CZ20013529A3 - Enzymy biosyntetické dráhy produkce triacylglycerolu a rekombinantní molekuly DNA kódující tyto enzymy - Google Patents

Description

• · · #1 "7 \ * ' yi/Uvl-irtl

®ť. «not vsertea .fv íi-rtvoi-ái tSř 1¾) tr ?. Mátová 2 dráhy produkce triacylglycerolu

Enzymy biosyntetické ( a rekombinantní molekuly DNA kódující tyto enzymy

Oblast techniky Předkládaný vynález se týká identifikace, izolace a charakterizace rekombinantní molekul DNA kódujících enzymy katalyzující přenos mastných kyselin z fosfolipidů na diacylglycerol v biosyntetické dráze produkce triacylglycerolu.

Dosavadní stav techniky

Triacylglycerol (TAG) je nejhojnšjší zásobárna energie v přírodě lipidového charakteru. Má sě za to, že hlavní metabolická dráha syntézy TAG zahrnuje tři postupné přenosy acylové skupiny z acyl-CoA na glycerolovou_ kostru (1,2). Po mnoho let se věřilo, že acyl-CoA: diacylglyceroltransferáza (DAGAT), která katalyzuje třetí reakci přenosu acylové skupiny, je jediným enzymem zúčastněným v v syntéze TAG. Působí tak, že odvádí diacylglycerol (DAG) ze syntézy membránových lipidů do TAG (2) . Geny kódující tento enzym byly nedávno identifikovány u myši (3) a v rostlinách (4,5) a bylo ukázáno, že kódované proteiny jsou homologní s acyl-CoA:cholesterol acyltransferázou (ACAT). Nedávno bylo také publikováno, že jiná DAGAT existuje v olejnaté houbě Mortierella ramanniana, která není příbuzná ani s myší DAGAT ani s rodinou genů ACAT ani s žádným jiným známým genem (6) . Předkládaný vynález se týká nového typu enzymů a genů, které je kódují, a které jsou vhodné pro transformaci. Konkrétně se vynález týká použití typů genů kódujících dosud nepopsané enzymy označené jako fosfolipid:diacylglycerol acyltransferázy (PEAT), kteréžto enzymy katalýzují reakci nezávislou na acyl-CoA. Tento typ genů, pokud je samotný exprimován v transgenním organismu, zvyšuje celkové množství olejů {triacylglycerolů) produkovaných buňkami. Geny PDAT v_kombinaci s geny pro syntézu neobvyklých mastných kyselin budou při expresi v transgenním organismu zvyšovat hladiny neobvyklých mastných kyselin v triacylglycerolech.

Existuje tedy celosvětově značný zájem vyrábět chemické potravinářské suroviny, jako jsou třeba mastné kyseliny, pro průmyslové účely užitím obnovitelných rostlinných zdrojů spíše než z neobnovítelných petrochemických zdrojů. Tento koncept je velmi přitažlivý pro výrobce i spotřebitele vzhledem k uchování zdrojů, a přitom poskytuje významnou příležitost pro rozvoj nových průmyslových plodin.

Existují různé sestavy neobvyklých mastných kyselin v olejích z planých rostlin, které byly dobře charakterizovány. Mnohé z těchto mastných kyselin mají značný průmyslový potenciál, což ..vedlo ke snahám u domestikaci odpovídajících druhů planých rostlin, aby se umožnila zemědělská produkce určitých mastných kyselin.

Rozvoj metod genového inženýrství kombinovaný s rostoucím pochopením biosyntézy neobvyklých mastných kyselin nyní umožňuje přenášet geny kódující klíčové enzymy zúčastněné v syntéze určitých mastných kyselin z planých rostlin do kulturních plodin - olejnin. Tímto způsobem je možné připravovat jednotlivé mastné kyseliny ve velkém množství s vysokou čistotou a při vynaložení přiměřeně nízkých nákladů. U plodin jako je řepka, slunečnice, palma olejová a další, je olej (tj. triacylglyceroly) nej cennější produkt v semenech nebo plodech a další sloučeniny jako je např. škrob, proteiny a vláknina jsou považována za méně hodnotné vedlejší produkty. Zvýšení množství oleje na hmotnostní jednotku na úkor ostatních sloučenin by tedy v případě olejnin zvýšilo hodnotu plodiny. Pokud by geny regulující alokaci redukovaného uhlíku byly "up-regulovány" (regulovány směrem k vyšší aktivitě), buňky by akumulovaly více olejů na úkor ostatních látek. Takové, geny by. se mohly užít nejen vjbuňkách již produkujících vysokou hladinu olejů, jako jsou buňky olejnin, ale také by mohly indukovat významnou produkci olejů u plodin obsahujících střední nebo nízkou hladinu olejů jako jsou např. sója, oves, kukuřice, brambory, cukrová řepa a tuřín, a také u mikroorganismů.

Podstata vynálezu

Mnohé požadované neobvyklé mastné kyseliny, např. mastné kyseliny se středním řetězcem, hydroxylované mastné kyseliny, epoxygenované mastné kyseliny, acetylenické mastné kyseliny, mají odlišné fyzikální vlastnosti ód běžných mastných kyselin vyskytujících se v rostlinách. Původci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že u rostlinných druhů, které přirozeně akumulují tyto neobvyklé mastné kyseliny v olejích (triacylglycerolech) v semenech, tyto kyseliny v membránových (fosfo)lipidech v semeni chybějí a nebo jsou přítomny jen ve velmi malém množství. Nízká koncentrace těchto kyselin v membránových lipidech je pravděpodobně základním předpokladem správné funkce těchto membrán a tudíž správné funkce buněk. Jedním aspektem předkládaného vynálezu je to, že semeno transgenní rostliny může být modifikováno tak, aby akumulovalo vysoké množství neobvyklých mastných kyselin tím, že jsou tyto mastné kyseliny odstraněny z membránových lipidů a přesměrovány o triacylglycerolů v semenech. a • • · · • · • # · • ·' · • · # • * • · · • · • • « · • · · · · • · • · Původci byla identifikována nová třída enzymů, které v rostlinách při tvorbě triacylglycerolů katalyzují přenos mastných kyselin z fosfolipidů na diacylglycerol, a sice v reakci nezávislé na acyl-CoA, a tyto enzymy (fosfolipid:diacylglycerol acyltransferázy, zkracované jako

é · · · k · •·· ·· · «·· PDAT} se účastní odstraňování hydroxylovaných a epoxygenovaných mastných kyselin, a také pravděpodobně dalších neobvyklých mastných kyselin jako. jsou např. mastné kyseliny se středním řetězcem, z fosfolipidů v rostlinách.

Bylo ukázáno, že tyto enzymatické reakce jsou přítomny také v mikrosomálních preparátech z pekařských kvasinek (Saccharomyces cerevisiae) .

Vynález se dále týká enzymu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 nebo její funkční fragment, derivát, elelu, homolog nebo isoenzym. Tzv. "knock-out" mutanty, tj . mutanty s vyřazeným příslušným genem, byly získány a bylo ukázáno, že mikrosomální membrány z takto mutovaných kvasinek neobsahují žádnou aktivitu PDAT. Bylo tak ukázáno, že tento vyřazený gen kódoval enzym PDAT (viz sekvence id. č. 1 a 2) . Dále byl enzym PDAT charakterizován aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 obsahující konzervativní lipázový motiv sekvence FXKWVEA. Předkládaný vynález se dále týká enzymu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 16, 20 nebo 22 nebo její funkční fragment, derivát, elelu, homolog nebo isoenzym. Dále byly identifikovány geny a/nebo proteiny s dosud neznámou funkcí, které spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu. V genu ze Schizosaccharomyces pombe, SPBC776.14 (sekvence id. č. 3) byl identifikován domnělý otevřený čtecí rámec CAA22887 SPBC776.14 (sekvence id. č. 13). Dále byly identifikovány genomické sekvence Arabidopsis thaliana (sekvence id. č. 4, 10 a 11) kódující domnělé proteiny a také domnělý otevřený čtecí rámec AAC80628 z lokusu Arabidopsis thaliana AC 004557 (sekvence id. č. 14) a domnělý otevřený čtecí rámec AAD10668 z lokusu Arabidopsis thaliana AC 003027 (sekvence id. č. 15).

Také byl identifikován cDNA klon z Neurospora crassa (sekvence· id. č.9) a Zea mays EST („extended .sequence tag") klon (sekvence id. č. 7) a odpovídající předpokládaná aminokyselinová sekvence (sekvence id. č. 8). A nakonec · byly identifikovány ještě další dva cĎNA klony, a sice EST klon Arabidopsis thaliana (sekvence id. č. 5 a odovídající aminokyselinová sekvence id. č. 6) a Lýcopersicon esculentum EST klon (sekvence id. č. 12). Dále enzymy označované jako PDAT obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 17, 18, 25 a 27, obsahující lipázový motiv FXKWVEA spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Navíc do rozsahu vynálezu spadají enzymy obsahující aminokyselinovou sekvenci kódovanou nukleotidovou sekvencí, její částí, derivátem, alelou nebo homologem, vybranou ze skupiny obsahující sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, '12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 a 31, nebo jejich funkční fragmenty, deriváty, alely, homology nebo isoenzymy.

Funkčním fragmentem enzymu podle vynálezu se rozumí jakákoliv polypeptidová sekvence vykazující specifickou enzymatickou aktivitu fosfolipid:diacylglycerol acyltransferázy (PDAT). Délka funkčního fragmentu je např. 660 ± 10 aminokyselin až 660 + 20 aminokyselin, výhodně 660 ± 50 aminokyselin až 660 ± 100 aminokyselin, přičemž „základní počet" 660 aminokyselin odpovídá v tomto případě polypeptidovému řetězci enzymu PDAT se sekvencí id. č. 2 kódovanému nukleotidovou sekvencí id. č. 1. Takže základní počet aminokyselin ve funkčním enzymu plné délky se mění v závislosti na odpovídající nukleotidové sekvenci. Částí nukleotidové sekvence podle vynálezu se míní jakákoliv nukleotidová sekvence kódující polypeptid, který vykazuje specifickou aktivitu fosfolipid:diacylglycerol acyltransf erázy (PDAT) . Délka nukleotidovéhoúseku může být

t 6 £ velmi proměnlivá v rozmezí několika - set nukleotidů v. závislosti na kódujícím úseku genu nebo vysoce konzervativní . sekvenci genu. Tak např. délka je 1900 10 až 1900 1000 nukleotidů, výhodně 1900 50 až 1900 700, a ještě výhodněji 1900 100 až 1900 500 nukleotidů, přičemž „základní počet" 1900 odpovídá v tomto případě nukleotidové sekvenci kódující enzym PDAT se sekvencí id. č. 1. Tudíž tento „základní počet" nukleotidů funkčního genu plné délky je proměnlivý. . Alelické varianty nukleotidové sekvence podle vynálezu jsou různé nukleotidové sekvence kódující polypeptid, jehož funkce je ekvivalentní. Alely zahrnují jak přirozeně se vyskytující varianty nukleotidové sekvence podle vynálezu, tak i syntetické nukleotidové sekvence připravené metodami, které jsou odborníkům známy. Patří sem dokonce i změněné nukleotidové sekvence, které poskytují enzymy se změněnou aktivitou a/nebo regulací, které jsou odolné vůči specifickým inhibitorům. Předkládaný vynález dále zahrnuje přirozené nebo syntetické mutace původní izolované nukleotidové sekvence. Tyto mutace jsou substituce, adice, delece, inverze nebo inzerce jednoho nebo více nukleotidů.

Homologní nukleotidovou sekvencí se rozumí komplementární sekvence a/nebo sekvence specificky hybridizující s nukleotidovou sekvencí podle vynálezu. K hybridizujícím sekvencím patří podobné sekvence vybrané ze skupiny obsahující DNA a RNA, které specificky interagují se sekvencí podle vynálezu alespoň za středně stringentních hybridizačnich podmínek, jak jsou odborníkům známy. Výhodným příkladem stringentních hybridizačnich podmínek, aniž by to však byl příklad omezující, je hybridizace v roztoku 6 x chlorid sodný/citrát sodný (SSC) při 45 °C po které následuje jedno nebo více promytí v 0,2 x SSC, 0,1% SDS při 50 až 65 °C. Dále sem patří krátké nukleotidové sekvence např. -délky 10 až 1 7 • ·<<» · · t ♦ · ♦ ·· • # · ’· ♦ * » • · • · « • ·.· '· .· ♦ • · · # • ♦ · * ··· «· • · ·* b 30 nukleotidů, výhodně 12 až 15 nukleotidů. A také .sem patří primery a hybridizačni sondy. ' -

Homologní nukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu je sekvence, která je alespoň ze 40 %, výhodně alespoň z 50 nebo 60 %, výhodněji z alespoň 70, 80 nebo 90 % a nej výhodněji z alespoň 95, 96, 97., 98 nebo 99' % homologní s nukleotidovou sekvencí id. č. 1. Výše uvedené definice analogicky platí pro aminokyselinové sekvence a funkční enzymy a odborník je schopen je snadno aplikovat.

Termín isoenzym označuje enzymy, který má stejnou nebo podobnou substrátovou specifitu a/nebo katalytickou aktivitu, ale odlišnou primární strukturu.

První provedení předkládaného vynálezu se týká nukleotidové sekvence kódující PDAT. To zahrnuje sekvence kódující biologicky aktivní PDAT a také sekvence využitelné jako sondy, transformační vektory nebo klonovací intermediáty. Sekvence kódující PDAT kóduje buďto celou nebo částečnou sekvenci v závislosti na zamýšleném použití. Vynález zahrnuje také- všechny části genomové sekvence, cDNA sekvence, a také sekvence pro prekurzory PDAT nebo zralý PDAT.

Vynález zahrnuje sekvence vybrané ze skupiny obsahující sekvence id. č. 1, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 19, 21, 23, 24, 29 a 30, nebo jejich části, deriváty, alely nebo homology. Vynález dále zahrnuje částečné nukleotidové sekvence odpovídající úplné nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny obsahující sekvence id. č. 5, 7, 9, 12, 25, 26, 28 a 31, nebo jejich části, deriváty, alely nebo homology. Navíc nukleotidové sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň ze 40 % homologní s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. č. 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 a 31. 9 • · ♦ ♦♦· · · ♦ ·♦ · · · • · · ·*-*··· δ «· ··· ··« · · · · λ · · Předkládaný vynález se dále týká genového konstruktu, který obsahuje nukleotidovou sekvenci podle vynálezu, která je operativně spojena s heterologní nukleovou kyselinou.

Termín operativně spojená znamená sériovou organizaci např.' promotoru, kódující sekvence, terminátoru a/nebo dalších regulačních elementů, přičemž každý element této série plní svou původní funkci při expresi nukleové kyseliny. Předkládaný vynález dále zahrnuje vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle vynálezu. To znamená expresní vektor a nebo vektor dále obsahující gen selekčního markéru a/nebo nukleotidovou sekvenci pro replikaci v hostitelské buňce a/nebo pro integraci do genomu hostitelské buňky.

Další aspekty předkládaného vynálezu se týkají způsobů produkce PDAT v hostitelských buňkách nebo jejich potomstvu, včetně buněk geneticky modifikovaných olejnin, kvasinek, plísní nebo jiných organismů akumulujících oleje, a sice tím, že se v jejich buňkách exprimuje konstrukt podle vynálezu. Buňky obsahující PDAT v důsledku exprese sekvence kódující PDAT jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dále se předkládaný vynález týká transgenních buněk nebo organismů obsahujících nukleové kyseliny a/nebo genové konstrukty a/nebo vektor podle předkládaného vynálezu. Předmětem vynálezu je tedy také transgenní buňka nebo organismus, které jsou eukaryotní. Výhodně je transgenní buňka nebo organismus kvasinková buňka nebo rostlinná buňka nebo rostlina. předkládaný vynález se dále týká transgenních buněk nebo organismů, které mají změněnou biosyntetickou dráhu tvorby triacylglycerolu. Transgenní buňky nebo organismy mající změněný obsah olejů jsou také předmětem vynálezu. Dále se předkládaný vynález týká transgenních buněk nebo organismů, kde je změněn aktivita PDAT. Změněná aktivita PDAT je charakterizovaná změnou genové exprese, katalytické aktivity a/nebo regulace aktivity enzymu. Navíc do 9 > t* předkládaného vynálezu spadá transgenní buňka nebo organismus, kde změněná biosyntetická dráhy syntézy triacylglycerolu je - charakterizována zabráněním akumulace nežádoucích mastných . kyselin v, membránových, lipidech·........ .................. Různá další provedení předkládaného vynálezu se týkají způsobů užití sekvence DNA kódující PDAT ke zvýšení obsahu olejů v buňce.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká akumulace velkého . množství neobvyklých mastných kyselin v triacylglycerolech produkovaných v buňce, a sice vnesením sekvence DNA produkující PDAT, který specificky odstraňuje tyto mastné kyseliny z membránových lipidů buňky a směruje je do triacylglycerolů. Rostlinné buňky mající takové modifikace spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu. Dále se předkládaný vynález týká způsobu produkce triacylglycerolu, který obsahuje krok. pěstování transgenních buněk nebo organismů podle vynálezu v podmínkách, ve kterých je nukleová kyselina exprimována a uvedené transgenní buňky nebo organismy obsahují enzym katalyzující přenos mastných kyselin z fosfolipidů na diacylglycerol za vzniku triacylglycerolu.

Navíc triacylglyceroly produkované výše uvedeným způsobem jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dále je předmětem předkládaného vynálezu použití nukleotidové sekvence a/nebo enzymu podle vynálezu pro produkci triacylglycerolu a/nebo triacylglycerolů s neobvyklými mastnými kyselinami. Do rozsahu vynálezu dále spadá také použití nukleotidové sekvence a/nebo enzymu podle vynálezu pro transformaci jakékoliv buňky nebo organismu, které pak exprimují nukleovou kyselinu podle vynálezu, což vede ke změně, výhodně zvýšení obsahu olejů v těchto buňkách nebo organismu. 10 10

• 9 9 9 9 9· ♦ 9 9 9 9 9 • · • » PDAT podle vynálezu obsahuje jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci, jako je protein, polypeptid nebo polypeptidový fragment, které lze získat z mikroorganismu, zvířete nebo .rostliny., , .a. které vykazuj í . schopnost _ katalýzo vat__produkci triacylglycerolu z fosfolipidu a diacylglycerolu ve vhodných reakčních podmínkách enzymu. Termín vhodné reakční podmínky enzymu označuje jakékoliv dostupné podmínky prostředí (definované faktory jako je teplota, pH, nepřítomnost inhibitorů) které dovolují, aby enzym byl funkční.

Další PDAT lze získat pomocí specifických sekvencí uvedených ve vynálezu. Dále odborníkovi je jasné, že je možné získat přírodní nebo syntetické PDAT, včetně modifikovaných aminokyselinových sekvencí a výchozích materiálů pro syntetické proteinové modelování ze.sekvencí PDAT, které jsou uvedeny ve vynálezu nebo užitím' takových sekvencí. K modifikovaným aminokyselinovým sekvencím patří sekvence, které byly mutovány, zkráceny, prodlouženy apod. , ač jsou částečně nebo plně syntetické. Sekvence skutečně purifikované z rostlinných preparátů nebo jsou identické nebo kódující s nimi identický protein, jsou považovány bez ohledu na způsob získání sekvence nebo proteinu, za sekvence nebo proteiny přírodního původu. Dále nukleové podle vynálezu kyseliny sloužící jako sondy (RNA, DNA) mohou být užity ke screeningu a izolaci „homologních" nebo „příbuzných" PDAT z různých rostlinných nebo mikrobiálních zdrojů. A dále je také jasné, že odborník na základě popisu předkládaného vynálezu a informací zde uvedených je schopen identifikovat v jakémkoliv organismu PDAT aktivitu, purifikovat enzym s touto aktivitou a tím identifikovat „nehomologní" sekvence nukleové kyseliny kódující takový enzym. 11

Předkládaný vynález v podstatě zahrnuje následující aspekty: 1. Použití genu PDAT (genomického klonu nebo cDNA) pro .transformaci.. , ...... ........ _______ 2. Použití molekuly DNA podle aspektu Γ, kdy se DNA užije k transformaci jakéhokoliv organismu, aby byla v tomto organismu exprimována a poskytla tak aktivní rekombinantní enzym PDAT, čímž se zvýší obsah olejů v organismu. 3. Použití molekuly DNA podle aspektu 1, kdy se DNA užije k transformaci jakéhokoliv organismu, aby se zabránilo akumulaci nežádoucích mastných kyselin v membránových lipidech. 4. Použití podle aspektu 1, kde je gen PDAT použit pro transformaci transgenního organismu akumulujícího olej, aby produkoval jakoukoliv neobvyklou mastnou kyselinu, která je škodlivá, pokud se vyskytuje ve velkém množství v membránových lipidech, jako jsou např. mastné*· kyseliny se středním řetězcem, hydroxylované mastné kyseliny, epoxygenované mastné kyseliny a acetylenické mastné kyseliny. 5. Použití podle aspektu 1, kdy je gen PDAT použit pro transformaci organismů a tyto organismy jsou kříženy s jinými organismy akumulujícími oleje, modifikovanými tak, aby produkovaly neobvyklou mastnou kyselinu, která je škodlivá, pokud se vyskytuje ve velkém množství v membránových lipidech, jako jsou např. mastné kyseliny se středním řetězcem, hydroxylované mastné kyseliny, epoxygenované mastné kyseliny a acetylenické mastné kyseliny. 6. Použití podle aspektu 1, kdy enzym kódovaný genem PDAT nebo PDAT cDNA je enzym s odlišnou acylovou spécifitou. 7. Použití podle aspektu 1, kdy gen kódující PDAT nebo cDNA pocházejí ze Saccharomyces cereviseae, nebo obsahují nukleotídovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci z 12 * 4 ·· é ·« · 6 v* -ý • e * .· • '· '· • · • /· · • 9 9 ; • · ·· · ··· '·· 9 9 ' • ·· «* 30 % nebo více identickou s aminokyselinovou sekvencí PDAT uvedenou zde jako sekvence id. č. 2. 8. Použití podle aspektu 1, kdy gen kódující PDAT nebo ____..wCDNA^.,pocház.ej.í. _ ze Saccharomyces..., cereviseae, . nebo . .obsahují

nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci ze 40 % nebo více identickou s aminokyselinovou sekvencí PDAT uvedenou zde-jako sekvence id. č.. 2. * . 9. Použití podle aspektu 1, kdy gen kódující PDAT nebo ^ cDNA pocházejí ze Saccharomyces cereviséae, nebo obsahují nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci ze %

60 % nebo více identickou s aminokyselinovou . sekvencí PDAT uvedenou zde jako sekvence id. č. 2. 10. Použití podle aspektu 1, kdy gen kódující PDAT nebo cDNA pocházejí ze Saccharomyces cereviseae, nebo obsahují

nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci z 80 % nebo více identickou s aminokyselinovou sekvencí PDAT uvedenou zde jako sekvence id. č. ’ 2. , 11. Použití podle aspektu 1, kdy gen kódující PDAT nebo cDNA pocházejí z rostlin nebo obsahují nukleotidové sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci ze 40 % a více identickou _s aminokyselinovou sekvencí PDAT z Arabidopsis thaliana nebo proteinem kódovaným příslušným cDNA klonem plné délky ze Zea ip mays, Lycopersicon esculentum nebo Neurospora crassa. 12. Transgenní olej akumulující organismy obsahující ve svém genomu gen PDAT vnesený technikou rekombinantní DNA nebo somatickou hybridizací. 13. Transgenní olej akumuluj ící organismy podle aspektu 12 obsahující ve svém genomu gen PDAT, který má specifitu pro substráty se zvláště neobvyklými aminokyselinami a gen pro tyto neobvyklé mastné kyseliny. 14. Transgenní organismy podle aspektu 12 nebo 13, které jsou vybrány ze skupiny obsahující houby, rostliny a zvířata. 15. Transgenní organismsy podle aspektu 12 nebo 13, které jsou vybrány ze skupiny kulturních rostlin. 16. Transgenní organismsy podle aspektu 12 nebo 13, které jsou vybrány ze skupiny kulturních rostlin, a kde gen.....PĎAT ie r exprimován pod kontrolou promotoru specifického pro zásobní orgán. 17. Transgenní organismsy podle aspektu 12 nebo 13, které .jsou vybrány ze skupiny kulturních rostlin, a kde gen PDAT je exprimován pod kontrolou promotoru specifického pro semena. 18. Oleje z organismů podle kteréhokoliv z nároků 12 až 17. 19. Způsob změny acylové specifity PDAT tím, že se změní nukleotidová sekvence přirozeně se vyskytujícího genu a tak se vytvoří gen kódující enzym s novou acylovou specifitou. 20. Protein kódovaný molekulou DNA podle aspektu 1 nebo jeho funkční fragment. 21. Protein podle : aspektu· 20 označený.....jako fosfolipid:diacyiglycerol acyltransferáza. 22. Protein podle aspektu 21, který má odlišnou acylovou specifitu. 23. Protein podle aspektu 13, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 2, 13, 14 nebo 15 (a proteiny kódované celým genem uvedeným zde jako sekvence id. č. 1 , 3, 4, 5, 7, 9, 10, 1 1 nebo 12 nebo jeho částí), nebo aminokyselinovou sekvenci z alespoň 30 % homologní s uvedenými sekvencemi. '24. Protein podle aspektu 23 izolovaný ze Saccharomyces cereviseae. ·· !· ,·· (,· '(,· !'· .· · · '· · · · · '· « · · · « · · · ·.· « .· (· · · ,· # · ' ·'· · · · · · 14 Příklady provedení vynálezu

Obecné materiály a metody použité v příkladech provedení Kmeny, kvasinek á plazmidy •Divoké kmeny kvasinek byly buďto FY1679 (MATa-his3-Δ200 Ieu2-Al trpl-Δβ Xira.3-52) nebo W303-1A (MATa ADE2-1 canl-100 his3-22,15 leu2-3,112 trpl-1 ura3-l) (7). Kmen s přerušením YNR008w::KanMX2 FVKT004-04C(AL), který je kongenní s kmenem FY1679, byl získán ze .sbírky Euroscarf Collection (8). Fragment velikosti 2751 bp obsahující gen YNR008w s lemujícími úseky 583 bp na 5'-konci a 183 bp na 31-konci byl amplifikován z genomové DNA W303-1A užitím Taq polymerázu a oligonukleotidy 5'TCTCCATCTTCTGCAAAACCT-3' a 5'-CCTGTCAAAAACCTTCTCCTC-3' . jako primery. Vzniklý PCR produkt byl. pprifikován elektroforézou na agarózovém gelu a klonován do místa ĚcoRV plazmidu pBluescript (pbluescript-pdat) . Pro komplémentáční pokusy byl klonovaný fragment vyštěpen pomocí HindlII-SacI a pak klonován mezi místa HindiII a Sací do pFL39 (9) , čímž se vytvořil plazmid pUSl. Pro expresi genu PDAT byl EcoRl fragment velikosti 2202 bp z plazmidu pBluscript obsahující pouze 24 bp dlouhý obklopující fragment na 51-konci do místa BamHI GAL1TPK2 expresního vektoru pJN92 (12), čímž byl vytvořen pUS4.

Preparáty mikrosomů

Mikrosomy z vyvíjejících se semen slunečnice (Helianthus annuus), Ricinus communis a Crepis palaestina byly připraveny postupem, který publikovali Stobart a Stymne (11). Pro získání mikrosomů z kvasinek byl 1 g kvasinkových buněk (čerstvá hmotnost) resuspendován v 8 ml ledového pufru (20 mM Tris-Cl, pH 7,9, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 % (objem.) glycerol, 1 mM DTT, 0,3 M síran amonný) ve 12ml skleněné zkumavce. Do této zkumavky se pak přidaly 4 ml skleněných perliček (průměr 0,45 15 15

«»·ι· ·. - Ο • ·· *'·♦ «·: , Ψ až 0,5 mm) a zkumavky byly sině třepány (3 x 60 s) v buněčném homogenizéru MSK (B. Braun Melsungen AG, Germany). Homógenizovaná suspenze byla centrifugována při 20000 x g po '15 minut v - 60 C_ a_ získaný supernatant byl opět centrů fugo ván při,· 100 000 x g po 2 hodiny v ’6°C. __ Pelet po 100 000. x g centrifugaci byl resuspendován v 0,1 M fosforečnanu draselném (pH 7,2). a pak uložen do -80°C. Tento preparát je dále označován jako hrubá frakce kvasinkových mikrosomů.

Lipidové substráty

Radioaktivně značené kyselina ricinolejová (12-hydroxy-9-oktadecenová) a kyselina vernolová (12,13-epoxy-9-oktadecenová) byly enzymaticky syntetizovány z kyseliny [1-14C] olejové a [1-14C] linolové, a sice inkubací s preparáty mikrosomů z Ricinus communis a Crepis palaestina, v uvedeném pořadí (12). Syntéza fosfatidylcholiriů (PC) nebo fosfatidylethanolaminů (PE) - s 14C-•-značenou----ačylovou skupinou v poloze sn-2 byla provedena buďto enzymatickou (13) nebo syntetickou (14) acylací kyseliny [14C] olejové, [14C] ricinolejové nebo [14C] vernolové. Dioleyl-PC označený v pozici sn-1 by syntetizován z sn-1-[14C] oleyl-lyso-PC a neznačené kyseliny olejové, jak bylo popsáno v (14). Sn-1- oleyl-sn-2-[14C]ricinoleyl-DAG byl syntetizován z PC působením fosfolipázy C typu XI z B. Cereus (Sigma Chemical Co.) jak bylo popsáno v (15). Monovernolyl- a divernolyl-DAG byly syntetizovány z TAG extrahovaného ze semen Euphorbia lagascae, užitím TAG-lipázy (Rizhopus arrhizus, Sigma Chemical Co.) jak bylo popsáno v (16). Monoricinoleyl-TAG byl stejným způsobem syntetizován užitím TAG extrahovaného z Ricinus.

Analýza lipidů

Celkové složení lipidů kvasinek bylo určeno z buněk sklizených ze 40 ml tekuté kultury, která byla homogenizována 16 v mixéru se skleněnými perličkami a pak extrahována do chloroformu, jak popsali Bligh a Dyer (17) , a pak .separací chr-omatograf ií na tenké vrstvě ve směsi hexan/diethylether/octová kyselina (80:20:l)v na__ předem potažených destičkách se silikagelem 60 (Merck) .· Oblast lipidů byla lokalizována rychlou expozici parám 12‘ a identifikována pomocí .vhodných standardů. Polární lipidy, sterolestery a triacylglyceroly, a další zbývající minoritní třídy lipidů označené jako ostatní lipidy, byly vyříznuty z destiček po separaci. Methylestery mastných kyselin byly připraveny zahříváním suchého vyřezaného materiálu při 85 °C po dobu 60 minut ve 2% (objem.) kyselině sírové v suchém methanolu. Methylestery byly extrahovány hexanem a analyzovány GLC na koloně 50 m x 0.32 mm CP-Wax58-CB s fúzním křemičitanem (Chrompack) s methylheptadékanovou - kýselinou jako vnitřním standardem. Obsah mastných kyselin v každé frakci byl kvantifikován a použit k výpočtu- relativního .množství lipidů v každé třídě. Pro stanovení celkového obsahu lipidů byly centrifugací sklizeny 3 ml alikvoty z kvasinkových kultur, získané pelety byly opláchnuty destilovanou vodou a lyofilizovány. Hmotnost suchých buněk byla určena a obsah mastných kyselin byl stanoven GLC-analýzou po konverzi na methylestery, jak bylo popsáno výše. Obsah lipidů byl pak vypočten v nmol mastných kyselin (FA) na mg suché hmotnosti kvasinek.

Enzymové testy

Alikvotní části hrubé frakce mikrosomů (odpovídající 10 nmol mikrosomálního PC) z vyvíjejících se semen rostlin nebo kvasinkových buněk byly lyofilizovány přes noc. 14C-značené lipidy sloužící jako substráty rozpuštěné v benzenu byly přidány k suchým mikrosomům. Benzen byl odpařen pod proudem N2 a lipidy .se tak dostaly do přímého kontaktu 17 17 • • 99 • 9 • 9 • 9 9 99 ' 999 • ·» «· ♦ · • · · « I I • * * 9 ψ. 9 '» f ·· * • « ·ι • · · « i · « 9 9 9 99 99 s membránami, a bylo přidáno 0,1 ml 50 mM fosforečnanu draselného (pH 7,2). Suspenze byla dobře promíchána a pak inkubována při 3 0°C po uvedenou dobu až do 90 minut. Lipidy byly extrahovány z reakční směsi chloroformem a separpyány_ chromatografií na tenké vrstvě ve směsi hexan/diethylether/octová kyselina (35:70:1.5) na deskách se silikagelem 60 (Merck). Radioaktivní lipidy na deskách byly vizualižovány a kvantifikovány elektronickou autoradiografií ..(Instant Imager, Packard, USA) .

Kultivace kvasinek

Kvasinkové buňky byly kultivovány ve 28 °C na rotační třepačce v tekutém médiu YPD (1% kvasinkový extrakt, 2% pepton, 2% glukóza), syntetickém médiu (18) obsahujícím 2% {objem.) glycerol a 2% (objem.) ethanol nebo minimálním médiu (19) obsahujícím glycerol v koncentraci 16 g/1 Předkládaný vynález je dále popsán a vysvětlen pomocí následujících příkladů výhodných provedení, které nijak neomezují rozsah vynálezu. Příklad 1

Acyl CoA-nezávislá syntéza TAG užitím mikrosomů ze semen olejnin V semenech olejnin se vyskytuje velký počet neobvyklých mastných kyselin (20) . Mnohé z těchto mastných kyselin, jako např. kyselina ricinolejová (21) a vernolová (22), jsou syntetizovány užitím fosfatidylcholinu {PC) s oleylovými nebo linolylovými skupinami esterifikovanými v poloze sn-2, jakožto bezprostředního prekurzoru. Avšak přestože PC může být substrátem pro syntézu neobvyklých mastných kyselin a je 18 »«·* # • ·· • ·· »* 4 9 • f # · • ·» • •f 9 <9 % • • • • · • 9 * {· • 9 'V t ·# ·· • «Μ * 9 «a· '· t i# • · ·· • hlavním membránovým lipidem v semenech, neobvyklé mastné kyseliny se jen zřídka vyskytují v membránách. Místo toho jsou hlavně inkorporovány v TAG. Musí proto u semen olejnin, která akumulují neobvyklé mastné kyseliny, existovat __ nějaký mechanismus účinného a selektivního přenosu těchto neobvyklých acylových skupin z PC. na TAG. Přenosová reakce byla biochemicky charakterizována u semen ,z Ricinus communis a Crepis palaestina, tj . rostlin akumulujících vysoké hladiny ricin.olejové a vernolové kyseliny, a u slunečnice (Helianthus annuus), tj. rostliny, která má v oleji ze semen pouze všeobecně rozšířené mastné kyseliny. Hrubé frakce mikrosomů z vyvíjejících se semen byly inkubovány s PC majícím 14C-značenou oleylovou, ricinoleylovou nebo vernolylovou skupinu v poloze sn-2. Po inkubaci byly extrahovány lipidy a analyzovány chromatografií na tenké vrstvě. Bylo zjištěno, že množství radioaktivity inkorporované do frakce neutrálních lipidů rostlo lineárně po.. .dobu - 4 hodin (data neuvedena) . Distribuce [14C]acylových skupin ve frakci neutrálních lipidů byla analyzována po 80 minutách (obr. 1). Zajímavým výsledkem bylo, že množství a distribuce radioaktivity mezi různými neutrálními lipidy byla silně závislé jak na druhu rostliny tak na typu [14C]acylového řetězce. Tak mikrosomy slunečnice inkorporovaly většinu značky do DAG bez ohledu na typ [14C] acylové skupiny. Naproti tomu mikrosomy R. communis přednostně inkorporovaly [14C] ricinoleylovou a [14C] vernolylovou skupinu do TAG, zatímco [14C]oleylovou skupinu byla nalezena hlavně v DAG. A nakonec mikrosomy C. palaestina inkorporovaly jen [14C] vernolylovou skupinu do TAG a [14C] ricinoleylová skupina byla nalezena hlavně ve volných mastných kyselinách a [14C] oleylovou skupinu byla nalezena hlavně v DAG. To ukazuje, že vysoké hladiny kyseliny ricinolejové a vernolové v poolu TAG u R. communis a C. palaestina, v uvedeném pořadí, lze 19 vysvětlit účinným a selektivním přenosem odpovídajících acylových skupin z PC na TAG v těchto organismech.

Syntéza triacylglycerolů v preparátech mikrosomů z vyvíjejících se semen R. coímunis je ^přehledně shrnuta, v'tabulce 1. Příklad 2

PDAT: nový enzym, který katalýzuje syntézu TAG nezávislou na acyl COA

Bylo zkoumáno, zda DAG může sloužit jako donor acylové skupiny a současně jako akceptor acylové skupiny .v reakci katalyzované mikrosomy ze semen olejnin. Proto byl neznačený divernolyl-DAG inkubován buďto s stí- 1-oleyl-sn-2 - [14C] ricinoleyl-DAG nebo sn-l-oleyl-sn-2-[14C] ricinoleyl-PC za přítomnosti mikrosomů z R„\ coímunis. Syntéza · molekul TAG obsahujících jak [14C] ricinoleylové tak vernolylové skupiny byla 5x vyšší když [14C] ricinoleyl-PC sloužil jako donor acylové skupiny ve srovnání s [14C] ricinoleyl-DAG jakožto donorem (Obr. 1B) . Tyto údaje silně naznačují, že PC je intermediátní donor acylové skupiny a DAG akceptor v reakci, kdy vzniká TAG nezávisle na acyl-CoA v mikrosomech semen. Tudíž je tato reakce katalyzovaná novým enzymem, který byl nazván fosfolipid : diacylglycerol acyltransferáza (PDAT).

Aktivita PDAT v mikrosomech kvasinek

Kvasinky divokého typu byly kultivovány za podmínek, kdy je indukována syntéza TAG. Membrány mikrosomů byly připraveny z těchto buněk a byly. inkubovány se sn-2 - [14C] -ricinoleyl-PC a DAG a byly analyzován, vytvářené produkty značené [14C] . [14C] - ricinoleylové skupiny' pocházející z PC ve frakci neutrálních lipidů byly nalezeny především ve volných mastných:kyselinách 20 • « * · · nebo TAG a množství syntetizovaných . TAG bylo závislé na množství DAG, který byl přidán do reakce (Obr. 2). Při syntéze in vitro TAG obsahujícího ricinoleylové i vernolylové skupiny .druhy..*,TAG.,. které ...se nevyskytují., in jvdyp.,z exogenně . „dodaného., sn-2 - [14C] ricinoleyl-PC a neznačeného vernolyl-DAG (Obr. 2, dráha 3) , jasně ukázaly na existenci na acyl-CoA nezávislé· syntézy TAG zahrnující PC a DAG jakožto substráty v mikrosomálních membránách kvasinek. Tudíž syntéza TAG v kvasinkách může být katalyzovaná enzymem podobným PDAT u' rostlin.

Gen kódující PDAT v kvasinkách

Gen v kvasinkovém genomu (YNROOSw) je známý, avšak nic není známo o jeho funkci až nato, že není nezbytný k růstu za normálních podmínek. Mikrosomální membrány byly připraveny z kvasinek kmene FVKT004-04C(AL) (8), ve kterých byl tento gen neznámé funkce narušen. PDAT >* aktivita v mikrosomech byla stanovena užitím PC s radioaktivně značenými mastnými kyselinami v poloze sn-2. Aktivita byla zcela nepřítomná u kmene s narušeným genem (viz obr. 2, dráha 4) . Významné bylo, že aktivita mohla být částečně obnovena v přítomnosti genu YNR008w v jediné kopii v plazmidu pUSl (obr. 2, dráha 5) . Navíc acylové skupiny fosfátidyletanolaminu (PE) byly účinně inkorporovány do TAG za přítomnosti mikrosomů z kmenu divokého typu, zatímco u mutovaného kmenu nedošlo k žádné inkorporaci z tohoto substrátu (data neuvedena). To ukazuje, že YNROOSw kóduje kvasinkový PDAT, který katalyzuje transfer acylové skupiny z polohy sn-2 fosfolipidu na DAG a tak vytváří TAG. Je nutno zmínit, že estery cholesterolu se netvořily z radioaktivního PC ani při inkubaci s přidanými ergosteroly, a také množství radioaktivně značených volných mastných kyselin tvořených z PC nebylo ovlivněno porušením genu YNR008w • · · · · 21 (data neuvedena) . To ukazuje, že PDAT z kvasinek nemá aktivitu syntetizující estery cholesterolu ani fosfolipázovou‘aktivitu. Příklad .3........... ...... -----------. ..... ..................

Zvýšený obsah TAG u kvasinkových buněk nadměrně exprimujících PDAT

Účinek · nadměrné exprese ("overexpression") genu kódujícího PDAT byl studován pomocí transformace kmenu kvasinek divokého typu plazmidem pUS4, ve kterém je tento gen exprimován pod kontrolou promotoru GAL1.-TPK2, který je indukován galaktózou. Buňky obsahující prázdný expresní vektor byly užity jako kontrola. Buňky byly kultivovány v syntetickém glycerol-ethanolovém médiu a exprese genu byla indukována po 2 hodinách (časná log-fáze) nebo po 25 hodinách (stacionární fáze) přidáním galaktózy. ' Buňky pak byly inkubovány dalších 21 hodin, poté byly sklizeny a byl proveden test. Bylo zjištěno, že exprese PDAT významně neovlivnila rychlost růstu, který byl stanoven prostřednictvím optické denzity. Avšak celkový obsah lipidů, měřený jako pmol mastných kyselin na mg suché hmoty kvasinek byl o 47 % (v log-fázi) nebo o 29 % (ve stacionární fázi) vyšší u kmene exprimujícího PDAT než u kontroly. Kromě toho obsah polárních lipidů a esterů cholesterolu nebyl ovlivněn expresí PDAT. Místo toho zvýšený obsah lipidů v těchto buňkách byl celý způsoben zvýšením obsahu TAG (obr. 3A,B). Množství TAG bylo zvýšeno 2 x u kmene exprimujícího PDAT v časné log-fázi a o 40 % u buněk ve stacionární fázi. Je zajímavé, že výrazné zvýšení obsahu TAG bylo dosaženo expresí PDAT dokonce i v podmínkách (např. ve stacionární fázi), kdy byl indukován DAGAT a významně přispěl k syntéze TAG. PDAT aktivita in vitro testovaná na mikrosomech. z kmenu kvasinek exprimujícího PDAT 22

• · • · ♦ • · ♦ »· ♦

• · · • · • · byla 7 x vyšší než u kontrolního kmenu, což bylo ve shodě se zvýšenou hladinou TAG pozorovanou in vivo (obr. 3C). Výsledky tak jasně ukázaly, že je možné využít gen PDAT, ke zvýšení^ obsahu olejů v transgenních organismech.

Substrátová specifita kvasinkové PDAT

Substrátová specifita kvasinkové PDAT byla analyzována užitím mikrosomových preparátů z kmenu kvasinek exprimujícího PDAT (viz obr. 4) . Rychlost syntézy TAG za podmínek uvedených na obr. 4 s dioleyl-PC jakožto donorem acylové skupiny, byla 0,15 nmol/min/mg proteinu. Se značením obou oleylových skupin PC bylo možné za daných testovacích podmínek detekovat přenos 11 pmol/min [14C] oleylových řetězců na TAG a vytvoření 15 pmol/min lyso-PG. V mikrosomech ze kmenu deficitního na PDAT nebyly detekovány vůbec žádné TAG ·a detekována byla pouze stopová množství lyso-PG, což indikuje, že kvasinková PDAT katalyzuje vznik ekvimolárních 'množství· TAG a lyso-PG, když jsou dodány PC a DAG jako substráty. Skutečnost, že vzniká poněkud více lyso-PC než TAG je možné vysvětlit přítomností fosfolipázy v kvasinkových mikrosomech, které tudíž z PC produkují lyso-PC a neesterifikované mastné kyseliny.

Specifita kvasinkové PDAT pro různé pozice acylové skupiny byla testována inkubací mikrosomů s di-oleyl-PC nesoucím [14C]acylovou skupinu buďto v pozici sn-1 (viz obr. 4A, sloupek 2) nebo sn-2 (viz obr. 4A, sloupek 3). Bylo zjištěno, že hlavním produktem značeným [14C] byl v uvedeném prvním případě lyso-PC, a ve druhém případě TAG. Byl tak učiněn závěr, že kvasinková PDAT má specifitu pro přenos acylových skupin z pozice sn-2 fosfolipidu na DAG, čímž tvoří sn-l-lyso-PC a TAG. Takže za použitých podmínek testu jen stopová množství [14C]-značeného DAG se tvořilo ze sn-1-značeného PC reverzibilním působením CDP-cholin : cholin 3

\ +·.

23 '

Fosfotransferázy. Značený DAH byl dále konvertován na TAG -

působením PDAT. Není tudíž možné odlišit, - zda malé množství '.značeného ;TAGř které se tvoří v přítomnosti di-oleýl-PC snrjl.,, „._§yn t e ťi z ováno 'přímo’ z sti-1-značeného DAG a pak přísně selektivně acylováno .. i \ ' .y. /PDAT, - která .může působit také. v pozici sn-1, nebo jestli je nejdříve .konvertován na sn-1-značený DAG a pak acylován ‘působením PDAT se striktní selektivitou pro přenos acylových skupin'na pozici sn-2 PC. Celkově to tedy ukazuje, že PDAT kódovaná genem YNR008w katalyzuje transfer acylové skupiny z'pozice sn-2; v -PC na DAG, čímž vzniká TAG a lyso-PC.

Substrátová specifita kvasinkové PDAT byla dále analyzována vzhledem k vedoucí skupině donoru acylové skupiny, přenášené acylové skupině a acylovým řetězcům na akceptorové molekule DAG. Dva hlavní membránové 'lipidy Saccharomyces cerevisiae jsou PC a PE, a jak je ukázáno na obr. 4B (sloupky 1 a 2) dioleyl-PĚ je téměř' 4' x%účinnější/ než dioleyl-PC V ... jakožto donor acylové skupiny v reakcích katalyzovaných PDAT. Kromě toho je rychlost přenosu acylové skupin silně závislá na typu acylové skupiny, která je přenášena. Takže ricinoleylová skupina v pozici sn-2 v PC je 2,5 x účinněji přenášena na TAG než oleylová skupina ve stejné pozici (obr. 4, sloupky 1 a 3). Naproti tomu kvasinková PDAT neupřednostňuje transfer verholylových skupin ve srovnání s oleylovými skupinami Obr. 4B," sloupky 1 a 4) . Acylové řetězce akceptorové molekuly DAG také/ ovlivňuj í účinnost reakce. Tak GAG s ricinoleylovou nebo vernolylovou skupinou je mnohem účinnějším akceptorem než dioelyl-DAG (viz obr. 4B, sloupky 1, 5 a 6) . Celkově uvedené výsledky ukazují, že účinnost přenosu acylové skupiny katalyzovaného -PDAT je silně závislá na vlastnostech substrátového1· lipidu'-. . / ·... Wj z * f

Geny PDAT

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence několika genů PDAT jsou zde uvedeny jako sekvence id. "č. 1 až 15. Další předběžné a/nebo částečné sekvence j sou _u_veděny jako sekvence id. ^ č’., 16 až 2 0 a 21 až 31. Jedna z genomových sekvencí,, Árabidopsis thaliana (sekvence id. č. 4) identifikovala EST cDNA 'klon Árabidopsis thaliana, a sice klon T04806. Tato cDNA bylá plně charakterizována a jeho nukleotidové sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 5. Na základě sekvenční homologie cDNA T04806 a genomové DNA sekvence z Árabidopsis thaliana (sekvence id. č. 4) je zjevné, že v pozici 417 cDNA klonu je přítomen dodatečný A (data neuvedena). Vyloučení tohoto nukleotidu poskytuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence id. č. 12. Příklad 4 . ..

Zvýšený obsah TAG v semenech Árabidopsis thaliana exprimujícího kvasinkovou PDAT

Pro expresi genu kvasinkové PDAT v Árabidopsis thaliana byl klonován EcoRI fragment z pBluescript-PDAT společně s napinovým promotorem (25) do vektoru pGPTV-KAN (26) .

Plazmid (pGNapPDAT) mající gen kvasinkové PDAT ve správné orientaci byl identifikován a pak transformován do

Agrobacterium tumefaciens. Tyto baktérie pak byly užity k transformaci rostlin Árabidopsis thaliana ekotyp Columbia (C-24) metodou transformace kořenů (27) . Jako kontroly byly užity rostliny transformované prázdným vektorem.

Semena první generace (TI) byla sklizena a naklíčena na médiu obsahujícím kanamycin. Semena druhé generace (T2) byla sloučena z jednotlivých rostlin a byl v nich analyzován obsah i ' mastných kyselin ' tak, že byly kvantifikovány methylestery 25 tl * «!) • · • · t • · • * užitím plynové kapalinové . chromatografie po methylaci semen -užitím 2% kyseliny sírové v methanolu při 85 °C po dobu 1,5-hodiny. Kvantifikace byla provedena užitím methylesteru heptadekanové kyseliny jakožto vnitřního standardu.. : _ .' ...... J i ... Z transformace plazmidem pGNapPDAT vznikla jedna Tl rostlina .-(26-14) , která poskytla sedm T2 rostlin, z nichž 3 přinesly semena, která měla statisticky průkazně •(v dvoustranném testu rozdílu průměrů) vyšší obsah oleje než semena' T2 rostlin vzešlých z Tl rostlin (32-4) transformovaných prázdným vektorem (viz tabulka 2). Přehled obrázků a tabulek

Obr. 1 '. . ‘

Metabolismus [14C] značeného PC. ' na frakci" neutrálních lipidů v rostlinných mikrosomech ·' .· ·..· ; f *· > . · ; · (A) Mikrosomy z vyvíjejících se.' semen, slunečnice, R. communis a C. palaestina byly inkubóváňy 80 minut ve 30°C s PC (8 nmol) obsahujícím kyselinu olejovou v poloze sn-1, a buďto se [14C]značenou kyselinou olejovou, ricinolejovou nebo vernolovou v poloze sn-2. Radioaktivita inkorporovaná do TAG (prázdné sloupky), DAG (plné sloupky), a neesterifikovaných mastných kyselin (čárkované sloupky) byla kvantitativně vyhodnocena chromatografií na tenké vrstvě a pak elektronickou autoradiografií a výsledky jsou uvedeny jako procenta přidaného značeného substrátu. (B) ,Syntéza in vitro TAG nesoucího dvě vernolylové skupiny a jednu [14C]ricinoleylovou skupinu v mikrosomech R. communis. Přidané substráty byly neznačený divernolyl-DAG (5 nmol) společně buďto se sn- 1-oleyl-sn-2- [14C] ricinoleyl-DAG (0.4 nmol, 7700 dpm/nmol) nebo sn-1-oleyl-sn-2-[14C], ricinoleyl-PC (0.4 nmol, 7700 dpm/nmol). Mikrosomy byly inkubovány se substráty po.. 3 0 minut ve 3 0°C, pak byly odebrány vzorky pro . : i. · ·' · í ; analýzu lipidů postupem, který byl popsán v obecných metodách. Zde uvedená data jsou průměrné hodnoty ze dvou experimentů.

Obr. 2 .......„........... ........................ _ 1 ' . . ..

Aktivita PDAT v kvasinkových, mikrosomech „vizualizóvaná autoradiografií vzniklých neutrálních lipidů separovaných chromatografií na tenké vrstvě (TLC).

Mikrosomální membrány (10 nmol PC) z kvasinek kmenu FY1679 divokého typu (dráhy 1-3), kongenního kmenu (FVKTOO4-04C(AL)) s narušeným genem YNR008W (dráha 4) nebo tohoto kmenu s narušeným genem transformovaného plazmidem pUSl, který

obsahuje gen YNR0 08w za svým nativním promotorem (dráha 5) , byly testovány na aktivitu PDAT. Jako substráty byly použity 2 nmol sn-l-oleyl-sn-2- [14C] ricinoleyl-PC společně s 5 nmol dioleyl-DAG (dráhy 2, 4 a 5) nebo rac-oleyl-vernolyl-DAG (dráha 3) . Enzymatický test . a ’ analýza lipidů byly provedeny postupem popsaným ve všeobecných -materiálech a postupech. Buňky byly překultivovány 20 hodin v tekutém médiu YPD, sklizeny a resuspendovány ve stejném objemu minimálního média (19) obsahujícího 16 g/l glycerolu. Pak byly buňky kultivovány dalších 24 hodin. Selekce plazmidu byla udržována růstem transformovaných buněk na syntetickém médiu postrádajícím uráčil (18) . Použité zkratky jsou: 10H-TAG, monoricinoleyl-TAG; 1-OH-l-ep-TAG, monoricinoleylmonovernolyl-TAG; OH-FA, neesterifikovaná ricinolejová kyselina.

Obr. 3..

Obsah lipidů (A, B) a aktivita PDAT (C) v kvasinkových buňkách exprimujících PDAT

Gen PDAT. v.plazmidu pUS4 byl nadměrně exprimován z promotoru GAL1-TPK2 'indukovaného galaktózou v buňkách kmenu W303-1A divokého typu (7). Exprese genu PDAT byla indukována po (A) 2 hodinách, nebo (B) 25 hodinách růstu přidáním galaktózy Jna finální, koncentraci 2 % (hmptnost/objem) ;·· Pak byly.' buňky inkubovány dalších 22 hodin před tím, než byly sklizeny. Množství lipidů v buňkách bylo stanoveno GLC-analýzou obsahu -mast-nýchUkyselin. a výsledky jsoju^uvedeny μ,πιοί mastných kyselin na mg suché hmotnosti, buďto v TÁG (prázdné sloupečky), polárních‘lipidech (šikmo šrafováné) , sterolesterech (plné) a‘ ostatních lipidech (svisle šrafováné)). Uvedená data jsou průměrné hodnoty ze třech nezávislých kultur kvasinek. (C) In yitró syntéza TAG preparátem mikrosomů z kvasinkových buněk obsahuj ících buďto prázdný vektor (vektor) nebo plazmid kódující PDAT (+ PDAT). Buňky byly kultivovány stejně jak bylo popsáno pro 3A. Substrátové lipidy dioleyl-DAG (2,5 nmol) a sn-l-oleyl-sn-2-[14C]-oleyl-PC (2 nmol) byly přidány k alikvotu mikrosomů (10 nmol PC) , a pak ' inkubovány po 10 minut při 2 8 °C. Množství značéného ’inkorporovaného TAG bylo kvantitativně stanoveno elektronickou áutÓřadiografií. Uvedené výsledky přédstavují průměrné hodnoty ze dvou měření .

Obr .4

Substrátová specifita kvasinkové PDAT.

Aktivita PDAT byla testována inkubací alikvotů lyofilizovaných mikrosomů (10 nmol PC) se substrátovými lipidy ve 30°C po 10 minut (panel A) nebo 90 minut (panel B) . neznačený DAG (2,5 mmol) byl užit jako substrát společně s různými značenými fosfolipidy, jak jsou uvedeny na obrázku. (A) Sn-poziční specifita kvasinkové PDAT vzhledem k substrátu, který je donorem acylové skupiny. Dioleyl-DAG společně s buďto sn-1 — [14C] oleyl-sn-2-[14C]oleyl-PC (di-[14C]-PC) , sn-1- [14C]oleyl-sn-2-oleyl-PC (snl-[14C]-PC) nebo sn-l-oleyl-sn-2-[14C]-PC (sn-2-[14C]-PC) . (B) Specifita kvasinkové PDAT vzhledem k hlavním skupinám fosfolipidů a acylovému složení fosfolipidů a diacylglycerolu. Dioleyl-DAG společně s buďto sn-1-oleyl-sn- 2-[ C]oleyl-PC (oleyl-PC), sn-l-oleyl-sn-2-[ C]oleyl-PE (oleyl-PE) , sn-l-oleyl-sn-2-[14C]ricinoleyl-PC (ricinoleyl-PC) nebo* sn-l-oléyl-sn-2 - [14C]vernolyl-PC (vernolyl-PC) . , V experimentu, 'j ehož'výsledky ' j sou znázorněny ·v grafu- - j ako-—2-------sloupečky nejvíce vpravo byly užity monoricinoleyl-DAG (ricinoleyl-DAG nebo monovernolyl-DAG (vernolylrDAG) společně se sn-l-pleyl-sn-ž- [14C] -oleyl-PC. Radioaktivní značka inkorporovaná do TAG .(plné sloupky) a lyso-PC (LPC, prázdné sloupky) byla

kvantitativně stanovena elektronickou autoradiografií. Uvedené výsledky jsou průměrné hodnoty ze dvou experimentů. Použité mikrosomy byly z buněk W303-1A exprimujících gen PDAT z promotoru GAL1-TPK2, jak bylo popsáno u obr. 3. Exprese byla indukována v časné stacionární fázi a buňky byly sklizeny po dalších 24 hodinách. ' ·. ' .·

Tabulka 1 i ’· : ·

Syntéza in vitro triacylglycerolů V mikrosomálních preparátech vyvíjejících se semen Ricinus conmunis

Alikvoty mikrosomů (20 nmol PC) byly lyofilizovány a substrátové lipidy byly přidány v benzenovém roztoku: (A) 0,4 nmol [14C]-DAG (7760 dpm/nmol) a 1,6 nmol neznačeného DAG; (B) 0,4 nmol [14C]DAG (7760 dpm/nmol) a 5 nmol neznačeného di-ricinoleyl-PC a (C) 0,25 nmol [14C]-PC (4000 dpm/nmol) a 5 nmol neznačeného DAG. Benzen byl odpařen N2 a byl přidán 0,1 ml 50 mM fosforečnanu draselného, směs byla dobře promíchána a inkubována ve 30 °C po dobu (A) 20 minut; (B) (C) 30 minut.

Testy byly ukončeny extrakcí lipidů chloroformem. Lipidy pak byly separovány chromatografií na tenké vrstvě na silikagelových deskách 60 (Merck; Darmstadt, Germany) ve směsi hexan/diethylether/kyselina octová 35:70:1.5. Radioaktivní lipidy byly vizualizovány a radioaktivita byla kvantitativně stanovena na deskách užitím elektronické autoradiografie

29 ···· '9' • *· 99 • ~-i 9 ·. ‘ ’*· • · 'φ·γ'λ 9*9 * r* 9 • » · 9 9 9 • · · • • t . t 9 ' * · • ’· • • «! ·#· • « · ·. · ·* « · ·

9 4 4 (Instant Imager,, Packard, US) . Uvedené výsledky -představují průměrné hodnoty ze dvou pokusů.

Radioaktivita v různých triaclglycerolech (TAG). Použité -a ~zkr'-atky-:^LxOH-w.._mojno-ri.cinoleyl-_; 2-OH, _di-ricinoleyl-'; -3-OH-, triricinoleyl; l.-OH-l-ver-, mono-ricinoleyl-monovernólyl-; 1- * * ’ V- ' .· r ΟΗ-2-ver-, mono-ricinoleyl-divernoleoyl-. Radioaktivně značený DAG a PC byly připraveny, enzymatickou reakcí. Radioaktivně značená ricinoleylová skupina je navázána na pozici sn-2 lipidu, a neznačená oleylová skupina na pozici sn-1. Neznačený DAG s veřnolýlovými nebo ricinoleylovými řetězci byl připraven působením enzymu TAG lipázy (6) na olej z Éuphorbia lágascae nebo Ricinus communis, v uvedeném pořadí. Syntetický di-ricinoleyl-PC byl laskavě poskytnut firmou Metapontum Agribios (Itálie).

Tabulka 2 " , · : ·

Celkové mastné kyseliny na * mg semen T2 po sloučení z více rostlin Arabidopsis thaliaňa transformovaných genem kvasinkové PDAT řízeným napinovým promotorem (26-14) nebo transformovaných prázdným vektorem (32-4) . * = statisticky významné rozdíly mezi kontrolními rostlinami a rostlinami transformovanými PDAT ve dvoustranném testu rozdílu průměrů pro a= 5. ·· i1* Λ

Ή '1

30

♦ » #♦·' -*·· • »· · ♦ ♦ ··♦

Citovaná literatura 1. Bell, R. M. & Coleman, R. A. (1980) Annu. Flev. Biochem. 49, 459-487. t 2. Stymne, S. & Stobart, K. (1987) in The biochemistry of plants: a -~~ 'compr^ Vol. 9,'edrStumpí,P. K. (AcademiePress,~New,-_,. ' York), pp. 175-214. 3. Cases, S. et al. (1998) Proč. Natí. Acad. Sel USA 95,13018-13023. 4. Hobbs, D. H., Lu, C. & Hills, M. J. (1999) FEBSLett. 452, 145-9 5. Zou, J., Wei, Y., Jako, C., Kumar, A., Selvaraj, G. & Taylor, D C. (1999) PlantJ. 19, 645-653. 6. Lardizabal, K., Hawkins, D., Maí, J., & Wagner, N. (1999) Abstract presented at the Biochem. Mol. Planí Fatty Acids Glycerolipids Symposium, South Lake tahoe, USA. 7. Thomas, B. J. & Rothstein, R. (1989) Cell56, 619-630. 8. Entian, K.-D. & Kotter, P. (1998) Meth. Microbiol. 26, 431-449. 9. Kern, L., de Montigny, J., Jund, R. & Lacroute, F. (1990) Gene 88,149-157. 10. Ronne, H., Cariberg, M., Hu, G.-Z. & Nehlíri, J. O. (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 4876-4884. . : ^ ,-1 " ·’ : 11. Stobart, K. & Stymne, S. (1990); \n ~Method in Plant Biochemistry, vol 4, eds. Harwood, J. L. & Bowyer, J. R. (Academie press, London), pp. 19-46. 12. Bafor, M., Smith, M. A., Jonsson, L., Stobrt, A. K. & Stymne, S. (1991) Biochem. J. 280, 507-514. 13. Banas, A., Johansson, I. & Stymne, S. (1992) Plant Science 84, 137-144. 14. Kanda, P. & Wells, M. A. (1981) J. Lipid. Res. 22, 877-879. 15. Stáhl, U., Ek, B. & Stymne, S. (1998) Plant Physiol. 117, 197-205. 16. Stobart, K., Mancha, M. & Lenman M, Dahlqvist, A. & Stymne, S. (1997) Planta 203, 58-66. 17. Bligh, E. G. & Dyer, W. J, (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917. 18.Sherman, F., Fink, G. R. & Hicks, J. B. (1986) in Laboratory Course Manual forMethods in Yeast Genentícs (Cold Spring Harbor Laboratory) 19. Meesters, P. A. E. P., Huijberts, G. N. M. and Eggink, G. (1996,) Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 575-579. 20. van de Loo, F. J., Fox, B. G. & Sommerville, C. (1993),in Lipid metabolism in plants, ed. Moore, T. S. (CRC Press, lne.), pp. 91-126. 21. van de Loo, F. J., Broun, P., Turner, S. & Sommerville, S. (1995) Proč. Natí. Acad. Sci. USA 95, 6743-6747. 22. Lee, M., Lenman,· M., Eanas, A., Bafor, M., Singh, S., Schweizer, M., Nilsson,. R., Liljenberg, C., Dahlqvist, A., Gummeson, P-O., Sjódahl, S.,

Greén, A., and Stymne, S. (1998) Science 280, 915-918. ^.Thompson, J. D., Gibson, T.. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, Dr • ; G. (1997) Nucl. Acids Res. 24, 4876-4882. ' 24, Saítou, N. & Nei, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4, 406-425,

Elléřstrórfi;' M.;'dosefsson, L·,-· &· Rask-r-L-flSOS)- Plent-Mol.

25. Stálberg, K "Biol. 23,-671 26.Becker, D., Kemper, E,, Schell, J., Masterson, R. (1992) Plant Mol. Biol. 20, . 1195 · ; • 27.D, Vaivekens, M. Van Montagu, and Van Lusbettens (1988) Proč. Nati. Ácad. Sci. U.S.A. 85, 5536 32 ¢4 « . ·♦ <♦ «· ·· ··". 9 ηβ '· '·.· >♦# ♦ 1· · * *y·' · ♦ ,· · ♦ · 'Λ · i ♦ < ♦ · .;· . -· • · # · · · -·♦·.« Přehled uvedených sekvencí SEKVENCE ID. Č. 1: Genomická DNA sekvence a předpokládaná aminokyselinová sekvence genu PDAT Saccharomyces cerevisiae, YNR008w, uloženého v GenBank pod č. Z71623 a Y1313.9, a nukleotidoyým identifikačním číslem 1302481. SEKVENCE ID. C. 2: Aminokyselinová sekvence předpokládaného otevřeného čtecího rámce YNROOSw ze Saccharomyces cerevisiae. SEKVENCE ID. Č. 3: Genomická DNA sekvence genu SPBC776.14 ze Schizosaccharomyces pombe. SEKVENCE ID. Č. 4: Genomická DNA sekvence části lokusu Arahidopsis thaliana GenBank č·. AB006704 . * - '* ' > . 1 SEKVENCE ID. Č. 5: E thaliana cDNA klonu, I identifikačním číslem J SEKVENCE ID. Č. 6 * Arabidópsis thaliana < * SEKVENCE ID. i 5. 7: 1 - Zea mays EST klonu, ’ % identifikačním číslem i * + SEKVENCE ID. Č. 8: mays EST klonu s identifikačním číslem

Nukleotidová . sekvence Arabidópsis

SEKVENCE ID. Č. 9: DNA sekvence části Neurospora ' crassa EST klonu ' W07G1, GenBank č.. A1398644, s nukleotidovým identifikačním číslem 4241729.. ’ . ( *

SEJCVENCÉ ID.- Č. 10: Genomická DNA sekvence -části lokusu Arabidópsis- thaliana s GenBank č. AC004557. SEKVENCE :ÍĎ. Č. 11: Genomická DNA sekvence části Arabidópsis thaliana lokusu s GenBank č. AC003027. SEKVENCE ID. Č. 12.: DNA sekvence části Lycopersicon

esculentum cDNA

Klonu s GenBank č. A1486835. SEKVENCE ID. Č. 13: Aminokyselinová sekvence

Schizosaccharomyces pombe předpokládaného otevřeného čtecího rámce CAA22887 genu ShBC776.14 ze- Schizosaccharomyces pombe. SEKVENCE ID. Č. 14: Ami nokys eli nová sekvence Arabidópsis thaliana předpokládaného otevřeného čtecího rámce AAC80628 pocházejícího z Arabidópsis thaliana lokusu s GenBank č. AC004557. SEKVENCE ID. Č. 15: Aminokyselinová sekvence Arabidópsis thaliana předpokládaného otevřeného čtecího rámce AAD10668 pocházejícího z lokusu Arabidópsis thaliana s GenBank č. AC 003 02 7.

Další prozatímní a částečné sekvence jsou definovány v následujících sekvencích SEKVENCE ID. č. 16: Aminokyselinová sekvence kvasinkového otevřeného čtecího, rámce (ORF) YNR008w ze Saccharómyces •v·..·' - * cerevisiae. .·- «"-'v i 34 • Λ9 * ··* ♦ · ♦ - ··.'· • '· · · ♦ ·/· t · · ·♦ Λ· , ··· • · - SEKVENCE ID. Č. 17: Aminokyselinová sekvence úseku genomové . .sekvence Arabidopsis thaliana (AC004557) . · r SEKVENCE ID. Č. 18: Aminokyselinová sekvence úseku genomové sekvence Arabidopsis thaliana (AB006704). SEKVENCE ID. Č. 19: Odpovídající genomická DNA sekvence a aminokyselinová sekvence kvasinkového ORF YNROOBw ze Saccharomyces cerevisiae. SEKVENCE ID. Č. 20: Aminokyselinová sekvence kvasinkového ORF YNR008w ze Saccharomyces cerevisiae predikovaná z odpovídající genomové DNA sekvence. SEKVENCE ID. Č. 21: Genomická DNA sekvence genu PDAT ze

Saccharomyces cerevisiae, YNR008w," s · GeneBank nukleotidovým id. číslem 1302481, a předpokládaná aminokyselinová sekvence YNR008W. SEKVENCE ID. Č. 22: Předpokládaná aminokyselinová sekvence kvasinkového genu YNR008w ze Saccharomyces cerevisiae. SEKVENCE ID. Č. 23: Genomická DNA sekvence genu SPBC776.14 ze Schizosaccharomyces pombe. SEKVENCE ID. Č. 24: Genomická DNA sekvence části lokusu

Arabidopsis thaliana s GeneBank č. AB006704. SEKVENCE ID. Č. 25: Nukleotidová sekvence a odpovídající aminokyselinová sekvence Arabidopsis thaliana EST klonu s Genebank č. T04806, s nukleotidovým identifikačním číslem 315966.

9999 • # *'· 99 ' 9 ·% · • · .· ( 9 9 -· ' • • J· ' · • · 9 '· • · - · • · · • j:· . · • · · 9: • '· • ♦ .·# *<·· ··· 99 •9.9 9 SEKVENCE ID. Č. 26: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence .Zea mays cDNA Klonu š GeneBank-identifikačním číslem 4388167. SEKVENCE ID. Č. 27: Aminokyselinová sekvence Zea mays cDNA klonu s GeneBank identifikačním číslem 43881 67. SEKVENCE ID. Č. 28: DNA sekvence části Neurospora crassa cDNA klonu W07Q1, identifikační číslo* 4241729. SEKVENCE ID. C. 29: Genomická DNA sekvence části lokusu Arabidopsis thaliana s GeneBank č. AC004557. SEKVENCE ID. Č. 30: Genomická DNA sekvence části Arabidopsis thaliana lokusu s GeneBank č.' AC0 03 02 7. SEKVENCE ID. C. 31: DNA sekvence části Lycopěřsicon esculentum cDNA klonu s GeneBank č. A1486635.

36 :Ψ. • * #· ·« -· V. · · • ·. m · ·« • · · .4« ·· · · • 1· » • * · • *· · • -%; • · • · 3 · · · • ··· ·· · <·<· ·· *· SK7NÁM SEKVENCÍ

<140>. -PCT/EP 00/02701 •<141> 2000-03-23 <160> 31· <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 . <211> 1986

<212> genomic DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1) . . (1983)

., » <400> 1 atg ggc aca ctg ttt ega aga aat gtc cag aac caa 33Q agt .gat tet Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn. Vál C-ln Asn Gin Lvs . Ser Asp Ser 1 5 •i. - • 10 ' 15 ' gat caa aac aat aaa ggg ggt tet gtt 'cat aac číS.CÍ’ ega 'gág age' aga Asp Glu Asn Asn Lys C-ly Gly Ser Val His Asn Lys Are Glu Ser' Arg- 20 25 ' 3 0 aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat aag 3Cf3 aga agg ggt Asn His Ile His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg C-ly 35 40 45 att agt ggc agt gca aaa aga aat gag cgt ggc 3.2.3. gat ttc gac agg Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg 50 55 60 aaa aga gac ggg clcLC ggt aaa cgt tgg aga gat tcc aga aga ctg Lys. Arg Asp C-ly As JI Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 70 75 80 aCC ttc att ctt ggt gca ttc tta ggt gta ctt ttg ccg ttt age ttt Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 95 ggc gct tat cat gtt cat aat age gat age gac ttg ttt gac aac ttt Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe 100 105 11Č) gca aac ttt gat ťca ctt aaa gtg tat ttg gat gat tgg aaa gat gtt Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Var Tyr Leu Asp A.sp Trp Lys •Asp Val 115' 120 125 48 '96 144 192 240 288 336

384

«··« • ·* » *. ♦· • · ‘ 9 *6 e* 9 9 • 9 . g, • • 9 9 9 \ · • • % · • f · • 9 ·*·; - ♦ ♦ ♦ • • • · . · · • ·· ··· • · · ·♦· f'· ;. . t**· ctc cca caa ggt ata agt tcg ttt átt gat gat att cag gqt ggt_aac . 432“ Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe Ile.Asp Asp Ile Gin Ala Gly Asn ·. 130 135 . ' - 140 v ' . - tac tcc aca tet tet tta gat gat ctc agt gaa aat ttt gccugtt ggt 480

Tyr Ser Thr Ser · Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val- Gly *,145’- '/V___' 150 * " '- 155 ' ’ - 160 V.áaá caa ctc ,tta·pgt gat tat aat atc gag gcč aaa. cat cct.gtt gta 5.28. ,Lyá Gin Leů Leu Arg Asp-Tyr Asn" Ile '„GlulAla Lys His.· Pro Val Val . ·.;· 1 * · ; · · " 165 ' 170' 175 Á, atg gtt cct ggt gtc att tet acg gga att gaa age tgg gga gtt att 576

Met Val-Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile 1 · '180. 185 190 • ; . . A. ,gga gac ‘gat gag tgc gat agt tet gcg cat ttt cgt aaa cgg ctg tgg 624

Gly Asp Asp Glu Cvs Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp . 195 * 200 205 gga agt ttt tac atg ctg aga aca atg gtt atg gat aaa gtt tgt tgg 672

Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 .220 ttg aaa cat gta atg tta gat cct gaa aca ggt ctg gac cca ccg aac 720

Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr .Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 : > -.23.5 ··' . ' ' 240 : · :4 ··.*· ttt acg cta cgt gca gca cag ggc ttc gaa tea act'gat tat ttc atc · 768 .Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr, Asp Tyr Phe Ile 245 ~ ·' · 250·. ' . : 255 . . gca ggg tat tgg att tgg aac aaa gtt ttc caa aat ctg gga gta att 816

Ala Gly Tyr Trp Ile Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val Ile 260 265 ' 270 ggc tac gaa ccc aat aaa atg acg agt get gcg tat gat tgg agg ctt 864

Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285 gca tat'tta gat cta gaa aga ege gat agg tac ttt acg aag cta aag 912

Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg A.rg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 290 ’ 295 300 gaa caa atc gaa ctg ttt cat caa ttg agt ggt gaa aaa gtt tgt tta 960

Glu Gin Ile Glu Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 310 315 320 att gga cat tet atg ggt tet cag att atc ttt tac ttt atg aaa tgg 1008 ' Ile Gly His Ser Met Gly Ser Gin Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lvs Trp 325 330 335 gtc gag get gaa ggc cct ctt tac ggt aat ggt ggt cgt ggc tgg gtt

Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 350 t ‘ ‘ ·

1056

; - 3>8 »·*<* >· • · >·* ·· • >0 •Φ :·* • 1 * * « .. · • .. ·· 1·» * *e #4 ·· • • · « *·· a « ·· * « • « • · · • β · • - · • .·» <#· ttc aac aaa aat ttg aca atg 1392 Phe Asn Lys Asn Leu -Thr Met 460, . ' aac gaa cac ata gat tca ttc att aat. gca gca ggg acg ctt ctg ggc . 1104

Asn Glu His Ile Asp Ser Phe I-le Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 355 360 365 ť r v gct cca aag gca gtt cca gct cta att agtggt gaa atg aaa gat acc 1152 _Ala. Pró Lvs Ala Val Pro Ala Leu Ile Ser Gly Glu Met Lys Asn Thr 370 " 375 ' 380 att.caa tta aat acg tta gcc atg~tát~glfc~ttg~gaaaag-'ttc-'t6e-~tca- - 1200 Ile :Gln Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu. Lys Phe Phe Ser 385 ; · 390 ~ 395 ' ‘ 400 aga att gag aga gta aaa atg tta caa acg tgg ggt ggt ata cca tca 1248

Arg Ile Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly Ile Pro Ser 405 410 415 'atg cta cca aag gga gaa gag gtc att tgg ggg gat atg aag tca tet 1296

Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val Ile Trp Gly. Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430 tca gag gat gca ttg aat aac aac act gac aca tac ggc aat ttc att 1344

Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe Ile 435 440 445 ega ttt gaa agg aat acg age gat gct Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala 450 455 ' ' . aaa gac gcc att aac atg aca tta tcg. ata - tca cct gaa tgg ctc caa 1440

Lys Asp Ala Ile Asn Met Thr.Leu Ser Ile’Ser Pro .Glu Tro ’ Leu "Gin 465 470 : _ /" 1 475. " ’ .*' ’ . 480 aga aga gta cat gag cag tac tcg ttc ggc tat tcc aag aat gaa gaa 1488

Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 485 490 ~ 495 gag tta aga aaa aat gag cta cac cac aag cac tgg tcg aat cca atg 153 6

Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Prc. Met 500 505 ' 510 gaa, gta cca ctt cca gaa gct ccc cac acg aaa atc tat tgt ata tac 1584

Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr 515 520 525 ggg gtg aac aac cca act gaa agg gca tat gta tat aag gaa gag gat 1632

Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg A.la Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 gac tcc tet gct ctg aat ttg acc atc gac tac gaa age aag caa cct 1680 A.sp Ser Ser A.la Leu Asn Leu Thr Ile A.sp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 545 550 " 555 560 gta ttc ctc acc gag ggg gac gga acc gtt ccg ctc gtg gcg cat tca 1728

Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 565 . 570 575 atg tgt cac aaa tgg gcc cag ggt gct tca ccg tac aac cct gcc gga Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 ’ 535 590 177 6

.V 33 ···· « • · · • · * ·· · • · • · • • ·♦ . • i • · 9 • · ♦ • · · ·· ··· • · • · · • · ♦ « • · • ··· 1824 att aac gtt act att gtg gaa atg aaa cac cag cca gat ega ttt gat Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Piie Asp 595 ’ 600 605

£ 9 ata cgt ggt gga gca aaa age gcc gaa cac gta gac atc ctc ggc age * Ile Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp Ile Leu Gly Ser ’ 610 615 620 ~~ gcg‘ gag"ťtg "'aac' gat’ -tác a-tc -ttg -aaa -att....g.car.agc„.ggt., ag.t ggc_gat Ala Glu Leu Asn Asp Tyr Ile Leu-Lys Ile Ala Ser Gly Asn Gly Asp . 625 ' “ 630 635 640 ctc gtc gag cca ege caa ttg tet-aat ttg age cag tgg .gtt tet cag Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin 645 .· 650 655 . atg. ccc ttc cca atg taa Met.Pro Phe Pro Met 660 1372 1920 1968 1986

A o * · · · · • · · * .· · · ·· ··· ··« <210> 2 ,

<211> 661 <212> PET <213 > Saccharomyces cerevisiae <400> 2 \ ^ ^ l?et’”GÍVr"Thr~'Ušu."J"Phe”ftrg"A'rg--Asn.-.V-alu31n._Asn Gin Lys Ser Asp Seř .'l ·,* .· - *" '5. 1.0 ‘

Asp Glu Asp. Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asň Lys Arg Glu Ser’Arg • *\ 20 ’ 25 , 30

Asn-His-Ile His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg A.rg Arg Gly . ; :.· 35 ’ 40 45

Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg 50 55 60

Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 70 75 .80 .Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 95

Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp A_sn Phe 100 Í05v' 110

Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val-TyrLeu Asp'-Asp Trp Lys Asp Val 115 - ' 12 0ο·'"· * í i -t i:' 125 -r · .. .. _ ,

Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe- Ile Asp Asp. Ile Gin Ala Gly Asn’ 130 135 . ' : '140

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly 145 150 155 160

Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175

Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile 180 185 ISO

Gly A.sp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205

Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220

Leu Lys His Val Met Leu A.sp Přo Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro A.sn 225 230 235 240

Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile 245 250 255

Ala Gly Tyr Trp. Ile Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val Ile .260 ; 265 270

Gly Tyr Glu Fro · Asn ’ Lys ;Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 27.5'' · 280 285 41 ♦ ♦· ·♦ · ♦· · · t 4 ·· • · · · · i * ··'··· ♦ « ♦ ♦ ♦ · · . · ··· ·· f ·*·

Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lvs • 290 295 · 300

Glu Gin Ile Glu Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cvs Léu 305." 310 315 " ’ 320 .Ile Gly His Ser Met Gly Ser Gin Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lys Trp ·' ·' ' 325........... -------'330—-----—-——335- - ·

Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp. Val 340 345 350 •Asn Glu His'Ile Asp Ser Phe Ile Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Giv * 35.5 360 3 65

Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu Ile Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 370 -375 380

Ile Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 385 390 395 400 'Arg Ile Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly Ile Pro Ser 405 410 415

Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val Ile Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 ' 425 .. .' 430 ' 4

Ser Glu A.sp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr- Tyr Gly Asn-Phe Ile 435 440 .. ,- -445

Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser A.sp A.la Phe Asn Lys · Asn Leu Thr Met 450 455 · 460 '. ‘

Lys Asp Ala Ile Asn Met Thr Leu Ser Ile Ser Pro Glu Trp Leu Gin 465 ' 470 475 480

Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys A.sn Glu Glu 485 490 495

Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 500 505 510

Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr 515 520 525

Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp ,530 535 540

Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro . 545 550 555 560

Val „Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 575 570

Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 . . 585 590

Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605 « * 9Λ2 « ·· ♦ · · - • · · · «

Ile Ařg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp Ile Leu Gly Ser ; .:610 615 · *. t 620 .·

Ala‘Glu Leu Ásn Asp Tyr Ile Leu Lvs Ile Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625 " ” 630 , 635 , ‘ 640 u-Val-Giu*"Fro··Arg Gin Leu. Ser Asn. Leu..Ser Gin Trp Val Ser Gin ’ ·. 645 650 ' '655

Met ’ Pro Phe - Pro Met v . . · 6 6 0 <210> 3 <211> 2312

<212> genomic DNA <213> Schizosaccharomyces porobe <400> 3 _atggcgtctt ccaagaagag caaaactcat aagaaaaaga aagaagtcaa atcocctatc 60 gacttaccaa a"ttcaaágaa accaacťcac gctcEgagcg agcaaccttc. agcgt.ccgaa. 120_ acacaatctg -tttcaaataa atcaagaaaa cctaaatttg gaaaaagatt gaattttata 180 'ttgggcgcta ttttgggaat atgcggtgcť ttttttttcg ctgttggaga cgacaatgct 240 gttttcgacc ctgctacgtt agacaaattt gggaatatgc taggctcttc agacttgttt 300 gatgacatta aaggatattt atcttataat gtgtttaagg atgcaccttt tactacggac 360 aagccttcgc agtctcctag cggaaatgaa gttcaagttg gtcttgatat gtacaatgag 420 ggatatcgaa gcgaccatcc tgttattatg gttccoggtg ttatcagctc aggattagaa 4S0 agctggtcgt ttaataattg ctcgattcct tactttagga aacgtctttg gggtagctgg 540 tctatgctga aggcaatgct ccttgacaag caatgctggc ttgaacattt aatgcttgat 600 aaaaaaaccg gcttggatcc gaagggaatt aagctgcgag cagctcaggg gtttgaagca 660 gctgattttt ttatcacggg ctattggatc tggagtaaag taattgaaaa ccttgctgca 720 attggttratg agcctaataa catgttaagt gcttcttacg attggcggtt atcatatgca 780 aatttagagg aacgtgataa. atatttttca aagtcaaaaa tgttcattga gtacagcaac 840 attgtacata agaaaaaggt agtgttgatt tctcactcca tgggttcaca ggttacgtac 900 . tattttttta agtgggttga agctgagggc tacggaaatg gtggaccgac ttgggttaat 960 gatcatattg aagcatttat aaatgtgagt ctcgatggtt gtttgactac gtttctaact 1020 tttgaataga tatcgggatc tttgattgga gcacccaaaa cagtggcagc gcťtt-tatcg 1080 ggtgaaatga aagatacagg tattgtaatt acattaaaca tgttaatatt taatttttgc 1140 taaccgtttt aagctcaatt gaatcagttt tcggtctatg ggtaagcaat aaattgttga 1200 gatctgttac taatttactg tttagtttgg 'aaaaatttct· ttcccgttct gaggtatatt 1260 caaaaataca aatgtgctct actttttcta acttttaata gagagccatg atggttcgca 1320 ccatgggagg agctagttct atgcrtccta aaggaggcga tgttgtatgg ggaaatgcca 1380 gttgggtaag aaatatgtgc tgttaatttt ttattaatat ttaggctcca gatgatctta 1440 atcaaacaaa tctttccaat ggtgcaaeta ttcgatatag agaagacatc gataaggacc 1.5.00 acgatgaatt tgacatagat gatgcattac aatttctaaa aaatgttaca gatgacgatt 1560 ttaaagtcat gctagcgaaa aattattccc acggtcttgc ttggactgaa:aaagaagtgt 1620 taaaaaataa cgaaatgccg tctaaatgga taaatccgct agaagtaaga acattaaagt 1680 tactaaatta tactaaccca aatagactag tcttccttat gctcctgata tgaaaattta 1740 ttgcgttcac ggggtcggaa aaccaactga gagaggttat tattatacta ataatcctga 1800 ggggcaacct gtcattgatt cctcggttaa tgatggaaca aaagttgaaa atgtgagaga 1860 atttatgttt caaacattct attaactgtt ttattagggt attgttatgg acgatggtga 1920 tggaacttta ccaatactag cccttggttt ggtgtrgcaat aaagtttggc aaacaaaaag 1980 gtttaatcct gctaatacaa gtatcacaaa ttatgaaatc aagcatgaac ctgctgcgtt 2040 tgatctgaga ggaggacctc gcccggcaga acacgtcgat atacctggac attcagagct 2100 aaatgtatgt tcactccacc ccacaaactr. ccattactaa cccctgaaat aaggaaatta 2160 ttttaaaagc ttcatcaggc cacggtgact cggtaccaaa ccgtcatata tcagatatcc 2220 agtacggaca taagttctgt agattgcaat. taactaacta accgaacagg gaaataataa 2280 atgagataaa tctcgataaa cctagaaatt aa 2312 ♦ ·· ·· · * <210> 4 . <211> -3685 <212> genomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <400>'4 acgcccCtta’ geggtgcacg aaaccgaacg gcgtgtgtaa cagtatgtaa aaagaaggtc cdcgagctct ggáacttttg gggatttgga 'tttaáttcca atťtĚGttaa tggačtatet gtcatcttat ttcctttact tatgttttgt gatagaggac tttgatctct cgagtttatt cctcccgacc acgatctgca aatgttattg ctttgattca gatccagctg cctggccact aaaaatatgt Ctctcatcgt cttaaatatg gtaatacaga ccatgggggt gtggcggggg gaccatttct ttgcagttgc gaactcaaag· ctgacattgg atgatgaatt taacatttgt ttecatgctt tgcatctatg gtcácttggt aggattctta acgcacatgg gcttgattgg aaččtgtggt gatgatatct tcctcgagta atatcCgtac cctgtcgtga ccgagaataa agaťgatggc gcaagtatca gattccaact gatatggttt ctcagtaata 'trcatcggaa· atgaggattc gaggagggaa cccggtggtt cggagcgaat ttaaggcgaa gggaaggcaa gťgaagtcta . ttggatctga tgcttgtctg gagactattt ctgtttgátt tgceaaatčt gtcgttgcgt tgggaataga tgttgcttta cagctcaatg cacatgtctt ctgctatgga tcttcttctt -ttgatggtaa ggcctctatg gtaťtagagt ttgtctgggc acatggctgc Gcttcctatc tttcatgttg gttgatggtt cttgtatttt tgggccagat tggtgttcca caggtattga ttattctact ttgattattt gataattctt cataccgtct gcattcttta gtcttttatt tccttaatac gacaccgata gactcaacaa tcaccggaga gaagcaggcg tttgggaaag aggacacata atcttatctg cgcgrggaca ggcctacacc gcgtggtgcc agatcccaaa gtatcccccg ccagcacaaa ttgaggtgct aaagecgacg- gcaaaagaaa gtggtcgtgc tcttctcttc cacgggtcct acatcctgct acaatgcgct caaaaggtga tgagatcacg tcttactctt ccgtatgtgt gttaacttta gttgctagac gtágatttag gaagttctaa ttattcaact tgcttttctc gaatttcgtc tatateaaaa tcggctcagt cagtggtata. ttgggtggaa tegagctgta agtgctgattt- atatgactgg attctgttcc aattaatagg tctaccaacg ctacattcta tggtgtgcaa aaagctgttg atatctgctt aaatatcaat ttgctgctta acgcattgct tttggagggc ccaattagcg tcttcttaat agaactttac tatttagact tgtctatgtt aaggccacac aaaacggagt aagtagcaga aatcataata gtgaagggtg gagtaccatg gctggcgaag gctcatctct tactggtcaa tcctgatgca gcttacaáag áaagttgata -gagaaac.cat;. ceacacgaat aCcgattctt ctttacaacg ttgcccgacc gtettcattc gatggcttat gctcaacaat cacttgctgc tacttttttc aaggtaagcg ggatataaaa atgccčcaga ctttgtgtag ctacatctgt atgtatatgt aatttttttc catcctcgtt aaaaagtgtt gttcacgctt gttgacagta' cacacgccac· Gcaggacccg - gcĚasccGGg cggcctccgt, atgttacgtť tacgrgatca gtggaaaaaa tgaagtgggt agtafcatcaa cagggctttt atacttttga tctaataaca tgtaactgaa ctgagatgac actgaacCCG ttatcctgct taaagactcg tttcttcgaa tcagaccttg accgaaggga ctgtcgtggg ttccaagaaa ggcGgcgcca aaccctgtac ctgtcaaagg acatgggaac ctacagatct cctatggaac atccgttaga tcatcagtct ctgtctctga catgtgactc .caacgccgcc cttccaaatc gttgctggtt caatgcctgc cgcccggtgt ctgggattgt ttagaaaacg tctcactctc tccttcaaca tcttttcgat tcccaaggac tagctgcctt gtccgttcat cgtataatga ggaaagtgcg gtaattaaag tcaatttcaa ctgttatcca tťgtgggttg tťgctatggt tcttaactáa ;ttgaeaatga tggbtgctga cacaCattgg ttcagafčac "tcttGbtSca gactcttagc agcagttata tgaggcacca ggcggtgatg ctctgctgaa tgatcagaac ctgctatatt actctcttga cagtttctta gctatggaaa cctttcaact ttggattagt aattgcagag cagcatgtaa ggtgacacga aaaaagcaaa agccctgtta tctgagatta attttgtgat tcagagta.tc tgctgggatc actacacGat tgctgatgat gacaaagtaa ttctgtttcc gcccccctca Gtgcttataa atctgaagag ccaccataag cattgggtgt gagcttcccC taagctcaaa caccggtggg tttgtggggt cctttatatt tcactczaac gtgaaacgc.t gtaattggct ggaattccaa aacaagttac agtagtgttt ttcaggctgt ctagttcctt agtttcacat gctttgaact catctttgtt agagatgggc tcaattacct aactgggctg ctactttgcc atatgaagag agaggttctt C tZ 3.C ϋ C 239ΌΓ cgtatgaaaa gttccgcatt gctcctctgg aacattggtg gcaaaggatg cttggctctg atcgctgcaa gattagacaa gcttcgacga gcgctggagc ttcttgtata tgccctatta cgattgcccc tgagaatgac tatggggcgg agaacaacga actatggaag ataatattga tgcacgatga ccaaatcaca aaagccaccg gccgccccta ttggatgaca gcgatttcct ggcctcgctg aáaaggcttg atcctccgtt 60. · 12čn .180 --240 300 360· 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1630 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 tggtttgttc tgctttttca gattaccgaa tgctcctgag atggaaatct actcattata 3240 cggagťgggg ataccaacgg aacgagcata'cg.tatačaag cttaaccagt ctcccgacag 3 300 ttgcatcccc tttcagatat tcacttctgc tcacgaggag gacgaagáta gctgtctgaa 3360 agcaggagtt tacaatgtgg atggggatga aacagtaccc gtcctaagtg ccgggtacat 3420 gtgtgcaaaa gcgtggcgtg gcaagacaag attcaačcct tccggaatca agacttatat 3480 aagagaatac aatcactctc cgccggctaa cctgttggaa gggcgcggga cgcagagtgg 3540 tgcccatgtt gatatcatgg gaaactttgc tttgatcgaa gatatcatga gggttgccgc 3600 cggaggtaac gggtctgata taggacatga .ccaggtccac tctggcatat ttgaatggtc 3 660 "ggágcgCátt*~gacctgaagc·-tgtga------.............-——.......... 3685

♦ ♦♦· ♦ i ·· • • · ·♦ · · · ♦ « • m Φ • · ♦ • · • · • • ♦ · • 4 444 • · ft ·· • · · « <21O> 5 <211> 2427 <212> cDNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 agaaacagcť ctttgtetct ·e-t-cgactgat-ctaacaatcc ccggacgaga tttgacaaag tccgtatagc ttaacctggt tgccccttat tcatcggaaa aagccgacgg agaaaccatc tggtgcacga tgaggattcg caaaagaaac cacacgaatc aatcgaacgg aggagggaag Cggtcgtgca ccgattcttg tgtgtgtaac ctggtggttt cttctcttcc tttacaacgc agcatgtaac ggagcgaatc acgggtcctt tgcctgaccc aaagaaggtc tcaaggcgaa acatcctgct gtcttcattc ctcgagcttt gggaaggcaa acaatgcgct gatggtttat 'ggaacttttg gtgaagtcta caaaaggccc ctatgttggg aatgaaactg ggttggatcc agccggtatt agagttcgag gctgactacc ttgctcctgg ctactttgtc tgggcagtgc attggatatg aagagaaaaa tatgtacatg gctgcatatg aacacagagg tacgtgatca gactcttagc cgtatgaaaa tctaccaacg gtggaaaaaa agcagttata gttccgcatt c.tacatttta tgaagtgggt tgaggcacca gctcctctgg tggtgtgcaa agtatattaa ggcggtgatg aacattggtg aaagctgttg cagggctttt ctctgctgaa gcaaaggatg gccccaggat tcttagacac cgatatattt agacttcaga atgacacgca catgggactc aacaatgtct atgttaccga ggcgggcttg attggtcacc ggagaaaggc cacacctgtt aacgaaactc gtggtgaagc aggtgaaaac ggagtttcca ggaaggatga tatcttttgg gaaagaagta gcagaggctg atcgattttc gaggtgctgt caaaggtcag agtatcccaa tggacagagt accatgacat gggaattgct gggatcaaag tacaccgccg gtgaagctat agatctacta catcatgttg ggtgccgctc atttctctta tggaattgct gatgatttgg cccaaatact ggtcaaatcc gttagagaca aaattaccga tactcattat acggagtggg gataccaacg gaacgagcat tctcccgaca gttgcatccc ctttcagata ttcacttctg agctgtctga aagcaggagt ttacaatgtg gatggggatg gccgggtaca tgtgtgcaaa agcgtggcgt ggcaagacaa aagacttata taagagaata caatcactct ccgccggcta acgcagagtg gtgcccatgt tgatatcatg ggaaactttg agggctgccg ccggaggtaa cgggtctgat ataggacacg tttgaatggt cggagcgtat tgacctgaag ctgtgaatat ctgtcagctt atgtgaaccc aatactttga aagagagatc gtcatcatca tgatgctcaa ctcacaaaga agcctgagaa ctcaatacct ctttaatatt cttatcgaat gtaaattata acgataacac aaaacttgct gcngccatgt ttgtttgtct gggctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa ctaatctgtg ttaatttcaa gacgccgcca- ttccaaatcc ttgttggttc aatgcctgcg gcccggtgtt ctgggattgt ttagaaaacg tggaacacat ctgtatcagg tgattgccaa actggcggct gtaatataga ccatgggggt gtggcggggg gaccatttct ttgcagttgc ccttgcagca agggaggtga gtgggaaaaa agaaaagtcc cgccatctga atcacacctg ctatcgctga ctcctaagat atgacaccaa atgctcctga acgtatacaa ctcacgagga aaacagtacc gattcaaccc acctgttgga ctttgatcga accaggtcca cacgatctct atcatcaatt tgatacttcg caatcctatc tgtcaaaagc ttctaaattc gtgacagata tctgaagagg caccataaga attgggtgtg agcttccctc .aagctcaaaa caccggcggg tttgtggggt gtcacttgač actcgtggct ccccgcacat ttcgtttcag gctgatggtc cttgtatttt tgggccagat tggtgttcca cagagcgatt tgtaatgaga cacgatatgg g c aaaagaac tgttaactat gattaataat tcgtgacgtg gtacaaggcc gatggcgcgd gtatcaagat gatggaaatc gcttaaccag ggacgaagat cgtcctaagt ttccggaatc agggcgcggg agaCatcatg ctctggcata ttaagccgtc catcatcatc gtgcgaaatt taatgtttga atcaattcgt 60 Ϊ20 ' 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2427 • · ·. ·· • · ······ • · » *···#· · ♦ -· · · · · · · » „ ·* · · # ··· ·· ·#. ··· <210> 6 <211> 671 -

<212> PRT <213> Arabičlopsis thaliana · <4Q0> 6 ; '

Met Pro Leu' Ile His Arg Lvs Lys Pro Thr Glu Lys Pro Ser Thr Pro 1 .............—.....-10-™—-------------- ----- 15...........

Pro Ser Glu Glu Val Val His Asp Glu Asp Ser-Gln Lys Lys Pro His 20 " 25 30

Glu Ser Ser Lys Ser His His Lys Lys Ser Asn Gly Gly Gly Lys Trp • ' 35 40 45

Ser Cys Ile Asp Ser Cys Cys Trp Phe Ile Gly Cys Val Cys Val Thr 50 55 60

Trp Trp Phe Leu Leu Phe Leu Tyr Asn Ala Met Pro Ala Ser Phe Pro 65 70 75 80

Gin Tyr Val Thr Glu Arg Ile Thr Gly Pro Leu Pro Asp Pro Pro Gly 85 90 95

Val Lys Leu Lys Lys Glu Gly Leu Lys Ala Lys His Pro Val Val Phe 100 105 . v 110

Ile Pro Gly Ile Val Thr Gly Gly Leu Glu Leu Trp Glu Gly Lys Gin 115- 120 ' '/ 125

Cys Ala Asp Gly Leu Phe Arg Lys Arg Leu Trp Gly Gly Thr Phe Gly 130 * 135 ·· ’;140

Glu Val Tyr Lys Arg Pro Leu Cys Trp Val Glu His Met Ser Leu Asp 145 150 155 160

Asn Glu Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Ile Arg Val Arg Ala Val Ser 165 170 175

Gly Leu Val Ala Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Tyr Phe Val Trp Ala 180 185 190

Val' Leu Ile Ala Asn Leu Ala His Ile Gly Tyr Glu Glu Lys Asn Met 195 200 205

Tyr Met Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu Ser Phe Gin Asn Thr Glu Val 210 215 220 A.rg Asp Gin Thr Leu Ser Arg Met Lys Ser Asn Ile Glu Leu Met Val 225 230 235 240

Ser 'Thr Asn Gly Gly Lys Lys Ala Val Ile Val Pro His Ser Met Gly 245 * 250 255

Val Leu Tyr Phe Leu His Phe Met Lys Trp Val Glu Ala Pro Ala Pro 260 265 270

Leu Glv Gly Gly Gly. Gly. Pro Asp Trp Cys Ala Lys Tyr Ile Lys Ala ' * 275 280 285

Val Met Asn Ile Gly Gly Pro Phe Leu Gly Val Pro Lys Ala Val Ala 290 295 . 300

Gly Leu Phe Ser Ala Glu Ala Lys Asp Val Ala Val Ala Arg Ala Ile 305. 310 315 . 320 ____..... ,Ala„Pro„Gly. Phe Leu Asp Thr Asp Ile Phe Arg Leu Gin Thr Leu Gin " 325 r --- - —.................—33-5—"— — -—*- * His Val Met Arg Met Thr Arg Thr Trp Asp Ser Thr Met Ser Met Leu 340 345 350

Pro Lys Gly. Gly Asp Thr Ile Trp Gly Gly Leu Asp Trp Ser Pro Glu 355 360 365

Lys Gly His Thr Cys Cys Gly Lys Lys Gin Lys Asn Asn Glu Thr Cys 370 375 380

Gly Glu Ala Gly Glu Asn Gly Val 385 390 Gly Arg Met Ile Ser Phe Gly Lys 405 Glu Ile Asn Asn Ile Asp Phe Arg 420 Pro Asn His Thr Cys Arg Asp Val 435 440 Ile Ala Gly Ile Lys Ala Ile Ala 450 455 Glu Ala Ile Asp Leu Leu His Tyr 465 470 Gly Ala Ala Hiš Phe Ser' Tyr Gly 485 Lys Tyr Gin Asp Pro Lys Tyr Trp 500 Pro Asn Ala Pro Glu Met Glu Ile 515 520 Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr 530 535

Ser Lys Lys Ser Pro Val Asn Tyr 395 400

Glu Val Ala Glu Ala Ala Pro Ser 410 415

Gly Ala Val Lys Gly Gin Ser Ile 425' 430

Trp Thr, Glu Tyr His Asp Met Gly V ,445

Glu Tyr Lys'Vál Tyr Thr Ala Gly 460

Val Ala Pro Lys Met Met Ala A.rg 475 480

Ile Ala Asp Asp Leu Asp Asp. Thr 490 495

Ser Asn Pro Leu Glu Thr Lys Leu 505 510

Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Gly Ile 525

Lys Leu Asn Gin Ser Pro Asp Ser 540

Cys Ile Pro Phe Gin Ile Fhe Thr Ser Ala His Glu Glu A.sp Glu Asp 545 550 555 560

Ser Cys Leu Lys

Pro Val Leu Ser 580

Thr.Arg Phe Asn 595

Ala Gly Val Tyr 565

Ala Gly Tyr Met

Pro Ser Gly Ile 600

Asn Val Asp Gly 570

Cys Ala Lys Ala 585

Lvs Thr Tyr Ile

Asp Glu Thr Val 575

Trp Arg Gly Lys 590

Arg Glu Tyr Asn 605

*t3

His Ser Pro Pro Ala Asn Leu Leu 610 615

Ala His Val Asp Ue Met Gly Asn 625 _ 630

Arg Val Ala Ala Glv Gly Asn Gly

His Ser Gly Ile Piie Glu Trp Ser 660

Glu Gly Arg Gly Thr Gin Ser Gly 620

Phe Ala Leu Ile Glu Asp Ile Met 635 640

Ser Asp Ile Gly His Asp Gin Val 650 655

Glu Arg Ile Asp Leu Lys Leu 665 670 <210> 7 · <211> 643 · - . <212> cDNA · <213> Zea mays * 4 <22G> . ' . <221> CDS ‘ <222> (1) . . (402)' ............... " ------------------------— ~~ · .......................... <40Ó> 7 ' cgg gag aaa ata gct gct ttg aag ggg ggt gtt tac tta gcc gat ggt 48

Arg Glu Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gly Gly Val Tyr Leu Ala Asp Gly * .1'/· . "" 5 10 15 gat.gaa act gtt cca gtt ctt agt gcg ggc tac atg tgt gcg aaa gga 96 ;Asp Glu Thr Val Pro' Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Gly ‘ ' ' — - 20 25 30 tgg cgt ggc aaa act cgt ttc agc cct gcc ggc agc aag act tac gtg 144

Trp Arg Gly Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 40 ' 45 aga gaa tac agc cat tcg cca ccc tet act ctc ctg gaa ggc agg ggc 192

Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 ' i ·. 60 acccag agc ggt gca cat gtt gat ata-atg ggg aac ttt gct cta att ' . 240

Thr Gin Ser Gly Ala His Val Asp- Ile Met. Gly Asn Phe Ala Leu Ile ; 65 70 ~ ' 75 ·’ ' ·. .80 ' gag gac gtc atc aga ata gct gčt ggg gca acc ggt gag gaa att ggt: 288

Glu Asp Val Ile Arg Ile Ala Ala Gly' Ala^Thr Gly Glu Glu Ile C-ly' 85 90 95 ggc gat cag gtt tat tea gat ata ttc aag tgg tea gag aaa atc aaa 336

Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp Ile Phe Lys Trp Ser Glu Lys Ile Lys 100 105 1Í0 ttg aaa ttg taa cct atg gga agt taa aga agt gcc gac ccg ttt att 384 Leu Lys Leu 115 gcg ttc caa agt gtc ctg cctgagtgca accctggatt ttgcttaaat 432 attgtaattt ttcacgcttc attcgtccct ttgtcaaatt tacatttgac aggacgccaa 492 tgcgatacga tgttgtaccg ctattttcag cattgtatat taaactgtac aggtgtaagt 552 tgcatttgcc agctgaaatt gtgtagtcgt tttctttacg atttaatanc aagtggcgga 612 643 gcagtgcccc aagcnaaaaa aaaaaaaaaa a. 51 ···· 9 · 9 ··; ··« • 9 ·· 9 · 9' 9 9 • 9 ' 9 9 9 · ·* · · 9 · . · 9 • 99 ·· · <210> 8 ' 1 <211> 115 ’ <212> PRT <213> Zea mays <400> 8 .

Arg Glu Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gly Gly Val Tyr Leu Ala Asp Gly 1 5 10 15- ~Glu^ Th.r^Val- Pro—VaL-Leu-Ser. Ala, Gly Tyr Met Cys Ala Lys Gly . . 20 25 ' .....30 '

Trp Arg Glý Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 · . 40 45

Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 60

Thr Gin Ser Gly Ala His Val Asp Ile Met Gly Asn Phe Ala Leu Ile 65 7 0 75'. 80

Glu. Asp Val Ile Arg Ile Ala Ala Gly Ala' Thr Gly Glu Glu Ile Gly 85 90 95

Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp Ile Phe Lys Trp Ser Glu Lys Ile Lys 100 105 110 .

Leu Lys Leu 115

Ή ·,·*(· * ·' . ’ r· · ·· • * * . Ψ '· • 0' « · i * • · • · ♦ # * • ♦ % Ψ. * • · • í·'· • · · * * ♦ · · ·« . 9 · · <210> 10 <211> 1562

<212> genomic DNA <213> Arabidopšis thaliana <4QC> 10 ' ' .·- atgaaaaaaa tatcttcaca ttattcggta gacatagcga tactcgttgt ggtgacgatg 60 "acctccac styar-caacctcrt gcrac-accaac ctcrcaccct.t._tgattctggt tcčaggaaac 120 ggaggcáacc'agctagaggt acggctggac agagaataca agccaagtag tgtctggtgt 180 agcagctggt tatatccgat ťcataagaag agtggtggat ggtttaggct -atggttcgac 240 gcagcagtgt tattgtctcc cttcaccagg tgcttcagcg atcgaatgat gttgtactat 300 gaqgctgatt tggatgatta ccaaaatgct cccggtgtcc aaacccgggt tcctcatttc 360 ggttcgacca aatcacttct atacctcgac cctcgtctcc ggttagtact .ttccaagata 420 tatcattttg ggacatttgc ataatgaaca aaatagacac aaatttgggg gattattgtt 480 atatcaatatccatttatat gctagtcggt aatgtgagtg ttatgttagt atagttaatg 540 tgagtgttac gtgattctcc attttaaatg aagctagaaa gttgtcgttt aataatgttg 600 ctatgtcatg agaattataa ggacactatg taaatgtagc ttaataataa ggtttgattt 660 gcagagatgc cacatcttac atggaacatt tggtgaaagc tctagagaaa aaatgcgggt 720 atgttaacga ccaaaccatc ctaggagctc catatgattt caggtacggc ctggctgctt 780 cgggccaccc gtcccgtgta gcctcacagt tcctacaaga cctcaaacaa ttggtggaaa 840 aaactagcag cgagaacgaa ggaaagccag tgatactcct ctcccatagc ctaggaggac 900 ttttcgtcct ccatttcctc aaccgtacca ccccttcatg gcgccgcaag tacatcaaac 960 actttgttgc actcgctgcg ccatggggtg ggacgatctc tcagatgaag acatctgcct 1020 ctggcaacac actcggtgtc cctttagtta accctttgct ggťcagacgg catcagagga 1080 cctccgagag taaccaatgg ctacttccat ctaccaaagt gtttcacgac agaactaaac 1140 cgcttgtcgt aactccccag gttaactaca cagcttacga gatggatcgg ttttttgcag 1200 acattggatt ctcacaagga gttgtgcctt,. acaagacaag_agtgtCgcct ttaacagagg 1260 agctgatgac tccgggagtg ccagtcactt;géatatatgg gagaggagtt gatacacčgg 1320 aggttttgat gtatggaaaa ggaggattcg aaaagcaacc agagattaag .tatggagatg 1380 gagatgggac ggtťaatttg gcgagcttag.cagctttgaa agcčgatagc·_tcgaacaccg 1440 tagagattga tggagtttcg cacacaccta ťaccCaaaga cgagatcgca’ cccaaagaga 1500 ttatgaagca gatttcaatt attaattatg aattagccaa tgttaatgcc gtcaatgaat 1560 ga 1562

v S*t

<· • > «

<210> 11 ' <211> 3896 ' <212> grenómie'DNA <213> Arabidopsis, thaliana <4G0> 11 ' . - acgggagcga-actcgaaatc. ag.taaccgca tccttcaccg tcatcgccgt ttttttcttg 60 atttgcggtg gccgaactgc ggtggaggat gagaccgagt ttcacggčga btactcgaag^KO™^ ctatcgggta taateattcc gggatttgcg ccgacgcagc tacgagcgtg gtcgatcct-t 180 » gactgtccat acactccgtt ggacttcaat ccgctcgačc tcgtacggcc agacaccact' 240 ‘‘ aaggtccgtg atcttcattt ccttcgctcc ttattctgtc ggtcgagtca ctcgttgatg 300 - aattccaage gáaatatagc aatgaagcat gtcccgcctc tcttattgat tcgttcatta’ 360 . gtcaacagtg acgcttctga atctgagctt agagccatat aaaacagctg actcggcgag 420 tgtttčGcať cgcttttggt tcgctaaat.g tagcgcaatg aatgtgtaat tagtctgcgc 480. tttetattca actagaectg caagtttfctc agagtgctca atagtagtta gaaaatgtta 540 ggtčatttta cttgtgcatt gtgactcttt tggctgttgc ttactgatcg acgtgatgga 600 tggttťaéag cttctttctg ctgtcaactg ctggtttaag tgtatggtgc tagatcctta 660 taátcaaaca gaccatcccg agtgtaágtc acggcctgac agtggtcttt cagccatcac 720 agaattggat ccaggttaca taacaggtag tttcggattt ttctttcttt tgagctttct 780 tcaatttgat atcatcttgt tgtgatataa tatggctaag ttcattaatC tggccaattt 840 tcaggtcctc tttctactgt ctggaaagag Gggcttaagt ggtgcgtcga gtttggtata 900 gaagcaaatg caattgtcgc tgttccatac gattggagat tgtcaccaac caaatcggaa 960 gagcgtgacc tttactttca caagctcaag ttagtcctta tcaggccaac gtcttttatc 1020 ttctcttttt atgtaagata agctaagagc tctggtcgtc ttcctttttg caggtcgacc 1080 tctgaaactg ctttaaaact ccgtggcggc ccttctatag tatttgccca ttcaatgggt 1140 aataatgtct tcagatactt tctggaatgg ctgaggctag aaattgcacc aaaacattac 1200 ttgaagtggc ttgatcagca tacccatgct tatttcgctgjtťggtaccgg cctactatcc 1260 ttaagttacc atettatttt ttctetaatt gggggagtca .tgttgtgact tactggattg 1320 agcccgatac ctgatttgtt gttgatttag gagctfcčťct'tct.tggttct gttgaggcaa. 1380 tcaaatctac tctctcCggt geaacgtttg., gccttb.CE.gt.:t,tdtgaggtg acctctgact -1440 tctctctagt CttaagtagC tgatatcaacJcággccttat aactcactgg attttccttt 1500 tgaaagtatt actcttgtta attgaactgc tgtacgcgat acggtatctg tagatcttga 1560 agtgctagtt atcaaagaac atattgtggg tagtatacct gtcagcggcc ttagctaata1620 caaccaaacc acatgtacac tgatttagtt ttcagattat tatggtagac tttaagttga 1680 gaagaaact.t tgactgaaac ctttttattt taataggcta' tgatttgttc attgaaatca 1740 tgtgacatat tgacatgcgc ttctcatgtt ttttgttggc aaggcttcag ggaactgctc 1800 ggttgttgtc caattctttt gcgtcgtcat tgtggcttat gccattttca aagaattgca 1860 agggtgataa cacattctgg acgcattttt ctgggggtgc tgcaaagaaa gataagcgcg 1920 tataccactg tgatgaagag gaatatcaat caaaatattc tggctggccg acaaatatta 1980 ttaacactga aattccttcc actagcggtt agactctgta tatgcaactg taacactaac 2040 aaaagtttca ccaagaatgt tcactcccat atctcgttcc ttcgatgtgt atccatcagt 2100 tacagaaaca gctctagtca acatgaccag catggaatgt ggccttccca ccctcttgtc 2160 tttcacagcc cgtgaactag cagatgggac tctcttcaaa gcaatagaag actatgaccc 2220 agatagcaag aggatgttac accagttaaa gaagtacgca cctttctttg tgataagaaa 2280 tattgctcat cgatcatcac ttgctggctt cttgtacgtc aaattgtttt gtttaaatct 2340 ctatatcaat tgttcatatg ccttgccttt cttactataa gaaacaagta taatcagaaa 2400 ccttattatt gattatcagt tctctcctta tattatggaa tgtcttcttc gtctacagtc 2460 atgaatgcaa aagggggtat tttagttgat tgattctctc attctctagc ttgttttgac 2520 taaCagcgtc aattttgttt ttctagcaaa tctttgtgaa ttatacataa cacgctaacc 2580 atacttttca ggctgtatca tgatgaccct gtctttaatc ctctgacccc tcgggagaga 2640 ccacctataa aaaatgtatt ttgcatatat ggtgcccatc taaagacaga ggtatgatgc 2700 attcccaaca tcacattatg cgtcgacttt gttactatat tccccatacg gttcgcaata 2760 tctttttgaa ttatgattta tcccctccct tgcatcttac gctatcaagc gtcaaaggta 2820 ctaaacgtat gaagctgtcc gtcacaggct ggctattact ttgccccaag tggcaaaccc 2880 taccctgaca attggatcat cacggatatc acccatgaaa ccgaaggcac cctcgcgtca 2940 aggtaatttt ccgcaacggc agaagtaaaa caggaaggca aagccttctg taccagtcta 3000·. gtggcatgtt atctcagtcg cacaagcaaa ttattaaaca accaaaattt aagcaccttc 3060 tťatcacacc ttttgagctc agtggatgac caguggctta aagtgggaag aggtgctgca 3120 tgaaacatga cacttgtapc aaagátaact agcaaáacaa aactaaccca tacctgaatc 3180

• · « · · • ·· • « • · · ♦ · ··· • · · · · · ··· '··. ·· « tcatattatt aggagtagtc gtgcttttaa aaaatttgtt ttaagaaace gaaaaactag 3240 . ttcatatctt gattgtgqaa tatctgcagg tc.tggaactg tggttgatgg gaacgctgga 3300 cctataactg gggatgagac ggtaagctca gaagttggtt ttgaaactat cttcttgcaa 3360 actacpgaag actaágataa' tacttgcttc tggaacactg cttgctatgt tctctagtac· 3420 actgcaatat tgactctccg ctacttttat. tgactatgaa attgatctct tataggtacc 3480 ctatcattca ctctettggt gcaagaattg gctcggacct aaagttaacá taacaatggc 3540 tccccaggta.ctctttctta gttcctcacc ttatatagat caaactttaa 'gtgtacttct 3600 ctggttatgt-gttgatctac ctccaatttg tcctctctaa aaatcatata tctccgtact 3660 c c t caagaae-tt-gěatat-aat—Gtaaacgaga„t.c.c.tcattgS- gaaaataaaa caacagccag 37 2 0 aacacgatgg .aagcgacgta catgtggaac taaatgttga tcatgagcat gggtcagaca 378θΓ tcatagctaá catgacaaaa gcaccaaggg ttaagtacat aaccttttat gaagactctg.3840 agagcattcc ggggaagaga accgcagtct gggagcttga taaaagtggg tattaa 3896

<211> 709 <212> cĎNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 12 * ctggggccaa, aagtgaacat aacaaggaca ccacagtcag agca'tgatgt tcagatgtac 60 liagťgcatct aaatačagag "catcaacatg^gtgaaga-tat · eattcccaat,-atgacaaagt. 12.0 tacc.taeaat-, gaagtacata acctattátg' -aggattctga aagtcttcca gggacáagaa 180 čagbagttťg· ggagcttgat aaagčaaatc acaggaacat tgtcagacct ccagctttga 240 tgcgggagct gtggcttgag atgtggcatg atattcatcc tgataaaaag tccaagtttg 300 tcacaaaágg .tggtgtctga tcctcactat tttcttctat aaatgtttga gtttgtattg 360 acactgtaag tacťgcaaca aaaagcaaag cgtgggcctc tgagggatga ggactgctat 420 tgggattacg ggaaagctcg atgtgcatgg gccgaacaci: gtgaatacag gttagaatat 480 tcaaaťtata ttttgcaaaa táttctcttt tcgtgcattc aggccacctt tccccggtca 540. caacgatgc.a: gacatgtatt cggggatgtt cacctgggac agagttgcag attgaagagt 600 tctacatctc acaccctgtc acactacgtg tgatatttaa gaaactttgt ttggcggaac 660 •aácaagtt.Cg cacaaacatt tgaagaagaa agcgaaatga ttcagagag 7 09

<210> 13 <211> 623 <212> PRT . <213> Schizosaccharomýces porobe <40Q> 13 ' H^^Álarser-^ex^ys--i.y'S- -S-ezt-Ly s-; ' ·. í > , ..t -/5; lys'Ser Pro Ile Asp Leu Pro. Asn ·' · > 20

Ser Glu Gin Pro Ser Ala Ser.Glu '·. . · 35 ' ' · ' 40 . Arg'Lys Ser Lys Phe Gly Lys Arg 50 · 55

Leu Gly Ile Cys Gly Ala Phe Phe 65 .70 .Val Phe Asp Pro Ala Thr Leu Asp 85

Ser Asp Leu Phe Asp Asp Ile Lys 100

Lys Asp Ala Pro Phe Thr Thr Asp 115 120

Asn Glu Val Gin Val Gly Leu Asp 130 135

Asp His Pro Val Ile Met Val Pro 145 150

Ser Trp Ser Phe Asn Asn Cys Ser 165

Trp Gly Ser Trp Ser Met Leu Lys 180

Trp Leu Glu His Leu Met Leu Asp 195 200

Gly Ile Lys Leu Arg Ala Ala Gin 210 215

Ile Thr Gly Tyr Trp Ile Trp Ser 225 230

Ile Gly Tyr Glu Pro Asn Asn Met 245 .

Leu Ser Tyr Ala Asn Leu Glu Glu 260 -ThbJ^isjLys. Lys JLvs Lys Glu Val '10 " T5~

Ser Lys Lys Pro Thr Au:g Ala Leu .25 30

Thr Gin Ser Val Ser Asn Lys Ser 45

Leu Asn Phe Ile Leu Gly Ala Ile 60

Phe Ala Val Gly Asp Asn Asn Ala 75 80

Lys Phe Gly Asn Met Leu Gly Ser 90 95 '

Gly Tyr L-eu rSer Tyr Asn Val Phe 105 , ; .110 i

Lys Pro Ser Gin - Sér. Pro Ser Gly ' ’ 125 ' ’ "

Met Tyr Asn Glu Gly "Tyr Arg Ser ' 140

Gly Val Ile Ser Ser Gly Leu Glu 155 160

Ile Pro Tyr Phe Arg Lys Arg Leu 170 175

Ala Met Phe Leu Asp Lys Gin Cys 185 190

Lys Lys Thr Gly Leu Aso Pro Lys 205

Gly Phe Glu Ala Ala Asp Phe Phe 220

Lys Val Ile Glu Asn Leu Ala Ala 235 240

Leu Ser Ala Ser Tyr Asp Trp Arg 250 255

Arg A.sp Lys Tyr Phe Ser Lys Leu 265 270

1 f 5*8 • · · · f, 9 ·«« ·· e e ♦ · :·· • · ·*♦··· ··♦ ’ · · · * ♦ ·♦ <·♦ ··· ··· ·· ·· ·♦· • ·

Lys Met Phe Ile Glu Tyr Ser Asn 275 280

Leu Ile Ser His Ser Met Gly Ser ' 290 295 •Trp Val-Glu Ala .Glu. Gly Tyr Gly 305 310...............

Aso His· Ile Glu Ala Phe Ile Asn .325

Pro Lys Thr Val Ala Ala Leu Leu. 340

Ile Val Ilé Thr Leu Asn Ile Leu 355 360

Arg Ala Met Met Val Arg Thr Met 370 375

Lys Gly Gly Asp Val Ala Pro Asp 385 390

Asn Gly Ala Ile Ile Arg Tyr Arg 405

Glu Phe Asp Ile Asp A.sp A.la Leu 420- A.sp Asp Phe Lys Val Met Leu Ala 435 440

Trp Thr Glu Lys Glu Val Leu Lys 450 455

Ile Asn Pro Leu Glu Thr Ser Leu 465 470

Tyr Cys Val His Gly Val Gly Lys 485

Thr Asn A.sn Pro Glu Gly Gin Pro 500

Gly Thr Lys Val Glu Asn Gly Ile 515 520

Leu Pro Ile Leu Ala Leu Gly Leu 530 535

Lys Arg Phe Asn Pro Ala Asn Thr 545 550

His Glu Pro Ala Ala Phe Aso Leu 565

Ile Val His Lys Lys Lys Val Val , 285

Gin Val Thr Tyr Tyr Phě Phe Lys 300

Asn Gly Gly Pro Thr Trp Val Asn " " 3Γ5 ' .......* - -3-20- ·

Ile Ser Gly Ser Leu Ile Gly Ala 330 335

Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr Gly 345 ’ 350

Glu Lvs Phe Phe Ser Arg Ser Glu 365

Gly Gly Val Ser Ser Met Leu Pro 380

Asp L-eu Asn Gin Thr Asn Phe Ser 395 400

Glu Asp Ile Asp Lys Asp His Asp 410 415

Gin Phe Leu Lys Asn Val Thr Asp 425 , - 430

Lys Asn ŤVr Šer His Glv Leu Ala· 445

Asn Asn Glu Met Pro Ser Lys Trp 460

Pro Tyr Ala Pro Asp Met Lys Ha 475 480

Pro Thr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr 490 495

Val Ile Asp Ser Ser Val Asn Asp 505 510

Val Met Asp Asp Gly Asp Gly Thr 525

Val Cys Asn Lys Val Trp Gin Thr 540

Ser Ile Thr Asn Tyr Glu Ile Lys 555 560

Arg Gly Gly Pro Arg Ser Ala Glu 570 575

(r

P ····

His Val Asp'lle Leu Gly His Ser Glu Leu Asn Glu 580 585

Ile Ile Leu Lys 590

Tyr Ile Ser Asp 605

Val Ser Ser Gly His Gly Asp Ser Val Pro Asň Arg 595 600 lle Gin Glu Ile Ile Asn Glu Ile Asn Leu Asp Lys Pro Arg Asn 610 ' 615 · 620 ’ ' % ; % i-t 60 60 .«1 2#· « · ·« ·· 2 é ··. - ' · · 2 2 ♦ · ·· .« « ®í I'· 2.· • '·%♦··· · e é · ' » · · ·· · φ| « · · · · · ·· · 2 · · · <210> 14 <211> 432 <212> PRT · <213> Arabidopsis thaliana <400> 14

Met Lys Lvs Ile Ser Ser His Tyr Ser Val Val Ile Ala Ile Leu Val 1 ..... 5' ------------ro---- -----

Val-Val Thr Met Thr Ser Met Cys Gin Ala Val Gly Ser AsnVyal Tyr 2 20 .25 30 ' ' .Pro Leu IleLeu Val Pro Gly Asn Gly Gly Asn Gin Leu Glu- Val Arg ' '' ·' . 35 ‘ 40 45

Leu Asp Arg Glu Tyr Lys Pro Ser Ser Val Trp Cys Ser Ser Tro Leu '50 55 60

Tyr-Pro Ile His Lys Lys Ser Gly Gly Trp Phe Arg Leu Trp Phe Asp 65 70 75 80

Ala Ala Val Leu Leu Ser Pro Phe Thr Arg Cys Phe Ser Asp Arg Met 85 S0 95

Met Leu Tyr Tyr Asp Pro Asp Leu, Asp Asp Tyr Gin Asn Ala Pro Gly 100 · 105 .. . 110, , , f"

Val Gin Thr Arg Val Pro His Phe· Gly 'Sér"v-Thr Lys Ser Leu Leu Tyr'·'· 115 120, / ’ ·2 2 125 . . ·; i' - - 1 2 ·2 .

Leu Asp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Thr Ser Tyr Met Glu His Leu Val 130 135 , 140 · ; - .

Lys Ala Leu Glu Lys Lys Cys Gly Tyr Val Asn Asp Gin Thr Ile Leu

145 150 ‘ 155 2 ISO

Gly Ala Pro Tyr A.sp Phe Arg Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Gly His Pro 165 170 175

Ser Arg Val Ala Ser Gin Phe Leu Gin Asp Leu Lys Gin Leu Val Glu 180 185 190

Lys Thr Ser Ser Glu Asn Glu Gly Lys Pro Val Ile Leu Leu Ser His .195 200 205

Ser Leu Gly Gly Leu Phe Val Leu His Phe Leu Asn Arg Thr Thr Pro 210 215 220

Ser Tm Arg Arg Lys Tyr Ile Lys His Phe Val Ala Leu Ala Ala Pro 225 230 235 240

Trp Gly Gly Thr Ile Ser Gin Met Lys Thr Phe Ala Ser Gly Asn Thr 245 250 255

Leu Gly Val Pro Leu Val Asn Pro Leu Leu Val Arg Arg His Gin Arg " 260 265 270

Thr Ser Glu Ser Ašxi Gin. Trp Leu Leu Pro Ser Thr Lys Val Phe His 275 . 2 280 285

<210> 15 . .’ <21i> 552’ <212¾ PRT '· <213> Arabidopsis thaliana <400> 15 ^Ma.c.*.G.lyv,,AlamAsri Ser Lys Ser Val Thr Ala Ser Phe Thr Val Ile Ala .J '% ' 5 " ' · ~T0~~......-......—*· -1-5-

Val·Phe Phe Leu Ile Cys Gly Gly Arg Thr Ala Val Glu Asp Glu Thr v' ' 20 25 - 30'

Glu ^Phe -His .Gly Asp Tyr Ser Lys Leu Ser Gly Ile Ile Ile Pro Gly ' ‘'35'..·· .V 40 45 'Phe Ala Ser T.hr Gin Leu Arg Ala Trp Ser Ile Leu Asp Cys Pro Tyr '30 55 60

Thr Pro Leu Asp Phe Asn Pro Leu Asp Leu Val Trp Leu Asp Thr Thr 55 70 75 80

Lys Leu Leu Ser Ala Val Asn Cys Trp Phe Lys Cys Met Val Leu Asp 85 90 ’ : 95

Pro Tyr Asn Gin Thr Asp His Pro Glu Cys Lys Ser Arg Pro Asp Ser 100 105 , 110

Gly Leu Ser Ala Ile Thr Glu Leu Asp P ro Gly * Tyr Tle .Thr Gly Pro 115 12 0 V* - CÍ23.

Leu Ser Thr Val Trp Lys Glu Trp Leu Lvs Trp Čys 'Val 'Glu Phe Gly 130 135 · .140 ' ' . C‘.

Ile Glu Ala Asn Ala Ile Val Ala Val Pro Tyr Asp Trp Arg Leu Ser 145 150 155 " 160

Pro Thr Lys Leu Glu Glu Arg Asp Leu Tyr Phe His Lys Leu Lys Leu 165 170 175

Thr Phe Glu Thr Ala Leu Lys Leu Arg Gly Gly Pro Ser Ile Val Phe 180 185 190

Ala His Ser Met Gly Asn Asn Val Phe Arg Tyr Phe Leu Glu Trp Leu 195 200 205

Arg Leu Glu Ile Ala Pro Lys His Tyr Leu Lys Trp Leu Asp Gin His 210 215 220

Ile His Ala Tyr Phe Ala Val Gly Ala Pro Leu Leu Gly Ser Val Glu 225 230 235 240

Ala Ile Lys Ser Thr Leu Ser Gly Val Thr Phe Gly Leu Pro Val Ser 245 250 255

Glu Gly Thr Ala Arg Leu Leu Ser Asn Ser Phe Ala Ser Ser Leu Trp 260 265 270

Leu Met Pro Phe Ser Lys A.sn Cys Lys Gly Asp Asn Thr Phe Trp Thr 275 280 285 ζ,ι • * ♦ ·' · · · 0 ·· · ·. « 0 * .0 s β 0 β . ' ♦ * * ·· #*♦ »Ί · « · · * * >» 0 · · «·· «* · *

His Phe Ser Gly Gly Ala Ala Lys Lys Asp Lys Arg Val Tyr His Cys .290 295 300

Asp Glu Glu Glu Tyr Gin Ser Lys Tyr Ser' Gly Trp Pro 'Thr Asn ile 305 _ 310 315 320

Ile Asn Ile Glu Ile Pro Ser Thr Ser Ala Arg Glu Leu Ala Asp Gly 325 330 335

Thr Leu Phe-Lys Ala Ile Glu Asp Tyr Asp Pro Asp Ser Lys Arg Met . 7 · - , 1 340 345, 350

Leu His Gin Leu Lys Lys Tyr Val Pro Phe Phe Val Ile Arg A.sn Ile 355 360 365

Ala His, Arg Ser Ser Leu Ala Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Asp Pro ,370 375 380

Val Phe Asn Pro Leu Thr Pro Trp Glu Arg Pro Pro Ile Lys Asn Val 385 390 395 400

Phe Cys Ile Tyr Gly Ala His Leu Lys Thr Glu Val Gly Tyr Tyr Phe 405 410 415

Ala Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Pro Asp Asn Trp Tle Ile Thr Asp Ile -420 425 430·

Ile Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Thr Val. Val .· 43 5 440 7 '· , . , . ' ·. 445' ' .

Asp Gly Asn Ala. Gly Pro Ile Thr Gly «Asp Glu Thr Val Pro •.Tyr’ -His 450 455 ' - 460 .

Ser Leu Ser Trp Cys Lys Asn Trp Leu Gly Pro Lys Val Asn Ile Thr 465 470 475 480

Met, Ala Pro Gin Ile Leu Ile Gly Lys Ile Lys Gin Gin Pro Glu His 485 490 495

Asp Gly Ser Asp Val His Val Glu Leu Asn Val Asp His Glu His Gly 500 505 510

Ser Asp Ile Ile Ala Asn Met Thr Lys Ala Pro Arg Val Lys Tvr Ile 515 520 525

Thr Phe Tyr Glu Asp Ser Glu Ser Ile Pro Gly Lys Arg Thr Ala Val 530 535 540

Trp Glu Leu Asp Lys Ser Gly Tyr 545 550

Η <210> 16 <211> 661 ·

<212> FRT '<213> Saccharomyces cerevisiae ' <400> 16

Met~Gly,„.Thr...Leu Phe.Arg Arg Asn Val .Gin Asn Gin Lys Ser Asp Ser 'i " - ·’ 5 ~........------ - ------- ", * - \ i ...

Asp Glu Asn Asn Lvs Gly Gly Ser Val.His A.sn Lys Arg Glu Ser_ Arg ' ' · 20' 25' 30

Asn His Ile His His Gin Gin. Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly ' 3 5.·' 40 45

Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg . 50 55 60

Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 .70 75 .80

Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser .Phe 85 90 95

Gly Ala Tyr His Val His Ash Ser Asp 'Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe.· íoo iG5. , ... 110 .

Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Vai Tyr, Leu '£.sp Asp· Trp Lys 'Asp Val 115 . 120", '·; "· ‘ . 125 . . .‘í ., . '

Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe' íle-lAsp .Asp-;Ile Gin A.la Gly Asn 130 135 . : ;λ. 140. ·;

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val. Gly 145 150 155 ' 160

Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175

Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile 180 185 190

Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205

Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220

Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240

Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile 245 250 255

Ala Gly Tyr Tro Ile Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val Ile 260 265 270

Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu * 275 280 285 65-

Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg .Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 290 295 300

Glu Gin Ile Glu'Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 . , 310 · 315 320 *· lle Gly His.Ser Met Gly Ser Gin Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lys Trp

Gly Gly Arg "Gly- Trp Val 350

Ala. Gly Thr Leu Leu Gly 365 Gly Glu Met Lys Asp Thr 380 Leu Glu Lys Phe Phe Ser 395 400 Trp Gly Gly Ile Pro Ser 415 Gly Asp Met Lys Ser Ser 430 Thr ’Tyr GÍy Asn Phe Ile '445 Asn Lýs Asn; . Leu Thr Met , 460 Ser Pro Glu - Trp Leu Gin 475 > 480 Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 495 His Trp Ser A.sn Pro Met 510 Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr C1C J Val Tyr Lys Glu Glu Asp 540 Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 555 560 Pro Leu Val Ala His Cgr 575 Pro Tyr. Asn Pro Ala Gly 590 Gin Pro Asp A.rg Phe Asp 605

6?

*ψ·* ·.♦ ·

9 % O;'*, <210> 17 <211> 387 <212> PRT. - <213.> Arabidopsis thaliana , <400> 17 Val,Gly Ser Asn Val Tyr Pro Leu Ile Leu Val Pro Gly Asn Gly Gly Asn Gin Leú Glu Val Arg Leu Asp-Arg Glu Tyr Lys Pro Ser=Ser Val - ;· 20 ' 25 30 ·' Trp Cys Ser Ser Trp Leu Ťyr Pro Ile His Lys Lys Ser Gly Gly Trp 35 40 45 ’ Phe Arg Leu Trp Phe Asp Ala Ala Val Leu Leu Ser Pro Phe Thr Arg ' - 50 55 60 Cys Phe Ser Asp Arg Met Met Leu Tyr Tyr Asp Pro Asp Leu Asp Asp 65 70 75 80 Tyr Gin Asn Ala Pro Gly . Val Gin Thr Arg Val Pro His Phe Gly Ser 85 90 95 Thr Lys Ser Leu Leu Tyr Leu Asn .Pro Arg Leu Arg Asp A.la Thr Ser 100 * 105 110 Tyr Met Glu His Leu Val Lys Ala Leu Glu Lys' Lys Cys Gly Ťyr Val 115 120 ' _ - · ‘ 125 Asn Asp Gin Thr Ile Leu Gly Ada Pro. Tyr .Asp Phe .Arg Tyr Gly Leu 130 135 140 ”

Ada Ala Ser Gly His Pro Ser Arg Val Ada Ser Gin Phe Leu Gin Asp 145 150 155 ' 160 Leu Lys Gin Leu Val Glu Lys Thr Ser Ser Glu Asn Glu Gly Lys Pro 165 170. 4 175 Val Ile Leu Leu Ser His Ser Leu Gly Gly Leu Phe Val Leu His Phe 130 185 190

Leu Asn Arg Thr Thr Pro Ser Trp Arg Arg Lys Tyr Ile Lys His Phe 195 200 205 Val Ala Leu Ala Ala Pro Trp Gly Gly Thr Ile Ser Gin Met Lys Thr 210 215 220 *

Phe Ala Ser Gly Asn Thr Leu Gly 225 230 Val Arg Arg His Gin Arg Thr Ser 245 Ser Thr'Lys Val Phe His Asp Arg 260 Gin Val Asn Tyr Thr Ala Tyr Glu 275 280

Val Pro Leu Val Asn Pro Leu Leu 235 240 Glu Ser Asn Gin Trp Leu Leu Pro 250 ' .255 Thr Lys Pro Leu Val Val Thr Prc 265 270 Met Aso Arg Phe Phe Ada Asp Ile 285 68 • ♦ 44 4 4 . ' 4 * 0 0 '4 0 > ♦ :** 4* ♦ · 4 4 0 0 9 \9 4 4 • · 4 0, 4 4 4 0 4 4 4 * · % 0 4 4 9 <»· 4 4 *09 44 0 M 4 4 4 444

Gly Phe Ser Gin Gly Val Val Pro Tyr Lvs Thr Arg Val Leu Pro Leu 290 . . . 295 300 * ’ ” ,

Thr Glu Glu Leu Met Thr Pro Gly Val Pro Val Thr Cys Ile Tyr Gly 305 \ "' -.310 315 . · ‘ 320 _^Arg Gly Val Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Tyr Gly Lys Gly Gly Phe

Asp Lys Gin Pro Glu·· Ile Lys Tyr Gly Asp* Gly Asp Gly Thr Val Asn . . ' \340t .·Χ '345 350

Leu Ala Ser,Leu Ala Ala Leu Lys Val Asp Ser Leu Asn Thr Val Glu · * 355 3 60 365

Ile Asp Glv Val Ser His Thr Ser Ile Leu Lys Asp Glu Ile Ala Leu - ' 370 · , . / -375 380

Lys Glu Ile 385

V · \<

v 63

% m

·#

<210> 18 <211> 389 <212> PRT <213> Arahidopsis thaliana <400> 18 '

Leu Lys Lys Glu Gly- Leu Lys Ala Lys His Pro Val Val Phe Ile Pro ________________5_____ _ 10 15

Gly Ile Val Thr Gly-Gly Leu Glu Leu Trp Glu Gly Lys Gin Cys Ala 20 25 30

Asp . Gly Leu Phe Arg Lys Arg Leu Trp Gly Gly Thr Phe Leu Cys Trp 35 40 45

Val Glu His Met Ser Leu Asp Asn Glu Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly 50 , 55 60

Ile Arg Val Arg Ala Val Ser Gly Leu Val Ala Ala Asp Tyr Phe Ala 65 70 75 80

Pro Gly Tyr Phe Val Trp A.la Val Leu Ile Ala Asn Leu Ala' His Ile 85 S0 95

Gly Tyr Glu Glu Lys Asn Met Tyr Met Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 100 105 110

Ser Phe Gin Asn Thr Glu Arg Asp Gin Thr Leu Ser Arg Met Lys Ser 115 120 125

Asn Ile Glu Leu Met Val Ser Thr Asn Gly Gly Lys Lys Ala Val Ile 130 135 '140........

Val Pro His Ser Met Gly Val Leu Tyr Phe Leu His Phe Meť Lys Trp 145 150 * 155 * 160

Val Glu Ala Pro Ala Pro Leu Gly Gly Gly Gly Gly Pro Asp Trp Cys 165 170 175 A.la Lys Tyr Ile Lys Ala Val Met Asn Ile Gly Gly Pro Phe Leu Gly 180 185 190

Val Pro Lys Ala Val Ala Gly Leu Phe Ser Ala Glu Ala Lys Asp Met 195 200 205

Arg Met Thr Arg Thr Trp Asp Ser Thr Met Ser Met Leu Pro Lys Gly 210 215 220

Gly Asp Thr Ile Trp Gly Gly Leu Asp Trp Ser Pro Glu Leu Pro Asn 225 230 235 240

Ala Pro Glu Met Glu Ile Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Gly Ile Pro Thr 245 250 255

Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Leu Asn Gin Ser Pro Asp Ser Cys Ile 260 265 270

Pro Phe Gin Ile Phe Thr Ser Ala His Glu Glu Asp Glu Asp Ser Cys 275 ' 280 285

4» 9

TO

Leu Lys Ala Gly Val Tyr Asn Val Asp Gly Asp Glu Thr Val Pro Val 290 295 ' 300

Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Ala Trp Arg Gly. Lys "Thr Arg 305 310 _ 315 320

Phe Asn Pro Ser Gly Ile Lys Thr Tyr Ile Arg Glu Tyr Asn His Ser ——n-.—---- - —3-2-5’..3-3-0~~ ..... , ..........335_

Pro Pro Ala Asn L'eu Leu'Glu Gly Arg Gly Thr Gin Ser Gly Ala His - 340 345 , 350 -

Val- Asp Ile Met Gly Asn Phe Ala Leu Ile Glu Asp Ile Met Arg Val '355 360 ’ 365

Ala Ala Gly Gly Asn Gly Ser- Asp Ile Gly His Asp Gin Val His Ser 370 375 380

Gly Ile Phe Glu Trp 385 ,4...... ··«♦ ♦ « v • . , • • ft t · ·· ♦ • · · ···

<210> 19 <211> 1986 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220>

<221> CDS (138.2) <-222>. (1) <400> 19 ' atg ggc aca ctg ttt ega aga aat gtc cag aac caa aag agt gat tet 48

Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gin Asn Gin Lys Ser'Asp Ser ' 1 "·· 5 10 15 gat gaa aac aat aaa ggg ggt tet gtt cat aac aag ega gag age aga 9 6

Asp Glu Asii Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg 20 25 30 aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat aag aga aga agg ggt 144

Asn His Ile His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly 35 40 45 att agt ggc agt gca aaa aga aat gag cgt ggc aaa gat ttc gac agg 192

Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg 50 55 ‘60 aaa aga gac ggg aac ggt aga aaa cgt·tgg aga‘gat tec aga aga ctg . 240

Lys Arg Asp Gly Asn.Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 7 0 ' ;75 ' ‘ - ,80' at-t ttc att ctt ggt gca ttc tta ggt gťa ctt ttg ccg ttt age.'cct. ^ 283

Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Pne Ser Phe 85 · " · 90 *; · 95 - ggc get tat cat gtt cat aat age gat

Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp 100 105 gta aat ttt gat tea ctt aaa gtg tat

Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr 115 120 ctc cca caa ggt ata agt tcg ttt att

Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe Ile 130 135 tac tcc aca tet tet tta gat gat ctc

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu 145 150 aaa caa ctc tta cgt gat tat aat atc

Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn Ile 165 atg gtt cct ggt gtc att tet acg gga

Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly 180 185 age gac ttg ttt gac aac ttt 336 Ser Asp Leu Phe Asp A.sn Phe 11Č) ttg gat gat tgg aaa gat gtt 384 Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val 125 gat gat att cag get ggt aac 432 A.sp Asp Ile Gin Ala Gly Asn 140 agt gaa aat ttt gcc gtt ggt 480 Ser Glu Asn Phe Ala Val Glý 155 160 gag gcc aaa cat cct gtt gta 528

Glu Ala Lys His Pro Val Val 170 175 att gaa age tgg gga gtc att

Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile 190 576 , > , > • „ • ·· '·· ·· ř ’ · · 9 r# - j/· • 9 • e 9 ‘4 ·, . · *· • '9 ···.'· é • Φ · • 4 ··'· 94 T-t gga gac gat gag tgc gat agt tcť gcg cat ttt. cgt aaa cgg ctg tgg ' 624

Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 ' 205 gga agt ttt tac atg ctg aga aca atg gtťatg gat aaa gtt tgt tgg 672

Gly. Ser. Phe Tyr Met -Leu Arg Thr Met Val Met Asp, Lys Val Cys Trp 210·. 215 220' ttg~aaa" cať'~gta 'atg tta gat cct-gaa- -aea- ggt-etg-gac-~cca„.ccg,aac________,7.20.

Leu Lys-His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr.Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 ’ ;* ' 230 ' ' 235 . ; 240 ttt acg^ cta. cgt gca gca cag ggc ttc gaa tca act gat tat ttc atc 768

Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile ’ . ’ ' . . . 245 250 255 gca ggg cat tgg att tgg aac aaa·· gtt ttc caa aat ctg gga gta att 816 :Ala Gly Tyr Trp Ile Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val Ile 260 265 270 ggc tat. gaa ccc aat aaa'. atg acg agt gct gcg tat gat tgg agg ctt 864

Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285 .. gca tat tta gat cta gaa Ala Tyr Leu Asp Leu Glu 290 gaa caa atc' gaa ctg ttt

Glu Gin Ile Glu Leu Phe 305' _ 310 att gga cat tet atg ggt

Ile Gly His Ser Met Gly 325 gtc gag gct gaa ggc cct Val Glu Ala Glu Gly Pro 340 aac gaa cac ata gat tca Asn Glu His Ile Asp Ser 355 gct. cca aag gca gtt cca Ala Pro Lys Ala Val Pro 370 att caa tta aat acg tta Ile Gin Leu Asn Thr Leu 385 390 aga att gag aga gta aaa Arg Ile Glu Arg Val Lys 405 atg cta cca aag gga gaa Met Leu Pro Lys Gly Glu 420 aga ege gat agg tac ttt Arg Arg Asp Arg Tyr Phe 295 _ 300 cat caa ttg. agt 'ggt'gaa' His Gin Leu. Seť.Gly"'Glu' . ,' Γ 3.15 *V‘; tet cag att atc* ttt.* tac Ser Gin Ile Ile 'Phe Tyr 330 : ctt tac ggt aat ggt ggt Leu Tyr Gly Asn Gly Gly 345 ttc att aat gca gca ggg Phe Ile A,sn Ala Ala Gly 360 gct cta att agt ggt gaa Ala Leu Ile Ser Gly Glu 375 380 gcc atg tat ggt ttg gaa Ala Met Tyr Gly Leu Glu 395 atg tta caa acg tgg ggt Met Leu Gin Thr Trp Gly 410 gag gtc att tgg ggg gat Glu Val Ile Trp Gly Asp 425 acg aag cta aag 912 Thr Lys Leu Lys aaa ’ctt tgt tta 960 Lys;.Val Cys Leu ;;>; ; V 320 ttt .atg aaa tgg 1008 Phe Met Lys Trp 335 cgt ggc tgg gtt 1056 Arg Gly Trp Val 350 acg ctt ctg ggc 1104

Thr Leu Leu Gly 365 atg aaa gat acc 1152

Met Lys Asp Thr aag ttc ttc tca 1200

Lys Phe Phe Ser 400 ggt ata cca tca 1248

Gly Ile Pro Ser 415 atg aag tca tet 1296

Met Lys Ser Ser 430 . 1' ·

ί» t ·#·· e • «« ♦ ·· • · < "· ♦ « ♦ « ,« 0 • · « • t · '· · ·· ··· • · · tt ·« ·· cca gag gat gca ttg aat aac aac act gac aca tac ggc aat ttc att 1344 Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe Ile 435 440 445 ega ttt gaa agg aat acg age gat get ttc' aac aaa aat ttg aca atg 1392 Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys Asn Leu Thr Met 450 455 460 'aaa'· gac- gcc •att -aac-, •atg-aca .tta.. tcg. „ata tea cct gaa tgg ctc caa 1440 Lys Asp Ala Ile Asn Met Thr Leu Ser’ 'ile" Šer' "Pro' Glu' 'Trp'; Leů" 'Gin ' 465 470 475 480 aga aga gta cat gag cag tac tcg ttc ggc tat tcc aag aat gaa gaa 1488 Arg. Arg Val His Glu Gin Tyr .Ser Phe Gly Tyr Ser Lýs Asn Glu Glu 485 490 495 gag tta aga aaa aat gag cta cac cac aag cac tgg tcg aat cca atg 1536 Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 500 505 510 gaa gta cca ctt cca gaa get ccc cac atg aaa atc tat tgt ata tac 1584 Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr 515 52 0 525 ggg gtg aac aac cca act gaa agg gca tat gta tat aag gaa gag gat 1632 Gly Val Asn Asn. Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 gac tcc tet get ctg aat ttg acc atc gac tac gaa age aag caa· cct 1680 Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Glri Pro 545 550 555 560 gta ctc ctc acc gag ggg gac gga acc gtt ccg ctc ghg gcg cat tea 1728 Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala Kis Ser 565 570 575 atg tgt cac 3.3.3. tgg gcc cag ggt get tea ccg tac aac cct gcc gga 1776 Met Cys Kis Lys Trp Ala Gin Gly A.ia Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 585 590 att aac gtt act att gtg gaa atg aaa cac cag cca gat ega ttt gat 1824 Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605 ata cgt ggt gga gca 333 age gcc gaa cac gta gac atc ctc ggc age 1872 Ile Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu Kis Val A.sp Ile Leu Gly Ser 610 615 620 gcg gag ttg aac gat tac atc ttg aaa att gca age ggt aat ggc gat 1920 Ala Glu Leu Asn Asp Tyr Ile Leu Lys Ile Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625 630 635 640 ctc gtc gag cca ege caa ttg tet aat ttg age cag tgg gtt tet cag 1958 Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin 645 650 655 atg ccc ttc cca atg taa 1986 Met Pro Phe Pro Met 660

<210> 20 <211> 661 <212> PRT <213> Saccharomvces cerevisiae <400> 20

Met.. Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gin Asn Gin Lys Ser Asp Ser Ϊ ~ —5— —--------..... --- 4

Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly'Ser Val His’ Asn Lys -Arg .Glu Ser Arg 20 25 30 1 Ásn His Ile His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly 35 40 45

Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys' Asp Phe Asp Arg 50 55 60

Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 70 75 80

Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 .95

Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe 100 105 " 110

Val Asn Phe Asp Sér Leu Lys Val Tyr Leu'Asp Asp Trp Lys Asp Val 115 120 125

Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe .Ile Asp Asp Ile Gin Ala Gly Asn 130 135 140

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly 145 150 155 160

Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175

Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile 180 185 190

Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205

Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220 .

Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240

Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile 245 ' 250 255

Ala Gly Tyr Trp Ile Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val Ile 260 265 270

Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285

•i ··«· f f ·· ·· ·♦ · · • ·· • f • · • · · • « • · · • · · + · ·· ·♦♦ • · · M ♦ · ··

Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg 290 _ 295

Glu Gin Ile Glu Leu Phe His Gin 305; 310

Ile Gly His Ser Met Gly Ser Gin ----------„325..

Val Glu Ala GÍu Gly Pro Leu Tyr 340

Asn Glu His Ile Asp Ser Phe Ile 355 360

Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu 370 375

Ile Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met 385 390

Arg Ile Glu Arg Val Lys Met Leu 405

Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val 420

Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn 435 440

Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp 450 455

Lys A.sp A.la Ile Asn Met Thr Leu 465 470

Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser 485

Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His 500

Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro 515 520

Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg 530 535

Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr 545 550

Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly 565

Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly 580

Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met 595 600

Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 300 Leu Ser'Gly Glu Lys Val Cys Leu 315 320 Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lys Trp ..........._33.Q. ....................33 5 _ Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 345 . 350 Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 365 Ile Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 380 Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 395 400 Gin Thr Trp Gly Gly Ile Pro Ser 410 415 Ile Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 425 430 Thr'Asp Thr Tyr Gly Asn Phe Ile 445 Ala Phe Asn Lys. Asn Leu Thr Met 460 . Ser Ile Ser Pro Glu Trp Leu Gin 475- 480 Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 490 495 His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 505 510 His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr 525 Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 540 Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 555 560 Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 570 575 Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 585 590 Lvs His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 605

·*·· • • • • · ♦· · · ' · ·# • é • · · • « • % • « • · · * · · φ • !· • • · * • · % ·* ··* ··· «t ·» • A 9

<210> 21 <211> 1986 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <22 0>

<221> CDS _<222> J1 1983) t , <400> 21 ' atg ggc 3C3 ctg ttt ega aga aat gtc cag aac Caa aag- agt gat tet 48 Met Gly -Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Glň Asn Gin Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 gat gaa aac aat, aaa ggg ggt tet gtt cat aac aag ega gag age aga 96 Asp Glu A.sn Asn Lvs Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg 20 25 30 aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat aag aga aga agg ggt 144 Asn His Ile His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg C-ly 35 40 45 att agt ggc agt gca aaa aga aat gag cgt ggc aaa gat ttc gac agg 192 Ile Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg 50 55 60 aaa 3.^3. gac ggg aac ggt aga aaa cgt tgg aga gat tcc aga aga ctg 240 Lvs Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 '70 75 80 att ttc att ctt ggt gca ttc tta ggt gta ctt ttg ccg ttt age tet 288 Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 95 ggc get tat cat gtt cat aat age gat age gac ttg ttt gac . aac ttt 336 Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe 100 105 110 gta aat ttt gat tea ctt aaa gtg tat ttg gat gat tgg aaa gat gtt 384 Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val 115 120 125 ctc cca caa ggt ata agt tcg ttt· att gat gat att cag get ggt 3SC 432 Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe Ile Asp Asp Ile Gin Ala Gly Asn 130 135 140 tac tcc aca tet tet tta gat gat ctc agu gaa aat ttt gcc gtt ggt 480 Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu 3θ2Γ Glu Asn Phe Ala Val Gly 145 150 155 160 aád caa ctc tta cgt gat tat aat atc gag gcc aaa cat cct gtt gta 528 Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr A.sn Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175

atg gtt cct ggt gtc att tet acg gga att gaa age tgg gga gtt att Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Iie Glu Ser Trp Gly Val Ile 180 185 ISO 576 >·· • e ·» * » · ·β ··« ·· gga gac gat,gag tgc gat agt tet gcg cat ttt cgt aaa cgg ctg tgg Gly Asp Asp 'Glu Cys Asp Ser Ser Ala Kis Phe Arg Lys -Arg Leu Trp • ‘ 195 ’ ‘ 200 205 624 gga'„agt1..ttt tac atg ctg aga aca atg gtt atg gat aaa gtt tgt tgg Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Meť Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210- : * 215 - 220 . 672 ttcťaaa~caf' cta atcr· tta- ga-t-GGt-qaa-^aca^.g.at...c.t_g.„gac cca ccg aac Leu"Lys His Val.Met Leu Asp Pro· Glu Thr Gly Leu Asp Pro. Pro Asn 225 v ' *'·· 230 235 - ” 240 720' ttt acg' cta cgt gca gca cag ggc ttc gaa tea act gat tat ttc atc Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile >· · *'' · 245 250 255 7 68 •gca ggg tat tgg att·. tgg aac aaa gtt ttc caa aat ctg gga gta att Ala Gly Tyr. Trp Ile Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val Ile ; 260 ' 265 270 816 ggc tat gaa ccC .aat aaa atg acg agt get gcg tat gat tgg agg ctt Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285 864 gca tat tta gat cta gaa aga ege gat agg tac ttt acg aag cta aag Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg A.rg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 290 295 . . 300· 912 gaa caa atc gaa ctg ttt cat caa ttg agt ggc, gaa aaa gtt tgt tta Glu Gin Ile Glu Leu Phe His Gin Leu Šer Gly· Glu Lys Val Cys Leu 305 '310 : ť -315. 320 960 att gga cat tet atg ggt tet cag att atc. ttt tac ttt atg aaa tgg Ile Gly His Ser Met Gly Ser Gin Ile Ile Phe, Tyr Phe Met Lys Trp 325 330 335 1008 gtc gag get gaa ggc cct ctt tac ggt aat ggt ggt cgt ggc tgg gtt Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 * 350 1056 aac gaa cac ata gat tea ttc att aat gca gca ggg acg ctt ctg ggc Asn Glu His Ile Asp Ser Phe Ile Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 355 360 ~ 365 1104 get cca aag gca gtt cca get cta att agt ggt gaa atg aaa gat acc Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu Ile Ser Gly Glu Met Lys A.sp Thr 370 375 380 1152 att caa tta aat acg tta gcc atg tat ggt ttg gaa aag ttc ttc tea Ile Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 385 ' 390 395 400 1200 aga att gag aga gta aaa atg tta caa acg tgg ggt ggt ata cca tea Arg Ile Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly Ile Prc Ser 405 410 415 1248 atg cta cca aag gga gaa gag gtc att tgg ggg gat atg aag tea tet Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val Ile Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430 1296 *ř9

tea gag gat gca ttg aat aac aac act gac aca tac ggc aat ttc att 1344 Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe Ile 435 440 445 ega ttt gaa. agg aat acg age gat gct ttc aac aaa aat ttg aca atg 1392 Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys A.sn Leu Thr Met 450 . 455 460 _αα.3._ „.gac. _gcc„ att aac atg aca tta tcg cLl.3. tea cct gaa tgg ctc caa 1440 Lys Asp Ala Ile' Asn "Met' ‘Thř Leu Sěř Ile' "Ser-'Pro·' -Glu· Trp- Leu-Gln . 465 470 475 480 aga aga gta cat gag cag tac tcg Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser 485 ttc ggc tat tcc aag aat gaa gaa 1488

Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 490 495. gag tta aga aaa aat gag cta cac cac aag cac tgg tcg aat cca atg 1536

Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 500 505 510 gaa gta cca ctt cca gaa gct ccc cac atg aaa atc tat tgt ata tac 1584

Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys Ile Tyr Cys- Ile Tyr 515 520 525 ggg gtg aac aac cca act gaa agg gca tat gta tat aag gaa gag gat 1632

Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 gac tcc tet gct ctg aat ttg acc atc gac tac gaa age aag caa cct 1680

Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 545 550 555 560 gta ttc ctc acc gag ggg gac gga acc gtt ccg ctc gtg gcg cat tea 1728

Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 565 570 575 atg tgt cac aaa tgg gcc cag ggt gct tea ccg tac aac cct gcc gga 1776

Met Cys His Lys Tm Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 585 590 att aac gtt act att gtg gaa atg aaa cac cag cca gat ega ttt gat 1824

Ile Asn Val Thr Ile Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605 ata cgt ggt gga gca aaa age gcc gaa cac gta gac atc ctc ggc age 1872-

Ile Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp Ile Leu Gly Ser 610 615 620 gcg gag ttg aac gat tac atc ttg aaa att gca age ggt aat ggc gat 1920

Ala Glu Leu Asn Asp Tyr Ile Leu Lys Ile Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625- 630 635 640 ctc gtc gag cca ege caa ttg tet aat ttg age cag tgg gtt tet cag 1968

Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin 645 650 655 1986 atg ccc ttc cca atg taa Met Pro Phe·Pro Met 660

<» * <210> 22 <211> 661 · : <212> PŘT ’ <213> Sacchařoroyces cerevisiae ' <4Q0> 22

Met Gly Thr Leu, Fhe Arg Arg Asn Val Gin Asn Gin Lvs Ser Asp Ser 1 . ^ 5. - ...... ... ------------ . iq --------.1_____ 15. .

Asp Glu Asn . Asn Lvs Gly Gly Ser Val His Asn'Lys‘ Arg4 Glu Ser Arg ’ 20 25 30

Asn' His·’Tle His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly 40 45

Ile Ser Gly Sér Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg - 50 55 60

Lys Arg" Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 70 75 80

Ile Phe Ile Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 -95

Gly Ala Tvr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp, Asn Phe 100 105 v/110

Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp .Trp' Lys Asp Val 115 120 '"/-125-;/

Leu Pro Gin Gly Ile Ser Ser Phe Ile Asp Asp-'Ile· Gin Ala-Gly Asn 130 135 U0/

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe-Ala Val Gly 145 150 155 160

Lys Gin Leu Leu Arg A.sp Tyr Asn Ile Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175

Met Val Pro Gly Val Ile Ser Thr Gly Ile Glu Ser Trp Gly Val Ile 180 185 190

Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205

Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220

Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 * 230 235 240

Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe Ile 245 250 255

2Λ • •«f f ,3 •í ·· « • ' 0 t • · · · 0 * • t é * * · * i ·* · · » • » · ♦♦ <*· ·«· Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 300 Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 315 320 Ile Ile Phe Tyr Phe Met Lys Trp 330 335 - ~ — — ------ Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 345 350 Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 365 Ile Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 380 .Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 395 400 Gin Thr Trp Gly Gly Ile Pro Ser 410 • 415 Ile Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 425 430 Thr • Asp Thr Tyr Gly .Asn Phe Ile 445 Ala Phe Asn Lys Ash Leu Thr Met 460

Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg 290 295

Glú Gin Ile Glu Leu Phe His 305 310

Ile Gly His Ser Met Gly Ser _____ _ 32 5 __

Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu . 340

Asn Glu His Ile Asp Ser Phe 355

Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala 370 375

Ile Gin Leu Asn Thr Leu Ala 385 . 390

Arg Ile Glu Arg Val Lys Met 405

Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu 420

Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn 435

Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser 450 455

Lys Asp Ala Ile Asn Met Thr 465 470

Arg Arg Val His Glu Gin Tyr 485

Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu 500

Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala 515

Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu 530 535

Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu 545 550

Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp 565

Met Cys His Lys Trp Ala Gin 580

Ile Asn Val Thr Ile Val Glu 595

Ser Ile Ser Pro Glu Trp Leu Gin 475 480

Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 490 495

His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 505 510

His Met Lys Ile Tyr Cys Ile Tyr 525

Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 540

Ile Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 555 560

Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 570 575

Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 585 590

Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 605

23 • é · » * <210> 23 <211> 2312

<212> genomic DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 23 atggcgtctt ccaagaagag caaaactcat aagaaaaaga aagaagtcaa atctcctatc 60 gacttaccaa aztcaaagaa accaacccgc gctttgagtg agcaaccttc agcgtccgaa 120. acacaatccg tttcaáataa atcáágáaaa' "tctaaatttg" gaaaaagatc-gaatttcata -1-3Q-· ctgggcgcta ttttgggaat atgcggtgct ttttttttcg ctgttggaga cgacaatgct 240 gtcttcgacc ctgctacgtt agataaactt gggaatatgc 'taggctcttc agacttgctt 300 gatgacatta aággatattt atcttataat gtgttcaagg atgcaccttt tactacggac 360 aagccttcgc agtctcctag cggaaatgaa gttcaagttg gtcttgatat gtacaatgag 420 ggataccgaa gtgaccatcc tgttattatg gttcctggtg ttatcagctc aggattagaa 480 agttggtcgt ttaataattg ctcgattcct tactttagga aacgtctttg gggtagctgg 540 tctatgctga aggcaatgtt ccttgacaag caatgctggc ttgaacattc aatgcttgat 600 aaaaaaaccg gcttggatcc gaagggaatt aagctgcgag cagctcaggg gtttgaagca 660 gctgattttt ttatcacggg ctattggatt tggagcaaag taattgaaaa ccttgctgca 720 attggttatg agcetaataa catgttaagt gcttcttacg attggcggtt atcatatgca 780 aatttagagg aacgtgataa atatttttca aagttaaaaa tgttcatcga gtacagcaac 840 attgtacata agaaaaaggt agtgttgatt tctcactcca tgggttcaca ggttacgtac 900 tattttttta agtgggttga agctgagggc tacggaaatg gtggaccgac ttgggttaat 960 gatcatattg aagcatttat aaatgtgagt ctcgatggtt gtttgactac gtctctaact 1020 tttgaataga tatcgggatc tttgattgga gcacccaaaa cagtggcagc gcttttatcg 1080 ggtgaaatga aagatacagg tattgtaatt acattaaaca tgttaatatt taattttcgc 1140 taaccgtttt aagctcaatt gaatcagttt tcggtctatg ggtaagcaat aaattgttga 1200 gatttgttac taatttactg tttagtttgg aaaaactttt ttcccgttct gaggcatact 1260 caaaaataca aatgtgctct actttttcta acttttaata gagagccatg atggctcgca 1320 ctatgggagg agttagttct atgcttccta aaggaggcga tgttgtatgg ggaaatgcca 1380 gttgggtaag aaatatgtgc tgttaatttt ctatčaatat ttaggctcca gatgatctca 1440 atcaaacaaa tttttccaat ggtgcaatca ttcgacacag agaagacatt gataaggacc 1500 acgatgaatt tgacatagat gatgcattac aa.fctttcaaa aaatgttaca gatgacgatt 1560 tcaaagtcat gctagcgaaa aattatcccc acggtcttgc'ttggaccgaa aaagaagtgc 1620 taaaaaataa cgaaatgccg tctaaatgga taaacccgct agaagtaaga acattaaagc 1680 tactaaatta tactaaccca aatagactag tcttccctat gctcctgata tgaaaattta 1740 ttgcgttcac ggggtcggaa aaccaactga gagaggctat tattatacta ataatcczga 1800 ggggcaacct gtcattgatt cctcggttaa tgatggaaca aaagttgaaa atgtgagaga 1860 atttatgttt caaacattct attaactgtt tcattagggt actgttatgg atgatggtga 1920 tggaacttta ccaaCattag cccttggttt ggtgtgcaat aaagtttggc aaacaaaaag 1980 gcttaatcct gctaatacaa gtatcacaaa ttatgaaatc aagcatgaac ctgctgcgtt 2040 tgatctgaga ggaggacctc gctcggcaga acacgtcgat atacttggac attcagagct 2100 aaaCgtatgt tcactttacc ttacaaattt ctattactaa cccttgaaat aaggaaatta 2160 ttttaaaagt ttcatcaggc catggtgact cggtaccaaa ccgttatata tcagacatcc 2220 agtacggaca taagttttgt agattgcaat taactaacta accgaacagg gaaataataa 2280 atgagataaa tctcgataaa cctagaaatc aa 2312 Μ <210> 24 ' <211> 3685 <212> genomicDNA <213 > Arajbidopsis thaliana .'t í · <40C> .24 atgccgctta -gcgg&gcacg-aaatcgaacg’ gtgtgtgtaa' cagta-tgtaa .aaagaaggtc^ ‘ctcgagcttt 'ggaacttttg. " gggatttgga tttaattcca 'attttcttaa tggactattt gtcatcttat ttcctttáct catgttttgt gatagaggac tttgatcttt cgagtttatt cctcccgacc acgatctgca aatgttattg ctttgattca gatccagctg cctggctact aaaaatatgt ttctcatcgť cttaaatatg gtaácataga ccatgggggt gtggcggggg gaccatttct ctgcagttgc gaactcaaag ccgacattgg atgatgaatt caacatatgt ctčcatgctt tgčatctatg gtcapttggc aggattctta acgcacatgg gcctgattgg aacttgtggt gacgatatct ttttbgagta atatctgtac cccgťcgtga ctgagtataa agatgatggc ccaagtatca gattccaact gatatggttt cccágtaata ttcatcggaa •aagaggattc. .gaggagggaa cctggtggct cggagcgaat ttaaggcgaa gggaaggcaa gtgaagqcta ttggatctga tgqttgtctg gagaccattt ctgťttgatt tgccaaatct gtcgttgcgt tgggaataga tgttgcttta cagctcaatg cacatgtctt ctgctatgga tcttcttctt t.tgatggtaa ggcctctatg gtattagagt ttgfctgggc acatggctgc tctttctatt tctcatgttg gttgatggtt cttgtatttt tgggccagat tggtgttcca caggtattga ttattctacc ttgattattt gataattctt catactgtct gcattcttta gtcttttatt tccttaatat gacaccgata gactcaacaa tcaccggaga gaagcaggtg tttgggaaag aggacataca attttatctg cgtgtggaca ggtctacact gcgtggtgcc agaccccaaa gtatccttcg tcagctcaaa tcgaggtgcc aaagccgacg gcaaaagaaa gtggtcgtgc tcttctcctc cacgggtcct acatcctgtt ácaatgcgct: caaaaggtga tgagatcadg tcttactctt ctgtatgtgt gttaacttta gttgctagac gtagacttag gaagttctaa ttattcaact -tgcttttctc gaatttcgtc tatattaaaa tcggctcagt cagtggtáta ttgggtggas." tcgagcťgta. agtgctgatt atatgactgg actctgttcc aattaatagg tctaccaaeg ctacatttta tggtgtgcaa aaagctgttg atatctgctt aaatatcaat ttgctgctta acgcattgct tttggagggc ccaattagcg tcttcttaat agaactttac tatttagacc tgtctatgtt aaggccacac aaaacggagt aagtagcaga aatcataaca gtgaagggtg gagtaccatg gccggtgaag gctcatttct tactggtcaa tcctgatgca gcttacaaag aaagttgata gagaaaccat ccacacgaat cgacgccgcc ct.tccáaatc atcgattctc ctttacaacgi ttgcctgacb gccttcattc gatggtttat gctcaacaat cacttgttgc tacttttttt aaggtaagcg ggatataaaa atgccctaga ctttgtgtag ctacatctgt atgtatatgt aatttttttc catcctcgtt aaaaagtgct gttcatgctt gttgatagta cacatgtcac : teaggactcg gctaacctcg cggctttcgt atgttacgtt tacgtgatca gtggaaaaaa tgaagtgggt agtatactaa cagggctttt atacttttga tctaataaca tgtaactgaa ctgtgatgac actgaattct ttattctgct taaagactcg tttcttcgaa tcagaccttg accgaaggga ctgttgtggg Ctccaagaaa ggctgcgcca aaccttgtac ctgtcaaagg acatgggaat ccacagatct cttacggaat atccgttaga ttaccagtct ctgtttctga catgtgactc gttgttggtt caatgcctgc čgcccggtgt ctgggattgt ttagaaaacg tctcactctt ttcttcaaca tťttcttgát ttccaaggac tagctgcctt gtccgttcat cgtataatga ggaaagtgtg gtaattaaag tcaatttcaa. ctgttatcca ttgtgggttg ttgccatggt tcttaaetaa ttgacaatga tggctgcťgá cacatattgg ttcagaacác tctttcttca’ gactcttagc agcagttata tgaggcacca ggcggtgatg ctctgctgaa tgatcagaac ttgctacatt actc.tcttga cagtttctta gctatggaaa tctttcaatt ttggattagt aattgcagag cagcatgtaa ggtgacacga aaaaagcaaa agtcctgtta cctgagacta actttgtgac tcagagtatc tgctgggatc actacat-cac tgctgatgat gacaaagtaa ttctgtctcc gcctttctca ccgcttataa atctgaagag ccaccacaag :cattgggcgtT gagcttccct taagcccaaa caccggtggg tttgtggggt ccctcacact tcactčaaac gtgaaacgct gtaactggcc ggaatttcaa aacaagttac agtagtgttt ttcaggctgt ctagttcctit agtttcacat gcttcgaact catccttgtt agagacgggc tcaattacct 'aactgggccg .ctactttgct .agatgaagag agaggttctt • tftactaaagg .cgtacgaaaa gttčcgcatt gctcctctgg aacattggtg gcaaaggatg cttggctctg atcgccgcaa gactagacaa gctccgacga gcgctggagc ttcttgtata tgctccatta cgatcgcccc tgagaatgac tatggggcgg agaacaačga actatggaag ataatatcga tgcatgacga ccaaatcaca aaagccatcg gttgctccca ttggatgaca gtgacc..cctt ggcccagttg aaaaggctcg atcccccgtc 60 .120 '180' -240 300 360 420 4.80 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 * 85 tggtttgttc tgctttttca gattaccgaa tgctcctgag atggaaatct actcattata 3240 cggagtgggg ataccaacgg aacgagcata cgtatacaag cttaaccagt ctcccgacag 3300 ttgcatcccc tttcagatat tcacttctgc tcacgaggag gacgaagata gctgtctgaa 3360 agcaggagtt tacaatgtgg atggggacga aacagtaccc gccctaagtg ccgggcacat 3420 gtgtgcaaaa gcgtggcgtg gcaagacaag attcaaccct tccggaatca agacttatat 3480 aagagaatac aatcactctc cgccggctaa cctgttggaa gggcgcggga cgcagagtgg '3540 tgcčcatgtt gatatcatgg gaaactttgc tttgatcgaa gatatcatga gggttgccgc 3600 cggaggtaac gggtctgata taggacacga ccaggtccac tctggcacat ttgaatggtc 3660 _ggag.cg-tatt,*gacctgaagc tgtga . _____________________________ 3_685 86 86

• ·1 2· t « «· Μ « > . "· · 2 · . Ψ ’'· t é 9 • f· ··'·;· 2. » 1 '· '· ’ · · · « ' 2 2 « <' ''· · ·2··2· ·2 ··· ·»· f f · ·,' ··· ' <210> 25 ; ’

<211> 402 <212> cDNA , <213> Aratoidopsis thaliana <22 0> % ?· ; k ; ' . * " . # v* ‘ ·'''’ i- v,’ !<'*·

1 • ,<221> CDS„ . ' 2 , ^<222>'Τί1φ'ΤΤ4Ό1Τ~'. 2' -------------~~..................._ . ..... , ' * ' - > t '"3P . - ‘ s1<400> 25 2 ' agaaacagct čtttgtctct ctcgactgat ctaacaatcc ctaatctgtg ttctaaattč 60 rccggacgagá ťttgaeaaag tccgtatagc ttaacctggt‘ttaatttcaa gtgacagat ·.· 119 .atg cčc· ctt att cat cgg aaa aag ccg acg gag aaa cca tcg acg ccg‘ 167, 2

Meč Pro'Leu lis His Arg Lys Lys Pro Thr Glu Lys Pro Ser Thr Pro ' -.1 " 5 . ' 10 15 'cca tcť/gaa gag gtg gtg cac gat gag gat tcg caa aag aaa cca cac 215

Pro Ser Glu Glu Val Val His Asp Glu Asp Ser Glii Lys Lys Pro His 20 25 30 gaa tet tcc aaa tcc cac cat aag naa tcg aac gga gga ggg aag tgg 263

Glu Ser Ser Lys Ser His His Lys Xaa Ser Asn Gly Gly Gly Lys Trp 35 40 45 tcg tgc atc gat tet tgt tgt tgg ttc, att\ggg. tgť‘gtg tgt gta acc 311

Ser Cys Ile Asp Ser Cys Cys Trp Phe Ilé Gly' Cys Val Cys Val Thr . . ' ’ 50 ' 55 ,· '„',60 tgg tgg ttt ctt ctc ttc ctt tac aac gca atg cct‘gcg age ttc cct 359

Trp Trp Phe Leu Leu Phe Leu Tyr Asn A-la. Met Fro Ala Ser Fhe Pro 65 7 0 ' '75 80 cag tat. gta acg gag ccg aat cac gng tcc ttt gcc tta ccc g 402

Gin Tyr Val Thr Glu Pro Asn His Xaa Ser Phe Ala Leu Pro 85 90 a* ·* ♦♦ |f '♦ 4 • ♦♦ <210> 26 <211> 643 <212> CDNA <213> Zea mays <220>

<221> CDS <222> (1)-.--(402) - - - -- ·- .. ......____ <400> 26 > cgg gag aaa ata gct gct ttg aag ggg ggt .gtt tac tta gcc gat ggt 48 Arg Glu Lys Ile Ala Ala Leu Lys Gly Gly Val Tvr Leu Ala Asp Gly - 1 5 10 15 gat gaa act gtt cca gtt ctt agt gcg ggc tac atg tgt gcg aaa gga 96 Asp Glu Thr Val Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lvs Gly 20 25 30 tgg cgt ggc aaa act cgt ttc agc cct gcc ggc agc aag act tac gtg 144 Trp Arg Gly Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 40 45 aga gaa tac agc cat tcg cca ccc tet act ctc ctg gaa ggc agg ggc 192 Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 60 acc cag agc ggt gca cat gtt gat ata atg ggg aac ttt gct cta att 240 Thr C-ln Ser Gly Ala His Val Asp Ile Met Gly Asri Phe Ala Leu Ile 65 70 75 80 gag gac gtc atc aga ata gct gct ggg gca acc ggt gag gaa att ggt 288 Glu Asp Val Ile Arg Ile Ala Ala C-ly Ala Thr Gly Glu Glu Ile Gly 85 90 95 ggc gat cag gtt tat tca gat ata ttc aag tgg tca gag 3.3.3 atc aaa 336 Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp Ile Phe Lys Trp Ser Glu Lys Ile Lys 100 105 110 ttg aaa ttg taa cct atg gga agt taa aga agt gcc gac ccg ttt att 384 Leu Lys Leu 115 gcg ttc caa agt gtc ctg cctgagtgca actctggat :t ttgcttaaat 432 attgtaattt ttcacgcttc attcgtccct ttgtcaaatt tacatttgac aggacgccaa 492 tgcgatacga tgttgtaccg ctattttcag cattgtatat taaactgtac aggtgtaagt 552 tgcatctgcc agctgaaatt gtgtagtcgt tttctttacg atttaatanc aagtggcgga 612 643 gcagtgcccc aagcnaaaaa aaaaaaaaaa a

83

<21Q> 28 <211> 516 <212> cDNA <213> Neurospora crassa <400> 28 ggtggcgaag acganggcgg aagttggagg ctaacgagaa tgacnctcgg·agatggatct 60 .accctctaga^^gacacgačta ccnttgcacc cagcctcaag gtntacngtt tntatgggta 120 ggaagccgac ggagcgágčc tačátccatc cggcgcccga scccgggacg»acaacgcacc~18C tttagatgac gatcgatacg acttcgactn aggggcacat tgaccacggt gtgattttgg 240 gcgaaggcga tggcacagtg aaccttatga gtťtggggta cctgtgcaat aaggggtgga 300 aaatgaagag atacaatcct gcgggctcaa aaataaccgt ggtcgagatg ccgcatgaac 360 cagaacggtt caatccgaga.ggagggccga atacggcgga cttaaátatg tagaaaaggt 420 tgaaatttat gaagagcaat taaatacggc acataggtta ctcaatagta tgactaatta 480 aaaaaaaatt-ttttCtctaa aaaaaaaaaa aaaaaa 516 <3o • · ·· ·· *t · » é 9 9 »' • 1 · · • • • · • * · Ψ • • • · ·· ♦ ·♦· ·· • <2Χ0> 29 <211> 1562

<212> genomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <40Q> 29 atgaaaaaaa tatcttcaca ttattcggta •acczcga-cgc'· gtcaagccgc gggcagcaac ggaggtaacc agctagaggt ácggctggac agcagctggt tatatccgat tcataagaag gcagcagtgt tattgtctcc ctccaccagg gaccctgátt tggatgatta ccaaaatgct ggttcgacca aatcacttct atacctcgac tatcattttg, .ggacatttgc ataatgaaca atatcaatat ccatttatatgctagtcggt tgagtgttat gtgattttcc attttaaatg ctatgtcatg agaattataa ggacactatg gcagagatgc cacatcttac atggaacatt atgttaacga ccaaaccatc ctaggagctc cgggccaccc gtcccgtgta gcctcacagt aaactagcag cgagaacgaa ggaaagccag ttttcgtcct ccatttcctc aaccgtacca actttgttgc actcgctgcg ccatggggtg ctggcaacac actcggtgtc cctttagtta cctccgagag taaccaatgg ctacttccat cgcttgtcgt aactccccag gctaactaca acattggatt ctcacaagga gttgtgcctt agctgatgac tccgggagtg ccagtcactt aggttttgac gtatggaaaa ggaggattcg gagatgggac ggttáatttg- gcgagcctag tagagattga tggagtťtcg catacatcta ttacgaagca gatttcaatt attaattatg ga gtcatagcga tactcgttgt ggtgacgatg 60 gtgtaccctt^_tgatcctggt tccaggaaac 120 agagaataca agccaagtag^tgTctggtgfc' Τ8Ό" agtggtggat ggtttaggct atggctcgat 240 cgcttcagcg. atcgaatgat gttgtactat 300 cctggtgtcc aaacccgggt tcctcacttc 360 cctcgtctcc ggttagtact ttccaagata 420 aaatagacat aaatctgggg gattattgtt 480 aatgtgagtg ttatgctagt atagttaatg 540 aagctagaaa gttgtcgttt aataatgttg600 taaatgcagc ttaataataa ggtttgattt 660 tggtgaaagc tctagagaaa aaacgcgggt 720 catatgattt caggtacggc ctggctgctt 780 tcctacaaga cctcaaacaa ttggtggaaa 840 tgatactcct ctcccatagc ctaggaggac 900 ccccttcatg· gcgccgcaag cacatcaaac 960 ggacgatctc tcagatgaag acatttgctt 1020 accctttgct ggtcagacgg catcagagga 1080 ctaccaaagt gtttcacgac agaacťaaac 1140 cagcttacga gatggatcgg ttttttgcag 1200 acaagacaag agtgttgcct ttaacagagg 1260 gcatatatgg gagaggagtt gatacaccgg 1320 ataagcaacc agagattaag · .tatggagatg 1380 cagctttgaa agtcgatagc ttgaacaccg 1440 tacttaaaga cgagatcgcá‘ctcaaagaga 1500 aatcagccaa tgttaacgcc gtcaacgaat 1560 1562 91 •. ě *#· · • • • * • • · • · ·. · * · ·· ♦·· ··· <210> 30 <211> 3896

<212> genomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 30 atgggagcga -atttgcggcg.. ctatcgggta gactgtccat aaggtccgtg aattccaagc gtcaacagtg tgtttcccat ttťttattca ggtcacttta tggttCacag taatcaaaca agaattggat tcaatttgat tcaggtcctc gaagcaaatg gagcgtgacc ttctcttttt tttgaaactg aaťaatgtct ttgaagtggc ttaagttacc agctcgatac tcaaatctac tctctttagt tgaaagtatt agtgctagtt caaccaaacc gaagaaactt tgtgacatat ggttgttgtc agggtgataa tataccactg ttaacattga aaaagtctca tacagaaaca cttcacagcc agat.agcaag tattgctcat ctatatcaat ccttattatt atgaatgcaa taatagcgtc atacttttca ccacctacaa attctcaata tctttttgaa ctaaatgtat taccctgata aggcaatttt gtggcatgtx ttatcatccc tgaaacatga attcgaaatc .gcqgaactgc taatcattcc acactccgtt atcttcattt gaaatatagc acgcttctga cgcttttggt actagatctg cttgtgcatt cttctttctg gaccatcccg ccaggttaca atcatcttgt tttctačtgt caattgtcgc

Gttactttca atgtaagata ctttaaaact tcagatactt ttgatcagca attttatttt ctgatttgtt tctctctggt tttaagtagt acctttgtta atcaaagaac acatgtacac tgactgaaat tgacatgcgc caattctttt cacattctgg tgatgaagag aattccttcc ccaagaatgt gctctagtca cgtgaactag aggatgtcac cgatcatcac tgttcatatg gattatcagc aagggggtat aattttgttt ggtcgtatca aaaatgcatt tcacatcatg ttacgattta gaagctgtct; attggatcat ccgcaatggc atctcagttg ctccgagctc cácttgnatc agtaacggct ggtggaggat gggatttgcg ggacttcaat ccttcgctcc aatgaagcat atctgagctt tcgctaaatg caagtttttc gtgattcttt ctgtcaactg agtgtaagcc taacaggtag tgtgatataa ctggaaagag tgttccatac caagctcaag agctaagagc ccgtggcggc tctggaatgg tatccatgct ttctctaatt gttgatttag gtaacgtttg tgatatcaac attgaactgc atattgcggg tgatttagtt ctttttattt ttctcacgtc gcg-tcgtzcat acgcattttt gaatatcaat actagcggtt tcactctcat acatgaccag cagatgggac accagttaaa ttgctggctc ctttgtcttt tctctcctta ttcagctgat ttccagcaaa tgatgacccc ttgcatatat cgttgacttt tcttctccct gtcataggtt cacggacatc agaagcaaaa cataagcasa agtggatgat aaagacaact tccttcaccg tcatcgccgt ttttttcttg 60 gagaccgagt ttcacggcga ctactcgaag 120 ťcgacgcagc tacgagcgcg-gccgatccct 180 ccgctcgacc tcgtatggct agacaccact 240 ttattctgtc ggtcgagtca cttgttgatg 300 gtctcgtctc tcttattgat tcgttcatta 360 agagtcatat aaaacágctg actcggcgag 420 tagcgcaatg aatgtgtaat tagtctgcgc 480 agagtgctca atagtagtta gaaaatgtta 540 tggtcgttgc ttactgatcg acgcgatgga 600 ctggtttaag tgtatggtgc tagatcctta 660 acggcctgac agtggtcttt cagccatcac 720 tttcggattt ttctttcttc tgagttttct 780 tatggctaag ctcattaatt tggccaattt 840 tggcttaagt ggtgtgttga gtttggtata 900 gattggagat tgtcaccaac caaattggaa 960 ttagtcctta tcaggctaat gtcttttatc 1020 tctggtcgtc ttcctttctg caggttgacc 1080 ccttctatag tatttgccca ttcaatgggt 1140 ctgaggctag aaattgcacc aaaacattac 1200 tatttcgctg ttggtaccgg cctactatcc 1260 ggggsagtta tgttgtgact tactggactg 1320 gagctcctct tcttggttct gťtgaggcaa 1380 gcccccctgt ttctgaggťg acctccgact 1440 caggtctbať aactcactgg attttccxtt 1500 tgtacgcgat atggtatctg tagatcttga 1560 tagtacacct gtcagcggcc ttagctaata 1620 ttcagactat tatggtagac tttaagctga 1680 taataggcca.tgatttgttt attgaaatca 1740 ttttgttggc aaggcttcag ggaactgctc 1800 tgtggcttat gccattttca aagaattgca 1860 ctgggggtgc tgcaaagaaa gataagcgcg 1920 caaaatattc tggctggccg acaaacatta 1980 agactctgča tatgcaactg taacaccaac 2040 atttcgttcc tttgatgtgt atccatcagt 2100 catggaatgt ggccttccca cccttttgtc 2160 tctttccaaa gcaatagaag actatgaccc 2220 gaagtacgta cctttctttg tgataagaaa 2280 cttgtacgtc aaatCgtttt gttcaaatct 2340 cttactataa gaaacaagta taaccagaaa 2400 tattatggaa tgtctttttc gtttacagtt 2460 tgattctctc attctccagt ttgctctgac 2520 tcttcgtgaa ttatatataa catgccaact 2580 gtttctaatc ctctgactcc ttgggagaga 2640 ggcgcccatc taaagacaga ggtacgatgc 2700 gttattatat cccccatttg^ gtttgcaata 2760 tgcatcctat gccatcaagc gttaaaggta 2320 ggttattact ttgccccaag tggcaaacct 2880 atttatgaaa ccgaaggctc cctcgtgtca 2940 caggaaggca áagtcttctg tatcagtcta 3000 ttattaaaca actaaaactt aagtactčtt 3060 cagtggctta aagpgggaag aggtgttgca 3120 agcaaaacaa aactaaccca Cttctgaatt 3180 91 91 Á- t Λ .0

tcatattatt aggagtagtc gtgcttttaa aaaatttgtt ttaagaaacc .gaaaaactag 3240 ttcatatctt gattgtgcaa tatctgcagg tctggaactg tggttgatgg gaácgctgga 3300 cctataactg gggatgagac ggtaagctca gaagttggtt ttgaáattat cttcttgcaa 3360 ,actactg'aag actáagataa tacttgcttc tggaacacťg cttgctatgt tctctagtac, 3420 actgcaatat tgactctccg ctacttttat tgattatgaa áttgatctct tataggtacc 3480 ctatcatcca ctctcttggt gcaagaattg gctcggacct aaagttaaca taacaatggc 3540 tccccaggta ctctttxtta gttcctcacc ttatatagat caaactttaa gtgtactttt 3600 ctggttatgt gttgatttac ctccaatttg ttctttctaa aaatcacata tctctgtacť 3660 cctcaagaac^tt.g.tattaaj: ctaaacgaga ttctcattgg gaaaataaaa caacagccag 3720 aacacgatgg aagcgacgta catgtggaac taaatgttga tcatgagčať gggtcagacá''3780" teatagctaa ;catgaCaaaa gcaccaaggg ttaágtacat aaccttttat gaagactctg 3840 agagcattcc ggggaagaga accgcagtct gggagcttga taaaagtggg tattaa ; 3,896

<5$ <5$

··'··«. « <·» ·· · « %β , ββ · · - * » *« • · . . · ,· · · · φ • · >* ···'··· φ · · · ······ • · · · · ·.· · ·’· ι· · φφφ <210> 31 <211> 709 <212> cDNA <213> tomato <400> 31 ctggggccaa aagtgaacat aacaaggaca ccacagtcag agcatgatgt tcagatgtac 60 „aagcgcatct,.aaatacagag catcaacatg gtgaagatat cattcccaat atgácaaagt 120 tacctacaat gaagtacata"acctáttfatg "aggat:tč'tga~aagttttcca-gggaeaagaa 180-—--—,____ cagcagtttg ggagcttgat aaagcaaatc acaggaacat tgtcagatct ccagctttga 240 tgcgggagct gtggcttgag atgtggcatg atattcaccc tgataaaaag tccaagtttg 300 ttacaaaágg tggtgtctga tcctcactat tttcttctat aaatgtttga gtttgtatcg 360 acattgtaag tattgcaaca aaaagcaaag cgtgggcctc tgagggatga ggactgctat 420 tgggattacg ggaaagctcg atgtgcatgg gctgaacatt gtgaatacag gttagaatat 480 tcaaattata ttttgcaaaa tattctcctt ttgtgtattt aggccacctt tccccggtca 540 caacgatgca gatatgtatt cggggatgtt cacctgggac agagttgcag attgaagagt 600 tctacatctc acatcctgtc acactatgtg tgatattcaa gaaactttgt ttggcggaac 660 aacaagtttg cacaaacatt tgaagaagaa agcgaaatga ttcagagag 709

Claims (23)

1. 9 ·· ΰ MS?. w®i vsst&ďka advokát 94 1&Ϊ OJ) ®*ΛΑΚΑ ?. m>uανα v PATENTOVÉ 9 · 9 , ·· ·♦· • · » · · #'·, ··« ·· ·· ··· -3Λ? N ÁROK Y

   • ť . - 1. Enzym katalýzující přenos mastných ‘kyselin rz fosfolipidů na ' diacvlglycergl, který je nezávislý na acyl-CoA, v biosyntetické dráze produkce triacylglycerolu. vC · * . ' U. • · 2. Enzym. podle nároku 1 obsahující' aminokyselinovou sekvenci ' uvedenou jako sekvence id. č. 2 nebo její funkční fragment, * ; derivát, alelu, homolog nebo isoenzym. (t
2. 3. Enzym podle nároku 1 označený jako fosfolipidtdiacylglycerol acyltransferáza (PDAT).

   •i

   Ά1 Λ I 9
3. 4. Enzym podle nároku 1 až 3 obsahující aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako sekvence id. č. 16., 20 nebo 22, nebo její funkční fragment, derivát,. · áielu,‘ í' homolog nebo isoenzym. .2· 'v Λ ’ :Γ · 5. Enzym podle nároku 1 až 4 obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence uvedené jako sekvence id. č. 6, 8, 13, 14, 15, 17, -18, 25 a 27 a jejich funkční fragmenty, deriváty, alely, homology nebo isoenzymy. 6. Enzym podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci nebo funkční fragment, derivát, alelu, homolog nebo isoenzym této aminokyselinové sekvence, která je kódovaná nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 1, 3, 4,.5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 a 31, nebo částí, derivátem, alelou nebo homologem této nukleotidové sekvence. Λ'1 i
4. 7. Nukleotidová sekvence kódující enzym katalýzující přenos mastných kyselin z fosfolipidů na diacylglycerol, který je nezávislý na acyl-CoA, v biosyntetické dráze produkce, triacylglycerolu.
5. 8. Nukleotidová sekvence podle nároku 7 kódující enzym označený jako fosfolipid:diacylglycerol acyltransferáza (PDAT).
6. 9. Nukleotidová sekvence podle nároku 7 nebo 8, vybraná ze skupiny obsahující sekvence uvedené jako sekvence id. č. 1, 3, 4, 10, 11, 19, 21, 23, 24, 29 a 30, nebo její část, derivát, alela nebo homolog. 10. Částečná nukleotidová sekvence odpovídající úplné nukleotidová sekvenci podle ,nároku 7 až 9, vybraná ze skupiny obsahující sekvencé uvedené jako sekvence id. č. 5, 7, 9, 12, 25, 26, 28 a 31, nebo-její část; derivát, alela nebo homolog. ' .
7. 11. Nukleotidová sekvence podle nároku 7 až 10, která obsahuje nukleotidovou sekvenci alespoň ze 40 % identickou s nukleotidovou sekvencí vybranou ze skupiny obsahující sekvence id. č. 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 a 31.
8. 12. Genový konstrukt obsahující nukleotidovou sekvenci podle nároku 7 až 11 operativně spojenou s heterologní nukleovou kyselinou.
9. 13. Vektor obsahující nukleotidovou sekvenci podle nároku 7 až 11 nebo genový konstrukt podle nároku 12.
10. 14. Vektor podle nároku 13, který je expresní vektor. I I ♦ ·· • <e © ©c « e • • · • · · • • · · • · · • • · ·· · «·· ·· • '·· 96
11. 15, Vektor podlé nároku 13 nebo 14, který dále obsahuje gen selekčního markéru a/nebo nukleotidovou sekvenci pro replikaci v hostitelské buňce nebo pro integraci do genomu hostitelské buňky, ;
12. 16. Transgenní buňka nebo organismus obsahující nukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 7 až 11 a/nebo genový konstrukt podle nároku 12 a/nebo vektor podle nároků 13 až 15.
13. 17. Transgenní buňka nebo organismus podle nároku 16, kde buňka nebo organismus jsou eukaryotické.
14. 18. Transgenní buňka nebo organismus'podle nároku 16 nebo 17, kde buňka ke kvasinková nebo. rostlinná buňka a organismus je rostlina. -
15. 19. Transgenní buňka nebo organismus podle nároků 16 až 18, které mají změněnou biosyntetickou dráhu produkce triacylglycerolu.
16. 20. Transgenní buňka nebo organismus podle nároků 16 až 19 mající změněný obsah oleje.
17. 21. Transgenní buňka nebo organismus podle nároků 16 až 20, které máji změněnou aktivitu PDAT.
18. 22. Transgenní buňka nebo organismus podle nároků 16 až 21, kde změněná aktivita PDAT je charakterizována změnou genové exprese, katalytické aktivity a/nebo regulace aktivity enzymu.. ···· · 9 99 99 9 • ·· 99 « 9 9 9 9 e • 9 • · 9 9 9 • 9 9 · 9 9 9 9 9 • 99 999 999 99 99 ·« ·

    >· ( P Η
19. 23. Transgenní buňka nebo organismus podle nároků 16 až 22, kde změněná biosyntetická dráha produkce triacylglycerolu je charakterizovaná zabráněním akumulace, nežádoucích mastných kyselin v membránových lipidech;.
20. 24. Způsob produkce triacylglycerolu vyznačující se t 2. Iřif ze obsahu, j 0 pěstování transgenních buněk nebo organismů podle nároků 16 až 23 v podmínkách, kdy je exprimována nukleotidová sekvence podle nároků 7 až 11.
21. 25. Triacylglyceroly produkované způsobem podle nároku 24.
22. 26. Použití nukleotidové sekvence podle nároků 7 až 11 a/nebo enzymu podle nároku 1 až 6 pro výrobu triacylglycerolu a/nebo triacylglycerolů s neobvyklými mastnými kyselinami.
23. 27. Použití nukleotidové sekvence podle nároků 7 až 11 a/nebo enzymu podle nároku 1 až 6 pro transformaci jakékoliv buňky nebo organismu, aby se exprimovaly v buňce nebo organismu a vedly ke změněnému, výhodně zvýšenému obsahu oleje v buňce nebo organismu. í