MX2014007964A - Procesos para producir lipidos. - Google Patents

Procesos para producir lipidos.

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MX2014007964A
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seeds
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MX2014007964A
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Thomas Vanhercke
James Robertson Petrie
Anna El Tahchy
Surinder Pal Singh
Qing Liu
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Commw Scient Ind Res Org
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Abstract

Métodos para producir lípidos. En particular, se describen métodos para aumentar el nivel de uno o más lípidos no polares y/o el contenido total de lípidos no polares en una parte vegetativa de una planta o un organismo transgénico o sus partes.

Description

PROCESOS PARA PRODUCIR LÍPIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para producir lipidos. En particular, la presente invención se relaciona con métodos para aumentar el nivel de uno o más lipidos no polares y/o el contenido total de lipidos no polares en un organismo transgénico o parte del mismo. En una forma de realización particular, la presente invención se relaciona con cualquier combinación de una o más monoacilglicerol aciltransferasas (MGATs), diacilglicerol aciltranstransferasas (DGATs), glicerol-3-fosfato aciltransferasas (GPATs), proteínas de cuerpos grasos y/o factores de transcripción que regulan la biosíntesis de lipidos en tanto silencian pasos enzimáticos clave en las vías de biosíntesis de almidón y de desaturación de ácidos grasos para aumentar el nivel de uno o más lipidos no polares y/o el contenido total de lipidos no polares y/o el contenido de ácidos grasos mono-insaturados en plantas o en cualquier parte de las mismas incluyendo semillas y/u hojas de plantas, algas y hongos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los combustibles derivados del petróleo suministran la mayor parte de la energía a nivel mundial, en particular para el transporte. Dado que se trata de un recurso limitado, existe la necesidad de fuentes alternativas que sean renovables, tal como aceites producidos biológicamente.
Biosíntesis de triacilglicerol Los triacilgliceroles (TAG) constituyen la principal forma de los lipidos en las semillas y consisten de tres cadenas de acilo esteri ficadas a un esqueleto de glicerol. Los ácidos grasos son sintetizados en los plástido como intermediarios de la proteina transportadora de acilos (ACP) donde pueden sufrir una primera desaturación catalizada. Esta reacción es catalizada por la estearoil-ACP desaturasa y produce ácido oleico (C18:1D9). Subsiguientemente, las cadenas de acilo son transportadas al citosol y al retículo endoplasmático (ER) como ésteres de acil-Co-enzima (CoA) . Antes de ingresar en la vía principal de biosíntesis de TAG, también conocida como la vía de Kennedy o de glicerol-3-fosfato (G3P), las cadenas de acilo típicamente se integran en los fosfolípidos de la membrana del ER, donde pueden sufrir una desaturación adicional. Dos enzimas clave en la producción de ácidos grasos poliinsaturados son las FAD2 y FAD3 desaturasas unidas a membrana que producen ácido linoleico (018:209, 12) y ácido D-linolénico (C18 : 3D9, 12, 15 ) , respectivamente .
La vía de biosíntesis de TAG por la vía de Kennedy consiste en una serie de acilaciones subsiguiente, cada una usando ésteres de acil-CoA como donante de acilo. El primer paso de acilación típicamente tiene lugar en la posición snl del esqueleto de G3P y es catalizado por la glicerol-3-fosfato aciltransferasa (snl-GPAT). El producto, ácido snl-lisofosfatídico { snl-LPh) sirve como sustrato para el ácido lisofosfatídico aciltrans ferasa (LPAAT) que acopla una segunda cadena de acilo en la posición sn2 para formar ácido fosfatídico. El PA es desfosforilado luego en diacilglicerol (DAG) por la ácido fosfatidico fosfatasa (PAP) proporcionando así el sustrato para el paso de acilación final. Finalmente, la tercera cadena de acilo es esterificada en la posición sn3 de DAG en una reacción catalizada por la diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) para formar TAG que se acumula en los cuerpos grasos. Una segunda reacción enzimática, la fosfatidil glicerol aciltransferasa (PDAT), también da como resultado la conversión de DAG en TAG. Esta reacción no está relacionada con DGAT y emplea fosfolípidos como donantes de acilo .
Para maximizar los rendimientos para la producción comercial de lipidos, persiste la necesidad de un medio adicional para aumentar los niveles de lipidos, en particular de los lipidos no polares tales como DAGs y TAGs, en organismos transgénicos o partes de los mismos tales como plantas, semillas, hojas, algas y hongos. Los intentos por incrementar los rendimientos de lipidos neutros en plantas se han centrado fundamentalmente en los pasos enzimáticos críticos individuales relacionados con la biosíntesis de ácidos grasos o en ensamblaje de TAG. Sin embargo, estas estrategias han dado como resultado aumentos modestos en el contenido de aceites de semillas o de hojas. Trabajos recientes de manipulación metabólica mediante ingeniería genética en la levadura oleaginosa Yarrowia lipolítíca han demostrado que un enfoque combinado de aumentar la producción de glicerol-3-fosfato y de impedir la degradación de TAG por medio de una D-oxidación dio como resultado aumentos acumulados en el contenido total de lipidos (Dulermo et al., 2011 ) .
Los lipidos vegetales, tales como los del el aceite de las semillas (TAG), tienen muchos usos, por ejemplo, usos culinarios (materia grasa, textura, sabor), usos industriales (en jabones, velas, perfumes, cosméticos, adecuados como agentes de secado, aislantes, lubricantes) y proporcionan valor nutricional. También existe un interés creciente en el uso de lipidos vegetales para la producción de biocombustible .
Para maximizar los rendimientos para la producción biológica con fines comerciales de lipidos, existe la necesidad de medios adicionales para aumentar los niveles de lipidos, en particular lipidos no polares tales como DAG y TAG, en organismos transgénicos o partes de los mismos, tales como plantas, semillas, hojas, algas y hongos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente han demostrado aumentos significativos en el contenido de lipidos de organismos, en particular en las partes vegetativas y las semillas de plantas, por manipulación de las vías de biosintesis de ácidos grasos y de ensamblaje de lipidos. Se usaron diversas combinaciones de genes para obtener aumentos sustanciales en el contenido de aceite, que es de gran significancia para la producción de biocombustibles y otros productos industriales derivados del aceite.
En un primer aspecto, la invención provee un proceso para producir un producto industrial de una parte vegetativa de una planta o de un organismo no humano, o una parte del mismo, que comprende niveles elevados de lipidos no polares.
En una forma de realización, la invención provee un proceso para producir un producto industrial, donde el proceso comprende los pasos de: i) obtener una parte vegetativa de una planta que tiene un contenido total de lipidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, preferiblemente al menos un 5% aproximadamente o al menos un 7% aproximadamente (p/p de peso seco ) , ii) convertir al menos algunos de los lipidos in sítu en la parte vegetativa de la planta en el producto industrial mediante calor, medios químicos o enzimáticos o cualquier combinación de los mismos, y iii) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
En otra forma de realización, el proceso para producir un producto industrial comprende los pasos de: i) obtener una parte vegetativa de una planta que tiene un contenido total de lipidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, preferiblemente al menos un 5% aproximadamente o al menos un 7% aproximadamente (p/p de peso seco ) , ii) procesar físicamente la parte vegetativa de la planta del paso i), iii) convertir al menos algunos de los lipidos en la parte vegetativa de la planta procesada en el producto industrial por aplicación de calor, medios químicos o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lípido en la parte vegetativa de la planta procesada, y iv) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
En otra forma de realización, el proceso para producir un producto industrial comprende los pasos de: i) obtener un organismo no humano, o una parte del mismo, que comprende uno o más polinucleótidos exógenos, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un organismo no humano o una parte del mismo, y en donde el organismo no humano, o una parte del mismo, tiene un mayor nivel de uno o más lipidos no polares con relación al correspondiente organismo no humano, o una parte del mismo, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, y ii) convertir al menos algunos de los lipidos in situ en el organismo no humano, o una parte del mismo, en el producto industrial mediante calor, medios químicos o enzimáticos o cualquier combinación de los mismos, y iii) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
En una forma de realización adicional, el proceso para producir un producto industrial comprende los pasos de: i) obtener un organismo no humano, o una parte del mismo, que comprende uno o más polinucleótidos exógenos, en donde el organismo no humano, o una parte del mismo, tiene un mayor nivel de uno o más lipidos no polares con relación al correspondiente .organismo no humano, o una parte del mismo, que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos, ii) procesar físicamente el organismo no humano, o una parte del mismo, del paso i), iii) convertir al menos algunos de los lipidos en el organismo no humano procesado o una parte del mismo en el producto industrial por aplicación de calor, de medios químicos o enzimáticos o de cualquier combinación de los mismos, al lípido en el organismo no humano procesado o una parte del mismo, y iv) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
En cada una de las formas de realización anteriores, un especialista en el arte comprenderá que el paso de conversión podría llevarse a cabo simultáneamente con el paso de procesamiento físico o después del mismo.
En cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente una ho a de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al -menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más pre eriblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos , un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p de peso seco). En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lípidos no polares es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, entre un 10% y un 15%, entre un 15% y un 20%, entre un 20% y un 25%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una hoja (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de ho a que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
Aún más, en cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de TAG de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente una ho a de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un "11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente o más preferiblemente al menos un 17% aproximadamente (p/p de peso seco) . En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de TAG es de entre un 5% y un 30%, entre un 7% y un 30%, entre un 10% y un 30%, entre un 12% y un 30%, entre un 15% y un 30%, entre un 7% y un 30%, entre un 10% y un 30%, entre un 20% y un 28%, entre un 18% y un 25%, entre un 22% y un 30%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco.
En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
Aún más, en cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de lipidos de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente una hoja de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente , más preferiblemen e al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente , más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 17% aproximadamente (p/p de peso seco), más preferiblemente al menos un 20% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 25% aproximadamente. En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lipidos es de entre un 5% y un 35%, entre un 7% y un 35%, entre un 10% y un 35%, entre un 12% y un 35%, entre un 15% y un 35%, entre un 7% y un 35%, entre un 10% y un 20%, entre un 18% y un 28%, entre un 20% y un 28%, entre un 22% y un 28%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente , un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente , un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente, un 22% aproximadamente o un 25% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco. Típicamente, el contenido total de lipidos de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano, o una parte del mismo, es aproximadamente un 2-3% mayor que el contenido de lipidos no polares. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
El producto industrial puede ser un producto hidrocarbonado tal como ésteres de ácidos grasos, preferiblemente metilésteres de ácidos grasos y/o etilésteres de ácidos grasos, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadenas más largas, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno gaseoso, un bioalcohol tal como etanol, propanol o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono. El producto industrial puede ser una mezcla de cualquiera de estos componentes, tal como una mezcla de alcanos, o alcanos y alquenos, preferiblemente una mezcla que predominantemente (>50%) comprende C4-C8 alcanos, o predominantemente C6 a CIO alcanos, o predominantemente C6 a C8 alcanos. El producto industrial no es dióxido de carbono y no es agua, aunque estas moléculas pueden ser producidas en combinación con el producto industrial. El producto industrial puede ser un gas a presión atmosférica/temperatura ambiente o, preferiblemente, un líquido o un sólido tal como biocarbono, o el proceso puede producir una combinación de un componente gaseoso, un componente líquido y un componente sólido tal como monóxido de carbono, hidrógeno gaseoso, alcanos y biocarbono, que subsiguientemente se pueden separar. En una forma de realización, el producto hidrocarbonado comprende predominantemente metilésteres de ácidos grasos. En una forma de realización alternativa, el producto hidrocarbonado es un producto distinto de metilésteres de ácidos grasos.
El producto industrial puede ser un producto intermedio, por ejemplo, un producto que comprende ácidos grasos, que subsiguientemente se puede convertir, por ejemplo, en biocombustible, por ejemplo, por trans-esterlficación en ésteres de ácidos grasos.
Se puede aplicar calor en el proceso, tal como por pirólisis, combustión, gasificación o junto con una digestión enzimática (incluyendo digestión anaeróbica, elaboración de compost, fermentación) . Una gasificación a menor temperatura tiene lugar, por ejemplo, entre aproximadamente 700 °C y aproximadamente 1000 °C. Una gasificación a mayor temperatura tiene lugar, por ejemplo, entre aproximadamente 1200 °C y aproximadamente 1600 °C. Una pirólisis a menor temperatura (pirólisis más lenta) tiene lugar, por ejemplo,, a 400 °C aproximadamente, en tanto una pirólisis a mayor temperatura tiene lugar, por ejemplo, a 500 °C aproximadamente. Una digestión mesofilica tiene lugar, por ejemplo, entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 40 °C. Una tiene digestión termofílica lugar, por ejemplo, entre aproximadamente 50 °C y aproximadamente 65 °C.
Los medios químicos incluyen, pero de manera no taxativa, craqueo catalítico, digestión anaeróbica, fermentación, elaboración de compost y transesterificación . En una forma de realización, un medio químico emplea un catalizador o una mezcla de catalizadores, que puede aplicarse junto con calor. El proceso puede emplear un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo y/o un catalizador enzimático. En una forma de realización, el catalizador es un catalizador de un metal, de transición, un catalizador tipo tamiz molecular, un catalizador de alúmina o de carbonato de sodio activado. Los catalizadores incluyen catalizadores ácidos, tal como ácido sulfúrico, o catalizadores alcalinos, tal como hidróxido de potasio o de sodio u otros hidróxidos. Los medios químicos pueden comprender transesterificación de ácidos grasos en el lipido, cuyo proceso puede emplear un catalizador homogéneo, un catalizador heterogéneo y/o un catalizador enzimático. La conversión puede comprender pirólisis, que aplica calor y puede aplicar medios químicos, y puede emplear un catalizador de un metal de transición, un catalizador tipo tamiz molecular, un catalizador de alúmina y/o de carbonato de sodio activado.
Los medios enzimáticos incluyen, pero de manera no taxativa, digestión por microorganismos, por ejemplo, en una digestión anaeróbica, fermentación o elaboración de compost, o mediante proteínas enzimáticas recombinantes .
El lipido que es convertido en un producto industrial en este aspecto de la invención puede ser algunos o todos los lípidos no polares de la parte vegetativa de la planta o de un organismo no humano o una parte del mismo, o preferiblemente la conversión es de al menos algunos de los lipidos no polares y al menos algunos de los lipidos polares, y, más preferiblemente, esencialmente todos los lipidos (tanto polares como no polares) de la parte vegetativa de la planta o de un organismo no humano, o una parte del mismo, son convertidos en el o los productos industriales.
En una forma de realización, la conversión del lípido en el producto industrial tiene lugar in situ sin ruptura física de la parte vegetativa de la planta o del organismo no humano o una parte del mismo. En esta forma de realización, la parte vegetativa de la planta o del organismo no humano, o una parte del mismo, se puede secar primero, por ejemplo por aplicación de calor, o la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o una parte del mismo, se puede usar esencialmente tal cornos se cosechó, sin secado. En una forma de realización alternativa, el proceso comprende un paso de procesar físicamente la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o una parte del mismo. El procesamiento físico puede comprender uno o más entre proceso con rodillos, prensado tal como formación de escamas, trituración o molienda de la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, que se puede combinar con secado de la parte vegetativa de la planta, o del organismo no humano o una parte del mismo. Por ejemplo, la parte vegetativa de la planta, o del organismo no humano, o una parte del mismo, primero se puede secar sustancialmente y luego se lo puede moler hasta obtener un material más fino, para facilitar el procesamiento subsiguiente.
En una forma de realización, el peso de la parte vegetativa de la planta, o del organismo no humano o una parte del mismo, usado en el proceso es de al menos un 1 kg o preferiblemente al menos un 1 tonelada métrica (peso seco) de partes vegetativas de plantas agrupadas, o de organismos no humanos agrupados o partes de los mismos. Los procesos pueden comprender además un primer paso de cosechar una parte vegetativa de las plantas, por e emplo de al menos un 100 ó 1000 plantas cultivadas a campo, para proveer una colección de al menos un 1000 de dichas partes vegetativas de las plantas, es decir, que sean esencialmente idénticas. Preferiblemente, las partes vegetativas de las plantas se cosechan en el momento en que es mayor el rendimiento de lipidos no polares. En una forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan aproximadamente en el momento de la floración. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan entre aproximadamente el momento de la floración y aproximadamente el comienzo de la senescencia. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan cuando las plantas tienen al menos un 1 mes de vida aproximadamente.
El proceso puede comprender además, o no, extraer parte del contenido de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, o del organismo no humano, o una parte del mismo, antes del paso de conversión. En una forma de realización, el proceso comprende además los pasos de: (a) extraer al menos algo del contenido de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta o del organismo no humano, o una parte del mismo, como lipidos no polares, y (b) recuperar los lipidos no polares extraídos, en donde los pasos (a) y (b) se conducen antes del paso de conversión de al menos algunos de los lipidos de la parte vegetativa de la planta, o del organismo no humano o una parte del mismo, en el producto industrial. La proporción de lipidos no polares que se extrae primero puede ser menos que un 50%, o más que un 50% o preferiblemente al menos un 75% de los lipidos no polares totales en la parte vegetativa de la planta, o en el organismo no humano o una parte del mismo. En esta forma de realización, los lipidos no polares extraídos comprenden triacilgliceroles , en donde los triacilgliceroles comprenden al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95%, de los lipidos extraídos. Los propios lipidos extraídos se pueden convertir en un producto industrial distinto del dicho lípido, por ejemplo por trans-esterificación en ésteres de ácidos grasos.
En un segundo aspecto, la invención provee un proceso para producir lipidos extraídos de un organismo no humano o una parte del mismo.
En una forma de realización, la invención provee un proceso para producir lipidos extraídos, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener un organismo no humano, o una parte del mismo, que comprende uno o más polinucleótidos exógenos y un mayor nivel de uno o más lipidos no polares con relación al correspondiente organismo no humano o una parte del mismo, respectivamente, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, ii) extraer lipidos del organismo no humano o una parte del mismo, y iii) recuperar los lipidos extraídos, produciendo de esa manera los lipidos extraídos, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un organismo no humano o una parte del mismo, y en donde se aplica una o más o todas las siguientes características: (a) dichos uno o más polinucleótidos exógenos comprenden un primer polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido relacionado con la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, (b) si el organismo no humano es una planta, una parte vegetativa de la planta tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p de peso seco ) , (c) el organismo no humano es un alga seleccionado del grupo que consiste de diatomeas (bacilariofitas ) , algas verdes ( clorofitas ) , algas verdiazules ( cianofitas ) , algas pardo-amarillentas ( crisofitas ) , haptofitas, algas marrones o pardas y algas heterocontas, (d) dichos uno o más lípidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera entre dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, (e) el contenido de ácidos grasos totales en los lipidos no polares comprende al menos un 2% más de ácido oleico y/o al menos un 2% menos de ácido palmitico que los lipidos no polares en el correspondiente organismo no humano, o una parte del mismo, que carece de dichos uno o más pol inucleótidos exógenos, (f) los lipidos no polares comprenden un nivel modificado de esteróles totales, preferiblemente esteróles libres (no esteri ficados ) , esteroil ésteres, esteroil glicósidos, con relación a los lipidos no polares en el correspondiente organismo no humano, o una parte del mismo, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, (g) los lipidos no polares comprenden ceras y/o ésteres de ceras, (h) el organismo no humano, o una parte del mismo, es un miembro de una población o colección agrupada de al menos un 1000 de tales organismos no humanos o partes de los mismos, respectivamente, de la cual se extraen los lipidos.
En una forma de realización del párrafo (b) anterior, el contenido total de lipidos no polares es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, de un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco.
En una forma de realización, el organismo no humano es un alga, o un organismo adecuado para una fermentación tal como un hongo o, preferiblemente, una planta. La parte del organismo no humano puede ser una semilla, una fruta o una parte vegetativa de una planta. En una forma de realización preferida, la parte de planta es una porción de ho a que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2. En otra forma de realización preferida, el organismo no humano es una planta, la parte es una semilla de una planta y los lipidos extraídos comprenden el aceite de semillas. En una forma de realización más preferida, la planta es de una especie de semillas oleaginosas, de utilidad comercial o que se podría usar comercialmente para la producción de aceite. La especie se puede seleccionar del grupo que consiste de Acrocomia aculeata (palma macaúba), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (maní), Astrocaryum murumuru (palmera murumuru), Astrocaryum vulgare (tucuma) , Attalea geraensís (Indaiá-rateiro), Attalea humilis (Palmera oleaginosa americana), Attalea oleífera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babassu) , Avena sativa (avenas), Beta vulgaris (remolacha), Brassica sp. tales como Brassica carinata, Brassica júncea, Brassica napobrassica , Brassica napus (cañóla), Camelina sativa (falso lino), Cannabis sativa (cáñamo), Carthamus tínctorius (alazor), Caryocar brasiliense (pequi o nuez souari ) , Cocos nucífera (coco), Cra be abyssinica (col de abisinia), Cucumis meló (melón), Elaeis guineensis (palmera africana), Glycine max (soja), Gossypium hírsutum (algodón), Helianthus sp. tal como Helianthus annuus (girasol), Hordeum vulgare (cebada), Jatropha curcas (piñón de leche), Joannesia princeps (nuez de arará), Le na sp. (lenteja de agua) tal como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoríensis, Lemna gibba (lentejita de agua), Lemna japónica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna teñera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rígida (oiticica), Linu usitatissimum (lino), Lupinus angustífolíus (lupino), Mauritia flexuosa (palmera buriti), Maximílíana maripa (palmera de inaja palm) , Miscanthus sp. tal como Miscanthus x gíganteus y Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana bentha iana, Oenocarpus bacaba (bacaba oleaginosa), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacabá), Oryza sp. (arroz) tal como Oryza sativa y Oryza glaberrima, Panicum virgatu (pasto varilla), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana (palta), Pongamia pinnata (Habas de la India), Populus trichocarpa, Ricinus communís (castor), Saccharum sp. (caña de azúcar), Sesamum indicum (sésamo), Solanum tuberosum (papa), Sorghum sp. tales como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cacao blanco), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (Palmera de Buruti ) , Triticum sp. (trigo) tal como Tritícum aestivum y Zea ays (maíz). En una forma de realización, la planta de Brassica napus es de la variedad Westar. En una forma de realización alternativa, si la planta es Brassica napus, es de una variedad o cultivar distinta de Westar. En una forma de realización, la planta es de una especie distinta de Arabidopsis thaliana. En otra forma de realización, la planta es de una especie distinta de Nicotiana tabacum. En otra forma de realización, la planta es de una especie distinta de Nicotiana benthamiana. En una forma de realización, la planta es una planta perenne, por ejemplo, un pasto varilla. Cada una de las características descritas para la planta del segundo aspecto se puede aplicar mutatis mutandis a la parte vegetativa de la planta del primer aspecto.
En una forma de realización, el organismo no humano es un hongo oleaginoso tal como una levadura oleaginosa.
En una forma de realización preferida, el lípido se extrae sin secar el organismo no humano, o una parte del mismo, antes de la extracción. Los lípidos extraídos se pueden secar subsiguientemente o se pueden fraccionar para reducir su contenido de humedad.
En otras formas de realización de este aspecto, la invención provee un proceso para producir lípidos extraídos de plantas oleaginosas específicas. En una forma de realización, la invención provee un proceso para producir el aceite de cañóla extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de cañóla que comprenden al menos un 45% del aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de cañóla, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG) , produciendo de esa manera el aceite de cañóla. En una forma de realización preferida, la semilla de cañóla tiene un contenido de aceite en base al peso de al menos un 46%, al menos un 47%, al menos un 48%, al menos un 49%, al menos un 50%, al menos un 51%, al menos un 52%, al menos un 53%, al menos un 54%, al menos un 55% o al menos un 56%. El contenido de aceite se puede determinar por medición de la cantidad del aceite que se extrae de la semilla, que es una semilla trillada cosechada de manera común, y calculado como un porcentaje del peso de la semilla, es decir, % (p/p) - El contenido de humedad de las semillas de cañóla es de entre un 5% y un 15%, y preferiblemente es de un 8,5% aproximadamente. En una forma de realización, el contenido de ácido oleico es de entre un 58% y 62% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de ca óla, preferiblemente al menos un 63%, y el contenido de ácido palmítico es de entre un 4% aproximadamente y un 6% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de cañóla. El aceite de cañóla preferido tiene un valor de iodo de 110-120 y un nivel de clorofila menor que 30 ppm.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir el aceite de semillas de maíz extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de maíz que comprenden al menos un 5% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de maíz, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 80%, preferiblemente al menos un 85% o al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG) , produciendo de esa manera el aceite de semillas de maiz. En una forma de realización preferida, las semillas de maiz tienen un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10%, al menos un 11%, al menos un 12% o al menos un 13%. El contenido de humedad de las semillas de maíz es de entre un 13% aproximadamente y un 17% aproximadamente, preferiblemente es de un 15% aproximadamente. El aceite de maíz preferido comprende un 0,1% aproximadamente de tocoferóles.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir aceite de soja extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de so a que comprenden al menos un 20% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer aceite de las semillas de soja, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG) , produciendo de esa manera el aceite de so a. En una forma de realización preferida, la semilla de so a tiene un contenido de aceite en base al peso de semillas (p/p) de al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24%, al menos un 25%, al menos un 26%, al menos un 27%, al menos un 28%, al menos un 29%, al menos un 30% o al menos un 31%. En una forma de realización, el contenido de ácido oleico es de entre un 20% aproximadamente y un 25% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de soja, preferiblemente al menos un 30%, el contenido de ácido linoleico es de entre un 45% aproximadamente y un 57% aproximadamente, preferiblemente menos que un 45%, y el contenido de ácido palmitico es de entre un 10% aproximadamente y un 15% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de soja, preferiblemente menos que un 10%. Preferiblemente, la semilla de soja tiene un contenido de proteina de un 40% aproximadamente en base al peso seco, y el contenido de humedad de la semilla de soja es de entre un 10% aproximadamente y un 16% aproximadamente, preferiblemente es de un 13% aproximadamente.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir aceite de semillas de lupino extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de lupino que comprenden al menos un 10% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer aceite de las semillas de lupino, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG) , produciendo de esa manera el aceite de lupino. En una forma de realización preferida, la semilla de lupino tiene un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un 14%, al menos un 15% o al menos un 16%.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir el aceite de semillas de maní extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener maníes que comprenden al menos un 50% el aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de los maníes, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de maní. En una forma de realización preferida, las semillas de maní (maníes) tienen un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 51%, al menos un 52%, al menos un 53%, al menos un 54%, al menos un 55% o al menos un 56%. En una forma de realización, el contenido de ácido oleico es de entre un 38% y un 59% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de maní, preferiblemente al menos un 60%, y el contenido de ácido palmítico es de entre un 9% aproximadamente y un 13% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de maní, preferiblemente menos que un 9%.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir aceite de girasol extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de girasol que comprenden al menos un 50% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer aceite de las semillas de girasol, y iü) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de girasol. En una forma de realización preferida, las semillas de girasol tienen un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 51%, al menos un 52%, al menos un 53%, al menos un 54% o al menos un 55%.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir aceite de semillas de algodón extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de algodón que comprenden al menos un 41% el aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de algodón, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semillas de algodón. En una forma de realización preferida, las semillas de algodón tienen un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 42%, al menos un 43%, al menos un 44%, al menos un 45%, al menos un 46%, al menos un 47%, al menos un 48%, al menos un 49% o al menos un 50%.
En una forma de realización, el contenido de ácido oleico es de entre un 15% y un 22% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de algodón, preferiblemente al menos un 22%, el contenido de ácido linoleico es de entre un 45% aproximadamente y un 57% aproximadamente, preferiblemente menos que un 45%, y el contenido de ácido palmitico es de entre un 20% aproximadamente y un 26% aproximadamente de los ácidos grasos totales en el aceite de semillas de algodón, preferiblemente menos que un 18%.
En una forma de realización, el aceite de semillas de algodón también contiene ácidos grasos ciclopropanados tales como los ácidos estercúlico y malválico, y puede contener cantidades menores de gosipol.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir el aceite de alazor extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de alazor que comprenden al menos un 35% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer aceite de las semillas de alazor, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de alazor. En una forma de realización preferida, la semilla de alazor tiene un contenido de aceite en base al peso de semillas (p/p) de al menos un 36%, al menos un 37%, al menos un 38%, al menos un 39%, al menos un 40%, al menos un 41%, al menos un 42%, al menos un 43%, al menos un 44% o al menos un 45%.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir aceite semillas de lino extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de lino que comprenden al menos un 36% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer aceite de las semillas de lino, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semillas de lino. En una forma de realización preferida, las semillas de lino tienen un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 37%, al menos un 38%, al menos un 39% o al menos un 40%.
En otra forma de realización, la invención provee un proceso para producir aceite de camelina extraído, donde dicho proceso comprende los pasos de: i) obtener semillas de Camelina sativa que comprenden al menos un 36% el aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de Camelina sativa, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos un 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG) , produciendo de esa manera el aceite de Camelina. En una forma de realización preferida, las semillas de Camelina sativa tienen un contenido de aceite en base al peso de las semillas (p/p) de al menos un 37%, al menos un 38%, al menos un 39%, al menos un 40%, al menos un 41%, al menos un 42%, al menos un 43%, al menos un 44% o al menos un 45%.
El proceso del segundo aspecto también puede comprender medir el contenido de aceite y/o de proteínas de la semilla mediante espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano como se describe en Hom et al. (2007).
En una forma de realización, el proceso del segundo aspecto de la invención comprende secar parcialmente o completamente la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano, o una parte del mismo, o la semilla, y/o uno o más entre procesar con rodillos, prensar tal como formar escamas, triturar o moler la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano, o una parte del mismo, o la semilla, o cualquier combinación de estos métodos, en el proceso de extracción. El proceso puede emplear un solvente orgánico (por ejemplo, hexano tal como n-hexano o una combinación de n-hexano con isohexano, o butano solo o en combinación con hexano) en el proceso de extracción para extraer el lipido o el aceite o para aumentar la eficiencia del proceso de extracción, en particular en combinación con un proceso de secado anterior para reducir el contenido de humedad.
En una forma de realización, el proceso comprende recuperar los lipidos o el aceite extraídos recolectándolos en un recipiente y/o purificar los 'lipidos o el aceite de semillas extraídos, tal como, por ejemplo, mediante desgomado, desodorización, decoloración, secado y/o fraccionamiento de los lipidos o el aceite extraídos, y/o eliminar al menos algunas, con preferencia sustancialmente todas, las ceras y/o ásteres de ceras de los lipidos o el aceite extraídos. El proceso puede comprender analizar la composición de ácidos grasos de los lipidos o el aceite extraídos, tal como, por ejemplo, por conversión de los ácidos grasos presentes en los lipidos o el aceite extraídos en metilésteres de ácidos grasos y analizarlos usando GC para determinar la composición de ácidos grasos. La composición de ácidos grasos de los lipidos o el aceite se determina antes de cualquier fraccionamiento de los lipidos o del aceite que pudiera alterar la composición de ácidos grasos. Los lipidos o el aceite extraídos pueden comprender una mezcla de los tipos de lipidos y/o uno o más derivados de los lipidos, tales como ácidos grasos libres.
En una forma de realización, el proceso del segundo aspecto de la invención da como resultado cantidades sustanciales de lipidos o aceite extraídos. En una forma de realización, el volumen de los lipidos o el aceite extraídos es de al menos un 1 litro, preferiblemente es de al menos 10 litros. En una forma de realización preferida, los lipidos o el aceite extraídos se envasan listos para su transporte o venta .
En una forma de realización, los lipidos o el aceite extraídos comprenden al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95% o al menos un 96% de TAG en base al peso. Los lipidos o el aceite extraídos pueden comprender fosfolípidos como un componente menor, hasta un 8% aproximadamente en peso, preferiblemente menos que un 5% en peso y más preferiblemente menos que un 3% en peso.
En una forma de realización, el proceso da como resultado lipidos o aceite extraídos, en donde se aplica una o más o todas las siguientes características: (i) los triacllgliceroles comprenden al menos un 90%, preferiblemente al menos un 95% o 96%, de los lipidos o el aceite extraídos, (ii) los lipidos o el aceite extraídos comprenden esteróles libres, esteroil ásteres, esteroil glicósidos, ceras o ásteres de ceras o cualquier combinación de los mismos, y (iii) el contenido total y/o la composición de esteróles en los lipidos o el aceite extraídos es significativamente diferente del contenido y/o la composición de esteróles en los lipidos o el aceite extraídos producidos a partir de un correspondiente organismo no humano o una parte del mismo, o de una semilla.
En una forma de realización, el proceso comprende además convertir los lipidos o el aceite extraídos en un producto industrial. Es decir, los lipidos o el aceite extraídos son convertidos después de la extracción en otra forma química que es un producto industrial. Preferiblemente, el producto industrial es un producto hidrocarbonado tal como ásteres de ácidos grasos, preferiblemente metilésteres de ácidos grasos y/o etilésteres de ácidos grasos, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadenas más largas, un alqueno, un biocombustible , monóxido de carbono y/o hidrógeno gaseoso, un bioalcohol tal como etanol, propanol o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono.
En el proceso de cualquiera entre el primer o segundo aspectos de la invención, la parte vegetativa de la planta, o la parte del organismo no humano puede ser una parte de planta aérea o una parte de planta verde tal como una ho a o un tallo de una planta, una parte leñosa tal como un tallo, una rama o un tronco, o una raiz o un tubérculo. Preferiblemente, las plantas se cultivan en un campo y las partes, tal como las semillas, se cosechan de las plantas en el campo. — En una forma de realización, el proceso comprende además un paso de cosechar la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente con un cosechador mecánico.
Preferiblemente, las partes vegetativas de las plantas se cosechan en el momento cuando el rendimiento de lipidos no polares se encuentra en su punto máximo. En una forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan aproximadamente en el momento de la floración. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan entre aproximadamente en el momento de la floración y aproximadamente el comienzo de la senescencia.
En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan cuando las plantas tienen al menos 1 mes de vida aproximadamente.
Si el organismo es un alga o un organismo fúngico, las células se pueden cultivar en un recipiente cerrado o en un sistema al aire libre tal como un estanque. Los organismos resultantes que comprenden a los lipidos no polares se pueden cosechar, tal como, por ejemplo, mediante un proceso que comprende filtración, centrifugación, sedimentación, flotación o floculación de algas o de organismos fúngicos tal como por ajuste del pH del medio. La sedimentación es el proceso menos preferido.
En el proceso del segundo aspecto de la invención, el contenido total de lipidos no polares del organismo no humano o una parte del mismo, tal como una parte vegetativa de la planta o un semilla, está aumentado con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una de parte del mismo, o de una semilla.
En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla del primer o segundo aspectos de la invención se define además por presentar tres características, a saber, la Característica (i), la Característica (ii) y la Característica (iii), individualmente o combinadas: La Característica (i) cuantifica la extensión del mayor nivel de dichos uno o más lipidos no polares o el contenido total de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, o del organismo no humano o una parte del mismo, o de la semilla, que se puede expresar como la extensión del aumento en base al peso (base de peso seco o base de peso de las semillas), o como un aumento relativo en comparación con el nivel en la correspondiente parte vegetativa de la planta, u organismo no humano, o una parte del mismo, o semilla. La Característica (ii) especifica el género o la especie de la planta, o la especie de hongo o alga, u otro tipo celular, y la Característica (iii) especifica uno o más lipidos específicos con un mayor contenido de lipidos no polares.
En el caso de la Característica (i), en una forma de realización, la extensión del aumento de dichos uno o más lipidos no polares es de al menos un 0,5%, al menos un 1%, al menos un 2%, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10%, al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17%, al menos un 18%, al menos un 19%, al menos un 20%, al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24%, al menos un 25% o al menos un 26% más en base al peso seco o en base al peso de las semillas que la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo.
Además, en la Característica (i), en una forma de realización preferida, el contenido total de lípidos no polares de la parte vegetativa de la planta o del organismo no humano, o una parte del mismo, o de la semilla, está aumentado en comparación con la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o de una semilla. En una forma de realización, el contenido total de lípidos no polares está aumentado en al menos un 0,5%, al menos un 1%, al menos un 2%, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10%, al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17%, al menos un 18%, al menos un 19%, al menos un 20%, al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24%, al menos un 25% o al menos un 26% en base al peso seco o en base de al peso de las semillas con respecto a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla.
Además, en el caso de la Característica (i), en una forma de realización, el nivel de dichos uno o más lípidos no polares y/o el contenido total de lípidos no polares es al menos un 1%, al menos un 2%, al menos un 3%, al menos un 4%, al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9%, al menos un 10%, al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17%, al menos un 18%, al menos un 19%, al menos un 20%, al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 100% mayor en una base relativa con respecto a la correspondiente parte vegetativa de la planta y organismo no humano o una parte del mismo, o semilla.
También para la Característica (i), la extensión del aumento del nivel de dichos uno o más lípidos no polares y/o del contenido total de lípidos no polares puede ser al menos dos ves, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces o al menos 12 veces, preferiblemente al menos 13 veces aproximadamente o al menos 15 veces aproximadamente mayor en una base relativa que la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo o semilla.
Como resultado del aumento en el nivel de dichos uno o más lípidos no polares y/o el contenido total de lipidos no polares definidos en la Característica (i), el contenido total de lípidos no polares de la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo o semilla preferiblemente es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, de un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco o de peso de semillas.
Para la Característica (ii), en una forma de realización, el organismo no humano es una planta, alga o un organismo adecuado para una fermentación tal como una levadura u otros hongos, preferiblemente un hongo oleaginoso tal como una levadura oleaginosa. La planta puede ser, o la parte vegetativa de la planta puede seleccionarse, por ejemplo, una planta que comprende Acrocomia aculeata (palma macaúba), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (maní), Astrocaryum murumuru (palmera murumuru) , Astrocaryum vulgare (tucuma), Attalea geraensis ( Indaiá-rateiro ) , Attalea humilis (Palmera oleaginosa americana), Attalea oleífera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babassu) , Avena sativa (avenas), Beta vulgaris (remolacha), Brassica sp. tales como Brassica carinata, Brassica júncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (cañóla), Camelína sativa (falso lino), Cannabis sativa (cáñamo), Carthamus tinctorius (alazor), Caryocar brasiliense (pequi o nuez souari), Cocos nucífera (coco), Crambe abyssíníca (col de abisinia), Cucumis meló (melón), Elaeis guineensis (palmera africana), Glycíne max (soja), Gossypium hirsutum (algodón), Helianthus sp. tal como Helianthus annuus (girasol), Hordeum vulgare (cebada), Jatropha curcas (piñón de leche), Joannesia princeps (nuez de arará), Lemna sp. (lenteja de agua) tal como Lemna aequínoctíalíSf Lemna disperma, Lemna ecuadoriensi s, Lemna gíbba (lentejita de agua), Lemna japónica, Lemna mínor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna teñera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdíviana, Lemna yungensis, Licania rígida (oiticica), Linum usitatissimum (lino), Lupinus angustífolius (lupino), Maurítía flexuosa (palmera buriti), Maximilíana maripa (palmera de inaja palm) , Miscanthus sp. tal como Miscanthus x giganteus y Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba oleaginosa), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacabá), Oryza sp. (arroz) tal como Oryza sativa y Oryza glaberrima, Panicum virgatum (pasto varilla), Paraqueiba paraensis (marí ) , Persea americana (palta), Pongamia pinnata (Habas de la India), Populus tríchocarpa, Ricínus communis (castor), Saccharum sp. (caña de azúcar), Sesamu indicum (sésamo), Solanum tuberosu (papa), Sorghum sp. tales como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandíforum (cacao blanco), Trifoliu sp., Tríthrínax brasíliensís (Palmera de Buruti), Tríticum sp. (trigo) tal como Tríticum aestivum y Zea mays (maíz). En una forma de realización, la planta de Brassica napus es de la variedad Westar. En una forma de realización alternativa, si la planta es Brassica napus, es de una variedad o cultivar distinta de Westar. En una forma de realización, la planta es de una especie distinta de Arabidopsís thaliana. En otra forma.de realización, la planta es de una especie distinta de Nícotiana tabacum. En otra forma de realización, la planta es de una especie distinta de Nícotiana bentha iana. En una forma de realización, la planta es una planta perenne, por ejemplo, un pasto varilla. Cada una de las características descritas para la planta del segundo aspecto se puede aplicar mutatís mutandís a la parte vegetativa de la planta del primer aspecto.
En el caso de la Característica (iii), los compuestos TAG, DAG, TAG y DAG, MAG, ácidos grasos poliinsaturados totales (PUFA) o un PUFA específico tal como ácido eicosadienoico (EDA), ácido araquidónico (ARA), ácido alfa-linolénico (ALA), ácido estearidónico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA) o un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, están aumentados o disminuidos. La extensión del aumento de TAG, DAG, TAG y DAG, MAG, PUFA, PUFA específico o ácido graso, es como se definió previamente en la Característica (i). En una forma de realización preferida, el MAG es 2-MAG. Preferiblemente, DAG y/o TAG, más preferiblemente el total de DAG y TAG, o MAG y TAG, están aumentados. En una forma de realización, los niveles de TAG están aumentados sin un aumento en el contenido de MAG y/o DAG.
Además, para la Característica (iii), en una forma de realización, el contenido de ácidos grasos totales y/o el contenido de TAG en el contenido total de lípidos no polares comprende (a) al menos un 2% más, preferiblemente al menos un 5% más, más preferiblemente al menos un 7% más, con mayor preferencia al menos un 10% más, al menos un 15% más, al menos un 20% más, al menos un 25% más de ácido oleico, o al menos un 30% más con relación a los lípidos no polares en la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos . En una forma de realización, el contenido de ácidos grasos totales en los lípidos no polares comprende (b) al menos un 2% menos, preferiblemente al menos un 4% menos, más preferiblemente al menos un 7% menos, al menos un 10% menos, al menos un 15% menos, o al menos un 20% menos ácido palmítico con relación a los lípidos no polares en la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos. En una forma de realización, el contenido de ácidos grasos totales del contenido total de lípidos no polares comprende (c) al menos un 2% menos, preferiblemente al menos un 4% menos, más preferiblemente al menos un 7% menos, al menos un 10% menos o al menos un 15% menos de ALA con relación a los lípidos no polares en la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos. En una forma de realización, el contenido de ácidos grasos totales del contenido total de lipidos no polares comprende (d) al menos un 2% más, preferiblemente al menos un 5% más, más preferiblemente al menos un 7% más, con mayor preferencia al menos un 10% más o al menos un 15% más, de LA, con relación a los lipidos no polares en la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos. Con mayor preferencia, los ácidos grasos totales y/o contenido de TAG del contenido total de lipidos no polares tiene un mayor nivel de ácido oleico de acuerdo con la cifra definida en (a) y un menor contenido de ácido palmítico de acuerdo con las cifras definidas en). En una forma de realización, el contenido total de esteróles está aumentado en al menos un 10% con relación al aceite de semillas de la semilla correspondiente. En una forma de realización, los lipidos o el aceite extraídos comprenden al menos 10 ppm de clorofila, preferiblemente al menos 30 ppm de clorofila. La clorofila se puede eliminar subsiguientemente por decoloración de los lipidos o del aceite extraídos.
En formas de realización preferidas, dichos uno o más lipidos no polares y/o el contenido total de lipidos no polares se define por la combinación de las Características (i), (ii) y (iii) o de las Características (i) y (ii) o de las Características (i) y (iii) o de las Características (ii) y (iü ) · El proceso del segundo aspecto de la invención provee, en una forma de realización, la aplicación de una o más o todas las siguientes características: (i) el nivel de uno o más lípidos no polares en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, es al menos un 0,5% mayor en base al peso que el nivel en una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, o preferiblemente como también se define en la Característica (i), (ii) el nivel de uno o más lípidos no polares en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla es al menos un 1% mayor en una base relativa que en una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, o preferiblemente como también se define en la Característica (i), (iii) el contenido total de lípidos no polares en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla es al menos un 0,5% mayor en base al peso que el nivel en una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, o preferiblemente como también se define en la Característica (i), (iv) el contenido total de lípidos no polares en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, es al menos un 1% mayor en una base relativa que en una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, o preferiblemente como también se define en la Característica (i), (v) el nivel de uno o más lipidos no polares y/o el contenido total de lípidos no polares de la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, es al menos 0,5% mayor en base al peso y/o al menos un 1% mayor en una base relativa que la correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos y que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un DGAT1 de Arabidopsís thalíana, o preferiblemente como también se define en la Característica (i), (vi) el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG o MAG en el lípido en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, y/o en los lipidos extraídos de los mismos, es al menos un 10% mayor en una base relativa que el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG o MAG en el lípido en la correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, o los correspondientes lipidos extraídos de los mismos, respectivamente, o preferiblemente como también se define en la Característica (i), y (vii) el contenido de ácidos grasos poliinsaturados totales (PUFA) en los lipidos de la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla y/o en los lipidos extraídos de los mismos, está aumentado (por ejemplo, en la presencia de un MGAT ) o disminuido (por ejemplo, en la ausencia de un MGAT) con relación al contenido total de PUFA en los lipidos de una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, o los correspondientes lipidos extraídos de los mismos, respectivamente, o preferiblemente como también se define en la Característica (i) o en la Característica (iii).
En una forma de realización, el nivel de un PUFA en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla y/o en los lípidos extraídos de los mismos, está aumentado con relación al nivel del PUFA en la correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, o los correspondientes lípidos extraídos de los mismos, respectivamente, en donde loes ácidos grasos poliinsaturados comprenden ácido eicosadienoico, ácido araquidónico (ARA) , ácido alfa-linolénico (ALA), ácido estearidónico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA) o una combinación de dos o más de los mismos. Preferiblemente, la extensión del aumento es como se define en la Característica (i).
En una forma de realización del segundo aspecto, la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, es una parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo o semilla, respectivamente, que no es no transgénica. En una forma de realización preferida, la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, es del mismo cultivar, cepa o variedad pero carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos . En una forma de realización preferida adicional, la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, se encuentra en la misma etapa del desarrollo, por ejemplo, la floración, que la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan entre aproximadamente en el momento de la floración y aproximadamente el comienzo de la senescencia. En otra forma de realización, la semilla se cosecha cuando las plantas tienen al menos 1 mes de vida aproximadamente.
En una forma de realización, una parte del organismo no humano es una semilla y el contenido total de aceite o el contenido de ácidos grasos totales, de la semilla es de al menos entre un 0,5% y un 25%, o entre al menos un 1,0% y un 24%, mayor en base al peso que la correspondiente semilla que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos.
En una forma de realización, el contenido relativo de DAG en el aceite de semillas es al menos un 10%, al menos un 10,5%, al menos un 11%, al menos un 11,5%, al menos un 12%, al menos un 12,5%, al menos un 13%, al menos un 13,5%, al menos un 14%, al menos un 14,5%, al menos un 15%, al menos un 15,5%, al menos un 16%, al menos un 16,5%, al menos un 17%, al menos un 17,5%, al menos un 18%, al menos un 18,5%, al menos un 19%, al menos un 19,5%, al menos un 20%, mayor en una base relativa que en el aceite de semillas de la correspondiente semilla. En una forma de realización, el contenido de DAG de la semilla está aumentado en una cantidad definida en la Característica (i) y la semilla es de un género y/o una especie definida en la Característica (ii).
En una forma de realización, el contenido relativo de TAG en la semilla es al menos un 5%, al menos un 5,5%, al menos un 6%, al menos un 6,5%, al menos un 7%, al menos un 7,5%, al menos un 8%, al menos un 8,5%, al menos un 9%, al menos un 9,5%, al menos un 10%, o al menos un 11% mayor en una base absoluta con relación a la correspondiente semilla. En una forma de realización, el contenido de TAG de la semilla está aumentado en una cantidad definida en la Característica (i) y la semilla es de un género y/o una especie definida en la Característica (ii).
En otra forma de realización, la parte del organismo no humano es una parte vegetativa de una planta y el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG o MAG de la parte vegetativa de la planta es al menos un 10%, al menos un 11%, al menos un 12%, al menos un 13%, al menos un 14%, al menos un 15%, al menos un 16%, al menos un 17%, al menos un 18%, al menos un 19%, al menos un 20%, al menos un 21%, al menos un 22%, al menos un 23%, al menos un 24%, al menos un 25%, al menos un 30% al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 100% mayor en una base relativa que el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG o MAG de una correspondiente parte vegetativa de la planta que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos. En una forma de realización preferida, el MAG es 2-MAG. En una forma de realización, el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG en la parte vegetativa de una planta se determina a partir de la cantidad de estos componentes lipidíeos en los lípidos que se pueden extraer de la parte vegetativa de la planta. En una forma de realización adicional, el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG o MAG de la parte vegetativa de la planta transgénica está aumento en una cantidad definida en la Característica (i) · En una forma de realización, al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% ( %mol ) o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol), más preferiblemente al menos un 66% (%mol), al menos un 67% (%mol), al menos un 68% (Imol) , al menos un 69% (%mol) o al menos un 70% (%mol) del contenido de ácidos grasos en el contenido total de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, o de lipidos o aceite extraídos del mismo, preferiblemente de la fracción TAG, es ácido oleico. Dichos elevados contenidos de oleico son preferidos para su uso en las aplicaciones de biodiésel .
En otra forma de realización, el contenido de PUFA de la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo o semilla, está aumentado (por ejemplo, en la presencia de un MGAT ) o disminuido (por ejemplo, en la ausencia de un MGAT) cuando se compara con la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla. En este contexto, el contenido de PUFA incluye PUFA esterificado (incluyendo TAG, DAG, etc.) y PUFA no esterificado. En una forma de realización, el contenido de PUFA de la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo o semilla, preferiblemente se determina a partir de la cantidad de PUFA en los lipidos que se pueden extraer de la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo o semilla. La extensión del aumento en el contenido de PUFA puede ser como se definió en la Característica (i). El contenido de PUFA puede comprender EDA, ARA, ALA, SDA, ETE, ETA, EPA, DPA, DHA o una combinación de dos o más de los mismos .
En otra forma de realización, el nivel de un PUFA en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, o de lipido o de aceite extraídos de los mismos está aumentado o disminuido en comparación con la correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, o los lipidos o aceites extraídos de los mismos. El PUFA puede ser EDA, ARA, ALA, SDA, ETE, ETA, EPA, DPA, DHA o una combinación de dos o más de los mismos. La extensión del aumento de PUFA puede ser como se definió en la Característica (i).
En otra forma de realización, el nivel de un ácido graso en los lipidos o el aceite extraídos está aumento cuando se compara con el lipido extraído de la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla y en donde el ácido graso comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente. La extensión del aumento de ácidos grasos puede ser como se definió en la Característica (i).
En una forma de realización, el nivel de dichos uno o más lipidos no polares (tales como TAG, DAG, TAG y DAG, MAG, PUFA o un PUFA específico o un ácido graso específico) y/o el contenido total de lipidos no polares se puede determinar mediante análisis usando cromatografía gaseosa de los metilésteres de ácidos grasos obtenidos de los lipidos extraídos. Hay métodos alternativos para determinar cualquiera de estos contenidos que son conocidos en el arte, e incluyen métodos que no requieren de la extracción de lipidos del organismo o de una parte del mismo, por ejemplo, un análisis mediante resonancia infrarroja cercana (NIR) o resonancia magnética nuclear (NMR) .
En una forma de realización adicional, el nivel de dichos uno o más lipidos no polares y/o el contenido total de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, es al menos 0,5% mayor en una base de peso seco o una base de peso de las semillas y/o al menos un 1% mayor en una base relativa, preferiblemente al menos un 1% o 2% mayor en una base de peso seco o base de peso de las semillas, que una correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos pero que comprende un polinucleótido exógeno que codifica un DGAT1 de Arabidopsis thaliana [ SEQ ID N°: 83).
En otra una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o una parte del mismo, o semilla comprende además (i) una o más mutaciones introducidas, y/o (ii) un polinucleótido exógeno que subregula la producción y/o la actividad de una enzima endógena de la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o una parte del mismo, donde la enzima endógena se selecciona entre una ácido graso aciltransferasa tal como un DGAT, sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa (sn-1 GPAT), 1-acil-glicerol-3-fos fato aciltransferasa (LPAAT), acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferasa (LPCAT), ácido fosfatidico fosfatasa (PAP), una enzima relacionada con la biosintesis de almidón tal como (ADP ) -glucosa pirofosforilasa (AGPasa), un ácido graso desaturasa tal como una 012 ácido graso desaturasa ( FAD2 ) , un polipéptido relacionado con la degradación de lipidos y/o que reduce el contenido de lipidos tal como una lipasa tal como el polipéptido CGÍ58 o SUGAR-DEPENDENT1 triacilglicerol lipasa, o una combinación de dos o más de las mismas. En una forma de realización alternativa, la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano, o una parte del mismo, no comprende el punto (i) anterior, o no comprende el punto (ii) anterior o no comprende el punto (i) anterior y no comprende el punto (ii) anterior. En una forma de realización, el polinucleótido exógeno que subregula la producción de AGPasa no es el polinucleótido divulgado en Sanj aya et al. (2011). En una forma de realización, los polinucleótidos exógenos en la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, no consiste de un polinucleótido exógeno que codifica un WRI1 y un polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhiba la expresión de un gen que codifica una AGPasa.
En el proceso de ya sea el primer o segundo aspectos, la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, o los lípidos o el aceite extraídos, se definen además en las formas de realización preferidas. Por ello, en una forma de realización, se aplica una o más o todas las siguientes características (i) el ácido oleico comprende al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% (%mol), o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol) o al menos un 66% ( %mol ) del contenido de ácidos grasos totales en los lípidos no polares o el aceite en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semilla, ii) el ácido oleico comprende al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% ( %mol ) , o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol) o al menos un 66% (%mol) del contenido de ácidos grasos totales en los lipidos o el aceite extraídos, (iü) los lipidos no polares o el aceite en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, comprenden ácidos grasos que comprenden un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, y (iv) los lipidos o el aceite extraídos comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente. La composición de ácidos grasos en esta forma de realización se mide antes de efectuar cualquier modificación de la composición de ácidos grasos, tal como, por ejemplo, por fraccionamiento de los lipidos o del aceite extraídos para alterar la composición de ácidos grasos. En formas de realización preferidas, la extensión del aumento es como se define en la Característica (i).
En una forma de realización, el nivel de un lípido en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla y/o en los lipidos o el aceite extraídos se puede determinar mediante análisis que emplea cromatografía gaseosa de los metilésteres de ácidos grasos preparados a partir de los lipidos o del aceite extraídos. El método de análisis preferiblemente es como se describe en el Ejemplo 1 de la presente.
Nuevamente, con respecto a ya sea el primer o segundo aspectos, la invención provee uno o más polinucleótidos exógenos en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla usados en el proceso. Por ello, en una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un ARN o preferiblemente un polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en una parte vegetativa de una planta, o un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respectivamente, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido relacionado con la biosintesis de uno o más lipidos no polares, en donde cada uno entre el primer y el segundo polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una parte vegetativa de una planta, o un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respectivamente. Es decir, el primer y segundo polinucleótidos exógenos codifica diferentes factores que juntos proporcionan el aumento del contenido de lipidos no polares en la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla.
El aumento preferiblemente es aditivo, más preferiblemente sinérgico, con relación a la presencia del primer o segundo polinucleótido exógeno solo. Los factores codificados por el primer y segundo polinucleótidos funcionan mediante diferentes mecanismos. Preferiblemente, el polipéptido de un factor de transcripción aumenta la disponibilidad de sustratos para la síntesis de lipidos no polares, tal como, por ejemplo, un aumento de glicerol-3-fosfato y/o de ácidos grasos preferiblemente en la forma de acil-CoA, por aumento de la expresión de genes, por ejemplo de al menos 5 o al menos 8 genes, relacionados con la glicólisis o la biosíntesis de ácidos grasos (tal como, pero en un sentido no limitativo, una o más entre ACCasa, transportadores de sacarosa (SuSy, invertasas de la pared celular), cetoacil sintasa (KAS), fosfofructoquinasa (PFK), piruvato quinasa (P ) (por ejemplo, (At5g52920, At3g22960), piruvato deshidrogenasa, transportadores de hexosa (por ejemplo, GPT2 y PPT1), fructoquinasa citosólica, fosfoglicerato mutasa citosólica, enoil-ACP reductasa (At2g05990) y fosfoglicerato mutasa (Atlg22170) ) preferiblemente más que un gen por cada categoría. En una forma de realización, el primer polinucleótido exógeno codifica un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), un factor de transcripción Leafy Cotyledon 1 (Lecl), un factor de transcripción Leafy Cotyledon 2 (Lec2), un factor de transcripción Fus3, un factor de transcripción ABI3, un factor de transcripción Dof4, un factor de transcripción BABY BOOM (BBM) o un factor de transcripción Dofll. En una forma de realización, el LEC2 no es un LEC2 de Arabidopsis . Como parte de esta forma de realización, o por separado, el segundo polinucleótido exógeno puede codificar un polipéptido que tiene actividad de una ácido graso aciltransferasa, por ejemplo, actividad monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT) y/o actividad diacilglicerol aciltransferasa ( DGAT ) o actividad glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) . En una forma de realización, el DGAT no es un DGAT de Arabidopsis.
En una forma de realización preferida, la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, del primer o segundo aspectos de la invención comprende dos o más polinucleótidos exógenos, uno de los cuales codifica un polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosintesis de ácidos grasos en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, tal como un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), y un segundo que codifica un polipéptido relacionado con la biosintesis de uno o más lípidos no polares tal como un DGAT.
En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, del primer o segundo aspectos de la invención pueden comprender además un tercer, o más, polinucleótidos exógenos. El tercer, o más, polinucleótidos exógenos puede codificar uno o más o cualquier combinación de: i) otro ARN o polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosintesis de ácidos grasos en un organismo no humano, o una parte del mismo, (por ejemplo, si el primer polinucleótido exógeno codifica un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), el tercer polinucleótido exógeno puede codificar un factor de transcripción LEC2 o BBM (preferiblemente, la expresión de LEC2 o BBM es controlada por un promotor inducible o un promotor que no da como resultado niveles elevados expresión de un transgen), ii) otro ARN o polipéptido relacionado con la biosíntesis de uno o más lipidos no polares (por ejemplo, si el segundo polinucleótido exógeno codifica un DGAT, el tercer polinucleótido exógeno puede codificar un MGAT o GPAT, o puede haber otros dos polinucleótidos exógenos que codifican un MGAT y un GPAT ) , iii) un polipéptido que estabiliza dichos uno o más lipidos no polares, preferiblemente una oleosina, tal como una polioleosina o una caleosina, más preferiblemente una polioleosina, iv) una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica un polipéptido relacionado con la biosíntesis de almidón tal como un polipéptido AGPasa, v) una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica un polipéptido relacionado con la degradación de lipidos y/ o que reduce el contenido de lipidos tal como una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58 o una SUGAR-DEPENDENTl triacilglicerol lipasa, o vi) un polipéptido supresor de silenciamiento, en donde el tercer, o más, polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de polinucleótidos en una. parte vegetativa de una planta, o un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respectivamente.
En la presente, se muestran numerosas combinaciones de genes específicos que son efectivas para aumentar el contenido de lípidos no polares. Por ello, con respecto al proceso de ya sea el primer o segundo aspectos de la invención, en una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, comprende uno o más polinucleótidos exógenos que codifican: i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1) y un DGAT, ii) un factor de transcripción WRI1 y un DGAT y una oleosina , iii) un factor de transcripción WRI1, un DGAT, un MGAT y una oleosina, iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT), v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) un MGAT y una glicerol-3-fosfato aci ltrans ferasa ( GPAT ) , vii) un MGAT y un DGAT, viii) un MGAT, un GPAT y un DGAT, ix) un factor de transcripción WRIl y un MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, un DGAT y un MGAT, xi) un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT, una oleosina y un GPAT, xii) un DGAT y una oleosina, o xiii) un MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor de silenciamiento, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión de polinucleótidos en una parte vegetativa de una planta, o un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respectivamente. Preferiblemente, dichos uno o más polinucleótidos exógenos están integrados de manera estable en el genoma de la parte vegetativa de la planta o del organismo no humano o de una parte del mismo, o de la semilla, y más preferiblemente están presentes en un estado homocigota. El polinucleótido puede codificar una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de una enzima natural de origen, por ejemplo, vegetal, de levadura o animal. Además, el polinucleótido puede codificar una enzima que tiene una o más mutaciones conservadoras en comparación con la enzima natural .
En una forma de realización, (i) el GPAT también tiene actividad fosfatasa para producir MAG, tal como un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de GPAT4 o GPAT6 de Arabidopsís, y/o (ii) el DGAT es un DGAT1 o un DGAT2, y/o (iii) el MGAT es un MGAT1 o un MGAT2.
En una forma de realización preferida, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1 y un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1.
En otra forma de realización preferida, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, y un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno cue codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGA 1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, un quinto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un sexto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización, la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2. Preferiblemente, la semilla comprende además un quinto polinucleotido exógeno que codifica un GPAT.
Cuando fuera relevante, en lugar de un polinucleotido que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, tiene una o más mutaciones introducidas en el gen de lipasa tal como un gen CGÍ58 que confiere niveles reducidos del polipéptido de lipasa en comparación con una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que no contiene a la mutación.
En una forma de realización preferida, los polinucleotidos exógenos que codifican el DGAT y la oleosina están ligados operativamente a un promotor constitutivo, o un promotor activo en los te idos verdes de una planta por lo menos antes y hasta la floración, que sea capaz de dirigir la expresión de polinucleotidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla. En una forma de realización preferida adicional, el polinucleótido exógeno que codifica WRI1, y la molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, está ligado operativamente a un promotor constitutivo, un promotor activo en tejidos verdes de una planta por lo menos antes y hasta la floración, o un promotor inducible, que sea capaz de dirigir la expresión de polinucleotidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo o la semilla. En otra una forma de realización preferida adicional, los polinucleotidos exógenos que codifican LEC2, BBM y/o MGAT2 están ligados operativamente a un promotor inducible capaz de dirigir la expresión de polinucleotidos en la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o de la semilla.
En cada una de las formas de realización anteriores, los polinucleótidos se pueden proveer como moléculas separadas o se pueden proveer como una sola molécula contigua, tal como en una sola molécula de ADN-T. En una forma de realización, la orientación de la transcripción de por lo menos un gen en la molécula de ADN-T es opuesta a la orientación de la transcripción de al menos un gen adicional en la molécula de ADN-T.
En cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente una ho a de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p de peso seco). En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lípidos no polares es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, entre un 10% y un 15%, entre un 15% y un 20%, entre un 20% y un 25%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco o de peso de las semillas. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
Aún más, en cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de TAG de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente una ho de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente o más preferiblemente al menos un 17% aproximadamente (p/p de peso seco). En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de TAG es de entre un 5% y un 30%, entre un 7% y un 30%, entre un 10% y un 30%, entre un 12% y un 30%, entre un 15% y un 30%, entre un 7% y un 30%, entre un 10% y un 30%, entre un 20% y un 28%, entre un 18% y un 25%, entre un 22% y un 30%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco o de peso de semillas. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
Aún más, en cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de lipidos de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente una ho a de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 17% aproximadamente (p/p de peso seco), más preferiblemente al menos un 20% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 25% aproximadamente. En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lipidos es de entre un 5% y un 35%, entre un 7% y un 35%, entre un 10% y un 35%, entre un 12% y un 35%, entre un 15% y un 35%, entre un 7% y un 35%, entre un 10% y un 20%, entre un 18% y un 28%, entre un 20% y un 28%, entre un 22% y un 28%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente, un 22% aproximadamente o un 25% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco. Típicamente, el contenido total de lipidos de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano, o una parte del mismo, es aproximadamente un 2-3% mayor que el contenido de lipidos no polares. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una hoja (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente la parte vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGATl, un tercer polinucleótido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, presenta una o más o todas las siguientes características: i) un contenido de lípidos totales de al menos un 8%, al menos un 10%, al menos un 12%, al menos un 14% o al menos un 15,5% (% en peso), ii) un contenido de lípidos totales al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces o al menos 10 veces, mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, iii) un contenido total de TAG de al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 6,5% o al menos un 7% (% en peso de peso seco o de peso de semillas), iv) un contenido total de TAG al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces o al menos 70 veces o al menos 100 veces, mayor con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, v) ácido oleico que comprende al menos un 15%, al menos un 19% o al menos un 22% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) un nivel de ácido oleico en TAG al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 17 veces mayor con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, vii) ácido palmitico que comprende al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30% o al menos un 33% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) un nivel al menos 1,5 veces mayor de ácido palmitico en TAG con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, ix) ácido linoleico que comprende al menos un 22%, al menos un 25%, al menos un 30% o al menos un 34% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, x) ácido Ll-linolénico que comprende menos que un 20%, menos que un 15%, menos que un 11% o menos que un 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, y xi) un nivel de ácido Ll-linolénico en TAG al menos 5 veces o al menos 8 veces menor con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos. En esta forma de realización, preferiblemente la parte vegetativa de la planta presenta al menos las características, i), ii) iii), iv), i) y ii), i) y iii), i) y iv), i) a iii), i), iii) y iv) , i) a iv) , ii) y iii), ii) y iv) , ii) a iv) o iii) y iv) - En una forma de realización, el % en peso seco es el % en peso seco de las ho as.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente la parte vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla presenta una o más o todas las siguientes características: i) un contenido total de TAG de al menos un 10%, al menos un 12,5%, al menos un 15% o al menos un 17% (% en peso de peso seco o de peso de semillas), ii) un contenido total de TAG al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces o al menos 70 veces o al menos 100 veces mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, iü) ácido oleico que comprende al menos un 19%, al menos un 22% o al menos un 25% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, iv) un nivel de ácido oleico en TAG al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 19 veces mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, v) ácido palmitico que comprende al menos un 20%, al menos un 25% o al menos un 28% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) un nivel de ácido palmitico en TAG al menos 1,25 veces mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, vii) ácido linoleico que comprende al menos un 15%, o al menos un 20% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) D-linolénico ácido que comprende menos que un 15%, menos que un 11% o menos que un 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, y ix) un nivel de D-linolénico ácido en TAG al menos 5 veces, o al menos 8 veces menor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos.
En esta forma de realización, preferiblemente la parte vegetativa de la planta presenta por lo menos las características i), ii) o i) y ii). En una forma de realización, el % en peso seco es el ¾ en peso seco de las hoj as .
Preferiblemente, las características definidas para las dos formas de realización anteriores son en la etapa de floración de la planta.
En una forma de realización alternativa, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, consiste de uno o más polinucleótidos exógenos que codifican un DGAT1 y un LEC2.
En una forma de realización preferida, el polinucleótido exógeno que codifica WRIl comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 231 a 278, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 279 a 337, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) nucleótidos que se hibridizan con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas.
En una forma de realización preferida, el polinucleótido exógeno que codifica DGAT comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 204 a 211, 338 a 346, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 83, 212 a 219, 347 a 355, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que se hibridiza con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas.
En otra forma de realización preferida, el polinucleótido exógeno que codifica MGAT comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N° : 1 a 44 , ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las S5Q ID N°: 45 a 82, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que se hibridiza con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas.
En otra forma de realización preferida, el polinucleótido exógeno que codifica GPAT comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 84 a 143, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N° : 144 a 203, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que se hibridiza con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas.
En otra forma de realización preferida, el polinucleótido exógeno que codifica DGAT2 comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 204 a 211, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 212 a 219, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que se hibridiza con cualquiera de i ) a iii) bajo condiciones severas.
En otra forma de realización preferida, el polinucleótido exógeno que codifica una oleosina comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 389 a 408, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N° : 362 a 388, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con cualquiera de i ) a iii) bajo condiciones severas.
En una forma de realización, el polipéptido CGÍ58 comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 422 a 428, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 429 a 436, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con cualquiera de i ) a iii) bajo condiciones severas.
En otra forma de realización, el polinucleotido exógeno que codifica LEC2 comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 437 a 439, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 442 a 444 , o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con cualquiera de i ) a iii) bajo condiciones severas.
En una forma de realización adicional, el polinucleótido exógeno que codifica BBM comprende uno o más de los siguientes: i) nucleótidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 440 a 441 ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se muestra en cualquiera de las SEQ ID N°: 445 o 446, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos un 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas.
Claramente, las secuencias preferidas de una forma de realización pueden combinarse con las secuencias preferidas de otra forma de realización y más ventajosamente, combinarse además con una secuencia preferida de aún otra forma de realización.
En una forma de realización, dichos uno o más polinucleótidos exógenos codifican un MGAT y/o DGAT y/o GPAT mutante. Por ejemplo, dichos uno o más polinucleótidos exógenos pueden codificar un MGAT y/o un DGAT y/o un GPAT que contienen una, o más de una, sustituciones de aminoácidos conservadoras como se muestra a modo de ejemplo en la Tabla 1 con relación a un MGAT y/o DGAT y/o GPAT de tipo salvaje definido por un SEQ ID N° en la presente. Preferiblemente, el polipeptido mutante tiene una actividad equivalente o mayor con relación al polipéptido no mutante.
En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un MGAT y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un GPAT. El primer y segundo polinucleotidos se pueden proveer como moléculas separadas o se pueden proveer como una sola molécula contigua, tal como en una sola molécula de ADN-T. En una forma de realización, la orientación de la transcripción de por lo menos un gen en la molécula de ADN-T es opuesta a la orientación de la transcripción de al menos un gen adicional en la molécula de ADN-T. En una forma de realización preferida, el GPAT es un GPAT que tiene actividad fosfatasa tal como un GPAT4 o GPAT6 de Arabidopsis . El GPAT que tiene actividad fosfatasa cataliza la formación de MAG a partir de G-3-P (es decir, acila a la G-3-P para formar LPA y subsiguientemente elimina un grupo fosfato para formar MAG) en el organismo no humano o una parte del mismo. El MGAT cataliza luego la formación de DAG en el organismo no humano, o una parte del mismo, por acilación de MAG con un grupo acilo derivado de acilo graso-CoA. El MGAT, tal como el MGAT1 de A. thaliana, también puede catalizar la formación de TAG en el organismo no humano, o una parte del mismo, si también tiene actividad DGAT.
La parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, puede comprender un tercer polinucleótido exógeno que codifica, por ejemplo, un DGAT. El primer, segundo y tercer polinucleotidos se pueden proveer como moléculas separadas o se pueden proveer como una sola molécula contigua, tal como en una sola molécula de ADN-T. El DGAT cataliza la formación de TAG en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla transgénica por acilación de DAG (preferiblemente producido por la vía MGAT) con un grupo acilo derivado de acilo graso-CoA. En una forma de realización, la orientación de la transcripción de por lo menos un gen en la molécula de ADN-T es opuesta a la orientación de la transcripción de al menos un gen adicional en la molécula de ADN-T.
En otra forma de realización, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un MGAT y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT. El primer y segundo polinucleótidos se pueden proveer como moléculas separadas o se pueden proveer como una sola molécula contigua, tal como en una sola molécula de ADN-T. En una forma de realización, la orientación de la transcripción de por lo menos un gen en la molécula de ADN-T es opuesta a la orientación de la transcripción de al menos un gen adicional en la molécula de ADN-T. La parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, puede comprender un tercer polinucleótido exógeno que codifica, por ejemplo, un GPAT, preferiblemente un GPAT que tiene actividad fosfatasa tal como un GPAT4 o GPAT6 de Arabidopsis. El primer, segundo y tercer polinucleótidos se pueden proporcionar como moléculas separadas o se pueden proveer como una sola molécula contigua .
Aún más, se puede subregular la actividad de un gen endógeno en la planta, parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla. Por ello, en una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, comprende uno o más entre: (i) una o más mutaciones introducidas en un gen que codifica una enzima endógena de la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, o (ii) un polinucleótido exógeno que subregula la producción y/o la actividad de una enzima endógena de la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, respectivamente, en donde cada enzima endógena se selecciona del grupo que consiste de una ácido graso aciltrans ferasa tal como DGAT, una sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa {sn-1 GPAT), una l-acil-glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa (LPAAT), una acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferasa (LPCAT), una ácido fosfatídico fosfatasa (PAP), una enzima relacionada con la biosintesis de almidón tal como (ADP) -glucosa pirofosforilasa (AGPasa), una ácido graso desaturasa tal como una D12 ácido graso desaturasa ( FAD2 ) , un polipéptido relacionado con la degradación de lipidos y/o que reduce el contenido de lipidos tal como una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58 o SUGAR-DEPENDENT1 triacilglicerol lipasa, o una combinación de dos o más de las mismas. En una forma de realización, el polinucleótido exógeno se selecciona del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, un polinucleótido orientado en el sentido del marco de lectura, un polinucleótido catalítico, un microARN, un polinucleótido que codifica un polipéptido que se une a enzima endógena, una molécula de ARN de cadena doble o una molécula de ARN procesada derivada de la misma. En una forma de realización, el polinucleótido exógeno que subregula la producción de AGPasa no es el polinucleótido divulgado en San aya et al. (2011) . En una forma de realización, los polinucleótidos exógenos en la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, no consiste de un polinucleótido exógeno que codifica un WRI1 y un • polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhiba la expresión de un gen que codifica una AGPasa.
El aumento del nivel de lipidos no polares es importante para las aplicaciones que comprenden ácidos grasos particulares. Por ello, en una forma de realización, los lipidos no polares totales, los lipidos o el aceite extraídos comprenden: (i) un lípido no polar que es TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG, y (ii) un PUFA específico que es EDA, ARA, SDA, ETE, ETA, EPA, DPA, DHA, donde dicho PUFA específico se encuentra a un nivel de al menos un 1% del contenido de ácidos grasos totales en los lipidos no polares, o una combinación de dos o más de los PUFA específicos, o (iii) un ácido graso presente a un nivel de al menos un 1% del contenido de ácidos grasos totales en los lipidos no polares y que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente.
En un tercer aspecto, la invención provee organismos no humanos, preferiblemente plantas, o partes de las mismas, tal como partes vegetativas de plantas o semillas, que son de utilidad en los procesos del primer y segundo aspectos o en otros aspectos que se describen de aquí en adelante. Cada una de las características en las formas de realización descritas para el primer y segundo aspectos se puede aplicar mutatis mutandís a los organismos no humanos, preferiblemente plantas, o partes de las mismas, tales como partes vegetativas de las plantas o semilla del tercer aspecto. Se destacan las siguientes formas de realización particulares.
En una forma de realización del tercer aspecto, la invención provee una planta que comprende una parte vegetativa, o la parte vegetativa de la misma, en donde dicha parte vegetativa tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p de peso seco). En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lípidos no polares es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente, o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcenta e de peso seco. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja gue tiene un área superficial de al menos un 1 cm2. En una forma de realización adicional, los lipidos no polares comprende al menos un 90% de triacilgliceroles (TAG). Preferiblemente la planta es fértil, morfológicamente normal y/o de utilidad agronómica. Las semillas de las plantas germinan preferiblemente a una velocidad sustancialmente igual que en el caso de una correspondiente planta de tipo salvaje. Preferiblemente, la parte vegetativa es una hoja o un tallo, o una combinación de ambos, o una raíz o un tubérculo tal como, por ejemplo, los tubérculos de papa.
En otra forma de realización, el organismo no humano, preferiblemente una planta, o una parte de la misma tal como una parte vegetativa de la planta o una semilla, comprende uno o más polinucleotidos exógenos definidos en la presente y tiene un mayor nivel de dichos uno o más lípidos no polares y/o el contenido total de lipidos no polares que es al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces o al menos 12 veces, preferiblemente al menos 13 veces aproximadamente o al menos 15 veces aproximadamente mayor en una base relativa que un correspondiente organismo no humano, preferiblemente una planta, o una parte de la misma, tal como una parte vegetativa de la planta o una semilla, que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos.
En una forma de realización, la invención provee una planta de cañóla que comprende semillas de cañóla cuyo contenido de aceite comprende al menos un 45% en base al peso. Preferiblemente, la planta de cañóla o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de maíz que comprende semillas de maíz cuyo contenido de aceite comprende al menos un 5% en base al peso. Preferiblemente, la planta de maíz o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de soja que comprende semillas de soja cuyo contenido de aceite comprende al menos un 20% en base al peso. Preferiblemente, la planta de soja o su semilla presenta las ' características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de lupino que comprende semillas de lupino cuyo contenido de aceite comprende al menos un 10% en base al peso. Preferiblemente, la planta de lupino o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de maní que comprende maníes cuyo contenido de aceite comprende al menos un 50% en base al peso. Preferiblemente, la planta de maní o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención .
En una forma de realización, la invención provee una planta de girasol que comprende semillas de girasol cuyo contenido de aceite comprende al menos un 50% en base al peso. Preferiblemente, la planta de girasol o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de algodón que comprende semillas de algodón cuyo contenido de aceite comprende al menos un 41% en base al peso. Preferiblemente, la planta de algodón o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de alazor que comprende semillas de alazor cuyo contenido de aceite comprende al menos un 35% en base al peso. Preferiblemente, la planta de alazor o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de lino que comprende semillas de lino cuyo contenido de aceite comprende al menos un 36% en base al peso. Preferiblemente, la planta de lino o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la invención provee una planta de Camelina sativa que comprende semillas de Ca elína sativa cuyo contenido de aceite comprende al menos un 36% en base al peso. Preferiblemente, la planta de Camelina sativa o su semilla presenta las características que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En formas de realización, las plantas se pueden definir además por las Características (i), (ii) y (iii) descritas precedentemente. En una forma de realización preferida, la planta o la parte vegetativa comprende una o más o todas las siguientes características: (i) ácido oleico en la parte vegetativa o semilla de la planta, donde el ácido oleico se encuentra en una forma esterificada o no esterificada, en donde al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% (%mol), o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol) o al menos un 66% (%mol) de los ácidos grasos totales en el contenido de lípidos de la parte vegetativa o semilla es ácido oleico, (ii) ácido oleico en la parte vegetativa o semilla de la planta, donde dicho ácido se encuentra en una forma esterificada en los lípidos no polares, en donde al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% (%mol), o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol) o al menos un 66% (%mol) de los ácidos grasos totales en el contenido de lípidos no polares de la parte vegetativa o semilla es ácido oleico, (iii) un ácido graso modificado en la parte vegetativa o la semilla de la planta, donde el ácido graso modificado se encuentra en una forma esterificada o no esterificada, preferiblemente en una forma esterificada en los lipidos no polares de la parte vegetativa o la semilla, en donde el ácido graso modificado comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, y (iv) ceras y/o esteres de ceras en los lipidos no polares de la parte vegetativa o semilla de la planta.
En una forma de realización, la planta o la parte vegetativa de la planta es un miembro de una población o colección de al menos aproximadamente 1000 de tales plantas o partes. Es decir, cada planta o parte de planta en la población o colección tiene esencialmente las mismas propiedades o comprende a los mismos ácidos nucleicos exógenos que los demás miembros de dicha población o colección. Preferiblemente, las plantas son homocigotas para los polinucleótidos exógenos, que proveen un grado de uniformidad. Preferiblemente, las plantas crecen en un campo. La colección de partes vegetativas de plantas preferiblemente fue cosechada de plantas que crecen en un campo. Preferiblemente, las partes vegetativas de las plantas fueron cosechadas en el momento cuando el rendimiento de lipidos no polares se encuentran en su punto máximo. En una forma de realización, las partes vegetativas de las plantas fueron cosechadas aproximadamente en el momento de la floración. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan cuando las plantas tienen al menos 1 mes de vida aproximadamente. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan entre aproximadamente en el momento de la floración y aproximadamente el comienzo de la senescencia. En otra forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan al menos 1 mes aproximadamente después de inducir la expresión de genes inducibles.
En una forma de realización adicional del tercer aspecto, la invención provee una parte vegetativa de una planta, de un organismo no humano o de una parte del mismo, o semilla, que comprende uno o más polinucleótidos exógenos y un mayor nivel de uno o más lipidos no polares con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleotido en una parte vegetativa de una planta, de un organismo no humano o una parte del mismo, o de una semilla y en donde se aplica una o más o todas las siguientes características: (i) dichos uno o más polinucleótidos exógenos comprenden un primer polinucleotido exógeno que codifica un ARN o polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en una parte vegetativa de una planta, de un organismo no humano o de una parte del mismo, o de una semilla y un segundo polinucleotido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido relacionado con la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, (ii) si el organismo no humano es una planta, una parte vegetativa de la planta tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p de peso seco ) , (iii) el organismo no humano es un alga seleccionado del grupo que consiste de diatomeas (bacilariofitas ) , algas verdes ( clorofitas ) , algas verdiazules ( cianofitas ) , algas pardo-amarillentas ( crisofitas ) , haptofitas, algas marrones o pardas y algas heterocontas, (d) dichos lipidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera entre dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, (v) la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, comprende ácido oleico en una forma esterificada o no esterificada en sus lipidos, en donde al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% (%mol) o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol) o al menos un 66% (%mol) de los ácidos grasos totales en el lipido de la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o de la semilla es ácido oleico, (vi) la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla comprende ácido oleico en una forma esterificada en sus lipidos no polares, en donde al menos un 20% (%mol), al menos un 22% (%mol), al menos un 30% (%mol), al menos un 40% (%mol), al menos un 50% (%mol), o al menos un 60% (%mol), preferiblemente al menos un 65% (%mol) o al menos un 66% (%mol) de los ácidos grasos totales en los lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o de una parte del mismo, o de una semilla es ácido oleico, . (vii) el contenido de ácidos grasos totales en el lipido de la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o de una semilla comprende al menos un 2% más ácido oleico y/o al menos un 2% menos de ácido palmítico que el lipido en la correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos, y/o (viii) el contenido de ácidos grasos totales en los lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, comprende al menos un 2% más ácido oleico y/o al menos un 2% menos de ácido palmítico que los lipidos no polares en la correspondiente parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o de una semilla que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos, (ix) los lipidos no polares comprenden un nivel modificado de esteróles totales, preferiblemente esteróles libres, esteroil ésteres y/o esteroil glicosidos, (x) los lipidos no polares comprenden ceras y/o ésteres de ceras, y (xi) el organismo no humano, o una parte del mismo, es un miembro de una población o colección de al menos aproximadamente 1000 de tales organismos no humanos o partes de los mismos.
En una forma de realización, dichos uno o más polinucleotidos exógenos comprenden al primer pol inucleótido exógeno y al segundo polinucleótido exógeno, y en donde se aplica una o más o todas las características (ii) a (xi) .
En una forma de realización del párrafo (ii) anterior, el contenido total de lipidos no polares es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, de un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
En formas de realización preferidas, el organismo no humano, o una parte del mismo, es una planta, un alga o un organismo adecuado para una fermentación, tal como un hongo. La parte del organismo no humano puede ser una semilla, una fruta o una parte vegetativa de una planta, tal como una parte aérea o una parte verde de la planta, tal como una ho a o un tallo. En otra forma de realización, la parte es una célula de un organismo multicelular. Con respecto a la parte del organismo no humano, la parte comprende al menos una célula del organismo no humano. En otras formas de realización preferidas, el organismo no humano, o una parte del mismo, se define además por las características que se definen en cualquiera de las formas de realización que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención, incluyendo pero en un sentido no limitativo las Características (i), (ii) y (iii), y los polinucleótidos exógenos o combinaciones de polinucleótidos exógenos definidos en cualquiera de las formas de realización que se describen en el primer y segundo aspectos de la invención.
En una forma de realización, la planta, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, comprende uno o más polinucleótidos exógenos que codifican: i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRIl) y un DGAT, ii) un factor de transcripción WRIl y un DGAT y una oleosina, iii) un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT y una oleosina, iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT), v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) un MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa (GPAT), vi i ) un MGAT y un DGAT , viii) un MGAT, un GPAT y un DGAT, ix) un factor de transcripción WRIl y un MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, un DGAT y un MGAT, xi) un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT, una oleosina y un GPAT, xii) un DGAT y una oleosina, o xiii) un MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor de silenciamiento, en donde cada polinucleótido exógeno está ligado operativamente a un promotor "capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una planta, una parte vegetativa de la planta, un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respectivamente. Dichos uno o más polinucleótidos exógenos pueden comprender nucleótidos cuya secuencia se define en la presente. Preferiblemente, la planta, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, es homocigota para dichos uno o más polinucleótidos exógenos. Preferiblemente, los polinucleótidos exógenos están integrados en el genoma de la planta, parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o de la semilla. Dichos uno o más polinucleótidos se pueden proveer como moléculas separadas o se pueden proveer como una sola . molécula contigua. Preferiblemente, los polinucleótidos exógenos están integrados en el genoma de la planta u organismo en un solo locus genético o en loci ligados genéticamente, más preferiblemente en el estado homocigota. Más preferiblemente, los polinucleótidos exógenos integrados están ligados genéticamente a un gen de un marcador de selección tal como un gen de gen de tolerancia a herbicidas.
En una forma de realización preferida, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno cue codifica un WRI1 y un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1.
En otra forma de realización preferida, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, y un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGA 2.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosína, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGATl, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGA 2.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, un quinto polinucleótido exogeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un sexto polinucleótido exogeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización, la semilla comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2. Preferiblemente, la semilla comprende además un quinto polinucleótido exógeno que codifica un GPAT.
Cuando fuera relevante, en lugar de un polinucleótido que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, tiene una o más mutaciones introducidas en el gen de lipasa tal como un gen CGÍ58 que confiere niveles reducidos del polipéptido de lipasa en comparación con una parte vegetativa de la planta, un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla isogénica, que no contiene a la mutación.
En una forma de realización preferida, los polinucleótidos exógenos que codifican el DGAT y la oleosina están ligados operativamente a un promotor cons itutivo, o un promotor activo en los tejidos verdes de una planta por lo menos antes y hasta la floración, que sea capaz de dirigir la expresión de polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla. En una forma de realización preferida adicional, el polinucleótido exógeno que codifica WRI1, y la molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, está ligado operativamente a un promotor constitutivo, un promotor activo en tejidos verdes de una planta por lo menos antes y hasta la floración, o un promotor inducible, que sea capaz de dirigir la expresión de polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo o la semilla. En otra una forma de realización preferida adicional, los polinucleótidos exógenos que codifican LEC2, BBM y/o MGAT2 están ligados operativamente a un promotor inducible capaz de dirigir la expresión de polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, del organismo no humano o una parte del mismo, o de la semilla.
En cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de lípidos no polares de la parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente una hoja de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p de peso seco o de peso de semillas). En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lipidos no polares es de entre un 5% y un 25%, entre un 7% y un 25%, entre un 10% y un 25%, entre un 12% y un 25%, entre un 15% y un 25%, entre un 7% y un 20%, entre un 10% y un 20%, entre un 10% y un 15%, entre un 15% y un 20%, entre un 20% y un 25%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco o de peso de las semillas. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
Aún más, en cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de TAG de la parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente una ho a de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente, o más preferiblemente al menos un 17% aproximadamente (p/p de peso seco o de peso de semillas). En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de TAG es de entre un 5% y un 30%, entre un 7% y un 30%, entre un 10% y un 30%, entre un 12% y un 30%, entre un 15% y un 30%, entre un 7% y un 30%, entre un 10% y un 30%, entre un 20% y un 28%, entre un 18% y un 25%, entre un 22% y un 30%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente o un 22% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco o de peso de semillas. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una ho a (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de hoja que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
Aún más, en cada una de las formas de realización anteriores, el contenido total de lipidos de la parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente una ho a de una planta o una parte de la misma, un tallo o un tubérculo, es al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 17% aproximadamente (p/p de peso seco o de peso de semillas), más preferiblemente al menos un 20% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 25% aproximadamente. En una forma de realización preferida adicional, el contenido total de lipidos es de entre un 5% y un 35%, entre un 7% y un 35%, entre un 10% y un 35%, entre un 12% y un 35%, entre un 15% y un 35%, entre un 7% y un 35%, entre un 10% y un 20%, entre un 18% y un 28%, entre un 20% y un 28%, entre un 22% y un 28%, un 10% aproximadamente, un 11% aproximadamente, un 12% aproximadamente, un 13% aproximadamente, un 14% aproximadamente, un 15% aproximadamente, un 16% aproximadamente, un 17% aproximadamente, un 18% aproximadamente, un 20% aproximadamente, un 22% aproximadamente, o un 25% aproximadamente, cada uno como un porcentaje de peso seco o de pesp de semillas. Típicamente, el contenido total de lipidos de la parte vegetativa de la planta, o de un organismo no humano, o una parte del mismo, es aproximadamente un 2-3% mayor que el contenido de lipidos no polares. En una forma de realización particularmente preferida, la parte vegetativa de la planta es una hoja (u hojas) o una porción de la misma. En una forma de realización más preferida, la parte vegetativa de la planta es una porción de ho a que tiene un área superficial de al menos un 1 cm2.
En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente la part.e vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGATl, un tercer polinucleótido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla, presenta una o más o todas las siguientes características: i) un contenido de lípidos totales de al menos un 8%, al menos un 10%, al menos un 12%, al menos un 14% o al menos un 15,5% (% en peso de peso seco o de peso de semillas), ii) un contenido de lípidos totales al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces o al menos 10 veces, mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, üi) un contenido total de TAG de al menos un 5%, al menos un 6%, al menos un 6,5% o al menos un 7% (% en peso de peso seco o de peso de semillas), iv) un contenido total de TAG al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces o al menos 70 veces o al menos 100 veces, mayor con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, v) ácido oleico que comprende al menos un 15%, al menos un 19% o al menos un 22% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) un nivel de ácido oleico en TAG al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 17 veces mayor con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u. organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, vii) ácido palmitico que comprende al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30% o al menos un 33% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) un nivel al menos 1,5 veces mayor de ácido palmitico en TAG con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleotidos exógenos, ix) ácido linoleico que comprende al menos un 22%, al menos un 25%, al menos un 30% o al menos un 34% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, x) ácido D-linolénico que comprende menos que un 20%, menos que un 15%, menos que un 11% o menos que un 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, y xi ) un nivel de ácido D-linolénico en TAG al menos 5 veces o al menos 8 veces menor con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos . En esta forma de realización, preferiblemente la parte vegetativa de la planta presenta al menos las características, i), ii) iii), iv) , i) y ii), i) y iii), i) y iv) , i) a iii), i), iii) y iv) , i) a iv) , ii) y iii), ii) y iv) , ii) a iv) o iii) y iv) . En una forma de realización, el % en peso seco es el % en peso seco de las hojas.
En una forma de realización adicional, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla, preferiblemente la parte vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno gue codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla presenta una o más o todas las siguientes características: i ) un contenido total de TAG de al menos un 10%, al menos un 12,5%, al menos un 15% o al menos un 17% (% en peso de peso seco o de peso de semillas), ii) un contenido total de TAG al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 60 veces o al menos 70 veces o al menos 100 veces mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, üi) ácido oleico que comprende al menos un 19%, al menos un 22% o al menos un 25% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, iv) un nivel de ácido oleico en TAG al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 17 veces o al menos 19 veces mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, v) ácido palmitico que comprende al menos un 20%, al menos un 25% o al menos un 28% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) un nivel de ácido palmitico en TAG al menos 1,25 veces mayor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos, vii) ácido linoleico que comprende al menos un 15%, o al menos un 20% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) D-linolénico ácido que comprende menos que un 15%, menos que un 11% o menos que un 8% (% en peso) de los ácidos grasos, en TAG, y ix) un nivel de D-linolénico ácido en TAG al menos 5 veces, o al menos 8 veces menor en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la correspondiente parte vegetativa de la planta u organismo no humano que no contiene a los polinucleótidos exógenos . En esta forma de realización, preferiblemente la parte vegetativa de la planta presenta por lo menos las características i), ii) o i) y ii). En una forma de realización, el % en peso seco es el % en peso seco de las hoj as .
Preferiblemente, las características definidas para las dos formas de realización anteriores son en la etapa de floración de la planta.
En un cuarto aspecto, la invención provee una semilla de una planta que tiene la capacidad de crecer hasta convertirse en una planta de la invención, o que se obtiene de una planta de la invención, por ejemplo un organismo no humano de la invención que es una planta. En una forma de realización, la semilla comprende uno o más polinucleótidos exógenos definidos en la presente.
En un quinto aspecto, la invención provee un proceso para obtener una célula con capacidad mejorada para producir uno o más lípidos no polares, donde dicho proceso comprende los pasos de: a) introducir en una célula uno o más polinucleótidos exógenos , b) expresar dichos uno o más polinucleótidos exógenos en la célula o una célula de la progenie de la misma, c) analizar el contenido de lipidos de la célula o la célula de la progenie, y d) seleccionar una célula o una célula de la progenie que tiene un mayor nivel de uno o más lipidos no polares con relación a una correspondiente célula o célula de la progenie que no contiene a los polinucleótidos exógenos, en donde dichos uno o más polinucleótidos exógenos codifican i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRIl) y un DGAT, ii) un factor de transcripción WRIl y un DGAT y una oleosina , iii) un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT y una oleosina, iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT) , v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) un MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa (GPAT) , vii ) un MGAT y un DGAT, viii) un MGAT, un GPAT y un DGAT, ix) un factor de transcripción WRIl y un MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, un DGAT y un MGAT, xi ) un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT, una oleosina y un GPAT, xii) un DGAT y una oleosina, o xiií) un MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor de silenciamiento, en donde cada polinucleótido exógeno está ligado operativamente a un promotor que tiene la capacidad para dirigir la expresión del polinucleótido exógeno en la célula o célula de la progenie.
En una forma de realización, la célula o la célula de la progenie seleccionada comprende: i) un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRIl y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1 , ii) un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRIl, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, y un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, iii) un primer polinucleótido exógeno que codifica un WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, iv) un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, v) un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, vi) un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, vii) un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exogeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleotido exogeno que codifica LEC2 o BBM, viii) un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, o ix) un primer polinucleotido exógeno que codifica un RI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, un quinto polinucleotido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2, y un sexto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
En una forma de realización adicional, la célula o la célula de la progenie seleccionada es una célula de una semilla de una planta y comprende un primer polinucleotido exógeno que codifica un WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica un DGAT, preferiblemente un DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica un MGAT, preferiblemente un MGAT2. Preferiblemente, la semilla comprende además un quinto polinucleótido exógeno que codifica un GPAT.
En una forma de realización preferida, dichos uno o más polinucleótidos exógenos están integrados de manera estable en el genoma de la célula o de la célula de la progenie.
En una' forma de realización preferida, el proceso comprende además un paso de regenerar una planta transgénica a partir de la célula o de la célula de la progenie que comprende dichos uno o más polinucleótidos exógenos. El paso de regenerar una planta transgénica se puede conducir antes del paso de expresar dichos uno o más polinucleótidos exógenos en la célula o una célula de la progenie de la misma, y/o antes del paso de analizar el contenido de lipidos de la célula o célula de la progenie, y/o antes del paso de seleccionar la célula o la célula de la progenie que tiene un mayor nivel de uno o más lipidos no polares. El proceso puede comprender además un paso de obtener una semilla o una planta de progenie a partir de la planta transgénica, en donde la semilla o la planta de la progenie comprende dichos uno o más polinucleótidos exógenos .
El proceso del quinto aspecto se puede usar como un ensayo de selección para determinar si un polipéptido codificado por un polinucleótido exógeno tiene la función deseada. Dichos uno o más polinucleótidos exógenos de este aspecto pueden comprender una secuencia como se definió previamente. Además, es posible que dichos uno o más polinucleótidos exógenos no sean conocidos antes del proceso de codificar un factor de transcripción WRIl y un DGAT, un factor de transcripción WRIl y un MGAT, un factor de transcripción WRIl, un DGAT y un MGAT, un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT y una oleosina, un factor de t anscripción WRIl, un DGAT, un MGAT, una oleosina y un GPAT, un factor de transcripción WRIl, un DGAT y una oleosina, un DGAT y una oleosina, o un MGAT y una oleosina, sino que sean candidatos para ello. Por ello, el proceso se puede usar como un ensayo para identificar o seleccionar polinucleótidos que codifican un factor de transcripción WRIl y un DGAT, un factor de transcripción WRIl y un MGAT, un factor de transcripción WRIl, un DGAT y un MGAT, un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT y una oleosina, un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT, una oleosina y un GPAT, un factor de transcripción WRIl, un DGAT y una oleosina, un DGAT y una oleosina o un MGAT y una oleosina.
Los polinucleotidos candidatos se introducen en una célula y los productos se pueden analizar para determinar si los candidatos tienen la función deseada.
En un sexto aspecto, la invención provee una célula transgénica o una planta transgénica obtenida usando un proceso de la invención, o una parte vegetativa de una planta o una semilla obtenida de la misma que comprende a dichos uno o más polinucleotidos exógenos .
En un séptimo aspecto, la invención provee el uso de uno o más polinucleotidos que' codifican, o una construcción genética que comprende polinucleótidos que codifican: i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1) y un DGAT, ii) un factor de transcripción WRI1 y un DGAT y una oleosina, iii) un factor de transcripción WRI1, un DGAT, un MGAT y una oleosina, iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT), v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) un MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa ( GPAT ) , vii) un MGAT y un DGAT, viii) un MGAT, un GPAT y un DGAT, ix) un factor de transcripción WRI1 y un MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, un DGAT y un MGAT, xi ) un factor de transcripción WRIl, un DGAT, un MGAT, una oleosina y un GPAT, xii) un DGAT y una oleosina, o xiii) un MGAT y una oleosina, y xiv] opcionalmente, un polipéptido supresor de silenciamiento, para producir una célula transgénica, un organismo transgénico no humano o una parte del mismo, o una semilla transgénica que tiene una capacidad mejorada para producir uno o más lipidos no polares con relación a la correspondiente célula, organismo no humano o una parte del mismo o semilla que carece de dichos uno o más polinucleótidos, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos es exógeno para la célula, el organismo no humano o una parte del mismo o la semilla y está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula, un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respec i amente.
En una forma de realización, la invención provee el uso de un primer polinucleótido que codifica un ARN o un polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosintesis de ácidos grasos en una célula, un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, unto con un segundo polinucleótido que codifica un ARN o un polipéptido relacionado con la biosíntesis de uno o más lipidos no polares, para producir una célula transgénica, un organismo transgénico no humano o una parte del mismo, o una semilla transgénica que tiene una capacidad mejorada para producir uno o más lipidos no polares con relación a la correspondiente célula, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla que carece del primer y segundo polinucleotidos, en donde el primer y segundo polinucleotidos son cada uno exógenos para la célula, el organismo no humano o una parte del mismo, o la semilla y cada uno está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en la célula transgénica, el organismo transgénico no humano o una parte del mismo, o una semilla transgénica, respectivamente.
En una forma de realización adicional, la invención provee el uso de uno o más polinucleotidos para producir una célula transgénica, un organismo transgénico no humano o una parte del mismo o una semilla transgénica que tiene una capacidad mejorada para producir uno o más lipidos no polares con relación a la correspondiente célula, organismo no humano o una parte del mismo, o semilla que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleotidos es exógeno para la célula, el organismo no humano o una parte del mismo o una semilla y está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula, un organismo no humano o una parte del mismo, o una semilla, respectivamente, y en donde los lipidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente. Dichos usos también tienen utilidad como ensayos de selección.
En un octavo aspecto, la invención provee un proceso para producir semillas, donde dicho proceso comprende: i) cultivar una planta, múltiples plantas o un organismo no humano de acuerdo con la invención, y ii) cosechar semillas de la planta, plantas o el organismo no humano.
En una forma de realización preferida, el proceso comprende cultivar una población de al menos aproximadamente 1000 de tales plantas en un campo, y cosechar semillas de la población de plantas. La semilla cosechada se puede colocar en un recipiente y transportarla lejos del campo, por e emplo exportarla fuera del país, o guardarla antes del uso.
En un noveno aspecto, la invención provee un proceso de fermentación que comprende los pasos de: i) proveer un recipiente que contiene una composición liquida que comprende un organismo no humano de la invención que sea adecuado para la fermentación, y los constituyentes necesarios para la fermentación y la biosíntesis de ácidos grasos, y ii) proveer condiciones que permitan la fermentación de la composición líquida contenida en dicho recipiente.
En un décimo aspecto, la invención provee un lípido recuperado o extraído que se puede obtener mediante un proceso de la invención, o que se puede obtener a partir de una parte vegetativa de una planta, de un organismo no humano o una parte del mismo, de una célula o de una célula de la progenie, de una planta transgénica o de una semilla de la invención. El lípido recuperado o extraído, preferiblemente el aceite tal como el aceite de semillas, puede tener un mayor contenido de TAG, contenido de DAG, contenido de TAG y DAG, contenido de MAG, contenido de PUFA, contenido de PUFA específico o un contenido de ácidos grasos específicos y/o contenido total de lípidos no polares. En una forma de realización preferida, el MAG es 2-MAG. La extensión del mayor contenido de TAG, contenido de DAG, contenido de TAG y DAG, contenido de MAG, contenido de PUFA, contenido de PUFA especifico, contenido de ácidos grasos específicos y/o contenido total de lípidos no polares pueden ser como se definen en la Característica (i).
En un décimo primer aspecto, la invención provee un producto industrial producido mediante un proceso de la invención, preferiblemente un producto hidrocarbonado tal como esteres de ácidos grasos, preferiblemente metilésteres de ácidos grasos y/o etilésteres de ácidos grasos, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena más larga, una mezcla de alcanos de cadenas más largas, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno gaseoso, un bioalcohol tal como etanol, propanol o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono .
En un decimosegundo aspecto, la invención provee el uso de una planta, una parte vegetativa de la planta, un organismo no humano o una parte del mismo, una célula o una célula de la progenie, una planta transgénica producida mediante un proceso de la invención, o una semilla o un lípido recuperado o extraído de la invención para la elaboración de un producto industrial. El producto industrial puede ser como se definió previamente.
En un décimo tercer aspecto, la invención provee un proceso para producir semillas, donde dicho proceso comprende : i) hacer reaccionar un lipido de la invención con un alcohol, opcionalmente en la presencia de un catalizador, para producir alquil ásteres, y ii) opcionalmente, mezclar los alquil ésteres con un combustible basado en petróleo. Los alquil ésteres preferiblemente son metilésteres . El combustible producido mediante el proceso puede comprender un nivel mínimo del lipido de la invención o un producto hidrocarbonado producido a partir del mismo, tal como al menos un 10%, al menos un 20% o al menos un 30% en volumen.
En un décimo cuarto aspecto, la invención provee un proceso para producir un combustible diésel sintético, donde dicho proceso comprende: i) convertir los lipidos de una planta vegetativa, un organismo no humano o una parte del mismo, de la invención en un syngas por gasificación, y ii) convertir el syngas en un biocombustible usando un catalizador de metal o un catalizador microbiano.
En un décimo quinto aspecto, la invención provee un proceso para producir un biocombustible, donde dicho proceso comprende convertir los lipidos de una parte vegetativa de una planta, de un organismo no humano, o una parte del mismo, de la invención en el bioaceite por pirólisis, un bioalcohol por fermentación o un biogas por gasificación o digestión anaeróbica .
En un décimo sexto aspecto, la invención provee un proceso para producir un alimento, donde dicho proceso comprende mezclar una planta, una parte vegetativa de dicha planta, un organismo no humano o una parte del mismo, una célula o una célula de la progenie, una planta transgénica producida mediante un proceso de la invención, una semilla, un lípido recuperado o extraído, o un extracto o una porción de la misma, con al menos un ingrediente alimenticio adicional .
En un décimo séptimo aspecto, la invención provee alimentos, cosméticos o sustancias químicas que comprenden una planta, una parte vegetativa de la misma, un organismo no humano o una parte del mismo, una célula o una célula de la progenie, una planta transgénica producida mediante un proceso de la invención, una semilla o un lípido recuperado o extraído de la invención, o un extracto o una porción del mismo .
Naturalmente, cuando el material vegetativo de una planta será cosechado debido a su contenido de aceite resulta deseable cosechar el material cuando los niveles de lípidos son tan altos como fuera posible. Los inventores de la presente han observado una asociación entre el brillo del tejido vegetativo de las plantas de la invención y el contenido de aceite, dónde los niveles elevados de lipidos están asociados con mucho brillo. Por consiguiente, el brillo del material vegetativo se puede usar como un marcador para ayudar en la determinación cuando se cosechará el material .
En un aspecto adicional, la invención provee una célula recombinante que comprende uno o más polinucleótidos exógenos y un mayor nivel de uno o más lipidos no polares con relación a la correspondiente célula que carece de dichos uno o más polinucleótidos exógenos, en donde cada uno de dichos uno o más polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula, y en donde se aplica una o más o todas las siguientes características: (a) dichos uno o más polinucleótidos exógenos comprenden un primer polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido de un factor de transcripción que aumenta la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido relacionado con la biosintesis de uno o más lípidos no polares, (b) si la célula es una célula de una parte vegetativa de una planta, la célula tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 5% aproximadamente, preferiblemente al menos un 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos un 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos un 15% aproximadamente (p/p) , (c) la célula es un alga seleccionado del grupo que consiste de diatomeas (bacilariofitas ) , algas verdes ( clorofitas ) , algas verdiazules ( cianofitas ) , algas pardo-amarillentas ( crisofitas ) , haptofitas, algas marrones o pardas y algas heterocontas, (d) dichos uno o más lípidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera entre dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, (e) el contenido de ácidos grasos totales en los lipidos no polares comprende al menos un 2% más de ácido oleico y/o al menos un 2% menos de ácido palmitico que los lipidos no polares en la correspondiente célula que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos, (f) los lipidos no polares comprenden un nivel modificado de esteróles totales, preferiblemente esteróles libres (no esteri ficados ) , esteroil ésteres, esteroil glicósidos, con relación a los lipidos no polares en la correspondiente célula que carece de dichos uno o más polinucleotidos exógenos, (g) los lipidos no polares comprenden ceras y/o ésteres de ceras, y (h) la célula es un miembro de una población o colección de al menos aproximadamente 1000 de tales células.
En una forma de realización, dichos uno o más polinucleotidos exógenos comprenden al primer pol inucleótido exógeno y al segundo polinucleótido exógeno, y en donde se aplica una o más o todas las características (b) a (h) .
En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para determinar cuándo cosechar una planta para optimizar la cantidad de lípidos en el tejido vegetativo de la planta en el momento de la cosecha, donde dicho método comprende i) medir el brillo del tejido vegetativo, ii) comparar la medición con un nivel de brillo mínimo predeterminado, y iii) opcionalmente cosechar la planta.
En otro aspecto, la presente invención provee un método para predecir la cantidad de lipidos en el tejido vegetativo de una planta, donde dicho método comprende medir el brillo del tejido vegetativo.
En una forma de realización preferida de los dos aspectos anteriores, el tejido vegetativo comprende una hoja (hojas) o una porción de la misma.
En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para comercializar una planta o una parte de la misma, que comprende obtener la planta o una parte que comprende una célula de la invención, y comercializar la planta o parte de planta obtenida para lograr una ganancia pecuniaria.
En una forma de realización, el método comprende además una o más o todas entre: i) cultivar la planta, ii) cosechar la parte de planta de la planta, iii¡ guardar la planta o una parte de la misma, o iv) transportar la planta o una parte de la misma a una ubicación diferente.
En un aspecto adicional, la presente invención provee un proceso para producir bandejas de partes de plantas que comprende : a) cosechar partes de plantas que comprenden una célula de la invención por recolección de las partes de las plantas o por separación de las partes de plantas de otras partes de las plantas, b) opcionalmente, tamizar y/o separar las partes de plantas cosechadas, y c) cargar las partes de plantas de a) o las partes de plantas tamizadas y/o separadas de b) en bandejas, produciendo de esa manera las bandejas de partes de plantas.
Cualquiera de las formas de realización de la presente se aplicará mutatis utandis a cualquier otra forma de realización a menos que específicamente se defina de otra manera .
La presente invención no está limitada en cuanto a su alcance por las realizaciones específicas que se describen en la presente, que solamente se ofrecen a modo de ejemplo. Los productos, las composiciones y los métodos funcionalmente equivalentes claramente se encuentran dentro del alcance de la invención, que se describe en la presente.
En toda esta memoria descriptiva, a menos que específicamente se defina de otra manera o que el contexto requiera lo contrario, la referencia a un paso, composición de materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de materia individual abarcará una y una pluralidad (es decir uno o más) de dichos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupo de composiciones de materia.
La invención se describirá de aquí en adelante por medio de los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras adjuntas.
DESCRIPCION BREVE DE LAS FIGURAS ADJUNTAS Figura 1. Una representación de diversas vías de síntesis de lípidos, la mayoría de las cuales convergen en DAG, una molécula central en la síntesis de lípidos. Este modelo incluye una ruta posible para la formación de sn-2 MAG que se podría usar con una MGAT/DGAT bifuncional para la formación de DAG a partir de glicerol-3-fosfato (G-3-P). Las abreviaturas empleadas son: G-3-P; glicerol-3-fosfato LisoPA; ácido lisofosfatídico PA; ácido fosfatídico MAG; monoacilglicerol DAG; diacilglicerol TAG; triacilglicerol Acil-CoA y FA-CoA; acil-coenzima A y acilo graso-coenzima A PC; fosfatidilcolina GPAT; glicerol-3-fosfato aciltransferasa; glicerol-3-fosfato C-aciltransferasa; acil-CoA: sr¡-glicerol-3-fosfato 1-O-aciltransferasa; EC 2,3,1,15 GPA74; glicerol-3-fosfato aciltransferasa 4 GPAT6; glicerol-3-fosfato aciltransferasa 6 LPAAT; l-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa; 1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltrans ferasa ; acil-CoA: l-acil-sn-glicerol-3-fosfato 2-O-aciltransferasa; EC 2,3,1,51 PAP; ácido fosfatidico fosfatasa; fosfatidato fosfatasa; ácido fosfático fosfohidrolasa; ácido fosfatidico fosfatasa; EC 3,1,3.4 MGAT; una aciltransferasa gue tiene actividad monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT; 2-acilglicerol O-aciltransferasa acil-CoA: 2-acilglicerol O-aciltransferasa; EC 2,3,1,22) M/DGAT; una aciltransferasa gue tiene actividad monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT; 2-acilglicerol O-aciltransferasa; acil-CoA: 2-acilglicerol O-aciltransferasa; EC 2,3,1,22) y/o diacilglicerol aciltransferasa (DGAT; diacilglicerol O-aciltransferasa; acil-CoA: 1 , 2-diacil-sr!- glicerol O-aciltransferasa; EC 2,3,1,20) LPCAT; . acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferasa; 1-acilglicerofosfocolina O-aciltransferasa; acil-CoA: 1-acil-sn-glicero-3-fosfocolina O-aciltransferasa; EC 2,3,1,23 PLD-Z; Fosfolipasa D zeta; colina fosfatasa; lecitinasa D; lipofosfodiesterasa II; EC 3,1.4.4 CPT; CDP-colina :diacilglicerol colina fosfotransferasa; l-alquil-2-acetilglicerol colina fosfotransferasa; alquilacilglicerol colina fosfotransferasa; colina fosfotransferasa; fosforilcolina-glicérido transferasa; EC 2.7.8,2 PDCT; fos fatidilcolina : diacilglicerol colina fosfotrans ferasa PLC; fosfolipasa C; EC 3,1.4,3 PDAT; fosfolípido rdiacilglicerol aciltransferasa; fosfolipido : 1 , 2-diacil-sji-glicerol O-aciltransferasa; EC 2,3,1,158 Pi; fosfato inorgánico Figura 2. Incrementos relativos de DAG y TAG en te ido foliar de Nicotiana benthamiana transformado con construcciones que codifican pl9 (control negativo), DGAT1 de Arabídopsís thalíana, MGAT1 de Mus musculus y una combinación de DGAT1 y MGAT1, cada una expresada a partir del promotor 35S. La enzima MGAT1 era mucho más activa que la enzima DGATl en la promoción de la acumulación de ambos DAG y TAG en el tejido foliar. La expresión del gen de MGAT1 dio como resultado el doble de acumulación de DAG y TAG en el tejido foliar en comparación con la expresión de DGATl solamente.
Figura 3. Incrementos relativos de TAG en ho as de N. benthamiana transformadas con construcciones que codifican pl9 (control negativo), DGATl de A. thaliana, MGAT2 de M. musculus y una combinación de MGAT2 y DGATl. Las barras de error indican el error estándar de muestras triplicadas.
Figura 4. Radioactividad (DPM) en fracciones de MAG, DAG y TAG aisladas de lisados de hojas de ¿V. benthamiana transformadas transitoriamente alimentadas con sn-2-MAG [14C] y ácido oleico no marcado en un transcurso de tiempo. Las construcciones usadas eran las mismas que las usadas para la Figura 3.
Figura 5. Igual que la Figura 4 pero alimentadas con [14CJG-3-P y ácido oleico no marcado.
Figura 6. Autorradiograma de una placa de TLC que muestra la formación de TAG por DGATl de A. thaliana y MGAT1 de M. musculus pero no MGAT2 de M. musculus en ensayos de levadura. El ensayo se describe en el Ejemplo 5.
Figura 7. Niveles de TAG en semillas T2 y T3 de Arabidopsis thaliana transformada con un ADN quimérico que expresa MGAT2 con relación a un control parental (no transformado) . Las semillas se cosecharon en la madurez (desecadas). SW: Peso de semillas desecadas. Los niveles de TAG se expresan como µg de TAG por 100 µ? de peso de semillas .
Figura 8. Contenido de ácidos grasos totales en semillas de plantas transformadas de Arabidopsis thaliana transformadas con construcciones que codifican MGAT1 o MGAT2.
Figura 9. Nivel relativo de TAG en tejido foliar de N. benthamiana transformado transitoriamente en comparación con sobreexpresión de DGAT1 en Arabidopsis thaliana.
Figura 10. Conversión de TAG de sn-l,2-DAG en un ensayo con DGAT de microsomas de tejidos foliares de N. benthamiana que expresan al control P19, DGAT1 de Arabidopsis thaliana y DGAT2 de Arabidopsis thaliana Figura 11. Cuantificación FAME total en semillas de A. thaliana transformadas con pJP3382 y pJP3383.
Figura 12. Niveles máximos de TAG obtenidos para diferentes combinaciones de genes expresados transitoriamente en ho as de N. benthamiana. El control negativo V2 representa el nivel promedio de TAG basado en 15 repeticiones independientes .
Figura 13. Coexpresión de los genes que codifican la DGAT1 aciltransferasa de Arabidopsis thaliana y el factor de transcripción WRIl de A. thaliana que dio como resultado un efecto sinérgico sobre los niveles de TAG en ho as de Nícotiana benthamiana . Los datos que se muestran son los promedios y las desviaciones estándar de cinco infiltraciones independientes .
Figura 14. Niveles de TAG en te ido aéreo de plántulas de N. benthamiana transformadas de forma estable. Los lípidos totales se extrajeron de tejidos aéreos de plántulas de N. benthamiana y se analizaron por TLC-FID usando un estándar interno de DAGE para permitir una comparación precisa entre muestras.
Figura 15. Niveles de ácidos grasos totales de poblaciones de semillas T2 de A. thaliana transformadas con el vector control (pORE04), MGAT1 de M. musculus (35S:MGAT1) o MGAT2 de M. musculus (35S:MGAT2).
Figura 16. Mapa de la región de inserción entre los bordes izquierdo y derecho de pJP3502. TER Glima-Lectina se refiere al terminador de lectina de Glycine max; Arat-WRIl, región de codificación del factor de transcripción WRIl de Arabidopsis thaliana; PRO Arat-Rubisco SSU, un promotor de la subunidad pequeña rubisco de A. thaliana; Sesina-Oleosina, región de codificación de oleosina de Sesame indicum; PRO CaMV35S-Ex2, promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor que tiene una región potenciadora duplicada; Arat-DGATl, región de codificación de DGAT1 aciltransferasa de A. thalíana; TER Agrtu-NOS, terminador de la nopalina sintasa Agrobacterium turnefaciens .
Figura 17. Representación esquemática de la construcción pJP3503 que incluye la región de inserción entre los bordes izquierdo y derecho de pJP3503. TER Agrtu-NOS, significa terminador de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefacíens; Musmu-MGAT2, MGAT2 aciltransferasa de Mus Musculus; PRO CaMV24S-Ex2, región duplicada del potenciador 35S del virus en mosaico de la coliflor; TER Glima-Lectina, terminador de lectina de Glycine max; Arat-WRIl, factor de transcripción WRI1 de Arabidopsis thalíana; PRO Arat-Rubisco SSU, promotor de la subunidad pequeña de rubisco A. thalíana; Sesina-Oleosina, oleosina de Sesa e índicum; Arat-DGATl, DGAT1 aciltransferasa de A. thalíana Figura 18. Rendimientos de TAG en diferentes edades de hojas de tres plantas de tabaco de tipo salva e ( tl-3) y tres transformantes primarios de pJP3503 (4, 29, 21). Las etapas de las hojas están indicadas por AG' , verde; ^YG' , verde amarillento; ??' , amarillo. Etapas de las plantas durante la toma de muestras: tipo salvaje 1; primera aparición de flores, tipo salvaje 2; floración, tipo salvaje 3; vainas productoras de semillas (transformantes pJP3503).
Figura 19A. Inserto de ADN que contiene a los casetes de expresión para DGAT2A de U belopsís ramanniana expresado por el promotor de beta-conglicinina subunidad alfa' de Glycíne ax, WRI1 de Arabídopsís thaliana expresado por el promotor del inhibidor 3 de tripsina kunitz de Glycíne max y MGAT2 de Mus musculus expresado por el promotor de beta-conglicinina subunidad alfa' de Glycíne max. Las regiones de codificación y los casetes de expresión de los genes se pueden recortar mediante digestión por restricción.
Figura 19B. Inserto de ADN que contiene casetes de expresión para los genes de los factores de transcripción LEC2 y WRI1 de Arabídopsís thaliana expresados por los promotores inducibles alcA de Aspergillus , el DGAT1 de Arabídopsís thaliana expresado por el promotor constitutivo CaMV-35S y el gen alcR de Aspergillus expresado por el promotor constitutivo CsVMV. La expresión de los factores de transcripción LEC2 y WRI1 es inducida por etanol o un compuesto análogo.
Figura 20. Mapa de pJP3507 Figura 21. Mapa de pJP3569 CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID N°: 1 MGAT1 de codones optimizados de Mus muscul us SEQ ID N° : 2 MGAT2 de codones optimizados de Mus muscul us SEQ ID N°: 3 MGATl de codones optimizados de Cíona intestinalis SEQ ID N°: 4 MGATl de codones optimizados de Tribolium castaneum SEQ ID N°: 5 MGATl de codones optimizados de Danio rerio SEQ ID N°: 6 MGAT2 de codones optimizados de Danio rerio SEQ ID N ° : 7 polinucleótido MGATl de Homo sapiens (AF384163) SEQ ID N°: 8 polinucleótido de MGATl de Mus musculus (AF384162) SEQ ID N°: 9 variante de transcripto del polinucleótido de MGATl de Pan troglodytes (XM_001166055 ) SEQ ID N°: 10 variante de transcripto del polinucleótido de MGATl de Pan troglodytes (XM_0526044.2 ) SEQ ID N°: 11 polinucleótido de MGATl de Canis famílíaris (XM_545667 , 2 ) SEQ ID N°: 12 polinucleótido de MGATl de Bos taurus (NM_001001153, 2 ) SEQ ID N°: 13 polinucleótido de MGATl de Rattus norvegícus (NM_001108803, 1 ) SEQ ID N°: 14 polinucleótido de MGATl de Danio rerio (NM 001122623,1) SEQ ID N°: 15 polinucleótido de MGAT1 de Caenorhabditis elegans (NM_073012.4 ) SEQ ID N°: 16 polinucleótido de MGAT1 de Caenorhabditis elegans (NM_182380, 5 ) SEQ ID N°: 17 polinucleótido de MGAT1 de Caenorhabditis elegans (NM_065258.3 ) SEQ ID N°: 18 polinucleótido de MGAT1 de Caenorhabditis elegans (NM_075068.3 ) SEQ ID N°: 19 polinucleótido de MGAT1 de Caenorhabditis elegans (NM_072248.3 ) SEQ ID N°: 20 polinucleótido de MGAT1 de Kluyvero yces lactis (XM_455588 , 1 ) SEQ ID N°: 21 polinucleótido de MGAT1 de Ashbya gossypii (NM_208895, 1 ) .
SEQ ID N°: 22 polinucleótido de MGAT1 de Magnaporthe oryzae (XM_368741 , 1 ) SEQ ID N°: 23 polinucleótido de MGAT1 de Clona intestinalis (XM_002120843, 1 ) SEQ ID N°: 24 polinucleótido MGAT2 de Homo sapiens (AY157608) SEQ ID N°: 25 polinucleótido de MGAT2 de Mus musculus (AY157609) SEQ ID N°: 26 polinucleótido de MGAT2 de Pan troglodytes ( XM_522112 , 2 ) SEQ ID N°: 27 polinucleótido de MGAT2 de Canis famílíarís (XM_542304 , 1 ) SEQ ID N°: 28 polinucleótido de MGAT2 de Bos taurus (NM_001099136, 1 ) SEQ ID N°: 29 polinucleótido de MGAT2 de Rattus norvegicus (NM_001109436, 2 ) SEQ ID N°: 30 polinucleótido de MGAT2 de Gallus gallus (XM_424082, 2 ) SEQ ID N°: 31 polinucleótido de MGAT2 de Danio rerio (NM_001006083, 1 ) SEQ ID N°: 32 polinucleótido de MGAT2 de Drosophila elanogaster (NM_136474 , 2 ) SEQ ID N°: 33 polinucleótido de MGAT2 de Drosophila melanogaster (NM_136473, 2 ) SEQ ID N°: 34 polinucleótido de MGAT2 de Drosophila melanogaster (NM_136475, 2 ) SEQ ID N°: 35 polinucleótido de MGAT2 de Anopheles gambiae (XM_001688709,1 ) SEQ ID N°: 36 polinucleótido de MGAT2 de Anopheles gambiae (XM_315985) SEQ ID N°: 37 polinucleótido de MGAT2 de Tríbolium castaneum ( XM_970053 , 1 ) SEQ ID N°: 38 polinucleótido de MGAT3 de Homo sapiens (AY22985 ) SEQ ID N°: 39 variante de transcripto 1 del polinucleótido de MGAT3 de Pan troglodytes (XM_001154107 , 1 ) SEQ ID N°: 40 variante de transcripto 2 del polinucleótido de MGAT3 de Pan troglodytes (XM_001154171, 1 ) SEQ ID N°: 41 variante de transcripto 3 del polinucleótido de MGAT3 de Pan troglodytes (XM_527842, 2 ) SEQ ID N°: 42 polinucleótido de MGAT3 de Canís familiarís (XM_845212, 1 ) SEQ ID N°: 43 polinucleótido de MGAT3 de Bos taurus (XM_870406.4) SEQ ID N°: 44 polinucleótido de MGAT3 de Danio rerio (XM_688413.4) SEQ ID N°: 45 polipéptido MGAT1 de Homo sapiens (AAK84178, 1 ) SEQ ID N°: 46 polipéptido de MGAT1 de Mus musculus (AA 84177, 1 ) SEQ ID N°: 47 isoforma 1 del polipéptido de MGAT1 de Pan troglodytes (XP_001166055, 1 ) SEQ ID N°: 48 isoforma 2 del polipéptido de MGAT1 de Pan troglodytes (XP_526044 , 2 ) SEQ ID N°: 49 polipéptido de MGAT1 de Canís familiarís (XP_545667 , 2 ) SEQ ID N°: 50 polipéptido de MGAT1 de Bos taurus (NP 001001153,1) SEQ ID N°: 51 polipéptido de MGATl de Rattus norvegícus (NP_001102273, 1 ) SEQ ID N°: 52 polipéptido de MGATl de Danio rerio (NP_001116095, 1 ) SEQ ID N°: 53 polipéptido de MGATl de Caenorhabdi tí s elegans (NP_505413, 1 ) SEQ ID N°: 54 polipéptido de MGATl de Caenorhabdi tis elegans (NP_872180, 1 ) SEQ ID N°: 55 polipéptido de MGATl de Caenorhabdi ti s elegans (NP_497659, 1 ) SEQ ID N°: 56 polipéptido de MGATl de Caenorhabdi tis elegans (NP_507469,1) SEQ ID N°: 57 polipéptido de MGATl de Caenorhabdi tis elegans (NP_504649 , 1 ) SEQ ID N°: 58 polipéptido de MGATl de Kluyveromyces lactis (XP_455588,1) SEQ ID N°: 59 polipéptido de MGATl de Ashbya gossypii (NP_983542,1) SEQ ID N°: 60 polipéptido de MGATl de Magnaporthe oryzae (XP_368741 , 1 ) SEQ ID N°: 61 polipéptido de MGATl de Ciona intestinalis (XP_002120879 ) SEQ ID N°: 62 polipéptido MGAT2 de Homo sapiens (AA023672, 1) SEQ ID N°: 63 polipéptido de MGAT2 de Mus musculus (AA023673,1) SEQ ID N°: 64 polipéptido de MGAT2 de Pan troglodytes (XP_522112,2) SEQ ID N°: 65 polipéptido de MGAT2 de Canis familiaris (XP_542304 , 1 ) SEQ ID N°: 66 polipéptido de MGAT2 de Bos taurus (NP_001092606, 1 ) SEQ ID N°: 67 polipéptido de MGAT2 de Rattus norvegicus (NP_001102906, 2 ) SEQ ID N°: 68 polipéptido de MGAT2 de Gallus gallus (XP_424082, 2 ) SEQ ID N°: 69 polipéptido de MGAT2 de Danio rerio (NP_001006083,1) SEQ ID N°: 70 polipéptido de MGAT2 de Drosophila melanogaster (NP_610318, 1 ) SEQ ID N°: 71 polipéptido de MGAT2 de Drosophila melanogaster (NP_610317 , 1 ) SEQ ID N°: 72 polipéptido de MGAT2 de Drosophila melanogaster (NP_610319, 2 ) SEQ ID N°: 73 polipéptido de MGAT2 de Anopheles gambiae (XP_001688761 ) SEQ ID N°: 74 polipéptido de MGAT2 de Anopheles gambiae (XP_315985, 3 ) SEQ ID N°: 75 polipéptido de MGAT2 de Tribolium castaneum (XP_975146) SEQ ID N°: 76 polipéptido de MGAT3 de Homo sapiens (AA063579,1) SEQ ID N°: 77 isoforma 1 del polipéptido de MGAT3 de Pan troglodytes (XP_001154107 , 1 ) SEQ ID N°: 78 isoforma 2 del polipéptido de MGAT3 de Pan troglodytes (XP_001154171 , 1 ) SEQ ID N°: 79 isoforma 3 de MGAT3 predicha de Pan troglodytes (XP_527842, 2 ) SEQ ID N°: 80 polipéptido de MGAT3 de Canís famíliaris (XP_850305, 1 ) SEQ ID N°: 81 polipéptido de MGAT3 de Bos taurus (XP_875499, 3) SEQ ID N°: 82 polipéptido de MGAT3 de Danio rerio (XP_693505,1) SEQ ID N°: 83 polipéptido de DGAT1 de Arabídopsis thaliana (CAB44774,1) SEQ ID N°: 84 polinucleótido de GPAT4 de Arabídopsis thaliana (NM_100043.4 ) SEQ ID N°: 85 polinucleótido de GPAT6 de Arabídopsis thaliana (NM_129367 , 3 ) SEQ ID N°: 86 polinucleótido de Arabídopsis thaliana GPAT (AF195115,!) SEQ ID N°: 87 polinucleótido de Arabidopsis thaliana GPAT (AY062466,1) SEQ ID N°: 88 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (AC118133.4) SEQ ID N°: 89 polinucleótido GPAT de Picea sitchensis (EF086095, 1) SEQ ID N°: 90 polinucleótido GPAT de Zea mays (BT067649, 1) SEQ ID N°: 91 polinucleótido GPAT de Arabidopsis thaliana (AK228870,1) SEQ ID N°: 92 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (AK241033, 1 ) SEQ ID N°: 93 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (CM000127, 1) SEQ ID N°: 94 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (CM000130,1) SEQ ID N°: 95 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (CM000139,1) SEQ ID N°: 96 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (CM000126,1) SEQ ID N°: 97 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (CM000128, 1) SEQ ID N°: 98 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (CM000140, 1 ) SEQ ID N°: 99 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffii (GL377667,1) SEQ ID N°: 100 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffií (GL377667,1) SEQ ID N°: 101 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffii (GL377648,1) SEQ ID N°: 102 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffii (GL377622,1) SEQ ID N°: 103 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffii (GL377590,1) SEQ ID N°: 104 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffii (GL377576,1) SEQ ID N°: 105 polinucleotido GPAT de Selaginella moellendorffii (GL377576,1) SEQ ID N°: 106 polinucleotido GPAT de Oryza sativa (NM_001051374.2) SEQ ID N°: 107 polinucleotido GPAT de Oryza sativa (NM_001052203, 1 ) SEQ ID N°: 108: polinucleotido GPAT8 de Zea mays (NM_001153970, 1 ) SEQ ID N°: 109: polinucleotido GPAT de Zea mays (NM_001155835, 1 ) SEQ ID N°: 110: polinucleotido GPAT de Zea mays (NM 001174880,1) SEQ ID N°: 111 Brassica napus polinucleotido GPAT4 (JQ666202,1) SEQ ID N°: 112 polinucleotido GPAT8 de Arabidopsis thalíana ( NM_116264 , 5 ) SEQ ID N°: 113 polinucleotido GPAT de Physco itrelia patens (XM_001764949, 1 ) SEQ ID N°: 114 polinucleotido GPAT de Physcomitrelia patens (XM_001769619, 1 ) SEQ ID N°: 115 polinucleotido GPAT de Physcomitrelia patens (XM_001769672 , 1 ) SEQ ID N°: 116 polinucleotido GPAT de Physcomitrelia patens (XM_001771134 , 1 ) SEQ ID N°: 117 polinucleotido GPAT de Physcomitrelia patens (XM_001780481, 1 ) SEQ ID N°: 118 polinucleotido GPAT de Vitis vinifera (XM_002268477,1) SEQ ID N°: 119 polinucleotido GPAT de Vitis vinifera (XM_002275312,1) SEQ ID N°: 120 polinucleotido GPAT de Vitis vinifera (XM_002275996,1) SEQ ID N°: 121 polinucleotido GPAT de Vitis vinifera (XM_002279055,1) SEQ ID N°: 122 polinucleotido GPAT de Populus trichocarpa (XM_002309088, 1 ) SEQ ID N°: 123 polinucleotido GPAT de Populus trichocarpa (XM_002309240, 1 ) SEQ ID N°: 124 polinucleotido GPAT de Populus trichocarpa (XM_002322716, 1 ) SEQ ID N°: 125 polinucleotido GPAT de Populus trichocarpa (XM_002323527 , 1 ) SEQ ID N°: 126 polinucleotido GPAT de Sorghum bicolor (XM_002439842, 1 ) SEQ ID N°: 127 polinucleotido GPAT de Sorghum bicolor (XM_002458741,1) SEQ ID N°: 128 polinucleotido GPAT de Sorghum bicolor (XM_002463871, 1 ) SEQ ID N°: 129 polinucleotido GPAT de Sorghum bicolor (XM_002464585,.l) SEQ ID N° : 130 polinucleotido GPAT de Ricinus communis (XM_002511827,1) SEQ ID N° : 131 polinucleotido GPAT de Ricinus communis (XM__002517392,1) SEQ ID N° : 132 polinucleotido GPAT de Ricinus communis (XM_002520125,1) SEQ ID N°: 133 polinucleotido GPAT de Arabidopsis lyrata (XM_002872909, 1 ) SEQ ID N°: 134 polinucleotido GPAT6 de Arabidopsis lyrata (XM 002881518,1) SEQ ID NO 135 polinucleótido GPA 8 putativo de Vernicia fordii (FJ479753,1) SEQ ID NO 136 polinucleótido GPAT de Oryza sativa (NM_001057724,1) SEQ ID N°: 137 polinucleótido GPAT4 de Brassica napus ( JQ666203,1) SEQ ID N°: 138 polinucleótido GPAT de Populus tríchocarpa (XM_002320102 , 1 ) SEQ ID N°: 139 polinucleótido GPAT de Sorghum bicolor (XM_002451332,1) SEQ ID N°: 140 polinucleótido GPAT de Ricinus co munis (XM_002531304, 1) SEQ ID N°: 141 polinucleótido GPAT4 de Arabidopsis lyrata (XM_002889315, 1 ) SEQ ID N°: 142 polinucleótido GPAT1 de Arabidopsis thaliana (NM_100531.2 ) SEQ ID NO 143 polinucleótido G AT3 de Arabidopsis thaliana (NM_116426.2 ) SEQ ID N°: 144 polipéptido G AT4 de Arabidopsis thaliana (NP_171667, 1 ) SEQ ID N°: 145 polipéptido GPAT6 de Arabidopsis thaliana (NP_181346, 1 ) SEQ ID N°: 146 polipéptido GPAT de Arabidopsis thaliana (AAF02784,!) SEQ ID N°: 147 polipéptido GPAT de Arabidopsis thaliana (AAL32544,1) SEQ ID N°: 148 polipéptido GPAT de Oryza sativa (AAP03413,1) SEQ ID N°: 149 polipéptido GPAT de Picea sitchensis (ABK25381f 1 ) SEQ ID N°: 150 polipéptido GPAT de Zea mays (ACN34546,1) SEQ NO ID: 151 polipéptido GPAT de Arabidopsis thaliana (BAF00762rl) SEQ ID N°: 152 polipéptido GPAT de Oryza sativa (BAH00933, 1) SEQ ID N°: 153 polipéptido GPAT de Oryza sativa (EAY84189r 1 ) SEQ ID N°: 154 polipéptido GPAT de Oryza sativa (EAY98245,1) SEQ ID polipéptido GPAT de Oryza sativa (EAZ21484, 1 ) SEQ ID N°: 156 polipéptido GPAT de Oryza sativa (EEC71826,1) SEQ ID polipéptido GPAT de Oryza sativa (EEC76137,1) SEQ ID polipéptido GPAT de Oryza sativa (EEE59882, 1 ) SEQ ID N°: 159 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii (EFJ08963,1) SEQ ID N°: 160 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii (EFJ08964,1) SEQ ID N°: 161 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii ( EFJ11200, 1 ) SEQ ID N°: 162 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii (EFJ15664,1) SEQ ID N°: 163 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii (EFJ24086,1) SEQ ID N°: 164 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii (EFJ29816,1) SEQ ID N°: 165 polipéptido GPAT de Selaginella moellendorffii (EFJ29817,1) SEQ ID N°: 166 polipéptido GPAT de Oryza sativa (NP_001044839, 1 ) SEQ ID N°: 167 polipéptido GPAT de Oryza sativa (NP_001045668, 1 ) SEQ ID N°: 168 polipéptido GPAT8 de Zea ays (NP_001147442, 1 ) SEQ ID N°: 169 polipéptido GPAT de Zea mays (NP_001149307, 1 ) SEQ ID N°: 170 polipéptido de la proteína GPAT de Zea mays (NP 001168351, 1 ) SEQ ID N°: 171 polipéptido GPAT4 de Brassica napus (AFH02724,1) SEQ ID N°: 172 polipéptido GPAT8 de Arabidopsis thaliana (NP_191 50.2 ) SEQ ID N°: 173 polipéptido GPAT de Physcomi trella patens (X?_001765001 , 1 ) SEQ ID N°: 174 polipéptido GPAT de Physcomi trella patens (XP_001769671 , 1 ) SEQ ID N°: 175 polipéptido GPAT de Physcomi trella patens (XP_001769724 , 1 ) SEQ ID N°: 176 polipéptido GPAT de Physcomi trella patens (XP_001771186, 1 ) SEQ ID N°: 177 polipéptido GPAT de Physcomi trella patens (XP_001780533, 1 ) SEQ ID N°: 178 polipéptido GPAT de Vitis vínifera (XP_002268513, 1 ) SEQ ID N°: 179 polipéptido GPAT de Vitis vínifera (XP_002275348, 1 ) SEQ ID N°: 180 polipéptido GPAT de Vitis vínifera (XP_002276032,1) SEQ ID N°: 181 polipéptido GPAT de Vitis vínifera (XPJD02279091, 1 ) SEQ ID N°: 182 polipéptido GPAT de Populus trichocarpa (XP 002309124,1) SEQ ID N°: 183 polipéptido GPAT de Populus trichocarpa (XP_002309276,1) SEQ ID N°: 184 polipéptido GPAT de Populus trichocarpa (XP_002322752,1) SEQ ID N°: 185 polipéptido GPAT de Populus trichocarpa (XP_002323563,1) SEQ ID N°: 186 polipéptido GPAT de Sorghum bicolor (XP_002439887, 1 ) SEQ ID N°: 187 polipéptido GPAT de Sorghum bicolor (XP_002458786, 1 ) SEQ ID N°: 188 polipéptido GPAT de Sorghum bicolor (XP_002463916, 1 ) SEQ ID N°: 189 polipéptido GPAT de Sorghum bicolor (XP_002464630, 1 ) SEQ ID N°: 190 polipéptido GPAT de Ricinus communis (XP_002511873,1) SEQ ID N°: 191 polipéptido GPAT de Ricinus communis (XP_002517438, 1) SEQ ID N°: 192 polipéptido GPAT de Ricinus communis (XP_002520171,1) SEQ ID N°: 193 polipéptido GPAT de Arabidopsis lyrata (XP_002872955, 1 ) SEQ ID N°: 194 polipéptido PAT 6 de Arabidopsís lyrata (XP 002881564,1) SEQ ID N°: 195 polipéptido GPAT de Vernicia fordii (ACT32032,1) SEQ ID N°: 196 polipéptido GPAT de Oryza sativa (NP_001051189,1) SEQ ID N°: 197 polipéptido GPAT4 de Brassica napus (AFH02725, 1 ) SEQ ID N°: 198 polipéptido GPAT de Populus trichocarpa (XP_002320138,1) SEQ ID N°: 199 polipéptido GPAT de Sorghum bicolor (XP_002451377,1) SEQ ID N°: 200 polipéptido GPAT de Ricinus co munis (XP_002531350, 1 ) SEQ ID N°: 201 polipéptido de GPAT 4 de Arabidopsis lyrata (XP_002889361 , 1 ) SEQ ID N°: 202 polipéptido de GPATl de Arabidopsis thaliana (NP_563768, 1 ) SEQ ID N°: 203 polipéptido de GPAT3 de Arabidopsis thaliana (NP_192104 , 1 ) SEQ ID N°: 204 polinucleotido de DGAT2 de Arabidopsis thaliana (NM_115011 , 3) SEQ ID N° : 205 polinucleotido de DGAT2 de Ricinus communis (??916129, 1 ) SEQ ID N° : 206 polinucleotido de DGAT2 de Vernicia fordii (DQ356682,!) SEQ ID N° : 207 polipéptido de DGAT2 de Mortierella ramanníana (AF391089,1) SEQ ID N°: 208 polipéptido de DGAT2 de Homo sapiens (NM_032564,1) SEQ ID N°: 209 polipéptido de DGAT2 de Homo sapiens (NM_001013579,2) SEQ ID N°: 210 polipéptido de DGAT2 de Bos taurus (NM_205793, 2 ) SEQ ID N°: 211 polipéptido de DGAT2 de Mus musculus (AF384160,1) SEQ ID N°: 212 polipéptido de DGAT2 Arabídopsis thaliana (NP_566952, 1 ) SEQ ID N°: 213 polipéptido de DGAT2 Ricinus communis (AAY16324, 1) SEQ ID N°: 214 polipéptido de DGAT2 de Vernícía ford: (ABC94474,1) SEQ ID N°: 215 polipéptido de DGAT2 de Mortierella ramanníana (AA 84179, 1 ) SEQ ID N°: 216 polipéptido de DGAT2 de Homo sapiens (Q96PD7,2) SEQ ID N°: 217 polipéptido de DGAT2 de Homo sapiens (Q58HT5, 1 ) SEQ ID N°: 218 polipéptido de DGAT2 de Bos taurus (Q70VZ8, 1) SEQ ID N°: 219 polipeptido de DGAT2 de Mus musculus (AAK84175,1) SEQ ID N°: 220 tripéptido YFP -motivo de secuencia conservado de DGAT2 y/o MGAT1/2 SEQ ID N°: 221 tetrapéptido HPHG -motivo de secuencia conservado de DGAT2 y/o MGAT1/2 SEQ ID N°: 222 tetrapéptido EPHS -motivo de secuencia conservado de DGAT2 vegetal SEQ ID N°: 223 RXGFX ( K/R ) XAXXXGXXX ( L/V) VPXXXFG ( E/Q ) -motivo de secuencia conservado largo de DGAT2 que forma parte del dominio putativo de fosfolípido glicerol SEQ ID N°: 224 FLXLXXXN - motivo de secuencia conservado de DGAT2 y MGAT1/2 de ratón que es un dominio de unión de lipidos neutro putativo SEQ ID N°: 225 dominio plsC aciltrans ferasa (PF01553) de GPAT SEQ ID N°: 226 dominio de la superfamilia de hidrolasa tipo HAD (PF12710) de GPAT SEQ ID N°: 227 dominio de fosfoserina fosfatasa (PF00702). GPAT4-8 contiene una región N-terminal homologa de este dominio SEQ ID N°: 228 secuencia de aminoácidos GDLVICPEGTTCREP conservada de GPAT SEQ ID N°: 229 secuencia de aminoácidos conservada de GPAT/fosfatasa (Motivo I) SEQ ID N°: 230 secuencia de aminoácidos conservada de GPAT/fosfatasa (Motivo III) SEQ ID N°: 231 polinucleotido WRI1 de Arabidopsis thalíana ( NM_202701.2 ) SEQ ID N°: 232 polinucleotido WRI1 de Arabidopsis thalíana (NM_001035780.2 ) SEQ ID N°: 233 polinucleotido WRI1 de Arabidopsis thalíana (NM_115292.4 ) SEQ ID N°: 234 polinucleotido de Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XM_002876205, 1 ) SEQ ID N°: 235 polinucleotido RI1 de Brassica napus (DQ370141, 1 ) SEQ ID N°: 236 polinucleotido WRI1 de Brassica napus (HM370542,1) SEQ ID N°: 237 polinucleotido WRI1 de Glycíne max (XM_003530322, 1 ) SEQ ID N°: 238 polinucleotido WRI1 de Jatropha curcas ( JF703666, 1 ) SEQ ID N°: 239 polinucleotido WRI1 Ricínus cow unis (XM 002525259, 1 ) SEQ ID N°: 240 polinucleotido WRI1 de Populus tríchocarpa (XM_002316423, 1 ) SEQ ID N°: 241 polinucleotido WRI1 de Brachypodium distachyon (XM_003578949, 1 ) SEQ ID N°: 242 polinucleotido WRIl de Hordeum vulgare subsp. vulgare (AK355408 , 1 ) SEQ ID N°: 243 polinucleotido WRIl de Sorghum bicolor (XM_002450149,1) SEQ ID N°: 244 polinucleotido WRIl de Zea ays (EU960249, 1 ) SEQ ID N°: 245 polinucleotido WRIl de Brachypodiu dístachyon (XM_003561141 , 1 ) SEQ ID N°: 246 polinucleotido WRIl de Sorghum bicolor (XM_002437774, 1 ) SEQ ID N°: 247 polinucleotido WRIl de Sorghum bicolor (XM_002441399,1) SEQ ID N°: 248 polinucleotido WRIl de Glycine max (XM_003530638, 1 ) SEQ ID N°: 249 polinucleotido WRIl de Glycine max (XM_003553155, 1 ) SEQ ID N°: 250 polinucleotido WRIl de Populus trlchocarpa (XM_002315758, 1 ) SEQ ID N°: 251 polinucleotido WRIl de Vitis vinifera (XM_002270113, 1 ) SEQ ID N°: 252 polinucleotido WRIl de Glycine max (XM_003533500, 1 ) SEQ ID N°: 253 polinucleotido WRIl de Glycine max (XM 003551675,1) SEQ ID N°: 254 polinucleótido WRI1 de Medicago bruncatula (XM 003621069,1) SEQ ID N°: 255 polinucleótido WRI1 de Populus trichocarpa (XM_002323800, 1 ) SEQ ID N°: 256 polinucleótido WRI1 de Ricinus co munís (XM_002517428,1) SEQ ID N°: 257 polinucleótido WRI1 de Brachypodium dístachyon (XM_003572188 , 1 ) SEQ ID N°: 258 polinucleótido WRI1 de Sorghum bicolor (XM_002444384,1) SEQ ID N°: 259 polinucleótido WRI1 de Zea mays (NM 001176888,1) SEQ ID N°: 260 polinucleótido WRI1 de Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XM_002889219, 1 ) SEQ ID N°: 261 polinucleótido WRI1 de Arabidopsis thaliana ( NM_106619.3 ) SEQ ID N°: 262 polinucleótido WRI1 de Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XM_002890099, 1 ) SEQ ID N°: 263 polinucleótido WRI1 de Thellungiella halophila (AK352786, 1 ) SEQ ID N°: 264 polinucleótido WRI1 de Arabidopsis thaliana (NM 101474.2) SEQ ID N°: 265 polinucleótido WRI1 de Glycine max (XM_003530302,1) SEQ ID N°: 266 polinucleótido WRI1 de Brachypodíum distachyon (XM_003578094 , 1 ) SEQ ID N°: 267 polinucleótido WRI1 de Sorghu bicolor (XM_002460191, 1 ) SEQ ID N°: 268 polinucleótido WRI1 de Zea mays (NM_001152866,1) SEQ ID N°: 269 polinucleótido WRI1 de Glycine max (XM_003519119, 1 ) SEQ ID N°: 270 polinucleótido WRI1 de Glycine max (XM_003550628, 1 ) SEQ ID N°: 271 polinucleótido WRI1 de Medicago truncatula (XM_003610213, 1 ) SEQ ID N°: 272 polinucleótido WRI1 de Glycine max (XM_003523982, 1 ) SEQ ID N°: 273 polinucleótido WRI1 de Glycine max (XM_003525901, 1 ) SEQ ID N°: 274 polinucleótido WRI1 de Populus trichocarpa (XM_002325075, 1 ) SEQ ID N°: 275 polinucleótido WRI1 de Vítis vínifera (XM_002273010.2) SEQ ID N°: 276 polinucleótido WRI1 de Populus trichocarpa (XM_002303830, 1 ) SEQ ID N°: 277 polinucleótido RI1 de Lupinis angustífolí us, secuencia parcial (NA-080818_Platel4f06.bl) SEQ ID N°: 278 polinucleótido WRIl de Lupinis angustífolíus SEQ ID N°: 279 polipéptido WRIl de Arabidopsis thalíana (A8MS57) SEQ ID N°: 280 polipéptido WRIl de Arabidopsis thaliana (Q6X5Y6) SEQ ID N°: 281 polipéptido WRIl de Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XP_002876251, 1 ) SEQ ID N°: 282 polipéptido WRIl de Brassica napus (ABD16282,1) SEQ ID N°: 283 polipéptido WRIl de Brassica napus (AD016346, 1 ) SEQ ID N°: 284 polipéptido WRIl de Glycine max (XP_003530370, 1 ) SEQ ID N°: 285 polipéptido WRIl de Jatropha curcas (AE022131, 1 ) SEQ ID N°: 286 polipéptido WRIl de Rícínus com unis (XP_002525305, 1 ) SEQ ID N°: 287 polipéptido WRIl de Populus trichocarpa (XP_002316459,1) SEQ ID N°: 288 polipéptido WRIl de Vítís vinifera (CBI29147.3) SEQ ID N°: 289 polipéptido WRIl de Brachypodium dist chyon (XP_00357899 , 1 ) SEQ ID N°: 290 polipéptido RI1 de Hordeum vulgare subsp. vulgare ( BAJ86627 , 1 ) SEQ ID N°: 291 polipéptido WRI1 de Oryza sativa (EAY79792, 1) SEQ ID N°: 292 polipéptido WRI1 de Sorghum bicolor (XP_002450194, 1) SEQ ID N°: 293 polipéptido WRI1 de Zea mays (ACG32367,1) SEQ ID N°: 294 polipéptido WRI1 de Brachypodium distachyon (XP_003561189, 1 ) SEQ ID N°: 295 polipéptido RI1 de Brachypodium sylvaticum (ABL85061,1) SEQ ID N°: 296 polipéptido WRI1 de Oryza sativa (BAD68417, 1 ) SEQ ID N°: 297 polipéptido WRI1 de Sorghum bicolor (XP_002437819, 1 ) SEQ ID N°: 298 polipéptido WRI1 de Sorghum bicolor (XP_002441444, 1 ) SEQ ID N°: 299 polipéptido WRI1 de Glycine max (XP_003530686, 1 ) SEQ ID N°: 300 polipéptido WRI1 de Glycine max (XP_003553203, 1 ) SEQ ID N°: 301 polipéptido WRI1 de Populus trichocarpa (XP_002315794, 1) SEQ ID N°: 302 polipéptido WRI1 de Vitis vinifera (XP_002270149,1) SEQ ID N°: 303 polipéptido WRI1 de Glycine max (XP_003533548,1) SEQ ID N°: 304 polipéptido RI1 de Glycine max (XP_003551723, 1 ) SEQ ID N°: 305 polipéptido WRI1 de Medicago truncatula (XP_003621117, 1) SEQ ID N°: 306 polipéptido WRI1 de Populus trichocarpa (XP_002323836, 1 ) SEQ ID N°: 307 polipéptido WRI1 de Ricinus communis (XP_002517474, 1) SEQ ID N°: 308 polipéptido WRI1 de Vitis vinifera (CAN79925,1) SEQ ID N°: 309 polipéptido WRI1 de Brachypodium distachyon (XP_003572236, 1 ) SEQ ID N°: 310 polipéptido WRI1 de Oryza sativa (BAD10030, 1 ) SEQ ID N°: 311 polipéptido WRI1 de Sorghum bicolor (XP_002444429, 1 ) SEQ ID N°: 312 polipéptido WRI1 de Zea mays (NP_001170359, 1 ) SEQ ID N°: 313 polipéptido WRI1 de ñrabidopsis lyrata subsp. lyrata (XP_002889265, 1 ) SEQ ID N°: 314 polipéptido WRI1 de Arabidopsis thaliana (AAF68121,!) SEQ ID N°: 315 polipéptido WRIl de Arabidopsis thaliana (NP_178088.2 ) SEQ ID N°: 316 polipéptido WRI1 de Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XP_002890145, 1 ) SEQ ID N°: 317 polipéptido WRI1 de Thellungiella halophila (BAJ33872,1) SEQ ID N°: 318 polipéptido WRI1 de Arabidopsis thaliana (NP_563990, 1 ) SEQ ID N°: 319 polipéptido WRI1 de Glycine max (XP 003530350,1) SEQ ID N°: 320 polipéptido WRIl de Brachypodium distachyon (XP_003578142, 1 ) SEQ ID N°: 321 polipéptido WRIl de Oryza sativa (EAZ09147,1) SEQ ID N°: 322 polipéptido WRIl de Sorghu bicolor (XP_002460236, 1 ) SEQ ID N°: 323 polipéptido WRIl de Zea mays (NP 001146338,1) SEQ ID N°: 324 polipéptido WRIl de Glycine max (XP 003519167,1) SEQ ID N°: 325 polipéptido WRIl de Glycine max (XP_003550676, 1 ) SEQ ID N°: 326 polipéptido WRIl de Medícago truncatula (XP_003610261, 1 ) SEQ ID N°: 327 polipéptido WRIl de Glycine max (XP_003524030, 1 ) SEQ ID N°: 328 polipéptido WRIl de Glycine max (XP_003525949, 1 ) SEQ ID N°: 329 polipéptido WRIl de Populus trichocarpa (XP_002325111, 1 ) SEQ ID N°: 330 polipéptido WRIl de Vítis vínifera (CBI36586.3) SEQ ID N°: 331 polipéptido WRIl de Vítis vínifera (XP_002273046.2) SEQ ID N°: 332 polipéptido WRIl de Populus trichocarpa (XP_002303866, 1 ) SEQ ID N°: 333 polipéptido WRIl de Vítis vínifera (CBI25261.3) SEQ ID N°: 334 Sorbi-WRLl SEQ ID N°: 335 Lupan-WRLl SEQ ID N°: 336 Ricco-WRLl SEQ ID N°: 337 polipéptido WRIl de Lupin angustí folius polipéptido WRIl SEQ ID N°: 338 polinucleótido DGAT de Aspergí llus fumígatus (XM 750079,1) SEQ ID N°: 339 polinucleotido DGAT de Ricínus co munis (AY366496,1) SEQ ID N°: 340 polinucleotido DGATl de Vernícía fordíi (DQ356680,1) SEQ ID N°: 341 polinucleotido DGATl de Vernonia galamensis (EF653276,1) SEQ ID N°: 342 polinucleotido DGATl de Vernonia galamensis (EF653277,1) SEQ ID N°: 343 polinucleotido DGATl de Euonymus alatus (AY751297,1) SEQ ID N°: 344 polinucleotido DGATl de Caenorhabdi ti s elegans (AF221132,1) SEQ ID N°: 345 polinucleotido DGATl de Rattus norvegícus (NM_053437 , 1 ) SEQ ID N°: 346 polinucleotido DGATl de Homo sapiens NM_012079.4 ) SEQ ID N°: 347 polipéptido DGATl de Aspergillus fumigatus (XP_755172 , 1 ) SEQ ID N°: 348 polipéptido DGATl de Ricínus communis (AAR11479,1) SEQ ID N°: 349 polipéptido DGATl de Vernicía fordíi (ABC94472, 1 ) SEQ ID N°: 350 polipéptido DGATl de Vernonia galamensis (ABV21945,!) SEQ ID N°: 351 polipéptido DGAT1 de Vernonia galamensis (ABV21946,1) SEQ ID N°: 352 polipéptido DGAT1 de Euonymus alatus (AAV31083,1) SEQ ID N°: 353 polipéptido DGAT1 de Caenorhabditis elegans (AAF82410,1) SEQ ID N°: 354 polipéptido DGAT1 de Rattus norvegicus (NP_445889,1) SEQ ID N°: 355 polipéptido DGAT1 de Ho o sapiens (NP_036211.2) SEQ ID N°: 356 motivo WRI1 (R G V T/S R H R W T G R) SEQ ID N°: 357 motivo WRI1 (F/Y E A H L W D K) SEQ ID N°: 358 motivo WRI1 (D L A A L K Y W G) SEQ ID N°: 359 motivo WRI1 (S X G F S/A R G X) SEQ ID N°: 360 motivo WRI1 (H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V) SEQ ID N°: 361 motivo WRI1 (Q E E A A A X Y D) SEQ ID N°: 362 polipéptido de oleosina de Brassica napus (CAA57545, 1 ) SEQ ID N°: 363 polipéptido de oleosina Sl-1 de Brassica napus (ACG69504 , 1 ) SEQ ID N°: 364 polipéptido de oleosina S2-1 de Brassica napus (ACG69503,1) SEQ ID N°: 365 polipéptido de oleosina S3-1 de Brassica napus (ACG69513,1) SEQ ID N°: 366 polipéptido de oleosina S4-1 de Brassíca napus (ACG69507,1) SEQ ID N°: 367 polipéptido de oleosina S5-1 de Brassica napus (ACG69511,1) SEQ ID N°: 368 polipéptido de oleosina 1 de Arachís hypogaea (AAZ20276,1) SEQ ID N°: 369 polipéptido de oleosina 2 de Arachís hypogaea (AAU21500,1) SEQ ID N°: 370 polipéptido de oleosina 3 de Arachís hypogaea (AAU21501,1) SEQ ID N°: 371 polipéptido de oleosina 5 de Arachís hypogaea (ABC96763,1) SEQ ID N°: 372 polipéptido de oleosina 1 de Ricínus communis (EEF40948,1) SEQ ID N°: 373 polipéptido de oleosina 2 de Ricínus communis (EEF51616,1) SEQ ID N°: 374 polipéptido de la isoforma a de oleosina de Glycine max (P29530.2) SEQ ID N°: 375 polipéptido de la isoforma b de oleosina de Glycine ax (P29531,l) SEQ ID N°: 376 polipéptido de la isoforma de bajo peso molecular de oleosina de Linum usitatíssimum (ABB01622,1) SEQ ID N° : 377 secuencia de aminoácidos del polipéptido de la isoforma de alto peso molecular de oleosina de Linum usitatissímum (ABB01624,1) SEQ ID N°: 378 polipéptido de oleosina de Helianihus annuus (CAA44224,1) SEQ ID N°: 379 polipéptido de oleosina de Zea mays (NP_001105338,1) SEQ ID N°: 380 polipéptido de esteroleosina de Brassica napus (ABM30178,1) SEQ ID N°: 381 polipéptido de esteroleosina SLOl-1 de Brassica napus (ACG69522,1) SEQ ID N°: 382 polipéptido de esteroleosina SL02-1 de Brassica napus (ACG69525,1) SEQ ID N°: 383 polipéptido de esteroleosina de Sesamum indicum (AAL13315,1) SEQ ID N°: 384 polipéptido de esteroleosina de Zea mays (NP_001152614 , 1 ) SEQ ID N°: 385 polipéptido de caleosina CLO-1 de Brassica napus (ACG69529,1) SEQ ID N°: 386 polipéptido de caleosina CLO-3 de Brassica napus (ACG69527,1) SEQ ID N°: 387 polipéptido de caleosina de Sesamum indicum (AAF13743,1) SEQ ID N°: 388 polipéptido de caleosina de Zea mays (NP 001151906,1) SEQ ID N°: 389 polinucleotido de oleosina de Brassica napus (X82020,l) SEQ ID N°: 390 polinucleotido de oleosina Sl-1 de Brassica napus (EU678256,1) SEQ ID N°: 391 polinucleotido de oleosina S2-1 de Brassica napus (EU678255,1) SEQ ID N°: 392 polinucleotido de oleosina S3-1 de Brassica napus (EU678265,1) SEQ ID N°: 393 polinucleotido de oleosina S4-1 de Brassica napus ( EU678259, 1 ) SEQ ID N°: 394 polinucleotido de oleosina S5-1 de Brassica napus (EU678263,1) SEQ ID N°: 395 polinucleotido de oleosina 1 de Arachis hypogaea (DQ097716,1) SEQ ID N°: 396 polinucleotido de oleosina 2 de Arachis hypogaea (AY722695,1) SEQ ID N° : 397 polinucleotido de oleosina 3 de Arachis hypogaea (AY722696,1) SEQ ID N°: 398 polinucleotido de oleosina 5 de Arachis hypogaea (DQ368496,1) SEQ ID N°: 399 polinucleotido de oleosina de Helíanthus annuus (X62352,l) SEQ ID N°: 400 polinucleotido de oleosina de Zea mays (NM 001111868,1) SEQ ID N°: 401 polinucleotido de esteroleosina de Brassica napus (EF143915,1) SEQ ID N°: 402 polinucleotido de esteroleosina SLOl-1 de Brassica napus (EU678274,1) SEQ ID N°: 403 polinucleotido de esteroleosina SL02-1 de Brassica napus (EU678277,1) SEQ ID N° : 404 polinucleotido de esteroleosina de Zea ays (NM_001159142, 1 ) SEQ ID N°: 405 polinucleotido de caleosina CLO-1 de Brassica napus (EU678281,!) SEQ ID N°: 406 polinucleotido de caleosina CLO-3 de Brassica napus (EU678279,1) SEQ ID N° : 407 polinucleotido de caleosina de Sssamum indicum (AF109921,1) SEQ ID N°: 408 polinucleotido de caleosina de Zea mays (NM_001158434, 1 ) SEQ ID N°: 409 secuencia completa del vector pJP3502 (tres genes) SEQ ID N°: 410 secuencia completa del vector pJP3503 (cuatro genes) SEQ ID N°: 411 secuencia de ADN-T del pJP3502 (insertada en el genoma) SEQ ID N°: 412 secuencia de ADN-T del pJP3503 (insertada en el genoma) SEQ ID N°: 413 secuencia del vector pJP3507 SEQ ID N°: 414 secuencia conectora SEQ ID N°: 415 sinergia con soja SEQ ID N°: 416 inserto_12ABFJYC_pJP3569 SEQ ID N°: 417 secuencia parcial de CGI-58 de N. bentha iana seleccionada para el silenciamiento con hpARNi (pTV46) SEQ ID N°: 418 secuencia parcial de AGPasa de N. tabacum seleccionada para el silenciamiento con hpARNi (pTV35) SEQ ID N°: 419 motivo de lipasa GXSXG SEQ ID N°: 420 motivo de aciltrans ferasa HX(4)D SEQ ID N°: 421 probable motivo de unión a lipidos VX ( 3 ) HGF SEQ ID N°: 422 polinucleótido CGÍ58 de Arabídopsis thaliana (NM_118548,1) SEQ ID N°: 423 polinucleótido CGÍ58 de Brachypodium distachyon (XM_003578402, 1 ) SEQ ID N°: 424 polinucleótido CGÍ58 de Glycine max (XM_003523590,1) SEQ ID N°: 425 polinucleótido CGÍ58 de Zea mays (NM_001155541, 1 ) SEQ ID N°: 426 polinucleótido CGÍ58 de Sorghurn bicolor (XM 002460493,1) SEQ ID N°: 427 polinucleótido CGÍ58 de Ricinus communis (XM_002510439, 1 ) SEQ ID N°: 428 polinucleótido CGÍ58 de Medicago truncatula (XM_003603685, 1 ) SEQ ID N°: 429 polipéptido CGÍ58 de Arabidopsis thaliana (NP_194147.2 ) SEQ ID N°: 430 polipéptido CGÍ58 de Brachypodíum distachyon (XP_003578450, 1 ) SEQ ID N°: 431 polipéptido CGÍ58 de Glycine ax (XP_003523638,1) SEQ ID N°: 432 polipéptido CGÍ58 de Zea Mays (NP_001149013,1) SEQ ID N°: 433 polipéptido CGÍ58 de Sorghum bicolor (XP_002460538,1) SEQ ID N°: 434 polipéptido CGi 58 de Ricinus communis (XP_002510485,1) SEQ ID N°: 435 polipéptido CGÍ58 de Medicago truncatula (XP_003603733, 1 ) SEQ ID N°: 436 polipéptido CGÍ58 de Oryza sativa (EAZ09782,1) SEQ ID N°: 437 polinucleótido LEC2 de Arabidopsis thaliana (NM_102595.2 ) SEQ ID N°: 438 polinucleótido LEC2 de Medicago truncatula (X60387,l) SEQ ID N°: 439 polinucleótido LEC2 de Brassíca napus (HM370539,1) SEQ ID N°: 440 polinucleótido BBM de Arabidopsis thaliana (NM_121749.2 ) SEQ ID N°: 441 polinucleótido BBM de Medicago truncatula (AY899909,1) SEQ ID N°: 442 polipéptido LEC2 de Arabidopsis thaliana (NP_564304 , 1 ) SEQ ID N°: 443 polipéptido LEC2 de Medicago truncatula (CAA42938,1) SEQ ID N°: 444 polipéptido LEC2 de Brassíca napus (AD016343, 1 ) SEQ ID N°: 445 polipéptido BBM de Arabidopsis thaliana (NP_197245.2) SEQ ID N°: 446 polipéptido BBM de Medicago truncatula (AAW82334, 1 ) SEQ ID N°: 447 promotor inducible alcA de Aspergilus ni ger SEQ ID N°: 448 inductor AlcR que activa al promotor AlcA en la presencia de etanol DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Técnicas generales y definiciones A menos que específicamente se defina de otra manera, se considera que todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por el especialista en el arte (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas, química de lípidos y ácidos grasos, producción de biocombustible y bioquímica).
A menos que se indique de otra manera, las técnicas de proteínas recombinantes , de cultivo celular e inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándar, bien conocidos por los especialistas en el arte. Dichas técnicas se describen y explican en la literatura en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloníng, John Wiley y Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Bro n (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), F.M. Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow y David Lañe (editores), Antibodíes : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al., (editores), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente).
Definiciones seleccionadas El término "organismo no humano transgénico" se refiere, por ejemplo, a una planta completa, un alga, un animal no humano o un organismo adecuado para la fermentación tal como una levadura o un hongo, que comprende un polinucleotido exógeno (transgen) o un polipéptido exógeno. En una forma de realización, el organismo no humano transgénico no es un animal o una parte del mismo. En una forma de realización, el organismo no humano transgénico es un organismo fototrófico (por ejemplo, una planta o un alga) capaz de obtener energía de la luz solar para sintetizar compuestos orgánicos para su nutrición. En otra forma de realización, el organismo no humano transgénico es una bacteria fotosintética .
El término "exógeno" en el contexto de un polinucleotido o polipéptido hace referencia al polinucleotido o polipéptido cuando está presente en una célula que naturalmente no comprende el polinucleotido o polipéptido. Dicha célula es referida en la presente como "célula recombinante" o una "célula transgénica" . En una forma de realización, el polinucleotido o polipéptido exógeno es de un género diferente al de la célula que comprende el polinucleotido o polipéptido exógeno. En otra forma de realización, el polinucleótido o polipéptido exógeno es de una especie diferente. En una forma de realización el polinucleótido o polipéptido exógeno se expresa en una planta o célula vegetal huésped y el polinucleótido o polipéptido exógeno es de una especie o género diferente. El polinucleótido o polipéptido exógeno puede ser de origen no natural, tal como por ejemplo, una molécula de ADN sintética gue ha sido producida por métodos de ADN recombinante . La molécula de ADN puede, con frecuencia preferentemente, incluir una región gue codifica para una proteina que se le han optimizado los codones para la expresión en la célula, produciendo de este modo un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de origen natural, aunque la secuencia de nucleótidos de la región que codifica para la proteina no es de origen natural. El polinucleótido exógeno puede codificar, o puede ser el polipéptido exógeno: una diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) tal como una DGATl o una DGAT2, una glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) tal como una GPAT que tiene la capacidad de sintetizar MAG, un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), una Oleosina, o un polipéptido supresor por silenciamiento . En una forma de realización, el polipéptido exógeno es una MGAT exógena tal como una MGAT1 o un MGAT2.
Según se usa en la presente, el término "lipido extraído" se refiere a una composición extraída de un organismo transgénico, o una parte del mismo, que comprende al menos un 60% (peso en peso) del lipido.
Según se usa en la presente, el término "lipido no polar" se refiere a ácidos grasos y derivados de los mismos, que son solubles en solventes orgánicos pero insolubles en agua. Los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos libres y/o se pueden encontrar en una forma esterificada . Los ejemplos de formas esteri floadas incluyen, pero en un sentido no limitativo, triacilglicerol (TAG), diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG) . Los lípidos no polares también incluyen esteróles, ésteres esterol y ésteres de ceras. Los lípidos no polares también se conocen como "lípidos neutros". El lipido no polar típicamente es líquido a temperatura ambiente. Preferentemente, el lipido no polar comprende predominantemente (>50%) ácidos grasos que son de al menos 16 carbonos de longitud. Más preferentemente, al menos un 50% de los ácidos grasos totales en el lipido no polar son ácidos grasos de C18 como por ejemplo ácido oleico. En una forma de realización, al menos un 50%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99% de los ácidos grasos en el lípido no polar de la invención se pueden encontrar como TAG. El lípido no polar se puede purificar o tratar además, por ejemplo mediante hidrólisis con una base fuerte para liberar el ácido graso libre, o mediante fraccionamiento, destilación o semejantes. El lípido no polar puede estar presente o ser obtenido de partes de plantas tales como semilla, hojas o frutos, de células recombinantes o de organismos no humanos tal como levaduras. El lípido no polar de la invención puede formar parte del "aceite de semillas" si es obtenido de la semilla. Los concentraciones de esterol libre y esterificado (por ejemplo, sitoesterol, campesterol, estigmaesterol , brassicaesterol , D5-avenaesterol , sitostanol, campestanol y colesterol) en los lípidos extraídos pueden ser como se describe en Phillips et al., 2002. Los esteróles en los aceites de semillas están presentes como alcoholes libres, ésteres con ácidos grasos (esteróles esterificados ) , glicósidos y glicósidos acilados de esteróles. Las concentraciones de esteróles en aceites vegetales de origen natural (aceites de semilla) varían hasta un máximo de aproximadamente HOOmg/lOOg. El aceite de palma hidrogenado tiene una de las concentraciones más ba as de aceites vegetales de origen natural de aproximadamente 60mg/100g. Los aceites de semillas recuperados o extraídos de la invención preferentemente tienen entre aproximadamente 100 y aproximadamente lOOOmg de esterol total/100g de aceite. Para su uso en alimentos o alimentación, se prefiere que los esteróles estén presentes como formas libres o esterificadas en lugar de formas glicosiladas . En los aceites de semillas de la presente invención, preferentemente al menos 50% de los esteróles en los aceites están presentes como esteróles esterificados , excepto para el aceite de semillas de soja que tiene aproximadamente 25% de los esteróles esterificados . El aceite de semillas de cañóla y aceite de semillas de colza de la invención preferentemente tienen entre aproximadamente 500 y aproximadamente 800 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal y campesterol el más abundante. El aceite de semillas de maíz de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 600 y aproximadamente 800 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como esterol principal. El aceite de semillas de so a de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 350 mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal y estigmasterol como el más abundante, y con más esterol libre que esterol es terificado . El aceite de semillas de algodón de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 200 y aproximadamente 350 mg de esterol total/lOOg, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de coco y el aceite de palma de la invención preferentemente tienen entre aproximadamente 50 y aproximadamente lOOmg de esterol total/lOOg, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semillas de cártamo de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 150 y aproximadamente 250mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de maní de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 100 y aproximadamente 200mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de semillas de sésamo de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 400 y aproximadamen e 600mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. El aceite de girasol de la invención preferentemente tiene entre aproximadamente 200 y 400mg de esterol total/100g, con sitoesterol como el esterol principal. Los aceites obtenidos de partes de plantas vegetativas de acuerdo a la invención preferentemente tienen menos de 200mg de esterol total/100g, más preferentemente menos de lOOmg de esterol total/100 g, y aún más preferentemente menos de 50mg de esteróles totales/100g, siendo la mayor parte de los esteróles, esteróles libres. - Según se usa en la presente, el término "aceite de semillas" se refiere a una composición obtenida a partir de semillas/granos de una planta que comprende al menos un 60% (peso en peso) de lipidos, o que se puede obtener a partir de semillas/granos si el aceite de semillas aún está presente en dichas semillas/granos. Es decir, el aceite de semillas de la invención incluye un aceite de semillas que está presente en dichas semillas/granos o en una porción de los mismos, asi como un aceite de semillas que ha sido extraído de las semillas/granos. El aceite de semillas preferentemente es un aceite de semillas extraído. Típicamente el aceite de semillas es un líquido a temperatura ambiente. Preferentemente, el contenido de ácidos grasos totales (TFA) en el aceite de semillas comprende predominantemente (>50%) ácidos grasos que tienen al menos 16 carbonos de longitud. Más preferentemente, al menos un 50% de los ácidos grasos totales en el aceite de semillas son ácidos grasos de C18 como por ejemplo ácido oleico. Los ácidos grasos típicamente se pueden encontrar en una forma esterificada tal como por ejemplo, TAG, DAG, acil-CoA o fosfolípido. Los ácidos grasos pueden ser ácidos grasos libres y/o se pueden encontrar en una forma esterificada. En una forma de realización, al menos un 50%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99% de los ácidos grasos en el aceite de semillas de la invención se pueden encontrar como TAG. En una forma de realización, el aceite de semillas de la invención es un aceite "sustancialmente purificado" o " purificado" que- fue separado de uno o más lipidos adicionales, ácidos nucleicos, polipéptidos u otras moléculas contaminantes con los cuales está asociado en la semilla o en un extracto crudo. Se prefiere que el aceite de semillas sustancialmente purificado esté al menos un 60% libre, más preferentemente al menos un 75% libre y, más preferentemente, al menos un 90% libre de otros componentes con los cuales esté asociado en la semilla o el extracto. El aceite de semillas de la invención puede comprender además moléculas de ácidos no grasos tales como, en un sentido no limitativo, esteróles. En una forma de realización, el aceite de semillas es aceite de semillas de cañóla (Brassíca sp. tal como Brassica carinata, Brassíca júncea, Brassica napobrassica, Brassica napus) aceite de mostaza [Brassica júncea), otro aceite de Brassica (por ejemplo, Brassica napobrassica, Brassica camelina) , aceite de girasol {Helianthus sp. tal como Helianthus annuus) , aceite de semillas de lino {Linu usitatissimum) , aceite de so a [Glicina max) , aceite de cártamo ( Carthamus tínctorius) , aceite de maíz {Zea mays) , aceite de tabaco {Nicotiana sp . tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana benthamiana) , aceite de maní {Arachis hypogaea) , aceite de palma {Elaeis guineensis) , aceite de semillas de algodón [Gossypium hirsutum) , aceite de coco {Cocos nucífera) , aceite de palma {Persea americana) , aceite de oliva {Olea europaea) , aceite de castaña de cajú {Anacardium occidentale) , aceite de macadamia {Macadamia intergrifolia) , aceite de almendras {Prunus amygdalus) , aceite de semillas de avena {Avena sativa) , aceite de arroz {Oryza sp. tal como Oryza sativa y Oryza glaberri a) , aceite de semillas de Arabidopsis {Arabidopsís thaliana) , o aceite de la semilla de Acrocomia aculeata (palma macaúba), Aracinis hypogaea (maní), Astrocaryum murumuru (murumuru) , Astrocaryum vulgare (tucuma) , Attalea geraensis ( Indaiá-rateiro ) , Attalea humilis (palma de aceite americana), Attalea oleífera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea specíosa (babassu) , Beta vulgarís (remolacha azucarera), Camelina sativa (lino falso), Caryocar brasiliense (pequi), Crambe abyssinica (col abisinio), Cucumís meló (melón), Hordeum vulgare (cebada), Jatropha curcas (jatrofa) , Joannesia princeps (árbol de nuez de Brasil), Licania rígida (oiticica), Lupinus angustífolius (lupino), Mauritia flexuosa (palma de moriche) , Maxi iliana maripa (palma inaja), Miscanthus sp. tal como Míscanthus x giganteus y Miscanthus sinensis, Oenocarpus bacaba (milpesos de aceite), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (milpesos de leche), Panicum virgatum (mijo), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana (palta), Ponga ia pinnata (haya india), Populus trichocarpa, Ricinus communis (ricino), Saccharum sp. (caña de azúcar), Sesamum indicum (sésamo), Solanu tuberosum (papa), Sorghum sp. tal como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobro a grandíflorum (copoazú), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (caranday brasileño) y Tritícum sp. (trigo) tal como Tritícum aestivum. El aceite de semillas se puede extraer de las semillas/granos mediante cualquier método conocido en el arte. Esto comprende típicamente extracción con solventes no polares tales como éter dietílico, éter de petróleo, mezclas de cloroformo/metanol o butanol, asociados generalmente con la primera molienda de las semillas. Los lípidos asociados con el almidón en el grano se pueden extraer con butanol saturado con agua. El aceite de semillas se puede "desgomar" mediante métodos conocidos en el arte para eliminar polisacáridos o se puede tratar de otras maneras para eliminar los contaminantes o mejorar la pureza, la estabilidad o el color. Los TAG y otros ásteres en el aceite de semillas se puede hidrolizar para liberar los ácidos grasos libres o el aceite de semillas se puede hidrogenar, tratar químicamente o enzimáticamente como es sabido en el arte.
Según se usa en la presente, el término "ácido graso" se refiere a un ácido carboxílico con una cola alifática larga de al menos 8 átomos de carbono de longitud, ya sea saturado o insaturado. Típicamente, los ácidos grasos tienen una cadena de carbono-carbono de al menos 12 carbonos de longitud. La mayoría de los ácidos grasos naturales tienen un número par de átomos de carbono porque su biosíntesis comprende acetato que tiene dos átomos de carbono. Los ácidos grasos se pueden encontrar en un estado libre (no esterificado ) o en una forma esterificada tal como una parte de un triglicérido (TAG), diacilglicérido (DAG), monoacilglicérido (MAG), unido a acil-CoA (tio-éster) u otra forma unida. Cuando está unido de manera covalente en una forma esterificada, en la presente el ácido graso se conoce como un grupo "acilo". El ácido graso puede estar esterificado como un fosfolípido tal como una fosfatidilcolina (PC), fos fatidiletanolamina , fosfatidilserina, fosfatidilglicerol , fos fatidil inositol o difosfatidilglicerol . Los "ácidos grasos saturados" no contienen ningún enlace doble o ningún grupo funcional a lo largo de la cadena. El término "saturado" se refiere a hidrógeno, en que todos los carbonos (además del grupo de ácido carboxílico [-COOH]) contiene tantos hidrógenos como sea posible. En otras palabras, el extremo omega (?) contiene 3 hidrógenos (CH3-) y cada carbono dentro de la cadena contiene 2 hidrógenos (-CH2-). Los "ácidos grasos insaturados" son de una forma similar a los ácidos grasos saturados, excepto que existe uno o más grupos funcionales alqueno a lo largo de la cadena, donde cada alqueno sustituye una parte "-CH2-CH2-" de enlace simple de la cadena con una porción "-CH=CH-" unida mediante un enlace doble (es decir, un carbono unido mediante un enlace doble a otro carbono) . Los dos átomos de carbono siguientes en la cadena que están unidos por cualquiera de los lados del enlace doble pueden presentar una configuración cis o trans.
Según se usan en la presente, los términos "ácidos grasos poliínsaturados" o "PUFA" se refieren a un ácido graso que comprende al menos 12 átomos de carbono en su cadena de carbonos y al menos dos grupos alqueno (dobles enlaces carbono-carbono). El contenido de PUFA de la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o una parte del mismo de la invención se puede aumentar o disminuir dependiendo de la combinación de polinucleótidos exógenos expresados en la parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla de la invención. Por ejemplo, cuando se expresa una MGAT el nivel de PUFA típicamente aumenta, mientras cuando se expresa DGAT1 solo o en combinación con WRIl, el nivel de PUFA típicamente disminuye debido a un aumento en el nivel de ácido oleico. Adicionalmente, si se disminuye la actividad de ?12 desaturasa, por ejemplo por silenciamiento de una ?12 desaturasa endógena, es poco probable que el contenido de PUFA aumente en ausencia de un polinucleótido exógeno que codifica para una ?12 desaturasa diferente.
Un "monoacilglicérido" o "MAG" es un glicérido en el cual el glicerol está esterificado con un ácido graso. Según se usa en la presente, un MAG comprende un grupo hidroxilo en la posición sn-1/3 (en la presente también denominado sn-1 MAG o 1-MAG o 1/3-MAG) o sn-2 (en la presente también denominado 2-MAG) y por ello el MAG no incluye moléculas fosforiladas tal como PA o PC. Por lo tanto, MAG es un componente de lipidos neutros en una célula.
Un "diacilglicérido" o "DAG" es un glicérido en el cual el glicerol está esterificado con dos ácidos grasos que pueden ser los mismos o, preferentemente, diferentes. Según se usa en la presente, un DAG comprende un grupo hidroxilo en la posición sn-1,3 o sn-1, 2/2,3, y por ello DAG no incluye moléculas fosforiladas tal como PA o PC. Por lo tanto, DAG es un componente de lipidos neutros en una célula. En la vía Kennedy de la síntesis de DAG (Figura 1), el precursor sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) se esterifica a dos grupos acilo, cada uno proveniente de un éster de coenzima A de ácidos grasos, en una primera reacción catalizada por una glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) en la posición sn-1 para formar LisoPA, seguido por una segunda acilación en la posición sn-2 catalizada por un ácido lisofosfatídico aciltrans ferasa (LPAAT) para formar ácido fosfatídico (PA). Este intermediario se desfosforila luego para formar DAG. En una via anabólica alternativa (Figura 1), el DAG se puede formar por la acilación de ya sea sn-1 MAG o preferentemente sn-2 MAG, catalizada por MGAT . El DAG también se puede formar a partir de TAG por eliminación de un grupo acilo con una lipasa, o a partir de PC esencialmente por eliminación de un grupo cabeza de colina con cualquiera de las enzimas CPT, PDCT o PLC (Figura 1).
Un "triacilglicérido" o "TAG" es un glicérido en el cual el glicerol está esterificado con tres ácidos grasos que pueden ser los mismos (por ejemplo como en trioleina) o, más comúnmente, diferentes. En la vía Kennedy de la síntesis de TAG, el DAG se forma como se describió previamente, y luego se esterifica un tercer grupo acilo en el esqueleto de glicerol por la actividad de DGA . Las vías alternativas para la formación de TAG incluyen una catalizada por la enzima PDAT y la via MGAT que se describe en la presente.
Según se usa en la presente, el término "aciltransferasa" se refiere a una proteina que tiene la capacidad de transferir un grupo acilo de la acil-CoA sobre un sustrato e incluye MGAT, GPAT y DGAT.
Como se usa en la presente, el término "Wrinkled 1" o "WRI1" o "WRLl" hace referencia a un factor de transcripción de la clase AP2/ERWEBP que regula la expresión de varias enzimas involucradas en la glicólisis y síntesis de novo de ácidos grasos. WRI1 tiene dos dominios de unión a ADN específicos de planta (AP2/EREB) . WRI1 en al menos Arabidopsis también regula la ruptura de sacarosa por medio de la glicólisis regulando de ese modo la provisión de precursores para la biosíntesis de ácidos grasos. En otras palabras, controla el flujo de carbonos del fotosintato a lípidos de almacenamiento. Los mutantes de wril tienen el fenotipo de semilla wrinkled, debido a un defecto en la incorporación de sacarosa y glucosa a los TAG.
Los ejemplos de genes que son transcriptos por WRI1 incluyen, a título enunciativo no taxativo, uno o más, preferentemente todos, de piruvato quinasa (At5g52920, At3g22960), subunidad Elalfa piruvato deshidrogenasa (PDH) (Atlg01090), acetil-CoA carboxilasa (ACCasa), subunidad BCCP2 (At5gl5530), enoil-ACP reductasa (At2g05990; EAR) , fos foglicerato mutasa (Atlg22170), fructoquinase citosólica, y fosfoglicerato mutasa citosólica, sacarosa sintasa (SuSi) (véase, por ejemplo, Liu et al., 2010b; Baud et al., 2007; Ruuska et al . , 2002 ) .
El RL1 contiene el dominio conservado AP2 (cd00018) . El AP2 es un dominio de unión a ADN encontrado en los reguladores de transcripción en plantas tales como APETALA2 y EREBP (proteina de unión al elemento de respuesta a etileno) . En las EREBP el dominio se une específicamente a la caja GCC de llpb del elemento de respuesta a etileno (ERE), un elemento promotor esencial para la respuesta etileno. Las EREBP y el factor de unión a repeticiones de C CBF1, que está involucrado en la respuesta al estrés, contiene una copia única del dominio AP2. Las proteínas similares a APETALA2, que tienen un papel en el desarrollo de la planta contienen dos copias.
Otros motivos de secuencia en RI1 y sus homólogos funcionales incluyen: 1. R G V T/S R H R W T G R ( SEQ ID NO:356) . 2. F/Y E A H L W D K (SEQ ID NO:357) . 3. D L A A L K Y W G (SEQ ID NO:358) . 4. S X G F S/A R G X ( SEQ ID NO:359) . 5. H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V ( SEQ ID NO:360) . 6. Q E E A A A X Y D (SEQ ID NO:361) .
Como se usa en la presente, el término "Wrinkled 1" o "WRIl" también incluye proteínas "similares a Wrinkled 1" o "similares a WRIl". Los ejemplos de proteínas WRIl incluyen Nos. de Acceso: Q6X5Y6, [Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 280), XP_002876251.1 {Arabidopsis lyrata subesp. Lyrata; SEQ ID NO:281), ABD16282.1 {Brassica napus; SEQ ID NO:282), AD016346.1 [Brassica napus; SEQ ID NO:283), XP_003530370.1 [Glicina max; SEQ ID NO: 284), AE022131.1 [Jatropha curcas SEQ ID NO: 285), XP_002525305.1 (Ricinus communis; SEQ ID ' ??:28ß), XP_002316459.1 (Populus tríchocarpa; SEQ ID NO:287), CBI29147.3 [Vitis vinifera; SEQ ID NO:288), XP_003578997.1 [Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:289), BAJ86627.1 [Hordeum vulgare subesp. vulgare; SEQ ID NO: 290), EAY79792.1 [Oryza sativa; SEQ ID NO: 291), XP_002450194.1 [Sorghum bicolor; SEQ ID NO:292), ACG32367.1 [Zea mays; SEQ ID NO:293), XP_003561189.1 {Brachypodium distachyon; SEQ ID NO: 294), ABL85061.1 {Brachypodium sylvaticu ; SEQ ID NO: 295), BAD68417.1 {Oryza sativa; SEQ ID NO:296), XP_002437819.1 {Sorghum bicolor; SEQ ID NO: 297), XP_002441444.1 {Sorghum bicolor; SEQ ID NO:298), XP_003530686.1 [Glicina max; SEQ ID NO:299), XP_003553203.1 (Glicina max; SEQ ID NO:300), XP_002315794.1 {Populus trichocarpa; SEQ ID NO.301), XP_002270149.1 (Vitís vinifera; SEQ ID NO:302), XP_003533548.1 (Glicina max; SEQ ID NO:303), XP_003551723.1 (Glicina max; SEQ ID NO: 304), XP_003621117.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO: 305), XP_002323836.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO: 306), XP_002517474.1 (Ricínus communis; SEQ ID NO:307), CAN79925.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO: 308), XP_003572236.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO: 309), BAD10030.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO: 310), XP_002444429.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO: 311), NP_001170359.1 (Zea mays; SEQ ID NO:312), XP_002889265.1 (Arabidopsis lyrata subesp. lyrata; SEQ ID NO:313), AAF68121.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 314), NP_178088.2 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:315), XP_002890145.1 ( rabidopsis lyrata subesp. lyrata; SEQ ID NO: 316), BAJ33872.1 ( hellungiella halophila; SEQ ID NO: 317), NP_563990.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:318), XP_003530350.1 (Glicina max; SEQ ID NO:319), XP_003578142.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO: 320), EAZ09147.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:321), XP_002460236.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:322), NP_001146338.1 (Zea mays; SEQ ID NO: 323), XP_003519167.1 (Glicina max; SEQ ID NO:324), XP_003550676.1 (Glicina max; SEQ ID NO:325), XP_003610261.1 (Medicago trunca tul a; SEQ ID NO:326), XP_003524030.1 {Glicina max; SEQ ID NO.-327), XP_003525949.1 (Glicina max; SEQ ID NO:328), XP_002325111.1 {Populus trichocarpa; SEQ ID NO: 329), CBI36586.3 (Vitis vínifera; SEQ ID NO:330), XP_0022730 6.2 {Vitis vínifera SEQ ID NO:33U, XP_002303866.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO: 332;, y CBI25261.3 (Vitis vínifera; SEQ ID NO:333) . Otros ejemplos incluyen Sorbi-WRLl (SEQ ID NO: 334), Lupan-WRLl ( SEQ ID NO: 335), Ricco-WRLl (SEQ ID NO: 336), y Lupín angustí folius Y¡RI1 (SEQ ID NO: 337) .
Según se usa en la presente, el término "monoacilglicerol aciltransferasa" o "MGAT" se refiere a una proteina que transfiere un grupo de acilo graso de la acil-CoA a un sustrato MAG para producir DAG. Por lo tanto, el término "actividad monoacilglicerol aciltransferasa" se refiere al menos a la transferencia de un grupo acilo de la acil-CoA al MAG para producir DAG. La MGAT se conoce más por su rol en la absorción de grasa en el intestino de mamíferos, donde los ácidos grasos y sn-2 MAG generados por la digestión de la grasa de la dieta son resinteti zados en TAG en los enterocitos para la síntesis y secreción de quilomicrones. La MGAT cataliza el primer paso de este proceso, en donde se une covalentemente el grupo acilo de la acilo graso-CoA, formada a partir de ácidos grasos y CoA, con sr¡-2 MAG. El término "MGAT" según se usa en la presente incluye enzimas que actúan sobre sustratos sn-1/3 MAG y/o sn-2 MAG para formar sn-1,3 DAG y/o sn-1 , 2/2, 3-DAG, respectivamente. En una forma de realización preferida, la MGAT tiene preferencia por el sustrato sn-2 MAG con relación a sn-1 MAG o sustancialmente emplea solamente sn-2 MAG como sustrato (los ejemplos incluyen las MGAT que se describen en Cao et al., 2003 (especificidad de la MGATl de ratón por sn2-18 : 1-MAG > snl/3-18:1-MAG (Figura 5)); Yen y Farese, 2003 (las actividades generales de MGATl de ratón y de MGAT2 humana sobre 2-MAG son mayores que sobre sustratos aceptores de acilo 1-MAG (Figura 5); y Cheng et al., 2003 (la actividad de la MGAT3 humana sobre 2-MAG es mucho mayor que sobre los sustratos 1/3-MAG ( Figura 2D) ) .
Según se usa en la presente, la MGAT no incluye enzimas que transfieren preferencialmente un grupo acilo a LisoPA con relación a MAG, donde dichas enzimas se conocen como LPAAT. Es decir, una MGAT emplea preferencialmente sustratos de monoacilo no fosforilados , aun cuando pueden mostrar una actividad catalítica baja sobre LisoPA. Una MGAT preferida no tiene una actividad detectable en la acilación de LisoPA. Según se muestra en la presente, una MGAT (es decir, MGAT2 de M. musculus) también puede tener una función DGAT pero funciona predominantemente como una MGAT, es decir, tiene mayor actividad catalítica como una MGAT que como una DGAT cuando la actividad de la enzima se expresa en unidades de nmoles de producto/min/mg de proteina (véase también Yen et al., 2.002).
Hay tres clases conocidas de MGAT, denominadas, MGAT1, MGAT2 y MGAT3, respectivamente. Los homólogos del gen MGAT1 humano (AF384163, SEQ ID N° 7) están presentes (es decir, se conocen las secuencias) al menos en chimpancé, perro, vaca, ratón, rata, pez cebra, Caenorhabditi s elegans, Schi zosaccharomyces po be, Saccharomyces cerevisíae, Kluyveromyces lactís, Eremothecium gossypií , Magnaporthe grísea y Neurospora crassa. Los homólogos del gen MGAT2 humano (AY157608) están presentes al menos en chimpancé, perro, vaca, ratón, rata, pollo, pez cebra, mosca de la fruta y mosquito. Los homólogos del gen MGAT3 humano (AY229854) están presentes al menos en chimpancé, perro, vaca y pez cebra. Sin embargo, los homólogos de otros organismos se pueden identificar fácilmente mediante métodos conocidos en el arte de identificación de secuencias homologas.
Los e emplos polipéptidos de MGAT1 incluyen proteínas codificadas por los genes MGAT1 de Homo sapiens (AF384163; SEQ ID NO:7), Mus musculus (AF384162; SEQ ID N0:8), Pan troglodytes (XM_001166055 y XM_0526044.2; SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO:10, respectivamente), Canis familiaris (XM_545667.2; SEQ ID NO:ll), Bos taurus (NM 001001153.2; SEQ ID NO:12), Rattus norvegícus (NM_001108803.1; SEQ ID NO:13), Danio rerio MGAT1 (NM_001122623.1; SEQ ID NO:14), Caenorhabditis elegans (NM_073012.4, NM_182380.5, NM_065258.3, NM_075068.3, y NM_072248.3; SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, y SEQ ID NO: 19, respectivamente), Kluyvero yces lactis (XM_455588.1; SEQ ID NO:20), Ashbya gossypíi ( NM_208895.1 ; SEQ ID NO: 21), Magnaporthe oryzae ( XM_368741.1 ; SEQ ID NO: 22), Clona íntestinalís predicho (XM_002120843.1 SEQ ID NO:23) . Los ejemplos de polipéptidos de MGAT2 incluyen proteínas codificadas por los genes MGAT2 de Homo sapiens (AY157608; SEQ ID NO:24), Mus musculus (AY157609; SEQ ID NO: 25), Pan troglodytes (XM_522112.2; SEQ ID NO: 26), Canis familiaris ( XM_542304.1 ; SEQ ID NO: 27), Bos taurus (NM_001099136.1; SEQ ID NO:28), Rattus norvegícus (NM_001109436.2; SEQ ID NO:29), Gallus gallus ( XM_424082.2 ; SEQ ID NO:30), Danio rerio (NM_001006083.1 SEQ ID NO:31), Drosophila melanogaster ( NM_136474.2 , NM_136473.2, y NM_136475.2; SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, y SEQ ID NO:34, respectivamente), Anopheles gambiae ( XM_001688709.1 y XM_315985; SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, respectivamente), Tribolium castaneum (XM_970053.1 ; SEQ ID NO: 37). Los ejemplos de polipéptidos de MGAT3 incluyen proteínas codificadas por genes MGAT3 de Homo sapiens (AY229854; SEQ ID NO:38), Pan troglodytes (XM 001154107.1, XM 001154171.1, y XM_527842.2; SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, y SEQ ID NO: 41), Canis fawíliaris (X _845212.1; SEQ ID NO:42), Bos taurus (XM_870406.4 ; SEQ ID NO: 43), Danio rerío (XM_688413.4 ; SEQ ID NO: 44).
Según se usa en la presente, la "vía de MGAT" se refiere a una vía anabólica, diferente de la via Kennedy, para la formación de TAG, en la cual se forma DAG por la acilación de sn-1 MAG o, preferentemente, sn-2 MAG, catalizada por MGAT. El DAG se puede usar luego para formar TAG u otros lípidos. La via MGAT se muestra como ejemplo en la Figura 1.
Según se usa en la presente, el término "diacilglicerol aciltransferasa" (DGAT) se refiere a una proteina que transfiere un grupo de acilo graso de la acil-CoA a un sustrato DAG para producir TAG. Por lo tanto, el término "actividad diacilglicerol aciltransferasa" se refiere a la transferencia de un grupo acilo de la acil-CoA a DAG para producir TAG. Una DGAT también puede tener una función MGAT pero funciona predominantemente como una DGAT, es decir, tiene mayor actividad catalítica como una DGAT que como una MGAT cuando la actividad de la enzima se expresa en unidades de nmoles de producto/min/mg de proteína (véase, por ejemplo, Yen et al. , 2005) .
Hay tres tipos conocidos de DGAT denominados DGAT1, DGAT2 y DGA 3 respectivamente. Los polipéptidos de DGAT1 típicamente tienen 10 dominios transmembrana, los polipéptido de DGAT2 típicamente tienen 2 dominios transmembrana, en tanto los polipéptidos DGAT3 típicamente no tienen ninguno y se cree que son solubles en el citoplasma, no estando integrados en las membranas. Los e emplos de polipéptidos DGAT1 incluyen proteínas codificadas por los genes DGAT1 de Aspergillus fumigatus (XP_755172.1 ; SEQ ID NO: 347), Arabídopsis thaliana ( CAB44774.1 ; SEQ ID NO: 83), Ricinus communis (AAR11479.1; SEQ ID NO: 348), Vernícía fordíi (ABC94472.1; SEQ ID NO: 349), Vernonia gala ensís (ABV21945.1 y ABV21946.1; SEQ ID NO:350 y SEQ ID NO:351, respectivamente), Euonymus alatus (AAV31083.1; SEQ ID NO:352), Caenorhabdítís elegans (AAF82410.1; SEQ ID NO:353), Rattus norvegicus (NP_445889.1; SEQ ID NO: 354), Homo sapiens (NP_036211.2; SEQ ID NO: 355), así como variantes y/o mutantes de los mismos. Los ejemplos de polipéptidos de DGAT2 incluyen proteínas codificadas por genes de DGAT2 de Arabídopsis thaliana (NP_566952.1 ; SEQ ID N°:212), Ricinus communis (AAY16324.1; SEQ ID N°:213), Vernicia fordii (ABC94474.1; SEQ ID N°:214), Mortierella ramanniana (AA 84179.1; SEQ ID N°:215), Homo sapiens (Q96PD7,2; SEQ ID N°:216) (Q58HT5.1; SEQ ID N°:217), Bos taurus (Q70VZ8.1; SEQ ID N°:218), Mus musculus (AAK84175.1; SEQ ID N°:219), así como variantes y/o mutantes de los mismos.
Los ejemplos de polipéptidos DGAT3 incluyen proteínas codificadas por los genes DGAT3 de maní (Arachis hypogaea, Sana, et al., 2006), así como variantes y/o mutantes de los mismos. Una DGAT tiene poca o ninguna actividad MGAT detectable, por ejemplo, menos que 300 pmol/min/mg de proteína, preferentemente menos que 200 pmol/min/mg de proteína, más preferentemente menos de 100 pmol/min/mg de proteína .
La DGAT2, pero no DGAT1, comparte una gran homología de secuencia con las enzimas MGAT, lo cual sugiere que los genes de DGAT2 y MGAT probablemente comparten un origen genético común. Aunque se conocen múltiples isoformas relacionadas con la catálisis del mismo paso de síntesis de TAG, pueden cumplir distintos roles funcionales, como lo sugiere la distribución tisular diferencial y la localización subcelular de la familia de enzimas DGAT/MGAT . En mamíferos, la MGAT1 se expresa principalmente en estómago, riñon, tejido adiposo, en tanto MGAT2 y MGAT3 muestran la mayor expresión en el intestino delgado. En mamíferos, DGAT1 se expresa de manera ubicua en muchos tejidos, pero con mayor expresión en el intestino delgado, en tanto DGAT2 es más abundante en el hígado. MGAT3 solamente existe en mamíferos superiores y seres humanos, pero no en roedores según un análisis bioinformático . MGAT3 comparte una mayor homología de secuencia con DGAT2 que MGAT1 y MGAT3. MGAT3 presenta una actividad DGAT significativamente mayor que las enzimas MGAT1 y MGAT2 (MGAT3 > MGAT1 > MGAT2 ) cuando se usó cualquier MAG o DAG como sustrato, lo cual sugiere que MGAT3 funciona como una TAG sintasa putativa.
Ambas MGAT1 y MGAT2 pertenecen a la misma clase de aciltransferasas que la DGAT2. Algunos de los motivos que han demostrado ser importantes para la actividad catalítica de DGAT2 en algunas DGAT2, también están conservados en las aciltransferasas MGAT . De particular interés es un dominio de unión a lípidos neutros putativo con la secuencia consenso FLXLXXXN (SEQ ID N°: 224), donde cada X es de manera independiente cualquier aminoácido distinto de prolina, y N es cualquier aminoácido no polar, ubicado dentro de la región transmembrana N-terminal seguido por un dominio glicerol/ fosfolipido aciltransferasa putativo. El motivo FLXLXXXN está presente en la DGA 2 (aminoácidos 81-88) y en la MGAT1/2 de ratón pero no en las DGAT2 de levaduras o plantas. Es importante para la actividad de la DGAT2 de ratón. Otros motivos de secuencias de DGAT2 y/o MGAT1/2 incluyen : 1. Un tripéptido YFP altamente conservado (SEQ ID N°:220) en la mayoría de los polipéptidos de DGAT2 y también en MGAT1 y MGAT2, por ejemplo, presente como los aminoácidos 139-141 en DGAT2 de ratón. Una mutación de este motivo dentro de la DGAT2 de levadura con sustituciones no conservadoras volvió a la enzima no funcional. 2. Un tetrapéptido HPHG (SEQ ID N°: 221), altamente conservado en las MGAT asi como en las secuencias de DGAT2 de animales y hongos, por ejemplo, presente como los aminoácidos 161-164 en DGAT2 de ratón, e importante para la actividad catalítica al menos en DGAT2 de levadura y ratón. Las aciltransferasas DGAT2 de plantas contienen en su lugar una secuencia conservada EPHS (SEQ ID N°: 222), de modo que se pueden tolerar cambios conservadores en el primer y cuarto aminoácidos . 3. Un motivo conservado más largo que forma parte del dominio putativo de fosfolípido glicerol. Un ejemplo de este motivo es RXGFX ( /R ) XAXXXGXXX ( L/V) VPXXXFG ( E/Q ) ( SEQ ID N°: 223), que está presente como los aminoácidos 304-327 en la DGAT2 de ratón. Este motivo está menos conservado en una secuencia de aminoácidos que los demás, como sería de esperar por su longitud, pero se pueden reconocer homólogos mediante búsqueda de motivos. El espaciado puede variar entre los aminoácidos más conservados, es decir, puede existir X aminoácidos adicionales o X aminoácidos menos dentro del motivo en comparación con la secuencia anterior.
Según se usa en la presente, el término "glicerol-3- fosfato aciltransferasa" o "GPAT" se refiere a una proteína que acila glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar LisoPA y/o MAG, donde éste último producto se forma si la GPAT también tiene actividad fosfatasa sobre LisoPA. El grupo acilo transferido típicamente es de la acil-CoA. Por lo tanto, el término "actividad glicerol-3-fosfato aciltransferasa" se refiere a la acilación de G-3-P para formar LisoPA y/o MAG. El término "GPAT" abarca enzimas que acilan G-3-P para formar sn-1 LPA y/o sn-2 LPA, preferentemente sn-2 LPA. En una forma de realización preferida, la GPAT tiene actividad fosfatasa. En una forma de realización más preferida aún, la GPAT es una sn-2 GPAT que tiene una actividad fosfatasa que produce sn-2 MAG.
Según se usa en la presente, el término n sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa" {sn-1 GPAT) se refiere a una proteína que acila sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar preferencialmente l-acil-sn-glicerol-3-fosfato {sn-1 LPA). Por lo tanto, el término "actividad sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa" se refiere a la acilación de sr¡-glicerol-3-fosfato para formar l-acil-s.n-glicerol-3-fosfato {sn-1 LPA).
Según se usa en la presente, el término "sn-2 glicerol-3-fosfato aciltransferasa" (sn-2 GPAT) se refiere a una proteína que acila sn-glicerol-3-fos fato (G-3-P) para formar preferencialmente 2-acil-sn-glicerol-3-fosfato ( sn-2 LPA) .
Por lo tanto, el término "actividad sn-2 glicerol-3-fosfato aciltransferasa" se refiere a la acilación de s.n-glicerol-3-fosfato para formar 2-acil-sr¡-glicerol-3-fosfato [sn-2 LPA) .
La familia GPAT es grande y todos los miembros conocidos contienen dos dominios conservados, un dominio plsC aciltransferasa (PF01553; SEQ ID N°: 225) y un dominio de la superfamilia de hidrolasas tipo HAD (PF12710; SEQ ID N°: 226) . Además de esto, en Arabidopsis thaliana, la GPAT4-8 contiene una región N-terminal homologa de un dominio fosfoserina fosfatasa (PF00702; SEQ ID N°:227) . Ambas GPAT4 y GPAT6 contienen residuos conservados conocidos por ser críticos para la actividad fosfatasa, específicamente aminoácidos conservados (indicados en negritas) en el Motivo I (DXDX[T/V] [L/V] ; SEQ ID N°:229) y en el Motivo III (K-[G/S] [D/S]XXX[D/N] ; SEQ ID N°:330) ubicados por el extremo N-terminal (Yang et al., 2010) . Preferentemente, la GPAT tiene preferencia por sn-2 y actividad fosfatasa para producir sn-2 MAG (también denominado "2-MAG" en la presente) a partir de glicerol-3-fosfato (G-3-P) (Figura 1), por ejemplo, ( GPAT4 (NP_171667.1, SEQ ID N°144) y GPAT6 ( NP_181346.1 , SEQ ID N°145) ) de Arabidopsis. Más preferentemente, la GPAT emplea acil-CoA como sustrato de ácidos grasos.
Los homólogos de GPAT4 ( NP_171667.1 ; SEQ ID NO: 144) y GPAT6 (NP_181346.1; SEQ ID NO:145) incluyen AAF02784.1 {Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 146), AAL32544.1 {Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 147), AAP03413.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:148), ABK25381.1 (Pícea sitchensis; SEQ ID NO:149), ACN34546.1 (Zea Mays; SEQ ID NO:150), BAF00762.1 [Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:151), BAH00933.1 {Oryza sativa; SEQ ID NO:152), EAY84189.1 [Oryza sativa; SEQ ID NO:153), EAY98245.1 {Oryza sativa; SEQ ID NO:154), EAZ21484.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO: 155), EEC71826.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:156), EEC76137.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:157), EEE59882.1 (Oryza sativa; SEQ ID N0.158), EFJ08963.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO: 159), EFJ08964.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:160), EFJ11200.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO: 161), EFJ15664.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO: 162), EFJ24086.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO: 163), EFJ29816.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO: 164), EFJ29817.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:165), NP_001044839.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO: 166), NP_001045668.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:167), NP_001147442.1 (Zea mays; SEQ ID NO:168), NP_001149307.1 (Zea mays; SEQ ID NO:169), NP_001168351.1 (Zea mays; SEQ ID NO: 170), AFH02724.1 (Brassica napus; SEQ ID NO: 171) NP_191950.2 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO: 172), XP_001765001.1 ( Physcomi trella patens; SEQ ID NO:173), XP_001769671.1 ( Physcomi trella patens; SEQ ID NO: 174), XP_001769724.1 {Physcomitrella patens SEQ ID NO:175) XP_001771186.1 {Physcomítrella patens; SEQ ID NO:176) XP_001780533.1 {Physcomitrella patens; SEQ ID NO: 177) XP_002268513.1 (Vitis vínifera; SEQ ID NO:178) XP_002275348.1 {Vitis vínifera; SEQ ID NO: 179) XP_002276032.1 {Vitis vínifera; SEQ ID NO:180) XP_002279091.1 {Vitis vínif ra; SEQ ID NO: 181 ) XP_002309124.1 ( Populus trichocarpa; SEQ ID NO: 182 ) XP_002309276.1 { Populus trichocarpa; SEQ ID NO:183) XP_002322752.1 { Popul us trichocarpa; SEQ ID NO:184) XP_002323563.1 ( Populus trichocarpa; SEQ ID NO:185) XP_002439887.1 { Sorghum bi color; SEQ ID NO:186) XP_002458786.1 { Sorghum bi color; SEQ ID NO:187) XP_002463916.1 { Sorghum bicolor; SEQ I DNO:188) XP_002464630.1 { Sorghum bi color; SEQ I DNO:189) XP_002511873.1 ( Ricinus communis; SEQ ID NO:190) XP_002517438.1 { Ri cinus communi s; SEQ ID NO:191) XP_002520171.1 { Ricinus communí s; SEQ ID NO:192) XP_002872955.1 {Arabidopsís lyrata; SEQ ID NO:193) XP 002881564.1 {Arabidopsís lyrata; SEQ ID NO:194) ACT32032.1 {Vernicía fordii; SEQ ID NO: 195), NP_001051189.. {Oryza sativa; SEQ ID NO:196), AFH02725.1 {Brassica napus SEQ ID NO: 197), XP_002320138.1 {Populus trichocarpa; SEQ ID NO: 198), XP 002451377.1 {Sorghum bicolor; SEQ ID NO: 199) XP_002531350.1 {Ricinus communís; SEQ ID NO:200), y XP_002889361.1 (Arabídopsis lyrata; SEQ ID NO:201).
Los motivos y/o residuos conservados se pueden usar como elemento diagnóstico basado en secuencias para la identificación de enzimas GPAT/ fosfatasa bifuncionales . Como alternativa, se podría usar un ensayo basado en la función más severo. Dicho ensayo comprende, por ejemplo, alimentar glicerol-3-fosfato marcado a células o microsomas y cuantificar los niveles de productos marcados por cromatografía en capa delgada o una técnica similar. La actividad GPAT da como resultado la producción de LPA marcado en tanto la actividad GPAT/ fosfatasa da como resultado la producción de MAG marcado.
Como se usa en la presente, el término "Oleosina" hace referencia a una proteína anfipática presente en la membrana de los cuerpos grasos en te idos de almacenamiento de semillas (véase, por ejemplo, Huang, 1996; Lin et al., 2005; Capuano et al., 2007; Lui et al., 2009; Shimada y Hara-Nishimura, 2010) .
Las semillas de las plantas acumulan TAG en estructuras subcelulares llamadas cuerpos grasos. Estas organelas consisten en un núcleo de TAG rodeado por una monocapa de fosfolípidos que contienen varias proteínas embebidas que incluyen oleosinas (Jolivet et al., 2004). Las oleosinas representan la proteína más abundante en la membrana de los cuerpos grasos.
Las oleosinas son de bajo Mr (15-26.000). En cada especie de semillas, usualmente hay dos o más oleosinas de diferente Mr. Cada molécula de oleosina contiene un dominio N terminal relativamente hidrofilico (por ejemplo, aproximadamente 48 residuos de aminoácidos), un dominio central totalmente hidrofóbico (por ejemplo, de aproximadamente entre 70 y 80 residuos de aminoácidos) que es particularmente rico en aminoácidos alifáticos tales como alanina, glicina, leucina, isoleucina y valina, y un dominio a-hélice anfipático (por ejemplo, de aproximadamente 33 residuos de aminoácidos) en o cerca del extremo C terminal. Generalmente, la extensión central de residuos hidrofóficos se inserta en el núcleo lipídico y los extremos N terminal anfipático y/o C terminal anfipático están localizados en la superficie de los cuerpos grasos, con los residuos cargados positivamente embebidos en una monocapa de fosfolípidos y los cargados negativamente expuestos hacia el exterior.
Como se usa en la presente, el término "oleosina" abarca polioleosinas que tienen múltiples polipéptidos oleosina fusionados junto a un polipéptido simple, por ejemplo 2x, 4x o 6x péptidos oleosina, y caleosinas que unen calcio (Froissard et al., 2009), y esteroleosinas que unen esteróles. Sin embargo, generalmente una gran proporción de las oleosinas de cuerpos grasos ' no serán caleosinas y/o esteroleosinas .
Un número sustancial de secuencias de proteina oleosina, y secuencias de nucleótidos que codifican para las mismas, son conocidas de un gran número de diferentes especies vegetales. Los ejemplos incluyen, a titulo enunciativo no taxativo, oleosinas de Arabidposís, cañóla, maíz, arroz, maní, castor, soja, lino, uva, repollo, algodón, girasol, sorgo y cebada. Los ejemplos de oleosinas (con sus Nos. de Acceso) incluyen oleosina de Brassica napus (CAA57545.1; SEQ ID NO:362), oleosina Sl-1 de Brassica napus (ACG69504.1; SEQ ID NO:363), oleosina S2-1 de Brassica napus (ACG69503.1; SEQ ID NO:364), oleosina S3-1 de Brassica napus (ACG69513.1; SEQ ID NO:365), oleosina S4-1 de Brassica napus (ACG69507.1; SEQ ID NO: 366), oleosina S5-1 de Brassica napus (ACG69511.1; SEQ ID N0:367), oleosina 1 de Arachis hypogaea (AAZ20276.1; SEQ ID NO:368), oleosina 2 de Arachis hypogaea (AAU21500.1; SEQ ID NO:369), oleosina 3 de Arachis hypogaea (AAU21501.1; SEQ ID NO: 370), oleosina 5 de Arachis hypogaea (ABC96763.1; SEQ ID NO:371), oleosina 1 de Ricinus communis (EEF40948.1; SEQ ID NO:372), oleosina 2 de Ricinus communis (EEF51616.1; SEQ ID NO: 373), isoforma a de oleosina de Glicina max (P29530.2; SEQ ID NO:374), isoforma b de oleosina de Glicina max (P29531.1; SEQ ID NO:375), isoforma de bajo peso molecular de oleosina de Línum usitatissimum (ABB01622.1; SEQ ID NO: 376), isoforma de alto peso molecular de oleosina de Línum usitatissimum (ABB01624.1; SEQ ID NO:377), oleosina de Helianthus annuus (CAA44224.1; SEQ ID NO:378), oleosina de Zea mays (NP_001105338.1; SEQ ID NO:379), esteroleosina de Brassica napus (ABM30178.1; SEQ ID NO:380), esteroleosina SL01-1 de Brassica napus (ACG69522.1; SEQ ID NO: 381), esteroleosina SL02-1 de Brassica napus (ACG69525.1; SEQ ID NO:382), esteroleosina de Sesamu indicum (AAL13315.1; SEQ ID NO:383), esteroleosina de Zea ays (NP_001152614.1; SEQ ID NO:384), caleosina CLO-1 de Brassica napus (ACG69529.1; SEQ ID NO:385), caleosina CLO-3 de Brassica napus (ACG69527.1; SEQ ID NO: 386), caleosina de Sesamum indicum (AAF13743.1; SEQ ID NO:387), caleosina de Zea mays { NP_001151906.1 ; SEQ ID NO:388) .
Como se usa en la presente, el término un "polipéptido involucrado en la biosintesis de almidón" hace referencia a cualquier polipéptido, cuya disminución en una célula por debajo de los niveles normales (tipo salvaje) da como resultado una reducción en el nivel de la síntesis de almidón y una disminución en los niveles de almidón. Un ejemplo de dicho polipéptido es AGPasa.
Como se usa en la presente, el término "ADP-glucosa fosforilasa" o "AGPasa" hace referencia a una enzima que regula la biosintesis de almidón, catalizando la conversión de glucosa-l-fosfato y ATP a ADP-glucosa que sirve como el bloque de construcción para los polímeros de almidón. La forma activa de la enzima AGPasa consiste de 2 subunidades grandes y 2 pequeñas.
La enzima ADPasa en plantas existe principalmente como un tetrámero que consiste de 2 subunidades grandes y 2 pequeñas. A pesar de que estas subunidades difieren en sus papeles catalíticos y regulatorios dependiendo de la especie (Kuhn et al., 2009), en las plantas la subunidad pequeña generalmente muestra una actividad catalítica. El peso molecular de la subunidad pequeña es aproximadamente entre 50 y 55 kDa. El peso molecular de la unidad grande es aproximadamente entre 55 y 60 kDa. La enzima vegetal es activada fuertemente por 3-fosfoglicerato (PGA), un producto de la fijación de dióxido de carbono; en ausencia de PGA, la enzima exhibe sólo aproximadamente 3% de su actividad. La AGPasa vegetal también es inhibida fuertemente por fosfato inorgánico (Pi) . Por el contrario, la AGPasa bacteriana y de algas existe como homotetrámeros de 50kDa. La enzima de algas, tal como su contraparte vegetal, es activada por PGA e inhibida por Pi, mientras que la enzima bacteriana es activada por f uctosa-1 , 6-bis fosfato (FBP) e inhibida por AMP y Pi.
Como se usa en la presente, el término "polipéptido involucrado en la degradación lipidos y/o que reduce el contenido de lipidos" hace referencia a cualquier polipéptido, cuya disminución en una célula por debajo de los límites normales (de tipo salvaje) resulta en un aumento en el nivel de aceites, tal como ácidos grasos y/ o TAG, en la célula, preferentemente una célula de tejido vegetativo de una planta. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen, a título enunciativo no taxativo, lipasas, o una lipasa tal como polipéptido CGÍ58, triacilglicerol lipasa SUGAR-DEPENDENT1 (véase, por ejemplo, Kelly et al., 2012) o una lipasa descrita en WO 2009/027335.
Como se usa en la presente, el término lipasa" hace referencia a una proteína que hidroliza grasas a glicerol y ácidos grasos. Por lo tanto, el término "actividad lipasa" hace referencia a la hidrólisis de grasas a glicerol y ácidos grasos.
Como se usa en la presente, el término "CGÍ58" hace referencia a una ácido lisofos fatídico acil trans ferasa soluble dependiente de acil-CoA también conocida en el arte como "At4g24160" (en plantas) y "Ictlp" (en levaduras) . El gen vegetal tal como el del locus del gen de Arabidopsís, At4g24160, se expresa como dos transcriptos alternativos: una isoforma de longitud completa más larga ( At4g24160.1 ) y una isoforma más pequeña (At4g24160.2 ) que carece de una porción del extremo 3' (véase James et al., 2010; Ghosh et al., 2009; US 201000221400) . Ambos ARNm codifican para una proteína que es homologa a la proteina CGI-58 humana y otros miembros ortólogos de esta familia de a/ ß hidrolasa (ABHD) . En una forma de realización, la proteina CGI58 (At4g24160) contiene tres motivos que están conservados entre las especies vegetales: un motivo GXSXG de lipasa (SEQ ID NO: 419), un motivo HX(4)D de aciltrans ferasa (SEQ ID NO:420), y VX(3)HGF, un motivo de unión a lipidos probable (SEQ ID NO:421) . La proteína CGI-58 humana tiene actividad ácido lisofosfatídico aciltransferasa (LPAAT) pero no actividad lipasa. Por el contrario, las proteínas vegetales y de levaduras poseen un motivo GXSXG de secuencia de lipasa canónico (SEQ ID NO: 419), que está ausente en proteínas de vertebrados (humanos, ratones, y peces cebra). A pesar de que la proteína CGI58 vegetal y de levaduras parece que poseen cantidades detectables de actividades TAG lipasa y fosfolipasa A además de la actividad de LPAAT, la proteína humana no.
La alteración del gen CGI-58 homólogo en Arabidopsis thaliana da como resultado la acumulación de gotas de lipidos neutros en hojas maduras. La espectrometría de masas de gotas de lipidos aisladas de mutantes con pérdida de función cgí-58 mostró que las mismas contienen triacilgliceroles con ácidos grasos específicos de hojas comunes. Las hojas de plantas cgí-58 maduras exhiben un aumento marcado en los niveles absolutos de triacilglicerol , más de 10 veces mayor que en las plantas de tipo salvaje. Los niveles de lípidos en las semillas que almacenan aceite de las plantas cgi-58 con pérdida de función no cambiaron, y a diferencia de mutaciones en la ß-oxidación, las semillas de cgi-58 germinaron y crecieron normalmente, sin requerir rescate con sacarosa (James et al., 2010) .
Los ejemplos de polipéptidos CGÍ58 incluyen proteínas de Arabidopsis thaliana (NP_194147.2; SEQ ID NO: 429), Brachypodíum distachyon (XP_003578450.1; SEQ ID NO: 430), Glicina max (XP_003523638.1; SEQ ID NO: 431), Zea mays (NP_001149013.1; SEQ ID NO:432), Sorghum bicolor (XP_002460538.1; SEQ ID NO:433), Ricinus com unis (XP_002510485.1; SEQ ID NO: 434), Medicago truncatula (XP_003603733.1; SEQ ID NO:435), y Oryza sativa (EAZ09782.1; SEQ ID NO: 436) .
Como se usa en la presente, el término "Leafy Cotyledon 2" o "LEC2" hace referencia a un factor de transcripción del dominio B3 que participa en la embriogénesis cigótica y somática. Su expresión ectópica facilita la embriogénesis de tejidos de plantas vegetativas (Alemanno et al., 2008). El LEC2 también comprende una región de unión a ADN encontrada hasta el momento sólo en proteínas vegetales. Los ejemplos de polipéptidos LEC2 incluyen proteínas de Arabidopsis thaliana (NP_564304.1) (SEQ ID NO: 442), Medicago truncatula (CAA42938.1) (SEQ ID NO:443) y Brassica napus (AD016343.1) (SEQ ID NO: 444 ) .
Como se usa en la presente, el término "BABY BOOM" o "BBM" hace referencia a un factor de transcripción AP2/ERF que induce regeneración bajo condiciones de cultivo que normalmente no estimulan la regeneración en plantas de tipo salvaje. La expresión ectópica de los genes de BBM de Brassica napus {BnBBM) en B. napus y Arabidopsis induce la embriogénesis somática y organogénesis espontáneas de plántulas hechas crecer en medio basal libre de hormonas (Boutilier et al., 2002). En tabaco, la expresión ectópica de BBM es suficiente para inducir regeneración de brotes adventicios y raíces en medio basal, pero se requiere citoquina exógena para la formación de embriones somáticos (SE) (Srinivasan et al., 2007) . Los ejemplos de polipéptidos BBM incluyen proteínas de Arabidopsis thaliana (NP_197245.2 ) (SEQ ID NO: 445) y Medicago truncatula (AAW82334.1) (SEQ ID NO: 446) .
Como se usa en la presente, el término "FAD2" hace referencia a una desaturasa de ácidos grasos delta-12 unida a membrana que desatura el ácido oleico para producir ácido oleico (18:1?9) para producir ácido linoleico ( C18 : 2?9, 12 ) .
Como se usa en la presente, el término "epoxigenasa" o "epoxigenasa de ácidos grasos" hace referencia a una enzima que introduce un grupo epoxi en un ácido graso que resulta en la producción de un ácido graso epoxi. En una forma de realización preferida, el grupo epoxi se introduce en el carbono 12 de una cadena de ácido graso, en cuyo caso la epoxigenasa es una A12-epoxigenasa , especialmente de una cadena de ácido graso de C16 o C18. La epoxigenasa puede ser una A9-epoxigenasa, una ?15 epoxigenasa, o actuar en una posición diferente en la cadena de acilos como se conoce en el arte. La epoxigenasa puede ser de la clase P450. Las epoxigenasas preferidas son de la clase mono-oxigenasa como se describe en W098/46762. Se han clonado numerosas epoxigenasas o epoxigenasas presumidas y son conocidas en el arte. Otros e emplos de expoxigenasas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos provista en SEQ ID NO: 21 de WO 2009/129582, polipéptidos codificados por los genes de Crepis paleastína (CAA76156, Lee et al., 1998), Stokesia laevis (AAR23815, Hatanaka et al., 2004) (tipo monooxigenasa ) , Euphorbia lagascae (AAL62063) (tipo P450), CYP2J2 humano (ácido araquidónico epoxigenasa, U37143); CYPIA1 humano (ácido araquidónico epoxigenasa, K03191), así como variantes y/o mutantes de los mismos.
Como se usa en la presente, el término, "hidrolasa" o "hidrolasa de ácido grasos" hace referencia a una enzima que introduce un grupo hidroxilo en un ácido graso que da como resultado la producción de un ácido graso hidroxilado. En una forma de realización preferida, el grupo hidroxilo es introducido en el 2do, 12do y/o 17vo carbono de una cadena de C18. Preferentemente, el grupo hidroxilo se introduce en el carbono 12do, en cuyo caso la hidrolasa es una A12-hidrolasa . En otra forma de realización preferida, el grupo hidroxilo se introduce en el carbono 15to en una cadena de ácido graso C16. Las hidrolasas también pueden tener actividad enzimática como una ácido graso desaturasa. Los ejemplos de genes que codifican para A12-hidrolasas incluyen aquellos de Ricínus communis (AAC9010, van de Loo 1995); Physaria lindhei eri , (ABQ01458, Dauk et al., 2007); Lesquerella fendleri, (AAC32755, Broun et al., 1998); Daucus carota, (AAK30206); hidrolasas de ácidos grasos que hidroxilan el extremo de los ácidos grasos, por ejemplo: A, thaliana CYP86A1 (P48422, ácido graso ?-hidrolasa ) ; Vicia sativa CYP94A1 (P98188, ácido graso ?-hidrolasa ) ; CYP2E1 de ratón (X62595, ácido láurico ?-1 hidrolasa); CYP4A1 de rata (M57718, ácido graso ?-hidrolasa) , asi como variantes y/o mutantes de las mismas.
Como se usa en la presente, el término "conjugasa" o "ácido graso conjugasa" hace referencia a una enzima que tiene la capacidad de formar un enlace conjugado en la cadena de acilos de un ácido graso. Los ejemplos de conjugados incluyen aquellos codificados por genes de Caléndula officinalis (AF343064, Qiu et al.f 2001); Vernícia fordii (AAN87574, Dyer et al., 2002); Púnica granatum (AY178446, Iwabuchi et al., 2003) y Trichosanth&s kirilowíi (AY178444, Iwabuchi et al., 2003); asi como variantes y/o mutantes de los mismos.
Como se usa en la presente, el término " acetilenasa" o "ácido graso acetilenasa" hace referencia a una enzima que introduce un triple enlace a un ácido graso que da como la producción de un ácido graso acetilénico. En una forma de realización preferida, el triple enlace se introduce en el 2do, 6to, 12do y/o 17mo carbono en una cadena de ácido graso C18. Los ejemplos de acetilenasas incluyen aquellas de Helianthus annuus (AA038032, ABC59684), así como las variantes y/o mutantes de las mismas.
Los e emplos de genes que modifican los ácidos grasos incluyen proteínas de acuerdo a los siguientes Números de Acceso que están agrupados por su función putativa, y homólogos de otras especies: ?12 acetilenasas ABC00769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; ?12 conjugasas AAG42259, AAG42260, AAN87574; ?12 desaturasas P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; ?12 epoxigenasas XP_001840127, CAA76156, AAR23815; ?12 hidrolasas ACF37070, AAC32755, ABQ01458, AAC49010; y enzimas ?12 P450 tal como AF406732.
Como se usa en la presente, el término "tejido vegetativo " o "parte vegetativa de la planta" es cualquier tejido vegetal, órgano o parte diferente de los órganos para la reproducción sexual de las plantas, específicamente órganos que portan semillas, flores, polen, frutos y semillas. Los tejidos y partes vegetativos incluyen al menos hojas de las plantas, tallos (que incluye espigamientos y macollos pero que excluye los cogollos), tubérculos y raices, pero excluye flores, polen, semillas que incluyen el recubrimiento de semillas, embrión y endosperma, frutos que incluye tejido de mesocarpio, vainas que portan semillas y cogollos que portan semillas. En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta es una parte aérea de la planta. En otra forma de realización o adicional, la parte vegetativa de la planta es una parte verde tal como una hoja o tallo.
Según se usa en la presente, el término "tipo salvaje" o variaciones del mismo se refieren a una célula o a un organismo no humano o a una parte del mismo que no ha sido modificado genéticamente.
El término "que corresponde" hace referencia a una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla que tiene el mismo antecedente genético o similar que una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla de la invención pero que no ha sido modificado como se describe en la presente (por ejemplo, una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla que carece de un polinucleotido exógeno que codifica para una MGAT o una MGAT exógena) . En una forma de realización preferida, una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla está en el mismo estadio de desarrollo que una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla de la invención. Por e emplo, si el organismo no humano es una planta con flores, entonces preferentemente la correspondiente planta también tiene flores. Una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla correspondiente se puede usar como un control para comparar niveles de ácido nucleico o de expresión de proteína, o la extensión y naturaleza de la modificación de rasgo, por ejemplo producción y/o contenido de lípidos no polares, con una parte vegetativa de la planta, una célula, u organismo no humano o una parte del mismo, o semilla modificado como se describe en la presente. Una persona con experiencia en el arte fácilmente tendrá la capacidad de determinar una célula, tejido, órgano u organismo "correspondiente" apropiado para dicha comparación.
Según se usa en la presente "comparado con" se refiere a la comparación de niveles de un lipido no polar o del contenido total de lípidos no polares del organismo no humano transgénico, o una parte del mismo, que expresa dichos uno o más polinucleótidos exógenos o polipeptidos exógenos con un organismo no humano transgénico, o una parte del mismo, que no contiene a dichos uno o más polinucleótidos o polipéptidos exógenos .
Según se usa en la presente, "mayor capacidad para producir lipidos no polares" es un término relativo que se refiere a la cantidad total de lipidos no polares producida por una célula, o por un organismo no humano o una parte del mismo, de la invención que es incrementada con relación a una célula, o un organismo no humano o una parte del mismo, correspondiente. En una forma de realización, aumenta el contenido de TAG y/o ácidos grasos poliinsaturados del lipido no polar.
Como se usa en la presente, "germinar a una tasa sustancialmente igual que la de la correspondiente planta de tipo salvaje" hace referencia a una semilla de una planta de la invención que es relativamente fértil en comparación a una semilla de una planta de tipo salvaje que carece del o los polinucleótidos exógenos definidos. En una forma de realización, el número de semillas que germinará, por ejemplo cuando se hicieron crecer bajo condiciones de vivero óptimas para la especie de la planta, es al menos 75%, más preferentemente al menos 90%, de la de cuando se compara a la correspondiente semilla de tipo salvaje. En otra forma de realización, las semillas que germinan, por ejemplo cuando se hicieron crecer bajo condiciones de vivero óptimas para la especie de la planta, crecidas a una tasa que, en promedio, es al menos 75%, más preferentemente al menos 90%, de cuando se compara a las correspondientes plantas de tipo salvaje.
Según se usa en la presente, el término "un polinucleotido aislado o recombinante que disminuye la regulación de la producción y/ o actividad de una enzima endógena" o variaciones del mismo, se refiere a un polinucleotido que codifica una molécula de ARN que disminuye la regulación de la producción y/o actividad (por ejemplo, que codifica un ARNpi, ARNih), o que por si mismo disminuye la regulación de la producción y/o actividad (por ejemplo, es un ARNpi que se puede administrar directamente, por ejemplo, a una célula) de una enzima endógena por ejemplo, DGAT, sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT), l-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa (LPAAT), acil- CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferasa (LPCAT), ácido fosfatidico fosfatasa (PAP), AGPasa, o delta-12 ácido graso desaturasa ( FAD2 ) , o una combinación de dos o más de los mismos .
Según se usa en la presente, el término "sobre una base ponderal" se refiere al peso de una sustancia (por ejemplo, TAG, DAG, ácidos grasos) como un porcentaje del peso de la composición que comprende la sustancia (por ejemplo, semillas, hojas). Por ejemplo, si una semilla transgénica contiene 25 µg de ácidos grasos totales por cada 120 µg de peso de la semilla; el porcentaje de ácidos grasos totales sobre una base ponderal es del 20,8%.
Según se usa en la presente, el término "sobre una base relativa" se refiere a la cantidad de una sustancia en una composición que comprende la sustancia en comparación con una composición correspondiente, como un porcentaje.
Según se usa en la presente, el término "el contenido no lipídico relativo" se refiere a la expresión del contenido de lípidos no polares de una célula, organismo o una parte del mismo, o a los lipidos extraídos de los mismos, en comparación con una célula, organismo o una parte del mismo, correspondiente o al lipido extraído de la célula, organismo o una parte del mismo, correspondiente como un porcentaje. Por ejemplo, si una semilla transgénica contiene 25 µg de ácidos grasos totales, en tanto la semilla correspondiente tenía 20 µg de ácidos grasos totales; el incremento en el contenido de lipido no polar sobre una base relativa es igual al 25%.
Como se usa en la presente, el término "biocombust ible" hace referencia a cualquier tipo de combustible, típicamente como se usa para maquinaria de energía tal como automóviles, camiones o motores potenciados por petróleo, cuya energía deriva de la fijación de carbono biológico. Los biocombustibles incluyen combustibles derivados de la conversión de biomasa, así como biomasa sólida, combustibles líquidos y biogases. Los ejemplos de biocombustibles incluyen bioalcoholes, biodiésel, diésel sintético, aceite vegetal, bioéteres, biogas, syngas, biocombustibles sólidos, combustible derivado de algas, biohidrógeno, biometanol, 2,5-Dimetilfurano (DMF), biodimetil éter (bioDME), Fischer-Tropsch diésel, diésel biohidrógeno, alcoholes mezclados y diésel de madera.
Como se usa en la presente, el término "bioalcohol" hace referencia a un alcohol biológicamente producido, por ejemplo, etanol, propanol y butanol. Los bioalcoholes son producidos por acción de microorganismos y/o enzimas por medio de la fermentación de azúcares, hemicelulosa o celulosa .
Como se usa en la presente, el término "biodiésel" hace referencia a una composición que comprende ácido graso metil-o etil- ésteres derivados de lípidos no polares por transesterificacion.
Como se usa en la presente, el término "diésel sintético" hace referencia a una forma de combustible diésel que deriva de materia prima renovable en lugar de materia prima fósil usada en la mayor parte de los combustibles diésel .
Como se usa en la presente, el término "aceite vegetal" incluye un aceite vegetal puro (o aceite vegetal lineal) o un aceite vegetal de desperdicio (por producto de otras industrias ) .
Como se usa en la presente, el término 'bioéteres" hace referencia a compuestos que actúan como potenciadores de octanaje.
Como se usa en la presente, el término "biogas" hace referencia a un metano o una mezcla inflamable de metano y otros gases producidos por digestión anaeróbica de material orgánico por anaerobios.
Como se usa en la presente, el término "syngas" hace referencia a una mezcla de gases que contiene cantidades que varían de monóxido de carbono e hidrógeno y posiblemente otros hidrocarburos, producidos por combustión parcial de biomasa.
Como se usa en la presente, el término "biocombustibles sólidos" incluye madera, aserrín, poda de césped, y cultivos energéticos no alimenticios.
Como se usa en la presente, el término "etanol celulósico" hace referencia a etanol producido a partir de celulosa o hemicelulosa .
Como se usa en la presente, el término 11 combustible de algas" hace referencia a un biocombustible hecho de algas e incluye biodiésel de algas, biobutanol, bionafta, metano, etanol, y el equivalente de aceite vegetal hecho de algas.
Como se usa en la presente, el término "biohidrógeno" hace referencia a hidrógeno producido biológicamente por, por ejemplo, algas.
Como se usa en la presente, el término "biometanol ' hace referencia a metanol producido biológicamente. El biometanol se puede producir por gasificación de materiales orgánicos a syngas seguido por síntesis de metanol convencional .
Como se usa en la presente, el término "2,5- Dimetilfurano" o "DMF" hace referencia a un compuesto heterociclico con la fórmula (CH3)2C4H20. DMF es un derivado del furano que se puede derivar de la celulosa.
Como se usa en la presente, el término "biodimetiléter" o "bioDME", también conocido como metoximetano, hace referencia a un compuesto orgánico con la fórmula CH30CH3.
El syngas puede ser convertido a metanol en presencia de catalizador (usualmente basado en cobre), con la posterior deshidratación del metanol en presencia de un catalizador diferente (por ejemplo, sílice-alúmina) que resulta en la producción de DME .
Como se usa en la presente, el término "Fischer-Tropsch" hace referencia a un conjunto de reacciones químicas que convierten una mezcla de monóxido de carbono e hidrógeno a hidrocarburos líquidos. El syngas puede ser inicialmente acondicionado usando por ejemplo, un desplazamiento de gas de agua para obtener la relación requerida de H2/CO. La conversión tiene lugar en presencia de un catalizador, usualmente hierro o cobalto. La temperatura, presión y catalizador determinan si se produce un syncrudo liviano o pesado. Por ejemplo a 330°C se producen principalmente nafta y olefinas mientras que a entre 180° y 250°C principalmente se producen diesel y ceras. Los líquidos producidos a partir del syngas, que comprenden diferentes fracciones de hidrocarburos, son hidrocarburos de cadena lineal muy limpios (libres de azufre). El diésel de Fischer-Tropsch se puede producir directamente, pero se logra un rendimiento mayor si se produce primero una cera de Fischer-Tropsch, seguido por hidrocraqueo .
Como se usa en la presente, el término "biocar" hace referencia a carbón hecho de biomasa, por ejemplo, por pirólisis de la biomasa.
Como se usa en la presente, el término "materia prima" hace referencia a un material, por ejemplo, biomasa o un producto de conversión de la misma (por ejemplo, syngas ) cuando se usa para producir un producto, por ejemplo, un biocombustible tal como biodiésel o un diésel sintético.
Como se usa en la presente, el término "producto industrial" hace referencia a un producto hidrocarburo que está hecho predominantemente de carbono e hidrógeno tal como ácido graso metil y/o etilésteres o aléanos tal como metano, mezclas de alcanos de cadenas mayores que son típicamente líquidos a temperatura ambiente, un biocombustible, monóxido de carbono y/o hidrógeno, o un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, o biocar. El término "producto industrial" tiene como intención incluir productos intermedios que pueden convertirse a otros productos industriales, por ejemplo, syngas es considerado en sí mismo un producto industrial que se puede usar para sintetizar un producto hidrocarburo que también es considerado un producto industrial. El término producto industrial como se usa en la presente incluye ambas formas puras de los compuestos anteriores, o más comúnmente una mezcla de diferentes compuestos y componentes, por e emplo el producto hidrocarburo puede contener un rango de longitudes de cadena de carbonos, como es bien entendido en el arte.
Como se usa en la presente, "brillo" hace referencia a un fenómeno óptico producido cuando se evalúa la apariencia de una superficie. La evaluación del brillo describe la capacidad de una superficie para reflejar la luz directa.
A lo largo de esta memoria descriptiva la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un elemento especificado, entero o paso, o grupo de elementos, enteros o pasos, pero no exclusión de cualquier otro elemento, entero o paso, o grupo de elementos, enteros o pasos .
El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se entenderá que hace referencia a "X e Y" o "X o Y" y se debe considerar que provee apoyo explícito a ambos significados o a cada signi ficado .
Como se usa en la presente, el término aproximadamente, a menos que se especifique lo contrario, hace referencia a +/- 10%, más preferentemente +/- 5%, más preferentemente +/-2%, más preferentemente +/- 1%, incluso más preferentemente +/- 0,5%, del valor designado.
Producción de Diacilgliceroles y Triacilgliceroles En una forma de realización, la parte vegetativa de la planta, organismo no humano transgénico o una parte del mismo de la invención produce niveles mayores de lipidos no polares tal como DAG o TAG, preferentemente ambos, que una correspondiente parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo. En un ejemplo, las plantas transgénicas de la invención producen semillas, hojas, porciones de hojas de al menos lcm2 de área superficial, tallos y/o tubérculos que tienen un contenido aumentado de lipidos no polares tal como DAG o TAG, preferentemente ambos, cuando se comparar con las correspondientes semillas, hojas, porciones de hojas de al menos lcm2 de área superficial, tallos y/o tubérculos. El contenido de lipidos no polares de la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o una parte del mismo es 0,5% mayor en base al peso cuando en comparación al correspondiente organismo no humano o una parte del mismo, o como se define adicionalmente en la Característica (i).
En otra forma de realización, la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano transgénico o una parte del mismo, preferentemente una, planta o semilla, produce DAG y/o TAG que están enriquecidos en uno o más ácidos grasos particulares. Se pueden incorporar un amplio espectro de ácidos grasos a DAG y/o TAG, que incluye ácidos grasos saturados e insaturados y ácidos grasos de cadena corta y de cadena larga. Algunos ejemplos no limitantes de ácidos grasos que se pueden incorporar a DAG y/o TAG y que se puede incrementar su nivel incluyen: ácido graso cáprico (10:0), láurico (12:0), mirístico (14:0), palmítico (16:0), palmitoleico (16:1), esteárico (18:0), oleico (18:1), vacénico (18:1), linoleico (18:2), eleoestearico (18:3), ?-linolénico (18:3), a-linolénico (18:3?3), estearidónico (18:4?3), araquidónico (20:0), eicosadienoico (20:2), dihomo-?-linoleico (20:3), eicosatrienoico (20:3), araquidónico (20:4), eicosatetraenoico (20:4), eicosapentaenoico (20:5?3), behénico (22:0), docosapentaenoico (22:5?), docosahexaenoico (22:6?3), lignocérico (24:0), nervónico (24:1), cerótico (26:0), y montánico (28:0) . En una forma de realización de la presente invención, la parte vegetativa de la planta, organismo transgénico o partes del mismo están enriquecidos por DAG y/o TAG que comprenden ácido oleico, o ácidos grasos poliinsaturados .
En una forma de realización de la invención, la parte vegetativa de la planta, organismo no humano transgénico o una parte del mismo, preferentemente una planta o semilla, se transforma con un ADN quimérico que codifica para una MGAT que puede o no tener actividad DGA . La expresión de la MGAT preferentemente da como resultado niveles mayores de lipidos no polares tal como DAG o TAG y/o rendimiento aumentado de lipidos no polares en dicha parte vegetativa de la planta, organismo no humano transgénico o una parte del mismo. En una forma de realización preferida, el organismo no humano transgénico es una planta.
En otra forma de realización, la parte . vegetativa de la planta, organismo no humano transgénico o una parte del mismo se transforma con un ADN quimérico que codifica para una GPAT o una DGAT. Preferentemente, la parte vegetativa de la planta u organismo no humano transgénico se transforma con ambos ADN quiméricos, que preferentemente están unidos covalentemente en una molécula de ADN tal como, por ejemplo, una molécula de ADN-T simple.
Yang et al., (2010) describen dos glicerol-3-fosfato aciltransferasas ( GPAT4 y GPAT6 ) de Rrabidopsis con preferencia por sn-2 y actividad fosfatasa que tienen capacidad para producir sn-2 MAG a partir de glicerol-3- fosfato (G-3-P) (Figura 1). Se propone que estas enzimas forman parte de la vía de síntesis de cutina. Se ha demostrado que las GPAT4 y GPAT6 de Arabidopsis emplean acil-CoA como sustrato de ácidos grasos (Zheng et al., 2003).
La combinación de una GPAT/ fos fatasa bifuncional con una MGAT permite obtener una nueva vía de síntesis de DAG usando G-3-P como un sustrato y dos grupos acilo derivados de acil-CoA como los otros sustratos. De manera similar, la combinación de dicha GPAT/ fosfatasa bifuncional con una MGAT que tiene actividad DGAT permite obtener una nueva vía de síntesis de TAG usando glicerol-3-fosfato como un sustrato y tres grupos acilo derivados de acil-CoA como los otros sustratos .
Por consiguiente, en una forma de realización de la invención, parte vegetativa de la planta, el organismo no humano transgénico, o una parte del mismo, es co-trans formado con una GPAT/ fos fatasa bifuncional y con una MGAT que no tiene actividad DGAT. Esto daría como resultado la producción de MAG por la GPAT/fosfatasa bifuncional que luego se podría convertir en DAG por la MGAT y luego en TAG por una DGAT nativa u otra actividad. La nueva producción de DAG se podría confirmar y seleccionar, por ejemplo, realizando dicha co-transformación en una cepa de levadura que contiene noqueos SLC1 + SLC4 letales tal como el que describen Benghezal et al., (2007; Figura 2). La Figura 2 de Benghezal et al., (2007) muestra que el noqueo de las dos LPATS de levadura (SLC1 y SLC4) es letal. El doble mutante SLC1 + SLC4 de levadura solamente se puede mantener debido a un plásmido complementario que provee uno de los genes slc (SLC1 en ese caso) en trans. La selección negativa por adición de FOA al medio da como resultado la pérdida de este plásmido complementario (contraselección del marcador de selección Ura ) y vuelve no viables a las células.
En otra forma de realización de la invención, parte vegetativa de la planta, el organismo no humano transgénico, o una parte del mismo, preferentemente una planta o semilla, es co-transformado con ADN quiméricos que codifican una GPAT/ fos fatasa bifuncional y una MGAT que tiene actividad DGAT . Esto daría como resultado la producción de MAG por la GPAT/ fosfatasa bifuncional que luego se podría convertir en DAG y luego en TAG por la MGAT.
En una forma de realización adicional, se silencia una o más GPAT endógenas sin actividad fosfatasa detectable, por ejemplo se silencia uno o más genes que codifican GPAT que acilan glicerol-3-fosfato para formar LPA en la vía Kennedy (por ejemplo, Arabidopsis GPATl).
En otra forma de realización, la parte vegetativa de la planta, organismo no humano transgénico o una parte del mismo, preferentemente una planta o semilla, se transforma con ADN quimérico que codifica para una DGAT1, una DGAT2, un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), una Oleosina, o un polipéptido supresor por silenciamiento . Los ADN quiméricos están preferentemente unidos covalentemente en una molécula de ADN tal como, por ejemplo, una molécula de ADN-T, y la parte vegetativa de la planta, organismo no humano transgénico o una parte del mismo preferentemente es homocigota para la molécula de ADN insertada en su genoma.
Las preferencias de sustrato se podrían introducir en las nuevas vías de síntesis DAG y TAG, por ejemplo, suministrando cepas H1246 de levadura transgénicas que expresan variantes MGAT con una concentración de un ácido graso libre particular (por ejemplo, DHA) que previene la complementación por el gen MGAT de tipo salvaje. Solamente crecerían las variantes capaces de usar los ácidos grasos libres suministrados. Varios ciclos de introducción de MGAT daría cono resultado la producción de una MGAT con mayor preferencia por ácidos grasos particulares.
Los diversos complementos y suplementos de la vía Kennedy descritos precedentemente se podría efectuar en cualquier tipo celular debido a la naturaleza ubicua del sustrato inicial glicerol-3-fosfato . En una forma de realización, el uso de transgenes da como resultado mayores rendimientos de aceite.
Polinucleotidos Los términos "polinucleotido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos , o análogos de los mismos. Un polinucleotido de la invención puede ser de origen genómico, ADNc, semisintético, o sintético, de cadena doble o de cadena simple y en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleotido con el cual está asociado en la naturaleza, (2) está ligado a un polinucleotido distinto del polinucleotido al cual está ligado en la naturaleza o (3) no existe en la naturaleza. Los siguientes son ejemplos no limitativos de polinucleotidos: regiones de codificación o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci {locus) definidos por análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm) , ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), riboziraas, ADNc, polinucleotidos recombinantes , polinucleotidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, ADN quimérico de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleotido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones de la estructura de nucleótidos pueden ser impartidas antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleot ídicos . Un polinucleótido se puede modificar además después de la polimerización, tal como por conjugación, con un componente de marcación.
Un "polinucleótido aislado" significa un polinucleótido que generalmente fue separado de las secuencias de polinucleótidos con las cuales está asociado o ligado en su estado nativo. Preferentemente, el polinucleótido aislado está al menos un 60% libre, más preferentemente al menos un 75% libre y más preferentemente al menos un 90% libre de las secuencias de polinucleótidos con las cuales está naturalmente asociado o ligado.
Según se usa en la presente, el término "gen" se interpreta es su sentido más amplio e incluye las secuencias de desoxirribonucleótidos que comprenden a la región transcrita y, si se traducen, la región codificante de la proteína, de un gen estructural e inclusive las secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante por ambos extremos 5' y 3' para una distancia de al menos 2 kb aproximadamente por cualquier extremo y que están relacionadas con la expresión del gen. En este sentido, el gen incluye las señales de control, tales como promotores, potenciadores , señales de terminación y/o de poliadenilación, que están asociadas naturalmente con un gen dado, o señales de control heterologas en cuyo caso el gen se conoce como un "gen quimérico". Las secuencias ubicadas 5' con respecto a la región codificante de la proteina y que están presentes sobre el ARNm se denominan secuencias no traducidas 5' . Las secuencias ubicadas 3' con respecto a la región codificante de la proteina y que están presentes sobre el ARNm se denominan secuencias no traducidas 3' . El término "gen" abarca tanto al ADNc como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante que puede interrumpirse con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intervinientes" o "secuencias intervinientes" . Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en un ARN nuclear (ARNn) . Los intrones pueden contener elementos reguladores tales como potenciadores. Los intrones son removidos o "procesados fuera" del transcripto nuclear o primario; por ello no hay intrones en el transcripto de ARNm. El ARNm funciona durante la traducción1 especificando la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente. El término "gen" incluye una molécula sintética o de fusión que codifica todo o parte de las proteínas de la invención que se describen en la presente y una secuencia de nucleótidos complementaria de cualquiera de las mencionadas anteriormente .
Según se usa en la presente, "ADN quimérico" se refiere a cualquier molécula de ADN que no existe naturalmente en la naturaleza; también denominada " construcción de ADN" en la presente. Típicamente, un ADN quimérico comprende secuencias reguladoras y transcritas o codificantes de proteínas que no existen juntos en la naturaleza. Por consiguiente, un ADN quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de distintas fuentes o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero en una disposición diferente de la hallada en la naturaleza. El marco de lectura abierto puede estar ligado, o no, a sus elementos reguladores 5' y 3' naturales. El marco de lectura abierto se puede incorporar, por ejemplo, en el genoma de la planta, en una ubicación no natural o en un replicón o vector donde no existe naturalmente tal como en un plásmido bacteriano o un vector viral. El término "ADN quimérico" no se limita a moléculas de ADN que se pueden replicar en un huésped, sino que incluye ADN capaz de ligarse en un replicón, por ejemplo, mediante secuencias adaptadoras específicas.
Un "transgen" es un gen que fue introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación. El término incluye un gen en una célula de progenie, planta, semilla, organismo no humano o una parte del mismo que se introdujo en el genoma de una célula progenitora del mismo. Dichas células de la progenie, etc. pueden ser al menos una progenie de 3ra o 4ta generación respecto a la célula progenitora que fue la primera célula transformada. La progenie se puede producir por reproducción sexual o vegetativamente tal como, por ejemplo, a partir de tubérculos en papas o soca en caña de azúcar. El término "modificado genéticamente" y variaciones de los mismos, es un término más amplio que incluye introducir un gen en una célula por transformación o transducción, mutar un gen en una célula y alterar o modular genéticamente la regulación de un gen en una célula, o la progenie de cualquier célula modificada como se describió previamente.
Una "región genómica", según se usa en la presente, se refiere a una posición dentro del genoma en donde se ha insertado un transgen, o un grupo de transgenes (también denominado agrupación en la presente), en una célula, o en un predecesor de la misma. Dichas regiones comprenden solamente nucleótidos que fueron incorporados por la intervención del hombre, tal como mediante los métodos que se describen en la presente .
Un "polinucleótido recombinante" de la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que se construyó o modificó mediante métodos recombinantes artificiales. El polinucleotido recombinante puede estar presente en una célula en una cantidad alterada o se puede expresar a un Indice alterado (por ejemplo, en el caso del ARNm) en comparación con su estado nativo. En una forma de realización, el polinucleotido se introduce en una célula que no comprende naturalmente al polinucleotido. Típicamente se usa un ADN exógeno como templado para la transcripción del ARNm que luego es traducido en una secuencia de residuos de aminoácidos continua que codifican un polipéptido de la invención dentro de la célula transformada. En otra forma de realización, el polinucleotido es endógeno para la célula y su expresión es alterada por medios recombinantes, por ejemplo, se introduce una secuencia de control exógena 5' con respecto a un gen endógeno de interés para permitir la expresión del polipéptido · codificado por el gen por parte de la célula transformada.
Un polinucleotido recombinante de la invención incluye polinucleótidos que no han sido separados de los demás componentes del sistema de expresión basado en células o sin células, en el cual está presente, y los polinucleótidos producidos en tales sistemas celulares o no celulares que luego se separan por purificación de por lo menos algunos de los demás componentes. El polinucleótido puede ser una extensión contigua de nucleotidos existente en la naturaleza, o comprende dos o más extensiones contiguas de nucleotidos de fuentes diferentes (naturales y/o sintéticas) unidas para formar un solo polinucleótido. Típicamente dichos polinucleótidos quiméricos comprenden al menos un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de la invención ligado operativamente a un promotor adecuado para dirigir la transcripción del marco de lectura abierto en una célula de interés.
Con respecto a los polipéptidos definidos, se podrá apreciar que las cifras de % de identidad mayores que las provistas antes abarcarán formas de realización preferidas. Por consiguiente, cuando fuera aplicable, a la luz de las cifras mínimas de % de identidad, se prefiere que el polinucleótido comprenda una secuencia de polinucleótidos que es al menos un 60%, más preferentemente al menos un 65%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, mas preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99%, más preferentemente al menos un 99,1%, más preferentemente al menos un 99,2%, más preferentemente al menos un 99,3%, más preferentemente al menos un 99,4%, más preferentemente al menos un 99,5%, más preferentemente al menos un 99,6%, más preferentemente al menos un 99,7%, más preferentemente al menos un 99,8% y aún más preferentemente al menos un 99,9% idéntica al SEQ ID N° relevante nominado.
Un polinucleótido de, o de utilidad para, la presente invención se puede hibridizar selectivamente, bajo condiciones severas, con un polinucleótido definido en la presente. Según se usa en la presente, las condiciones severas son aquellas que (1) durante la hibridación emplean un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida 50% (volumen en volumen) con albúmina de suero bovino 0,1% (peso en volumen), Ficoll 0,1%, polivinilpirrolidona 0,1%, solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42oC; o (2) emplean formamida 50%, SSC 5 x (NaCl 0,75 M, citrato de sodio 0,075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS 0,1% y sulfato de dextrano 10% a 42oC en SSC 0,2 x y SDS 0,1% y/o (3) emplean una fuerza iónica baja y temperatura alta para el lavado, por ejemplo, NaCl 0,015 M/citrato de sodio 0,0015 M/SDS 0,1% a 50oC.
Los polinucleotidos de la invención pueden contener, en comparación con las moléculas naturales, una o más mutaciones que son supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de nucleótidos. Los polinucleotidos que contienen mutaciones con relación a una secuencia de referencia pueden ser naturales (vale decir, aislados de una fuente natural) o sintéticas (por ejemplo, obtenidos mediante mutagénesis dirigida al sitio o entremezclado de ADN del ácido nucleico descrito precedentemente).
Polinucleótido para reducir los niveles de expresión de proteínas endógenas Interferencia por ARN La interferencia por ARN (ARNi) es particularmente útil para inhibir específicamente la producción de una proteína particular. A pesar de no desear de estar limitado por la teoría, aterhouse et al. (1998) han provisto un modelo para el mecanismo por el cual se puede usar el ARNcd (dúplex de ARN) para reducir la producción de proteína. Esta tecnología se basa en la presencia de moléculas de ARNcd que contienen una secuencia que es esencialmente idéntica al ARNm del gen de interés o parte del mismo. Convenientemente, el ARNcd se puede producir a partir de un promotor único en un vector recombinante o célula huésped, en donde las secuencias sentido y antisentido están flanqueadas por una secuencia no relacionada que permite que las secuencias sentido y antisentido hibridicen para formar la molécula de ARNcd con la secuencia no relacionada formando una estructura de bucle. El diseño y producción de moléculas de ARNcd adecuadas está dentro de la capacidad de una persona con experiencia en el arte, particularmente considerando Waterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, y WO 01/34815.
En un ejemplo, se introduce un ADN que dirige la síntesis de al menos un producto (s) ARN parcialmente de doble cadena con homología con el gen blanco a ser inactivado. El ADN por lo tanto comprende las secuencias sentido y antisentido que, cuando se transcriben a ARN, pueden hibridizar para formar la región de ARN de doble cadena. En una forma de realización de la invención, las secuencias sentido y antisentido están separadas por una región espadadora que comprende un intrón que, cuando se transcribe a ARN, se escinde. Se ha mostrado que este arreglo da como resultado una mayor eficacia en el silenciamiento de genes. La región de doble cadena puede comprender una o dos moléculas de ARN, transcriptas de una región de ADN o dos. La presencia de la molécula de doble cadena se piensa que inicia una respuesta de un sistema endógeno que destruye el ARN de doble cadena y también el transcripto de ARN homólogo del gen blanco, reduciendo eficazmente o eliminando la actividad del gen blanco.
La longitud de las secuencias sentido y antisentido que hibridizan deben tener cada una al menos 19 nucleótidos contiguos. Se puede usar la secuencia de longitud completa que corresponde al transcripto del gen entero. El grado de identidad de las secuencias sentido y antisentido con el transcripto que es blanco debe ser al menos 85%, al menos 90%, o al menos entre 95 y 100%. La molécula de ARN puede comprender por supuesto secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula. La molécula de ARN se puede expresar bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II o ARN polimerasa III. Los e emplos de estos últimos incluyen promotores de ARNt o ARNsn.
Las moléculas de ARN pequeño de interferencia preferidas ("ARNpi") comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica a aproximadamente entre 19 y 21 nucleótidos contiguos del ARNm blanco. Preferentemente, la secuencia de ARNpi comienza con el dinucleótido AA, comprende un contenido de GC de aproximadamente entre 30 y 70% (preferentemente, entre 30 y 60%, más preferentemente entre 40 y 60% y más preferentemente aproximadamente entre 45% y 55%), y no tiene un alto porcentaje de identidad con ninguna secuencia de nucleótidos diferente del blanco en el genoma del organismo en el cual se introduce, por ejemplo, determinado por búsqueda por BLAST estándar. mi croARN Los microARN (abreviados ARNmi ) son generalmente moléculas de ARN no codificantes de entre 19 y 25 nucleótidos (comúnmente aproximadamente entre 20 y 24 nucleótidos en plantas) que derivan de precursores más largos que forman estructuras de tallo-bucle imperfectas.
Los ARNmi se unen a secuencias complementarias en los transcriptos de ARN mensajero blanco (ARNm) , usualmente dando como resultado la represión de la traducción o degradación del blanco y el silenciamiento del gen.
En las células vegetales, se cree que las moléculas precursoras de ARNmi que son procesadas extensamente en el núcleo. El ARNmi-pri (que contiene una o más regiones locales de doble cadena u "horquilla" asi como el usual "extremo protector" 5' y la cola de poliadenilación de un ARNm) es procesado a una molécula precursora de ARNmi más corta que también incluye una estructura de tallo-bucle o plegada y es llamada "pre-ARNmi" . En las plantas, los pre-ARNmi son clivados por diferentes enzimas similares a DICER (DCL), dando dúplex ARNmi : ARNmi* . Antes de transportarlos hacia afuera del núcleo, estos dúplex son metilados.
En el citoplasma, la cadena de ARNmi del dúplex de ARNmi : ARNmi se incorpora selectivamente a un complejo de silenciamiento activo inducido por ARN (RISC) para el reconocimiento de blanco. Los complejos RISC contienen un subconjunto particular de proteínas Argonauta que e ercen represión de genes especifica de secuencia (véase, por ejemplo, Millar y Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al., 2005; Almeida y Allshire, 2005) .
Cosupressión Los genes pueden suprimir la expresión de genes endógenos relacionados y/o transgenes ya presentes en el genoma, un fenómeno llamado silenciamiento de genes dependiente de homología. La mayor parte de los casos de silenciamiento de genes dependiente de homología cae dentro de dos clases - aquellos que funcionan al nivel de transcripción del transgen, y aquellos que operan post-transcripcionalmente.
El silenciamiento de genes dependiente de homología post-transcripcionalmente (es decir, cosupresión) describe la pérdida de expresión de un transgen y genes endógenos relacionados o virales en plantas transgénicas . La cosupresión con frecuencia, pero no siempre, se produce cuando los transcriptos de transgen son abundantes, y generalmente se cree que es iniciado a nivel del procesamiento del ARNm, localización, y/o degradación. Existen varios modelos para explicar cómo funciona la cosupresion (véase en Taylor, 1997).
Un modelo, el modelo "cuantitativo" o "umbral de ARN", propone que las células pueden hacer frente a la acumulación de grandes cantidades de transcriptos de transgenes, pero sólo hasta un punto. Una vez que se ha cruzado el umbral critico, se inicia la degradación dependiente de secuencia de los transcriptos del transgen y gen endógeno relacionado. Se ha propuesto que este modo de cosupresion puede ser iniciado luego de la síntesis de las moléculas de ARN copia (ARNc) por transcripción reversa del ARNm del transgen en exceso, presumiblemente por ARN polimerasas dependientes de ARN endógeno. Estos ARNc pueden hibridizar con el ARNm del transgen y endógeno, estando dirigidos los híbridos inusuales a los transcriptos homólogos para la degradación. Sin embargo, este modelo no tiene en cuenta reportes que sugieren que la cosupresion puede producirse aparentemente en ausencia de la transcripción del transgen y/o sin la acumulación detectable de los transcriptos del transgen.
Para tener en cuenta estos datos, un segundo modelo, el modelo "cualitativo" o "ARN aberrante", propone que las interacciones entre el ARN del transgen y el ADN y/o entre los ADN endógeno e introducido llevan a la metilación de las regiones transcriptas de los genes. Se propone que los genes metilados producen ARN que de algún modo son aberrantes, sus características anómalas iniciando la degradación específica de todos los transcriptos relacionados. Dichos ARN aberrantes pueden ser producidos por loci del transgen complejos, particularmente aquellos que contienen repeticiones invertidas.
Un tercer modelo propone que el apareamiento intermolecular de bases entre transcriptos, en lugar de híbridos ARNc-ARNm generado por la acción de una ARN polimerasa dependiente de ARN, puede iniciar la cosupresión. Dicho apareamiento de bases se puede volver más común a medida que los niveles de transcripto aumentan, con las regiones de doble cadena putativas iniciando la degradación dirigida de transcriptos homólogos. Un modelo similar propone el apareamiento intramolecular de bases en lugar de apareamiento intermolecular de bases entre los transcriptos.
La cosupresión involucra introducir una copia extra de un gen o un fragmento del mismo en una planta en la orientación sentido respecto al promotor para su expresión. Una persona con experiencia podría apreciar que el tamaño del fragmento sentido, su correspondencia con las regiones del gen blanco, y su grado de identidad de secuencia con el gen blanco pueden variar. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia del gen interfiere con la expresión del gen vegetal blanco. Se hace referencia a WO 97/20936 y EP 0465572 para métodos para implementar las estrategias de cosupresión.
Polinucleótídos antisentido El término "polinucleótido antisentido" se debe tomar como que hace referencia a una molécula de ADN o ARN, o combinación de las mismas, que es complementaria a al menos una porción de una molécula de ARNm especifica que codifica para un polipéptido endógeno y que tiene la capacidad de interferir con un evento post-transcripcional tal como la traducción del ARNm. El uso de métodos con antisentido es bien conocido en el arte (véase por ejemplo, G. Hartmann y S. Endres, Manual of Antisense Methodology, lu er (1999)). El uso de técnicas con antisentido en plantas ha sido revisado por Bourque (1995) y Sénior (1998). Bourque (1995) lista un gran número de e emplos de cómo las secuencias antisentido han sido utilizadas en sistemas vegetales como un método para la inactivación de genes. Bourque también afirma que alcanzar el 100% de inhibición de cualquier actividad enzimática puede no ser necesario ya que la inhibición parcial dará como resultado más que probablemente un cambio que se puede medir en el sistema. Sénior (1998) afirma que los métodos con antisentido son ahora una técnica muy bien establecida para manipular la expresión de genes.
En una forma de realización, el polinucleótido antisentido hibridiza bajo condiciones fisiológicas, es decir, el polinucleótido antisentido (que es completa o parcialmente de cadena simple) tiene al menos la capacidad para formar un polinucleótido de doble cadena con el ARNm que codifica para una proteina tal como una enzima endógena, por ejemplo, DGAT, GPAT, LPAA, LPCAT, PAP, AGPasa, bajo condiciones normales en una célula.
Las moléculas antisentido pueden incluir secuencias que corresponden con los genes estructurales o para secuencias que afectan el control sobre la expresión de genes o eventos de corte y empalme. Por ejemplo, la secuencia antisentido puede corresponderse con la región codificante blanco del gen endógeno gene, o la región no traducida 5' (UTR) o la 3 ' -UTR o una combinación de estas. Puede ser complementaria en parte a las secuencias intrones, que pueden ser quitadas por corte y empalme durante o luego de la transcripción, preferentemente sólo a secuencias exones del gen blanco. En vista de la generalmente mayor divergencia de las UTR, el direccionamiento hacia estas regiones provee mayor especificidad de inhibición de genes.
La longitud de la secuencia antisentido debe ser de al menos 19 nucleótidos contiguos, preferentemente al menos 50 nucleótidos, y más preferentemente al menos 100, 200, 500 ó 1000 nucleótidos. Se puede usar la secuencia de longitud completa complementaria al transcripto del gen completo. La longitud más preferentemente es de entre 100 y 2000 nucleótidos. El grado de identidad de la secuencia antisentido con el transcripto blanco debe ser de al menos 90% y más preferentemente entre 95 y 100%. La molécula de ARN antisentido puede por supuesto comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar para estabilizar la molécula .
Polinucleótidos catalíticos El término "polinucleótido catalítico" hace referencia a una molécula de ADN o molécula que contiene ADN (también conocida en el arte como una "desoxi rribozima" ) o un ARN o molécula que contiene ARN (también conocida como una "ribozima") que reconoce específicamente un sustrato diferente y cataliza la modificación química de este sustrato. Las bases de ácido nucleico en el ácido nucleico catalítico pueden ser bases A, C, G, T (y U para ARN) .
Típicamente, el ácido nucleico catalítico contiene una secuencia antisentido para reconocimiento específico de un ácido nucleico blanco, y una con actividad enzimática de clivaje de ácidos nucleicos (también referida en la presente como el "dominio catalítico") . Los tipos de ribozimas que son particularmente útiles en esta invención son ribozimas en cabeza de martillo (Haseloff y Gerlach, 1988; Perriman et al., 1992) y ribozimas en horquilla (Zolotukhin et al., 1996; Klein et al., 1998; Shippy et al., 1999).
Las ribozimas útiles en la invención y el ADN que codifica para las ribozimas pueden ser químicamente sintetizados usando métodos bien conocidos en el arte. Las ribozimas también se pueden preparar a partir de una molécula de ADN (que con la transcripción, produce una molécula de ARN ) operativamente ligada a un promotor de ARN polimerasa, por ejemplo, el promotor de la ARN polimerasa T7 o ARN polimerasa SP6. En una forma de realización separada, el DNA se puede insertar en un cásete de expresión o cásete de transcripción. Luego de la síntesis, la molécula de ARN se puede modificar por ligado a una molécula de ADN que tiene la capacidad de estabilizar la ribozima y hacerla resistente a ARNasa .
Como con los oligonucleotidos antisentido, el ARN pequeño de interferencia y microARN descritos en la presente, los polinucleótidos catalíticos útiles en la invención deben tener la capacidad de "hibridizar" la molécula de ácido nucleico blanco bajo "condiciones fisiológicas", es decir aquellas condiciones de una célula vegetal, de algas o fúngica .
Vectores recombinantes Una forma de realización de la presente invención incluye un vector recombinanter que comprende al menos un polinucleótido definido en la presente, capaz de distribuir el polinucleótido en una célula huésped. Los vectores recombinantes incluyen vectores de expresión. Los vectores recombinantes contienen secuencias heterólogas de polinucleotidos, es decir, secuencias de polinucleotidos que no existen naturalmente adyacentes a un polinucleótido definido en la presente, que, preferentemente, deriva de una especie diferente. El vector puede ser de ARN o ADN, ya sea procariota o eucariota, y típicamente es un vector viral, derivado de un virus, o un plásmido. Los vectores de plásmidos incluyen típicamente secuencias de ácidos nucleicos adicionales que proporcionan una manera fácil de selección, amplificación y transformación del cásete de expresión en células procariotas, por ejemplo, vectores derivados de pUC, vectores derivados de pS , vectores derivados de pGEM, vectores derivados de pSP, vectores derivados de pBS o vectores binarios que contienen una o más regiones de ADN-T . Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales incluyen orígenes de replicación para proporciona una replicación autónoma del vector, genes marcadores seleccionables , que preferentemente codifican resistencia a antibióticos o herbicidas, múltiple sitios de clonación únicos que proporcionan múltiples sitios para insertar secuencias de ácidos nucleicos o genes codificados en la construcción de ácido nucleico, y secuencias que mejoran la transformación de células procariotas y eucariotas (en especial plantas).
El término "ligado operativamente", según se usa en la presente, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de un elemento regulador de la transcripción (promotor) con una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificante de un polinucleotido definido en la presente, si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula apropiada. En general, los elementos promotores reguladores de la transcripción que están ligados operativamente a una secuencia transcrita se encuentran físicamente contiguos de la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunos de los elementos reguladores de la transcripción, tales como potenciadores , no necesitan ubicarse físicamente contiguas o muy próximas de las secuencias codificantes cuya transcripción mejoran.
Cuando se encuentran presentes múltiples promotores, cada promotor puede ser igual o diferente.
Los vectores recombinantes también pueden contener (a) una o más señales secretoras que codifican secuencias de péptidos señal, para permitir la secreción de un polipéptido expresado definido en la presente de la célula que produce dicho polipéptido o que proporcione la localización del polipéptido expresado, por ejemplo para retener el polipéptido en el retículo endoplasmático (ER) de la célula o transferirlo a un plástido, y/o (b) secuencias de fusión que conducen a la expresión de moléculas de ácidos nucleicos como proteínas de fusión. Los ejemplos de segmentos de señal adecuados incluyen cualquier segmento de señal capaz de dirigir la secreción o la localización de un polipéptido definido en la presente. Los segmentos señal preferidos incluyen, pero en un sentido no limitativo, el péptido señal de Nicotiana nectarin (US 5.939.288), la señal de la extensina de tabaco o la señal de la proteína de unión a cuerpos oleosos de la oleosina de soja. Los vectores recombinantes también pueden incluir secuencias intervinientes y/o no traducidas que rodean y/o que se encuentran dentro de la secuencia de ácidos nucleicos de un polinucleót ido definido en la presente.
Para facilitar la identificación de los transformantes, el vector recombinante comprende preferentemente un gen de un marcador seleccionable o rastreable como secuencia de ácidos nucleicos de un polinucleótido definido en la presente, o además de la misma. Un "gen marcador" se refiere a un gen que imparte un fenotipo distinto a las células que expresan al gen marcador y por consiguiente permite diferenciar dicha célula transformada de las células que no contienen al marcador. Un gen marcador seleccionable confiere una característica que se puede "seleccionar" basado en la resistencia a un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, un antibiótico, radiación, calor u otro tratamiento capaz de dañar células no transformadas). Un gen marcador rastreable (o gen informante) confiere un rasgo que se pueda identificar por observación o evaluación, es decir, mediante un "examen" (por ejemplo, ß-glucuronidasa, luciferasa, GFP u otra actividad enzimática que no está presente en células no transformadas). El gen marcador y la secuencia de nucleótidos interés no tienen que estar unidos, dado que la co-trans formación de genes no ligados como se describe, por ejemplo, en la US 4,399,216 también constituye un proceso eficiente, por ejemplo, en la transformación de plantas. La elección real de un marcador no es crucial en tanto sea funcional (es decir, selectivo) en combinación con las células de elección, tal como una célula vegetal.
Los ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son marcadores que confieren resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, eritromicina, cloramfenicol o tetraciclina, preferentemente resistencia a kanamicina. Los ejemplos de marcadores seleccionables para la selección de transformantes de plantas incluyen, pero en un sentido no limitativo, un gen hyg que codifica resistencia a higromicina B; un gen de neomicina fos fotrans ferasa (nptXT) que confiere resistencia a kanamicina, paromomicina , G418; un gen de glutatión-S-trans ferasa de hígado de rata que . confiere resistencia a herbicidas derivados de glutatión como se describe, por ejemplo, en EP 256223; un gen de la glutamina sintetasa que confiere, con la sobreexpresión, resistencia a los inhibidores de la glutamina sintetasa tal como fosfinotricina como se describe, por ejemplo, en WO 87/05327, un gen de la acetiltransferasa de Strepto yces víridochromogenes que confiere resistencia al agente selectivo de fos finotricina como se describe, por ejemplo, en EP 275957, un gen que codifica una 5-enolshiquimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que confiere tolerancia a N-fos fonometilglicina como describen, por ejemplo, Hinchee et al., (1988), un gen bar que confiere resistencia contra bialafos como se describe, por ejemplo, en WO91/02071; un gen de nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia a bromoxinilo (Stalker et al., 1988); un gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) que confiere resistencia a metotrexato (Thillet et al., 1988); un gen mutante de acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinona, sulfonilurea u otras sustancias químicas inhibidoras de ALS (EP 154,204); un gen mutado de la antranilato sintasa que confiere resistencia a 5-metiltriptofano ; o un gen de dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al herbicida.
Los marcadores rastreables preferidos incluyen, pero en un sentido no limitativo, un gen uidA que codifica una enzima ß-glucuronidasa (GUS) para la cual se conocen diversos sustratos cromogénicos ; un gen de ß-galactosidasa que codifica una enzima para la cual se conocen sustratos cromogénicos; un gen de aecuorina (Prasher et al., 1985) que se puede emplear en la detección de bioluminiscencia sensible a calcio; un gen de la proteína fluorescente verde (Niedz et al., 1995) o derivados de los mismos; o un gen de luciferasa (luc) (Ow et al., 1986) que permite la detección de bioluminiscencia. Una "molécula informante" significa una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal analíticamente identi ficable que facilita la determinación de la actividad del promotor por referencia al producto proteico .
Preferentemente, el vector recombinante se incorpora de manera estable en el genoma de la célula, tal como la célula vegetal. Por consiguiente, el vector recombinante puede comprender elementos apropiados que permiten incorporar al vector en el genoma, o en un cromosoma de la célula.
Vector de expresión Según se usa en la presente, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que tiene la capacidad de transformar una célula huésped y de lograr la expresión de uno o más polinucleótidos específicos. Preferentemente, el vector de expresión también permite la replicación dentro de una célula huésped. Los vectores de expresión pueden ser procariotas o eucariotas, y típicamente son virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualquier vector que funciona (es decir, expresión directa de genes) en células huésped de la presente invención, incluyendo en células bacterianas, fúngicas, de endoparásitos , de artrópodos, de animales, algas y vegetales. Los vectores de expresión particularmente preferidos de la presente invención pueden dirigir la expresión de genes en células de levadura, algas y/o vegetales.
Los vectores de expresión de la presente invención contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula huésped y que controlan la expresión de los polinucleotidos de la presente invención. En particular, los vectores de expresión de la presente invención incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el comienzo, la elongación y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el comienzo de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras , operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en al menos una de las células recombinantes de la presente invención. La elección de las secuencias reguladoras usadas depende del organismo blanco, tal como una planta y/u órgano blanco o tejido de interés. Dichas secuencias reguladoras se pueden obtener de cualquier organismo eucariota tal como plantas o virus de plantas, o se pueden sintetizar químicamente. Los especialistas en el arte conocen una gran variedad de tales secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente preferidas son promotores activos en la dirección de la transcripción en plantas, ya sea constitutivamente o específicos de etapa y/o tejidos, dependiendo del uso de la planta o de partes de la misma .
Se han descrito numerosos vectores adecuados para una transfección estable de células vegetales o para establecer plantas transgénicas , por ejemplo, en Pouwels et al., Cloning Vectors: ? Laboratory Manual, 1985, suplemento 1987; Weissbach y Weissbach, Métodos for Plant Molecular Bíology, Academic Press, 1989; y Gelvin et al., Plant . Molecular Bíology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Típicamente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión en plantas también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora que controla una expresión inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo o especifica de células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/ o una señal de poliadenilación.
Se han descrito numerosos promotores constitutivos que son activos en células vegetales. Los promotores adecuados para una expresión constitutiva en plantas incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor del 35S virus en mosaico de la escrofularia (FMV), el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor del virus moteado amarillo de la cornelina, el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1 , 5-bi-fosfatocarboxilasa, el promotor de la triosafosfato isomerasa citosólica de arroz, el promotor de la adenina fosforibosiltransferasa de Arabidopsís, el promotor del gen de la actina 1 de arroz, los promotores de la manopina sintasa y octopina sintasa, el promotor Adh, el promotor de la sacarosa sintasa, el promotor del complejo del gen R y el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/ ß . Estos promotores se han usado para crear vectores de ADN que se han expresado en plantas; véase, por ejemplo, WO 84/02913. Todos estos promotores se han usado para crear diversos tipos de vectores de ADN recombinantes de expresión en plantas.
Con el fin de obtener expresión en los te idos fuente de la planta, tal como hojas, semillas, raíz o tallo, se prefiere que los promotores utilizados en la presente invención sean de una expresión relativamente alta en estos te idos específicos. Para este fin, se puede elegir entre una cantidad de promotores para genes con expresión específica o mejorada para tejidos o células. Los ejemplos de tales promotores informados en la literatura incluyen el promotor GS2 de la glutamina sintetasa de cloroplasto de arveja, el promotor de la fructosa-1 , 6-bifosfatasa de cloroplastos de trigo, el promotor ST-LS1 fotosintética nuclear de papa, el promotor de serina/ treonina quinasa y el promotor de glucoamilasa (CHS) de Arabidopsis thaliana. También se informaron como activos en los tejidos fotosintéticamente activos al promotor de la ribulosa-1, 5-bifosfato carboxilasa del alerce del este (Larix laricina) , el promotor del gen Cab, Cab6, de pino, el promotor del gen Cab-1 de trigo, el promotor del gen Cab-1 de espinaca, el promotor del gen Cab IR de arroz, el promotor del gen de piruvato, el promotor de ortofosfato diquinasa (PPDK) de Zea mays, el promotor del gen Lhcbl*2 de tabaco, el promotor Suc2 sacarosa-H30 symporter de Arabidopsis thaliana y el promotor de los genes de proteínas de la membrana tilacoide de espinaca (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS ) . También se pueden utilizar otros promotores de las proteínas, de unión a clorofila a/ ß en la presente invención, tales como los promotores del gen LhcB y del gen PsbP de mostaza blanca [Sinapis alba) .
Hay una variedad de promotores de genes vegetales que son regulados como respuesta a señales del medio ambiente, hormonales, sustancias químicas y/o del desarrollo que también se pueden usar para la expresión de genes de proteínas de unión a ARN en células vegetales, incluyendo promotores regulados por (1) calor, (2) luz (por ejemplo, el promotor RbcS-3A de arveja, el promotor RbcS de maíz) ; (3) hormonas, tales como ácido abscísico, (4) lesiones (por ejemplo, WunI ) ; o (5) sustancias químicas, tal como asmonato de metilo, ácido salicílico, hormonas esteroides, alcohol, protectores (WO 97/06269) o también puede ser ventajoso emplear (6) promotores específicos de órganos.
Según se usa en la presente, el término "promotor específico del órgano de almacenamiento de una planta" se refiere a un promotor que preferencialmente, en comparación con otros tejidos vegetales, dirige la transcripción de genes en un órgano de almacenamiento de una planta. Preferentemente, el promotor solamente dirige la expresión de un gen de interés en el órgano de almacenamiento y/o la expresión del gen de interés en otras partes de la planta, tal como las hojas, no es detectable mediante un análisis de transferencia Northern y/o RT-PCR. Típicamente, el promotor dirige la expresión de genes durante el crecimiento y desarrollo del órgano de almacenamiento, en particular durante la fase de síntesis y acumulación de compuestos de almacenamiento en el órgano de almacenamiento. Tales promotores pueden dirigir la expresión de genes en todo el órgano de almacenamiento de una planta o solamente en una parte del mismo, tal como el recubrimiento, el embrión o los cotiledones en semillas de plantas dicotiledóneas o el endosperma o la capa de aleurona de semillas de plantas monocotiledóneas .
Con el fin de obtener expresión en los te idos de almacenamiento o reserva de la planta, tales como el tubérculo de la planta de papa, el fruto de tomate o las semillas de soja, cañóla, algodón, Zea mays, trigo, arroz y cebada, se prefiere que los promotores utilizados en la invención tengan una expresión relativamente alta en estos tejidos específicos. Se conocen numerosos promotores de genes con expresión específica o mejorada en tubérculos, incluyendo el promotor de patatina de clase I, el promotor para los genes ADPGPP de tubérculos de papa, ambas subunidades grande y pequeña, el promotor de sacarosa sintasa, el promotor de las proteínas mayores de tubérculos incluyendo los complejos proteicos de 22 kD e inhibidores de proteinasas, el promotor para el gen de la almidón sintasa unida a gránulos (GBSS) y otros promotores de patatinas de clase I y II. También se pueden emplear otros promotores para expresar una proteína en tejidos específicos, tales como semillas o frutas. Se puede usar el promotor de la ß-conglicinina u otros promotores específicos de semillas tales como los promotores de napina, zeína, linina y faseolina. También se pueden usar promotores específicos de raíces. Un ejemplo de un promotor tal es el promotor del gen de la ácido quitinasa. La expresión en los te idos de la raíz también se podría lograr utilizando los subdominios específicos de la raíz del promotor CaMV 35S que han sido identificados.
En una forma de realización particularmente preferida, el promotor dirige la expresión en tejidos y órganos en los cuales tiene lugar la biosíntesis de lípidos. Dichos promotores actúan en el desarrollo de las semillas en el momento adecuado para modificar la composición del lípido en las semillas.
En otra forma de realización preferida particular, el promotor es promotor específico de los órganos de almacenamiento de una planta. En una forma de realización, el promotor específico del órgano de almacenamiento vegetal es un promotor específico de semillas. En una forma de realización más preferida, el promotor dirige preferencialmente la expresión en los cotiledones de una planta dicotiledónea o en el endosperma de una planta monocotiledónea, con relación a la expresión en el embrión de la semilla o con relación a otros órganos en la planta, tal como las hojas. Los promotores preferidos para una expresión específica de semillas incluyen: 1) promotores de genes que codifican enzimas relacionadas con la biosíntesis y la acumulación en semillas de lipidos tales como desaturasas y elongasas, 2) promotores de genes que codifican proteínas de almacenamiento en semillas, y 3) promotores de genes que codifican enzimas relacionadas con la biosíntesis y acumulación en semillas de carbohidratos. Los promotores específicos de semillas que son adecuados comprenden el promotor del gen de napina de colza oleaginosa (US 5.608.152), el promotor de USP de Vicia faba (Baumlein et al., 1991), el promotor de oleosina de Arabídopsis (WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), el promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) o el promotor de legumina B4 (Baumlein et al., 1992) y los promotores que conducen a la expresión específica de semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz y semejantes. Los promotores adecuados más importantes son el promotor del gen lpt2 o lptl de cebada (WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores que se describen en WO 99/16890 (promotores del gen de la hordeína de cebada, el gen de glutelina de arroz, el gen de orizina de arroz, el gen de prolamina de arroz, el gen de gliadina de trigo, el gen de glutelina de trigo, el gen de zeína de maíz, el gen de glutelina de avena, el gen de kasirina de sorgo, el gen de secalina de centeno) . Otros promotores incluyen los que se describen en Broun et al., (1998), Potenza et al., (2004), US 20070192902 y US 20030159173. En una forma de realización, el promotor específico de semillas se expresa preferencialmente en partes definidas de las semillas tales como en los cotiledones o en el endosperma. Los ejemplos de promotores específicos de cotiledones incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor de FP1 (Ellerstrom et al., 1996), el promotor de legumina de arveja (Perrin et al., 2000) y el promotor de fitohemaglutinina de haba (Perrin et al., 2000). Los ejemplos de promotores específicos del endosperma incluyen, pero en un sentido no limitativo, el promotor de zeína-1 de maíz (Chikwamba et al., 2003), el promotor de glutelina-1 de arroz (Yang et al., 2003), el promotor de D-hordeína de cebada (Horvath et al., 2000) y los promotores de HMW glutenina de trigo (Alvarez et al., 2000). En una forma de realización adicional, el promotor específico de semillas no se expresa, o solamente se expresa a un nivel bajo, en el embrión y/o después que germinó la semilla.
En otra forma de realización, el promotor específico del órgano de almacenamiento vegetal es un promotor específico de tubérculos. Los ejemplos incluyen, pero en un sentido no limitativo, los promotores B33, PAT21 y GBSS de patatina de papa, así como el promotor de esporamina de batata (por una revisión véase Potenza et al., 2004). En una forma de realización preferida, el promotor dirige la expresión preferencialmente en la médula del tubérculo, con relación a las capas externas (piel, corteza) o el embrión del tubérculo.
En otra forma de realización, el promotor especifico del órgano de almacenamiento vegetal es un promotor especifico de frutos. Los ejemplos incluyen, pero en un sentido no limitativo, los promotores E8 y Pds de la poligalacturonasa de tomate, asi como el promotor ACC oxidasa de manzana (por una revisión véase Potenza et al., 2004). En una forma de realización preferida, el promotor dirige preferencialmente la expresión en las partes comestibles de la fruta, por ejemplo la médula de la fruta, con relación a la piel de la fruta o las semillas dentro del fruto.
En una forma de realización, el promotor inducible es el sistema ale de Aspergillus nidulans. Los ejemplos de los sistemas de expresión inducible que se pueden usar en lugar del sistema ale de Aspergillus nidulans se describen en una revisión de Padidam (2003) y Corrado y arali (2009). Estos incluyen sistemas basados en (TetR) represores de tetraciclina e inducibles por tetraciclina (Gatz, 1997), sistemas basados en represor de tetraciclina e inactivables por tetraciclina (Weinmann et al., 1994), sistemas basados en receptores de glucocorticoides (Picard, 1994), basados en receptores de estrógenos y otros sistemas inducibles por esteroides (Bruce et al., 2000), sistemas de control dual basados en receptor de glucocorticoides , y en represor de tetraciclina (Bohner et al., 1999), sistemas basados en receptores de ecdisoma, inducibles por insecticida (Martínez et al., 1999, Padidam et al., 2003, Unger et al, 2002, Riddiford et al., 2000, Dhadialla et al., 1998, Martínez y Jepson, 1999), sistemas basados en AlcR, inducibles por etanol (Felenbok, 1991) y sistemas basados en ACEI, inducibles por cobre (Mett et al., 1993).
En otra forma de realización, el promotor inducible es un promotor inducible protector tal como, por ejemplo, el promotor In2-1 o ln2-2 de maíz (Hershey y Stoner, 1991), el promotor inducible protector es el promotor GST-27 de maíz (Jepson. et al., 1994), o el promotor GH2/4 de soja (Ulmasov et al . , 1995) .
Los protectores son un grupo de guímicos estructuralmente diversos usados para aumentar la tolerancia de la planta a los efectos tóxicos de un compuesto herbicida. Los ejemplos de estos compuestos incluyen anhídrido naftálíco y N,N-dialil-2, 2-dicloroacetamida (DDCA), gue protege al maíz y al sorgo contra los herbicidas con tiocarbamato; ciometrinilo, gue protege al sorgo contra metoclor; triapentenol , gue protege a la soja contra metribuzina; y bencenosul fonamidas sustituidas, gue mejora la tolerancia de varias especies de cultivos de cereal a herbicidas de sul fonilureas .
En otra forma de realización, el promotor inducible es un promotor inducible de senescencia tal como, por ejemplo, promotor inducible por senescencia SAG (gen asociado a senescencia) 12 y SAG 13 de Arabidopsis (Gan, 1995; Gan y Amasino, 1995) y LSC54 de Brassica napus ( Buchanan-Wollaston, 1994 ) .
Para la expresión en tejido vegetativo se pueden usar promotores específicos de hoja, tal como los promotores de ribulosa bifosfato carboxilasa (RBCS). Por ejemplo, los genes RBCS1, RBCS2 y RBCS3A de tomate se expresan en hojas y plántulas marrón claro (Meier et al., 1997). Se puede usar un promotor de ribulosa bisfosfato carboxilasa expresado casi exclusivamente en células del mesófilo en láminas de las hojas y vainas a niveles altos, descrito por Matsuoka et al. (1994) . Otro promotor específico de hoja es el promotor del gen de la proteína de unión a clorofila a/b captadora de luz (véase, Shiina et al., 1997). El promotor del gen relacionado con myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5) descrito por Li et al. (1996), es específico de ho a. El promotor AtmybS se expresa en tricomas de hojas en desarrollo, estípulas, y células epidérmicas en los márgenes de rosetas jóvenes y hojas caulinas, y en semillas inmaduras. También se puede usar un promotor de ho a identificado en maíz por Busk et al. (1997) .
En algunos casos, por ejemplo cuando se expresa recombinantemente LEC2 o BBM, puede ser deseable que el transgen no se exprese a niveles altos. Un e emplo de un promotor que se puede usar en dichas circunstancias es un promotor de napina A truncado que retiene el patrón de expresión específico de semilla pero con un nivel de expresión reducido (Tan et al., 2011).
La secuencia directriz no traducida 5' puede derivar del promotor seleccionado para expresar la secuencia del gen heterólogo del polinucleótido de la presente invención o puede ser heteróloga con respecto a la región codificante de la enzima a producir y se puede modificar específicamente, si se desea, para incrementar la traducción del ARNm. Por una revisión sobre la optimización de la expresión de transgenes, véase Koziel et al., (1996). Las regiones no traducidas 5' también se pueden obtener de los ARN virales de plantas (virus en mosaico del tabaco, virus del grabado de la hoja de tabaco, virus en mosaico enano de maíz, virus en mosaico enano de alfalfa, entre otros), de genes eucariotas adecuados, de genes vegetales (directriz del gen de la proteína de unión a clorofila a/b de trigo y maíz) o de una secuencia genética sintética. La presente invención no se limita a las construcciones en donde la región no traducida deriva de la secuencia no traducida 5' que acompaña a la secuencia del promotor. La secuencia directriz también podría derivar de una secuencia codificante o de un promotor no relacionado. Las secuencias directrices de utilidad en el contexto de la presente invención comprenden la directriz Hsp70 de maíz (US 5.362.865 y US 5.859.347) y el elemento TMV omega .
La terminación de transcripción se efectúa con una secuencia de ADN no traducida 3' ligada operativamente en el vector de expresión al polinucleótido de interés. La región no traducida 3' de una molécula de ADN recombinante contiene una señal de poliadenilacion cuya función en plantas causa la adición de nucleótidos adenilato al extremo 3' del ARN. La región no traducida 3' se puede obtener de diversos genes que se expresan en células vegetales. La región no traducida 3' de la nopalina sintasa, la región no traducida 3' del gen de la subunidad pequeña de Rubisco de arveja, la región no traducida 3' de la proteína de almacenamiento 7S de soja en genes de semillas son de uso común en este sentido. También son adecuadas las regiones no traducidas transcritas 3', que contienen la señal de poliadenilato de los genes del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium.
Se pueden usar tecnologías de ADN recombinante para mejorar la expresión de un polinucleotido transformado mediante manipulación, por ejemplo, la cantidad de copias del polinucleotido dentro de una célula huésped, la eficacia con la cual se transcriben dichos polinucleótidos, la eficacia con que se traducen los transcriptos resultantes y la eficacia de las modificaciones de post-traducción . Las técnicas recombinantes de utilidad para incrementar la expresión de los polinucleótidos definidos en la presente incluyen, pero en un sentido no limitativo, unión operativa del polinucleotido a plásmidos con un gran número de copias, integración del polinucleotido en uno o más cromosomas de las células huésped, adición de secuencias estabilizadoras del vector al plásmido, sustituciones o modificaciones de las señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores ) , sustituciones o modificaciones de las señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, secuencias Shine-Dalgarno), modificación del polinucleotido para que se correspondan con la utilización de codones de la célula huésped y supresión de las secuencias que desestabilizan a los transcriptos. Ácidos nucleicos de transferencia Se pueden usar ácidos nucleicos de transferencia para administrar un polinucleotido exógeno a una célula y comprende una, preferentemente dos, secuencias de bordes y un polinucleotido de interés. El ácido nucleico de transferencia puede codificar, o no, un marcador seleccionable . Preferentemente, el ácido nucleico de transferencia forma parte de un vector binario en la bacteria, donde dicho vector binario comprende además elementos que permiten la replicación del vector en la bacteria o permite la selección o conservación de células bacterianas que contienen al vector binario. Con la transferencia a una célula eucariota, el componente de ácido nucleico de transferencia del vector binario tiene la capacidad de integrarse en el genoma de la célula eucariota.
Según se usa en la presente, el término "ácido nucleico de transferencia extracromosómico" se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene la capacidad de poder ser transferida de una bacteria, tal como Agrobacterium sp. , a una célula eucariota, tal como una célula foliar vegetal. Un ácido nucleico de transferencia extracromosómico es un elemento genético reconocido como un elemento que puede ser transferido con la subsiguiente integración de la secuencia de nucleótidos contenida dentro de sus bordes en el genoma de la célula receptora. En este sentido, un ácido nucleico de transferencia típicamente está flanqueado por dos secuencias de "bordes", aunque en algunos casos se puede usar un solo borde por uno de los extremos y el segundo extremo del ácido nucleico transferido es generado aleatoriamente en el proceso de transferencia. Un polinucleótido de interés se ubica típicamente entre la secuencia tipo borde izquierdo y la secuencia tipo borde derecho de un ácido nucleico de transferencia. El polinucleótido contenido dentro del ácido nucleico de transferencia se puede ligar operativamente a una variedad de diferentes elementos reguladores promotores y terminadores que facilitan su expresión, es decir, la transcripción y/o traducción del polinucleótido. Los ADN-T de Agrobacterium sp. tal como de Agrobacterium turnefaciens o de Agrobacterium rhizogenes, y variantes/mutantes de los mismos elaboradas por el hombre son probablemente los ejemplos mejor caracterizados de ácidos nucleicos de transferencia. Otro e emplo es el ADN-P ("ADN de plantas") que comprende secuencias tipo borde de ADN-T de plantas.
Según se usa en la presente, "ADN-T" se refiere, por ejemplo, al ADN-T de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o de un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes, o variantes de los mismos elaboradas por el hombre que funcionan como ADN-T. El ADN-T puede comprender un ADN-T completo incluyendo ambas secuencias de bordes derecho e izquierdo, pero solamente es necesario que comprenda las secuencias mínimas requeridas en cis para la transferencia, es decir, la secuencia del borde derecho y de ADN-T. En los ADN-T de la invención se han insertado, en cualquier parte entre las secuencias de bordes derecho e izquierdo (si está presente), el polinucleótido de interés flanqueado por sitios blanco para una recombinasa especifica del sitio. Las secuencias que codifican los factores requeridos en trans para la transferencia del ADN-T en una célula vegetal, tal como los genes vír, se pueden insertar en el ADN-T o pueden estar presentes sobre el mismo replicón que el ADN-T o preferentemente se encuentran en trans sobre un replicón compatible en el huésped de Agrobacteríum. Dichos "sistemas de vectores binarios" son bien conocidos en el arte.
Según se usa en la presente, el "ADN-P" se refiere a un ácido nucleico de transferencia aislado de un genoma vegetal, o variantes/mutantes del mismo elaboradas por el hombre, y comprende por cada extremo, o por un solo extremo, una secuencia tipo borde de ADN-T. La secuencia tipo borde comparte preferentemente al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95%, pero menos que un 100% de identidad de secuencia, con una secuencia de borde de ADN-T de Agrobacteríum sp., tal como de Agrobacteríum tumefacíens o de Agrobacteríum rhizogenes . Por consiguiente, se pueden usar ADN-P en lugar de ADN-T para transferir una secuencia de nucleótidos contenida en el ADN-P, por ejemplo de Agrobacterium a otra célula. El ADN-P, antes de la inserción del polinucleótido exógeno que será transferido, puede modificarse para facilitar la clonación y preferentemente no debería codificar ninguna proteina. El ADN-P se caracteriza por contener al menos una secuencia de borde derecho y preferentemente también una secuencia de borde izquierdo.
Según se usa en la presente, las secuencias de "bordes" de un ácido nucleico de transferencia se pueden aislar de un organismo seleccionado, tal como una planta o bacteria, o puede ser una variante/mutante de la misma elaborada por el hombre. La secuencia del borde promueve y facilita la transferencia del polinucleótido con el cual está ligado y puede facilitar su integración en el genoma de la célula receptora. En una forma de realización, una secuencia de borde es de entre 5-100 pares de bases (pb) de longitud, 10-80 pb de longitud, 15-75 pb de longitud, 15-60 pb de longitud, 15-50 pb de longitud, 15-40 pb de longitud, 15-30 pb de longitud, 16-30 pb de longitud, 20-30 pb de longitud, 21-30 pb de longitud, 22-30 pb de longitud, 23-30 pb de longitud, 24-30 pb de longitud, 25-30 pb de longitud o 26-30 pb de longitud. Las secuencias de bordes del ADN-T de Agrobacterium sp. son bien conocidas en el arte e incluyen los que se describen en Lacroix et al. (2008), Tzfira y Citovsky (2006) y Glevin (2003) .
Si bien tradicionalmente sólo se ha usado Agrobacteríum sp. para transferir genes una células vegetales, existe ahora una gran cantidad de sistemas que fueron identificados/desarrollados y que actúan de una manera similar a Agrobacteríum sp. Recientemente se han modificado genéticamente varias especies distintas de Agrobacteríum para que sean competentes para la transferencia de genes (Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005) . Estas especies incluyen Rhízobium sp. NGR234, Sínorhízobíum melíloti y Mezorhizobium loti. Las bacterias se hacen competentes para la transferencia de genes proporcionándoles a las bacterias la maquinaria necesaria para el proceso de transformación: es decir un conjunto de genes de virulencia codificado por un plásmido Ti de Agrobacteríum y el segmento de ADN-T que reside sobre un pequeño plásmido binario separado. Las bacterias manipuladas de esta manera tienen la capacidad de transformar diferentes te idos vegetales (tejido de discos de hoja, callos y oval), de monocotiledóneas o dicotiledóneas, y de diversas especies vegetales diferentes (por ejemplo, tabaco, arroz ) .
La transferencia directa de plásmidos de expresión eucariotas de bacterias a huéspedes eucariotas se logró por primera vez hace varias décadas por fusión de células de mamífero y protoplastos de Escherichia coli portadores de plásmidos (Schaffner, 1980). Desde entonces, ha ido aumentando de manera constante la cantidad de bacterias capaces de distribuir genes en células de mamífero (Weiss, 2003), habiendo sido descubiertos por cuatro grupos de forma independiente (Sizemore et al., 1995; Courvalin et al., 1995; Powell et al., 1996; Dar i et al., 1997).
Se ha demostrado que Shigella flexneri , Salmonella typhimurium o E. coli atenuadas que se volvieron invasivas por el plásmido de virulencia (pWRlOO) de S. flexneri pueden transferir plásmidos de expresión después de la invasión en células huésped y muerte intracelular debido a una atenuación metabólica. La aplicación en mucosas, ya sea por vía nasal u oral, de tales organismos recombinantes de Shigella o Salmonella indujo respuestas inmunes contra el antígeno codificado por los plásmidos de expresión. Mientras tanto, se había más que duplicado la lista de bacterias capaces de transferir plásmidos de expresión una células huésped de mamífero in vitro e in vivo y fue documentado para S. typhi, 5. choleraesuiSf Listeria monocytogenes, Yersinia pseudotuberculosis e Y. enterocolitica (Fennelly et al., 1999; Shiau et al., 2001; Dietrich et al., 1998; Hense et al., 2001; Al-Mariri et al., 2002) .
En general, se podría asumir que todas las bacterias capaces de ingresar en el citosol de la célula huésped (como S. flexnerí o L. monocytogenes) y Usarse dentro de este compartimento celular, deberían poder transferir ADN. Esto se conoce como una invasión ^abortiva' o xsuicida' ya que las bacterias deben lisarse para que tenga lugar la transferencia de ADN (Grillot-Courvalin et al., 1999) . Además, aún muchas de las bacterias que permanecen en la vacuola fagocítica (como S. typhímurium) también podrían hacerlo. Por consiguiente, las cepas de laboratorio recombinantes de E. colí que han sido manipuladas para ser invasivas pero incapaces de un escape fagosómico, podrían no obstante distribuir su carga de plásmidos en el núcleo de la célula de mamífero infectada (Grillot-Courvalin et al., 1998). Además, recientemente también se ha demostrado que Agrobacteríum tumefaciens puede introducir transgenes en células de mamífero (Kunik et al., 2001) .
Según se usa en la presente, los términos "transíección", "transformación" y variaciones de los mismos en general se usan indistintamente. Las células "transfectadas" o "transformadas" pueden haber sido manipuladas para introducir el o los pol inucl eótidos de interés, o pueden ser células de la progenie derivadas de ellas .
Células recombinantes La invención también provee una célula recombinante, por ejemplo, una célula vegetal recombinante, que es una célula huésped transformada con uno o más polinucleótidos o vectores definidos en la presente, o una combinación de los mismos. El término "célula recombinante" se usa indistintamente con el término "célula transgénica" en la presente. Las células adecuadas de la invención incluyen cualquier célula que se pueda transformar con un polinucleótido o un vector recombinante de la invención, que codifica, por ejemplo, un polipéptido o una enzima descrita en la presente. La célula es preferentemente una célula que de esa manera se pueda usar para producir lipidos. La célula recombinante puede ser una célula en cultivo, una célula in vi tro o presente en un organismo, tal como por ejemplo una planta, o en un órgano, tal como por ejemplo una semilla o una hoja. Preferentemente, la célula se encuentra en una planta, más preferentemente en la semilla de una planta. En una forma de realización, la célula recombinante es una célula no humana.
Las células huésped en las cuales se introducen los polinucleótido pueden ser células no t ansformadas o células que ya fueron transformadas con al menos un ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos pueden estar relacionados, o no, con la síntesis de lipidos. Las células huésped de la presente invención pueden tener capacidad endógena (es decir, natural) para producir los polipéptidos definidos en la presente, en cuyo caso la célula recombinante derivada de los mismos tienen una mayor capacidad para producir los polipéptidos, o pueden tener la capacidad de producir tales polipéptidos solamente después de su transformación con al menos un polinucleótido de la invención. En una forma de realización, la célula recombinante de la invención tiene una capacidad mejorada para producir lipidos no polares.
Las células huésped de la presente invención pueden ser cualquier célula capaz de producir al menos una de las proteínas descritas en la presente, e incluyen células bacterianas, fúngicas (incluyendo de levadura), de parásitos, de artrópodo, de animales, algas y vegetales. Las células pueden ser procariotas o eucariotas . Las células huésped preferidas son células de levadura, algas y vegetales. En una forma de realización preferida, la célula vegetal es una célula de semilla, en particular una célula del cotiledón o endosperma de una semilla. En una forma de realización, la célula es una célula animal. La célula animal puede ser de cualquier tipo de animal tal como, por ejemplo, una célula de un animal no humano, una célula de un vertebrado no humano, una célula de mamífero no humano o células de animales acuáticos tales como, peces o crustáceos, invertebrados, insectos, etc. Los ejemplos no limitativos de células de artrópodos incluyen células de insecto, tal como células de Spodoptera frugiperda (Sf), por ejemplo Sf9, Sf21, células de Tríchoplusia ni y células S2 de Drosophila. Un e emplo de una célula bacteriana de utilidad como una célula huésped de la presente invención es de Synechococcus spp. (también conocida como Synechocystí s spp.), por ejemplo Synechococcus elongatus . Los ejemplos de células de algas de utilidad como células huésped de la presente invención incluyen, por ejemplo, Chlamydomoñas sp (por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii) , Dunaliella sp., Haematococcus sp. , Chlorella sp., Thraustochytríum sp., Schizochytríu sp. y Volvox sp.
Las células huésped para la expresión de los ácidos nucleicos de la presente pueden incluir huéspedes microbianos que crecen sobre una variedad de alimentaciones, incluyendo carbohidratos simples o complejos, ácidos orgánicos y alcoholes y/o hidrocarburos, son un amplio rango de valores de temperatura y pH. Los huéspedes microbianos preferidos son organismos oleaginosos que tienen una capacidad natural de sintetizar lipidos no polares.
Las células huésped pueden ser de un organismo adecuado para un proceso de fermentación, tal como, por ejemplo, Yarrowia lipolitica u otras levaduras.
Plantas transgénicas La invención también provee una planta que comprende un polinucleótido o un polipéptido exógeno de la invención, una célula de la invención, un vector de la invención o una combinación de los mismos. El término "planta" se refiere a plantas completas, en tanto el término "parte de la misma" se refiere a órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raices, flores, frutos), células individuales (por ejemplo, polen), semillas, partes de semillas tales como un embrión, endosperma, escutelo o recubrimiento de semillas, tejido vegetal tal como tejido vascular, células vegetales y la progenie de las mismas. Según se usa en la presente, las partes de plantas comprenden células vegetales.
Según se usa en la presente, el término "planta" se usa en su sentido más amplio. Incluye, pero en un sentido no limitativo, cualquier especie de pasto, planta ornamental o decorativa, cultivo o cereal (por ejemplo, semilla oleaginosa, maíz, soja), pienso o forraje, frutos o verduras, plantas herbáceas, plantas leñosas, plantas con flores o árboles. No pretende limitar una planta a ninguna estructura particular. También se refiere a una planta unicelular (por ejemplo, un microalga) . El término "parte de la misma" con referencia a una planta se refiere a una célula vegetal y a la progenie de la misma, a una pluralidad de células vegetales que se diferencian mayormente en una colonia (por ejemplo, volvox), una estructura que está presente en cualquier etapa del desarrollo de una planta, o un tejido vegetal. Dichas estructuras incluyen, pero en un sentido no limitativo, hojas, tallos, flores, frutos, nueces, raíces, semillas, recubrimiento de semillas, embriones. El término "tejido vegetal" incluye tejidos vegetales diferenciados y no diferenciados incluyendo los que están presentes en hojas, tallos, flores, frutos, nueces, raíces, semillas, por ejemplo, tejido embrionario, endosperma, tejido dérmico (por ejemplo, epidermis, periderma), te ido vascular (por ejemplo, xilema, floema) o tejido básico (que comprende células de parénquima, colénquima y/o esclerénquima ) , así como células en cultivo (por ejemplo, células individuales, protoplastos , callos, embriones, etc.). El te ido vegetal puede estar in planta, en cultivo de órganos, en cultivo tisular o cultivo celular .
Una "planta transgénica" , una "planta modificada genéticamente" o variaciones de las mismas, se refieren a una planta que contiene un transgen que no se encuentra en una planta de tipo salvaje de la misma especie, variedad o cultivar. Las plantas transgénicas definidas en el contexto de la presente invención incluyen plantas y su progenie que han sido modificadas genéticamente usando técnicas recombinantes para producir al menos un polipéptido definido en la presente en la planta o parte- de la misma. Las partes de plantas transgénicas tienen un significado correspondiente .
Los términos "semilla" y "grano" se usan indistintamente en la presente. Un "grano" se refiere a un grano maduro, tal como un grano cosechado o un grano que aún se encuentra sobre la planta pero que está listo para ser cosechado, y también se refiere a un grano después de embeberlo o hacerlo germinar, según el contexto. Los granos maduros comúnmente tienen un contenido de humedad menor que entre 18 y 20% aproximadamente. En una forma de realización preferida, el contenido de humedad del grano está en un nivel que generalmente es considerado como seguro para el almacenamiento, preferentemente entre 5% y 15%, entre 6% y 8%, entre 8% y 10%, o entre 12% y 15%. Una "semilla en desarrollo", según se usa en la presente, se refiere a una semilla antes de la madurez, típicamente presente en las estructuras reproductoras de la planta después de la fertilización o antesis, pero también se refieren a las semillas antes de la madurez que se pueden aislar de la planta. La semilla madura tiene comúnmente un contenido de humedad menor de aproximadamente entre 18 y 20%. En una forma de realización preferida, el contenido de humedad de la semilla está en un nivel que generalmente es considerado como seguro para el almacenamiento, preferentemente entre 5% y 15%, entre 6% y 8%, entre 8% y 10%, o entre 12% y 15%.
Según se usa en la presente, el término "órgano de almacenamiento de una planta" se refiere a una parte de una planta especializada en guardar energía en la forma de, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos. Los ejemplos de órganos de almacenamiento de una planta son semillas, frutos, raíces tuberosas y tubérculos. Un órgano de almacenamiento preferido de una planta de la invención es la semilla.
Según se usa en la presente, el término "fenotípicamente normal" se refiere a una planta o parte de la misma, en particular un órgano de almacenamiento tal como una semilla, tubérculo o fruto de la invención modificada genéticamente que no tiene una capacidad significativamente reducida para crecer y reproducirse en comparación con una planta o parte de la misma no modificada. En una forma de realización, la planta o parte de la misma modificada genéticamente que es fenotípicamente normal comprende un polinucleótido recombinante que codifica un supresor por silenciamiento ligado operativamente a un promotor específico del órgano de almacenamiento de una planta y que tiene la capacidad de crecer o reproducirse, esencialmente igual que una planta o parte de la misma correspondiente que no que comprende a dicho polinucleótido. Preferentemente, la biomasa, el índice de crecimiento, índice de germinación, el tamaño de los órganos de almacenamiento, el tamaño de las semillas y/o la cantidad de semillas viables producidas no son menores que un 90% de los valores de una planta que no contiene a dicho polinucleótido recombinante cuando se cultiva bajo condiciones idénticas. Este término no abarca las características de la planta que pueden ser diferentes de la planta de tipo salvaje pero que no afectan la utilidad de la planta para fines comerciales tal como, por ejemplo, un fenotipo ballerína de las hojas de las plántulas.
Las plantas suministradas o contempladas para su uso en la práctica de la presente invención incluyen tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. En formas de realización preferidas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y legumbres, maíz, trigo, papa, tapioca, arroz, sorgo, mijo, mandioca, cebada o arveja) u otras legumbres. Las plantas se pueden cultivar para la producción de raíces, tubérculos, hojas, tallos, flores o frutos comestibles. Las plantas pueden ser verduras o plantas ornamentales. Las plantas de la invención pueden ser: Acrocomia aculeata (palma de macauba), Arabídopsis thaliana, Aracinis hypogaea (maní), Astrocaryum muru uru (murumuru), Astrocaryum vulgare (tucuma) , Attalea geraensis ( Indaiá-rateiro ) , Attalea humilis (palma de aceite americana), Attalea oleífera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babassu) , Avena sativa (avena), Beta vulgaris (remolacha), Brassíca sp. tal como Brassica carínata, Brassica júncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (cañóla), Camelina sativa (lino falso), Cannabís sativa (cáñamo), Carthamus tínctorius (cañóla), Caryocar brasiliense (pequi), Cocos nucífera (coco), Crambe abyssinica (col abisinio), Cucumis meló (melón), Elaeis guineensis (palma africana), Glicina max (soja), Gossypium hirsutum (algodón), Helianthus sp. tal como Helianthus annuus (girasol), Eordeum vulgare (cebada), Jatropha curcas (coquito), Joannesia princeps (árbol de nuez de Brasil), Lemna sp. (lenteja de agua) tal como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lenteja de agua hinchada), Lemna japónica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucícostata, Lemna perpusílla, Lemna teñera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rígida (oiticica), Linum usitatissimum (lino), Lupinus angustífolius (lupino), Mauritia flexuosa (palma de moriche), Maximiliana aripa (inaja palm) , Miscanthus sp. tal como Miscanthus x giganteus y Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana benthamíana, Oenocarpus bacaba (milpesos de aceite), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (milpesos de leche), Oryza sp. (arroz) tal como Oryza sativa y Oryza glaberrima, Panicu virgatum (mijo), Paraqueiba paraensís (mari), Persea americana (palta), Pongamia pinnata (haya india), Populus trichocarpa, Rícinus communis (ricino), Saccharum sp. (caña de azúcar), Sesamum indicum (sésamo), Solanum tuberosum (papa), Sorghum sp. tal como Sorghum bicolor, Sorghum vulgar , Theobroma grandiflorum (copoazú), Trífolium sp., Trithrinax brasílíensis (caranday brasileño), Tríticum sp. (trigo) tal como Tríticum aestivum, Zea mays (maíz), alfalfa (Medicago sativa), centeno (S cale cerale) , batata (Lopmoea batatus) , mandioca [Manihot esculenta) , café (Cofea spp. ) , ananá {Anana comosus) , árbol cítrico (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia senensis) , banana (Musa spp. ) , palta (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifer indica), oliva (Olea europaea) , papaya (Carica papaya), castaña de cajú (Anacardium occidentale) , macadamia (Macada ia intergrifolia) y almendra (Prunus amygdalus) .
Otras plantas preferidas incluyen pastos C4 tales como, adicionalmente a aquellos mencionados anteriormente, Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloídes, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus; pastos C3 tales como Elymus canadensis, las leguminosas Lespedeza capitata y Petalostemum villosum, la hierba Aster azureus; y plantas leñosas tales como Q ercus ellípsoídalís y Q. macrocarpa. Otras plantas preferidas incluyen pastos C3.
En una forma de realización preferida, la planta es una angiosperma.
En una forma de realización, la planta es una planta oleaginosa, preferentemente una planta de cultivo de semillas oleaginosas. Según se usa en la presente, una "planta oleaginosa" es una especie vegetal usada en la producción comercial de lipidos a partir de las semillas de la planta. La planta oleaginosa puede ser colza oleaginosa (tal como cañóla), maíz, girasol, alazor, soja, sorgo, lino (semillas de lino) o remolacha. Además, la planta oleaginosa puede ser otras Brassicas, algodón, mani, amapola, rutabaga, mostaza, semillas de ricino, sésamo, alazor o plantas productoras de nueces. La planta puede producir niveles altos de lipidos en sus frutos, tal como olivo, palma oleaginosa o coco. Las plantas de horticultura en las cuales se puede aplicar la presente invención son lechuga, endivia o verduras de brassicas incluyendo coles, brócoli o coliflor. La presente invención se puede aplicar en tabaco, cucurbitáceas, zanahorias, frutillas, tomate o pimiento.
En una forma de realización preferida, la planta transgénica es homocigota para cada uno y todos los genes que fueron introducidos (transgen) de modo que su progenie no segregará el fenotipo deseado. La planta transgénica también puede ser heterocigota para los transgenes introducidos, preferentemente uniformemente heterocigotas para el transgen, tal como por e emplo en la progenie Fl que fue cultivada a partir de semillas híbridas. Dichas plantas pueden ofrecer ventajas tales como el vigor híbrido, bien conocido en el arte .
Cuando fuera relevante, las plantas transgénicas también pueden comprender transgenes adicionales que codifican enzimas relacionadas con la producción de lípidos no polares tales como, en un sentido no limitativo, LPAAT, LPCAT, PAP o una fosfolípido : diacilglicerol aciltransferasa (PDAT1, PDAT2 o PDAT3; véase por ejemplo, Ghosal et al., 2007) , o una combinación de dos o más de los mismos. Las plantas transgénicas de la invención también pueden expresar oleosina a partir de un polinucleótido exógeno.
Transformación de plantas Las plantas transgénicas se pueden producir usando técnicas conocidas en el arte, tales como las que se describen en general en A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), y Christou y lee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley y Sons (2004).
Según se usa en la presente, los términos "transformación de manera estable", "transformado de manera estable" y variaciones de los mismos se refieren a la integración del polinucleótido en el genoma de la célula de modo tal que son transferidas a las células de la progenies durante la división celular sin necesidad de seleccionar positivamente su presencia. Los transformantes estables, o la progenie de los mismos, se pueden seleccionar con cualquier medio conocido en el arte tales como transferencias Southern con ADN cromosómico o hibridación en sítu de ADN genómico.
La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema de amplia aplicación para introducir genes en células vegetales porque el ADN se puede introducir en las células en tejidos vegetales u órganos vegetales completos o en explantes en cultivo tisular, ya sea para una expresión transitoria o para una integración estable del ADN en el genoma de la célula vegetal. El uso de vectores de integración vegetales mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en el arte (véase, por ejemplo, US 5177010, US 5104310, US 5004863 o US 5159135) . La región de ADN a transferir está definida por las secuencias de los bordes, y el ADN que interviene (ADN-T) comúnmente se inserta en el genoma vegetal. Además, la integración del ADN-T es un proceso relati amente preciso que da. como resultado unos pocos reordenamientos. En aquellas variedades vegetales donde la transformación mediada por Agrobacteri um es eficiente, es el método de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia de genes. Los vectores preferidos para la transformación con Agrobacterium tienen la capacidad de replicarse en E. coli, asi como en Agrobacterium, permitiendo manipulaciones convenientes como se describe en la literatura (Klee et al., En: Plant DNA Infectious Agents, Hohn y Schell (editores), Springer-Verlag, Nueva York, páginas 179-203 (1985)).
Los métodos de aceleración que se pueden usar incluyen, por ejemplo, bombardeo con microproyectiles y semejantes. Un ejemplo de un método para distribuir moléculas de ácidos nucleicos transformantes en células vegetales es el bombardeo con microproyectiles. Este método ha sido revisado por Yang et al., Partióle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994) . Se pueden recubrir partículas no biológicas (microproyectiles) con ácidos nucleicos y distribuirlas en las células mediante una fuerza propulsora. Los ejemplos de partículas incluyen las que comprenden tungsteno, oro, platino y semejantes. Una ventaja particular del bombardeo de microproyectiles, además de ser un medio eficaz para transformar monocotiledóneas de manera reproducible, es que no es necesario aislar los protoplastos ni susceptibilidad de una infección por Agrobacterium. Una forma de realización ilustrativa de un método para distribuir ADN en células de Zea mays por aceleración es un sistema de distribución de partículas a biolístico, que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con ADN a través de una pantalla, tal como una pantalla de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con células de maíz cultivadas en suspensión. Un sistema de distribución de partículas adecuado para su uso con la presente invención es la pistola de aceleración por helio PDS-1000/He disponible de Bio-Rad Laboratories.
Para el bombardeo, se pueden concentrar células en suspensión sobre filtros. Los filtros que contienen a las células que serán bombardeadas se ubican a una distancia apropiada debajo de la placa de detención de microproyectiles . Si se deseara, también se pueden colocar una o varias pantallas entre la pistola y las células a bombardear .
Como alternativa, se pueden disponer embriones inmaduros u otras células blanco sobre un medio de cultivo sólido. Las células que serán bombardeadas se ubican a una distancia apropiada debajo de la placa de detención de microproyectiles. Si se deseara, también se coloca una o varias pantallas entre el dispositivo de aceleración y las células que serán bombardeadas. El uso de las técnicas que se describen en este documento permitirá obtener hasta 1000 o más focos de células que expresan de forma transitoria un gen de un marcador rastreable o seleccionable . La cantidad de células de un foco que expresa el producto genético .48 horas después del bombardeo a menudo varia en un rango de uno a diez, con un promedio de uno a tres.
En la transformación por bombardeo, se pueden optimizar las condiciones de cultivo de pre-bombardeo y los parámetros de bombardeo con el fin de obtener la cantidad máxima de transformantes estables. Tanto los parámetros físicos como biológicos para el bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos son aquellos que comprenden la manipulación del ADN/precipitado de microproyectiles o aquellos que afectan el vuelo y la velocidad de los macro- o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todos los pasos involucrados en la manipulación de las células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células blanco para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN alineado o plásmidos superenrollados intactos. Se considera que las manipulaciones de pre-bombardeo son especialmente importantes ¦ para una transformación exitosa de embriones inmaduros.
En otra forma de realización alternativa, se pueden transformar plástidos de forma estable. Los métodos divulgados para la transformación de plástidos en plantas superiores incluyen distribución con pistola de partículas de ADN que contienen un marcador seleccionable y direccionamiento del ADN al genoma del plástido por medio de recombinación homologa (US 451.513, US 5.545.818, US 5.877.402, US 5.932.479 y WO 99/05265).
Por consiguiente, se considera que puede ser necesario ajustar diversos aspectos de los parámetros de bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar completamente las condiciones. Puede ser particularmente deseable ajustar los parámetros físicos, tal como la distancia a la hendidura, la distancia de vuelo, la distancia al tejido y la presión de helio. También puede ser conveniente minimizar los factores de reducción de trauma modificando las condiciones que afectan el estado fisiológico de las células receptoras y que por ello pueden afectar la transformación y las eficacias de integración. Por ejemplo, se puede ajustar el estado osmótico, la hidratacion del tejido y la etapa de subcultivo o el ciclo celular de las células receptoras para lograr una transformación óptima. La ejecución de otros ajustes de rutina constituye un aspecto conocido para los especialistas en el arte a la luz de la presente descripción.
La transformación de protoplastos vegetales se puede efectuar usando métodos basados en precipitación por fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol , electroporación y combinaciones de estos tratamientos. La aplicación de estos sistemas a diferentes variedades de plantas depende de la capacidad para regenerar dicha cepa vegetal particular a partir de protoplastos. Se han descrito métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al. , 1986) .
También se pueden usar otros métodos de transformación de células, los cuales incluyen, por ejemplo, la introducción de ADN en plantas mediante la transferencia directa de ADN en el polen, la inyección directa de ADN en los órganos reproductores de una planta o la inyección directa de ADN en las células de embriones inmaduros, seguida por. la rehidratación de embriones desecados .
La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de protoplastos transformantes de plantas individuales, o a partir de varios explantes transformados, son bien conocidos en el arte (Weissbach et al., en: Métodos for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, CA (1988). Este proceso de regeneración y desarrollo típicamente incluye los pasos de selección de las células transformadas, cultivo de aquellas células individualizadas a través de las etapas usuales del desarrollo embrionario, hasta la etapa de plántula con raiz. Los embriones y las semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Luego se siembran los brotes con raíces resultantes en un medio apropiado para el cultivo de plantas, tal como tierra.
El desarrollo o la regeneración de plantas que contienen al gen exógeno extraño son bien conocidos en el arte. Preferentemente, las plantas regeneradas son autopolinizadas para proveer plantas transgénicas homocigotas . Por otro lado, puede cruzarse el polen obtenido de las plantas regeneradas con plantas cultivadas a partir de semillas de líneas de importancia agrícola. Por otro lado, se usa el polen de plantas de estas líneas importantes para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polinucleótido deseado se cultiva usando métodos bien conocidos por aquellos versados en la técnica.
Los métodos para transformar dicotiledóneas, primariamente mediante el uso de Agrobacterium turnefaciens, y obtener plantas transgénicas fueron publicados para algodón (US 5.004.863, US 5.159.135, US 5,518.908); so a (US 5.569.834, US 5.416.011); Brassica (US 5.463.174); maní (Cheng et al., 1996); y arveja (Grant et al., 1995).
Los métodos para transformar de plantas de cereales tales como trigo y cebada para introducir una variación genética en la planta por introducción de un ácido nucleico exógeno y para regenerar plantas a partir de protoplastos o de embriones inmaduros de las plantas son bien conocidos en el arte, véase por ejemplo, CA 2.092,588, AU 61781/94, AU 667939, US 6.100.447, WO 97/048814, US 5.589.617, US 6.541.257, y otros métodos se indican en W099/14314. Preferentemente, las plantas transgénicas de trigo o cebada se producen mediante procedimientos de transformación mediados por Agrobacterium turnefaciens . Los vectores que contienen el polinucleótido deseado se pueden introducir en células de trigo regenerables de plantas de cultivo tisular o de explantes, o de sistemas vegetales adecuados tales como protoplastos.
Las células de trigo regenerables son preferentemente del escutelo de embriones inmaduros, embriones maduros, callos derivados de los mismos o del tejido meristemático .
Para confirmar la presencia de los transgenes en células y plantas transgénicas, se puede conducir una amplificación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un análisis de transferencia Southern usando métodos conocidos por los especialistas en el arte. Los productos de expresión de los transgenes se pueden detectar en cualquiera de una variedad de maneras, dependiendo de la naturaleza del producto e incluyen transferencia Western y ensayos enzimáticos. Una manera de particular utilidad para cuantificar la expresión de proteínas y para detectar la replicación en diferentes te idos vegetales comprende usar un gen informante, tal como GUS . Una vez que se obtuvieron las plantas transgénicas, se pueden cultivar para producir tejidos vegetales o partes de plantas con el fenotipo deseado. Se puede cosechar el tejido vegetal o las partes de plantas y/o se pueden recolectar las semillas. La semilla puede servir como una fuente para cultivar plantas adicionales con tejidos o partes que tienen las características deseadas. Preferentemente, las partes vegetativas de las plantas se cosechan en un momento cuando el rendimiento de lípidos no polares está en su máximo. En una forma de realización, las partes vegetativas de las plantas se cosechan alrededor del tiempo de florecimiento.
Una planta transgénica formada usando métodos de transformación con Agrobacterium u otros métodos contiene típicamente un solo locus genético sobre un cromosoma. Dichas plantas transgénicas pueden considerarse como hemicigotas para el o los genes agregados. Más preferida es una planta transgénica que es homocigota para el o los genes agregados; es decir, una planta transgénica que contiene dos genes agregados, un gen en el mismo locus de cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener una planta transgénica homocigota por auto-fertilización de una planta transgénica hemicigota, germinación de algunas de las semillas producidas y análisis de las plantas resultantes para el gen de interés.
Se comprenderá asimismo que también se pueden cruzar (aparear) dos diferentes plantas transgénicas que contienen dos genes o loci exógenos que segregan de forma independiente para producir una descendencia que contiene a ambos juegos de genes o loci. La autocruza de la progenie Fl apropiada puede producir plantas que son homocigotas para ambos loci o genes exógenos agregados. También se contempla la retrocruza con una planta progenitora y la exocruza con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Se pueden consultar descripciones de otros métodos de cruzamiento usados comúnmente para distintos caracteres y cultivos en Fehr, en Breeding Métodos for Cultivar Development, ilcos J. ed., American Society of Agronomy, Madison, Wis .
TILLING En una forma de realización, se puede usar TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas) para producir plantas en las cuales se han noqueado genes endógenos, por ejemplo genes que codifican una DGAT, sn-1 glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT), l-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa . (LPAAT), acil- CoA: lisofos fatidilcolina aciltransferasa (LPCAT), ácido fosfatidico fosfatasa (PAP) o una combinación de dos o más de los mismos .
En un primer paso, se inducen las mutaciones introducidas, tales como cambios de pares de bases individuales novedosos, en una población de plantas mediante tratamiento de semillas (o polen) con un mutágeno químico y luego avanzar las plantas hasta una generación donde las mutaciones serán heredadas de manera estable. Se extrae el ADN y las semillas se guardan separadas de todos los miembros de la población para crear una fuente al cual se puede acceder repetidamente en el tiempo.
Para un ensayo de TILLING, se diseñan cebadores para PCR para amplificar específicamente un solo gen blanco de interés. La especificidad es especialmente importante si el blanco es un miembro de una familia de genes o forma parte de un genoma poliploide. A continuación, los cebadores marcados con colorante se pueden usar para amplificar los productos de la PCR del ADN agrupado de múltiples individuos. Estos productos de la PCR se desnaturalizan y alinean nuevamente para permitir la formación de pares de bases no coincidentes. Las faltas de coincidencia, o heterodúplex, representan tanto polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) naturales (es decir, es probable que varias plantas de la población sean portadores del mismo polimorfismo) y SNP inducidos (es decir, solamente unas pocas plantas individuales tienen probabilidad de expresar la mutación) . Una vez formada la heterodúplex, el uso de una endonucleasa , tal como CelJ, que reconoce y corta el ADN no coincidente, es la clave del descubrimiento de nuevos SNP dentro de una población TILLING.
Cuando se usa este enfoque, se pueden examinar miles de plantas para identificar cualquiera que tuviera un único cambio de base, asi como inserciones o supresiones pequeñas (1-30 pb) en cualquier gen o región especifica del genoma . Los fragmentos genómicos evaluados pueden variar en tamaño en un rango entre 0,3 y 1,6 kb. Con 8 agrupaciones, fragmentos de 1,4 kb (descontando los extremos de los fragmentos donde la detección de SNP es problemática debido al ruido) y 96 calles por ensayo, esta combinación permitió examinar hasta un millón de pares de bases de ADN genómico por cada ensayo, lo que vuelve al TILLING una técnica de gran rendimiento.
El TILLING se describe además en Slade y Knauf (2005) y en Henikoff et al., (2004).
Además de permitir una detección eficiente de las mutaciones, la tecnología TILLING de gran rendimiento es ideal para la detección de polimorfismos naturales. Por ello, la búsqueda de un ADN homólogo desconocidos por formación de heterodúplex con una secuencia conocida revela la cantidad y posición de sitios polimórficos . Se identifican tanto cambios de nucleótidos como inserciones y supresiones pequeñas, incluyendo al menos algunos polimorfismos de número repetido. Esto se ha denominado Ecotilling (Comai et al., 2004) .
Cada SNP se registra según su posición aproximada dentro de unos pocos nucleótidos. Por lo tanto, cada haplotipo se puede obtener en base de su movilidad. Los datos de secuencia se pueden obtener con un esfuerzo de incremento relativamente pequeño usando alícuotas del mismo ADN amplificado que se usa para el ensayo de falta de coincidencia-clivaj e . El cebador de secuenciación izquierdo o derecho para una sola reacción se elige por su proximidad con el polimorfismo. El programa de computación Sequencher efectúa una alineación múltiple y descubre el cambio de bases, que en cada caso confirmó la banda de gel.
El ecotilling es más económico que la secuenciación completa, el método utilizado actualmente en el descubrimiento de la mayoría de los SNP. Se pueden examinar placas que contienen al ADN ecotípico agrupado en lugar de agrupaciones de ADN de las plantas mutadas. Dado que la detección se efectúa sobre geles con una resolución cercana al par de bases y que los patrones básales son uniformes en todas las calles, se pueden hacer coincidir las bandas que son de tamaño idéntico, por consiguiente el descubrimiento y la determinación del genotipo de los SNP se efectúa en un solo paso. De esta manera, la secuenciación final del SNP es simple y eficiente, aún más por el hecho que las alícuotas de los mismos productos de PCR usados para la selección pueden someterse a secuenciación de ADN.
Aumento de los niveles de ARN exógeno y expresión estabilizada El silenciamiento de genes de post-transcripción ( PTGS ) es un mecanismo de defensa específico de la secuencia de nucleotidos que puede ser dirigido a ARNm celulares y virales para la degradación. El PTGS tiene lugar en plantas u hongos transformados de manera estable o transitoria con uno o más polinucleótidos recombinantes y da como resultado la acumulación reducida de moléculas de ARN con similitud de secuencia con el polinucleótido introducido. "Post-transcripcional" hace referencia a un mecanismo que opera al menos parcialmente, pero no necesariamente en forma exclusiva, luego de la producción de un transcripto de ARN inicial, por ejemplo durante el procesamiento del transcripto de ARN inicial, o concomitante con corte y empalme o exportación del ARN del citoplasma, o en el citoplasma por complejos asociados con proteínas Argonauta.
Los niveles de moléculas de ARN se pueden incrementar y/o los niveles de moléculas de ARN se pueden estabilizar sobre numerosas generaciones o bajo condiciones ambientales diferentes, limitando la expresión de un supresor por silenciamiento en un órgano de almacenamiento de una planta o una parte del mismo. Según se usa en la presente, un "supresor por silenciamiento" es cualquier polinucleótido o polipéptido que se puede expresar en una célula vegetal que aumente el nivel de los productos de expresión de un transgen diferente en la célula vegetal, en particular sobre repetidas generaciones a partir de la planta inicialmente transformada. En una forma de realización, el supresor por silenciamiento es un supresor por silenciamiento viral o un mutante del mismo. Se conocen numerosos supresores por silenciamiento virales en el arte que incluyen, pero en un sentido no limitativo, P19, V2, P38, Pe-Po y RPV-PO. Los ejemplos de supresores de silenciamiento virales adecuados incluyen los que se describen en WO 2010/057246. Se puede expresar un supresor por silenciamiento de manera estable en una planta, o en una parte del mismo, de la presente invención.
Según se usa en la presente, el término "expresado de forma estable" o variaciones del mismo se refiere al nivel de moléculas de ARN siendo esencialmente igual o mayor en las plantas de progenie sobre generaciones repetidas, por ejemplo, al menos tres, al menos cinco o al menos diez generaciones, en comparación con las plantas correspondiente que no contienen al polinucleótido exógeno que codifica al supresor por silenciamiento . Sin embargo, estos términos no excluyen la posibilidad que sobre repetidas generaciones haya una cierta pérdida de los niveles de la molécula de ARN en comparación con una generación anterior, por ejemplo no menos que un 10% de pérdida por generación.
El supresor se puede seleccionar de cualquier fuente como por ejemplo vegetal, viral, de mamífero, etc. El supresor puede ser, por ejemplo: virus B2 de los gallineros; virus P14 latente de Pothos; virus AC2 latente de Pothos; virus en mosaico AC4 de mandioca africana; enfermedad por el virus en mosaico de amarillamiento de venas C2 de Bhendi; enfermedad por el virus en mosaico de amarillamiento de venas C4 de Bhendi; enfermedad por el virus en mosaico de amarillamiento de venas peí de Bhendi; virus de clorosis p22 de tomate; virus de clorosis CP de tomate; virus de clorosis CPm de tomate; virus en mosaico clorado AL2 de tomate; virus de hoja enrollada Java Cl de tomate; virus de amarillamiento de hojas enrolladas V2 de tomate; virus de amarillamiento de ho as enrolladas China-C2 de tomate; forma aislada ß?? del virus Y10-China de amarillamiento de hojas enrolladas de tomate; forma aislada V2 israeli de amarillamiento de hojas enrolladas de tomate; virus en mosaico amarillo Vigna AC2 de habichuela; virus clorótico de manchas en anillo CP de hibisco; virus rugoso P38 de nabo; virus rugoso CP de nabo; virus en mosaico de la coliflor P6; virus de amarillamiento p21 de remolacha; virus tristeza p20 de cítricos; virus tristeza p23 de cítricos; virus tristeza CP de cítricos; virus en mosaico SCP de caupí; virus enano clorótico p22 de batata; virus en mosaico 2b de pepino; virus HC-Pro de aspermia de tomate; virus L2 de punta enrollada de remolacha; virus en mosaico 19K del suelo de trigo; virus en mosaico estriado Gammab de cebada; virus Gammab semilatente de Poa; pecluvirus P15 de aglomeraciones de maní; virus PnslO enano de arroz; virus PO de amarillamiento transmitido por áfidos de curcubitáceas ; virus PO de amarillamiento del oeste de la remolacha; virus X P25 de papa; virus Plb del amarillamiento de venas de pepino; virus HC-Pro pox de ciruela; virus en mosaico HC-Pro de caña de azúcar virus Y cepa HC-Pro de papa; virus del grabado de la ho a Pl/HC-Pro de tabaco; virus en mosaico Pl/HC-Pro de nabo; virus Pl moteado de pasto ovillo; forma aislada del virus noruego Pl moteado de pasto ovillo; virus Pl moteado amarillo de arroz; forma aislada del virus nigeriano Pl moteado amarillo de arroz; virus NS3 de hoja blanca de arroz; virus NS3 estriado de arroz; virus en mosaico del tabaco 126K infectante de cruciferas; virus en mosaico del tabaco pl22 infectante de cruciferas ; virus en mosaico del tabaco pl22; virus en mosaico del tabaco 126 virus en mosaico del tabaco 130 ; virus del cascabel 16 de tabaco; virus enano arbustivo P19 de tomate; virus bandeado reticular NSs de tomate; virus de manchas cloróticas de hojas P50 de manzana; virus A plO de uva; virus 2 homólogo de BYV p21 asociado a enrollamiento de ho as de uva, asi como variantes/mutantes de los mismos. El listado anterior proporciona el virus del cual se puede obtener el supresor y la denominación de la proteina (por ejemplo, B2, P14 etc.) o región codificante del supresor de cada virus particular. Otros candidatos supresores por silenciamiento se pueden obtener por estudio de las secuencias del genoma viral para polipéptidos codificados en la misma posición en el genoma viral, en relación a la estructura de un genoma viral relacionado que comprende un supresor por silenciamiento conocido, como puede ser apreciado por una persona con experiencia en el arte.
Los supresores por silenciamiento se pueden categorizar en base a su modo de acción. Los supresores tal como el V2 que se une preferencialmente a una molécula de ARN de cadena doble que tiene una sobreextensión en los extremos 5' en relación a la correspondiente molécula de ARN de cadena doble que tiene extremos romos son particularmente útiles para potenciar la expresión del transgen cuando se usa en combinación con el silenciamiento de genes (pol inucleótido exógeno que codifica para un ARNcd) . Otros supresores tal como pl9 que se une preferencialmente a una molécula de ARNcd que tiene 21 pares de bases de longitud en relación a una molécula de ARNcd de una longitud diferente también puede permitir la expresión del transgen en presencia de un polinucleótido exógeno que codifica para un ARNcd, pero generalmente en un menor grado que, por ejemplo, V2. Esto permite la selección de una combinación óptima de ARNcd, supresor por silenciamiento y transgen sobreexpresado para un propósito particular. Dichas combinaciones óptimas se pueden identificar usando un método de la invención.
En una forma de realización, el supresor por silenciamiento se une preferencialmente a una molécula de ARN de cadena doble que tiene sobreextensión de los extremos 5' en relación a la correspondiente molécula de ARN de cadena doble que tiene extremos romos. En este contexto, la molécula de ARN de cadena doble correspondiente preferentemente tiene la misma secuencia de nucleótidos que la molécula con las sobreextensiones en los extremos 5', pero sin las sobreextensiones en los extremos 5'. Rutinariamente se realizan ensayos de unión, por ejemplo en ensayos ín vítro, por cualquier método tal como es sabido por una persona con experiencia en el arte.
Se pueden usar múltiples copias de un supresor. Se pueden usar diferentes supresores juntos (por ejemplo, en tándem) .
Se puede co-expresar esencialmente cualquier molécula de ARN que se deseara expresar en un órgano de almacenamiento de una planta con el supresor por silenciamiento . La molécula de ARN puede afectar una característica agronómica, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, esterilidad, características de los granos y semejantes. Los polipéptidos codificados pueden estar relacionados con el metabolismo de lípidos, almidón, carbohidratos, nutrientes, etc., o pueden ser responsables de la síntesis de proteínas, péptidos, lípidos, ceras, almidones, azúcares, carbohidratos, sabores, olores, toxinas, carotenoides , hormonas, polímeros, flavonoides, proteínas de almacenamiento, ácidos fenólicos, alcaloides, ligninas, taninos, celulosas, glicoproteínas , glucolípidos , etc.
En un ejemplo particular, las plantas produjeron niveles incrementados de enzimas para la producción de lipidos en plantas tales como Brassícas, por ejemplo colza oleaginosa o girasol, alazor, lino, algodón, soja o maíz.
Biomasa vegetal Un aumento en el contenido de lipidos totales de la biomasa vegetal es equivalente a un mayor contenido de energía, haciendo su uso en la producción de biocombustible más económico.
La biomasa vegetal son los materiales orgánicos producidos por plantas, tal como hojas, raíces, semillas, y tallos. La biomasa vegetal es una mezcla compleja de materiales orgánicos, tal como hidratos de carbono, grasas, y proteínas, junto con pequeñas cantidades de minerales, tal como sodio, fósforo, calcio, e hierro. Los componentes principales de la biomasa vegetal son los hidratos de carbono (aproximadamente 75%, peso seco) y lignina (aproximadamente 25%), que puede variar con el tipo de planta. Los hidratos de carbono son principalmente fibras de celulosa o hemicelulosa, que imparten fuerza a la estructura de la planta, y lignina, que sostiene las fibras entre sí. Algunas plantas también almacenan almidón (otro polímero de hidrato de carbono) y grasas como fuentes de energía, principalmente en semillas y raíces (tal como maíz, soja, y papa).
La biomasa vegetal típicamente tiene una densidad de energía baja como resultado de su forma física y contenido de humedad. Esto la hace inconveniente e ineficaz para almacenamiento y transporte, y también usualmente inadecuada para uso sin algún tipo de preprocesamiento.
Hay un rango de procesos disponibles para convertirla en una forma más conveniente que incluye: 1) preprocesamiento físico (por ejemplo, molido) o 2) conversión por procesos térmicos (por ejemplo, combustión, gasificación, pirólisis) o químicos (por ejemplo, digestión anaeróbica, fermentación, elaboración de compost, transesterificacion) . En este sentido, la biomasa se convierte a lo que se puede describir como un combustible de biomasa.
Combustión La combustión es el proceso por el cual los materiales inflamables se dejan arder en presencia de aire u oxígeno con la liberación de calor. El proceso básico es la oxidación. La combustión es el método más sencillo por el cual se puede usar la biomasa para energía, y ha sido usada para proveer calor. Este calor puede ser usado en un número de formas: 1) calentamiento de espacio, 2) calentamiento de agua (u otro fluido) para calefacción central o calefacción de distrito o calor de proceso, 3) vapor que sube para generación de electricidad o fuerza motriz. Cuando el material combustible inflamable es una forma de biomasa la oxidación es predominantemente del carbono (C) e hidrógeno (H) en la celulosa, hemicelulosa, lignina, y otras moléculas presentes para formar dióxido de carbono (C02) y agua (H20) .
Gasificación La gasificación es un proceso de oxidación parcial mediante el cual una fuente de carbono tal como la biomasa vegetal, se separa en monóxido de carbono (CO) e hidrógeno (H2), más dióxido de carbono ( C02 ) y posiblemente molécula de hidrocarburo tal como metano (CH4). Si la gasificación tiene lugar a una temperatura relativamente baja, tal como entre 700°C y 1000°C, el gas producto tendrá un nivel relativamente alto de hidrocarburos en comparación a la gasificación a alta temperatura. Como resultado se puede usar, directamente, ser quemado para la generación de calor o electricidad por medio de una turbina de vapor o, con un limpiado del gas adecuado, para hacer funcionar un motor de combustión interna para la generación de electricidad. La cámara de combustión para un hervidor simple puede estar acoplado cercano al gasificador, o el gas producido se puede limpiar de hidrocarburos de cadena más larga (alquitrán), transportar, almacenar y quemar remotamente. Un sistema de gasificación puede estar cercanamente integrado con una turbina de gas en ciclo combinado para la generación de electricidad ( IGCC - ciclo combinado de gasificación integrada) . La gasificación a temperaturas mayores (entre 1200°C y 1500°C) lleva a pocos hidrocarburos en el gas producto, y una mayor proporción de CO y H2. Esto es conocido como gas de síntesis (syngas o biosyngas) que puede ser usado para sintetizar hidrocarburos de cadena más larga usando técnicas tal como la síntesis de Fischer-Tropsch ( F ) . Si la relación de H2 a CO es correcta (2:1) la síntesis de FT se puede usar para convertir syngas a biocombustible diesel sintético de alta calidad que es compatible con los diésel fósiles convencionales y los motores a diésel.
Pirólisi s Como se usa en la presente, el término "pirólisis" hace referencia a un proceso que usa calentamiento lento en ausencia de oxígeno para producir productos gaseosos, aceite y carbón a partir de biomasa. La pirólisis es una conversión térmica o termoquímica de materiales basados en lípidos, particularmente basados en triglicéridos . Los productos de la pirólisis incluyen gas, líquido y un alquitrán sólido y carbón sólido, con las proporciones de cada uno dependiendo de los parámetros del proceso. Temperaturas inferiores (alrededor de 400°C) tienden a producir un carbón más sólido (pirólisis lenta), mientras que de cierto modo temperaturas mayores (alrededor de 500°C) producen una proporción mucho mayor de líquido (bioaceite), dado que el tiempo de residencia del vapor se limita a alrededor de ls o menos. Luego de esto, las reacciones secundarias tienen lugar y aumenta el rendimiento del gas. El bioaceite producido por pirólisis rápida (temperatura mayor) es un líquido marrón oscuro, móvil con un valor de calentamiento de aproximadamente la mitad del aceite combustible convencional. Se puede hacer arder directamente, co-encender, mejorado a otros combustibles o gasificado.
La pirólisis involucra el craqueo térmico directo de los lípidos o una combinación de craqueo térmico y catalítico. A temperaturas de aproximadamente entre 400 y 500oC, se produce el craqueo, produciendo hidrocarburos de cadena corta tal como alcanos, alquenos, alcadienos, aromáticos, olefinas y ácido carboxílico, así como monóxido de carbono y dióxido de carbono.
Se pueden usar cuatro tipos de catalizador principales que incluyen catalizadores de metales de transición, catalizadores tipo tamiz molecular, alúmina activada y carbonato de sodio (Maher et al., 2007). Los e emplos se dan en US 4102938. La alúmina (A1203) activada por ácido es un catalizador eficaz (US 5233109). Los catalizadores de tamiz molecular son estructuras porosas, altamente cristalinas que exhiben selectividad de tamaño, de modo que sólo las moléculas de ciertos tamaños pueden pasar. Estos incluyen catalizadores de zeolita tal como ZSM-5 o HZSM-5 que son materiales cristalinos que comprenden A104 y Si04 y otros catalizadores de sílice-alúmina. La actividad y selectividad de estos catalizadores depende de la acidez, tamaño de poro y forma del poro, y típicamente operan entre 300 y 500oC. Los catalizadores de metales de transición se describen por ejemplo en US 4992605. El catalizador de carbonato de sodio ha sido usado en la pirólisis de aceites (Dandik y Aksoy, 1998) .
Transes teríficacíón La "transesterificacion" como se usa en la presente es la conversión de lípidos, principalmente triacilgliceroles , en ésteres de ácido graso metilo o etil ésteres usando alcoholes de cadena corta tal como metanol o etanol, en presencia de un catalizador tal como álcali o ácido. Se usa el metanol más comúnmente debido a su bajo costo y disponibilidad. Los catalizadores pueden ser catalizadores homogéneos, catalizadores heterogéneos o catalizadores enzimáticos. Los catalizadores homogéneos incluyen sulfato férrico seguido por OH. Los catalizadores heterogéneos incluyen CaO, 3P04, y W03/Zr02. Los catalizadores enzimáticos incluyen Novozyme 435 producido de Candida antárctica .
Digestión anaeróbica La digestión anaeróbica es el proceso por el cual las bacterias degradan el material orgánico en ausencia de aire, produciendo un biogas que contienen metano. Los productos de este proceso son biogas (principalmente metano (CH4) y dióxido de carbono (C02)), un residuo sólido (fibra o digestato) que es similar, pero no idéntico, al compost y un licor liquido que puede ser usado como un fertilizante. El metano se puede quemar para calefacción o generación de electricidad. El residuo sólido del proceso de digestión anaeróbica se puede usar como acondicionador de suelos o como alternativa se puede quemar como un combustible, o ser gasificado .
La digestión anaeróbica típicamente se realiza en un material biológico en una lechada acuosa. Sin embargo hay un número en aumento de digestores secos. La digestión mesofílica tiene lugar entre 20°C y 40°C y puede tomar uno .o dos meses para completarse. La digestión termofílica tiene lugar entre 50 y 65°C y es más rápida, pero las bacterias son más sensibles.
Fermentación Los procesos de fermentación convencionales para la producción de bioalcohol hacen uso de almidón y componentes azúcares de cultivos vegetales. El bioalcohol de segunda generación precede a éste con hidrólisis ácida y/o enzimática de hemicelulosa y celulosa a sacáridos fermentables para hacer uso de una proporción mucho mayor de biomasa disponible. Se provee más detalle a continuación ba o el encabezado de "Procesos de fermentación para, la producción de lípidos" .
Elaboración de Compost La elaboración de compost es la descomposición aeróbica de materia orgánica por microorganismos. Típicamente se realiza sobre material relativamente seco en lugar de una lechada. En lugar de, o además de, recolectar el biogas inflamable emitido, la naturaleza exotérmica del proceso de elaboración de compost puede ser aprovechada y el calor producido ser usado, usualmente usando una bomba de calor.
Producción de lípidos no polares Se pueden emplear las técnicas que son de práctica rutinaria en el arte para extraer, procesar, purificar y analizar los lípidos no polares producidos por células, organismos o partes de los mismos, de la presente invención. Dichas técnicas se describen y explican en la literatura, en fuentes tales como Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Anaiytícal Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. (2001) Dl.l.l-Dl.1.11, y Perez-Vich et al. (1998).
Producción de aceite de semillas Típicamente, las semillas de las plantas se cocinan, se prensan y/o se extraen para producir un aceite de semillas crudo, que luego es desgomado, refinado, blanqueado y desodorizado . En general, las técnicas para triturar semillas son conocidas en el arte. Por ejemplo, semillas oleaginosas se pueden temperar rociándolas con agua para elevar el contenido de humedad, por ejemplo, a un 8,5%, y cortar en copos usando un rodillo compactador liso con un ajuste de hueco definido en 0,23 a 0,27 mm. Según el tipo de semilla, se puede agregar agua, o no, antes de la trituración. La aplicación de calor desactiva las enzimas, facilita la ruptura celular posterior, coalesce las gotas de lípidos y aglomera las partículas de proteínas, todo lo cual facilita el proceso de extracción.
En una forma de realización, la mayoría de los aceites de semillas se libera por medio de pasaje a través de una prensa de tornillo. Las tortas expulsadas de la prensa de tornillo son sometidas a extracción con solvente, por ejemplo, con hexano, usando una columna de temperatura controlada. Como alternativa, el aceite de semillas crudo producido por la operación de prensado se puede hacer pasar a través de un tanque de asentamiento con una vía de drenaje acanalada superior para remover los sólidos que se generan con el aceite de semillas durante la operación de prensado.
El aceite de semillas clarificado se puede hacer pasar a través de un filtro tipo placa y marco para remover cualquier partícula sólida fina. Si se deseara, el aceite de semillas recuperado del proceso de extracción se puede combinar con el aceite de semillas clarificado para producir un aceite de semillas crudo mezclado.
Una vez que se deprivó el solvente del aceite de semillas crudo, se combinan las porciones prensadas y extraídas y luego son sometidas a los procedimientos normales de procesamiento de lípidos (es decir, desgomado, refinación cáustica, blanqueado y desodori zación ) .
En una forma de realización, el contenido de aceites y/o proteínas de la semilla se analiza por espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano como se describe en Hom et al . (2007 ) .
Desgomado El desgomado es un paso temprano en el refinamiento de aceites y su propósito principal es la eliminación de la mayor parte de los fosfolípidos del aceite, que pueden estar presentes en aproximadamente entre 1 y 2% de los lípidos extraídos totales. El agregado de aproximadamente 2% de agua, típicamente que contiene ácido fosfórico, a entre 70 y 80°C al aceite en crudo da como resultado la separación de la mayor parte de los fosfolípidos acompañados por metales y pigmentos traza. El material insoluble que se elimina es principalmente una mezcla de fosfolipidos y triacilgliceroles y es conocido como lecitina. El desgomado se puede realizar por adición de ácido fosfórico concentrado al aceite de semillas crudo para convertir los fosfátidos no hidratables en una forma hidratable y para quelar los metales menores que están presentes en el aceite. La goma se separa del aceite de semillas por centrifugación. El aceite de semillas se puede refinar por adición de una cantidad suficiente de una solución de hidróxido de sodio para titular todos los ácidos grasos y remover los jabones asi formados.
Refinamiento con álcali El refinamiento con álcali es uno de los procesos de refinamiento para tratar aceite crudo, algunas veces referido como neutralización. Usualmente continúa luego del desgomado y precede al blanqueamiento. Luego del desgomado, el aceite de semillas puede ser tratado por adición de una cantidad suficiente de una solución alcalina para titular todos los ácidos grasos y ácidos fosfóricos, y eliminar los jabones asi formados. Los materiales alcalinos adecuados incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de sodio, hidróxido de litio, hidróxido de calcio, carbonato de calcio e hidróxido de amonio. Este proceso típicamente es realizado a temperatura ambiente y elimina la fracción de ácidos grasos libres. El abón se elimina por centrifugación o por extracción en un solvente para el jabón, y el aceite neutralizado se lava con agua. Si se requiere, cualquier exceso de álcali en el aceite se puede neutralizar con un ácido adecuado tal como ácido clorhídrico o ácido sulfúrico.
Blanqueamíen to El blanqueamiento es un proceso de refinamiento en el cual los aceites se calientan a entre 90 y 120°C durante entre 10 y 30 minutos en presencia de una tierra de blanqueamiento (entre 0,2 y 2,0%) y en ausencia de oxígeno por operación con nitrógeno o vapor o en vacío. Este paso en el procesamiento de aceites es diseñado para eliminar pigmentos no deseados ( carotenoides , clorofila, gosipol, etc.), y el proceso además elimina los productos de oxidación, metales traza, compuestos con azufre y trazas de j abones .
Desodori zación La desodorización es un tratamiento de aceites y grasas a una temperatura alta (entre 200 y 260°C) y presión baja (entre 0,1 y 1 mm Hg). Esto típicamente se logra por introducción de vapor dentro del aceite de semillas a una velocidad de aproximadamente 0,1 ml/minuto/100 mi de aceite de semillas. La desodorización se puede realizar calentando el aceite de semillas a 260°C bajo vacío e introduciendo lentamente vapor en el aceite de semillas a una velocidad de 0,1 ml/minuto/100 mi de aceite de semillas aproximadamente. Después de aproximadamente 30 minutos de burbujeo, se deja que el aceite de semillas se enfrie bajo vacio. El aceite de semillas es transferido típicamente a un recipiente de vidrio y se lava con argón antes de almacenarlo bajo refrigeración. Si la cantidad de aceite de semillas es limitada, el aceite de semillas se puede colocar bajo vacío, por ejemplo, en un reactor Parr y calentar a 260°C por el mismo tiempo que hubiera sido desodorizado . Este tratamiento . mej ora el color del aceite de semillas y remueve la mayoría de las sustancias volátiles o compuestos olorosos que incluyen cualquier ácido graso libre remanente, monoacilgliceroles y productos de oxidación .
Winteri zación La winterización un proceso usado algunas veces en la producción comercial de aceites para la separación de aceites y grasas en fracciones sólida (estearina) y líquida (oleína) por cristalización a temperaturas más bajas que la ambiente. Se aplicó originalmente a aceite de semillas de algodón para producir un producto libre de sólidos. Típicamente se usa para disminuir el contenido de ácidos grasos saturados de los aceites .
Biomasa vegetal para la producción de llpidos Las partes de plantas relacionadas con la fotosíntesis (por ejemplo, tallos y hojas de plantas superiores y plantas acuáticas tales como algas) también se pueden usar para producir lípidos. Independientemente del tipo de planta, existen diversos métodos para extraer lípidos de la biomasa verde. Otra manera es la extracción física, que a menudo no emplea extracción con solventes. Es una manera "tradicional" que emplea diversos tipos diferentes de extracción mecánica. La extracción por prensa Expéller es un tipo común, como lo es la prensa de tornillo y los métodos de extracción con una prensa Ram. La cantidad de lípido extraído usando estos métodos varía ampliamente, dependiendo del material vegetal y del proceso mecánico empleado. Típicamente la extracción mecánica es menos eficiente que la extracción con solvente que se describe a continuación.
En la extracción con solvente, se mezcla un solvente orgánico (por ejemplo, hexano) con al menos la biomasa vegetal verde modificada genéticamente, preferentemente después de secar y moler dicha biomasa verde. Por supuesto, también se pueden moler y mezclar otras partes de la planta además de la biomasa verde (por ejemplo, semillas que contienen lípidos). El solvente disuelve el lípido en la biomasa y semejantes, luego se separa dicha solución de la biomasa por acción mecánica (por ejemplo, con los procesos de prensado anteriores). Este paso de separación también se puede efectuar por filtración (por ejemplo, con un filtro prensa o un dispositivo similar) o por centrifugación etc. El solvente orgánico se puede separar luego del lipido no polar (por ejemplo, por destilación). Este segundo paso de separación permite obtener lipidos no polares de la planta y puede dar como resultado un solvente reusable si se emplea una recuperación por vapor convencional.
Si, por ejemplo, el tejido vegetativo como se describió en la presente, no se va a usar inmediatamente para extraer, y/o procesar, los lipidos preferentemente se manipula luego de la recolección para asegurar que el contenido de lipidos no disminuye, o tal que cualquier disminución en el contenido de lipidos sea minimizado tanto como sea posible (véase, por ejemplo, Christie, 1993). En una forma de realización, el tejido vegetativo se congela tan pronto como sea posible luego de la recolección usando, por ejemplo, hielo seco o nitrógeno liquido. En otra forma de realización, el tejido vegetativo se almacena a una temperatura fría, por ejemplo -20°C o -60°C en una atmósfera de nitrógeno.
Algas para la producción de lipidos Las algas pueden producir entre 10 y 100 veces la masa que producen las plantas terrestres en un año. Además de ser un organismo prolifico, las algas también tienen la capacidad de producir aceites y almidones que se pueden convertir en biocombustibles .
Las algas especificas más útiles para la producción de biocombustible son conocidas como microalgas, que consisten en tipos pequeños, con frecuencia unicelulares. Estas algas pueden crecer casi en cualquier parte. Con más de 100.000 especies conocidas de diatomeas (un tipo de alga), 40.000 especies conocidas de algas similares a plantas verdes, y números más pequeños de otras especies de algas, las algas crecerán rápido en casi cualquier ambiente, con casi cualquier tipo de agua. Específicamente, las algas útiles pueden crecer en áreas marginales con calidad de agua limitada o pobre, tal como en las regiones áridas y mayormente vacías del Sudoeste Americano. Estas áreas tienen abundante luz solar para la fotosíntesis. Brevemente, las algas pueden ser un organismo ideal para la producción de biocombustibles - crecimiento eficaz, no necesitan de tierra o agua de excelente calidad, no compiten con los cultivos de alimentos, necesitan cantidades mucho menores de tierra que los cultivos de alimentos, y almacenan energía en una forma deseada .
Las algas pueden almacenar energía en su estructura celular en la forma de aceite o almidón. El aceite almacenado puede ser tanto como el 60% del peso del alga. Se han identificado ciertas especies que son altamente prolificas en la producción de aceite o almidón, y se han ensayado las condiciones de cultivo. Los procesos para extraer y convertir estos materiales a combustibles también se han desarrollado.
Las algas productoras de aceites más comunes pueden generalmente incluir, o consistir esencialmente en, las diatomeas (bacilariofitas), algas verdes ( clorófitas ) , algas azul-verdosas ( cianófitas ) , y algas doradas marrones ( crisófitas ) . Adicionalmente se puede usar un quinto grupo conocido como haptófitas. Los grupos incluyen algas marrones y heterocontes . Los ejemplos no limitantes específicos de algas incluyen las Clases: Chlorophyceae, Eustigmatophyceae, Prymnesiophyceae, Bacillariophyceae . Las bacilariofitas con capacidad de producir aceite incluyen los géneros Amphipleura, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Cymbella, Fragilaria, Hantzschia, Navícula, Nitzschia, Phaeodactylum, y Thalassiosira . Los ejemplos no limitantes específicos de clorófitas con capacidad de producir aceite incluyen Ankistrodesmus , Botryococcus , Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Monoraphidium, Oocystis, Scenedesmus, y Tetraselmis. En un aspecto, las clorófitas pueden ser Chlorella o Dunaliella. Los e emplos no limitantes específicos de cianófitas con capacidad de producir aceite incluyen Oscillatoria y Synechococcus . Un ejemplo específico de crisófitas con capacidad de producir aceite incluye Boekelovia. Los ejemplos no limitantes específicos de haptófitas incluyen Isochysis y Pleurochysis.
Las algas específicas útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, Chlamydomonas sp. tal como Chlamydomonas reinhardtii , Dunaliella sp. tal como Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, D. acídophila, D. bardawil, D. bioculata , D. lateralis, D. marítima, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. polímorpha, D. primolecta, D. pseudosalina, D. quartolecta. D. viridis, Haematococcus sp. , Chlorella sp. tal como Chlorella vulgari s, Chlorella sorokiniana o Chlorella protothecoides, Thraustochytrium sp. , Schizochytrium sp. , Volvox sp, Nannochloropsis sp., Botryococcus braunii que puede contener más del 60 % en peso de lipidos, Phaeodactylum trícornutum, Thalassiosíra pseudonana, Isochrysis sp., Pavlova sp., Chlorococcum sp, Ellipsoidion sp., Neochloris sp., Scenedesmus sp.
Además, las algas productoras de aceite de la presente invención pueden incluir una combinación de una cantidad eficaz de dos o más cepas con el ob etivo de maximizar los beneficios de cada cepa. En un aspecto práctico, puede ser difícil alcanzar el 100% de pureza de una cepa única de algas o una combinación de cepas de algas deseadas. Sin embargo, cuando se expone en la presente, las algas productoras de aceite tienen como intención cubrir intencionalmente las cepas introducidas de algas, mientras que las cepas foráneas son preferentemente minimizadas y mantenidas por debajo de una cantidad que podría afectar per udicialmente los rendimientos de las algas productoras de aceite deseadas y aceite de algas. Las cepas de algas no deseables se pueden controlar y/o eliminar usando cualquier número de técnicas. Por ejemplo, el control cuidadoso del ambiente de crecimiento puede reducir la introducción · de cepas foráneas. Como alternativa, o adicionalmente a otras técnicas, un virus elegido selectivamente dirigido específicamente sólo a las cepas foráneas se puede introducir en los reservorios de crecimiento en una cantidad que es eficaz para reducir y/o eliminar la cepa foránea. Un virus apropiado puede ser fácilmente identificado usando técnicas convencionales. Por ejemplo, una muestra de algas foráneas con frecuencia incluirá pequeñas cantidades de un virus que está dirigido contra las algas foráneas. Este virus puede ser aislado y e puede hacer crecer con el objetivo de producir cantidades que podrían controlar o eliminar eficazmente la población de algas foráneas entre las algas productoras de aceite más deseables .
El cultivo de algas es una forma de acuicultura que comprende la cría de especies de algas (incluyendo microalgas, también denominado fitopláncton, micrófitas o algas planctónicas, y macroalgas, comúnmente conocidas como sargazo ) .
El cultivo comercial e industrial . de algas tiene numerosos usos, incluyendo producción de ingredientes alimenticios, alimento y combustible de algas.
Los cultivos de un alga o de algas mixtos se pueden cultivar en estanques abiertos (tales como estanques tipo raceway y lagos) o fotobiorreactores .
Las algas se pueden cosechar usando Microscreens, por centrifugación, por floculacion (usando por ejemplo, quitosán, alúmina y cloruro férrico) y por flotación con espuma. La interrupción del suministro de dióxido de carbono puede causar la floculacion de las algas por si solos, que se denomina "autofloculación". En la flotación con espuma, el cultivador airea el agua formando una espuma, y luego se limpian las algas desde la superficie. El ultrasonido y otros métodos de cosecha se encuentran actualmente bajo desarrollo.
Los lipidos se pueden separar de las algas por trituración mecánica. Cuando las algas se secan retienen su contenido de lipidos, que luego se puede extraer por "prensado" con una prensa para aceite. Dado que las diferentes cepas de algas varían ampliamente en cuanto a sus atributos físicos, hay distintas configuraciones de prensas (tornillo, Expeller, pistón, etc.) que funcionan mejor para tipos de algas específicos.
A menudo se emplea shock osmótico para liberar componentes celulares tales como lipidos de algas. El shock osmótico es una reducción repentina de la presión osmótica y puede causar la ruptura de las células en solución.
La extracción ultrasónica puede acelerar los procesos de extracción, en particular los procesos de extracción enzimática empleados para extraer lipidos de algas. Se usan ondas ultrasónicas para crear burbujas de cavitación en un material solvente. Cuando estas burbujas colapsan cerca de las paredes celulares, las ondas de shock resultantes y los chorros líquidos causan la ruptura de las paredes celulares y la liberación de su contenido en un solvente.
A menudo se usan solventes químicos (por ejemplo, hexano, benceno, éter de petróleo) en la extracción de los lipidos de las algas. Se puede usar extracción Soxhlet para extraer lipidos de algas por lavado repetido, o percolación, con un solvente orgánico bajo reflujo en un material de vidrio especial.
La extracción enzimática se puede usar para extraer lipidos de algas. La extracción enzimática emplea enzimas para degradar las paredes celulares con agua que actúan como solvente. La extracción enzimática puede ser sustentada por ultrasonicación .
También se puede usar C02 supercritico como solvente. En este método, se licúa C02 bajo presión y se calienta hasta el punto en que se vuelve supercritico (con propiedades tanto de liquido como de gas), permitiendo que actúe como solvente.
Proceso de fermentaciones para la producción de lípidos Según se usa en la presente, el término "proceso de fermentación" se refiere a cualquier proceso de fermentación o a cualquier proceso que comprende un paso de fermentación. Un proceso de fermentación incluye, en un sentido no limitativo, los procesos de fermentación usados para producir alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgánico (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico) ; cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico) ; gases (por ejemplo, H2 y C02 ) ; antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina ) ; enzimas; vitaminas (por ejemplo, riboflavina, beta-caroteno); y hormonas. Los procesos de fermentación también incluyen los procesos de fermentación usados en la industria de alcohol de consumo (por ejemplo, cerveza y vino), la industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), la industria del cuero y la industria del tabaco. Los procesos de fermentación preferidos incluyen los procesos de fermentación de alcoholes, bien conocidos en el arte. Los procesos de fermentación preferidos son procesos de fermentación anaeróbicos, bien conocidos en el arte. Las células termentadoras adecuadas, típicamente microorganismos, tienen la capacidad de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de microorganismos termentadores incluyen organismos fúngicos, tal como levadura, preferentemente un organismo oleaginoso. Según se usa en la presente, un "organismo oleaginoso" es aquel que acumula al menos un 25% de su peso seco como triglicéridos . Según se usa en la presente, una "levadura" incluye Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candida spp., Kluveromyces spp., Píchia spp., Hansenula spp., Trichoderma spp., Lípo yces starkey y Yarrowía lipolitíca. Las levaduras preferidas incluyen Yarrowía lipolitíca u otras levaduras oleaginosas y cepas de Saccharomyces spp. Y, en particular, Saccharomyces cerevisiae .
En una forma de realización, el microorganismo termentador es un organismo transgénico que comprende uno o más polinucleótidos exógenos, en donde el organismo transgénico tiene un nivel aumentado de uno o más lípidos no polares en comparación con un organismo correspondiente que carece de uno o más polinucleótidos exógenos. El microorganismo transgénico preferentemente se cultiva bajo condiciones que optimizan la actividad de los genes de la biosintesis de ácidos grasos y los genes de aciltransferasas de ácidos grasos. Esto conduce a la producción del mayor rendimiento y más económico de lipidos. En general, las condiciones de los medios que se pueden optimizar incluyen el tipo y la cantidad de fuentes de carbono, el tipo y la cantidad de fuentes de nitrógeno, la relación de carbono a nitrógeno, el nivel de oxigeno, la temperatura de crecimiento, pH, extensión de la fase de producción de biomasa, extensión de la fase de acumulación de lipidos y el momento de cosecha de las células.
El medio de fermentación debe contener una fuente de carbono adecuada. Las fuentes de carbono adecuadas pueden incluir, pero en un sentido no limitativo: monosacáridos (por ejemplo, glucosa, fructosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa), oligosacáridos , polisacáridos (por ejemplo, almidón, celulosa o mezclas de los mismos), alcoholes de azúcares (por ejemplo, glicerol) o mezclas de alimentaciones renovables (por ejemplo, permeato de suero de queso, licor de maíz macerado, molasas de remolacha, malta de cebada). Además, las fuentes de carbono pueden incluir alcanos, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, monoglicéridos, diglicéridos , triglicéridos, fosfolípidos y diversas fuentes de ácidos grasos comerciales incluyendo aceites vegetales (por ejemplo, aceite de soja) y grasas animales. Además, el sustrato de carbono puede incluir sustratos de un carbono (por ejemplo, dióxido de carbono, metanol, formaldehido, formiato, aminas que contienen carbono) para los cuales se haya demostrado conversión metabólica en los intermediarios bioquímicos clave. Por ende, se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solamente queda limitada por la elección del microorganismo huésped. Aunque se espera que todos los sustratos de carbono mencionados previamente y las mezclas de los mismos sean adecuados en la presente invención, los sustratos de carbono preferidas son azúcares y/o ácidos grasos. Se prefiere especialmente la glucosa y/o los ácidos grasos que contienen entre 10-22 carbonos.
El nitrógeno se puede suministrar de una fuente inorgánica (por ejemplo, (NH4)2S04) u orgánico (por ejemplo, urea, glutamato). Además de fuentes de carbono y nitrógeno apropiados, el medio de fermentación también puede contener minerales, sales, cofactores, soluciones amortiguadoras, vitaminas y otros componentes adecuados conocidos por los especialistas en el arte que son adecuados para el crecimiento del microorganismo y la promoción de las vías enzimáticas necesarias para la producción de lipidos.
Un rango de pH adecuado para la fermentación comprende típicamente entre aproximadamente pH 4,0 y pH 8,0, en donde se prefiere entre pH 5,5 y pH 7,0 como rango para las condiciones de crecimiento iniciales. La fermentación se puede conducir bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas, siendo preferidas las condiciones microaeróbicas .
Típicamente, la acumulación de niveles elevados de lipidos en las células de microorganismos oleaginosos requiere de un proceso de dos etapas, dado que el estado metabólico debe "equilibrarse" entre el crecimiento y la síntesis/almacenamiento de grasas. Por lo tanto, con mayor preferencia, es necesario un proceso de fermentación de dos etapas para la producción de lipidos en los microorganismos. En este enfoque, la primera etapa de la fermentación está dedicada a la generación y acumulación de masa celular y se caracteriza por un crecimiento celular y división celular rápidos. En la segunda etapa de la fermentación, se prefiere establecer condiciones de deprivación de nitrógeno en el cultivo para promover niveles elevados de acumulación de lipidos. El efecto de esta deprivación de nitrógeno comprende reducir la concentración efectiva de A P en las células, reduciendo así la actividad de la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NAD de las mitocondrias . Cuando esto sucede, se acumulará ácido cítrico y por lo tanto se forman agrupaciones abundantes de acetil-CoA en el citoplasma y se ceba la síntesis de ácidos grasos. Por lo tanto, esta fase se caracteriza por el cese de la división celular seguido por la síntesis de ácidos grasos y acumulación de TAG.
Aunque las células típicamente se cultivan a 30 °C aproximadamente, algunos estudios han mostrado una mayor síntesis de ácidos grasos insaturados a temperaturas inferiores. Sobre la base de la economía del proceso, este cambio de temperatura probablemente debería tener lugar después de la primera fase de la fermentación de dos etapas, cuando ya se ha producido el crecimiento masivo del microorganismo .
Se contempla que se puede aplicar una variedad de diseños de procesos de fermentación, cuando se desea una producción comercial de lípidos usando los ácidos nucleicos de la presente. Por ejemplo, la producción comercial de lípidos a partir de un huésped recombinante microbiano se puede efectuar mediante un proceso de fermentación por lotes, por lote alimentado o continuo.
Un proceso de fermentación por lotes es un sistema cerrado en donde la composición del medio se define al comienzo del proceso y no se efectúan otras adiciones más allá de los requeridos para mantener el pH y el nivel de oxígeno durante el proceso. Por lo tanto, al comienzo del proceso de cultivo el medio es inoculado con el organismo deseado y se permite que tenga lugar el crecimiento o la actividad metabólica sin adición de otros sustratos (es decir, fuentes de carbono y nitrógeno) al medio. En los procesos por lotes, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento de terminar el cultivo. En un proceso por lotes típico, las células pasan por una fase de retardo estático a una fase logarítmica- de gran crecimiento y finalmente a una fase estacionaria, en donde el índice de crecimiento está disminuido o detenido. Si se dejan sin tratar, las células en la fase estacionaria finalmente morirán. Una variación del proceso por lotes estándar es el proceso por lote alimentado, en donde el sustrato se agrega de manera continua al fermentador durante el transcurso del proceso de fermentación. Un proceso por lote alimentado también es adecuado en la presente invención. Los procesos por lotes alimentados son de utilidad cuando la represión de catabolitos es adecuada para inhibir el metabolismo de las células o cuando fuera deseable contar con cantidades limitadas de sustrato en el medio en cualquier momento. La medición de la concentración de sustrato en los sistemas por lotes alimentados es difícil y por ello se puede estimar en base a les cambios de factores mensurables tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de los desechos gaseosos (por ejemplo, C02 ) . Los métodos de cultivo por lotes y por lotes alimentados son comunes y bien conocidos en el arte, y se pueden consultar e emplos de ellos en Brock, en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2da ed., Sinauer Associates, Sunderland, Mass, (1989); o Deshpande ( 1992 ) .
La producción comercial de lípidos con las células de la presente también se puede efectuar mediante un proceso de fermentación continuo, en donde se agrega un medio definido de manera continua a un biorreactor al mismo tiempo que se retira una cantidad igual de volumen de cultivo para la recuperación de producto. Los cultivos continuos generalmente conservan las células en la fase de crecimiento logarítmica a una densidad celular constante. Los métodos de cultivo continuos o semi-continuos permiten modular un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o la concentración del producto final. Por ejemplo, un enfoque puede limitar la fuente de carbono y permitir los demás parámetros para moderar el metabolismo. En otros sistemas, se pueden alterar numerosos factores que afectan el crecimiento de manera continua en tanto la concentración celular, medida por la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas continuos buscan mantener un crecimiento de estado estable y por lo tanto se debe equilibrar el índice de crecimiento celular contra la pérdida de células debido al medio retirado del cultivo. Los métodos para modular los nutrientes y factores de crecimiento para los procesos de cultivo continuos, asi como técnicas para maximizar el índice de formación de producto, son bien conocidos en el arte de la microbiología industrial y una variedad de métodos se describen con detalle en Brock, supra.
Los ácidos grasos, incluyendo los PUFA, presentes en el microorganismo huésped se pueden encontrar como ácidos grasos libres o en formas esteri ficadas , tales como acilgliceroles , fosfolípidos, sulfolípidos o glucolípidos, y se pueden extraer de la célula huésped mediante una variedad de medios bien conocidos en el arte.
En general, la purificación de ácidos grasos, incluyendo PUFA, puede incluir extracción con solventes orgánicos, sonicación, extracción por fluidos supercríticos (por ejemplo, usando dióxido de carbono), saponificación y medios físicos tales como prensas, o combinaciones de los mismos. De particular interés es la extracción con metanol y cloroformo en la presencia de agua (Bligh y Dyer, 1959) . Cuando fuera deseable, se puede acidificar la capa acuosa para protonar los grupos de carga negativa y de esa manera incrementar el particionamiento de los productos deseados en la capa orgánica. Después de la extracción, los solventes orgánicos se pueden eliminar por evaporación bajo flujo de nitrógeno. Cuando se aislan en formas conjugadas, los productos se pueden cortar enzimáticamente o químicamente para liberar los ácidos grasos libres o un conjugado menos complejo de interés, y luego pueden ser sometidos a manipulaciones adicionales para producir un producto final deseado. Preferentemente, las formas conjugadas de los ácidos grasos se cortan con hidróxido de potasio.
Si fuera necesaria una purificación adicional, se pueden emplear métodos estándar. Dichos métodos pueden incluir extracción, tratamiento con urea, cristalización fraccionada, HPLC, destilación fraccionada, cromatografía sobre gel de sílice, centrifugación o destilación a gran velocidad, o combinaciones de estas técnicas. La protección de grupos reactivos, tales como grupos ácidos o alquenilo, se puede efectuar en cualquier paso mediante técnicas conocidas (por ejemplo, alquilación, iodación) . Los métodos usados incluyen metilación de los ácidos grasos para producir metil ásteres. De manera similar, los grupos protectores se pueden eliminar en cualquier paso. Preferentemente, la purificación de las fracciones que contienen GLA, STA, ARA, DHA y EPA se puede efectuar mediante tratamiento con urea y/o destilación fraccionada .
Un ejemplo del uso de la biomasa vegetal para la producción de una lechada de biomasa usando levaduras se describe en WO 2011/100272.
Usos de los lipidos Los lipidos producidos mediante los métodos descritos tienen diversos usos. En algunas formas de realización, los lipidos se usan como aceites comestibles. En otras formas de realización, los lipidos se refinan y usan como lubricantes o para otros usos industriales tal como en la síntesis de plásticos. En algunas formas de realización preferidas, los lipidos se refinan para producir biodiésel.
Biocombustibie Como se usa en la presente el término "biocombustible" incluye biodiésel y bioalcohol. El biodiésel puede ser hecho a partir de aceites derivados de plantas, algas y hongos. El bioalcohol se produce a partir de la fermentación de azúcares. Este azúcar se puede extraer directamente de plantas (por ejemplo, caña de azúcar), derivado de almidón de plantas (por ejemplo, maíz o trigo) o hecho a partir de celulosa (por ejemplo, madera, ho as o tallos) .
Actualmente los biocombustibles son más costosos para producirlos que los combustibles de petróleo. Además de los costos de procesamiento, los cultivos de bio combustible requieren plantar, fertilizar, aplicaciones de pesticidas y herbicidas, cosechar y transporte. Las plantas, algas y hongos de la presente invención pueden reducir los costos de producción del biocombustible .
Los métodos generales para la producción de biocombustible se pueden encontrar en, por ejemplo, Maher y Bressler, 2007; Green ell et al., 2010; Karmakar et al., 2010; Alonso et al., 2010; Lee y Mohamed, 2010; Liu et al., 2010a; Gong y Jiang, 2011; Endale et al., 2011; Sem al et al., 2011.
Bioalcohol La producción de alcoholes biológicamente producidos, por ejemplo etanol, propanol y butanol, es bien conocida. El etanol es el bioalcohol más común.
Los pasos básicos para la producción a gran escala de etanol son: 1) fermentación microbiana (por ejemplo, levaduras) de azúcares, 2) destilación, 3) deshidratación, y opcionalmente 4) desnaturalización. Antes de la fermentación, algunos cultivos requieren sacarificación o hidrólisis de hidratos de carbono tales como celulosa y almidón a azúcares. La sacarificación de celulosa se llama celulolisis. Se pueden usar enzimas para convertir el almidón a azúcar.
Fer en tación El bioalcohol se produce por fermentación microbiana del azúcar. La fermentación microbiana en realidad sólo funcionará directamente con azúcares. Dos componentes principales de las plantas, almidón y celulosa, están hechos de azúcares, y pueden en principio ser convertidos a azucares por medio de fermentación.
Destilación Para que el etanol se pueda usar como un combustible, la mayor parte del agua debe ser extraída. La mayor parte del agua se elimina por destilación, pero la pureza se limita a entre 95 y 96% debido a la formación de un azeótropo agua-etanol de ba a ebullición con etanol máximo (95,6% masa en masa (96,5% volumen en volumen) y 4,4% masa en masa (3,5% volumen en volumen) de agua). Esta mezcla es llamada etanol hidratado y se puede usar como un combustible solo, pero a diferencia del etanol anhidro, el etanol hidratado no es miscible en todas las relaciones con nafta, por lo cual la fracción de agua típicamente se elimina en otro tratamiento con el objetivo de quemarlo en combinación con nafta en motores a nafta.
Deshidrabación El agua puede ser eliminada de una mezcla azeotrópica etanol/agua por deshidratación . La destilación azeotrópica, usada en muchas de las primeras plantas de etanol combustible, consiste en el agregado de benceno o ciclohexano a la mezcla. Cuando estos componentes se agregan a la mezcla, se forma una mezcla azeotrópica heterogénea en equilibrio vapor-líquido- líquido, que cuando se destila produce etanol anhidro en la parte inferior de la columna, y una mezcla de vapor de agua y ciclohexano/benceno . Cuando se condensa, se vuelve una mezcla líquida de dos fases. Otro método antiguo, llamado destilación extractiva, consiste en el agregado de un componente ternario que aumentará la volatilidad relativa del etanol. Cuando la mezcla ternaria se destila, producirá etanol anhidro en la corriente superior de la columna.
Un tercer método ha emergido y ha sido adoptado por la mayor parte de las plantas de etanol modernas. Este nuevo proceso usa tamices moleculares para eliminar el agua del etanol combustible. En este proceso, el vapor de etanol bajo presión pasa a través de un lecho de esferas de tamiz molecular. Los poros de las esferas tienen un tamaño para permitir la absorción de agua a la vez que excluyen el etanol. Luego de un período de tiempo, el lecho se regenera bajo vacío o en el flujo de una atmósfera inerte (por ejemplo N2) para quitar el agua absorbida. Frecuentemente se usan dos lechos para que uno esté disponible para absorber agua mientras que el otro está siendo regenerado.
Biodiésel La producción de biodiésel, o alquil ésteres, es bien conocida. Hay tres rutas básicas para la producción de ésteres a partir de lipidos: 1) transesterificación basada en bases de los lipidos con alcohol; 2) esterificación directa catalizada por ácido de los lipidos con metanol; y 3) conversión de los lipidos a ácidos grasos, y luego a alquil ésteres con catálisis ácida.
Se puede usar cualquier método para preparar alquil ésteres y gliceril éteres de ácidos grasos (en los cuales uno, dos o tres de los grupos hidroxilos del glicerol son eterificados) . Por ejemplo, los ácidos grasos se pueden preparar, por ejemplo, por hidrólisis o saponificación de triglicéridos con catalizadores ácidos o básicos, respectivamente, o usando una enzima tal como una lipasa o una esterasa. Los alquil ésteres de ácidos grasos se pueden preparar por reacción de un ácido graso con un alcohol en presencia de un catalizador ácido. Los alquil ésteres de ácidos grasos también se pueden preparar por reacción de un triglicérido con un alcohol en presencia de un catalizador ácido o básico. Los éteres de glicerol se pueden preparar, por ejemplo, por reacción del glicerol con un haluro de alquilo en presencia de una base, o con una olefina o alcohol en presencia de un catalizador ácido.
En algunas formas de realización preferidas, los lípidos se transesteri fican para producir metil ésteres y glicerol. En algunas formas de realización preferidas, los lípidos se hacen reaccionar con un alcohol (tal como metanol o etanol) en presencia de un catalizador (por ejemplo, hidróxido de potasio o sodio) para producir alquil ésteres. Los alquil ésteres se pueden usar para biodiésel o mezclarlos con combustibles basados en petróleo.
Los alquil ésteres se pueden mezclar directamente con combustible diésel, o lavarlo con agua u otras soluciones acuosas para eliminar impurezas, que incluye los catalizadores, antes de mezclarlos. Se pueden neutralizar los catalizadores ácidos con base. Sin embargo, este proceso genera sales. Para evitar la corrosión del motor, se prefiere minimizar la concentración de sales en la composición del aditivo para combustible. Las sales pueden ser sustancialmente eliminadas de la composición, por ejemplo, por lavado de la composición con agua.
En otra forma de realización, la composición se seca luego de ser lavada, por ejemplo, por pasaje de la composición a través de un agente para secado tal como sulfato de calcio.
En aún otra forma de realización, se obtiene un aditivo para combustible neutro sin producir sales o usar un paso de lavado, con el uso de un ácido polimérico, tal como Dowex 50™ que es una resina que contiene grupos de ácido sulfónico. El catalizador se puede eliminar fácilmente por filtración luego de que se completan las reacciones de esterificación y eterificación .
Triacílgliceroles vegetales como una fuente de biocombus tibie El uso de los triacílgliceroles vegetales para la producción de biocombustible se revisó en Durrett et al. (2008) . Brevemente, los aceites vegetales están compuestos principalmente por diferentes triacílgliceroles (TAG) , moléculas que consisten de tres cadenas de ácido graso (usualmente de 18 ó 16 carbonos de longitud) esterificadas a glicerol. Las cadenas de ácidos grasos son químicamente similares a los hidrocarburos alifáticos que constituyen el grueso de las moléculas que se encuentran en la nafta y diésel. Los hidrocarburos en la nafta contiene entre 5 y 12 átomos de carbono por molécula, y este combustible volátil se mezcla con aire y se enciénde con una chispa en un motor convencional. Por el contrario, los componentes del combustible diésel típicamente tienen entre 10 y 15 átomos de carbono por molécula y se encienden por la muy alta compresión obtenida en un motor diésel. Sin embargo, la mayor parte de los TAG vegetales tienen un rango de viscosidad que es mucho mayor que el del diésel convencional: entre 17,3 y 32,9 mm2s-l en comparación a entre 1,9 y 4,1 mm2s-l, respectivamente (ASTM D975; Knothe y Steidley, 2005). Esta mayor viscosidad da como resultado una peor atomización del combustible en los motores diésel modernos, llevando a problemas derivados de la combustión incompleta tal como deposición de carbón y coquificación (Ryan et al., 1984). Para superar este problema, los TAG se convierten a ésteres de ácidos grasos menos viscosos por esterificación con un alcohol primario, más comúnmente metanol . El combustible resultante es comúnmente llamado biodiésel y tiene un rango de viscosidad dinámico de 1,9 a 6,0 mm2s-l (ASTM D6751). Los metilésteres de ácidos grasos ( FAME ) encontrados en el biodiésel tienen una densidad de energía alta como lo refleja si alto calor de combustión, que es similar, si no es mayor, que el del diésel convencional (Knothe, 2005). Similarmente, el número de cetanos (una medida de la calidad de ignición del diésel) de los FAME encontrados en el biodiésel excede el del diésel convencional (Knothe, 2005).
Los aceites vegetales están principalmente compuestos por cinco ácidos grasos comunes, específicamente palmitato (16:0), estearato (18:0), oleato (18:1), linoleato (18:2) y linolenato (18:3), a pesar de que, dependiendo de las especies particulares, los ácidos grasos más cortos o más largos pueden ser también los principales constituyentes.
Estos ácidos grasos difieren uno del otro en términos de la longitud de la cadena de acilos y el número de dobles enlaces, llevando a diferentes propiedades físicas. Consecuentemente, las propiedades como combustible del biodiésel derivado de una mezcla de ácidos grasos dependen de esa composición. La alteración del perfil de ácidos grasos puede por lo tanto mejorar las propiedades como combustible del biodiésel tal como características de flujo a baja temperatura, estabilidad oxidativa y emisiones de NOx. La alteración de la composición de ácidos grasos de TAG puede reducir la viscosidad de los aceites vegetales, eliminando la necesidad de la modificación química, mejorando de este modo la costos-eficacia de los of biocombustibles .
La mayor parte de los aceites vegetales son derivados de triacilgliceroles almacenados en las semillas. Sin embargo, la presente invención provee métodos para además aumentar el contenido de aceite en los tej idos vegetativos . Los tejidos vegetales de la presente invención tienen una producción de lípidos totales aumentada. Adicionalmente, el nivel de ácido oleico está aumentado significativamente mientras que el ácido graso poliinsaturado ácido alfa linolénico está disminuido.
Una vez que una hoja se desarrolló, sufre un cambio en el desarrollo de sumidero (absorbiendo nutrientes) a fuente (proveyendo azúcares) . En los cultivos de alimentos, la mayor parte de los azúcares translocan hacia afuera de las ho as fuente para apoyar al crecimiento de .nuevas hojas, raices y frutos. Debido a que la translocación de hidratos de carbono es un proceso activo, hay una pérdida de carbono y energía durante la translocación. Adicionalmente, luego de que la semilla en desarrollo incorpora carbono de la planta, hay pérdidas adicionales de carbono y energía asociadas con la conversión de hidratos de carbono a aceite, proteína u otros componentes principales de la semilla (Goffman et al., 2005) . Las plantas de la presente invención aumentan el contenido de energía de las hojas y/o tallos de modo que la planta entera por encima de la tierra puede ser cosechada y usada para producir .
Algas como una fuente de biocombustible Las algas almacenan aceite dentro de su cuerpo celular, algunas veces pero no siempre en vesículas. Este aceite puede ser recuperado de varios modos relativamente simples, que incluyen solventes, calor, y/ o presión. Sin embargo, estos métodos típicamente recuperan sólo aproximadamente 80% a 90% del aceite almacenado. Los procesos que ofrecen métodos de extracción de aceites más eficaces que pueden recuperar cerca del 100% del aceite almacenado a bajo costo son conocidos en el arte. Estos procesos incluyen o consisten en despolimerización, tal como ruptura biológica de las paredes de la célula del alga y/o vesículas de aceite, si están presentes, para liberar el aceite de las algas productoras de aceite .
Adicionalmente, existe un gran número de virus que invaden y rompen las células de las algas, y así pueden liberar los contenidos de la célula en particular el aceite o almidón almacenado. Dichos virus son una parte integral del ecosistema de algas, y muchos de los virus son específicos para un tipo único de algas. Los e emplos específicos de dichos virus incluyen el virus de Chlorella PBCV-1 ( Paramecium Bursaria Chlorella Virus) que es específico para ciertas algas Chlorella, y cianófagos tales como SM-1, P-60, y AS-1 específicos por las algas azul verdosas Synechococcus. El virus particular seleccionado dependerá de la especie particular de algas a ser usada en el proceso de crecimiento. Un aspecto de la presente invención es el uso de dicho virus para romper las algas de modo que se pueda recuperar el aceite contenido dentro de las paredes de las células de las algas. En otro aspecto detallado de la presente invención, se puede usar una mezcla de agentes biológicos para romper la pared celular del alga y/o vesículas de aceite.
El aplastamiento mecánico, por ejemplo, un Expeller o prensa, un paso de recuperación de solvente hexano o butano, extracción de fluido supercrítica, o similar también pueden ser útiles para extraer el aceite de las vesículas de aceite de las algas que producen aceite. Como alternativa, se pueden usar estrategias mecánicas en combinación con agentes biológicos con el ob etivo de mejorar las velocidades de reacción y/o separación de materiales. Sin importar el agente o agentes biológicos particulares elegidos para que se puedan introducir en cantidades que son suficientes para servir como mecanismo primario por el cual se libera el aceite del alga desde vesículas de aceite en las algas que producen aceite, es decir no una presencia meramente incidental de cualquiera de estos .
Una vez que el aceite ha sido liberado de las algas se puede recuperar o separar de una lechada de material de restos de algas, por ejemplo, residuo celular, aceite, enzima, subproductos, etc. Esto se puede hacer por sedimentación o centrifugación, siendo con centrifugación generalmente más rápido. La producción de almidón puede seguir procesos de separación similares.
Se puede formar un alimento de algas a partir de una fuente de alimento de biomasa así como una fuente de alimento de algas. La biomasa de fuentes de algas o terrestres pueden ser despolimeri zadas en una variedad de modos tales como, pero sin limitación, sacarificación, hidrólisis o similar. El material fuente puede ser casi cualquier celulosa suficientemente voluminosa, lignocelulosa, polisacárido o hidrato de carbono, glicoproteína , u otro material que constituye la pared celular del material fuente.
El estadio de fermentación puede ser convencional en su uso de levaduras para fermentar azúcar a alcohol. El proceso de fermentación produce dióxido de carbono, alcohol, y membranas de algas. Todos estos productos se pueden usar en cualquier momento del proceso y sistemas de la presente invención, sustancialmente sin material sin uso o calor desperdiciado. Como alternativa, si se produce etanol de este modo, puede ser vendido como un producto o usado para producir acetato de etilo para el proceso de transesterificación . Se podrían aplicar consideraciones similares a alcoholes diferentes del etanol.
El aceite de algas se puede convertir a biodiésel por medio de un proceso de hidrogenación directa o transesterificación del aceite de algas. El aceite de algas es en forma similar como la mayoría de los aceites vegetales, que están en la forma de triglicéridos . Un triglicérido consiste de tres cadenas de ácido graso, una unida a cada uno de los tres átomos de carbono en un esqueleto de glicerol. Esta forma de aceite se puede quemar directamente. Sin embargo, las propiedades del aceite en esta forma no son ideales para usar en un motor diésel, y sin modificación, el motor rápidamente funcionará pobremente o fallará. De acuerdo a la presente invención, el triglicérido es convertido a biodiésel, que es similar pero superior al combustible diésel de petróleo en muchos aspectos.
Un proceso para convertir el triglicérido a biodiésel es la transesterificacion, e incluye hacer reaccionar el triglicérido con alcohol u otro aceptor de acilo para producir ésteres de ácidos grasos libres y glicerol. Los ácidos grasos libres están en la forma de alquil ésteres de ácidos grasos ( FAAE ) .
En el proceso químico, se necesitan pasos adicionales para separar el catalizador y limpiar los ácidos grasos. Adicionalmente, si se usa el etanol como el aceptor de acilos, debe estar esencialmente seco para prevenir la producción de jabón por medio de saponificación en el proceso, y el glicerol debe ser purificado. El proceso biológico, por comparación, puede aceptar etanol en un estado menos seco y la limpieza y purificación del biodiésel y glicerol son mucho más fáciles.
La con frecuencia usa un alcohol simple, típicamente metanol derivado de petróleo. Cuando se usa metanol, el biodiésel resultante es llamado metiléster de ácidos grasos ( FAME ) y la mayor parte del biodiésel vendido en la actualidad, especialmente en Europa, es FAME . Sin embargo, el etanol también se puede usar como el alcohol en la transesterificacion, en cuyo caso el biodiésel es etiléster de ácidos grasos (FAEE). En los EE.UU., los dos tipos usualmente no se distinguen, y son colectivamente conocidos como alquil ésteres de ácidos grasos ( FAAE ) , el cual como un término genérico puede aplicar sin importar el aceptor de acilo usado. La hidrogenación directa también se puede utilizar para convertir al menos una porción del aceite de algas a un biodiésel. Como tal, en un aspecto, el producto biodiésel puede incluir un alcano.
El triglicérido de algas también se puede convertir a biodiésel por hidrogenación directa. En este proceso, los productos son cadenas de alcanos, propano, y agua. El esqueleto de glicerol es hidrogenado a propano, por lo tanto sustancialmente no hay glicerol producido como subproducto. Además, no se necesita alcohol o catalizadores de transesterificacion. Toda la biomasa se puede usar como alimento para las productoras de aceite sin necesidad de fermentación para producir alcohol para la transesterificacion. Los alcanos resultantes son hidrocarburos puros, sin oxigeno, por lo tanto el biodiésel producido de este modo tiene un contenido de energía levemente mayor que los ésteres de alquilo, se degrada más lentamente, no atrae agua, y tiene otras propiedades químicas deseables .
Alimentos La presente invención incluye composiciones que se pueden usar como alimentos. A los efectos de la presente invención, el término "alimentos" incluye cualquier alimento o preparación destinada al consumo de humanos o animales (incluyendo un consumo por vía enteral y/o parenteral) que cuando es ingerido por el cuerpo (1) sirve para nutrir o aumentar los te idos o suministrar energía; y/o (2) mantiene, restablece o sustenta un estado nutricional o función metabólica adecuados. Los alimentos de la invención incluyen composiciones nutricionales para bebés y/o niños. ¦ Los alimentos de la invención comprenden, por ejemplo, una célula de la invención, una planta de la invención, la parte de planta de la invención, la semilla de la invención, un extracto de la invención, el producto de un método de la invención, el producto de un proceso de fermentación de la invención o una composición junto con uno o más vehículos adecuados. El término "vehículo" se usa en su sentido más amplio para abarcar cualquier componente que puede tener, o no, valor nutricional. Como podrá apreciar el especialista, el vehículo debe ser adecuado para su uso (o usado a una concentración suficientemente baja) en un alimento de modo tal que no tenga efectos nocivos sobre un organismo que consume el alimento.
El alimento de la presente invención comprende un lipido producido directa o indirectamente mediante el uso de los métodos, células u organismos divulgados en la presente. La composición se puede encontrar en la forma de un gel o de un liquido. Además, la composición puede incluir macronutrientes comestibles, vitaminas y/o minerales en las cantidades deseadas para un uso particular. Las cantidades de estos ingredientes varían dependiendo de si la composición se usará con individuos normales o si se usará con individuos que tienen necesidades especiales, tales como los individuos que sufren de trastornos metabólicos y semejantes.
Los ejemplos de vehículos adecuados con valor nutricional incluyen, pero en un sentido no limitativo, macronutrientes tales como grasas comestibles, carbohidratos y proteínas. Los ejemplos de tales grasas comestibles incluyen, pero en un sentido no limitativo, aceite de coco, aceite de borraja, aceite de hongos, aceite de grosellas, aceite de soja y mono y diglicéridos . Los ejemplos de dichos hidratos de carbono incluyen, a modo de ejemplo ilustrativo, glucosa, lactosa comestible y almidón hidrolizado. Además, los ejemplos de proteínas que se pueden utilizar en la composición nutricional de la invención incluyen (pero en un sentido no limitativo) proteínas de soja, suero electrodializado, leche descremada electrodializada, suero de leche o los hidrolizados de estas proteínas.
Con respecto a las vitaminas y los minerales, se puede agregar lo siguiente a las composiciones de alimento de la presente invención: calcio, fósforo, potasio, sodio, cloruro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, zinc, selenio, iodo y las vitaminas A, E, D, C y el complejo B. También se pueden agregar otras vitaminas y minerales.
Los componentes utilizados en las composiciones alimenticias de la presente invención pueden ser de origen semipuri ficado o purificado. Los términos semipurificado o purificado se refieren a un material que fue preparado por purificación de un material natural o mediante síntesis de novo.
La composición alimenticia de la presente invención también se puede agregar a un alimento aun cuando la dieta no requiera de suplementos. Por ejemplo, la composición se puede agregar a un alimento de cualquier tipo, incluyendo (pero en un sentido no limitativo): margarina, manteca modificada, quesos, leche, yogur, chocolate, caramelos, refrigerios, aceites para ensalada, aceites para cocinar, grasas para cocinar, carnes, pescado y bebidas.
El género Saccharomyces spp se usa tanto en la elaboración de cerveza como en la elaboración de vino y también como un agente de horneado, en particular de pan. La levadura es uno de los constituyentes principales de los extractos vegetales. La levadura también se usa como un aditivo en los piensos. Resultará evidente que se pueden suministrar cepas de levadura modificadas que están adaptadas para sintetizar los lipidos que se describen en la presente. Estas cepas de levadura se pueden usar luego en alimentos y en la elaboración de vino y cerveza para proporcionar productos con un mayor contenido de lipidos.
Además, los lipidos producidos de acuerdo con la presente invención o células huésped transformadas para contener y expresar los genes ob eto de la presente también se pueden usar como suplementos de piensos para alterar el te ido de un animal o la composición de ácidos grasos de la lecha para uno que fuera más deseable para consumo humano o animal. Los ejemplos de dichos animales incluyen ovejas, ganado, caballos y semejantes.
Además, los alimentos de la invención se pueden usar en acuicultura para aumentar los niveles de ácidos grasos en los peces para consumo humano o de animales.
Los alimentos preferidos de la invención son las plantas, semillas y otras partes de plantas tales como hojas, frutas y tallos que se pueden usar directamente como alimento o pienso para humanos u otros animales. Por ejemplo, los animales pueden pastar directamente sobre tales plantas cultivadas a campo o pueden ser alimentados con cantidades más medidas en una alimentación controlada. La invención incluye el uso de dichas plantas y partes de plantas como un alimento para aumentar los niveles de ácidos grasos poliinsaturados en humanos y otros animales.
Composiciones La presente invención también abarca composiciones, en particular composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más lipidos producidos usando los métodos de la invención.
Una composición farmacéutica puede comprender uno o más de los lipidos, en combinación con un transportador, adyuvante o vehículo estándar, bien conocido, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como solución amortiguadora fosfato salina, agua, etanol, polioles, aceites vegetales, un agente humectante o una emulsión tal como una emulsión de agua/aceite. La composición estar tanto en forma líquida como sólida. Por ejemplo, la composición puede estar en la forma de una tableta, cápsula, líquido o polvo ingerible o ungüento tópico o crema. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, por mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos . También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. Además de dichos diluyentes inertes, la composición también puede incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, agentes edulcorantes, agentes saborizantes y agentes aromatizantes.
Las suspensiones pueden comprender, además del ingrediente activo, agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearilicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de estas sustancias.
Las formas de dosificación sólidas tales como tabletas y cápsulas se pueden preparar usando técnicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, los lipidos producidos de acuerdo a la presente invención se pueden armar en tabletas con bases de tabletas convencionales tales como lactosa, sacarosa, y almidón de maíz en combinación con aglutinantes tales como acacia, almidón de maiz o gelatina, agentes desintegrantes tales como almidón de papa o ácido algínico, y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Las cápsulas se pueden preparar por incorporación de estos excipientes a una cápsula de gelatina junto con antioxidantes y el o los lipidos de interés.
Para una administración intravenosa, los lipidos producidos de acuerdo con la presente invención, o derivados de los mismos, se pueden incorporar en formulaciones comerciales .
Una dosificación típica de un acido graso particular comprende entre 0,1 mg y 20 g, ingeridas una a cinco veces por día (hasta 100 g por día) y preferentemente se encuentra en el rango de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 1, 2, 5 ó 10 g diarios (tomado en una o múltiples dosis). Según es de conocimiento en el arte, resulta deseable un mínimo de aproximadamente 300 mg/día de ácidos grasos, en especial de ácidos grasos poliinsaturados . Sin embargo, se podrá apreciar que cualquier cantidad de ácidos grasos será beneficiosa para el sujeto.
Las posibles rutas de administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, por ejemplo, la vía enteral y parenteral. Por ejemplo, una preparación líquida se puede administrar por vía oral. Además, se puede dispersar por completo una mezcla homogénea en agua, mezclar bajo condiciones estériles con diluyentes, conservantes, soluciones amortiguadoras o propelentes fisiológicamente aceptables para formar un aerosol o inhalante.
La dosificación de la composición que será administrada al sujeto puede ser determinada por el especialista en el arte y depende de diversos factores tales como peso, edad del paciente, estado de salud general, antecedentes, estado inmune, etc. del sujeto.
Además, las composiciones de la presente invención se pueden utilizar con fines de cosméticos. Las composiciones se pueden agregar a composiciones cosméticas pre-existentes de modo tal que se forma una mezcla o se. puede usar un ácido graso producido de acuerdo con la presente invención como único ingrediente "activo" en una composición cosmética.
Polípéptidos Los términos "polipéptido" y "proteína" generalmente se usan indistintamente.
Un polipéptido o clase de polipéptidos se puede definir por el grado de identidad (% de identidad) de su secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia, o por tener un mayor % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia que con otra. El % de identidad de un polipéptido con una secuencia de aminoácidos de referencia se determina típicamente mediante el análisis GAP (Needleman y Wunsch, 1970; programa GCG) con los parámetros de una penalidad por creación de hueco = 5 y una penalidad por extensión de hueco = 0,3. La secuencia de consulta es de al menos 100 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 aminoácidos. Aún más preferentemente, la secuencia de consulta es de al menos 250 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 250 aminoácidos. Más preferentemente aún, el análisis GAP alinea dos secuencias sobre su longitud completa. El polipéptido o la clase de polipéptidos pueden tener la misma actividad enzimática o una actividad diferente o una falta de actividad, con respecto al polipéptido de referencia. Preferentemente, el polipéptido tiene una actividad enzimática de al menos 10% de la actividad del polipéptido de referencia .
Según se usa en la presente, un fragmento "fragmento biológicamente activo" es una porción de un polipéptido de la invención que mantiene una actividad definida de un polipéptido de referencia de longitud completa, por ejemplo, actividad MGAT. Los fragmentos biológicamente activos, según se usan en la presente, excluyen al polipéptido de longitud completa. Los fragmentos biológicamente activos pueden ser una porción de cualquier tamaño, siempre que conserven la actividad definida. Preferentemente, el fragmento biológicamente activo conserva al menos un 10% de la actividad del polipéptido de longitud completa.
Con respecto a un polipéptido o a una enzima definida, se podrá apreciar que las cifras de % de identidad mayores que las provistas en la presente abarcarán formas de realización preferidas. Por consiguiente, cuando fuera aplicable, a la luz de las cifras mínimas de % de identidad, se prefiere que el polipéptido/enzima comprenda un aminoácido que es al menos un 60%, más preferentemente al menos un 65%, más preferentemente al menos un 70%, más preferentemente al menos un 75%, más preferentemente al menos un 80%, más preferentemente al menos un 85%, más preferentemente al menos un 90%, más preferentemente al menos un 91%, más preferentemente al menos un 92%, más preferentemente al menos un 93%, más preferentemente al menos un 94%, más preferentemente al menos un 95%, más preferentemente al menos un 96%, más preferentemente al menos un 97%, más preferentemente al menos un 98%, más preferentemente al menos un 99%, más preferentemente al menos un 99,1%, más preferentemente al menos un 99,2%, más preferentemente al menos un 99,3%, más preferen emente al menos un 99,4%, más preferentemente al menos un 99,5%, más preferentemente al menos un 99,6%, más preferen emente al menos un 99,7%, más preferentemente al menos un 99,8% y aún más preferentemente al menos un 99,9% idéntica al SEQ ID N° relevante nominado.
Los mutantes de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos definidos en la presente se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en un ácido nucleico definido en la presente, o mediante síntesis ín vítro del polipéptido deseado. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, supresiones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Se puede efectuar una combinación de supresiones, inserciones y sustituciones para obtener la construcción final, siempre que el producto polipeptídico final posea las características deseadas.
Los polipéptidos mutantes (alterados) se pueden preparar usando cualquier técnica conocida en el arte, por ejemplo, usando estrategias de evolución dirigida o de diseño racional (véase más adelante) . Los productos derivados de ADN mutado/alterado se pueden examinar fácilmente usando las técnicas que se describen en la presente para determinar si poseen actividad aciltransferasa de ácidos grasos, por ejemplo, actividad MGAT, DGAT o GPAT/ fos fatasa .
Cuando se diseñan secuencias de aminoácidos mutantes, la ubicación del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerá de la o las características a modificar. Los sitios para la mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo, por (1) sustitución primero con las elecciones de los aminoácidos conservadores y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados obtenidos, (2) suprimir el residuo de interés o (3) insertar otros residuos adyacentes al sitio ubicado.
Las supresiones de secuencia de aminoácidos varían en general en un rango entre 1 y 15 residuos aproximadamente, más preferentemente entre 1 y 10 residuos aproximadamente y típicamente entre 1 y 5 residuos contiguos aproximadamente.
En estos mutantes de sustitución se ha eliminado al menos un residuo de aminoácido en el polipéptido y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen los sitios identificados como sitio(s) activo (s). Otros sitios de interés son aquellos en los cuales los residuos particulares obtenidos de diversas cepas o especies son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos sitios, en especial los que se encuentran dentro de una secuencia de al menos tres sitios idénticamente conservados adicionales, se sustituyen preferentemente de una manera relativamente conservadora. Tales sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 en la columna con el encabezado de "Ejemplos de sustituciones".
En una forma de realización preferida, un polipéptido mutante/variante tiene solamente, o no más de, uno o dos o tres o cuatro cambios de aminoácidos conservadores en comparación con un polipéptido natural. Los detalles de los cambios de aminoácidos conservadores se indican en la Tabla 1. Como comprenderá el especialista, tales cambios menores pueden ser razonablemente predichos para no alterar la actividad del polipéptido cuando se expresa en una célula recombinante .
Tabla 1. Ejemplos de sustituciones.
Evolución dirigida En la evolución dirigida, se aplica mutagénesis aleatoria a una proteina, y se usa un régimen de selección para escoger variantes con las cualidades deseadas, por ejemplo, una mayor actividad aciltransferasa de ácidos grasos. Además, luego se aplican rondas de mutación y selección. Una típica estrategia de evolución dirigida comprende tres pasos: 1) Díversificación: El gen que codifica la proteina de interés es mutado y/o recombinado aleatoriamente para crear una gran biblioteca de variantes de genes. Se pueden construir bibliotecas de variantes genes por medio de PCR sujeto a error (véase, por ejemplo, Leung, 1989; Cad ell y Joyce, 1992), a partir de agrupaciones de fragmentos digeridos con DNasa I preparados con templados parentales (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b; Crameri et al., 1998; Coco et al., 2001) a partir de oligonucleotidos degenerados (Ness et al., 2002, Coco, 2002) o a partir de mezclas de ambos, o aún a partir de templados parentales no digeridos (Zhao et al., 1998; Eggert et al., 2005; Jézéquek et al., 2008) y habitualmente se ensamblan por medio de PCR. Las bibliotecas también se pueden obtener a partir de secuencias parentales recombinadas ín vivo o in vítro por recombinación homologa o no homologa (Ostermeier et al., 1999; Volkov et al., 1999; Sieber et al., 2001). Las bibliotecas de variantes de genes también se pueden construir por subclonación de un gen de interés en un vector adecuado, transformar el vector en una cepa "mutator" tal como cepa XL-1 red de E. coli (Stratagene) y propagar la bacteria transformada por una cantidad adecuada de generaciones. Las bibliotecas de variantes de genes también se puede construir sometiendo al gen de interés a entremezclado de ADN (es decir, recombinación homologa in vítro de agrupaciones de genes mutantes seleccionados por fragmentación y re-ensambla e aleatorio) como se describe ampliamente en Harayama (1998). 2) Selección: La biblioteca es evaluada por la presencia de mutantes (variantes) que posean la propiedad deseada usando pruebas o selección. El examen permite identificar y aislar mutantes de alto rendimiento manualmente, en tanto las selecciones automáticamente eliminan todos los mutantes no funcionales. Una prueba puede comprender el examen de la presencia de motivos de aminoácidos conservados conocidos. Como alternativa, o además, una prueba puede comprender expresar el polinucleótido mutado en un organismo huésped, o una parte del mismo, y evaluar el nivel de actividad aciltransferasa de ácidos grasos, por ejemplo, por cuantificación del nivel del producto resultante en el lipido extraído del organismo, o una parte del mismo, y determinar el nivel de producto en los lípidos extraídos del organismo, o una parte del mismo, con relación a un organismo correspondiente o una parte del mismo que no contiene al polinucleótido mutado y, opcionalmente, expresar el polinucleótido parental (no mutado). Como alternativa, la prueba puede comprender alimentar el organismo, o una parte del mismo, con el sustrato marcado y determinar el nivel de sustrato o producto en el organismo, o una parte del mismo, con relación a un organismo correspondiente o una parte del mismo que no contiene al polinucleótido mutado y, opcionalmente, expresar el polinucleótido parental (no mutado). 3) Amplificación : Las variantes identificadas en la selección o prueba se replican muchas veces, lo que permite que los investigadores puedan secuenciar su ADN con el fin de comprender las mutaciones que se produjeron.
Con untamente, estos tres pasos se conocen como una "ronda" de evolución dirigida. La mayoría de los experimentos comprenderá más de una ronda. En estos experimentos, los "ganadores" de la ronda previa se diversifican en la ronda siguiente para crear una biblioteca nueva. Al final del experimento, se caracterizan todos los mutantes de proteínas o polinucleotidos desarrollados usando métodos bioquímicos.
Diseño racional Se puede diseñar racionalmente una proteína, sobre la base de la información conocida acerca de la estructura y plegamiento de la proteína. Esto se puede lograr por diseño desde cero (diseño de novo) o por rediseño basado en andamiajes nativos (véase, por ejemplo, Hallinga, 1997; y Lu y Berry, Protein Structure Desígn y Engineering, Handbook of Proteins 2, 1153-1157 (2007)). El diseño de proteínas comprende típicamente la identificación de secuencias que se pliegan en una estructura dada o blanco y se puede efectuar usando modelos computarizados . Los algoritmos de diseño de proteínas por computadora buscan el espacio de secuencia-conformación para secuencias de energía ba a cuando se pliegan en la estructura blanco. Los algoritmos de diseño de proteínas computacionales emplean modelos de energía de proteínas para evaluar la manera en que las mutaciones afectarían la estructura y función de la proteína. Estas funciones de energía incluyen típicamente una combinación de mecánicas moleculares, estadísticas (es decir, basado en el conocimiento previo) y otros términos empíricos. Un programa de computación disponible adecuado incluye IPRO (Rediseño y Optimización Interactivo de Proteínas), EGAD (un Algoritmo Genético para el Diseño de Proteínas), Rosetta Design, Sharpen y Abalone.
También se incluyen en el alcance de la invención los polipéptidos definidos en la presente que fueron modificados di ferencialmente durante o después de la síntesis, por ejemplo, por biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, clivaje proteolítico, unión a una molécula de anticuerpo o a otro ligando celular, etc. Estas modificaciones pueden servir para aumentar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido de la invención.
Identificación de acíltransferasas de ácidos grasos En un aspecto, la invención provee un método para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica una aciltrans ferasa de ácidos grasos que tiene mayor capacidad para producir MAG, DAG y/o TAG en una célula.
El método comprende obtener una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una aciltransferasa de ácidos grasos ligada operativamente a un promotor que es activo en la célula. La molécula de ácido nucleico puede codificar una aciltrans ferasa de ácidos grasos natural tal como MGAT, GPAT y/o DGAT, o uno o más mutantes de las mismas. Los mutantes se pueden modificar usando procedimientos estándar en el arte (véase previamente) tal como mediante una mutagenesis aleatoria, mutagénesis dirigida o mutagénesis de saturación en genes de interés conocidos, o sometiendo diferentes genes a entremezclado de ADN . Por ejemplo, se puede mutar y/o recombinar aleatoriamente un polinucleótido que comprende una secuencia seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID N°: 1 a 44 que codifica una MGAT para crear una gran biblioteca de variantes de genes (mutantes) usando por ejemplo, PCR sujeto a error y/o entremezclado de ADN. Los mutantes se pueden seleccionar para realizar una investigación adicional sobre la base que comprenden un motivo de aminoácido conservado. Por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico candidato que codifica una MGAT, un especialista puede determinar si comprende una secuencia provista en las SEQ ID N°: 220, 221, 222, 223 y/o 224 antes de evaluar si el ácido nucleico codifica una MGAT mutante funcional (por ejemplo, por transfección en una célula huésped, tal como una célula vegetal y evaluar la actividad aciltransferasa de ácidos grasos (es decir, MGAT) según se describe en la presente) .
Se puede usar secuenciación directa por PCR del ácido nucleico o un fragmento del mismo, para determinar la secuencia de nucleótidos exacta y deducir la secuencia de aminoácidos correspondiente y de esa manera identificar secuencias de aminoácidos conservadas. Se pueden usar cebadores degenerados basados en secuencias de aminoácidos conservadas para dirigir la amplificación por PCR. También se pueden usar cebadores degenerados como sondas en ensayos de hibridación de ADN. Como alternativa, la o las secuencias de aminoácidos conservadas se pueden detectar en ensayos de hibridación de proteínas que utilizan, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a las secuencias de aminoácidos conservadas, o un sustrato que se une específicamente a las secuencias de aminoácidos conservadas tal como, por ejemplo, un lípido que se une a FLXLXXXN (un dominio de unión de lipidos neutro putativo; SEQ ID N°: 224).
En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una MGAT . La secuencia de nucleotidos puede i) comprender una secuencia seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID N°:l a 44, ii) codificar un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se provee en cualquiera de las SEQ ID N°:45 a 82, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) ser al menos un 50% idéntica a i) o ii), o iv) hibridizarse con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas. En otra forma de realización o en una forma adicional, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos conservadas de DGAT2 y/o MGAT1/2 provistas en las SEQ ID N°:220, 221, 222, 223, y 224. En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica las secuencias de aminoácidos conservadas provistas en la SEQ ID N°:220 y/o en la SEQ ID N°:224.
En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una GPAT, preferentemente una GPAT con actividad fosfatasa.
La secuencia de nucleótidos puede i) comprender una secuencia seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID N°:84 a 141, ii) codificar un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se provee en cualquiera de las SEQ ID N°:144 a 201, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) ser al menos un 50% idéntica a i) o ii), o iv) hibridizarse con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas. En otra forma de realización o en una forma adicional, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos conservadas de GPAT provistas en las SEQ ID N°: 225, 226, y 227, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50%, preferentemente al menos un 60%, más preferentemente al menos un 65% idéntica a las mismas.
En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una DGAT2. La secuencia de nucleótidos puede i) comprender una secuencia de nucleótidos seleccionada entre cualquiera de las SEQ ID N°:204 a 211, ii) codificar un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se provee en cualquiera de las SEQ ID N°:212 a 219, o un fragmento biológicamente activo de la misma, iii) ser al menos un 50% idéntica a i) o ii), o iv) hibridizarse con cualquiera de i) a iii) bajo condiciones severas. En una forma de realización preferida, la DGAT2 comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 204 y/o una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende aminoácidos cuya secuencia se provee en la SEQ ID N°: 212.
Se puede obtener una célula que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una aciltransferasa de ácidos grasos ligada operativamente a un' promotor que es activo en la célula usando procedimientos estándar en el arte tal como por introducción de la molécula de ácido nucleico en una célula, por ejemplo, mediante precipitación por fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol , electroporación y combinaciones de estos tratamientos. También se pueden usar otros métodos de transformación de células e incluyen, pero en un sentido no limitativo, la introducción de ADN en plantas por transferencia o inyección directa de ADN. Las células vegetales transformadas también se pueden obtener usando transferencia mediada por ñgrobacteríu y los métodos de aceleración que se describen en la presente.
El método comprende además determinar si el nivel de MAG, DAG y/o TAG producido en la célula está incrementado en comparación con una célula correspondiente que no contiene al ácido nucleico usando técnicas conocidas en el arte, tales como los e emplificados en el Ejemplo 1. Por ejemplo, los lipidos se pueden extraer en una solución de cloroformo/metanol, secar y separar por cromatografía en capa delgada (TLC) . Las identidades de TAG, DAG, MAG, ácidos grasos libres y otros lipidos se pueden verificar usando estándares internos de lipidos después de tinción con vapor de iodo. Los cromatogramas resultantes se pueden analizar usando un equipo Fosforlmager y la cantidad de MAG, DAG y TAG se puede cuantificar sobre la base de la cantidad conocida de estándares internos o, como alternativa, las células pueden ser alimentados con sn-2 monooleoilglicerol [ 14C] o [ 14C] glicerol-3-fos fato y luego se puede cuantificar la radioactividad asociada mediante recuento de centelleo liquido (es decir, se cuantifica la cantidad de MAG, DAG y TAG marcados ) .
El método comprende además identificar una molécula de ácido nucleico que codifica una aciltrans ferasa de ácidos grasos con mayor capacidad para producir MAG, DAG y/o TAG en una célula. En una forma de realización preferida, la aciltrans erasa de ácidos grasos cataliza una reacción enzimática en la vía MGAT . En una forma de realización adicional preferida, DAG aumenta debido a la vía MGAT (es decir, la acilación de MAG con acilo graso-CoA está catalizada por una MGAT para formar DAG) . En otra forma de realización o en una forma adicional, el sustrato MAG es producido por una GPAT que también tiene actividad fosfatasa y/o DAG es acilado con acilo graso-CoA por una DGAT y/o una MGAT que tiene actividad DGAT para formar TAG.
Brillo Ciertos aspectos de la invención se relacionan con la medida del brillo del material vegetativo como un marcador del nivel de lipidos en el material, con mayores niveles de brillo estando asociados con mayores niveles de lipidos.
El brillo del material vegetativo se puede determinar usando procedimientos conocidos. Los medidores de brillo ( reflectometros ) proveen una manera cuantificable de medir la intensidad del brillo asegurando consistencia en la medida definiendo la iluminación precisa y condiciones de observación. La configuración de la fuente de iluminación y ángulos de recepción de observación permite la medida en un pequeño rango del ángulo de reflexión completo. Los resultados de la medida de un medidor de brillo están relacionados con la cantidad de luz reflejada de un estándar de vidrio negro con un índice de refracción definido. La relación de la luz reflejada por el espécimen a la luz incidente, en comparación con la relación para el estándar de brillo, se registra como unidades de brillo.
La escala de medida, Unidades de Brillo (GU, del inglés Gloss Units) , de un medidor de brillo es una escala basada en un estándar de vidrio negro de referencia altamente pulido con un índice de refracción definido que tiene una reflectancia especular de 100GU en un ángulo especifico. Este estándar se usa para establecer un punto superior de calibración de 100 con el punto extremo inferior establecido a 0 en una superficie perfectamente mate. Esta escala es adecuada para la mayoría de los materiales no metálicos.
El nivel óptimo o esperado de brillo del material vegetativo es probable que varíe entre las especies de plantas. La persona con experiencia puede analizar fácilmente el contenido de lipidos del material vegetativo de diferentes plantas de la invención e identificar un nivel adecuado predeterminado de brillo que se puede usar como estándar en el campo para evaluar el mejor tiempo para cosechar un material vegetativo de una especie vegetal particular.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Materiales y métodos generales Expresión de genes en células vegetales en un si stema de expresión transitorio Los genes se expresaron en células vegetales usando un sistema de expresión transitorio esencialmente como fue descrito por Voinnet et al., (2003) y Wood et al., (2009) . Se introdujeron vectores binarios que contienen a la región de codificación a expresar por un fuerte promotor constitutivo e35S que contiene una región potenciadora duplicada en la cepa AGL1 de Agrobacterium turnefaciens . Además se introdujo por separado el vector binario quimérico, 35S:pl9, para la expresión del supresor por silenciamiento viral pl 9 en AGL1, como se describe en WO2010/057246. Separadamente se introdujo un vector binario quimérico, 35S:V2, para la expresión del supresor por silenciamiento viral V2 en AGL1. Las células recombinantes se cultivaron hasta la fase estacionaria a 28°C en caldo LB suplementado con kanamicina 50 mg/1 y rifampicina 50 mg/l. Las bacterias se agruparon luego en pélets por centrifugación a 5000 g durante 5 min a temperatura ambiente antes de resuspenderlas hasta una DO600 = 1,0 en una infiltración solución amortiguadora que contiene MES 10 mM pH 5.7, MgC12 10 mM y acetosiringona 100 µ?. Las células se incubaron luego a 28°C con agitación por 3 horas después de lo cual se midió la DO600 y se agregó un volumen de cada cultivo, incluyendo la construcción del supresor viral 35S:pl9 o 35S:V2, necesario para alcanzar una concentración final de DO600 = 0,125 en un tubo limpio. El volumen final se conformó con la solución amortiguadora anterior. Luego se infiltraron ho as con la mezcla de cultivo y las plantas se cultivaron típicamente por otros tres a cinco días después de la infiltración antes de recuperar discos de ho a para la preparación de lisados celulares purificados o para el aislamiento de lípidos totales.
Ensayo con Usados de hojas purificados Se molieron tejidos foliares de Nicotiana benthamiana infiltradas previamente como se describió previamente en una solución que contiene solución amortiguadora de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,2) y sacarosa 0,33 M usando un homogeneizador de vidrio. El homogenato de hojas se centrifugó a 20.000 g durante 45 minutos a 4°C después de lo cual se recolectó cada sobrenadante. El contenido de proteínas en cada sobrenadante se midió de acuerdo con el método Bradford (1976) usando un contador multi-marca Wallacl420 y un reactivo colorante para ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Los ensayos con aciltransferasa emplearon 100 µ? de proteína de acuerdo con Cao et al., (2007) con algunas modificaciones. El medio de reacción contenía Tris-HCl 100 mM (pH 7,0), MgC12 5 mM, BSA 1 mg/ml (ácidos grasos, libres), sacarosa 200 mM, oleoil-CoA frío 40 mM, sn-2 monooleoilgllcerol [ 14C] 16,4 µ? (55 mCi/mmol, American Radiochemicals, Saint Louis, MO, EE.UU.) o [14C] glicerol-3-fosfato (G-3-P) sal disódica 6,0 µ? (150 mCi/mmol, American Radiochemicals). Los ensayos se condujeron por 7,5, 15 ó 30 minutos.
Análisis de lípidos En resumen, los métodos que se usaron para analizar lipidos en semillas o tejidos vegetativos fueron como sigue: Semilla de Arabidopsis y cualquier otra semilla de tamaño similar: (i) Composición de ácidos grasos - metilación directa de ácidos grasos en las semillas, sin romper las semillas. (ii) Cuantificación de ácidos grasos totales o TAG -metilación directa de ácidos grasos en las semillas, sin romper las semillas, con uso de un estándar del TAG 17:0.
Semilla de Cañóla, semilla de Camelina, y cualquier otra semilla de tamaño más grandej_ (i) Composición de ácidos grasos de semilla individual - metilación directa de ácidos grasos en la semilla después de romper el recubrimiento de la semilla. (ii) Semillas agrupadas - composición de ácidos grasos de lipidos extraídos totales - rotura de semillas en CHC13/ MeOH y metilación de alícuotas de los lipidos extraídos. (iii) Semillas agrupadas - contenido de lipidos totales (contenido de aceite de semilla) - extracción de lipidos dos veces para recuperación completa de lipidos de semilla después de la rotura de semillas a partir de una cantidad conocida de semillas desecadas, con metilación de lipidos a partir de cantidad conocida de semillas junto con ácidos grasos 17:0 como' estándar interno. (iv) Semillas agrupadas - cuanti ficación de TAG purificados - extracción de lipidos dos veces para recuperación completa de lipidos de semilla después de romper las semillas, a partir de cantidad conocida de semillas desecadas, fraccionamiento de TAG a partir del lipidos usando TLC, y metilación directa de los TAG ín silica usando TAG 17:0 como estándar interno.
Muestras de hoja: (i) Composición de ácidos grasos de lipidos totales -metilación directa de ácidos grasos en muestras secadas por congelación . (ii) Cuanti ficación de lipidos totales - metilación directa de ácidos grasos en peso conocido de muestras secadas por congelación, con FFA17:0. (iii) Cuantificación de TAG - debido a la presencia dé cantidades sustanciales de lipidos polares en las hojas, los TAG se fraccionaron mediante TLC a partir de lipidos totales extraídos, y se metilaron en presencia de TAG 17:0 como estándar interno. Pasos: Secar muestras por congelación, pesar, extraer lipidos, fraccionar TAG a partir de cantidad conocida de lipidos totales, metilación directa de TAG ín silica. junto con TAG 17:0 como estándar interno.
Los métodos se detallan como sigue: Análisis de contenido de aceite en semillas de Arabidopsi s Para determinar el contenido de aceite de semillas en semillas pequeñas tales como semillas de Arabídopsis, se secaron las semillas en un desecador durante 24 horas y se transfirieron aproximadamente 4 mg de semilla a un vial de vidrio de 2 mi con tapa a rosca revestida en Teflón. Se agregó 0,05 mg de triheptadecanoina disuelta en 0,1 mi de tolueno al vial como estándar interno. Se prepararon los FAME de semilla mediante agregado de 0,7 mi de HC1 metanólico 1 N (Supelco) al vial con el material de las semillas. No fue necesario romper las semillas para el caso de las semillas pequeñas tales como las semillas de Arabídopsis . Se pasó la mezcla por vórtex brevemente y se incubó a 80°C durante 2 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agregaron 0,3 mi de NaCl al 0,9% (p/v) y 0,1 mi de hexano al vial y se mezclaron bien durante 10 minutos en un Heidolph Vibramax 110. Se colectaron los FAME en un inserto de vidrio de 0,3 mi y se analizaron mediante GC con un detector de ionización con llama (FID) como se mencionó anteriormente.
Primero se corrigió el área de pico de los FAME individuales en base a la respuesta de área de pico de una cantidad conocida de los mismos FAME presentes en un estándar comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, INC., EE.UU.). El GLC-411 contiene cantidades iguales de 31 ácidos grasos (% en peso), en el rango entre C8:0 y C22:6. En el caso de los ácidos grasos que no estaban presentes en el estándar, se tomaron las respuestas de área de pico de los FAME más similares. Por ejemplo, se usó la respuesta de área de pico de los FAME de 16:ld9 para 16:ld7 y se usó la respuesta del FAME de C22:6 para C22:5. Se usaron las áreas corregidas para calcular la masa de cada FAME en la muestra por comparación con la masa del estándar interno. El aceite se almacena principalmente en forma de TAG y se calculó su peso en base al peso de los FAME. Se determinaron los moles totales de glicerol mediante el cálculo de los moles de cada FAME y dividiendo los moles totales moles de FAME por tres. El TAG se calculó como la suma de grupos glicerol y acil grasos usando una relación: % en peso de aceite = lOOx ( (41x moles totales de FAME/ 3 ) + ( gramos totales de FAME- (15x moles totales de FAME) ) )/g de semilla, en donde 41 y 15 son los pesos moleculares del grupo glicerol y el grupo metilo, respectivamente .
Análisis de contenido de aceite en semillas de Camelina y semillas cañóla mediante extracción Después de cosechar en la madurez de la planta, se desecaron las semillas de Camelina o cañóla mediante almacenamiento de las semillas durante 24 horas a temperatura ambiente en un desecador con gel de sílice como desecante. El contenido de humedad de las semillas típicamente es de entre 6 y 8%. Se extrajeron los lípidos totales a partir de pesos conocidos de las semillas desecadas mediante rotura de las semillas usando una mezcla de cloroformo y metanol ¡2/1 v/v) en un tubo eppendorf usando un lisador de tejido Reicht (22 frecuencias/segundo durante 3 minutos) y una bola de metal. Se agregó un volumen de KC1 0,1 M y se agitó la mezcla durante 10 minutos. Se colectó la fase no polar inferior después de centrifugar la mezcla durante 5 minutos a 3000 rpm. Se lavó la fase superior remanente (acuosa) con 2 volúmenes de cloroformo mezclando durante 10 minutos. También se colectó la segunda fase no polar y se juntó con la primera. Se evaporó el solvente de los lípidos en el extracto bajo flujo de nitrógeno y se disolvieron los lipidos totales secos en un volumen conocido de cloroformo.
Para medir la cantidad de lípidos en el material extraído, se agregó una cantidad conocida de 1 : 0-TAG como estándar interno y se incubaron los lípidos de la cantidad conocida de semillas en HC1 metanólico 1 N (Supelco) durante 2 horas a 80oC. Los FAME hechos de ese modo se extrajeron en hexano y se analizaron mediante GC. Se cuanti ficaron los FAME individuales en base a la cantidad de 17:0 TAG-FAME. Se convirtieron los pesos de los FAME individuales, después de la resta de los pesos de los grupos metilo esterificados de los FAME, a moles mediante la división por los pesos moleculares de los FAME individuales. Se dividieron los moles totales de todos los FAME por tres para calcular los moles de TAG y por lo tanto de glicerol. Luego, se convirtieron los moles de TAG a peso de TAG. Finalmente, se calculó el porcentaje de contenido de aceite en base al peso de la semilla usando los pesos de las semillas, asumiendo que todos los lípidos extraídos son TAG o equivalentes a TAG con el propósito del cálculo del contenido de aceite. Este método se basó en Li et al., (2006) . También se pueden analizar mediante este método semillas distintas a las semillas de Camelina o cañóla que son de un tamaño similar.
También se puede medir el contenido de aceite de semillas de cañóla o de otras mediante técnicas de resonancia magnética nuclear (Rossell y Pritchard, 1991), por ejemplo, mediante un NMS 100 Minispec de onda pulsátil (Bruker Pty Ltd Scientific Instruments, Alemania), o mediante espectroscopia de reflectancia infrarroja cercana tal como usando un monocromador NIRSystems Model 5000. El método de NMR puede medir en forma simultánea el contenido de humedad. El contenido de humedad también se puede medir en una muestra a partir de un lote de semillas secando las semillas de la muestra durante 18 horas a aproximadamente lOOoC, de acuerdo a Li et al . , (2006) .
Cuando se determina la composición de ácidos grasos para el aceite de la semilla de cañóla, también se puede usar el método de metilación directa que se usó previamente para Arabídopsis (véase anterior), modificado con el agregado de la ruptura del recubrimiento de la semilla de cañóla. Este método extrae suficiente aceite de la semilla para permitir el análisis de composición de ácidos grasos.
Análisis de los lipidos de los ensayos de Usados de hojas Los lipidos de los ensayos con Usados se extrajeron usando cloroformo : metanol : KC1 0,1 M (2:1:1) y se recuperaron. Las diferentes clases de lipidos presentes en las muestras se separaron sobre placas de cromatografía en capa delgada (TLC) de gel de sílice 60 (MERCK, Dermstadt, Alemania) impregnadas con ácido bórico 10%. El sistema de solventes usado para fraccionar TAG del extracto de lipidos consistía de cloroformo/acetona (90/10 v/v) . Las clases individuales de lipidos se visualizaron por exposición de las placas a vapor de iodo y se identificaron corriendo estándares auténticos en paralelo sobre la misma placa de TLC. Las placas se expusieron a pruebas de obtención de imágenes con fósforo durante la noche y se analizaron con un equipo Fosforimager Fujifilm FLA-5000 antes del recuento de centelleo líquido para la cuanti ficación del DPM.
Aislamiento y fraccionamiento de lipidos totales Los tejidos incluyendo las muestras de hojas se secaron por congelación, se pesaron (peso seco) y se extra eron los lípidos totales como se describe en Bligh y Dyer (1959) o mediante el uso de cloroformo: metanol : KC1 0,1 M (CMK; 2:1:1) como solvente. Se extrajeron los lipidos totales a partir de muestras de N. benthamiana, después del secado por congelación, mediante agregado de 900 µ?? de una mezcla cloroformo/metanol (2/1 v/v) por cada 1 era de diámetro de muestra de hoja. Se agregaron 0,8 µg de DAGE por cada 0,5 mg de peso de hoja seca como estándar interno cuando se llevó a cabo el análisis por TLC-FID. Se homogenei zaron las muestras usando un lisador de tejido IKA ultra-turrax después de lo cual se agregaron 500 pL de C1 0,1 M. Se agitaron las muestras con vórtex, se centrifugaron durante 5 minutos y se colectó la fase inferior. Se extrajo la fase superior remanente una segunda vez mediante el agregado de 600 L de cloroformo, agitación con vórtex y centrifugación durante 5 minutos. Se recuperó la fase inferior y se untó con lo recolectado previamente. Se secaron los lipidos bajo un flujo de nitrógeno y se resuspendieron en 2 L de cloroformo por cada mg de peso de hoja seca. Se extrajeron los lipidos totales de hojas o de muestras de hojas de N. tabacum como se hizo previamente con algunas modificaciones. Cuando se combinaron 4 o 6 discos de ho a (cada uno de aproximadamente 1 cm2 de área superficial), se usó 1,6 mi de solvente de CMK, mientras que cuando se combinaron 3 o menos discos de hoja, se usó 1,2 mi de CMK. Se homogeneizaron los tejidos de hojas secados por congelación en un tubo eppendorf conteniendo una bolita metálica usando un lisador de tejidos Reicht (Qiagen) durante 3 minutos a 20 frecuencias/segundo.
Separación de lipidos neutros a través de TLC y transmetilación Se cargaron volúmenes conocidos de extractos totales de hoja tales como, por ejemplo, 30 L, en una placa de TLC de gel de sílice 60 (1x20 cm) (Merck KGaA, Alemania). Se separaron los lipidos neutros a través de TLC en un tanque de desarrollo equilibrado conteniendo un sistema de solventes de hexano/DEE/ácido acético (70/30/1 v/v/v/ ) . Las bandas de TAG se visualizaron mediante vapor de iodo, se rasparon de la placa de TLC, se transfirieron a viales de GC de 2 mi y se secaron con N2. Se agregaron 750 L de HC1 metanólico 1N (Supelco analytical, EE.UU.) a cada vial junto con una cantidad conocida de C17:0 TAG, tal como, por ejemplo, 30 iq, como estándar interno para la cuanti ficación .
Para analizar el efecto sobre los niveles de ácido oleico de las combinaciones de genes específicos, se colectaron las bandas de TAG y de lipidos polares a partir de las placas de TLC. Luego, se agregaron 15 \iq de estándar interno de C17:0 a las muestras tales como las muestras de TAG, las muestras de lípidos polares y 20 i de los extracto lipidíeos totales. Después de secar bajo N2, se agregaron 70 µ?, de tolueno y 700 µ?, de HCl metanolico.
Se transmetilaron las muestras de lípidos para el análisis de composición de ácidos grasos mediante GC, mediante incubación de las mezclas a 80°C durante 2 horas en presencia del HCl metanolico. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente, se detuvo la reacción mediante agregado de 350 µ? de H20. Se extra eron los esteres metílicos de ácidos grasos ( FAME ) de la mezcla mediante agregado de 350 µ? de hexano, mezclado con vórtex y centrifugación a 1700 rpm durante 5 minutos. Se colectó la fase superior de hexano y se transfirió a viales de GC con insertos cónicos de 300 µ? . Después de la evaporación, se resuspendieron las muestras en 30 µ? de hexano. Se inyectó un µ? en el GC .
Se cuantificó la cantidad de ácidos grasos individuales y totales (TFA) presentes en las fracciones lipídicas mediante GC mediante la determinación del área bajo cada pico y se calculó mediante comparación con el área de pico de la cantidad conocida de estándar interno. Se calculó el contenido de TAG en la hoja como la suma de grupos glicerol y acil grasos en la fracción de TAG usando una relación: % TAG en peso = 100x ((41x moles totales de FAME/3) + (gramos totales de FAME- (15x moles totales de FAME) ))/g de peso seco de hoja, en donde 41 y 15 son los pesos moleculares del grupo glicerol y el grupo metilo, respectivamente.
Cromatografía gas-liquida capilar (GC) Se analizaron los FAME mediante GC usando un GC Agilent Technologies 7890A (Palo Alto, California, EE.UU.) equipado con una columna SGE BPX70 (70% cianopropil polisilfenileno-siloxano) (30 m x 0,25 mm de d.i., 0,25 µp? de espesor de película), un FID, un inyector con divisor/sin divisor y un automuestreador e inyector Agilent Technologies 7693 Series. Se usó helio como gas transportador. Se inyectaron las muestras en modo con divisor (proporción 50:1) a una temperatura de horno de 150°C. Después de la inyección, se mantuvo la temperatura del horno a 150°C durante 1 minuto, luego se elevó a 210°C a 3°C.minuto-l y finalmente a 240°C a 50°C . minuto-1. Se cuanti ficaron los picos con el programa Agilent Technologies ChemStation (Rev B0,40,3 (16), Palo Alto, California, EE.UU.) en base a la respuesta de la cantidad conocida del estándar externo GLC-411 (Nucheck) y del estándar interno C17:0-Me.
Cuantificación de TAG a través de Iatroscan cargó un \iL de extracto lipídico en un Chromarod-SI I para TLC-FID IatroscanTM (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japón) . Luego se transfirió el anaquel Chromarod a un tanque de desarrollo equilibrado con 70 mi de un sistema de solventes de hexano/CHC13/2-propanol/ácido fórmico (85/10,716/0,567/00,567 v/v/v/v). Después de una incubación de 30 minutos, se secó el anaquel Chromarod durante 3 minutos a 100°C y se barrió inmediatamente en un analizador Iatroscan M -6s TLC-FID (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japón) . Se integraron las áreas de pico del estándar interno de DAGE y de los TAG usando el programa de integración SIC-480II (Versión : 70 , -E SIC System instruments Co . , LTD - Japón).
La cuanti ficación de los TAG se llevó a cabo en dos pasos. Primero, se barrió el DAGE en todas las muestras para corregir los rendimientos de extracción después de los cual se seleccionaron y diluyeron las muestras de TAG concentrados. Luego, se cuanti ficaron los TAG en las muestras diluidas con un segundo barrido de acuerdo a la calibración externa usando trilinoleato de glicerilo como estándar externo ( Sigma-Aldrich) .
Cuantificación de TAG en muestras de hojas mediante GC Primero se corrigieron las áreas de pico de los FAME individuales en base a las respuestas de área de pico de cantidades conocidas de los mismos FAME presentes en un estándar comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, Inc., EE.UU.) . Las áreas corregidas se usaron para calcular la masa de cada FAME en la muestra por comparación con el estándar interno. Debido a que el aceite se almacena primariamente en forma de TAG, se calculó la cantidad de aceite en base a la cantidad de FAME en cada muestra. Se determinaron los moles totales de glicerol mediante el cálculo del número de moles de FAME y dividiendo los moles totales de FAME por tres. Se calculó la cantidad de TAG como la suma de los grupos glicerol y acil graso usando la fórmula: % en peso de aceite = lOOx ((41x moles totales de FAME/3) + (gramos totales de FAME-(15x moles totales de FAME)) )/g de peso seco de hoja, en donde 41 y 15 fueron los pesos moleculares del grupo glicerol y el grupo metilo, respectivamente.
Ensayo con DGAT en H1246 de Saccharomyees cerevisiae La cepa H1246 de Saccharomyces cerevisiae carece por completo de actividad DGAT y no contiene TAG ni ásteres de esterol como resultado de mutaciones de noqueo en cuatro genes ( DGA1 , LROl, ARE1, ARE2 ) . La adición de ácidos grasos libre (por e emplo 1 mM 18.1?9) al medio de crecimiento de H1246 es tóxica en ausencia de actividad DGAT. El crecimiento sobre dicho medio se puede usar entonces como un indicador o selección de la presencia de actividad DGAT en esta cepa de levadura .
Se transformó la cepa H1246 de S cerevisiae con la construcción pYES2 (control negativo), una construcción que codifica la DGAT1 de Arabidopsis thaliana en el pYES2, o una construcción que codifica la MGAT2 de Mus musculus en pYES2. Los transformantes fueron alimentados con [14C]18:lñ9 ácidos grasos libres.
En un experimento separado, se transformó la cepa H1246 de S cerevisiae con la construcción pYES2 (control negativo), una construcción que codifica la DGAT1 de Bernadia pulchella en el pYES2 o una construcción que codifica la MGAT1 de M. musculus en el pYES2 y fue alimentada con 18:1?9 ácidos grasos libres. La cepa S288C de S. cerevisiae de tipo salvaje transformada con el pYES2 sirvió como control positivo.
Los transformantes de levadura se resuspendieron en agua mQ estéril y se diluyeron hasta una DO600 = 1. Las muestras se diluyeron luego en cuatro diluciones consecutivas, cada una 1/10. Se sembraron 2 µ? de cada dilución sobre cada una de las placas (YNBD, YNBG, YNBG+FA) unto con 2 µ? de agua mQ y 2 µ? de una suspensión de células H1246 no transformadas (DO600 = 1). Las placas se incubaron durante 6 días a 30°C antes de calificar el crecimiento.
Medio de placas, 40 mi de medio por placa •YNBD: medio mínimo selectivo [dropout] sin uracilo y que contiene 2% de glucosa, 0,01% de NP40 y 100 µ? de etanol.
•YNBG: medio mínimo selectivo [dropout] sin uracilo y que contiene 2% de galactosa, 1% de rafinosa, 0,01% de NP40 y 100 µ? de etanol.
•YNBG+FA: medio mínimo [dropout] sin uracilo y que contiene 2% de galactosa, 1% de rafinosa, 0,01% de NP40 y C18:lñ9 1 mM disuelto en 100 µ? de etanol.
Ejemplo 2. Expresión constitutiva de una monoacilglicerol aciltransferasa en células vegetales MGAT1 Se demostró la actividad enzimática de la monoacilglicerol aciltransferasa 1 (MGAT1) codificada por el gen de M. musculus (Yen et al., 2002) y de la diacilglicerol aciltransferasa (DGAT1) de A. thaliana ( Bouvier-Nave et al., 2000), usada aquí para su comparación con la MGAT1, en te ido foliar de N. benthamíana usando un sistema de expresión transitorio según se describió en el Ejemplo 1.
Se elaboró un vector denominado 35S-pORE04 por inserción de un fragmento Psfcl que contiene un promotor 35S en el sitio Sfo del vector pORE04 después de un tratamiento con la T4 ADN polimerasa para obtener extremos adhesivos (Coutu et al., 2007). Se sintetizó un ADN quimérico que codifica la MGAT1 de M. musculus, de codones optimizados para Brassica napusr mediante Geneart y se denominó 0954364_MGAT_pMA. Se elaboró un ADN quimérico denominado 35S:MGAT1 y que codifica la MGAT1 de M. musculus (Genbank, N° Acceso Q91ZV4) para expresión en células vegetales por inserción de la región de codificación completa de 0954364_MGAT_pMA, contenido en un fragmento EcoKL, en 35S-pORE04 en el sitio EcoKl . El vector que contiene a la construcción 35S:MGAT1 se denominó pJP3184. De manera similar, se elaboró un ADN quimérico 35S:DGAT1 que codifica la DGAT1 de A. thaliana (Genbank, N° Acceso AAF19262) para expresión en células vegetales, por inserción de la región de codificación completa de pXZP513E, contenido en un fragmento BamUI-EcoRV, en 35S-pORE04 en el sitio Barritil -EcoRV. El vector que contiene a la construcción 35S:DGAT1 se denominó pJP2078.
Los vectores quiméricos se introdujeron en la cepa AGL1 de ?. turnefacíens y las células de los cultivos de la misma se infiltraron en tejido foliar de plantas de N. benthamiana en un cuarto de crecimiento a 24°C. Con el fin de permitir comparaciones directas entre muestras y para reducir la variación entre hojas, las muestras comparadas eran infiltradas de cada lado de la misma hoja. Los experimentos se condujeron por triplicado. Después de la infiltración, las plantas se cultivaron por otros tres días antes de recolectar discos de hoja, secarlos por congelamiento y los lipidos que se extrajeron de las muestras se fraccionaron y cuantificaron según se describió en el Ejemplo 1. Este análisis reveló que los genes de MGAT1 y de DGAT1 funcionaban aumentando los niveles de aceite en las hojas de N. benthamiana de la siguiente manera.
El tejido foliar transformado con la construcción 35S:pl9 solamente (control negativo) contenia un promedio de 4 µ? de ácidos grasos libres (FFA) derivados de DAG/mg de peso seco de hojas y 5 de FFA derivados de TAG/ mg de peso seco de hojas. El tejido foliar transformado con las construcciones 35S:pl9 y 35S:DGAT1 (control para la expresión de DGAT1 ) contenía un promedio de 4 µg de FFA derivados de DAG/mg de peso seco de hojas y 22 µg de FFA derivados de TAG/mg de peso seco de hojas. El tejido foliar transformado con las construcciones 35S:pl9 y 35S:MGAT1 contenía un promedio de 8 µg de FFA derivados de DAG/mg de peso seco de hojas y 44 µq de FFA derivados de TAG/mg de peso seco de hojas. El tejido foliar transformado con las construcciones 35S:pl9, -35S:DGAT1 y 35S:MGAT1 no contenía niveles de DAG o de TAG mayores que los observados en la infiltración con 35S:pl9 y 35S:MGAT1 (Figura 2). Además, se notó una disminución en el nivel de saturados en semillas después de la expresión de MGAT en comparación con ya sea el control pl9 o las muestras DGAT1 (Tabla 2) .
Los datos descritos previamente demostraban que la enzima MGAT1 era mucho más activa que la enzima DGATl en la promoción de la acumulación de ambos DAG y TAG en el tejido foliar. La expresión del gen de MGAT1 dio como resultado el doble de acumulación de DAG y TAG en el tejido foliar en comparación con la expresión de DGATl. Este resultado era muy sorprendente e inesperado, considerando que la MGAT es una enzima que se expresa en intestino de ratón, un sistema biológico muy diferente de las hojas vegetales. Este estudio era la primera demostración de expresión ectópica de MGAT en una célula vegetal.
Las muestras de hoja infiltradas con MGAT1 de M. musculus acumularon el doble de DAG y TAG con relación al tejido foliar infiltrado solamente con la DGATl de A. thaliana . La eficiencia de la producción de TAG también fue sorprendente e inesperada dado que la MGAT de ratón sólo tiene una actividad muy baja como DGAT . El tejido foliar infiltrado con genes que codifican ambas MGAT1 y DGATl no acumularon significativamente más TAG que la muestra de hojas de MGAT1 solamente. La Figura 1 es una representación de diversas vías de acumulación de TAG, la mayoría de las cuales convergen en DAG, una molécula central en la síntesis de lípidos. Por ejemplo, MAG, DAG y TAG se pueden interconvertir a través de diversas actividades enzimáticas incluyendo transacilación, lipasa, MGAT, DGAT y PDAT. Se notó asimismo una disminución en el nivel de saturados después de la expresión de MGAT.
MGAT2 Se elaboró un ADN quimérico denominado 35S:MGAT2 y que codifica la MGAT2 de M. musculus para expresión en células vegetales por inserción de la región de codificación completa de MGAT2, contenido en un fragmento EcoRI, en 35S-pORE04 en el sitio EcoRI. La actividad enzimática de la monoacilglicerol aciltrans ferasa 2 (MGAT2) codificada por el gen de M. musculus (Yen, 2003) (Genbank, N° Acceso Q80W94) y DGAT1 de A. th li n ( Bouvier-Nave et al., 2000), usada aqui para su comparación con la MGAT2, se demostró también en te ido foliar de N. benthamiana usando un sistema de expresión transitorio según se describió en el Ejemplo 1.
En comparación con los controles, la expresión de DGAT1 incremento el TAG en hojas en 5,9 veces, la MGAT2 en 7,3 veces y la combinación de MGAT2+DGAT1 en 9,8 veces (Figura 3). La capacidad de la MGAT2 sola para obtener tales incrementos significativos en TAG era inesperada por numerosas razones. En primer lugar, se sabe que la cantidad de sustrato MAG presente en el tejido foliar es baja y no serian esperables grandes . incrementos en la acumulación de TAG de este sustrato. En segundo lugar, se esperaría que la adición de actividad MGAT solamente (es decir, adición de MGAT2 sin actividad DGAT) solamente diera como resultado DAG, no TAG, en especial en un entorno foliar donde habitualmente hay poca actividad DGAT nativa.
Discusión Los inventores de la presente han demostrado sorprendentemente que la expresión transgénica de un gen MGAT da como resultado incrementos significativos en el rendimiento de lipidos en células vegetales. Los inventores de la presente entienden que Tumaney et al. Han aislado una DGAT con alguna actividad MGAT y que no tuvieron éxito en sus intentos por clonar un gen que codificara una MGAT según se define en la presente. Tumaney et al., (2001), informaron actividad MGAT en mani y aislaron una enzima responsable de esta actividad. Sin embargo, Tumaney et al. No publicaron los resultados de las pruebas de actividad DGAT y por ello parece que la enzima informada era una DGAT con alguna actividad MGAT. Aún más, en trabajos anteriores no se pudo identificar ninguna actividad MGAT en otras especies (Stobart et al., 1997) . Además, era sorprendente que la enzima aislada por Tumaney et al. Era una enzima soluble, citosólica, en lugar de una enzima unida a membrana.
Recientemente, unos investigadores han identificado una monoacilglicerol aciltrans ferasa microsomal (MGAT) unida a membrana de semillas de maíz inmaduro (Arachis hypogaea) . La MGAT se pudo solubilizar a partir de membranas microsomales usando una combinación de un agente caotrópico y un detergente zwiteriónico, y se pudo aislar y caracterizar un complejo multiproteico 14S funcionalmente activo. Se identificó a oleosina3 (0LE3) como parte del complejo multiproteico, la cual es capaz de llevar a cabo actividades bifuncionales tales como acilar monoacilglicerol (MAG) a diacilglicerol (DAG) y de fosfolipasa A2 (PLA2; Parthibane et al. , 2012) .
Ejemplo 3.
Demostración bioquímica de la actividad MGAT transgénica en extractos de hojas Se obtuvieron Usados celulares de tejido foliar de N. benthamiana que había sido infiltrado con 35S:MGAT1, 35S:MGAT2 y 35S:DGAT1, según se describió en el Ejemplo 1. Se condujeron infiltraciones separadas de hojas, cada una por triplicado, para cepas que solamente contienen la construcción 35S:pl9 (control negativo), la cepa 35S:MGAT2 junto con la cepa 35S:pl9 y una mezcla de las cepas 35S:MGAT2 y 35S:DGAT1 de Agrobacteriu con la cepa 35S:pl9. Se cosecharon muestras por triplicado después de tres días y se preparó un lisado celular purificado preparado lisis mecánica del tejido y centrifugación. Las actividades MGAT de los lisados celulares purificados se compararon alimentándolos con [14C]MAG según se describió en el Ejemplo 1. Los datos se muestran en la Figura 4.
Se observó poca actividad MGAT en la muestra control 35S:pl9, dado que la mayor parte de la radioactividad permanecía en MAG durante todo el ensayo. Por el contrario, la mayoría del MAG marcado en la muestra 35S:MGAT2 era convertido rápidamente en DAG (Figura 4, panel central), lo cual era indicativo de una fuerte actividad MGAT expresada por la construcción 35S:MGAT2. Además, también se produjo una cantidad significativa de TAG. La producción de TAG observada en la muestra 35S:MGAT2 probablemente se debía a la actividad DGAT nativa de N. benthamiana, o era producido por otra ruta de síntesis de TAG. La cantidad de TAG producida aumentaba mucho con la adición de 35S:DGAT1 (Figura 4, panel derecho), lo cual indica que la enzima MGAT2 produjo DAG que era accesible para su conversión en TAG por la DGAT1 en tejidos vegetales vegetativos.
Ejemplo 4.
Demostración bioquímica de la producción de MAG accesible para MGAT en extractos de hojas En los ensayos in vítro que se describen en el Ejemplo 3 usando lisados de hojas, los sustratos (sn-2 MAG y oleoil-CoA) eran suministrados exógenamente, en tanto la actividad MGAT in vivo en tejidos vegetales intactos requerirán la presencia nativa de estos sustratos. La presencia de niveles bajos de MAG en diversos tejidos vegetales ya fue descrita previamente (Hirayama y Hujii, 1965; Panekina et al., 1978; Lakshminarayana et al., 1984; Perry & Harwood, 1993). Para evaluar si la MGAT2 tenia acceso al MAG producido por las vías nativas de las plantas, se repitió el experimento anterior pero esta vez se alimentó [14CJG-3-P a los Usados. Los datos resultantes se muestran esquemáticamente en la Figura 5.
Se observó producción de MAG marcado en todas las muestras, lo cual indica la producción de novo de MAG a partir de G-3-P en los lisados de hojas. También se observaron los productos marcados, DAG y TAG, en todas las muestras aunque eran relativamente bajos en la muestra control 35S:pl9, lo cual indica que la producción de estos lípidos neutros por la vía Kennedy endógena era relativamente ba a en esta muestra. Por el contrario, la mayor parte de la marca en las muestras de MGAT2 y MGAT2 + DGAT1 apareció en las agrupaciones de DAG y TAG, lo cual indica que la MGAT agregada exógenamente catalizaba la conversión del MAG producido a partir del G-3-P marcado por una vía nativa de la planta .
Los ejemplos 2 a 4 demuestran diversos puntos clave: 1) El tejido foliar puede sintetizar MAG a partir de G-3-P de manera tal que el MAG es accesible para una MGAT exógena expresada en el tejido foliar; 2) Aún una MGAT que deriva de intestino de mamífero puede funcionar en tejidos vegetales, en los cuales no habría una MGAT endógena, lo que requiere de una interacción exitosa con otros factores de plantas relacionados con la síntesis de lípidos; 3) El DAG producido por la actividad MGAT exógena se encuentra accesible para una DGAT vegetal o una DGAT exógena, para producir TAG; y 4) la expresión de una MGAT exógeno puede dar niveles muy incrementados de TAG en tejidos vegetales, siendo dichos niveles al menos tan elevados como los obtenidos con la expresión de la DGATl exógena de A. thaliana .
Ejemplo 5. Expresión de DGATl, MGA 1 y MGAT2 en levadura Se construyeron vectores de expresión quiméricos de levadura por inserción de genes que codifican la DGATl de A. thaliana, MGAT1 de M. musculus y MGAT2 de M. musculus en el vector pYES2 para obtener pYES2: DGATl, pYES2:MGATl y pYES2:MGAT2. Estas construcciones fueron transformadas en la cepa H1246 de Saccharomyces cerevisiae que carece por completo de actividad DGAT y no contiene TAG ni ésteres de esterol como resultado de mutaciones de noqueo en cuatro genes (DGA1, LR01, ARE1, ARE2 ) . La cepa H1246 de levadura tiene la capacidad para sintetizar DAG a partir de ácidos grasos agregados exógenamente, pero no puede convertir el DAG en TAG debido a las mutaciones de noqueo. Los cultivos de levadura transformados fueron alimentados con [14C]18:lñ9 antes que se extrajeran y fraccionaran los lipidos totales por TLC según se describió en el Ejemplo 1. En la Figura 6 se muestra un autorradiograma de una placa de TLC representativa.
Se observó formación de TAG, indicativo de la presencia de actividad DGAT, en las células de levadura que contienen DGAT1 (control positivo) y la MGAT1 de mamífero, pero no en las células que contienen a la MGAT2 codificada por la región codificante de M. musculus nativa. Se concluyó que la MGAT1 de ratón también tenía actividad DGAT en células de levadura, y por ello funcionaba como una enzima de función doble MGAT/DGAT, en tanto MGAT2 no presentaba una actividad DGAT detectable y por ello solamente era una MGAT . Una construcción que incluyó una región codificante de MGAT2 que estaba optimizada por codones para su expresión en levaduras exhibió actividad MGAT (producción de DAG) cuando se probó in vítro usando microsomas de levadura y sustrato de MAG marcado, mientras que una construcción similar que estaba optimizada por codones para expresión en B. napus no mostró producción de DAG en los microsomas de levadura. Este experimento mostró el beneficio de la optimización por codones para el organismo en el que se van a expresar las regiones codificantes heterólogas.
Ejemplo 6. Expresión de una monoacilglicerol aciltransferasa en plantas, semillas y hongos Expresión de MGATl en semillas de Axrabtdopsls thaliana Se usó un gen que codifica MGATl M. musculus y se encuentra bajo el control de un promotor especifico de semillas (FP1, un promotor de napina truncado de Brassica napus) para generar plantas y semillas de la progenie transformadas de forma estable de A. thaliana . El vector denominado pJP3174 se obtuvo por inserción de un fragmento Salí que contiene un sitio EcoRI flanqueado por el promotor FP1 y la señal de poliadenilación de lectina de Glycíne max en el sitio Sall-Xhol del vector pCW141. El vector pCW141 también contenía un GFP dirigido por FP1, interrumpido por intrón, secretado por semillas como gen marcador rastreable. El gen quimérico denominado FP1 :MGAT1-GFP se obtuvo por inserción de la región de codificación completa de la construcción 0954364_MGAT_pMA, contenida en un fragmento EcoKL, en el pJP3174 en el sitio EcoRI, generando así el pJP3179. Este vector quimérico se introdujo en la cepa AGL1 de A. tumefacíens y las células del cultivo del Agrobacterium transformado se usó para tratar plantas de A. thaliana (ecotipo Columbia) usando el método de inmersión floral para la transformación (Clough y Bent, 1998) . Después de la maduración, las semillas de las plantas tratadas se visualizaron bajo un microscopio de disección Leica MZFLIII y una lámpara de mercurio 100 ebq. Se aislaron quince semillas transgénicas (fuertemente GFP-positivas) y quince semillas no transgénicas ( GFP-negativas ) y se agrupó cada conjunto. Las agrupaciones GFP-positivas y GFP-negativas se analizaron por su contenido total de ácidos grasos según se describió en el Ejemplo 1. Este análisis proporcionó el contenido promedio y la composición de ácidos grasos para semillas transformadas con la construcción MGAT, pero en una población que puede haber contenido semillas transformadas hemicigotas y homocigotas .
Este análisis reveló que el gen MGAT1 funcionaba aumentando los niveles de aceite de semillas en semillas de ?. thaliana , donde las quince semillas no transgénicas (control, igual que el tipo salvaje) contienen un promedio de 69,4 g de ácidos grasos totales en tanto las quince semillas transgénicas transformadas con el gen GFP, y por ello era probable que contuvieran a la construcción genética FPlrMGATl, contenían un promedio de 71,9 µq de ácidos grasos totales. Esto representaba un aumento del 3,5% en el contenido de aceite con relación al control (tipo salvaje) . El análisis también reveló que el gen MGAT enriquecía las semillas en ácidos grasos poliinsaturados , como se puede ver por la composición de ácidos grasos de los lipidos totales extraídos obtenidos a partir de las semillas. En particular, la cantidad de ALA presentes como un porcentaje de los ácidos grasos totales extraídos de las semillas aumentó del 16,0% al 19,6%. De manera similar, el porcentaje de los ácidos grasos 20:2n6 aumentó del 1,25% al 1,90% y los ácidos grasos 20:3n3 aumentó del 0,26% al 0,51% (Tabla 2).
Tabla 2. Efecto de la expresión de MGAT sobre la composición de ácidos grasos de semillas .
Se condujo un experimento adicional, en donde se modificó el ADN quimérico FP1 :MGAT1-GFP para eliminar el gen GFP. Esta construcción genética, denominado FP1:MGAT1, se transformó en una linea de A. thaliana que era mutante para FAD2. Se determinó el contenido total de ácidos grasos de semillas de T2 de plantas TI resistentes a antibióticos, asi como lineas parentales cultivadas junto con estas plantas, de acuerdo con el Ejemplo 1. Los datos se muestran en la Tabla 3. El promedio de ácidos grasos totales de semillas de las lineas control era de 347,9 g/100 semillas en tanto el promedio en semillas transgénicas era de 381,0 ug/100 semillas. Cuando se excluyeron los datos para la linea control C6 para determinar el promedio, el promedio para los controles era de 370 µg 100 semillas. El contenido de aceite en las semillas transgénicas representaba un aumento de aproximadamente un 3% en términos relativos en comparación con el contenido de aceite en las semillas no transformadas.
Tabla 3. Perfiles de ácidos grasos de semillas transgénicas de Arabidopsis thaliana T2 FP1: GAT1 y control parental y cuantificación de ácidos grasos totales.
Se sustituyó la región codificante del gen MGAT2 de ratón, se optimizó por codones para la expresión de células vegetales, se sustituyó por la región codificante de MGATl en las construcciones que se mencionaron previamente, y se introdujeron en Arabidopsis . Se crecieron treinta plantas de cada linea transgénica (plantas TI y T2, dando origen a las semillas de las generaciones T2 y T3) en el invernadero en una distribución acomodada al azar y se compararon con las plantas control. Las semillas de las plantas transgénicas tuvieron un contenido de aceite incrementado en relación a las semillas control (Figura 7). El porcentaje promedio de TAG de las semillas transgénicas T3 representó un incremento relativo de aproximadamente 8% en comparación con el porcentaje de TAG en las semillas no transformadas (Tabla 4). Se observó un incremento significativo en el nivel de ácidos grasos poliinsaturados en los TAG de las semillas transgénicas, en particular de ALA, y una disminución de los niveles de ácidos grasos saturados tales como ácidos palmitico y esteárico. Más aún, los niveles incrementados de TAG y la composición de ácidos grasos alterada fueron más pronunciados en la generación T3 que en las semillas T2, presumiblemente debido al estado homocigoto del transgen en las semillas T3.
Tabla 4. Niveles de TAG y composición de ácidos grasos en TAG extraídos de semillas T2 y T3 de Arabidopsis thaliana que expresan MGAT2 en comparación con semilla control no transformada ..
Expresión de MGATl en semillas de Brassica napus Se usó el vector FP1: MGATl usado para la expresión de MGATl de M. musculus en semillas de Arabidopsis thaliana para generar plantas transformadas de B. napus. El vector se introdujo en la cepa AGL1 de A. tumefaciens mediante procedimientos estándar de electroporación . Los cultivos se dejaron crecer durante la noche a 28°C en medio LB con agitación a 150 rpm. Las células bacterianas se recolectaron por centrifugación a 4000 rpm durante 5 minutos, se lavaron con medio AB de Winans (Winans, 1988) y se resuspendieron en 10 mi de medio AB de Winans (pH 5,2) y se cultivaron con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (25 mg/1) durante la noche con la adición de acetosiringona 100 µ?. Dos horas antes de la infección de las células de Brassica , se agregó espermidina (120 mg/1) y se ajustó la densidad final de las bacterias hasta una DO 600nm de 0,3-0,4 con medio AB fresco. Se infectaron peciolos de cotiledones recién aislados de plántulas de 8 día de vida de B. napus cultivadas sobre medio 1/2 MS (Murashige-Skoog, 1962) o segmentos de hipocotilo preacondicionado por 3-4 días sobre medio MS con tidiazurón (TDZ) 1 mg/1 + ácido alfa-naftalenacético (NAA) 0,1 mg/1 con 10 mi de cultivos de Agrobacterium durante 5 minutos. Los explantes (peciolo de cotiledón e hipocotilo) infectados con Agrobacterium fueron transferidos luego sobre papel de filtro estéril para eliminar el exceso de Agrobacterium y luego fueron transferidos a medio de cocultivo (medio MS con TDZ 1 mg/1 + NAA 0,1 mg/1 + acetosiringona 100 µ?) suplementado con o sin diferentes antioxidantes (L-cisteina 50 mg/1 y ácido ascórbico 15 mg/1) . Todas las placas se sellaron con Parafilm y se incubaron en oscuridad a 23-24 °C durante 48 horas.
Los explantes cocultivados (peciolo de cotiledón e hipocotilo) se lavaron luego con agua destilada estéril + cefotaxima 500 mg/1 + timentina 50 mg/1 durante 10 minutos, se lavaron en agua destilada estéril durante 10 minutos, se secaron sobre papel de filtro estéril, se transfirieron a medio de preselección (MS + TDZ 1 mg/1 + NAA 0,1 mg/1 + sulfato de adenina (ADS) 20 mg/1 + AgN03 1,5 mg/1 + cefotaxima 250 mg/1 y timentina 50 mg/1) y se cultivaron por cinco días a 24°C con un fotoperiodo de 16 horas/8 horas. Después fueron transferidos a medio de selección (MS + TDZ 1 mg/1 + NAA 0,1 mg/1 + ADS 20 mg/1 + AgN03 1,5 mg/1 + cefotaxima 250 mg/1 y timentina 50 mg/1) con glufosinato de amonio 1,5 mg/1 y se cultivaron durante 4 semanas a 24°C con un fotoperiodo de 16 horas/8 horas, con un subcultivo bisemanal sobre el mismo medio. Los explantes con callos verdes fueron transferidos a medio de inicio de brotes (MS + kinetina 1 mg/1 + ADS 20 mg/1 + AgN03 1,5 mg/1 + cefotaxima 250 mg/1 + timentina 50 mg/1 + glufosinato de amonio 1,5 mg/1) y se cultivaron durante otras 2-3 semanas. Los brotes que emergieron de los explantes resistentes fueron transferidos a medio de elongación de brote (medio MS con ácido giberélico 0,1 mg/1 + ADS 20 mg/1 + AgN03 1,5 mg/1 + cefotaxima 250 mg/1 + glufosinato de amonio 1,5 mg/1 y se cultivaron durante otras dos semanas. Se seleccionaron brotes saludables de 2-3 cm de longitud y se transfirieron a medio de enraizamiento (1/2 MS con NAA 1 mg/1 + ADS 20 mg/1 + AgN03 1,5 mg/1 + cefotaxima 250 mg/1) y se cultivaron entre 2 y 3 semanas. Los brotes con raices bien establecidos fueron transferidos a macetas (mezcla para plántulas) y se cultivaron en un gabinete de crecimiento durante dos semanas y a continuación fueron transferidos a invernadero. Se confirmó que dieciséis transformantes individuales eran transgénicos para la construcción FP1: GATl y crecieron normalmente bajo las condiciones de invernadero. El crecimiento aparentemente era normal y las plantas eran fértiles, florecían y establecían semillas normalmente. Se crecieron las plantas hasta la madurez y se cosecharon las semillas obtenidas de las plantas transformadas. Se analizaron las semillas de algunas de las plantas transformadas para ver el contenido de aceite de las semillas y la composición de ácidos grasos. Los datos de estos análisis preliminares mostraron variabilidad en el contenido de aceite y la composición de ácidos grasos, probablemente debido a que las plantas se crecieron y diferentes tiempos y bajo diferentes condiciones ambientales. Para reducir la variabilidad, se producen plantas TI que expresan MGATl y se crecen bajo las mismas condiciones que las plantas control (de tipo salvaje, cultivar Oscar) del mismo genotipo, y se compara el contenido de aceite.
Expresión de MGAT1 en semillas de Gossypium hirsutum Se usó el mismo gen quimérico específico de semillas usado para la expresión de GAT1 de M. musculus en semillas de Arabidopsis thaliana para generar plantas transformadas de Gossypium hirsutum. El vector denominado FP1 : MGAT1 se introdujo en la cepa AGL1 de A. tumefaciens mediante procedimientos estándar de electroporación y las células del cultivo de Agrobacterium se usaron para introducir los ADN quiméricos en las células de Gossypium hirsutum, variedad Coker315. Se usaron cotiledones recortados de plántulas de algodón de 10 días de vida como explantes y se infectaron y se cocultivaron con A. tumefaciens por un período de dos días. Esto fue seguido por una selección de seis semanas sobre medio MS (Murashige y Skoog, 1962) que contiene 2,4-D 0,1 mg/1, kinetina 0,1 mg/1, sulfato de kanamicina 50 mg/1 y cefotaxima 25 mg/1. Se transfirieron callos saludables derivados de los explantes de cotiledones a medio MS que contiene 6- (?, ?-dimetilalilamino) urina (2ip) 5 mg/1, ácido naftalenacético (NAA) 0,1 mg/1, kanamicina 25 mg/1 y cefotaxima 250 mg/1 por un segundo período de seis semanas a 28 °C. Los embriones somáticos formados después de aproximadamente seis a diez semanas de incubación se hicieron germinar y se mantuvieron sobre el mismo medio, pero sin adición de fitohormona o antibióticos. Las plántulas desarrolladas a partir de los embriones somáticos fueron transferidas a tierra y se mantuvieron en invernadero una vez que se habían desarrollado hojas y raíces, a una temperatura de crecimiento de 28°C/20°C (día/noche). Se crecieron diez plantas transgénicas primarias independientes (TO) conteniendo la construcción FP1-MGAT1 en el invernáculo, florecieron y produjeron bagas que contienen semillas. Se cosecharon las semillas en la madurez. Para aumentar la conflabilidad del análisis del contenido de aceite, se establecieron 5 plantas de cada una de las 10 plantas transgénicas primarias y se sometieron a las semillas T2 maduras a análisis de contenido de aceite. La expresión específica de semilla de GAT1 incrementa el contenido de aceite e incrementa el porcentaje de ácidos grasos poliinsaturados en el aceite de semilla de algodón.
Expresión de genes de MGAT1 y MGAT2 en plantas de N. benthamiana después de una transformación estable Se transformó N. benthamiana de forma estable con la construcción 35S:MGAT1 descrita en el Ejemplo 2. Se introdujo 35S:MGAT1 en la cepa AGL1 de A. tumefaciens mediante un procedimiento estándar de electroporación . Las células transformadas se cultivaron sobre medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (25 mg/1) y se incubaron a 28 °C por dos días. Se usó una sola colonia para iniciar cultivos frescos. Después de 48 horas de cultivo vigoroso, las células se recolectaron por centrifugación a 20,00x g y se eliminó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en solución fresca que contiene 50% de medio LB y 50% de medio MS a una densidad DO600 = 0,5.
Se recortaron muestras de hojas de N. benthamiana cultivada in vitro y se cortaron en secciones cuadradas de 0,5-1 cm2 aproximadamente con un bisturí filoso mientras estaban sumergidas en la solución de A. turnefaciens . Los trozos de hoja lesionados de N. benthamiana sumergidos en A. turnefaciens se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de secarlos sobre un papel de filtro estéril y luego se transfirieron sobre placas MS sin suplemento. Después de un período de cocultivo de dos días a 24°C, los explantes se lavaron tres veces con medio MS líquido, estéril, luego se secaron con papel de filtro estéril y se colocaron sobre el agar MS selectivo suplementado con bencilaminopurina (BAP) 1,0 mg/1, ácido indolacético (IAA) 0,25 mg/1, kanamicina 50 mg/1 y cefotaxima 250 mg/1. Las placas se incubaron a 24°C por dos semanas para permitir el desarrollo de brote a partir de los trozos de hoja transformadas de N. benthamiana .
Para establecer plantas transgénicas con raíces in vitro, se recortaron ' brotes verdes saludables y se transfirieron a recipientes para cultivo tisular de 200 mi que contienen medio de agar MS suplementado con IAA 25 g/l, kanamicina 50 mg/1 y cefotaxima 250 mg/1. Se tomaron discos de hoja suficientemente grandes de los brotes transgénicos y se secaron por congelamiento para el fraccionamiento de TAG y el análisis de cuantificación según se describió en el Ejemplo 1 (Tabla 4). La mejor planta 35S:MGAT1 de N. benthamiana tenía un contenido de TAG de 204,85 µg/100 mg de peso seco de tejido foliar en comparación con un contenido promedio de TAG de 85, 02 µg 100 mg de peso seco de tejido foliar en las líneas control, lo que representa un aumento en el contenido de TAG del 241%. ??. benthamiana también se transformó de forma estable con la construcción 35S:MGAT2 que se describió en el Ejemplo 2 y un vector binario control pORE4 (Tabla 6) . La mejor planta 35S:MGAT2 de N. benthamiana tenía un contenido de TAG de 79,0 g/100 mg de peso seco de tejido foliar en comparación con un contenido de TAG de 9,5 g/100 mg de peso seco de tejido foliar en la línea control en la misma etapa de desarrollo, lo que representa un aumento en el contenido de TAG del 731%. El perfil de ácidos grasos de las fracciones de TAG también estaba alterado con niveles significativamente reducidos de los ácidos grasos saturados 16:0 y 18:0, y niveles incrementados de ácidos grasos poliinsaturados, en particular 18:3co3 (ALA) (Tabla 5). El perfil de ácidos grasos de los lipidos polares las mismas muestras de hojas no se vio significativamente afectadas, lo cual indica que los cambios en la composición de ácidos grasos de los lipidos no polares eran reales. Las plantas control en este experimento eran más pequeñas y fisiológicamente diferentes que en el experimento previo con la construcción 35S:MGAT1, y esto podría explicar el contenido diferente de aceites de las plantas control entre un experimento y otro. Los experimentos para comparar directamente las construcciones 35S:MGAT1 y 35:MGAT2 con las plantas control se condujeron usando plantas del mismo tamaño y fisiología.
Se obtuvo un nuevo juego de vectores de expresión binarios constitutivos usando un promotor 35S con una región potenciadora duplicada (e35S) . Las construcciones 35S : GAT1#2 (PJP3346), 35S:MGAT2#2 (pJP3347) y 35S:DGAT1#2 (pJP3352) se obtuvieron clonando primero el promotor e35S, contenido dentro de un fragmento BamRI-EcoRI , en el pORE04 en los sitios i3aínHI-£coRI para obtener el pJP3343. Los plásmidos pJP3346 y pJP3347 se produjeron luego por clonación de los genes MGAT1 y MGAT2, respectivamente, en el sitio EcoRI del pJP3343. El pJP3352 se produjo por clonación de DGAT1 de A. thaliana , contenido en un sitio Xhol-AsiSI, en los sitios Xhol-AsiSI del pJP3343.
Se usaron los plásmidos pJP3346, pJP3347 y pJP3352 en la cepa AGLl de Agrobacterium para transformar N. benthamiana como se describió previamente. Se recuperaron catorce plantas transgénicas confirmadas para pJP3346 y 22 para pJP3347. Se había generado un número de brotes transformados resistentes a kanamicina con el pJP3352. El análisis de la expresión de los transgenes se condujo en plantas transformadas con MGAT1 o MGAT2. Se seleccionaron las plantas con niveles elevados de expresión. Se efectúa un análisis de la expresión en plantas transformadas con DGAT1 de A. thaliana. Las plantas crecen normalmente y se dejan crecer hasta alcanzar la madurez. Las semillas se cosechan cuando están maduras. Las semillas de la progenie de gran expresión se siembran directamente en tierra para el análisis de lípidos de la población segregante T2, que incluye plantas homocigotas y heterocigotas. El contenido de aceite en las hojas de plantas que expresan niveles elevados de MGAT1 o MGAT2 es significativamente mayor en comparación con las plantas transformadas con DGAT1 de A. thaliana o las plantas control. Las plantas transgénicas para MGAT2 mostraron un incremento significativo del ácido graso insaturado 18:1 y 1 % de incremento relativo en el contenido de ácidos grasos totales en comparación con los eventos nulos (Tabla 7) .
También se usó pJP3346, pJP3347 y un vector control en AGL1 para transformar A. thaliana como se describió previamente. Se identificaron veinticinco plantas transgénicas T2 confirmadas que comprenden al ADN-T del pJP3346 y 43 plantas transgénicas para pJP3347. El análisis de la expresión se efectuó en las plantas transgénicas. Se cosechan las semillas de la progenie de gran expresión y se siembran directamente en tierra. Se efectuó un análisis de lipido incluyendo contenido el de aceite de las hojas de la progenie T2 y T3, incluyendo de los segregantes que no contienen a los transgenes. Los mayores niveles de TAG se obtuvieron en las plantas que son homocigotas para los transgenes MGAT.
Tabla 5. Perfil de ácidos grasos y cuantificación de TAG en tejido foliar de Nicotiana benthamiana transformado de forma estable con la construcción 35S:MGAT1. Las muestras '?' son 35S:MGAT1, en tanto las muestras 'C son plantas control parentales .
Tabla 5. Perfil de ácidos grasos y cuantificación de TAG en tejido foliar de Nicotiana benthamiana transformado de forma estable con la construcción 35S.MGAT1. Las muestras '?' son 35S.MGAT1, en tanto las muestras 'C son plantas control parentales.
Tabla 6. Perfil de ácidos grasos y cuantificación de TAG en tejido foliar de Nicotiana benthamiana transformado de forma estable con la construcción 35S:MGAT2. Las muestras 'M' son 35S:MGAT2, en tanto las muestras 'C son plantas control parentales. Se tomaron dos ho as de cada planta y se analizaron por separado.
Tabla 7. Cantidad total de ácidos grasos (TFA) y composición de ácidos grasos en tejidos de hoja de Nicotiana benthamiana transformada establemente con la construcción 35S:MGAT2.
Se crecieron treinta plantas de cada linea transgénica en un arreglo al azar en el invernadero con plantas parentales control. Se analizaron las semillas T2 para el contenido de aceite y exhibieron un incremento de aproximadamente 2% en el contenido de aceite (nivel de ácidos grasos totales) en comparación con el contenido de ácidos grasos totales de las semillas parentales (Figura 8) .
Expresión de MGAT1 en plantas de Trifolíum repens transformadas de forma estable Se usó un gen quimérico que codifica MGAT1 de M. musculus para transformar Trifolíum repens, otra planta dicotiledónea. Los vectores que contienen los genes quiméricos 35S:MGAT1 y 35S:DGAT1 se introdujeron en A. tumefaciens por medio de un procedimiento de electroporación estándar. Ambos vectores también contienen un gen marcador seleccionable 35S:BAR. Las células transformadas de Agrobacteríum se cultivaron sobre medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (25 mg/1) y se incubaron a 28°C por dos días. Se usó una sola colonia para iniciar un cultivo fresco para cada construcción. Después de 48 horas de cultivo vigoroso, los cultivos de Agrobacterium se usaron para tratar cotiledones de - . repens (cv. Haifa) que hablan sido disecadas de semillas embebidas como se describe en Larkin et al. (1996). Después de tres dias de cocultivo, los explantes fueron expuestos a PPT 5 mg/1 para seleccionar los brotes transformados y luego fueron transferidos a medio de enraizamiento para formar raices, antes de su transferencia a tierra. Se obtuvo una planta transformada que contiene MGAT1. El promotor 35S se expresa de manera constitutiva en las células de las plantas transformadas. El contenido de aceite está aumentado al menos en los tejidos vegetativos, tales como hojas.
Expresión de MGAT en Hordeum vulgare transformada de forma estable Se usó un vector quimérico que incluye MGAT1 de M. musculus para producir Hordeum vulgare, una planta monocotiledónea, transformada de forma estable. Los vectores que contienen a los genes quiméricos Ubi:MGATl y Ubi:DGATl se construyeron por clonación por separado de las regiones de codificación completas de MGAT1 de M. musculus y DGAT1 de A. thaliana en el pWVEC8-Ubi. Los vectores que contienen los genes quiméricos Ubi :MGAT1 y Ubi : DGAT1 se introdujeron en la cepa AGL1 de A. turnefaciens por medio de un procedimiento de electroporación estándar. Las células transformadas de Agrobacterium se cultivaron sobre medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (25 mg/1) y las placas se incubaron a 28°C por dos días. Se usó una sola colonia de cada una para iniciar cultivos frescos.
Después de 48 horas de cultivo vigoroso, los cultivos de Agrobacterium se usaron para transformar células en embriones inmaduros de cebada (cv. Golden Promise) de acuerdo con los métodos publicados (Tingay et al., 1997; Bartlett et al., 2008) con algunas modificaciones. Brevemente, se aislaron embriones de entre 1,5 y 2,5 mm de longitud de cariopses inmaduros y se retiraron los ejes embrionarios. Los explantes resultantes se co-cultivaron durante 2-3 días con el Agrobacterium transgénico y luego se cultivaron en oscuridad durante 4-6 semanas sobre un medio que contiene timentina e higromicina para generar callos embriogénicos antes de moverlos a un medio de transición bajo condiciones de poca luz por dos semanas. Los callos fueron transferidos luego a un medio de regeneración para permitir la regeneración de brotes y raíces antes de su transferencia a tierra. Se obtuvieron plantas transformadas y fueron transferidas al invernadero. La región de codificación de MGAT1 se expresó de manera constitutiva bajo el control del promotor Ubi en las células de las plantas transformadas. El contenido de aceite aumentado al menos en los tejidos vegetativos. Se generaron plantas transgénicas y se analizaron sus tejidos para el contenido de aceite. Debido al bajo número de eventos transgénicos que se obtuvieron en una primera transformación, no se pudo extraer una conclusión estadísticamente significativa a partir de los. datos.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en Hordeum como se describió previamente. Los te idos vegetativos de las plantas transgénicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado.
Expresión de MGAT en células de levadura Se usó un vector quimérico que incluye MGAT1 de M. musculus para transformar levadura; en este ejemplo se trata de Saccharomyces cerevisiae, un microbio fúngico adecuado para la producción de aceite por fermentación. Se obtuvo una construcción genética Gall:MGATl por inserción de la región de codificación completa de una construcción denominada 0954364_MGAT_pMA, contenida en un fragmento EcoRI, en el pYES2 en el sitio EcoRI, generando asi el pJP3301. De manera similar, se obtuvo una construcción genética GallrDGATl, usada aqui por comparación y que codifica separadamente la enzima DGAT1 de A. thaliana , por inserción de la región de codificación completa de DGAT1 de A. thaliana en el pYES2. Estos vectores quiméricos se introdujeron en la cepa S288C de S. cerevisiae por shock de calor y los transformantes se seleccionaron sobre placas con medio mínimo de levadura (YMM) que contienen 2% de rafinosa como única fuente de carbono. Se establecieron cultivos de inóculos clónales en YMM líquido con 2% de rafinosa como única fuente de carbono. A partir de ellos se inocularon cultivos experimentales en medio YMM que contiene 1% de NP-40, hasta una DO600 inicial de 0,3 aproximadamente. Los cultivos se dejaron crecer a 28°C con agitación (100 rpm aproximadamente) hasta que la DO600 era de 1,0 aproximadamente. En este punto, se agregó galactosa hasta una concentración final de 2% (p/v) . Los cultivos se incubaron a 25°C con agitación por otras 48 horas antes de cosecharlos por centrifugación. Los pelets celulares se lavaron con agua antes de secarlos por congelamiento para el fraccionamiento en las clases de lípidos y el análisis de cuanti ficación según se describió en el Ejemplo 1. El promotor Gal se expresa de manera inducible en las células de levadura transformadas, incrementando el contenido de aceite en las células.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células de levadura, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en levadura. Las células transgénicas resultantes tienen un contenido de aceite aumentado. Los genes también se introducen en la levadura oleaginosa, Yarrowia lipolitíca, para aumentar el contenido de aceite.
Expresión de MGAT en células del alga Chlamydomoñas reinhardtí i Se usa un vector quimérico que incluye MGAT1 de M. musculus para transformar de forma estable células de algas. La construcción genética denominada 35S:MGAT1 se obtiene por clonación de la región de codificación de MGAT1 en un vector de clonación que contiene un cásete promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor y un gen de resistencia a paramomicina ( aminoglucósido-O-fosfotransferasa VIII) expresado por un promotor RBCS2 de C. reinhardtii. La construcción 35S:MGAT1 se introduce por separado en un cultivo en fase logarítmica de 5x107 cc503, una cepa deficiente en pared celular de Chlamydomoñas reinhardtii mediante un método de esferas de vidrio modificadas (Kindle, 1990). Ambos vectores también contienen el gen de resistencia a BLE como gen marcador seleccionable . Brevemente, se hace crecer una colonia de células no transformadas sobre una placa de agar TAP mantenida a 24°C aproximadamente hasta 5x106 células/ml aproximadamente sobre un periodo de cuatro días, las células resultantes se agrupan en pelets a 3000 g durante 3 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron para producir 5x107 células en 300 µ? de medio TAP. Se agregan 300 µ? de esferas de vidrio de 0,6 mm de diámetro, 0,6 µg de plásmido en 5 µ? y 100 µ? de PEG MW8000 20% y la mezcla se agita por vortexeo a velocidad máxima por 30 segundos, luego se transfieren a 10 mi de TA? y se incuban durante 16 horas con agitación en oscuridad. Las células se agrupan en pelets, se resuspenden en 200 µ? de TAP, luego se plaquean sobre placas TAP que contienen zeocina 5 mg/1 y se incuban en oscuridad durante 3 semanas. Las colonias transformadas se subcultivan sobre una placa fresca de TAP + zeocina 5 mg/1 después de lo cual se de an crecer bajo condiciones de medio estándar usando selección con zeocina. Después de una cosecha por centrifugación, los pelets celulares se lavan con agua antes de secarlos por congelamiento para el fraccionamiento en clases de lipidos y el análisis de cuanti ficación según se describió en el E emplo 1. El promotor 35S:MGAT1 se expresa de manera constitutiva en las células de algas transformadas. El contenido de aceite de las células está significativamente aumentado .
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en la construcción mencionada previamente, y se introducen en Chlamydomoñas . El contenido de aceite en las células transgénicas resultantes está aumentado significativamente.
Expresión de MGAT en Lupínus angustífolius transformada de forma estable Se usa un vector quimérico que incluye MGAT1 de M. musculus para transformar Lupínus angustí folius, una planta leguminosa. Se usan los vectores quiméricos 35S:MGAT1 y 35S:DGAT1 en Agrobacterium para transformar L. angustí folius como describieran Pigeaire et al. (1997) . Brevemente, se co-cultivan explantes de ápices de brotes con Agrobacterium transgénico antes de humedecerlos exhaustivamente con una solución de PPT (2 mg/ml) y transferirlos sobe un medio de regeneración sin PPT. Se recortan los múltiples brotes axilares que se desarrollan a partir de los ápices de brotes y se colocan sobre un medio que contiene PPT 20 mg/1 y los brotes sobrevivientes se transfieren sobre medio fresco que contiene PPT 20 mg/1. A continuación se transfieren los brotes saludables a tierra. El promotor 35S se expresa de manera constitutiva en células de las plantas transformadas, incrementando el contenido de aceite en los tejidos vegetativos y en las semillas. Se usa un promotor especifico de semillas para incrementar aún más el contenido de aceite en semillas transgénicas de Lupinus.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en Lupinus . Las semillas y los tejidos vegetativos de las plantas transgénicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado.
Expresión de MGAT en células de Sorghum bicolor transformadas de forma estable Se usa un vector quimérico que incluye MGAT1 de M. musculus para transformar de forma estable Sorghum bicolor. Se usan Ubi : MGAT1 y Ubi : DGA 1 en la cepa AGL1 de A. turnefaciens para transformar Sorghum bicolor como describen Gurel et al. (2009). El Agrobacterium se centrifuga primero a 50,00 rpm a 4°C durante 5 minutos y se diluye hasta una DO550 = 0,4 con medio de cocultivo líquido. Los embriones inmaduros aislados previamente se cubren luego por completo con la suspensión de Agrobacterium durante 15 minutos y después se cultivan, con el lado del escutelo hacia arriba, sobre medio de cocultivo en oscuridad durante 2 días a 24°C. Los embriones inmaduros son transferidos luego a medio de inducción de callos (CIM) con carbenicilina 100 mg/1 para inhibir el crecimiento de Agrobacterium y se deja asi durante 4 semanas. Los tejidos son transferidos luego a un medio de regeneración para formar brotes y raices. El promotor Ubi se expresa de manera constitutiva en células de las plantas transformadas, incrementando el contenido de aceite por lo menos en los te idos vegetativos.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en Sorghum. Los tejidos vegetativos de las plantas transgenicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado.
Expresión de MGAT en plantas de Sorghum bicolor transformadas de forma estable Se usa un gen quimérico que codifica MGAT1 de M. musculus para transformar de forma estable Glycine max, otra legumbre que se puede usar para la producción de aceite. Se usa 35S:MGAT1 en Agrobacterium para transformar G. max como se describe en Zhang et al. (1999). El Agrobacterium se co-cultiva durante tres días con explantes de cotiledones derivados de plántulas de cinco días de vida. Los explantes se cultivan luego sobre medio B5 de Gamborg suplementado con BAP 1,67 mg/1 y glufosinato 5,0 mg/1 por cuatro semanas después de lo cual los explantes se subcultivan en un medio que contiene sales MS mayores y menores y vitaminas B5 (MS/B5) suplementado con zeatina-ribósido 1,0 mg/1, GA3 0,5 mg/1 e IAA 0,1 mg/1 con lm7 mg/1 o glufosinato 2,0 mg/1. Los brotes elongados forman raíces sobre un medio de enraizamiento MS/B5 suplementado con NAA 0,5 mg/1 sin selección adicional con glufosinato. El promotor 35S se expresa de manera constitutiva en células de las plantas transformadas, incrementando el contenido de aceite en los tejidos vegetativos y en las semillas.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en Glycine. Los tejidos vegetativos y las semillas de las plantas transgénicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado.
Expresión de MGAT en Zea mays transformada de forma estable Se usa un gen quimérico que codifica MGAT1 de M. musculus para transformar de forma estable Zea mays. Los vectores que comprenden 35S:MGAT1 y 35S:DGAT1 se usan para transformar Zea mays según se describe en Gould et al. (1991). Brevemente, se co-cultivan explantes de ápices de brotes ccn Agrobacterium transgénico durante dos días antes de transferirlos sobre un medio de sales MS que contiene kanamicina y carbenicilina . Después de varias rondas de subcultivo, se forman espontáneamente brotes y raíces transformadas y se trasplantan a tierra. El promotor 35S se expresa en células de las plantas transformadas, incrementando el contenido de aceite en los tejidos vegetativos y en las semillas.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en Zea mays. Los tejidos vegetativos y las semillas de las plantas transgénicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado. Como alternativa, las regiones de codificación MGAT se expresan bajo el control de un promotor específico de endosperma, tal como el promotor de zeína, o un promotor específico de embriones obtenido a partir de una planta monocotiledónea , para una mayor expresión y un mayor contenido de aceite en las semillas. Se introduce otro gen quimérico que codifica una GPAT con actividad fosfatasa, tal como GPAT4 o GPAT6 de A. thaliana, en Zea mays en combinación con la MGAT, incrementando aún más el contenido de aceite en semillas de maíz , Expresión de MGAT en Elaeis guineensis transformada de forma estable (aceite de palma) Se usa un gen quimérico que codifica MGAT1 de M. musculus para transformar de forma estable Elaeis guineensis. Se usan los vectores quiméricos denominados Ubi: GATl y Ubi:DGATl en Agrobacteriu . Después de 48 horas de cultivo vigoroso, las células se usan para transformar Elaeis guineensis como describieron Izawati et al. (2009). El promotor Ubi se expresa de manera constitutiva en células de las plantas transformadas, incrementando el contenido de aceite por lo menos en los frutos y las semillas, y se pueden usar para obtener aceite.
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las construcciones mencionadas previamente, y se introducen en Elaeis. Las semillas de las plantas transgénicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado.
Expresión de MGAT en Avena sativa (avena) transformada de forma estable Se usa un gen quimérico que codifica MGAT1 de M. musculus para transformar de forma estable Avena sativa, otra planta monocotiledónea . Se usan los vectores quiméricos denominados UbirMGATl y Ubi:DGATl, como se describió previamente y que contienen, ambos, un marcador seleccionable Ubi: BAR, para transformar Avena sativa como describen Zhang et al. (1999) .
La región de codificación del gen MGAT2 de ratón, de codones optimizados para la expresión en células vegetales, se sustituye por la MGAT1 en las const ucciones mencionadas previamente, y se introducen en Avena. Las semillas de las plantas transgénicas resultantes presentan un contenido de aceite aumentado.
Ejemplo 7. Construcción de una MGAT con actividad DGAT Se puede construir una MGAT con actividad DGAT alterada, en especial mayor actividad DGAT y potencialmente mayor actividad MGAT llevando a cabo mutagénesis al azar, mutagénesis dirigida, o mutagénesis por saturación sobre el (los) gen (es) de MGAT de interés o sometiendo a diferentes genes de MGAT y/o DGAT a mezclado de ADN. La función de DGAT se puede cribar positivamente o usando, por ejemplo, una cepa de levadura que tiene requerimiento absoluto de complementación de síntesis de TAG cuando se alimenta con ácidos grasos libres, tal como la cepa H1246 que contiene mutaciones en cuatro genes ( DGA1 , LR01, AKE1 , ARE2) . La transformación de las variantes de MGAT en dicha cepa y la posterior suplementacion de la levadura transformada con una concentración de ácidos grasos libres que previene la complementación mediante el gen de MGAT de tipo salvaje solo permitirá el crecimiento de las variantes con mayor habilidad de síntesis de TAG debido a una mejor actividad DGAT. La actividad MGAT de estos genes mutados se puede determinar mediante alimentación con MAG marcado en sn-1 o sn-2 y cuantificación de la producción de DAG marcado. Varias rondas de evolución dirigida en combinación con diseño proteico racional resultarla en la producción de un nuevo gen de MGAT con actividades MGAT y DGAT similares.
El gen que codifica para la aciltrans ferasa MGAT1 de M. musculus se sometió a PCR propensa a error usando Taq ADN polimerasa en presencia de MnC12 0,15 mM para inducir mutaciones al azar. Las regiones codificantes randomizadas se usaron entonces como megacebadores para amplificar el vector de expresión en levaduras completo usando condiciones de reacción de PCR de alta fidelidad. La secuenciación de 9099 pb de ADN mutagenizado recuperado reveló una frecuencia de mutación de aproximadamente 0,8 %, correspondiente a 8 mutaciones por gen o, en promedio, 5,3 sustituciones de aminoácido por polipéptido. Se transformó la biblioteca completa mutagenizada en E. coli DH5 para almacenamiento a -80 °C y preparación de plásmidos. Se estimó el tamaño de la biblioteca de MGAT1 en 3,8356E6 clones. Se transformó una copia de La biblioteca de MGAT1 en la cepa de levadura H1246, lo que resultó en un tamaño de biblioteca de 3E6 clones. Se sometió a la biblioteca de MGAT1 asi como también a un control negativo de pYES2, transformada en S. cerevísíae H1246, a 8 rondas de selección, en donde cada una consiste en cultivos de redilución en medio de inducción mínimo (1 % de rafinosa + 2 % de galactosa; diluidos a DO600 = 0,35-0,7) en presencia de ácido graso libre C18:l a una concentración final de 1 mM. Los controles negativos consistieron en cultivos idénticos crecidos en forma simultánea en medio mínimo conteniendo glucosa (2%) y en ausencia del ácido graso libre C18:l. Después de 8 rondas de selección, se plaqueó una alícuota de la biblioteca de MGATl seleccionada en medio mínimo con glucosa (2%) . Se creció un total de 120 colonias en 240 µ? de medio de inducción mínimo en placas de 96 micropocillos y se ensayó para rendimiento de lípidos neutros usando un ensayo de fluorescencia con Rojo Nilo como se describió en Siloto et al. (2009). Se prepararon minipreparaciones de plásmidos a partir de 113 clones (= al 6 % superior) que mostraron los mayores niveles de TAG.
Se secuencia la región codificante completa de MGATl de los clones seleccionados para identificar el número de mutantes únicos y para identificar la naturaleza de las mutaciones seleccionadas. Los mutantes únicos de MGATl se ret ans forman en S. cerevísíae H1246 para ensayos ín vítro de MGAT y DGAT usando sustratos marcados de MAG y C18:l respectivamente (véase el Ejemplo 5). SE halla que las variantes seleccionadas de MGAT1 exhiben mayor actividad DGAT en comparación con la aciltransferasa de tipo salvaje, mientras que la actividad MGAT también esta posiblemente incrementada .
Las variantes de MGAT1 que muestran mayores actividades MGAT y/o DGAT se usan como parentales en una reacción de mezclado de ADN. La biblioteca resultante se somete a un sistema de selección similar como se describió previamente lo que resulta en una mejora adicional de la actividad aciltransferasa general. Además, se agregan ácidos grasos libres distintos a C18:l al medio de crecimiento para seleccionar variantes de MGAT1 mostrando especificidades de donor de acilo alteradas.
Ejemplo 8 Expresión constitutiva de la diaeilglicerol aciltransferasa 2 de A. tha.lla.na. en plantas La expresión de la DGAT2 de A. thalíana en levadura (Weselake et al., 2009) y células de insecto (Lardizabal et al., 2001) no demostró actividad DGAT. De manera similar, la DGAT2 no pudo complementar un noqueo de la DGAT1 de A. thalíana (Weselake et al., 2009). La actividad enzimática de la DGAT2 de A. thalíana en tejido foliar se determinó usando un sistema de expresión transitorio de N. benthamiana según se describió en el Ejemplo 1. La DGAT2 de A. thalíana (Acceso Q9ASU1) se obtuvo por PCR genómico y se clonó en un vector de expresión binario bajo el control del promotor 35S para generar 35S:DGAT2. Este vector quimérico se introdujo en la cepa AGL1 de ?. tumefaciens y las células de cultivos de la misma se infiltraron en tejido foliar de plantas de N. benthamíana en un cuarto de crecimiento a 24 °C usando 35S:DGAT1 como control. Se infiltraron diversas comparaciones directas con las muestras en comparación ubicadas a cada lado de la misma hoja. Los experimentos se condujeron por triplicado. Después de la infiltración, las plantas se cultivaron por otros cinco días antes de retirar discos de hojas y secarlos por congelamiento para el fraccionamiento en clases de lipidos y el análisis de cuantificación según se describió en el Ejemplo 1. Este análisis reveló que ambas DGAT1 y DGAT2 aumentaban los niveles de aceite en las hojas de Nicotiana benthamíana (Tabla 8).
El tejido de hoja transformado con la construcción 35S:pl9 (control negativo) contuvo un promedio de 25 µq de TAG/100 mg de peso seco de hoja. El te ido de hoja transformado con las construcciones 35S:pl9 y 35S:DGAT1 (control positivo) contuvo un promedio de 241 pg de TAG/100 mg de peso seco de hoja. El tejido de ho a transformado con las construcciones 35S:pl9 y 35S:DGAT2 contuvo un promedio de 551 µg de TAG/100 mg de peso seco de hoja.
Los datos que se describieron previamente demuestran que la enzima DGAT2 de ?. thaliana es más activa que la enzima DGAT1 de A. thaliana en la promoción de la acumulación de TAG en el tejido de hoja. La expresión del gen de DGAT2 resultó en tanto como un 229% de acumulación de TAG en el te ido de hoja en comparación con el caso en que la cantidad de TAG a partir de la sobreexpresion de DGAT1 se estableció como 100% relativo (Figura 9).
También se usaron tejidos de hoja de N. benthamíana transformada transitoriamente que expresan P19 solo (control), o P19 ya sea con AtDGATl o bien con AtDGAT2 , para preparar microsomas para ensayos in vi tro de actividad enzimática. Se llevó a cabo un ensayo bioquímico de DGAT usando microsomas correspondientes a 50 µ? de proteína y agregando 10 nmoles de [14]C6:0-DAG y 5 nmoles de acil-CoA, en solución amortiguadora de HEPES 50 mM, pH 7,2, con MgC12 5 mM, y 1% de ASB en un volumen final de 100 µL para cada ensayo. Los ensayos se llevaron a cabo a 30°C durante 30 minutos. Se extrajeron los lípidos totales de cada ensayo y se sembraron las muestras en placas de TLC, las que se desarrollaron usando un solvente de hexano : DEE : Hac (70:30:1 vol : vol : vol ) . Se cuantificó la cantidad de radiactividad en las manchas de DAG y TAG mediante medida con Phosphorlmage . Se calculó el porcentaje de DAG convertido a TAG para cada una de las preparaciones de microsoma.
Se detectó algo de actividad DGAT endógena en las hojas de N. benthamiana, ya que el ensayo control P19 mostró bajos niveles de producción de TAG. La expresión de AtDGATl rindió mayor actividad DGAT en relación al control P19 cuando de suplementaron los ensayos o bien con C18:l-CoA o con C18:2-GoA, pero no cuando se suplementaron con C18:3-CoA, en donde los niveles de TAG para el control P19 y la AtDGATl fueron similares. Sin embargo, en todos los ensayos con microsomas, cuando se expresó AtDGAT2 en los tejidos de hojas, se observaron mayores niveles de actividad DGAT (producción de TAG) en comparación con los microsomas con AtDGATl. Se observaron mayores niveles de producción de TAG cuando los microsomas se suplementaron o bien con C18:2-CoA o con C18:3-CoA en relación a C18:l-CoA (Figura 10). Esto indicó que DGAT2 tuvo una preferencia diferente de sustrato, en particular por C18:3-CoA (ALA), a la DGAT1.
Ejemplo 9. Co-expresión de MGAT y GPAT en semillas transgénicas Yang et al., (2010) describieron dos glicerol-3-fosfato aciltrans ferasas (GPAT4 y GPAT6) de A. thaliana, ambas con preferencia por sn-2 (es decir, forman preferencialmente sn-2 MAG en lugar de sn-1/3 MAG) y actividad fosfatasa, que podían producir sn-2 MAG a partir de G-3-P (Figura 1). Se propuso que estas enzimas formaran parte de la via de síntesis de cutina. GPAT4 y GPAT6 no presentaron una gran expresión en tejido de semillas. La combinación de dicha GPAT/fosfatasa bifuncional con una MGAT permite obtener una nueva via de síntesis de DAG usando G-3-P como sustrato que puede reemplazar o suplementar la típica vía Kennedy para la síntesis de DAG en plantas, en particular en el aceite de semillas, u otras células, lo que da como resultado un mayor contenido de aceite, en particular de niveles de TAG.
Se obtuvieron los ADN quiméricos denominados pJP3382 y pJP3383, que codifican las GPAT4 y GPAT6 de ?. thaliana, respectivamente, unto con la MGAT2 de jVf. musculus para su expresión en semillas insertando primero la región de codificación completa de MGAT2, contenida en un fragmento Swa.1, en el pJP3362 en el sitio Smal para obtener el pJP3378. El plásmido pJP3362 era un vector de expresión binario que contiene los casetes de expresión vacíos FAE1 y FP1 y un gen de resistencia a kanamicina como marcador seleccionable . La GPAT4 de A. thaliana se amplificó a partir del ADNc y se clonó en el pJP3378 en el sitio Notl para obtener el pJP3382 en el cual se expresaba la GPAT4 por el promotor de napina truncado, FP1, y la MGAT2 era expresada por el promotor FAE1 de ?. thaliana . De manera similar, se amplificó GPAT6 de A. thaliana a partir del ADNc y se clonó en el pJP3378 en el sitio Notl para obtener el pJP3384 en donde la GPAT6 estaba ligada operativamente al promotor de napina truncado, FP1, y la MGAT2 era expresada por el promotor FAE1 de A. thaliana . Los plásmidos pJP3382 y pJP3383 fueron transformados en A. thaliana (ecotipo Columbia) mediante el método de inmersión floral. Se plaquearon semillas de las plantas tratadas sobre un medio que contiene al antibiótico, kanamicina, para seleccionar las plantas de progenie (plantas TI) que fueron transformadas. Las plántulas transgénicas fueron transferidas a tierra y se cultivaron en invernadero. Se determinó la expresión de los transgenes en los embriones en desarrollo. Se seleccionan las plantas transgénicas con el mayor nivel de expresión y que muestran una relación 3:1 de plantas transgénicas : no transgénicas por línea, indicativa de una inserción de un solo locus de los transgenes, y se dejan crecer hasta alcanzar la madurez. Se obtuvieron semillas a partir de estas plantas (T2) las que incluyeron algunas que eran homocigotas para los transgenes. Se crecieron entre 30 y 32 (plantas T2) a partir de cada línea en macetas con suelo en un arreglo al azar en el invernadero con plantas control, y se determinó el contenido de lípidos, el contenido de TAG y la composición de ácidos grasos de las semillas resultantes. El contenido de ácidos grasos totales (determinado a partir de los FAME totales), en particular el contenido de TAG de las semillas que comprenden tanto una MGAT como una GPAT4 o GPAT6, se incrementó sustancial y significativamente en cerca de 3% (nivel absoluto) o en alrededor de 9% (nivel relativo) sobre los controles, y se incrementó en relación a las semillas que comprende la MGAT sola o la DAGT1 de A. thalíana sola ( Figura 11 ) .
Se introdujo la región codificante del gen de MGAT2 de ratón, optimizado por codones para la expresión de células vegetales, en Brassica napus junto con un gen quimérico que codifica para GPAT4 de Arabidopsís. Se cosecharon semillas a partir de las plantas transgénicas resultantes y se analizaron algunas. Los datos a partir de estos análisis preliminares mostraron variabilidad en el contenido de aceite y la composición de ácidos grasos, probablemente debido a que las plantas crecieron a diferentes tiempos y bajo diferentes condiciones ambientales. Se plantan las semillas para producir plantas de progenie, y se cosechan las semillas de la progenie.
Ejemplo 10. Evaluación del efecto de GPAT4 y GPAT6 sobre el incremento de ??T mediado por MGAT mediante silenciamiento y mutación de GPAT La familia GPAT es grande y todos los miembros conocidos contienen dos dominios conservados, un dominio plsC aciltransferasa y un dominio de la superfamilia de hidrolasas tipo HAD. Además de esto, todas las GPAT4-8 de A. thalíana contienen una región N-terminal homologa de un dominio fosfoserina fosfatasa. Ambas GPAT4 y GPAT6 de A. thaliana contienen residuos conservados conocidos por ser críticos para la actividad fosfatasa (Yang et al., 2010).
Se diseñaron cebadores degenerados basados en la secuencia de aminoácidos conservada GDLVICPEGTTCREP ( SEQ ID N°:228) para amplificar fragmentos en las GPAT de N. benthamiana expresados en tejido foliar. 3' Se conducirá un 3' RACE usando estos cebadores y cebadores de oligo-dT inversos con ARN aislado del tejido foliar de ¿V. benthamiana. Las GPAT con actividad fosfatasa (es decir, tipo GPAT4/6) se identificarán por su homología con la región del dominio de fosfoserina fosfatasa N-terminal descrita previamente. Se van a generar construcciones de ARNi dirigidas por 35S para estos genes blanco y serán transformadas en la cepa AGL1 de A. turnefaciens . De manera similar, se va a transformar una construcción 35S:V2 que contiene a la proteína supresora de silenciamiento viral V2 en la cepa AGL1 de A. tumefaciens . Se sabe que V2 suprime el mecanismo de silenciamiento de la planta nativa para permitir una expresión transitoria efectiva, pero también permitir que funcione el silenciamiento de genes basado en ARNi.
Luego se comparará la acumulación de TAG entre muestras de hojas transformadas transitoriamente infiltradas con las siguientes mezclas de cepas: 1) 35S:V2 (control negativo); 2) 35S:V2 + 35S:MGAT2 (control positivo); 3) 35S:V2 + GPAT-RNAi; 4) 35S:V2 + GPAT-RNAi + 35S:MGAT2. Se espera que la mezcla 35S:V2 + GPAT-RNAi + 35S:MGAT2 dará como resultado menos acumulación de TAG que 35S:V2 + muestra 35S:MGAT2 debido a la interrupción de la síntesis de sn-2 MAG debida al silenciamiento de GPAT.
Se conducirá un experimento similar usando secuencias tipo GPAT4/6 de A. thaliana y N. benthamiana que están mutadas para eliminar los residuos conservados conocidos por ser críticos para la actividad fosfatasa (Yang et al., 2010) . Estos genes mutados (conocidos conjuntamente como GPAT4/6-delta) se clonarán luego en vectores de expresión binarios dirigidos por 35S y transformados en A. tumefacíens . Luego se comparará la acumulación de TAG entre muestras de ho as transformadas transitoriamente infiltradas con las siguientes mezclas de cepas: 1) 35S:pl9 (control negativo); 2) 35S:pl9 + 35S:MGAT2 (control positivo); 3) 35S:pl9 + GPAT4/ 6-delta; 4) 35S:pl9+ GPAT4/ 6-delta + 35S:MGAT2. Se espera que la mezcla 35S:pl9 + GPAT4/ 6-delta + 35S:MGAT2 dará como resultado menos acumulación de TAG que 35S:pl9 + muestra 35S:MGAT2 debido a la interrupción de la síntesis de sn-2 MAG debida a la mutación de GPAT. Si bien los genes tipo GPAT4/6 nativos de N. benthamiana estarán presentes en este experimento, se espera que el alto nivel de expresión de las construcciones GPAT4/6-delta les dotará de una mayor capacidad para acceder al sustrato G-3-P que los genes endógenos.
Ejemplo 11. Expresión constitutiva de una diacilglicerol aciltransferasa y del factor de transcripción WRI1 en células vegetales Se hizo un vector designado como 35S-pORE04 mediante la inserción de un fragmento PstI que contiene un promotor 35S en el sitio Sfol del vector pORE04 después de tratamiento con T4 ADN polimerasa para hacer romos los extremos (Coutu et al., 2007). Se hizo una construcción genética 35S : Arath-DGATl que codifica para la diacilglicerol aciltransferasa DGAT1 de A. thaliana ( Bouvier-Nave et al., 2000). El Ejemplo 3 de WO 2009/129582 describe la construcción de AtDGATl en pXZP163. Se hizo un fragmento amplificado por PCR con extremos Kpnl y EcoRV a partir de pXZP163 y se insertó en pENTRll para generar pXZP513E. Se insertó la región codificante de AtDGATl completa de pXZP513E contenida dentro de un fragmento Ba HI-EcoRV, en 35S-pORE04 en el sitio Ba HI-EcoRV, generando pJP2078. Se sintetizó un fragmento sintético, Arath-WRIl, que codifica para el factor de transcripción WRI1 de A. thaliana (Cernac and Benning, 2004), flanqueado por sitios de restricción EcoRI y optimizado por codón para B. napus. Se hizo una construcción genética designada como 35S : Arath-WRIl mediante el clonado de la región codificante completa de Arath-WRIl, flanqueada por sitios EcoRI en 35S-pORE04 en el sitio EcoKL generando pJP3414. Se llevó a cabo la expresión de los genes en tejido de hoja de N. benthamiana de acuerdo al sistema de expresión transitoria como se describió en el Ej emplo 1.
La cuantificación de los niveles de TAG de hojas infiltradas de N. benthamiana mediante Iatroscan reveló que la expresión combinada de los genes DGAT1 y WRIl de A. thaliana resultó en 4,5 y 14,3 veces de incremento de contenido de TAG en comparación con la expresión de WRIl y el control negativo V2, respectivamente (Tabla 9) . Esto correspondió a un promedio y máximo observados de rendimiento de TAG por peso seco de hoja de 5,7 % y 6,51 % respectivamente (Tabla 9 y Figura 12) . El incremento en el aceite de ho a no fue solamente debido a la actividad de la DGAT1 aciltransferasa sobreexpresada ya que fue evidente en los niveles de TAG reducidos cuando se dejó a WRIl fuera de la combinación. Más aún, se observó un efecto sinérgico dando cuenta del 48 % del incremento total de TAG.
Ambas construcciones de DGAT1 y WRIl también condujeron a mayores niveles de ácido oleico a expensas del ácido linoleico en las fracciones de TAG de las hojas infiltradas de N. benthamiana (Tabla 10) . Estos resultados confirman hallazgos recientes de Andrianov et al. (2010) quienes informaron cambios similares en las fracciones lipídicas de TAG, fosfolípidos y TFA de plantas transgénicas de tabaco transformadas con la DGAT1 aciltransferasa de A. thaliana . Sin embrago, cuando se coexpresaron los genes de DGAT1 y WRI1, se observó un efecto sinérgico sobre la acumulación de ácido oleico en las hojas de N. benthamiana - este sinergismo dio cuenta de un estimado de 52 % del contenido total , de ácido oleico cuando se expresaron ambos genes. Los efectos sinérgicos inesperados tanto sobre la acumulación de TAG como sobre los niveles de ácido oleico en las ho as transgénicas de N. benthamiana demostraron el potencial de la activación simultánea de la biosintesis de ácidos grasos y de la captación de acilos en un lipido no polar tal como los TAG en tejidos vegetativos, dos procesos metabólicos que están altamente activos en las semillas en desarrollo.
Se repitió el experimento de expresión transitoria excepto que se sustituyó el supresor V2 por el supresor de silenciamiento viral P19, y con una cuidadosa comparación de muestras sobre la misma hoja para evitar cualquier variación de hoja a hoja. Para esto, se introdujo por separado una construcción quimérica 35S:P19 para la expresión de la proteina supresora de silenciamiento viral P19 del virus de tomate truncado peludo (Wood et al., 2009) en GV3101 de A., tu efaciens mediante coinfiltración.
La cuantificación de los niveles de TAG de las hojas infiltradas de N. benthamiana mediante Iatroscan en este experimento reveló que la expresión transitoria combinada de los genes DGAT1 y WRI1 de A. thalíana resultó en un incremento de 141 veces del contenido de TAG en comparación con el control negativo de P19 (Figura 13). En comparación con la expresión separada de los genes de DGAT1 y WRI1 en la misma hoja, la infiltración combinada aumentó los niveles de TAG en 17 y 5 veces, respectivamente. Una vez más, la coexpresión de ambos genes tuvo un efecto sinérgico (más grande que aditivo) sobre la acumulación de aceite en la ho a en donde el componente sinérgico dio cuenta del 73% del incremento de TAG total. La mayor extensión del incremento de contenido de TAG en este experimento (141 veces) en comparación con el experimento previo (14,3 veces) puede haber sido debido al uso del supresor de silenciamiento P19 en lugar de V2 y por lo tanto una mayor expresión génica a partir de los transgenes.
La Tabla 11 muestra la composición de ácidos grasos de los TAG. Cuando se coexpresaron los genes de DGAT1 y WRI1 en N. benthamiana, se observó una vez más un efecto sinérgico sobre el nivel de acumulación de ácido oleico en la fracción de TAG de hojas. En gran medida este incremento fue a expensas de los ácidos grasos insaturados de cadena media ácido palmítico y ácido esteárico (Tabla 11). También se incrementó el ácido linoleico lo que se puede explicar por los mayores niveles de sustrato de ácido oleico disponibles para la FAD2 ñl2-desaturasa endógena. La expresión individual de los genes de DGATl y WRI1 en N. benthamiana condujo a cambios intermedios en el perfil de TAG sin un incremento tan grande del ácido oleico. Además, pero contrariamente al primer experimento, se detectaron mayores niveles de ácido a-linolénico (ALA) mientras que esto se observó en una menor extensión ante la coexpresión de DGATl y WRI1 en el tejido de hoj a .
El efecto sinérgico observado de la expresión de DGATl y WRI1 sobre la biosintesis de TAG se confirmó con mayor detalle mediante la comparación del efecto de la introducción de ambos genes en JV. benthamiana individualmente o en combinación, en comparación con la introducción de un gen de P19 solo como control, en la misma hoja. Esto fue beneficioso en la reducción de la variación hoja a hoja. Además, se incrementó el número de replicados a 5 y se juntaron las muestras a lo largo de diferentes hojas de la misma planta para mejorar la calidad de los datos. Los resultados se presentan en la Tabla 12.
Tabla 8. Perfil de ácidos grasos y cuantificación de TAG por triplicado en tejido de ho a de Nicotiana benthamiana transformado transitoriamente con las construcciones 35S:pl9, 35S:DGAT1 y 35S:DGAT2.
Tabla 9. Niveles de TAG por triplicado de tejido de hoja de Nicotiana benthamiana transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:DGAT1 y 35S.WRI1. 1 Promedio de tres hojas diferentes infiltradas cuanti ficadas mediante Iatroscan 2 Proporción promedio en base a comparaciones lado a lado en las mismas hojas Tabla 10. Composición de ácidos grasos de TAG producidos en tejido de hoja de Nicotiana bentha iana transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:DGAT1 y 35S:WRI1 (datos de infiltraciones por triplicado).
Tabla 11. Composición de ácidos grasos de TAG producidos en tejido de hojas de N. benthamiana transformado transitoriamente con las construcciones 35S:P19 (control), 35S: RI1 y/o 35S:DGAT1.
Tabla 12. Comparación de WRI1 + DGAT1 unto con los genes individuales En base a los efectos individuales de ambos genes de DGATl y WRI1 ante su expresión en N. benthamiana, en presencia de solamente un efecto aditivo con ausencia de cualquier efecto sinérgico, los presentes inventores esperaban un nivel de TAG de aproximadamente 0,35 o un incremento de 35 veces en comparación con el control negativo de P19. Sin embargo, la introducción de ambos genes resultó en niveles de TAG que fueron 129 veces mayores que el control de P19. En base a estos resultados, los presentes inventores estimaron el efecto aditivo y el efecto sinérgico sobre la acumulación de TAG como 26,9 % y 73,1 %, respectivamente. Además, cuando se analizó la composición de ácidos grasos de los lipidos totales en las muestras de hojas por GC, se observó un efecto sinérgico sobre lo niveles de 018:1?9 en la fracción de TAG de las hojas de N. benthamiana infiltradas con RI1 y DGATl (3 repeticiones de cada una). Los datos se muestran en la Tabla 11.
Para la expresión específica de semilla de la combinación de WRI1 + DGATl, se transformó Arabidopsis thaliana con una construcción de vector binario que incluye un ADN quimérico tanto con el gen pFAEl::WRIl como con pCln2 :: DGATl , o, para comparación, los genes individuales pFAEl::WRIl o pCln2 :: DGATl . Se cosecharon semillas TI de las plantas. Se determina el contenido de aceite de las semillas.
Las semillas tienen un contenido de aceite incrementado.
Ejemplo 12. Expresión constitutiva de una monoacilglicerol aciltransferasa y factor de transcripción WRI1 en células vegetales Se sintetizó un ADN quimérico, que codifica para la MGAT2 de Mus musculus (Cao et al., 2003; Yen and Farese, 2003) y optimizada por codón para B. napus, en Geneart. Se hizo una construcción genética designada como 35S :Musmu-MGAT2 mediante la inserción de la región codificante completa de 1022341_MusmuMGAT2, contenido dentro de un fragmento EcoRI, en pJP3343 en el sitio EcoRI, generando pJP3347. El clonado de la construcción 35S :Arath-WRIl se describe en el E emplo 11. Se llevó a cabo la expresión transitoria en tejido de hoja de N. ben thamíana como se describió en el Ejemplo 1.
Cuando se coexpresaron la MGAT2 de ratón y el vector de transcripción WRI1 de A. thaliana, se incrementaron los niveles de TAG promedio en la hoja de N. benthamíana en 3,3 veces en comparación con la expresión de WRI1 solo (Tabla 13). Además, la expresión de los dos genes resultó en un pequeño (29 %) efecto sinérgico sobre la acumulación de TAG de ho a. El nivel de TAG que se obtuvo con el gen de MGAT2 en presencia de WRI1 fue 3,78 %, cuantificado mediante Iatroscan (Figura 12). Los resultados similares que se obtuvieron con las aciltransferasas MGAT2 animal y DGAT1 vegetal en combinación con el WRI1 de ?. thalíana sugiere que el efecto sinérgico podría ser un fenómeno general cuando se sobreexpresan WRI y las aciltransferasas en tejidos vegetativos de planta que no acumulan aceite.
Se repitió el experimento para introducir construcciones para expresar V2+MGAT2 en comparación con V2+MGAT2+WRI1 , de forma que se agruparon las muestras de hojas infiltradas de tres hojas a partir de la misma planta, para dos plantas cada uno. Por lo tanto, en total cada combinación tuvo infiltraciones con 6 replicados. Esto rindió una desviación estándar más pequeña que la agrupación de muestras de hojas entre diferentes plantas como se hizo en los primeros experimentos. Los datos de estos experimentos se muestran en la Tabla 14. Se confirmaron resultados anteriores (Tabla 13). A pesar de que los niveles absolutos de TAG son diferentes (inherente al ensayo de Benth y también diferente agrupamiento de muestras), el incremento relativo de TAG cuando se coexpresa WRI1 con V2+MGAT2 es similar (2,45 y 2,65 veces ) .
Ejemplo 13. Expresión constitutiva de una monoaci1glicerol aciltransferasa , diacilglicerol aciltransferasa y factor de transcripción WRI1 en células vegetales Se expresaron los genes que codifican para la diacilglicerol aciltransferasa DGAT1 de A. thaliana, la monoacilglicerol aciltransferasa MGAT2 de ratón y el WRI1 de A. thaliana en diferentes combinaciones en tejido de ho a de N. benthamiana de acuerdo al sistema de expresión transitoria como se describió en el Ejemplo 1. Una descripción detallada de las diferentes const ucciones se puede hallar en los Ejemplos 11 y 12.
La expresión combinada de los genes de DGAT1, WRI1 y MGAT2 resultó en un incremento promedio de TAG de casi 3 veces más en comparación con la expresión de las últimas dos (Tabla 15) . El máximo rendimiento observado de TAG que se obtuvo fue de 7,28 % cuantificado mediante Iatroscan (Figura 12) . Los niveles de TAG en hojas no se afectaron en forma significativa cuando se dejó fuera de esta combinación al gen de aciltransferasa de ratón MGAT2. Los resultados que se describieron en el Ejemplo 16, sin embargo, demostraron claramente el efecto positivo de la MGAT2 de ratón sobre la biosintesis de lipidos neutros en hojas de N. benthamiana cuando se expresa en combinación con WRI1, DGAT1 y la proteina oleosina de Sesamum indicum.
Tabla 13. Niveles de TAG por triplicado en tejido de ho a de Nicotiana benthamiana transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2 y 35S:WRI1. 1 Promedio de tres hojas diferentes infiltradas cuantificadas mediante Iatroscan 2 Proporción promedio en base a comparaciones lado a lado en las mismas hojas Tabla 14. Contenido de TAG de muestras de hojas de N. benthamiana infiltradas.
Tabla 15. Niveles de TAG por triplicado en tejido de hoja Nicotiana benthamiana transformada transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2, 35S:DGAT1 y 35S:WRI1. 537 que expresan transitoriamente el pJP3343-LuangWRLl y se analizaron para contenido de aceite.
Ejemplo 24. Silenciamiento del homólogo de CGI-58 en N. tabacum James et al. (2010) han informado que el silenciamiento del homólogo de CGI-58 de ?. thaliana resultó en una acumulación de hasta 10 veces de TAG en las hojas, principalmente en gotas de lipidos en le citosol. Los niveles de galactolipidos también se hallaron elevados, mientras que los niveles de la mayoría de las especies importantes de fosfolípidos permanecieron sin cambios. Interesantemente, los niveles de TAG en las semillas no se vieron afectados y, contrariamente a otros mutantes de degradación de TAG, no se observaron efectos negativos sobre la germinación de semillas.
Se halló que tres transcriptos de longitud completa y dos parciales en el transcriptoma de N. benthamiana mostraban homología con el gen CGI-58 de A. thaliana . Se amplificó una región de 434 pb presente en los cinco transcriptos a partir de ARN aislado de hoja de JV. benthamiana y se clonó mediante clonado LR (Gateway) en el vector de destino pHELLSGATE12. El vector de expresión resultante designado como pTV46 codifica para una molécula horquilla de ARN (ARNcd) para reducir la expresión del gen de tabaco que codifica para el homólogo de 538 CG1-58 y se usó para transformar N. tabacum como se describió en el Ejemplo 1, dando 52 transformantes primarios.
Los transformantes primarios con niveles incrementados de TAG en sus tejidos vegetativos se cruzan con las lineas homocigotas que se describieron en el Ejemplo 20.
Ejemplo 25. Silenci miento de la subunidad pequeña de ADP-glucosa pirofosforilasa (AGPasa) de N. fcabacrum Sanjaya et al. (2011) demostraron que el silenciamiento de la subunidad pequeña en de AGPasa en combinación con la sobreexpresión de WRI incrementa adicionalmente la acumulación de TAG en plántulas de A. thaliana a la vez que se reducen los niveles de almidón. Se ha clonado una subunidad pequeña de AGPasa de brotes de flores (K ak et al., 2007). La secuencia de aminoácidos deducida mostró un 87 % de identidad con la AGPasa de A. thaliana. Se sintetizó un fragmento de 593 pb y se clonó en pHELLSGATE12 mediante clonación LR (Gateway) resultando en el vector binario pTV35. La transformación de N. tabacum se hizo como se describió en el Ejemplo 1 y rindió 43 transformantes primarios.
Los transformantes primarios mostrando una reducción de los niveles totales de almidón hoja se cruzan con las lineas homocigotas que se describieron en los Ejemplo 20 y 21. Además, se cruzan transformantes primarios con lineas homocigotas que son el resultado de un cruzamiento de las 539 lineas que se describieron en 20 y 21.
Ejemplo 26. Producción y uso de construcciones para combinaciones de genes que incluyen un promotor inducible Se hacen construcciones génicas adicionales usando un sistema de promotor inducible para conducir la expresión de al menos uno de los genes en las combinaciones de genes que se describieron previamente, en particular en pJP3503 y pJP3502. En las const ucciones modificadas, el gen WRI1 es expresado por un promotor inducible tal como el promotor de alcA de Aspergilus niger en presencia de un gen alcR expresado por Aspergilus niger. Como alternativa, se expresa una DGAT usando un promotor inducible. Esto es ventajoso cuando no se desea una acumulación máxima de TAG a todos los tiempos durante el desarrollo. Un sistema de promotor inducible o un sistema de promotor controlado por el desarrollo, preferentemente para conducir al factor de transcripción tal como WRI1, permite la inducción del fenotipo de alto TAG en un momento apropiado durante el desarrollo, y la subsiguiente acumulación de TAG a altos niveles .
Se pueden incrementar adicionalmente los TAG mediante la coexpresión de factores de transcripción que incluyen a factores de transcripción embriogénicos tales como LEC2 o BABY BOOM (BBM, Srinivasan et al., 2007). Estos se expresan 540 bajo el control de promotores inducibles como se describió previamente y se súper transforman en lineas transgénicas o se co-trans forman con RI y DGAT.
Se genera pJP3590 mediante el clonado un espaciador MAR como fragmento AatlI en el sitio Aa lI de pORE04. Se genera pJP3591 mediante el clonado un segundo espaciador MAR como fragmento Kpnl en el sitio Kpn~L de pJP3590. Se genera pJP3592 mediante el clonado del fragmento ñsíSI-S al de la molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 416 ( 12ABFJYC_pJP3569_insert ; Figura 19B) en los sitios Asi SI-EcoRV de pJP3591. Se genera pJP3596 mediante el clonado de un cásete de expresión inducible flanqueado por PstI que contiene el promotor alcA que expresa la MGAT2 de M. musculus y una señal de poliadenilacion de lectina de Glycine ax en un sitio Sbfl de pJP3592. Se generan las versiones resistentes a higromicina tanto de pJP3592 como de pJP3596 (pJP3598 y pJP3597, respectivamente) mediante el reemplazo del gen marcador de selección NPTII con el gen flanqueado por HPH en el sitio Fsel-ñscI .
Estas construcciones se usan para transformar las mismas especies de planta que se describieron en el Ejemplo 20. La expresión a partir del promotor inducible se incrementa mediante tratamiento con el inductor de plantas transgénicas después de que las mismas han crecido 541 sustancialmente, de forma que las mismas acumulan niveles incrementados de TAG. Estas construcciones también se súper transforman en construcciones transformadas en forma estable que ya contienen una construcción para incrementar el aceite que incluye la región de T-ADN de tres genes o de cuatro genes (SEQ ID NO: 411 y SEQ ID NO: 412, respectivamente). Como alternativa, los casetes de expresión génica a partir de las construcciones de tres genes y de cuatro genes se clonan en el sitio Noti de- pJP3597 y pJP3598 para dar un sistema de vector constitutivo e inducible para síntesis, acumulación y almacenamiento elevado de ácidos grasos y TAG.
Además de otros promotores inducibles, una alternativa es que la expresión del gen se pueda restringir temporalmente y espacialmente mediante el uso de promotores que son solo activos durante periodos de desarrollo específicos o en tejidos específicos. También se usan promotores químicamente inducibles endógenos para limitar la expresión . a ventanas específicas del desarrollo.
Las personas calificadas en el arte apreciarán que pueden realizarse numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención, tal como se ilustran en las realizaciones específicas, sin apartarse del espíritu o alcance de la invención, tal como ha sido descripta ampliamente. Las realizaciones de la presente deben, por lo tanto, 542 considerarse en todo sentido a modo ilustrativo y no restrictivo .
La presente solicitud reivindica la prioridad de US 61/580590 presentada el 27 de diciembre de 2011 y US 61/718,563 presentada el 25 de octubre de 2012, los contenidos completos de las cuales se incorporan a la presente como referencia.
Todas las publicaciones descritas y/o a las cuales se hizo referencia en la presente se incorporan por completo en la presente.
Toda descripción de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o semejantes que se incluyera en la presente memoria descriptiva solamente sirve a los efectos de proveer un contexto para la presente invención. No debe considerarse como un reconocimiento que cualquiera o todos estos temas formen parte del sustento de Ta técnica anterior o que fueran de conocimiento general en el campo relevante de la presente invención como existía antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.
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Claims (145)

554 NOVEDAD DE IA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un proceso para producir un producto industrial, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido total de lipidos no polares de al menos un 3% aproximadamente, preferiblemente al menos un 5% aproximadamente o al menos un 7% aproximadamente (p/p peso seco ) , ii) convertir al menos algo del lipido en la parte vegetativa de la planta al producto industrial al aplicar calor, medios químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lipido en situ en la parte vegetativa de la planta, y iii) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
2. Un proceso para producir un producto industrial, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener una parte vegetativa de la planta que tiene un contenido total de lipidos no polares de al menos 3% aproximadamente, preferiblemente al menos 5% aproximadamente 555 o al menos 7% aproximadamente (p/p peso seco), ii) procesar físicamente la parte vegetativa de la planta del paso i), iii) convertir al menos algo del lipido en la parte vegetativa de la planta procesada al producto industrial al aplicar calor, medios químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lipido en la parte vegetativa de la planta procesada, y iv) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
3. Un proceso para producir un producto industrial, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener un organismo no humano o una parte del mismo que comprende uno o más polinucleótidos exógenos, en donde cada uno del uno o más polinucleótidos exógenos está ligado operativamente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un organismo no humano o una parte del mismo, y en donde el organismo no humano o parte del mismo tiene un nivel incrementado de uno o más lipidos no polares con relación a un organismo no humano correspondiente o una parte del mismo que carece de uno o más polinucleótidos exógenos, y ii) convertir al menos algo del lipido en el organismo no humano o parte del mismo al producto industrial al aplicar 556 calor, medios químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lipido en situ en el organismo no humano o parte del mismo, y iii) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
4. Un proceso para producir un producto industrial, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener un organismo no humano o una parte del mismo que comprende uno o más polinucleótidos exógenos, en donde el organismo no humano o parte del mismo tiene un nivel incrementado de uno o más lipidos no polares con relación a un organismo no humano correspondiente o una parte del mismo que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, ii) procesar físicamente el organismo no humano o parte del mismo del paso i), iii) convertir al menos algo del lipido en el organismo no humano procesado o parte del mismo al producto industrial al aplicar calor, medios químicos, o enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos, al lipido en el organismo no humano procesado o parte del mismo, y iv) recuperar el producto industrial, produciendo de esa manera el producto industrial.
5. El proceso de conformidad con la reivindicación 2 o reivindicación 4, caracterizado porque el paso de procesar físicamente la parte vegetativa de la planta, o el organismo 557 no humano o parte del mismo comprende uno o más de proceso con rodillos, prensado, trituración o molienda de la parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o parte del mismo .
6. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado además porque comprende los pasos de: (a) extraer al menos algo del contenido de lipido no polar de la parte vegetativa de la planta o el organismo no humano o parte del mismo como lipido no polar, y (b) recuperar el lipido no polar extraído, en donde los pasos (a) y (b) se realizan antes del paso de convertir al menos algo del lipido en la parte vegetativa de la planta, o el organismo no humano o parte del mismo al producto industrial.1
7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el lipido no polar extraído comprende triacilgliceroles, en donde los triacilgliceroles comprenden al menos 90%, preferiblemente al menos 95%, del lipido extraído.
8. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado porque el producto industrial es un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, preferiblemente metil ésteres de ácido graso y/o 558 etil ésteres de ácido graso, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena larga, una mezcla de alcanos de cadena larga, un algueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas de hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono.
9. Un proceso para producir lipido extraído, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener un organismo no humano o una parte del mismo que comprende uno o más polinucleótidos exógenos y un nivel incrementado de uno o más lípidos no polares con relación a un organismo no humano correspondiente o una parte del mismo, respectivamente, que carece de uno o más polinucleótidos exógenos , ii) extraer el lipido del organismo no humano o parte del mismo, y iii) recuperar el lipido extraído, produciendo de esa manera el lipido extraído, en donde cada uno del uno o más polinucleótidos exógenos se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un organismo no humano o parte del mismo, y en donde uno o más o todas las siguientes características aplican: (a) el uno o más polinucleótidos exógenos comprenden un primer polinucleótido exógeno que 559 codifica un ARN o péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, y un segundo polinucleotido exógeno que codifica un ARN o polipéptido involucrado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, (b) si el organismo no humano es una planta, una parte vegetativa de la planta tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos 5% aproximadamente, preferiblemente al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamen e, más preferiblemente al menos 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente , o más preferiblemente al menos 15% aproximadamente (p/p peso seco), (c) el organismo no humano es una alga seleccionada del grupo que consiste de diatomeas (bacilariofitas ) , algas verdes ( clorofitas ) , algas verdiazules ( cianofitas ) , algas pardo-amarillentas ( crisofitas ) , haptofitas, algas marrones o pardas y algas heterocontas , (d) el uno o más lípidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un 560 grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, (e) el contenido de ácido graso total en los lipidos no polares comprende al menos 2% más de ácido oleico y/o al menos 2% menos de ácido palmitico que los lipidos no polares en el organismo no humano correspondiente o parte del mismo que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, (f) los lipidos no polares comprenden un nivel modificado de esteróles totales, preferiblemente esteróles libres (no esterificados ) , esteroil ésteres, esteroil glicósidos, con relación a los lipidos no polares en el organismo no humano correspondiente o parte del mismo que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, (g) los lipidos no polares comprenden ceras y/o ésteres de ceras, y (h) el organismo no humano o parte del mismo es un miembro de una población o colección agrupada de al menos 1000 aproximadamente de tales organismos no humanos o partes de los mismos, respectivamente, de los cuales se extrae el lípido . 561
10. El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el uno o más polinucleótidos exógenos comprenden el primer polinucleótido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno, y en donde uno o más o todas las características (b) hasta (h) aplican.
11. El proceso de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque (i) el organismo no humano es una planta, una alga, o un organismo apropiado para fermentación tal como un hongo, o (ü) la parte del organismo no humano es una semilla, un fruto, o una parte vegetativa de una planta.
12. El proceso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la parte es una semilla de planta y el lípido extraído es aceite de semillas.
13. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 12, caracterizado porque la planta es, o la parte vegetativa de la planta es de una especie seleccionada del grupo que consiste de Acrocomía aculeata (palma macaúba), Arabidopsís thaliana, Aracinis hypogaea (cacahuate), Astrocaryum murumuru (palmera murumuru), Astrocaryu vulgare (tucuma), Attalea geraensis (Indaiá-rateiro), Attalea umilis (Palmera oleaginosa americana), Attalea oleífera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babassu) , Avena sativa (avenas), Beta 526 constitutivos de virus de monocotiledóneas o promotores que se ha demostrado que funcionan en un contexto transgénico en especies de monocotiledóneas (por ejemplo, el promotor Ubi de maiz descrito por Christensen et al., 1996). De forma similar, se intercambian los promotores CaMV-35S de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en especies de monocotiledóneas. Estas construcciones se transforman en trigo, cebada y maiz usando métodos estándar. Especies de Miscanthus Se hacen construcciones genéticas para transformación de especies de Miscanthus mediante el intercambio de los promotores Arath-SSU de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en Miscanthus. Los promotores adecuados incluyen a promotores virales constitutivos, un promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1996) o promotores que se ha demostrado que funcionan en un contexto transgénico en Miscanthus. De forma similar, se intercambian los promotores CaMV-35S de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en Miscanthus. Las nuevas construcciones se transforman en Miscanthus mediante un método mediado por microproyectiles similar al descrito por Wang et al., 2011. Mi o {Panicum virgatum) Se hacen construcciones genéticas para transformación de mijo mediante el intercambio de los promotores Arath-SSU 527 de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en mijo. Los promotores adecuados incluyen a promotores virales constitutivos o promotores que se ha demostrado que funcionan en un contexto transgénico en mijo (por ejemplo, Mann et al., 2011). De forma similar, se intercambian los promotores CaMV-35S de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en mijo. Las nuevas construcciones se transforman en mijo mediante un método mediado por Agrobacterium similar al descrito por Chen et al., 2010 y Ramamoorthy y Kumar, 2012. Caña de azúcar Se hacen construcciones genéticas para transformación de caña de azúcar mediante el intercambio de los promotores Arath-SSU de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en caña de azúcar. Los promotores adecuados incluyen a promotores virales constitutivos o promotores que se ha demostrado que funcionan en un contexto transgénico en caña de azúcar (por ejemplo, el promotor de maíz Ubi descrito por Christensen et al., 1996). De forma similar, se intercambian los promotores CaMV-35S de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en caña de azúcar. ¦ Las nuevas construcciones se transforman en caña de azúcar mediante un método mediado por microproyectiles similar al descrito por Bo er et al., 1996. Hierva elefante 528 Se hacen construcciones genéticas para transformación de Pennísetum purpureum mediante el intercambio de los promotores Arath-SSU de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en hierba elefante. Los promotores adecuados incluyen a promotores virales constitutivos o promotores que se ha demostrado que funcionan en un contexto transgénico en especies de Pennísetum tales como similares a P. glaucu (por ejemplo el promotor de maíz Ubi descrito por Christensen et al., 1996). De forma similar, se intercambian los promotores CaMV-35S de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en especies de Pennísetum. Las nuevas construcciones se transforman en P. purpureum mediante un método mediado por microproyectiles similar al descrito por Girgi et al., 2002. Lolium Se hacen construcciones genéticas para transformación de Lolium perenne y otras especies de Lolium mediante el intercambio de los promotores Arath-SSU de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en raigrás. Los promotores adecuados incluyen a promotores virales constitutivos o promotores que se ha demostrado que funcionan en un contexto transgénico en especies de Lolium (por e emplo el promotor de maiz Ubi descrito por Christensen et al., 1996). De forma similar, se intercambian los promotores CaMV-35S de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en especies de 529 Pennisetum. Las nuevas construcciones se transforman en Lolíum perenne mediante un método mediado por carburo de silicio similar al descrito por Dalton et al., 2002 o un método mediado por Agrobacterium similar al descrito por Bettany et al . , 2003. Se modifican pJP3502 y pJP3503 para la expresión especifica en semillas de las construcciones genéticas mediante intercambio de los promotores CaMV-35S y Arath-SSU (excepto el cásete marcador de selección) por promotores específicos de semilla que son activos en las especies obj etivo . Cañóla Se hacen construcciones genéticas para transformación de Brassíca napus mediante el intercambio de los CaMV-35S y promotores Arath-SSU de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en cañóla. Los promotores adecuados incluyen a promotores que se ha demostrado previamente que funcionan en un contexto transgénico en Brassíca napus (por ejemplo, el promotor FAE1 de A. thaliana, promotor napin de Brassíca napus, promotores conlininl y conlinin2 de Línum usítatíssímum) . Las nuevas construcciones se transforman en B. napus como se describió previamente. So a (Glicina ax) Se hace una construcción genética mediante el clonado 530 del fragmento PspOMI a partir de un fragmento de ADN sintetizado que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 415 (inserto So a synergy; Figura 19A) en un vector binario tal como pORE04 en el sitio Notl. Este fragmento contiene Arath-WRIl expresado por el promotor Arath-FAEl, Arath-DGATl expresado por un promotor Linus-Cnl2, Musmu-MGAT2 expresado por Linus-Cnll y Arath-GPAT4 expresado por Linus-Cnll. Se hace una construcción genética adicional mediante el intercambio de la región codificante de GPAT por una región que codifica para oleosina. Se hace una construcción genética adicional mediante la eliminación del cásete de expresión de MGAT. Se generó una construcción genética, pJP3569 (Figura 21), mediante el clonado del fragmento Sbfl-PstI de la molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 415 en el sitio Psti de pORE04. Esta construcción contuvo (i) una región codificante que codifica para el factor de transcripción WRI1 de A. thaliana optimizado por codón para expresión en G. max, y expresada a partir del promotor del inhibidor de tripsina 3 de G. max kunitz ( Glyma-KTi3 ) , (ii) una región codificante que codifica para la DGAT2A de Umbelopsis ramanniana (optimizada por codón como se describió en Lardizabal et al., 2008) y expresada a partir del promotor de la subunidad alfa de beta coniglicina 531 G. max (Glyma-b-conglicinina ) y (iii) una región codificante que codifica para la MGAT2 de M. usculus, optimizada por codón para expresión en G. max. Se generó una segunda construcción genética, pJP3570, mediante el clonado el fragmento Sbfl-SwaI de la molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 415 en pORE04 en los sitios EcoRV-Pstl para dar un vector binario que contiene genes que expresan el factor de transcripción WRI1 de A. thalíana y la enzima DGAT2A de U. ramanníana . De forma similar, se hizo una tercera construcción genética, pJP3571, mediante el clonado del fragmento AsiSI de la molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 415 en el sitio AsiSI de pORE04 para dar un vector binario que contiene un gen que codifica para la enzima DGAT2A de U. ramanníana. Se generó una cuarta construcción genética, pJP3572, mediante el clonado del fragmento Notl de la molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 415 en pORE04 en el sitio Notl para dar un vector binario que contiene un gen que expresa el factor de transcripción WRI1 de A. thaliana. Se generó una quinta construcción genética, pJP3573, mediante el clonado el fragmento SwaI de la molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 415 en pORE04 en el sitio EcoKV para dar un vector binario que 532 contiene el gen que codifica para MGAT2 de M. musculus . Se genera una sexta construcción genética, pJP3580, mediante el reemplazo de la MGAT2 de M. musculus por el gen de oleosina de Sesamum índicum. Cada una de estas seis construcciones se usa para transformar soja, usando los métodos que se describieron en el Ejemplo 6. Las plantas transgénicas que se produjeron mediante la transformación con cada una de las construcciones, en particular pJP3569, producen semillas con contenido de aceite incrementado. Remolacha Se usan los vectores pJP3502 y pJP3503 (ver anterior) como se usaron para la transformación de tabaco, para transformar plantas de remolacha {Beta vulgaris) mediante transformación mediada por Agrobacterium como se describió en Lindsey & Gallois (1990). Las plantas producen un gran incremento de los niveles de TAG en sus hojas, similar en extensión a las plantas de tabaco que se produ eron como se describió previamente. Se cosechan las plantas de remolacha transgénica mientras las hojas aún están verdes o preferentemente verde/ amarillas justo antes del comienzo de la senescencia o en forma temprana en el proceso de desarrollo, o sea, cuando el contenido de azúcar de la remolacha está en un alto nivel y después de permitir la 533 acumulación de TAG en las hojas. Esto permite la producción de remolachas de doble propósito que son adecuadas tanto para la producción de azúcar de la planta como de lipidos de las hojas; el lipido se puede convertir directamente a combustible biodiésel mediante ala molienda de las hojas y la centrifugación del material resultante para separar la fracción oleosa, o para la producción directa de hidrocarburos mediante pirólisis del material de hoja. Los promotores que son activos en la raíz (tubérculo) de remolacha también se usan para expresar los transgenes en el tubérculo. E emplo 21. Transformación estable de Solanvaa tuberosum con genes que incrementan el aceite Se modificó a pJP3502, el vector de expresión binario intermedio que se describió en el ejemplo previo, cortando primero un promotor SSU por digestión con Ascl+Ncol y reemplazándolo por el promotor de papa B33 flanqueado por AscI y Ncol para generar pJP3504. Se reemplazó el promotor SSU de pJP3504 junto con un fragmento del gen de WRL1 de A. thaliana en los sitios PspOMI por un promotor B33 de papa con el mismo fragmento del gen de WRL1 de A. thaliana flanqueado por No i-PspOMI para generar pJP3506. Se agregó pJP3347 a pJP3506 como se describió en el ejemplo previo para generar pJP3507. Esta construcción se muestra esquemáticamente en la 534 Figura 20. Su secuencia se da en SEQ ID NO: 413. La construcción se usa para transformar papa {Solanum tuberosum) para incrementar el contenido de aceite en los tubérculos. Ejemplo 22. Enzimas de fusión GPAT-MGAT Se prueba la actividad enzimática de las fusiones de enzima GPAT-MGAT para determinar si esto incrementaría la accesibilidad del MAG producido por GPAT para la actividad MGA . Primero se sintetizó una región conectora adecuada y se clonó en un vector de clonación. Este conector contuvo sitios adecuados para el clonado de las regiones codificantes N-terminal {EcoRI-Zral ) y C-terminal [Ndel-Smal o Ndel-Psti ) . atttaaatgcggccgcgaattcgtcgattgaggacgtccctactagacctgctgg acctcctcctgctacttactacgattctctcgctgtgcatatggtcagtcatgcccgggcc tgcaggcggccgcatttaaat (SEQ ID NO: 414) Se hizo una fusión GPAT4 -MGAT2 (N-terminal de G AT4 y C-terminal de MGAT2) clonando primero un fragmento de ADN que codifica para la GPAT4 de A. thaliana, flanqueada por los sitios Mfel y Zral y sin un codón de finalización C-terminal, en los sitios EcoKl-ZraL Luego se clonó el fragmento de ADN que codifica para la MGAT2 de M. musculus, flanqueada por los sitios Ndel-PstI , en los sitios Ndel-Pstl para generar una secuencia codificante individual GPAT4-MGAT2. Luego se clonó la secuencia codificante fusionada como fragmento iVofcl en pYES2 para generar pYES2 : : GPAT4-MGAT2 y el vector de 535 expresión binario constitutivo pJP3343 para generar pJP3343 : : GPAT4-MGAT2. De forma similar, se hizo una fusión MGAT2-GPAT4 (N-terminal de MGAT2 y C-terminal de GPAT4) clonando primero el fragmento de ADN que codifica para la MGAT2 de M. musculus, flanqueada por los sitios EcoRI y Zral sin un codón de terminación C-terminal, en los sitios EcoRI-Zral . Luego se clonó el fragmento de ADN que codifica para la GPAT4 de A. thalíana, flanqueado por los sitios Ndel-PstI , en los sitios Ndel-Psti para generar una secuencia codificante individual MGAT2-GPAT4. La secuencia codificante fusionada se clonó entonces como fragmento JVofcl en pYES2 para generar pYES2 : :MGAT2-GPAT4 y el vector de expresión binaria constitutivo pJP3343 para generar pJP3343 : :MGAT2-GPAT4. Los vectores de expresión en levaduras se prueban en levaduras S. cerevísiae y los vectores binarios se prueban en N. bentha iana y se comparan para contenido de aceite y composición con controles con las regiones codificantes individuales. Ejemplo 23. Descubrimiento de nuevas secuencias WRL1 Se clonan tres nuevas secuencias WRL1 en pJP3343 y en otros vectores de expresión binarios constitutivos adecuados y se prueban en N. benthamiana. Estos incluyen a los genes que codifican para Sorbi-WRLl (de Sorghum bicolor; SEQ ID 536 NO: 334), Lupan-WRLl (de Lupinus angustí folius; SEQ ID NO: 335) y Ricco-WRLl (de Ricínus communis; SEQ ID NO:336) . Se prueban estas construcciones en comparación con el gen que codifica para WRI1 de Arabidopsis en el ensayo en hojas de N. benthamiana . Como paso inicial de este procedimiento, se identificó un fragmento de ADNc parcial correspondiente a WRL1 en la base de datos de EST de semillas en desarrollo de Lupinus angustifolius (NA-080818_Platel4 f06. bl , SEQ ID NO:277) . Subsiguientemente se recuperó un ADNc de longitud completa (SEQ ID NO: 278) mediante una PCR RAC en 5' y 3' usando cebadores anidados y ADNc aislados de semillas en desarrollo de Lupinus angustifolius . El ADNc de longitud completa era de 1729 pb de longitud, incluyendo una secuencia codificante de proteina de 1284 pb que codifica para un polipéptido predicho de 428 aminoácidos (SEQ ID NO:337). Luego se amplificó por PCR la región codificante completa del ADNc de longitud completa de WRL1 de lupin usando cebadores directos y reversos en donde ambos incorporaron sitios de restricción EcoRI para facilitar el clonado en el vector pJP3343 bajo el control de un promotor 35S en orientación sentido. Se infiltró la cepa de A. turnefaciens AGL1 portando el pJP3343-LuangWRLl en tejidos de hoja de N. benthamiana como se describió en el Ejemplo 1. Luego se cosecharon discos de ho a 501 para extracción de ADN y subsiguiente PCR para determinar qué lineas eran transgénicas y cuáles eran nulas para el transgen. Luego se cosechó la población con el tejido aéreo entero de cada plántula, se limpió de suelo y se secó por congelación. Se registró el peso seco de cada muestra y se aislaron los lipidos totales. Se cuanti ficaron los TAG en estas muestras de lipidos totales mediante TLC-FID y se determinó la proporción de TAG con un estándar interno ( DAGE ) en cada muestra (Figura 14). Se halló que el nivel promedio de TAG en las plántulas transgénicas de la linea 35S:Musmu-MGAT2 3347-19 fue 4,1 veces superior que el nivel promedio de TAG en las plántulas nulas. El evento con el mayor incremento de TAG tuvo 7,3 veces más TAG que el promedio de los eventos nulos . Expresión constitutiva en A. thalíana Se demostró la actividad enzimática de las MGAT1 y MGAT2 de M. musculus en A. thaliana . Se transformaron los vectores quiméricos 35S : Musmu-MGA l y 35S : Musmu-MGAT2 junto con el control de vector vacio pORE04 en A. thaliana mediante el método de inmersión floral y se seleccionaron semillas de los transformantes primarios en medio de kanamicina. Se cosecharon las semillas T2 de estas plantas TI y se determinaron los TFA de las semillas de cada planta (Figura 15) . Se haló que el promedio de mg de TFA/g de semilla es 502 139±13 para las líneas control pORE04 con mediana de 1360, 152±14 para las líneas 35S:MGAT1 con mediana de 155,1 y 155+11 para las líneas 35S:MGAT2 con mediana de 154,7. Esto representó un incremento promedio de TFA, en comparación con el control, de 9,7 % para 35S:MGAT1 y de 12,1 % para 35S:MGAT2. Ejemplo 19. Genes adicionales Incrementos adicionales de aceite Se prueban genes adicionales junto con las combinaciones que se describieron previamente para determinar si se pueden conseguir incrementos adicionales de aceite. Estos incluyen a los siguientes genes de Arabidopsís: AT4G02280, sacarosa sintasa SUS3; AT2G36190, Invertasa CWINV4; AT3G13790, invertasa CWINV1; AT1G61800, translocador de Glucosa 6 fos fato : fos fato GPT2; AT5G33320, transportador de fosfoenolpiruvato PPT1; AT4G15530, piruvato ortofosfato diquinasa de plástido PPD ; AT5G52920, Piruvato quinasa pPK-ß?. Los genes que codifican para para estas enzimas se sintetizan y clonan en el vector de expresión binaria constitutiva pJP3343 como fragmentos £coRI para probar en N. ben thamiana . Cuando los siguientes genes se agregaron a la combinación de WRI1, DGAT1, MGAT2 y oleosina y se expresaron en hojas de N. benthamiana, no se observó un incremento 503 adicional en el nivel de TAG, : PDAT de cártamo, PDAT1 de Arabidopsis thaliana, DGAT2 de Arabidopsís thaliana, caleosina de Arabidopsis thaliana, oleosina de maní, hemoglobina 2 de Arabidopsis thaliana, iPLAh de Homo sapiens, GPAT4 de Arabidopsis thaliana, G3P deshidrogenasa de E. coli, G3P deshidrogenasa de levadura, LPAAT2 de castor, beta-fructofuranosidasa de Arabidopsis thaliana (ATBFRUCT1, NM_112232), beta-fructofuranosidasa de Arabidopsis thaliana (cwINV4, NM_129177 ), lo que indica que ninguna de estas actividades enzimáticas era limitante de reacción en las hojas de N. benthamiana cuando se expresaba transitoriamente. Esto no indica si las mismas no tendrán efecto en plantas transformadas en forma estable, tales como en las semillas, o en otros organismos. Se prueban otros genes adicionales para actividad de incremento de aceite aditiva o sinérgica. Estos incluyen a los siguientes genes modelos de Arabidopsis thaliana o las proteínas codificadas por los mismos, y homólogos de otras especies, que se agrupan por función putativa y que se ha demostrado previamente que están activados en tejidos con contenido de aceite incrementado. Genes/proteínas involucradas en degradación de sacarosa: AT1G73370, AT3G43190, AT4G02280, AT5G20830, AT5G37180, AT5G49190, AT2G36190, AT3G13784, AT3G13790, AT3G52600. Genes/proteínas 504 involucrados en la vía oxidativa de pentosas : fosfato: AT3G27300, AT5G40760, AT1G09420, AT1G24280, AT5G13110, AT5G35790, AT3G02360, AT5G41670, AT1G64190, AT2G45290, AT3G60750, AT1G12230, AT5G13420, AT1G13700, AT5G24410, AT5G24420, AT5G24400, AT1G63290, AT3G01850, AT5G61410, AT1G71100, AT2G01290, AT3G04790, AT5G44520, AT4G26270, AT4G29220, AT4G32840, AT5G47810, AT5G56630, AT2G22480, AT5G61580, AT1G18270, AT2G36460, AT3G52930, AT4G26530, AT2G01140, AT2G21330, AT4G38970, AT3G55440, AT2G21170. Genes/proteínas involucrados en glicólisis: AT1G13440, AT3G04120, AT1G16300, AT1G79530, AT1G79550, AT3G45090, AT5G60760, AT1G56190, AT3G12780, AT5G61450, AT1G09780, AT3G08590, AT3G30841, AT4G09520, AT1G22170, AT1G78050, AT2G36530, AT1G74030. Genes/proteínas que funcionan como transportadores de plástidos : AT1G61800, AT5G16150, AT5G33320, AT5G46110, AT4G15530, AT2G36580, AT3G52990, AT3G55650, AT3G55810, AT4G26390, AT5G08570, AT5G56350, AT5G63680, AT1G32440, AT3G22960, AT3G49160, AT5G52920. Genes/proteínas involucrados en metabolismo de malato y piruvato : AT1G04410, AT5G43330, AT5G56720, AT1G53240, AT3G15020, AT2G22780, AT5G09660, AT3G47520, AT5G58330, AT2G19900, AT5G11670, AT5G25880, AT2G13560, AT4G00570. Se preparan const ucciones que incluyen las secuencias que codifican para las proteínas candidato, las que se 505 infiltran en hojas de N. benthamiana como en los experimentos previos, y se analizan el contenido y la composición de ácidos grasos . Genes que ayudan a incrementar el contenido de lipidos no polares se combinan con otros genes como se describió previamente, principalmente los que codifican para MGAT, Wril, DGAT1 y una Oleosina, y se usan para transformar células de plantas. Incrementos en ácidos grasos inusuales Se prueban genes adicionales junto con las combinaciones que se describieron previamente para determinar si se pueden conseguir incrementos en ácidos grasos inusuales. Estos incluyen a los siguientes genes (se proveen los Nos. de Acceso a GenBank) que se agrupan por función putativa y homólogos de otras especies. Delta-12 acetilenasas ABC00769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; Delta-12 conjugasas AAG42259, AAG42260, AAN87574; Delta-12 desaturasas P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; Delta-12 epoxigenasas XP_001840127 , CAA76156, AAR23815; Delta-12 hidroxilasas ACF37070, AAC32755, ABQ01458, AAC49010; y enzimas Delta-12 P450 tales como AF406732. Se preparan construcciones que incluyen a las secuencias que codifican para las proteínas candidato, las que se infiltran en ho as de N. benthamiana como en los experimentos previos, y se analizan su contenido y 506 composición de ácidos grasos. Las secuencias nucleotidicas de las regiones codificantes pueden estar optimizadas por codón para las especies huéspedes de interés. Los genes que ayudan a incrementar el contenido de ácidos grasos inusuales se combinan con los otros genes como se describió previamente, principalmente con los que codifican para MGAT, WRI1, DGAT1 y una Oleosina, y se usan para transformar células vegetales. Ejemplo 20. Transformación estables de plantas que incluyen a Nlcotiana fcafoacrum con combinaciones de genes que incrementan el aceite Se usó un vector de expresión binario existente, pORE04+llABGBEC (Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. No. 61/660392), que contenia un promotor 35S con región potenciadora doble que expresa el gen de resistencia de kanamicina NPTII y tres casetes de expresión génica, como vector de inicio para preparar varias construcciones en donde cada una contiene una combinación de genes para transformación estable de plantas. Este vector se modificó por intercambio de los genes expresados por genes que incrementan el aceite, como sigue. Primero se modificó pORE04+llABGBEC mediante la inserción de un gen de oleosina de sésamo interrumpido por intrón, flanqueado por sitios Noti, a partir del vector pRShl-PSPl en los sitios Noti de PORE04+11ABGBEC para generar pJP3500. Luego se modificó 507 pJP3500 mediante la inserción de un fragmento de ADN optimizado por codón que codifica para el gen de WRL1 de A. thalíana en los sitios EcoRI para generar pJP3501. Se modificó adicionalmente a pJP3501 mediante la inserción de un fragmento de ADN que codifica para la región codificante de DGAT1 de tipo salva e de A. thalíana, flanqueada por los sitios AsíSI, en los sitios AsiSI para generar pJP3502 ( SEQ ID NO:409) . Se hizo una modificación final mediante la inserción de otro cásete de expresión, que consiste en un promotor 35S de región potenciadora doble que expresa una región codificante que codifica para la MGAT2 de M. musculus, como fragmento Stul-Zral en el sitio Sfol de pJP3502 para generar pJP3503 (SEQ ID NO:410) . Se extrajo el cásete de expresión de MGAT2 a partir de pJP3347 en los sitios Stul + Zral. Se usaron pJP3502 y pJP3503 para transformar establemente a N. tabacum como se describe más adelante. Mediante estas construcciones, pJP3502 contuvo las regiones codificantes de WRL1 y DGAT1 de A. thalíana dirigidas por el promotor de la subunidad pequeña de la Rubisco de A. thalíana (SSU) y el promotor 35S con doble región potenciadora, respectivamente, así como también un cásete SSU:oleosina de sésamo. La región de T-ADN de esta construcción se muestra esquemáticamente en la Figura 16. El vector pJP3503 además contuvo el cásete e35S::MGAT2. Esta construcción se muestra 508 esquemáticamente en la Figura 17. La secuencia de nucleótidos de la región de T-ADN de la construcción pJP3503 se da como SEQ ID NO:412. Transformación estable de Nicotiana tabacum con combinaciones de genes Se introdujeron por separado los vectores binarios pJP3502 y pJP3503 en la cepa AGL1 de A. turnefaciens mediante ün procedimiento de electroporación estándar. Las células transformadas se seleccionaron y crecieron en LB-agar suplementado con kanamicina (50 mg/1) y rifampicina (25 mg/1) y se incubaron a 28°C durante dos días. Se usó una colonia individual de cada uno para iniciar cultivos nuevos en caldo LB. Después de 48 horas de incubación con aireación vigorosa, se colectaron las células mediante centrifugación a 2.000 g y se eliminó el sobrenadante. Se resuspendieron las células a una densidad de OD600 = 0,5 en medio fresco consistente en 50% de LB y 50% de medio MS . Se extrajeron muestras de hojas de N. tabacum cultivar W38 crecidas en forma aséptica in vítro con un escalpelo y se cortaron en piezas de aproximadamente entre 0,5 y 1 cm2 de tamaño mientras que se sumergieron en suspensiones de A. turnefaciens . Las piezas de hojas cortadas se dejaron reposar en las suspensiones de A. turnefaciens a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de secarse por transferencia sobre 509 un papel de filtro estéril y transferirse a placas de MS sin suplemento antibiótico. Después de un periodo de cocultivo de dos días a 24°C, se lavaron los explantes tres veces con medio MS liquido estéril y luego se secaron por transferencia con papel de filtro estéril y se colocaron en un agar MS selectivo suplementado con 10 mg/1 de benzilaminopurina (BAP), 0,5 mg/1 de ácido indolacético (IAA), 100 mg/1 de kanamicina y 200 mg/1 de cefotaxima. Se incubaron las placas a 24°C durante dos semanas para permitir el desarrollo de brotes a partir de las piezas de ho a de N. tabacum transformadas . Para establecer plantas transgénicas enraizadas in vitro, se cortaron brotes verdes sanos y se transfirieron a medio de agar MS suplementado con 25 µg l de IAA, 100 mg/1 de kanamicina y 200 mg/1 de cefotaxima. Después de que se desarrollaron las raices, se transfirieron las plantas individuales a suelo y se crecieron en el invernáculo. Se cosecharon muestras de hojas a diferentes etapas del desarrollo de la planta incluyendo antes y después de la floración. Se cuantificaron los ácidos grasos totales, lipidos polares y TAG y se determinaron sus perfiles de ácidos grasos mediante TLC/GC como se describió en el Ejemplo 1. Análisis de t ansformantes de pJP3503 510 Para la transformación con pJP3503 ("construcción de 4 genes"), se tomaron muestras de hojas de aproximadamente 1 cm2 a partir de 30 transformantes primarios antes de la formación de brotes florales y se cuantificaron los niveles de TAG en las muestras mediante Iatroscan. Se seleccionaron siete plantas para análisis adicional, de las cuales cinco mostraron mayores niveles de aceite de ho a y dos exhibieron niveles de aceite esencialmente iguales a las plantas de tipo salvaje. Se analizaron muestras de hojas secadas por congelación de estas plantas para contenido de lipidos totales y contenido de TAG y composición de ácidos grasos por TLC y GC. Se halló que las plantas transformantes numeradas 4 y 29 tienen niveles considerablemente incrementados de aceite de hoja en comparación con las de tipo salvaje, mientras que la planta número 21 exhibió los menores niveles de TAG esencialmente como los niveles de las de tipo salvaje (Tabla 30) . Las plantas numeradas 11, 15 y 27 tuvieron niveles intermedios de aceite de hoja. Se halló que los niveles de ácido oleico en los TAG se correlacionan inversamente con los rendimientos de los TAG, en consistencia con los resultados de los experimentos anteriores de expresión transitoria en N. benthamíana . En las plantas transformadas numeradas 4 y 29, el contenido de aceite de hoja (como porcentaje de peso seco) se 511 halló considerablemente incrementado al momento de la floración (Tabla 31) . A partir de los datos de la Tabla 31, el incremento fue de al menos 1,7 y 2,4 veces para las plantas 4 y 29, respectivamente. No se observó tal cambio para la planta 21 que tuvo niveles de TAG similares a los controles de tipo salvaje. Los niveles de ácido oleico en las fracciones de TAG que se aislaron de cada muestra siguieron un patrón similar. Este ácido graso se acumuló hasta 22,1% de los ácidos grasos de los TAG de las plantas 4 y 29, un incremento de entre 17 y 18 veces en comparación con la planta 21 y la de tipo salvaje. El incremento de ácido oleico se acompañó por niveles incrementados de ácido linoleico y ácido palmítico mientras que los niveles de ácido a-linolénico cayeron 8 veces en comparación con la planta 21 y el control de tipo salvaje. A diferencia de los TAG, los niveles de lipidos polares disminuyeron levemente en la etapa de floración en las tres lineas (Tabla 32). Los cambios en los niveles de ácidos grasos C18 monoinsaturados y poliinsaturados en las fracciones de lipidos polares de las tres lineas fueron similares a los cambios en la composición de TAG a pesar de que los cambios en ácido oleico y ácido linoleico fueron menos marcados. Se observaron incrementos significativos en los lipidos totales de ho as para las lineas 4 y 29 durante la floración con niveles que alcanzaron 512 más de 10% del peso seco (Tabla 33) . Los niveles de lipidos totales de ho a en la planta 21 antes y durante la floración fueron similares a los niveles que se observaron en las plantas de tipo salvaje en etapas similares (Tablas 33 y 35) . Los cambios en la composición de ácidos grasos de lipidos totales de las tres plantas fueron similares a las respectivas composiciones de ácidos grasos de TAG. Se halló que el aceite de hoja en la planta 4 durante el establecimiento de semillas se elevó adicionalmente al inicio de la clorosis de hoja. Los mayores niveles de TAG de hoja que se detectaron en esta etapa correspondieron a un aumento de 65 veces en comparación con hojas de edad similar en la planta 21 durante la aparición de semillas y a un incremento de 130 veces en comparación con hojas de floración similar de plantas de tipo salvaje (Tabla 34; Figura 18) . Los TAG incrementados en esta planta coincidieron con los niveles elevados de ácido oleico. Contrariamente a la planta 4, los niveles de TAG de hoja en los otros dos transformantes primarios y en el tabaco de tipo salvaje no aumentaron, o solamente aumentaron en forma marginal, después de la floración y durante la clorosis. Las hojas inferiores de las plantas 4 y 29 exhibieron menores niveles de TAG ante la senescencia. En todas las plantas, los niveles de ácido linoleico cayeron mientras que los niveles de ácidos a- 513 linolénico se incrementaron con la progresión de la edad de las hojas. En consistencia con los niveles incrementados de TAG, los niveles de lipidos totales en las hojas de las plantas 4 y 29 durante la aparición de semillas se elevaron adicionalmente en comparación con hojas similar de ambas plantas durante la floración (Tablas 33 y 35). El nivel de lipidos totales más alto que se detectó en la planta 4 en base a peso seco fue de 15,8 %, equivalente a un incremento de 7,6 y 11,2 veces en comparación con hojas similares de la planta 21 y de las plantas de tipo salvaje, respectivamente. En tanto que la composición de ácidos grasos de lipidos totales en las hojas de la planta de tipo salvaje y de la planta 21 fue similar, se observaron diferencias significativas en las plantas 4 y 29. Estos cambios siguieron a los hallados en los TAG de ambos transformantes primarios. Desconcertantemente, las hojas de las plantas 4 y 29 antes y durante la aparición de semillas se caracterizaron por una superficie tersa, lo que provee un cambio fenotipico que puede servir como un fenotipo que se califica visualmente de forma fácil, que puede ayudar al cálculo temporal para la cosecha para un contenido de aceite máximo. En resumen, las hojas de las plantas 4 y 29 acumularon rápidamente TAG durante la floración hasta la aparición de 514 a última etapa, la mayoría de las hojas les de TAG entre 7 % y 13 % en base a peso ación con entre 0,1% y 0,2% para la línea 21. e TAG y niveles de lípidos totales observados lejos los niveles conseguidos por Andrianov et enes informaron hasta un máximo de 5,8% y 6,8% ? hojas de N. tabacum ante la expresión DGAT1 de A. thaliana y la expresión inducible 2 de A. thaliana. taje de TAG (% en peso del peso seco de hoja) do oleico (% de ácidos grasos totales) en los hojas de plantas de tabaco primarias ansformadas con pJP3503 % de TAG (PS) % de 018:1" Etapa desarrollo planta 00, 6 2,3 Brotación 0,1 1,3 Floración 00,5 1,5 Brotación 1,29 10,2 Brotación 0,21 7,4 Floración 0,23 4,5 Sin brotes 00, 1 1,9 Sin brotes 0,19 3,3 Brotación 1, 15 10, 4 Sin brotes i Niveles de TAG (% en peso del peso seco de .ición de ácidos grasos de TAG aislados de ? salvaje y tres plantas seleccionadas de rmadas con pJP3503, antes y durante la datos que se muestran son promedios y 515 desviaciones estándar de entre 2 y 3 repeticiones independientes . Tabla 32 . Niveles de lípidos polares ( en peso del peso seco de hoja) y composición de ácidos grasos de lipidos polares de tejido de hoja de plantas de tabaco seleccionadas transformadas con pJP3503, antes y durante la floración. Los datos que se muestran son el promedio y las desviaciones estándar de entre 2 y 3 repeticiones independientes, excepto para la planta 21 (antes de la floración). 516 Tabla 33. Niveles de lipidos totales (% en peso del peso seco de hoja) y composición de ácidos grasos de lipidos totales en hojas de plantas de tabaco transformadas con pJP3503, justo antes y durante la floración. Los datos que se muestran son el promedio de entre 2 y 3 muestras de hojas. 51 7 Tabla 34. Niveles de TAG (% en peso del peso seco de hoja) y composición de ácidos grasos de TAG aislados de hojas de diferente edad, después de la floración, de tres plantas de tabaco seleccionadas transformadas con pJP3503. 518 a: Las muestras de hojas se tomaron de planta de tipo salvaje en la etapa de floración y de tres transformantes primarios de pJP3503 durante la aparición de semillas. b: etapas de la hoja por color indicadas por XG' , verde; ^YG' , amarillo-verde; ?' , amarillo c: hoja muy vieja 519 Tabla 35. Rendimiento de lipidos totales ( en peso del peso seco de hoja) y composición de ácidos grasos de lipidos totales aislados de hojas de diferente edad de plantas de tipo salvaje y tres plantas seleccionadas de tabaco transformadas con pJP3503. a: las muestras se tomaron de plantas que portan múltiples vainas de semillas a menos que se indique de otra forma, b: antes de la floración, c: durante la floración Análisis de plantas de tabaco transformadas con pJP3502 520 Para la transformación con pJP3502 ("construcción de 3 genes''), se redujo el nivel de sacarosa en el medio MS con agar a la mitad del nivel estándar hasta que se formen callos suficientes, lo que ayudó a la recuperación de los transformantes que expresan WRI1. Se obtuvieron cuarenta y un transformantes primarios a partir de la transformación con pJP3502 y se transfirieron al invernadero. Se colectaron muestras de ho a de diferente edad ya sea en la etapa de floración o bien de formación de semillas (Tabla 36). Las plantas parecen fenotípicamente normales excepto por los tres transformantes, que se originaron de los mismos callos en el procedimiento de transformación y por lo tanto es probable que sean del mismo evento de transformación, los cuales eran levemente más pequeños y mostraron un fenotipo de hoja tersa similar al que se observó para la planta 4 con pJP3503 (anterior) pero en menos extensión. Se tomaron muestras de discos de hojas de transformantes primarios durante la floración y se cuanti ficaron los TAG visualizados por tinción con iodo después de TLC. Se analizaron adicionalmente en más detalle plantas transgénicas seleccionadas que mostraban mayores niveles de TAG en comparación con los controles de tipo salvaje mediante TLC y GC. El nivel más alto de TAG hojas verdes jóvenes se detectó en la linea 8,1 y correspondió a 521 8,3 % de TAG en base a peso seco o un incremento aproximado de 83 veces en comparación con hojas de tipo salvaje de la misma edad (Tabla 36) . Las hojas amarillas-verdes típicamente contuvieron un mayor contenido de aceite en comparación con las hojas verdes más jóvenes con los niveles de TAG máximos observados en la línea 14,1 (17,3 % de TAG en base a peso seco) . También se cuantificó el contenido de lípidos totales y la composición de ácidos grasos de lípidos totales en las hoj as (Tabla 37 ) . Se colectaron semillas (semilla TI) de los transformantes primarios en la madurez de semilla y se demostró que algunas producían plantas TI. Se predijo que estas plantas segreguen el transgen y por lo tanto se esperaban algunos segregantes nulos en las poblaciones TI, que podían servir como controles negativos apropiados además de las plantas que se sabía que eran de tipo salvaje que crecieron en el mismo tiempo y bajo las mismas condiciones. Se analizaron 51 plantas TI, derivadas del transformante primario 14,1 que tenían una inserción de una sola copia de T-ADN, que tenían entre 6 y 8 semanas de edad y entre 10 y 25 cm de altura, junto con 12 plantas de tipo salvaje. Las plantas parecían fenotípicamente normales, verdes y sanas, y no parecían más pequeñas que las correspondientes plantas de tipo salvaje. Se tomaron muestras de hoja de aproximadamente 522 1 cm de diámetro a partir de hojas verdes totalmente expandidas. 30 de las plantas TI mostraron niveles elevados de TAG en las hojas, de las cuales 8 plantas mostraron altos niveles de TAG, aproximadamente el doble del nivel de TAG en comparación con el transformante primario 14,1 en la misma etapa del desarrollo de la planta. Estas últimas plantas es posible que sean homocigotas para los transgenes. Se midieron el nivel de TAG y la composición de ácidos grasos de TAG en las hojas de plantas TI seleccionadas sembrando aislado lipidico de aproximadamente 5 mg de peso seco de tejido de hoja en cada calle de TLC, los datos se muestran en la Tabla 38. Tabla 36. Niveles de TAG (% en peso del peso seco de hoja) y composición de ácidos grasos de TAG aislados de hojas verdes de diez plantas de tabaco seleccionadas transformadas con pJP3502. 523 a plantas muy viejas que contienen solo hojas amarillas b aparición de semillas ( (S' ) , floración ( F' ) , hojas amarillas o amarillentas ( ?') Tabla 37. Lipidos totales y composición de ácidos grasos de lipidos totales extraídos de hojas amarillas de plantas de tabaco seleccionadas t ansformadas con pJP3502 ( DGATl+WRIl+Oleosina ) 524 Tabla 38. Niveles de TAG (% en peso del peso seco hoja) y composición de ácidos grasos de TAG aislados de hojas verdes de plantas seleccionadas de tabaco TI transformadas con pJP3502. 525 Se hacen construcciones genéticas que son adecuadas para la transformación de plantas monocotiledóneas intercambiando los promotores Arath-SSU de pJP3502 y pJP3503 por promotores que son más activos en monocotiledóneas. Los promotores adecuados incluyen a promotores virales 484 1 Promedio de tres hojas diferentes infiltradas cuantificadas mediante Iatroscan 2 Proporción promedio en base a comparaciones lado a lado en las mismas hojas Se obtuvieron datos adicionales a partir de otro experimento en donde se agruparon las muestras de hoja a partir de hojas dentro de la misma planta, 6 replicados de cada una. Los datos se muestran en la Tabla 16. Tabla 16. Contenido de TAG de muestras de hojas de JV. benthamiana infiltradas. 485 Ejemplo 14. Expresión constitutiva de una monoacilglicerol aciltransferasa, di cilglicerol aciltransferasa, factor de transcripción WRI1 y glicerol-3-fosfato aciltransferasa en células vegetales Se hizo una construcción genética 35S:GPAT4 mediante el clonado del gen de GPAT4 de ?. thaliana (Zheng et al., 2003) a partir de ARN total aislado de siliques en desarrollo, seguido por inserción como fragmento EcoKL en pJP3343 resultando en pJP3344. En los Ejemplos 11 y 12 se describen otras construcciones. Se llevó a cabo una expresión transitoria en tejido de hoja de N. bentha.mia.na como se describió en el E emplo 1. La expresión transitoria de la GPAT4 aciltransferasa de A. thaliana en combinación con MGAT2, DGAT1 y WRI1 condujo a una pequeña disminución del contenido de TAG en hojas de JV. benthamíana cuantificado mediante Iatroscan (Tabla 17) . El nivel de TAG (5,78 ) también se halló disminuido cuando se incluyó a GPAT4 en la mezcla de infiltración (Figura 12) . Sin embargo, este hallazgo no descarta la hipótesis de la síntesis de sr¡2-MAG a partir de G3P catalizada por la GPAT4 aciltransferasa. En su lugar, el mismo sugiere que es improbable que este paso catalítico sea limitante de reacción en tejido de hoja debido a los altos niveles de expresión del gen de GPAT4 endógeno (Li et al., 2007) . Más aún, la GPAT8 486 aciltransferasa de A. thaliana muestra un perfil de expresión similar a GPAT4 y se ha demostrado que exhibe una función solapada (Li et al., 2007). En semillas en desarrollo los niveles de expresión de GPAT4 y GPAT8 son bajos. Como resultado, la coexpresión de GPAT4 en un contexto de semilla podría ser crucial para asegurar sustrato de sn2-MAG suficiente para una MGAT aciltransferasa expresada heterólogamente . Tabla 17. Niveles de TAG por triplicado en tejido de hoja de Nicotiana benthamiana transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2, 35S:DGAT1, 35S:WRI1 y 35S:GPAT4. Se obtuvieron datos adicionales a partir de otro experimento en donde se agruparon muestras de hojas de hojas de la misma planta, 6 replicados de cada una. Los datos se muestran en la Tabla 18. Tabla 18. Contenido de TAG de muestras de hojas de N. 487 bentha iana infiltradas. Ejemplo 15. Expresión constitutiva de una monoacilglicerol aciltransferasa , di cilglicerol aciltransferasa , factor de transcripción WRIl y construcción silenciadora AGPasa-hpKNAi en células vegetales Se sintetizó un fragmento de ADN correspondiente a los nucleótidos 595 a 1187 del ARNm que codifica para la subunidad pequeña de AGPasa de Nicotíana tabacu (DQ399915) (Kwak et al., 2007). Primero se cortó el fragmento de 593 pb 1118501_NtAGP con Ncol, se trató con el fragmento grande (Klenow) de ADN polimerasa I para generar los extremos romos 5' y finalmente se digirió con Xhol. De forma similar, primero se digirió el vector de entrada pENTRll-NCOI con BamHI, se trató con el fragmento grande (Klenow) de ADN polimerasa I y se cortó con Xhol. La ligación del inserto 1118501_NtAGP en pENTRll-NCOI generó el clon de entrada pENTRll-NCOI-NtAGP. La recombinación LR entre el clon de entrada pENTRll-NCOI-NtAGP y el vector de destino pHELLSGATE12 generó a pTV35, un vector binario que contiene el cásete de ARNi NtAGPasa bajo el control del promotor 35S. En los Ejemplos 11 y 12 se describen otras construcciones. La 488 expresión transitoria en tejido de hoja de N. benthamíana se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 1. La expresión de la construcción de silenciamiento N. tabacum AGPasa junto con los genes que codifican para MGAT2 y WRI resultó en un incremento de 1,7 veces en los niveles de TAG de hoja cuantificado mediante Iatroscan (Tabla 19). En ausencia de la aciltransferasa MGAT2, los niveles de TAG cayeron casi 3 veces. Por lo tanto el incremento observado de TAG no se puede atribuir solamente al silenciamiento del gen de AGPasa endógeno de N. benthamíana. Sorprendentemente, la sustitución de MGAT2 en lugar de la DGAT1 de A. thaliana no alteró los niveles de TAG en hojas infiltradas de JV. benthamíana en combinación con la construcción de silenciamiento de AGPasa de N. tabacum. El silenciamiento de la AGPasa de N. benthamíana por lo tanto parece tener un efecto metabólico diferente sobre las aciltransferasas MGAT y DGAT. También se observó una diferencia similar en el máximo observado para los niveles de TAG con WRI1 y la construcción de silenciamiento de AGPasa en combinación con MGAT2 o DGAT1 rindiendo 6,16 % y 5,51 % de aceite de hoja, respectivamente ( Figura 12 ) . 489 Tabla 19. Niveles de TAG por triplicado de tejido de hoja de Nicotíana benthamíana transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2, 35S.DGAT1, 35S:WRI1 y 35S:AGPasa-hpRNAi 1 Promedio de tres hojas diferentes infiltradas cuantificadas mediante Iatroscan; 2 Proporción promedio en base a comparaciones lado a lado en las mismas hojas La sobreexpresion de WRIl y MGAT en combinación con el silenciamiento de la AGPasa es particularmente promisoria para incrementar los rendimientos de aceite en tejidos que acumulan almidón. Los ejemplos incluyen a tubérculos tales como papas, y el endosperma de cereales, conduciendo potencialmente a cereales con mayor contenido de aceite en grano (Barthole et al., 2011) . A pesar de que los genes de AGPasa de N. tabacum y N. benthamíana probablemente comparten una identidad de secuencia significativa, es probable que una construcción AGPasa-hpRNAi de N. benthamíana eleve además los 490 niveles de TAG debido a la mejor eficacia de silenciamiento . Se obtuvieron datos adicionales a partir de otro experimento en donde se agruparon muestras de hojas a partir de hojas dentro de la misma planta, 6 replicados de cada una. Los datos se muestran en las Tablas 19 y 20. Tabla 20. Contenido de TAG de muestras de hojas infiltradas de N. benthamíana. Ejemplo 16. Expresión constitutiva de una monoacilglicerol aciltransferasa , diacilglicerol aciltransferasa, factor de transcripción WRIl y una proteína oleosina en células vegetales Se proveyó un vector binario pRShl con el gen que codifica para la oleosina de semilla de S. indicum (Scott et al., 2010) bajo el control del promotor 35S por parte del Dr. N. Roberts (AgResearch Limited, Nueva Zelanda) . Otras construcciones se describen en los Ejemplos 11 y 12. La expresión transitoria en tejido de hoja de N. benthamíana se llevó a cabo como se describió en el Ejemplo 1. 491 Cuando se expresó la proteína oleosina de sésamo junto con el factor de transcripción WRI de ?. thaliana y la aciltrans ferasa MGAT2 de M. musculus, se halló que los niveles de TAG en hojas de N. bentha iana cuanti ficadas mediante Iatroscan fueron 2,2 veces mayores (Tabla 21) . No se detectaron cambios significativos en los perfiles de ácidos grasos de TAG de hoja (Tabla 22) . También se observó un pequeño incremento de TAG cuando se incluyó la aciltrans erasa DGAT1 de A. thaliana. En comparación con el control negativo V2, la expresión combinada de WRI1, DGAT1 y la proteína oleosina de sésamo resultó en un incremento de TAG de 3 veces y un nivel máximo observado de TAG de 7,72 % (Tabla 21 y Figura 12) . Los niveles de TAG de hoja se elevaron además en un factor de 2,5 ante la inclusión de la aciltrans ferasa MGAT2. Esto correspondió a un promedio de 5,7 % y un máximo observado de 18,8 % de TAG en base a peso seco. En incremento adicional de TAG de hoja cuando se incluyó a MGAT2 demuestra claramente el efecto positivo de esta aciltrans ferasa sobre la biosíntesis y acumulación de lipidos neutros en tejidos de hojas transgénicas . Se repitió el experimento con la combinación de genes para expresar V2 y V2+MGAT2+DGAT1+WRI1+Oleosina, se probó en diferentes plantas de N. benthamiana, con las muestras agrupadas por hoja a partir de la misma planta y con 492 infiltraciones con 12 replicados para cada una. Los datos se muestran en la Tabla 23. También se agruparon las muestras replicadas por hojas de la misma planta, con 6 repeticiones por cada infiltración. Los datos se muestran en las Tablas 24 y 25. A pesar de que la infiltración de hojas de N. benthamiana resultó en un incremento de los niveles de aceite de hoja (TAG) , no se detectó un incremento significativo en el contenido de lipidos totales, lo que sugiere que está ocurriendo una redistribución de ácidos grasos de diferentes grupos de lipidos hacia TAG. Por el contrario, cuando se coexpresó el gen GAT2 con los genes de DGAT1, WRI1 y oleosina, los lipidos totales se incrementaron 2,21 veces, lo que demuestra un incremento neto en la síntesis de lipidos de hoja. Ejemplo 17. Expresión constitutiva de una monoaeilglicerol aciltransferasa , diacilglicerol aciltransferasa, factor de transcripción WRI1 y una construcción de silenciamiento FAD2-hp NAi en células vegetales Se obtuvo un cásete de ARNi para FAD2 de N. benthamiana bajo el control de un promotor 35S por recombinación LR en el vector de destino pHELLSGATE8 para generar el vector pFN033. Otras construcciones se describen en los Ejemplos 11 y 12. 493 Tabla 21. Niveles de TAG por triplicado de te ido de hoja de Nicotiana bentha iana transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2, 35S.DGAT1, 35S:WRI1 y 35S : Oleosina . 1 Promedio de tres hojas diferentes infiltradas cuantificadas mediante Iatroscan 2 Proporción promedio en base a comparaciones lado a lado en las mismas hojas Tabla 22. Perfiles de TAG de ácidos grasos de tejido de hoja de Nicotiana benthamiana por triplicado transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2, 35S: DGATl, 35S:WRI1 and 35S : Oleosina . 494 Tabla 23 . Contenido de TAG de muestras de hojas infiltradas de ¿V. benthamiana Tabla 24 . Contenido de TAG de muestras de hojas infiltradas de N. benthamiana. 495 Tabla 25. Contenido de ácidos grasos totales de muestras de hojas infiltradas de N. benthamíana. Se expresaron los genes que codifican para la monoacilglicerol aciltransferasa MGAT2 de ratón, la diacilglicerol aciltransferasa DGAT1 de A. thaliana, WRI1 de A. thaliana y una construcción de ARNi horquilla para la desaturasa de ácidos grasos ?12 FAD2 de N. benthamíana (Wood et al., manuscrito en preparación) en combinación en tejido de hoja de N. benthamíana usando el sistema de expresión transitoria como se describió en el Ejemplo 1. Se observaron cambios similares en la composición de ácidos grasos de los TAG, los lipidos polares y los TFA de las hojas de N. benthamíana infiltradas con WRI1, MGAT2, DGAT1 y la construcción de silenciamiento de Fad2 (Tablas 26 a 28) . En las tres fracciones lipidicas, los niveles de ácido oleico se incrementaron adicionalmente y alcanzaron casi 20 % en los lipidos polares, 40 % en los TFA y más de 55 % en los TAG. Este incremento se produjo en su mayoría a expensas del ácido linoleico lo que refleja el efecto del silenciamiento sobre la ñl2-desaturase FAD2 de retículo endoplásmico . Los TAG de hoja también contuvieron menos ácido a-linolénico 496 mientras que los niveles en los TFA y lipidos polares no se vieron afectados. Cuando se repitieron estos experimentos y se determinó la composición de ácidos grasos para TAG, lipidos polares y lipidos totales, los resultados (Tabla 29) fueron consistentes con el primer experimento. Tabla 26. Perfiles de ácidos grasos de TAG de te ido de hoja de Nicotiana benthamiana por triplicado transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S.MGAT2, 35S.DGAT1, 35S:WRI1 y 35S: FAD2-hpRNAi. Tabla 27. Perfiles de ácidos grasos de lipidos polares aislados de tejido de hoja de Nicotiana benthamiana por 497 triplicado transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2r 35S:DGAT1, 35S:WRI1 y 35S : FAD2-hpRNAi . Tabla 28. Perfiles de ácidos grasos de lipidos totales aislados de tejido de hoja de Nicotiana benthamiana por triplicado transformado transitoriamente con 35S:V2, 35S:MGAT2, 35S.DGAT1, 35S:WRI1 y 35S : FAD2-hpRNAi . 498 Tabla 29. Composición de ácidos grasos de TAG, lipidos polares y lipidos totales en muestras de hojas infiltradas de N. benthamiana. 499 Ejemplo 18. Expresión de MGATl y MGAT2 de Mas musculus en células de Nicotiana benthamiana mediante transformación estable Expresión constitutiva en N. benthamiana Se demostró la actividad enzimática de MGATl y MGAT2 de M. musculus en Nicotiana benthamiana. Se introdujeron los vectores quiméricos 35S :Musmu-MGATl y 35S : Musmu-MGAT2 en la cepa de A. turnefaciens AGL1 a través de procedimiento de electroporación estándar y se crecieron en medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 mg/L) y rifampicina (25 mg/L) y se incubaron a 28°C durante dos dias. Se usó una colonia individual para iniciar el cultivo nuevo. Después de 48 horas de cultivo con aireación vigorosa, se colectaron las células por centrifugación a 2.000x g y se eliminó el sobrenadante. Se resuspendieron las células en una nueva solución con 50 % de LB y 50 % de medio MS y una densidad de D0600 = 0,5. Se tomaron muestras de hojas de plantas de Nicotiana benthamiana crecidas asépticamente ín vitro y se cortaron en secciones cuadradas de aproximadamente entre 0,5 y 1 cm2 de tamaño con un bisturí afilado estando sumergidas en una solución de A. tumefaciens. Se dejó que las piezas de hojas heridas de N. benthamiana sumergidas en A. turnefaciens reposen a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de secarse por t ansferencia sobre un papel de filtro estéril y transferirse 500 a placas de MS sin suplemento. Después del periodo de cocultivo de dos dias a 24°C, se lavaron los explantes tres veces con medio MS liquido estéril, y finalmente se secaron por transferencia sobre papel de filtro estéril y se colocaron en el medio MS selectivo solidificado con agar suplementado con 10, mg/1 de bencilaminopurina (BAP), 0,25 mg/1 de ácido indolacético (IAA), 50 mg/1 de kanamicina y 250 mg/1 de cefotaxima y se incubaron a 24°C durante dos semanas para permitir el desarrollo de tallos a partir de los discos de hoja transformados de N. benthamiana . Para establecer plantas transgénicas in vitro, se cortaron tallos verdes sanos y se transfirieron a una nueva maceta de cultivo de tejido de 200 mi con medio MS solidificado con agar suplementado con 25 iq/l de IAA y 50 mg/1 de kanamicina y 250 mg/1 de cefotaxima. La expresión de los transgenes de MGAT1 y MGAT2 se determinó mediante PCR en tiempo real. Se seleccionaron lineas con alta expresión y se cosecharon sus semillas. Esta semilla se plantó directamente en suelo y se cosechó la población de semillas segregadas después de cuatro semanas. Se seleccionaron eventos con alta expresión y las semillas producidas por estos se plantaron directamente en suelo para resultar en una población segregante de 30 plántulas. Después de tres semanas se tomaron discos de hoja de cada plántula vulgaris (betabel), Brassica sp. tales como Brassica carinata, Brassica júncea, Brassica napobrassica , Brassica napus (cañóla), Camelína sativa (falso lino), Cannabis sativa (cáñamo), Carthamus tinctorius (cártamo), Caryocar brasiliense (pequi o nuez souari), Cocos nucífera (coco), Crambe abyssinica (col de abisinia), Cucumís meló (melón), Elaeis guineensís (palmera africana), Glycine max (soya), Gossypium hirsutum (algodón), Helianthus sp. tal como Helianthus annuus (girasol), Hordeum vulgare (cebada), Jatropha curcas (piñón de leche), Joannesia princeps (nuez de arará), Lemna sp. (lenteja de agua) tal como Lemna aequinoctialis, Lemna dísperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentejita de agua), Lemna japónica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucícostata, Lemna perpusilla, Lemna teñera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rígida (oiticica), Linum usítatissimum (lino), Lupinus angustí folius (lupino), Mauritia flexuosa (palmera buriti), Maximiliana maripa (palmera de inaja), Miscanthus sp. tal como Miscanthus x gíganteus y Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba oleaginosa), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacabá), Oryza sp. (arroz) tal como Oryza sativa y Oryza glaberrima, Panicum virgatum (pasto varilla), Paraqueiba paraensis (mari), Persea americana (aguacate), Ponga ia pinnata (Habas de la India), Populus tríchocarpa, Ricinus communis (ricino), Saccharum sp. (caña de azúcar), Sesamum indicum (ajonjolí), Solanum tuberosum (papa), Sorghum sp. tales como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cacao blanco), Trifolium sp., Tríthrinax brasiliensis (Palmera de Burutí), Triticum sp. (trigo) tal como Triticum aestivum y Zea mays (maíz).
14. Un proceso para producir aceite extraído de cañóla, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener semillas de cañóla que comprenden al menos 45% del aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de cañóla, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de cánola.
15. Un proceso para producir aceite extraído de semilla de maíz, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de : i) obtener semilla de maíz que comprende al menos 5% aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de la semilla de maíz, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semilla de maíz.
16. Un proceso para producir aceite extraído del fríjol de soya, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de : i) obtener semilla del fríjol de soya que comprende al menos 20% aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de la semilla del fríjol de soya, Y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de fríjol de soya.
17. Un proceso para producir aceite extraído de semilla de lupino, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener semilla de lupino que compr-ende al menos 10% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de la semilla de lupino, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semilla de lupino .
18. Un proceso para producir aceite extraído de cacahuate, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener cacahuates que comprenden al menos 50% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de los cacahuates, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de cacahuate.
19. Un proceso para producir aceite extraído de girasol, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener semillas de girasol que comprenden al menos 50% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de girasol, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semillas de girasol .
20. Un proceso para producir aceite extraído de semillas de algodón, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener semillas de algodón que comprenden al menos 41% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de algodón, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semillas de algodón.
21. Un proceso para producir aceite extraído de cártamo, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) obtener semillas de cártamo que comprende al menos 35% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de cártamo, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semillas de cártamo.
22. Un proceso para producir aceite extraído de semillas de lino, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de : i) obtener semillas de lino que comprende al menos 36% aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de lino, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de semillas de lino.
23. Un proceso para producir aceite extraído de camelina, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de : i) obtener semillas de Camelina sativa que comprenden al menos 36% de aceite de semillas en base al peso, ii) extraer el aceite de las semillas de Camelina sativa, y iii) recuperar el aceite, en donde el aceite recuperado comprende al menos 90% (p/p) de triacilgliceroles (TAG), produciendo de esa manera el aceite de Camelina.
24. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 23, caracterizado porque comprende uno o más de secado, proceso con rodillos, prensado, trituración o molienda de la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas, y/o purificar el lipido extraído o aceite de semillas.
25. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 13, caracterizado porque el organismo no humano que comprende el uno o más polinucleótidos exógenos es un hongo oleaginoso tal como una levadura oleaginosa.
26. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 25, caracterizado porque usa un solvente orgánico en el proceso de extracción para extraer el aceite.
27. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 26, caracterizado porque comprende recuperar el lipido extraído o aceite al colectarlo en un recipiente y/o uno o más de desgomado, desodorización, decoloración, secado, f accionamiento del lipido extraído o aceite, removiendo al menos algunas ceras y/o ésteres de ceras del lipido extraído o aceite, o analizar la composición de ácido graso del lipido extraído o aceite.
28. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 27, caracterizado porque el volumen del lipido extraído o aceite es al menos 1 litro.
29. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 28, caracterizado porque uno o más o todas las siguientes características aplican: (i) el lipido extraído o aceite comprende triacilgliceroles, en donde los triacilgliceroles comprenden al menos 90%, preferiblemente al menos 95% o 96%, del lipido extraído o aceite, (ii) el lipido extraído o aceite comprende esteróles libres, esteroil ésteres, esteroil glicósidos, ceras o ésteres de cera, o cualquier combinación de los mismos, y (iii) el contenido de esterol total y/o la composición en el lipido extraído o aceite es significativamente diferente al contenido de esterol y/o la composición en el lipido extraído o aceite producido de un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, o semillas.
30. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 29, caracterizado porque el proceso comprende además convertir el lípido extraído o aceite a un producto industrial.
31. El proceso de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el producto industrial es un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, preferiblemente metil ésteres de ácido graso y/o etil ésteres de ácido graso, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena larga, una mezcla de alcanos de cadena larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas de hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono .
32. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 13 o 24 hasta 31, en donde la parte vegetativa de la planta o la parte del organismo no humano es una parte de planta aérea o una parte de planta verde tal como una ho a o tallo de una planta.
33. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 32, caracterizado además porque comprende el paso de cosechar la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, preferiblemente con un cosechador mecánico, o por un proceso que comprende filtración, centrifugación, sedimentación, flotación o floculación de algas u organismos de hongos tal como al ajustar el pH del medio.
34. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 13 o 24 hasta 33, caracterizado porque una o más o todas las siguientes características aplican: (i) el nivel de uno o más lípidos no polares en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo es al menos 0.5% mayor en base al peso que el nivel en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo, respectivamente, que carece de uno o más polinucleótidos exogenos, (ii) el nivel de uno o más lípidos no polares en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo es al menos 1% mayor en una base relativa que en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo, respectivamente, que carece de uno o más polinucleótidos exogenos, (iii) el contenido total de lípido no polar en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo es al menos 0.5% mayor en base al peso que el nivel en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo, respectivamente, que carece de uno o más polinucleótidos exogenos, (iv) el contenido total de lípido no polar en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo es al menos 1% mayor en una base relativa que en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo, respectivamente, que carece de uno o más polinucleótidos exógenos, (v) el nivel de uno o más lípidos no polares y/ o el contenido total de lipido no polar de la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo es al menos 0.5% mayor en base al peso y/o al menos 1% mayor en una base relativa que en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o una parte del mismo, respectivamente, que carece del uno o más polinucleótidos exógenos y que comprende un polinucleótido exógeno que codifica una DGATl de Arabidopsis thaliana, (vi) el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG en el lipido en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, y/o en el lipido extraído del mismo, es al menos 10% mayor en una base relativa que en el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG en el lipido en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o una parte del mismo que carece de uno o más polinucleótidos exógenos, o un correspondiente lipido extraído del mismo, respectivamente, y (vii) el contenido de ácido graso poliinsaturado (PUFA) total en el lipido en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, y/o en el lipido extraído del mismo, se incrementa o disminuye con relación a el contenido de PUFA total en el lipido en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo que carece de uno o más polinucleótidos exógenos, o un correspondiente lipido extraído del mismo, respectivamente .
35. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 hasta 13 o 24 hasta 34, caracterizado porque el nivel de un PUFA en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, y/o el lipido extraído del mismo, se incrementa o disminuye con relación al nivel del PUFA en la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o un correspondiente lipido extraído del mismo, respectivamente, en donde el ácido graso poliinsaturado es ácido eicosadienoico, ácido araquidónico (ARA) , ácido alfa-linolénico (ALA), ácido estearidónico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA) , ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), o una combinación de dos o más de los mismos .
36. El proceso de conformidad con la reivindicación 9 o reivindicación 34, caracterizado porque la parte vegetativa correspondiente de la planta, organismo no humano o parte del mismo es una parte vegetativa no transgénica de la planta, organismo no humano o parte del mismo, respectivamente.
37. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 35, caracterizado porque una o más o todas las siguientes características aplican (i) el ácido oleico comprende al menos 20% (mol%), al menos 22% (mol%), al menos 30% (mol%), al menos 40% (mol%), al menos 50% (mol%), o al menos 60% (mol%), preferiblemente al menos 65% (mol%) o al menos 66% (mol%) del contenido de ácido graso total en el lipido no polar o aceite en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, ii) el ácido oleico comprende al menos 20% (mol%), al menos 22% (mol%), al menos 30% (mol%), al menos 40% (mol%), al menos 50% (mol%), o al menos 60% (molí) , preferiblemente al menos 65% (mol%) o al menos 66% (mol%) del contenido de ácido graso total en el lipido extraído o aceite, (üi) el lipido no polar o aceite en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas comprende un ácido graso que comprende un grupo hidroxilc, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano , un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, y (iv) el lipido extraído o aceite comprende un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente.
38. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 37, caracterizado porque el nivel de un lipido en la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas y/o en el lipido extraído o aceite se determina por análisis usando cromatografía de gas de metil ésteres de ácido graso preparada a partir del lipido extraído o aceite.
39. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 38, caracterizado porque el proceso comprende además cosechar la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas de una planta.
40. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 39, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas comprende un primer pol inucleótido exógeno que codifica un ARN o un péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosintesis de ácidos grasos en una parte vegetativa de la planta, un organismo no humano o una parte del mismo, o semillas, respectivamente, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido involucrado en la biosintesis de uno o más lipidos no polares, en donde el primero y segundo polinucleótidos exógenos son ligados operablemente cada uno a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una parte vegetativa de la planta, un organismo no humano o una parte del mismo, o semillas, respectivamente.
41. El proceso de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el primer polinucleótido exógeno codifica un factor de transcripción rinkled 1 (WRI1), un factor de transcripción Leafy Cotyledon 1 (Lecl), un factor de transcripción Leafy Cotyledon 2 (Lec2), un factor de transcripción Fus3, un factor de transcripción ABI3, un factor de transcripción Dof4, un factor de transcripción BABY BOOM (BBM), o un factor de transcripción Dof 11.
42. El proceso de conformidad con la reivindicación 40 o reivindicación 41, caracterizado porque el segundo polinucleótido exógeno codifica un polipéptido que tiene actividad monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT) y/o actividad diacilglicerol aciltransferasa ( DGAT ) o actividad glicerol-3-fos fato aciltransferasa (GPAT).
43. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 40 hasta 42, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas comprende además un tercero, o más, polinucleótidos exógenos que codifican uno o más o cualquier combinación de i) un ARN adicional o péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosintesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, ii) un ARN adicional o polipéptido involucrado en la biosintesis de uno o más lipidos no polares, iii) un polipéptido que estabiliza el uno o más lipidos no polares, preferiblemente una oleosina, tal como una polioleosina o una caleosina, más preferiblemente una polioleosina, iv) una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica un polipéptido involucrado en biosíntesis de almidón tal como un polipéptido AGPasa, v) una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica un polipéptido involucrado en la degradación de lipido y/o que reduce el contenido de lipido tal como una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, o vi) un polipéptido supresor del silenciamiento, en donde el tercero, o más, polinucleótidos exógenos se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de los polinucleótidos en una parte vegetativa de la planta, o un organismo no humano o una parte del mismo, o a semillas, respectivamente.
44. El proceso de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el tercer polinucleótido codifica una oleosina, tal como una polioleosina o una caleosina.
45. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 44, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas comprende uno o más polinucleótidos exógenos que codifican: i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1) y una DGAT, ii) un factor de transcripción WRI1 y una DGAT y una oleosina, iii) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT y una oleosina, iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT), v) una diacilglicerol aciltrans ferasa 2 (DGAT2), vi) una MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa (GPAT) , vii) una MGAT y una DGAT, viii) una MGAT, una GPAT y una DGAT, ix) un factor de transcripción WRIl y una MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, una DGAT y una MGAT, xi ) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT, una oleosina y una GPAT, xii) una DGAT y una oleosina, o xiii) una MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor del silenciamiento, en donde cada uno del uno o más polinucleótidos exógenos se liga operablemente a un promotor gue es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente .
46. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 45, caracterizado porque (i) la GPAT también tiene actividad de fosfatasa para producir MAG, tal como un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Arabidopsís GPAT4 o GPAT6, y/o (ii) la DGAT es una DGAT1 o una DGAT2, y/o (iii) la MGAT es una MGAT1 o una MGAT2.
47. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 45, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas comprende: i) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1 y un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1 , ii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una RI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, y un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, iii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, iv) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, v) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGATl, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, vi) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGATl, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, vii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una RI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGATl, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, viii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, ix) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, un quinto polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un sexto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
48. El proceso de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque una o más de las siguientes características aplican i) los polinucleótidos exógenos que codifican la DGAT y oleosina se ligan operablemente a un promotor constitutivo, o un promotor activo en te idos verdes de una planta al menos antes y hasta que florezca, que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas , ii) el polinucleótido exógeno que codifica WRI1, y molécula de ARN que inhibe „ la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, se liga operablemente a un promotor constitutivo, un promotor activo en tejidos verdes de una planta al menos antes y hasta que florezca, o un promotor inducible, que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas, y iii) los polinucleótidos exógenos que codifica LEC2, BBM y/o MGAT2 se ligan operablemente a un promotor inducible que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas.
49. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 48, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta comprende un contenido total de lipidos no polares de al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente , más preferiblemente al menos 11% aproximadamente , más preferiblemente al menos 12% aproximadamente , más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 15% aproximadamente (p/p peso seco).
50. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 49, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta comprende un contenido de TAG total de al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente , más preferiblemente al menos 15% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 17% aproximadamente (p/p peso seco ) .
51. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 51, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta , el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas, preferiblemente la parte vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas tiene una o más o todas las siguientes características: i) un contenido de lipido total de al menos 8%, al menos 10%, al menos 12%, al menos 14%, o al menos 15.5% (% en peso de peso seco o peso de las semillas), ii) al menos unas 3 veces, al menos unas 5 veces, al menos unas 7 veces, al menos unas 8 veces, o al menos unas 10 veces, más alto el contenido de lipido total en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos, iü) un contenido de TAG total de al menos 5%, al menos 6%, al menos 6.5% o al menos 7% (% en peso de peso seco o peso de las semillas), iv) al menos unas 40 veces, al menos unas 50 veces, al menos unas 60 veces, o al menos unas 70 veces, o al menos unas 100 veces, más alto el contenido de TAG total con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos, v) el ácido oleico comprende al menos 15%, al menos 19% o al menos 22% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) al menos unas 10 veces, al menos unas 15 veces o al menos unas 17 veces más alto el nivel de ácido oleico en TAG con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos , vii) el ácido palmitico comprende al menos 20%, al menos 25%, al menos 30% o al menos 33% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) al menos una 1.5 veces más alto el nivel de ácido palmitico en TAG con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos, ix) el ácido linoleico comprende al menos 22%, al menos 25%, al menos 30% o al menos 34% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, x) el ácido a-linoleico comprende menos del 20%, menos del 15%, menos del 11% o menos del 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, y xi) al menos unas 5 veces, o al menos unas 8 veces, más bajo el nivel de ácido a-linoleico en TAG con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos.
52. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 50, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas, preferiblemente la parte vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas tiene una o más o todas las siguientes características: i ) un contenido de TAG total de al menos 10%, al menos 12.5%, al menos 15% o al menos 17% (% en peso de peso seco o peso de las semillas), ii) al menos unas 40 veces, al menos unas 50 veces, al menos unas 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 100 veces, más alto el contenido de TAG total en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos, iii) el ácido oleico comprende al menos 19%, al menos 22%, o al menos 25% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, iv) al menos unas 10 veces, al menos unas 15 veces, al menos unas 17 veces, o al menos a 19 veces, más alto el nivel de ácido oleico en TAG en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos, v) el ácido palmitico comprende al menos 20%, al menos 25%, o al menos 28% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) al menos una 1.25 veces más alto el nivel de ácido palmítico en TAG en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos, vii) el ácido linoleico comprende al menos 15%, o al menos 20%, (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) el ácido cx-linoleico comprende menos del 15%, menos del 11% o menos del 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, y ix) al menos unas 5 veces, o al menos unas 8 veces, más bajo el nivel de ácido a-linoleico en TAG en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos.
53. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 hasta 52, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica WRI1 comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:231 hasta 278, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprenden aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:279 hasta 337, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) nucleótidos que hibridizan a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
54. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 53, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica DGAT comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:204 hasta 211, 338 hasta 346, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:83, 212 hasta 219, 347 hasta 355, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
55. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 54, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica MGAT comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs : 1 hasta 44, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:45 hasta 82, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
56. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 hasta 54, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica GPAT comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:84 hasta 143, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs : 144 hasta 203, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
57. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 hasta 56, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica DGAT2 comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:204 hasta 211, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:212 hasta 219, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iü) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
58. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44 hasta 57, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica oleosina comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:389 hasta 408, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:362 hasta 388, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
59. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 hasta 58, caracterizado porque el polipéptido CGÍ58 comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs : 422 hasta 428, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs: 429 hasta 436, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
60. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 hasta 59, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica LEC2 comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs: 437 hasta 439, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs: 442 hasta 444, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
61. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 hasta 60, caracterizado porque el polinucleótido exógeno que codifica BBM comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:440 o 441, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:445 o 446, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) una secuencia de nucleótidos que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
62. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 61, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas comprende uno o más de: (i) una o más mutaciones introducidas en un gen que codifica una enzima endógena de la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente, o (ii) un polinucleótido exógeno que sub-regula la producción y/o actividad de una enzima endógena de la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente, en donde cada enzima endógena se selecciona del grupo que consiste de una DGAT, una sn-1 glicerol-3-fos fato aciltransferasa (sn-1 GPAT ) , una l-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa (LPAAT), una acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferasa ( LPCAT ) , un ácido fosfatidico fosfatasa (PAP), una enzima relacionada con la biosintesis de almidón tal como (ADP ) -glucosa pirofosforilasa (AGPasa), un ácido graso desaturasa tal como una ?12 ácido graso desaturasa ( FAD2 ) , un polipéptido involucrado en la degradación de lipido y/o que reduce el contenido de lipido tal como una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, o una combinación de dos o más de los mismos.
63. El proceso de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el polinucleótido exógeno se selecciona del grupo que consiste de un polinucleótido antisentido, un polinucleótido sentido, un polinucleótido catalítico, un microARN, un polinucleótido que codifica un polipéptido que enlaza la enzima endógena, una molécula de doble hebra de ARN o una molécula procesada de ARN derivada del mismo.
64. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 63, caracterizado porque el lipido no polar, el lipido extraído o aceite total comprende: (i) lipido no polar que es TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG, y (ii) un PUFA específica que es EDA, ARA, SDA, ETA, EPA, DPA, DHA, la PUFA específica está en el nivel de al menos 1 % del contenido de ácido graso total en el lipido no polar, o una combinación de dos o más de la PUFA especifica, o (iii) un ácido graso que está presente a un nivel de al menos 1 % del contenido de ácido graso total en el lipido no polar y que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente.
65. Una planta, caracterizada porque comprende una parte vegetativa, o la parte vegetativa de la misma, en donde la parte vegetativa tiene un contenido total de lipidos no polares de al menos 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos 5% aproximadamente, preferiblemente al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 15% aproximadamente (p/p peso seco), en donde el lipido no polar comprende al menos 90% triacilgliceroles (TAG) .
66. Una planta de cañóla, caracterizada porque comprende semillas de cañóla cuyo contenido de aceite es al menos 45% en base al peso.
67. Una planta de maíz, caracterizada porque comprende semilla de maíz cuyo contenido de aceite es al menos 5% en base al peso.
68. Una planta de fríjol de soya, caracterizada porque comprende semillas del fríjol de soya cuyo contenido de aceite es al menos 20% en base al peso.
69. Una planta de lupino, caracterizada porque comprende semilla de lupino cuyo contenido de aceite es al menos 10% en base al peso.
70. Una planta de cacahuate, caracterizada porque comprende cacahuates cuyo contenido de aceite es al menos 50% en base al peso.
71. Una planta de girasol, caracterizada porque comprende semillas de girasol cuyo contenido de aceite es al menos 50% en base al peso.
72. Una planta de algodón, caracterizada porque comprende semillas de algodón cuyo contenido de aceite es al menos 41% en base al peso.
73. Una planta de cártamo, caracterizada porque comprende semillas de cártamo cuyo contenido de aceite es al menos 35% en base al peso.
74. Una planta de lino, caracterizada porque comprende semillas de lino cuyo contenido de aceite es al menos 36% en base al peso.
75. Una planta de Camelina sativa, caracterizada porque comprende semillas de Camelina sativa cuyo contenido de aceite es al menos 36% en base al peso.
76. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 75 o la parte vegetativa de la planta de reivindicación 65, caracterizada porque comprende una o más o todas las siguientes características: (i) ácido oleico en una parte vegetativa o semillas de la planta, el ácido oleico estando en una forma esterificada o no esterificada, en donde al menos 20% (mol%), al menos 22% (mol%), al menos 30% (mol%), al menos 40% (mol%), al menos 50% (mol%), o al menos 60% (mol%), preferiblemente al menos 65% (mol%) o al menos 66% (mol%) de los ácidos grasos totales en el contenido de lípido de la parte vegetativa o semillas es ácido oleico, (ii) ácido oleico en una parte vegetativa o semillas de la planta, el ácido oleico estando en una forma esterificada en lípido no polar, en donde al menos 20% (mol%), al menos 22% (mol%), al menos 30% (mol%), al menos 40% (mol%), al menos 50% (mol%), o al menos 60% (mol%), preferiblemente al menos 65% (mol%) o al menos 66% (mol%) de los ácidos grasos totales en el contenido de lípido no polar de la parte vegetativa o semillas es ácido oleico, (iii) un ácido graso modificado en una parte vegetativa o semillas de la planta, el ácido graso modificado estando en una forma esterificada o no esterificada, preferiblemente en una forma esterificada en lipidos no polares de la parte vegetativa o semillas, en donde el ácido graso modificado comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, y (iv) ceras y/o esteres de ceras en el lípido no polar de la parte vegetativa o semillas de la planta.
77. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 76 o la parte vegetativa de la planta de reivindicación 65 o reivindicación 76, caracterizada porque es un miembro de una población o colección de al menos 1000 aproximadamente de tales plantas o partes .
78. Una población de al menos aproximadamente 1000 plantas, cada una siendo una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 77, caracterizada porque crecen en el campo.
79. Una colección de al menos aproximadamente 1000 partes vegetativa de las plantas, cada una siendo una parte vegetativa de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65, 76 o 77, caracterizada porque la parte vegetativa de la plantas se ha cosechado de plantas que crecen en el campo.
80. Un organismo no humano o una parte del mismo, caracterizado porque comprende uno o más polinucleotidos exógenos y un nivel incrementado de uno o más lipidos no polares con relación a un organismo no humano correspondiente o una parte del mismo que carece de uno o más polinucleotidos exógenos, en donde cada uno del uno o más polinucleotidos exógenos se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en un organismo no humano o parte del mismo, y en donde uno o más o todas las siguientes características aplican: (i) el uno o más polinucleotidos exógenos comprenden un primer polinucleótido exógeno que codifica un ARN o péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o polipéptido involucrado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, (ii) si el organismo no humano es una planta, una parte vegetativa de la planta tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos 5% aproximadamente, preferiblemente al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos aproximadamente 11 %, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 15% aproximadamente (p/p peso seco), (iii) el organismo no humano es una alga seleccionada del grupo que consiste de diatomeas (bacilariofitas ) , algas verdes ( clorofitas ) , algas verdiazules ( cianofitas ) , algas pardo-amarillentas ( crisofitas ) , haptofitas, algas marrones o pardas y algas heterocontas, (iv) los lípidos no polares comprenden un ácido graso gue comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, (v) el organismo no humano o parte del mismo comprende ácido oleico en una forma esterificada o no esterificada en su lípido, en donde al menos 20% (mol%), al menos 22% (mol%), al menos 30% (mol%), al menos 40% (mol%), al menos 50% (mol%), o al menos 60% (mol%), preferiblemente al menos 65% (mol%) o al menos 66% (mol%) de los ácidos grasos totales en el lipido del organismo no humano o parte del mismo es ácido oleico, (vi) el organismo no humano o parte del mismo comprende ácido oleico en una forma esterificada en su lipido no polar, en donde al menos 20% (mol%), al menos 22% (mol%), al menos 30% (mol%), al menos 40% (mol%), al menos 50% (mol%), o al menos 60% (molí) , preferiblemente al menos 65% (mol%) o al menos 66% (mol%) de los ácidos grasos totales en el lipido no polar de la planta o parte vegetativa de la planta es ácido oleico, (vii) el contenido de ácido graso total en el lipido del organismo no humano o parte del- mismo comprende al menos 2% más de ácido oleico y/ o al menos 2% menos de ácido palmitico que el lipido en el organismo no humano correspondiente o parte del mismo que carece del uno o más polinucleotidos exógenos, (viii) el contenido de ácido graso total en el lipido no polar del organismo no humano o parte del mismo comprende al menos 2% más de ácido oleico y/o al menos 2% menos de ácido palmítico que el lípido no polar en el organismo no humano correspondiente o parte del mismo que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, (ix) los lipidos no polares comprenden un nivel modificado de esteróles totales, preferiblemente esteróles libres, esteroil ésteres y/o esteroil glicósidos, (x) los lipidos no polares comprenden ceras y/o ésteres de ceras, y (xi) el organismo no humano o parte del mismo es un miembro de una población o colección de al menos 1000 aproximadamente de tales organismos no humanos o partes de los mismos.
81. El organismo no humano o una parte del mismo de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el uno o más polinucleótidos exógenos comprenden el primer polinucleótido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno, y en donde una o más o todas las características (ii) hasta (xi) aplican.
82. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con la reivindicación 80 o reivindicación 81, caracterizado porque el organismo no humano es una planta, una alga o un organismo apropiado para fermentación tal como un hongo.
83. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con la reivindicación 80 o reivindicación 81, caracterizado porque la parte del organismo no humano es una semilla, un fruto, o una parte vegetativa de una planta tal como una parte de planta aérea o una parte verde tal como una ho a o tallo.
84. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 77, la parte vegetativa de la planta de conformidad con la reivindicación 65, 76 o 77, o el organismo no humano o una parte del mismo de conformidad con la reivindicación 80 o reivindicación 81, caracterizados porque la planta es Acrocomia aculeata (palma macaúba), Arabidopsís thaliana, Aracinis hypogaea (cacahuate), Astrocary m murumuru (palmera murumuru), Astrocaryu vulgare (tucuma), Attalea geraensis ( Indaiá-rateiro ) , Attalea humilís (Palmera oleaginosa americana), Attalea oleífera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea specíosa (babassu), Avena sativa (avenas), Beta vulgaris (betabel), Brassica sp. tales como Brassica carinata, Brassica júncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (cañóla), Camelina sativa (falso lino), Cannabís sativa (cáñamo), Carthamus tinctorius (cártamo), Caryocar brasiliense (pequi o nuez souari), Cocos nucífera {coco), Crambe abyssinica (col de abisinia), Cucumis meló (melón), Elaeis guineensis (palmera africana), Glycíne max (soya), Gossypium hirsutum (algodón), Helianthus sp. tal como Helianthus annuus (girasol), Hordeum vulgare (cebada), Jatropha curcas (piñón de leche), Joannesia princeps (nuez de arará), Lemna sp. (lenteja de agua) tal como Lemna aequinoctíalis, Lemna disper a, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentejita de agua), Lemna japónica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna teñera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensís, Lícanía rígida (oiticica), Linum usitatissimum (lino), Lupínus angustífolius (lupino), Mauritia flexuosa (palmera buriti), Maximiliana maripa (palmera de inaja), Míscanthus sp. tal como Miscanthus x giganteus y Miscanthus sínensis, Nicotiana sp. (tabaco) tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba oleaginosa), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacabá), Oryza sp. (arroz) tal como Oryza sativa y Oryza glaberrima, Panicum virgatum (pasto varilla), Paraqueiba paraensis (mari), Persea amencana (aguacate), Pongamia pinnata (Habas de la India), Populus trichocarpa, Ricinus communis (ricino), Saccharu sp. (caña de azúcar), Sesamum indicu (ajonjolí), Solanum tuberosum (papa), Sorghum sp. tales como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cacao blanco), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (Palmera de Burutí), Triticum sp. (trigo) tal como Triticum aestivu y Zea mays (maíz).
85. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con la reivindicación 80 o reivindicación 81, caracterizado porque el organismo no humano es un hongo, preferiblemente un hongo oleaginoso tal como una levadura oleaginosa .
86. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 85, caracterizado porque el contenido de esterol total y/o la composición en el lípido no polar es significativamente diferente al contenido de esterol total y/o la composición en el lípido no polar en el organismo no humano correspondiente o parte del mismo que carece del uno o más polinucleótidos exógenos .
87. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 86, caracterizado porque el nivel incrementado de uno o más lípidos no polares es tal que una o más o todas las siguientes características aplican (i) el nivel es al menos 0.5% mayor en base al peso que el nivel en un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, (ii) el nivel es al menos 1% mayor en una base relativa que en un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, (iii) el contenido total de lipido no polar del organismo no humano o parte del mismo es al menos 0.5% mayor en base al peso que el contenido de un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, respectivamente, (iv) el contenido total de lipido no polar del organismo no humano o parte del mismo es al menos 1% mayor en una base relativa que en el contenido de un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, respectivamente, y (v) el nivel de uno o más lipidos no polares y/o el contenido total de lipido no polar del organismo no humano o parte del mismo es al menos 0.5% mayor en base al peso y/o al menos 1% mayor en una base relativa que en un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, respectivamente, que carece del uno o más polinucleótidos exógenos y que comprende un polinucleótido exógeno que codifica una DGAT1 de Arabidopsis thalíana .
88. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 87, caracterizado porque comprende: (i) un contenido de TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG que es al menos 10% mayor en una base relativa que en el contenido de TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG de un organismo no humano correspondiente o parte del mismo, y/o (ii) un contenido de ácido graso poliinsaturado (PUTA) total que se incrementa o disminuye con relación al contenido de PUFA total de un organismo no humano correspondiente o parte del mismo.
89. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 88, caracterizado porque comprende un nivel incrementado de un PUFA con relación al nivel del PUFA en el organismo no humano correspondiente o parte del mismo que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, en donde el PUFA es ácido eicosadienoico, ácido araquidónico (ARA), ácido alfa-linolénico (ALA), ácido estearidónico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), o una combinación de dos o más de los mismos.
90. La planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 77, 80 hasta 84 o 86 hasta 89, o la parte vegetativa de conformidad con las reivindicaciones 65, 76, 77, 80 hasta 83, caracterizada porque el contenido total de lípido no polar, o el uno o más lípidos no polares, y/o el nivel del ácido oleico o el PUFA en la planta o parte vegetativa del mismo se determina por análisis usando cromatografía de gas de metil ésteres de ácido' graso obtenida de la planta o parte vegetativa de la misma.
91. El organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 80 hasta 89, caracterizado porque el nivel del contenido total de lípido no polar, o el uno o más lípidos no polares, y/o el nivel del ácido oleico o PUFA en el organismo no humano o parte del mismo se determina por análisis usando cromatografía de gas de metil ésteres de ácido graso obtenida del organismo no humano o parte del mismo.
92. La planta, parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 91, caracterizados porque comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un péptido de un factor -de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en una planta, una parte vegetativa de la planta, un organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o un polipéptido involucrado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una planta, parte vegetativa de la planta, u organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente.
93. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con la reivindicación 92, caracterizados porque el primer polinucleótido exógeno codifica un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1), un factor de transcripción Leafy Cotyledon 1 (Lecl), un factor de transcripción Leafy Cotyledon 2 (Lec2), un factor de transcripción Fus3, un factor de transcripción ABI3, un factor de transcripción Dof4, un factor de transcripción BABY BOOM (BBM), o un factor de transcripción Dof 11.
94. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con la reivindicación 92 o reivindicación 93, caracterizados porque el segundo polinucleótido exógeno codifica un polipéptido que tiene actividad monoacilglicerol aciltrans ferasa (MGAT) y/o actividad diacilglicerol aciltransferasa (DGAT) o actividad glicerol-3-fosfato aciltransferasa (GPAT) .
95. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 92 hasta 94, caracterizados porque la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas comprenden además un tercero, o más, polinucleótidos exógenos que codifican uno o más o cualquier combinación de: i) un ARN adicional o péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosintesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, ii) un ARN adicional o polipéptido involucrado en la biosintesis de uno o más lipidos no polares, iii) un polipéptido que estabiliza el uno o más lipidos no polares, preferiblemente una oleosina, tal como una polioleosina o una caleosina, más preferiblemente una polioleosina, iv) una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica un polipéptido involucrado en biosintesis de almidón tal como un polipéptido AGPasa, v) una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica un polipéptido involucrado en la degradación de lípido y/o que reduce el contenido de lipido tal como una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, o vi) un polipéptido supresor del silenciamiento, en donde el tercero, o más, polinucleótidos exógenos se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión de los polinucleótidos en una parte vegetativa de la planta, o un organismo no humano o una parte del mismo, o semillas, respectivamente.
96. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con la reivindicación 95, caracterizados porque el tercer polinucleótido codifica una oleosina, tal como una polioleosina o una caleosina.
97. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 96, caracterizados porque la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas comprenden uno o más polinucleótidos exógenos que codifican: i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRIl) y una DGAT, ii) un factor de transcripción WRIl y una DGAT y una oleosina, iii) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT y una oleosina iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT), v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) una MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa ( GPAT ) , vii) una MGAT y una DGAT, viii) una MGAT, una GPAT y una DGAT, ix) un factor de transcripción WRIl y una MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, una DGAT y una MGAT, xi) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT, una oleosina y una GPAT, xii) una DGAT y una oleosina, o xiii] una MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor del silenciamiento, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente.
98. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con la reivindicación 97, caracterizados porque (i) la GPAT también tiene actividad de fosfatasa para producir MAG, tal como un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Arabidopsis G AT4 o GPAT6, y/o (ii) la DGAT es una DGAT1 o una DGAT2 , y/ o (iii) la MGAT es una MGAT1 o una MGAT2.
99. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 94 hasta 98, caracterizados porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas comprenden : i) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1 y un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, pre eriblemente una DGAT1, ii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, y un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, iii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una RI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, iv) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, v) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, vi) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGATl, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, vii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGATl, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM, viii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRIl, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGATl, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, ix) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido ex'ógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, un quinto polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un sexto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
100. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con la reivindicación 99, caracterizados porque una o más de las siguientes características aplican i) los polinucleótidos exógenos que codifica la DGAT y oleosina se ligan operablemente a un promotor constitutivo, o un promotor activo en te idos verdes de una planta al menos antes y hasta que florezca, que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas , ii) el polinucleótido exógeno que codifica RI1, y molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, se liga operablemente a un promotor constitutivo, un promotor activo en tej idos verdes de una planta al menos antes y hasta que florezca, o un promotor inducible, que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas, y iü) los polinucleótidos exógenos que codifica LEC2, BBM y/o MGAT2 se ligan operablemente a un promotor inducible que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótidos en la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas.
101. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 100, caracterizados porque la parte vegetativa de la planta comprende un contenido total de lipidos no polares de al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 15% aproximadamente (p/p peso seco o peso de las semillas) .
102. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 101, caracterizados porque la parte vegetativa de la planta comprende un contenido de TAG total de al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos 11% aproximadamente, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, "más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente, más preferiblemente al menos 15% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 17% aproximadamente (p/p peso seco o peso de las semillas ) .
103. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 65 hasta 102, caracterizados porque comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas tiene una o más o todas las siguientes caracteristicas : i) un contenido de lipido total de al menos 8%, al menos 10%, al menos 12%, al menos 14%, o al menos 15.5% (% en peso ) , ii) al menos unas 3 veces, al menos unas 5 veces, al menos unas 7 veces, al menos unas 8 veces, o al menos unas 10 veces, más alto el contenido de lipido total en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos, iii) un contenido de TAG total de al menos 5%, al menos 6%, al menos 6.5% o al menos 7% (% en peso de peso seco o peso de las semillas), iv) al menos unas 40 veces, al menos unas 50 veces, al menos unas 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 100 veces, más alto el contenido de TAG total con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos, v) ácido oleico comprende al menos 15%, al menos 19% o al menos 22% (% en peso de peso seco o peso de las semillas) de los ácidos grasos en TAG, vi) al menos unas 10 veces, al menos unas 15 veces o al menos unas 17 veces más alto el nivel de ácido oleico en TAG con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos , vii) ácido palmitico comprende al menos 20%, al menos 25%, al menos 30% o al menos 33% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) al menos una 1.5 veces más alto el nivel de ácido palmítico en TAG con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos, ix) el ácido linoleico comprende al menos 22%, al menos 25%, al menos 30% o al menos 34% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, x) el ácido a-linoleico comprende menos del 20%, menos del 15%, menos del 11% o menos del 8% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, y xi) al menos unas 5 veces, o al menos unas 8 veces, más bajo el nivel de ácido a-linoleico en TAG con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos.
104. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 102, caracterizado porque la parte vegetativa de la planta, el organismo no humano o parte del mismo, o las semillas, preferiblemente la parte vegetativa de la planta, comprende un primer polinucleótido exógeno que codifica una RI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, en donde la parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo o semillas tienen una o más o todas las siguientes características: i) un contenido de TAG total de al menos 10%, al menos 12.5%, al menos 15% o al menos 17% (% en peso de peso seco o peso de las semillas), ii) al menos unas 40 veces, al menos unas 50 veces, al menos unas 60 veces, o al menos unas 70 veces, o al menos unas 100 veces, más alto el contenido de TAG total en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos, iii) el ácido oleico comprende al menos 19%, al menos 22%, o al menos 25% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, iv) al menos unas 10 veces, al menos unas 15 veces, al menos unas 17 veces, o al menos a 19 veces, más alto el nivel de ácido oleico en TAG en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleotidos exógenos, v) el ácido palmítico comprende al menos 20%, al menos 25%, o al menos 28% (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, vi) al menos unas 1.25 veces más alto el nivel de ácido palmitico en TAG en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos, vii) el ácido linoleico comprende al menos 15%, o al menos 20%, (% en peso) de los ácidos grasos en TAG, viii) el ácido a-linoleico comprende menos del 15%, menos del 11% o menos del 8% ( % en peso) de los ácidos grasos en TAG, y ix) al menos unas 5 veces, o al menos unas 8 veces, más bajo el nivel de ácido a-linoleico en TAG en la parte vegetativa de la planta u organismo no humano con relación a la parte vegetativa correspondiente de la planta u organismo no humano que carece del polinucleótidos exógenos.
105. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 93 hasta 104, caracterizados porque el polinucleótido exógeno que codifica WRI1 comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:231 hasta 278, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:279 hasta 337, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
106. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 94 hasta 105, caracterizados porque el polinucleótido exógeno que codifica DGAT comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:204 hasta 211, 338 hasta 346, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:83, 212 hasta 219, 347 hasta 355, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i ) o ii ) , y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
107. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 94 hasta 106, caracterizados porque el polinucleótido exógeno que codifica MGAT comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs : 1 hasta 44, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:45 hasta 82, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iü) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
108. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 94 hasta 107, caracterizados porque el polinucleótido exógeno que codifica GPAT comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:84 hasta 143, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs : 144 hasta 203, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
109. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humane o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 94 hasta 108, caracterizados porque el polinucleótido exógeno que codifica DGAT2 comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:204 hasta 211, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:212 hasta 219, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) nucleótidos cuya secuencia es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
110. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 95 hasta 109, caracterizados porque el polinucleótido exógeno que codifica oleosina comprende uno o más de lo siguiente: i) nucleótidos cuya secuencia se establece en cualquiera de SEQ ID NOs:389 hasta 408, ii) nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende aminoácidos cuyas secuencias se establecen en cualquiera de SEQ ID NOs:362 hasta 388, o un fragmento biológicamente activo del mismo, iii) una secuencia de nucleótidos que es al menos 30% idéntica a i) o ii), y iv) un polinucleótido que hibridiza a cualquiera de i) hasta iii) bajo condiciones severas.
111. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 110, caracterizados porque comprenden (i) una o más mutaciones introducidas en un gen que codifica una enzima endógena de la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente, y/o (ü) un polinucleótido exógeno que sub-regula la producción y/o actividad de una enzima endógena de la planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas, respectivamente, en donde cada enzima endógena se selecciona del grupo que consiste de una DGAT, una sn-1 glicerol-3-fosfato aciltrans erasa (sn-1 GPAT), una l-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferasa (LPAAT), una acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferasa (LPCAT), un ácido fosfatidico fosfatasa (PAP), una enzima relacionada con la biosíntesis de almidón tal como (ADP ) -glucosa pirofosforilasa (AGPasa), un ácido graso desaturasa tal como una ?12 ácido graso desaturasa ( FAD2 ) , un polipéptido involucrado en la degradación de lipido y/o que reduce el contenido de lipido tal como una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, o una combinación de dos o más de los mismos.
112. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con la reivindicación 111, caracterizados porque el polinucleotido exógeno se selecciona del grupo que consiste de un polinucleotido antisentido, un polinucleotido sentido, un polinucleotido catalítico, un microARN, un polinucleotido que codifica un polipéptido que enlaza la enzima endógena, una molécula de doble hebra de ARN y una molécula procesada de ARN derivada del mismo.
113. La planta, parte vegetativa de la planta, organismo no humano o parte del mismo, o semillas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 115, caracterizados porque el lípido no polar (i) comprende TAG, DAG, TAG y DAG, o MAG, y (ii) comprende un PUFA específica que es EDA, ARA, SDA, ETA, EPA, DPA o DHA, la PUFA específica está presente a un nivel de al menos 1 % de los ácidos grasos totales en el lípido no polar, o una combinación de dos o más de los mismos, o (iii) comprende un ácido graso que está presente a un nivel de al menos 1 % de los ácidos grasos totales en el lípido no polar y que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono- carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente .
114. Semillas, caracterizadas porque se obtienen de una planta u organismo no humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 113.
115. Las semillas de conformidad con la reivindicación 114, caracterizadas porque comprenden uno o más polinucleótidos exogenos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 92 hasta 110.
116. Una célula recombinante, caracterizada porque comprende uno o más polinucleótidos exogenos y un nivel incrementado de uno o más lipidos no polares con relación a una célula correspondiente que carece de uno o más polinucleótidos exogenos, en donde cada uno del uno o más polinucleótidos exogenos se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleotido en una célula, y en donde uno o más o todas las siguientes características aplican: (a) el uno o más polinucleótidos exogenos comprenden un primer polinucleotido exógeno que codifica un ARN o péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicolíticos o de la biosíntesis de ácidos grasos en un organismo no humano o una parte del mismo, y un segundo polinucleótido exógeno que codifica un ARN o polipéptido involucrado en la biosíntesis de uno o más lípidos no polares, (b) si la célula es una célula de una parte vegetativa de una planta, la célula tiene un contenido total de lípidos no polares de al menos 3% aproximadamente, más preferiblemente al menos 5% aproximadamente, preferiblemente al menos 7% aproximadamente, más preferiblemente al menos 10% aproximadamente, más preferiblemente al menos aproximadamente 11 %, más preferiblemente al menos 12% aproximadamente, más preferiblemente al menos 13% aproximadamente, más preferiblemente al menos 14% aproximadamente, o más preferiblemente al menos 15% aproximadamente (p/p), (c) la célula es una alga seleccionada del grupo que consiste de diatomeas (bacilariofitas ) , algas verdes ( clorofitas ) , algas verdiazules ( cianofitas ) , algas pardo-amarillentas ( crisofitas ) , haptofitas, algas marrones o pardas y algas heterocontas, (d) el uno o más lípidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente, (e) el contenido de ácido graso total en los lípidos no polares comprende al menos 2% más de ácido oleico y/o al menos 2% menos de ácido palmitico que los lipidos no polares en la célula correspondiente que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, (f) los lipidos no polares comprenden un nivel modificado de esteróles totales, preferiblemente esteróles libres (no esteri ficados ) , esteroil ésteres, esteroil glicósidos, con relación a los lipidos no polares en la célula correspondiente que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, (g) los lipidos no polares comprenden ceras y/o ésteres de ceras, y (h) la célula es un miembro de una población o colección de al menos 1000 aproximadamente de tales células.
117. La célula de conformidad con la reivindicación 116, caracterizada porque el uno o más polinucleótidos exógenos comprenden el primer polinucleót ido exógeno y el segundo polinucleótido exógeno, y en donde uno o más o todas las características (b) hasta (h) aplican.
118. La célula de conformidad con la reivindicación 116 o reivindicación 117, caracterizada porque comprende una o más características de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82 hasta 110.
119. Un proceso para obtener una célula con capacidad aumentada para producir uno o más lipidos no polares, el proceso caracterizado porque comprende los pasos de: i) introducir en una célula uno o más polinucleotidos exógenos, ii) expresar el uno o más polinucleotidos exógenos en la célula o una célula de la progenie de la misma, iii) analizar el contenido de lípido de la célula o célula de la progenie, y iv) seleccionar una célula o célula de la progenie que tiene un nivel incrementado de uno o más lipidos no polares con relación a un correspondiente célula o célula de la progenie que carece del polinucleotidos exógenos, en donde el uno o más polinucleotidos exógenos codifica i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRI1) y una DGAT, ii) un factor de transcripción WRI1 y una DGAT y una oleosina , iii) un factor de transcripción WRI1, una DGAT, una MGAT y una oleosina, iv) una monoacilglicerol aciltransferasa (MGAT) , v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) una MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa (GPAT) , vii) una MGAT y una DGAT, viii) una MGAT, una GPAT y una DGAT, x) un factor de transcripción WRIl y una MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, una DGAT y una MGAT, xi ) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT, una oleosina y una GPAT, xii) una DGAT y una oleosina, o xiii) una MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor del silenciaraiento, en donde cada polinucleótido exógeno se liga operablemente a un promotor que es capaz de. dirigir la expresión del polinucleótido exógeno en la célula o célula de progenie .
120. El proceso de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque la célula seleccionada o célula de la progenie comprende: i) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRIl y un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1 , ii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, y un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, iii) un primer polinucleotido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleotido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleotido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, iv) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM, v) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM, vi) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, y un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, vii) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica LEC2 o BBM, viii) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, y un quinto polinucleótido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, ix) un primer polinucleótido exógeno que codifica una WRI1, un segundo polinucleótido exógeno que codifica una DGAT, preferiblemente una DGAT1, un tercer polinucleótido exógeno que codifica una oleosina, un cuarto polinucleótido exógeno que codifica una molécula de ARN que inhibe la expresión de un gen que codifica una lipasa tal como un polipéptido CGÍ58, un quinto polinucleotido exógeno que codifica una MGAT, preferiblemente una MGAT2, y un sexto polinucleotido exógeno que codifica LEC2 o BBM.
121. El proceso de conformidad con la reivindicación 119 o reivindicación 120, caracterizado porque el uno o más polinucleotidos exógenos se integran establemente en el genoma de la célula o célula de la progenie.
122. El proceso de conformidad con la reivindicación 121, caracterizado además porque comprende el paso de regenerar una planta transgénica de la célula o célula de la progenie que comprende el uno o más polinucleotidos exógenos.
123. El proceso de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque el paso de regenerar la planta transgénica se realiza antes del paso de expresar el uno o más polinucleotidos exógenos en la célula o la célula de la progenie del mismo, y/ o antes del paso de analizar el contenido de lipido de la célula o célula de la progenie, y/o antes del paso de seleccionar la célula o célula de la progenie que tiene un nivel incrementado de uno o más lipidos no polares.
124. El proceso de conformidad con la reivindicación 122 o reivindicación 123, caracterizado porque comprende además el paso de obtener semillas o una planta de la progenie de la planta transgénica, en donde las semillas o planta de la progenie comprende el uno o más polinucleotidos exógenos .
125. El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119 hasta 124, caracterizado porque la célula seleccionada o planta regenerada del mismo, o una parte vegetativa de la planta o semillas de la planta regenerada, tiene una o más de las características de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 113.
126. Una célula transgénica o planta transgénica, caracterizada porque se obtiene usando el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119 hasta 125, o una parte vegetativa de la planta o semillas obtenidas del mismo que comprende el uno o más polinucleotidos exógenos.
127. El uso de uno o más polinucleotidos codificados, o un constructo genético que comprende polinucleotidos codificados : i) un factor de transcripción Wrinkled 1 (WRIl) y una DGAT, ii) un factor de transcripción WRIl y una DGAT y una oleosina, iii) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT y una oleosina, iv) una . monoacilglicerol aciltrans ferasa (MGAT) , v) una diacilglicerol aciltransferasa 2 (DGAT2), vi) una MGAT y una glicerol-3-fosfato aciltrans ferasa (GPAT) , vii) una MGAT y una DGAT, viii) una MGAT, una GPAT y una DGAT, ix) un factor de transcripción WRIl y una MGAT, x) un factor de transcripción WRIl, una DGAT y una MGAT, xi) un factor de transcripción WRIl, una DGAT, una MGAT, una oleosina y una GPAT, xii) una DGAT y una oleosina, o xiii) una MGAT y una oleosina, y xiv) opcionalmente, un polipéptido supresor del silenciamiento, para producir una célula transgénica, un organismo no humano transgénico o una parte del mismo o semillas transgénicas que tiene una capacidad aumentada para producir uno o más lipidos no polares con relación a una célula correspondiente, organismo no humano o parte del mismo, o semillas que carece del uno o más polinucleótidos , en donde cada uno del uno o más polinucleótidos es exógeno hasta la célula, organismo no humano o parte del mismo, o semillas y se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula, un organismo no humano o una parte del mismo, o semillas, respectivamente.
128. El uso de un primer polinucleotido que codifica un ARN o péptido de un factor de transcripción que incrementa la expresión de uno o más genes glicoliticos o de la biosintesis de ácidos grasos en una célula, un organismo no humano o una parte del mismo o semillas, junto con un segundo polinucleotido que codifica un ARN o polipéptido involucrado en la biosintesis de uno o más lipidos no polares, para producir una célula transgénica, un organismo no humano transgénico o parte del mismo, o semillas transgénicas que tienen una capacidad aumentada para producir uno o más lipidos no polares con relación a una célula correspondiente, organismo no humano o parte del mismo, o semillas que carecen del primero y segundo polinucleotidos, en donde el primero y segundo polinucleotidos son cada uno exógenos a la célula, organismo no humano o parte del mismo, o semillas y son ligados operablemente cada uno a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleotido en la célula transgénica, organismo no humano transgénico o parte del mismo, o semillas transgénicas, respectivamente.
129. El uso de uno o más polinucleotidos para producir a célula transgénica, un organismo no humano transgénico o parte del mismo, o semillas transgénicas que tienen una capacidad aumentada para producir uno o más lipidos no polares con relación a una célula correspondiente, organismo no humano o parte del mismo, o semillas que carece del uno o más polinucleótidos exógenos, en donde cada uno del uno o más polinucleótidos es exógeno a la célula, organismo no humano o parte del mismo, o semillas y se liga operablemente a un promotor que es capaz de dirigir la expresión del polinucleótido en una célula, un organismo no humano o una parte del mismo, o semillas, respectivamente, y en donde los lipidos no polares comprenden un ácido graso que comprende un grupo hidroxilo, un grupo epoxi, un grupo ciclopropano, un doble enlace carbono-carbono, un triple enlace carbono-carbono, enlaces dobles conjugados, una cadena ramificada tal como una cadena ramificada metilada o hidroxilada, o una combinación de dos o más de los mismos, o cualquiera de dos, tres,, cuatro, cinco o seis de los grupos, enlaces o cadenas ramificadas mencionados previamente.
130. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 127 hasta 129, en donde la célula transgénica, organismo no humano o parte del mismo, o semillas comprenden una o más de las características definidas en las reivindicaciones 65 hasta 113.
131. Un proceso para producir semillas, el proceso caracterizado porque comprende: i) hacer crecer la planta, plantas, u organismo no humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 82, 84, 86 hasta 113 y ii) cosechar semillas de la planta, plantas, u organismo no humano.
132. El proceso de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque comprende hacer crecer una población de al menos aproximadamente 1000 plantas, cada una siendo una planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 82, 84, 86 hasta 113, y cosechar semillas de la población de plantas.
133. Un proceso de fermentación, caracterizado porque comprende los pasos de: i) proporcionar un recipiente que contiene una composición liquida que comprende el organismo no humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80, 81, 85 hasta 89 o 91 hasta 113 que es apropiado para fermentación, y constituyentes que se requieren para fermentación y biosintesis de ácidos grasos, y ii) proporcionar condiciones que conduzcan a la fermentación de la composición líquida contenida en dicho recipiente.
134. Un lipido recuperado o extraído, caracterizado porque se obtiene por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 hasta 64, o que se obtiene ce la parte vegetativa de la planta de conformidad con la reivindicación 65 o reivindicación 76 o reivindicación 77, el organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 89 o 91 hasta 113, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 116 hasta 118, la célula o célula de la progenie o planta transgénica producida por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119 hasta 125, o las semillas de reivindicación 114 o reivindicación 115.
135. Un producto industrial producido por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 hasta 8 o 30 hasta 64, caracterizado porque es un producto de hidrocarburo tal como ésteres de ácido graso, preferiblemente metil ésteres de ácido graso y/o etil ésteres de ácido graso, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena larga, una mezcla de alcanos de cadena larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas de hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono.
136. El uso de la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 78, 80 hasta 84, 86 hasta 113, una parte vegetativa de la planta de reivindicación 65 o reivindicación 76 o reivindicación 77, organismo no humano o una parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 113, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 116 hasta 118, la célula o célula de la progenie o planta transgénica producida por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119 hasta 125, o las semillas de conformidad con la reivindicación 114 o reivindicación 115, o el lipido recuperado o extraído de conformidad con la reivindicación 134 para la fabricación de un producto industrial.
137. El uso de conformidad con la reivindicación 136, en donde el producto industrial es un producto de hidrocarburo tal como ásteres de ácido graso, preferiblemente metil ésteres de ácido graso y/o etil ésteres de ácido graso, un alcano tal como metano, etano o un alcano de cadena larga, una mezcla de alcanos de cadena larga, un alqueno, un biocombustible, monóxido de carbono y/o gas de hidrógeno, un bioalcohol tal como etanol, propanol, o butanol, biocarbono, o una combinación de monóxido de carbono, hidrógeno y biocarbono .
138. Un proceso para producir combustible, el proceso caracterizado porque comprende: i) hacer reaccionar el lipido de conformidad con la reivindicación 134 con un alcohol, opcionalmente, en presencia de un catalizador, para producir alquil ésteres, y ii) opcionalmente, mezclar los alquil ésteres con combustible basado en petróleo.
139. El proceso de conformidad con la reivindicación 138, caracterizado porque los alquil ésteres son metil ésteres.
140. Un proceso para producir un combustible diésel sintético, el proceso caracterizado porque comprende: i) convertir el lipido en la parte vegetativa de la planta de conformidad con la reivindicación 65 o reivindicación 76 o reivindicación 77 o en el organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 116 a un gas de síntesis por gasificación, y ii) convertir el gas de síntesis a un biocombustible usando catalizador de metal o un catalizador microbiano.
141. Un proceso para producir un biocombustible, el proceso caracterizado porque comprende convertir el lipido en la parte vegetativa de la planta de reivindicación 65 o reivindicación 76 o reivindicación 77 o en el organismo no humano o parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 113 a un biopetroleo por pirólisis, un bioalcohol por fermentación, o un biogas por gasificación o digestión anaerobica.
142. Un proceso para producir un alimento para animal, el proceso caracterizado porque comprende mezclar la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 77, 80 hasta 84, 86 hasta 113, una parte vegetativa de la planta de conformidad con la reivindicación 65 o reivindicación 76 o reivindicación 77, organismo no humano o una parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 113, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 116 hasta 118, la célula o célula de la progenie o planta transgénica producida por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119 hasta 125, o las semillas de reivindicación 114 o reivindicación 115, o el lipido recuperado o extraído de conformidad con la reivindicación 134, o un extracto o porción del mismo, con al menos otro ingrediente alimenticio.
143. Alimentos para animales, cosméticos o químicos, caracterizados porque comprenden la planta de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65 hasta 77, 80 hasta 84, 86 hasta 113, una parte vegetativa de la planta de conformidad con la reivindicación 65 o reivindicación 76 o reivindicación 77, organismo no humano o una parte del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 80 hasta 113, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 116 hasta 118, la célula o célula de la progenie o planta transgénica producida por el proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 119 hasta 125, o las semillas de conformidad con la reivindicación 114 o reivindicación 115, o el lipido recuperado o extraído de conformidad con la reivindicación 134, o un extracto o porción del mismo.
144. Un método para determinar cuándo cosechar una planta para optimizar la cantidad de lipido en el tejido vegetativo de la planta a cosechar,, el método caracterizado porque comprende i) medir el brillo del tejido vegetativo, ii) comparar la medición con un nivel de brillantes mínimo predeterminado, y iii) opcionalmente cosechar la planta.
145. Un método para predecir la cantidad de lipido en el tejido vegetativo de una planta, el método caracterizado porque comprende medir el brillo del tejido vegetativo.
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