか1項に記載の方法により産生された細胞もしくは子孫細胞もしくはトランスジェニック植物、または、請求項114もしくは請求項115に記載の種子、または、請求項134に記載の採取された脂質もしくは抽出された脂質、または、それらからの抽出物もしくはそれらの一部と、少なくとも1つの他の食物成分とを混合することを含む、飼料を製造する工程。
- 請求項65〜77、80〜84、86〜113のいずれか1項に記載の植物、請求項65または請求項76または請求項77に記載の生育植物部分、請求項80〜113のいずれか1項に記載の非ヒト生物もしくはその一部、請求項116〜118のいずれか1項に記載の細胞、請求項119〜125のいずれか1項に記載の方法により産生された細胞もしくは子孫細胞もしくはトランスジェニック植物、または、請求項114もしくは請求項115に記載の種子、または、請求項134に記載の採取された脂質もしくは抽出された脂質、または、それらからの抽出物もしくはそれらの一部を含む、飼料、化粧品または化学薬品。
- i)生育組織の光沢を計測すること、
ii)前もって計測された最小光沢度レベルと、前記測定結果を比較すること、および、
iii)任意選択的に、植物を採取すること
を含む、収穫期の植物の生育組織中の脂質量を最大化するための、植物を採取する時期を決定する方法。 - 生育組織の光沢を測定することを含む、植物の生育組織中の脂質の量を予測する方法。
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