SK13872001A3 - Trieda enzýmov v biosyntetickej dráhe na produkciu triacylglycerolu a rekombinantné molekuly DNA kódujúce tieto enzýmy - Google Patents

Description

Predložený vynález sa týka izolácie, identifikácie a charakterizácie molekúl rekombinantnej DNA kódujúcej enzýmy katalyzujúce transfer mastných kyselín z fosfolipidov na diacylglycerol v biosyntetickej dráhe na produkciu triacylglycerolu.

Triacylglycerol (TAG) je najbežnejšou zásobárňou energie na báze lipidov v prírode. Predpokladá sa, že hlavná cesta syntézy TAG zahŕňa tri sekvenčné transfery acylov z acyl-CoA na glycerolovú kostru (1, 2). Po mnohé roky sa predpokladalo, že acyl-CoA : diacylglycerol acyltransferáza (DAGAT), ktorá katalyzuje reakciu tretieho transferu acylu, je jediným jedinečným enzýmom zapojeným do syntézy TAG. Pôsobí divergovaním diacylglycerolu (DAG) zo syntézy membránových lipidov do TAG (2). Gény kódujúce tento enzým boli nedávno identifikované v myši (3) ako aj v rastlinách (4, 5) a ukázalo sa, že kódované proteíny sú homologické s acyl-CoA : cholesterol acyltransferázou (ACAT). Nedávno bolo tiež publikované, že v olejnatej hube Mortiereila ramanniana existuje ďalšia DAGAT, ktorá nie je príbuzná s myšacou DAGAT, s génovou rodinou ACAT alebo akýmkoľvek iným známym génom (6).

Predložený vynález sa týka nového typu enzýmov a ich kódujúcich génov na transformáciu. Konkrétnejšie sa vynález týka použitia typu génov kódujúcich doposiaľ neopísaný typ enzýmov ďalej označených ako fosfolipid :diacylglycerol acyltransferázy (PDAT), pričom tento enzým katalyzuje reakciu nezávislú od acylCoA. Uvedený typ génov exprimovaný samotný v transgénnych organizmoch zlepší celkové množstvo oleja (triacylglycerolov) produkované v bunkách. Gény PDAT v kombinácii s génom na syntézu vzácnej mastnej kyseliny pri exprimovaní v transgénnych organizmoch zvýšia hladiny vzácnych mastných kyselín v triacylglyceroloch.

Doterajší stav techniky

Existuje značný celosvetový záujem o produkciu chemických surovín, napríklad mastných kyselín, na priemyselné použitie z obnoviteľných rastlinných zdrojov namiesto neobnoviteľných petrochemikálií. Táto koncepcia je všeobecne atraktívna pre výrobcov a spotrebiteľov vzhľadom na šetrenie zdrojov a poskytuje významnú príležitosť na vývoj nových priemyselných plodín pre poľnohospodárstvo.

V olejoch z divých rastlinných druhov existuje rozmanitý rad vzácnych mastných kyselín a tieto sú dobre charakterizované. Mnohé z týchto kyselín majú priemyselný potenciál a to viedlo k záujmu o domestikovanie relevantných rastlinných druhov, aby sa umožnila poľnohospodárska produkcia konkrétnych mastných kyselín.

Vývoj v technológiách genetického inžinierstva kombinovaný s lepším pochopením biosyntézy vzácnych mastných kyselín teraz umožňuje transfer génov kódujúcich kľúčové enzýmy zapojené do syntézy konkrétnej mastnej kyseliny z divých druhov do domestikovaných plodín s olejnatými semenami. Takýmto spôsobom možno produkovať jednotlivé mastné kyseliny vo vysokej čistote a množstvách pri miernych nákladoch.

Vo všetkých plodinách ako repka olejná, slnečnica, palma olejná atď. je olej (teda triacylglyceroly) najhodnotnejším produktom semien alebo plodov a ďalšie zlúčeniny ako škrob, proteíny a vláknina sa považujú za vedľajšie produkty s nižšou hodnotou. Zvýšenie množstva oleja na hmotnostnú jednotku na úkor iných zlúčenín v olejnatých plodinách by teda zvýšilo hodnotu tejto plodiny. Ak by sa gény regulujúce alokáciu redukovaného uhlíka do produkcie oleja dali regulovať k vyššiemu výkonu, bunky budú akumulovať viac oleja na úkor iných produktov. Také gény by sa nemuseli používať len v bunkách, ktoré už beztak produkujú veľké množstvo oleja, ako sú napríklad olejnaté plodiny, ale mohli by indukovať významnú produkciu oleja aj v plodinách obsahujúcich stredné alebo nízke množstvá oleja, ako je napríklad sója, ovos, kukurica, zemiak, cukrová repa a kŕmna repa, ako aj v mikroorganizmoch.

Podstata vynálezu

Mnohé zo zaujímavých vzácnych mastných kyselín, napr. mastné kyseliny so strednou dĺžkou reťazca, hydroxylové mastné kyseliny, epoxidované mastné kyseliny a acetylénové mastné kyseliny majú fyzikálne vlastnosti, ktoré sa výrazne líšia od bežných rastlinných mastných kyselín. Prihlasovatelia zistili, že v rastlinných druhoch prirodzene akumulujúcich tieto vzácne mastné kyseliny v oleji svojich semien (t.j. v triacylglycerole) tieto kyseliny chýbajú, alebo sú prítomné vo veľmi nízkych množstvách v membránových (fosfo)lipidoch semien. Nízka koncentrácia týchto kyselín v membránových lipidoch je veľmi pravdepodobne predpokladom správnej funkcie membrány a tým správnych funkcií bunky. Jedným z aspektov vynálezu je, že semená transgénnych plodín možno prinútiť akumulovať vysoké množstvá vzácnych mastných kyselín, ak sa tieto mastné kyseliny účinne odstraňujú z membránových lipidov a preorientujú sa do semenových triacylglycerolov.

Vynálezcovia identifikovali novú triedu enzýmov v rastlinách katalyzujúcu transfer mastných kyselín z fosfolipidov do diacylglycerolu pri produkcii triacyiglycerolu cez reakciu nezávislú od acyl-CoA a že tieto enzýmy (fosfolipid.’diacylglycerol acyltransferázy, v skratke PDAT) sú zapojené do odstraňovania hydroxylovaných, epoxidovaných mastných kyselín a pravdepodobne tiež iných vzácnych mastných kyselín, napríklad mastných kyselín so strednou dĺžkou reťazca, z fosfolipidov v rastlinách.

Ukázalo sa, že táto enzýmová reakcia je prítomná v mikrozómových prípravkoch z pekárskych kvasníc (Saccharomyces cerevisiae). Predložený vynález sa ďalej týka enzýmu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekvencii č. 2 alebo jej funkčný fragment, derivát, alelu, homológ alebo izoenzým. Získal sa takzvaný „knock out“ mutant narušený v príslušnom géne a ukázalo sa, že v mikrozómových membránach z tohto mutantu úplne chýba aktivita PDAT. Takto sa dokázalo, že narušený gén kóduje enzým PDAT (sekvencia č. 1 a 2). Tento enzým PDAT je navyše charakterizovaný aminokyselinovou sekvenciou podľa sekvencie č. 2 obsahujúcou lipázový motív konzervovaného sekvenčného reťazca FXKWVEA.

Predložený vynález sa ďalej týka enzýmu obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekvencii č. 16, 20 alebo 22 alebo jej funkčný fragment, derivát, alelu, homológ alebo izoenzým.

Boli identifikované a v rámci predloženého vynálezu sa uvažujú ďalšie gény a/alebo proteíny doposiaľ neznámej funkcie. Bol identifikovaný gén zo Schizosaccharomyces pombe, SPBC776.14 (sekvencia č. 3), putatívny otvorený čítací rámec CAA22887 zo SPBC776.14 (sekvencia č. 13). Ďalej boli identifikované genomické sekvencie Arabidopsis thaliana (sekvencia č. 4, 10 a 11) kódujúce putatívne proteíny, ako aj putatívny otvorený čítací rámec AAC80628 z A. thaliana, lokus AC 004557 (sekvencia č. 14) a putatívny otvorený čítací rámec AAD10668 z A. thaliana, lokus AC 003027 (sekvencia č. 15).

Okrem toho bol identifikovaný aj čiastočne sekvencovaný kloň cDNA z Neurospora crassa (sekvencia č. 9) a kloň Zea mays EST (Extended Sequence Tac) (sekvencia č. 7) a zodpovedajúca putatívna aminokyselinová sekvencia (sekvencia č. 8). Nakoniec boli identifikované dva klony cDNA, jeden Arabidopsis thaliana EST (sekvencia č. 5 a zodpovedajúca predikovaná aminokyselinová sekvencia č. 6) a kloň Lycopersicon esculentum EST (sekvencia č. 12). Ďalej sa v rámci vynálezu uvažujú enzýmy označené ako PDAT obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných sekvenciou č. 6, 17, 18, 25 alebo 27 obsahujúce lipázový motív FXKWVEA. Ďalej je v rámci vynálezu zahrnutý enzým obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu kódovanú cez nukleotidovú sekvenciu, jej časť, derivát, alelu alebo homológ, vybranú zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii č. 1,3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 alebo 31 alebo funkčný fragment, derivát, alela, homológ alebo izoenzým aminokyselinovej sekvencie kódujúcej tento enzým.

Funkčný fragment tohto enzýmu sa chápe ako akákoľvek polypeptidová sekvencia, ktorá vykazuje špecifickú enzýmovú aktivitu fosfolipid:diacylglycerol acyltransferázy (PDAT). Dĺžka funkčného fragmentu sa môže napríklad pohybovať od približne 660 ± 10 aminokyselín do 660 ± 250 aminokyselín, s výhodou od približne 660 ± 50 do 660 ± 100 aminokyselín, pričom „základný počet“ 660 aminokyselín zodpovedá v tomto prípade polypeptidovému reťazcu enzýmu PDAT so sekvenciou č. 2 kódovanou nukleotidovou sekvenciou podľa sekvencie č. 1.

Vzhľadom na to „základný počet“ funkčného enzýmu plnej dĺžky sa môže meniť v závislosti od kódujúcej nukleotidovej sekvencie.

Pod časťou tejto nukleotidovej sekvencie sa chápe akákoľvek nukleotidová sekvencia kódujúca polypeptid, ktorý vykazuje špecifickú aktivitu fosfolipid:diacylglycerol acyltransferázy (PDAT). Dĺžka nukleotidovej časti sa môže pohybovať v širokom rozmedzí približne niekoľkých stoviek nukleotidov na základe kódovacej oblasti génu alebo vysoko konzervovanej sekvencie. Dĺžka sa mení napríklad v rozmedzí od približne 1900 ± 10 do 1900 ± 1000 nukleotidov, s výhodou od približne 1900 ± 50 do 1900 ± 700 a s väčšou výhodou od približne 1900 ± 100 do 1900 ± 500 nukleotidov, pričom „základný počet“ 1900 nukleotidov zodpovedá v tomto prípade kódujúcej nukleotidovej sekvencii enzýmu PDAT so sekvenciou č. 1. Vzhľadom na to sa „základný počet“ funkčného génu plnej dĺžky môže meniť.

Pod aleiickým variantom tejto nukleotidovej sekvencie sa chápe akákoľvek iná nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje polypeptid s funkčne ekvivalentnou funkciou. Alely sa vzťahujú na prírodné sa vyskytujúce varianty týchto nukleotidových sekvencii ako aj syntetické nukleotidové sekvencie produkované metódami známymi v danej oblasti techniky. Uvažujú sa dokonca aj zmenené nukleotidové sekvencie, ktoré vedú k enzýmu so zmenenou aktivitou a/alebo reguláciou, alebo ktorý je rezistentný voči špecifickým inhibítorom. Predložený vynález ďalej zahŕňa prírodné alebo syntetické mutácie pôvodne izolovaných nukleotidových sekvencii. Tieto mutácie môžu byť substitúciou, adíciou, deléciou, inverziou alebo inzerciou jedného alebo viacerých nukleotidov.

Pod homologickou nukleotidovou sekvenciou sa chápe doplnková sekvencia a/alebo sekvencia, ktorá špecificky hybridizuje s touto nukleotidovou sekvenciou. Hybridizujúce sekvencie zahŕňajú podobné sekvencie vybrané zo skupiny DNA alebo RNA, ktoré špecificky interagujú s týmito nukleotidovými sekvenciami za prinajmenšom miernych podmienok prísneho riadenia, ktoré sú známe v danej oblasti techniky. Výhodným, rozsah vynálezu neobmedzujúcim príkladom podmienok prísne riadenej hybridizácie je hybridizácia v 6X chloride sodnom/citráte sodnom (SSC) pri približne 45 °C nasledovaná jedným alebo viacerými premytiami v 0,2 X SSC, 0,1 % SDS pri 50 - 65 °C. To ďalej zahŕňa krátke nukleotidové sekvencie, napr. 10 až 30 nukleotidov, s výhodou 12 až 15 nukleotidov. Zahrnuté sú aj primérové alebo hybridizačné sondy.

Homoiogická nukleotidová sekvencia zahrnutá do rozsahu predloženého vynálezu je sekvencia, ktorá je aspoň na 40 %, s výhodou aspoň približne na 50 % alebo 60 % a s väčšou výhodou aspoň na 70 %, 80 % alebo 90 % a s najväčšou výhodou aspoň na 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo 99 % alebo viac homoiogická s nukleotidovou sekvenciou č. 1.

Všetky vyššie uvedené definície platia pre aminokyselinové sekvencie a funkčné enzýmy a sú ľahko pochopiteľné pre odborníka v danej oblasti.

Izoenzýmy sa chápu ako enzýmy, ktoré majú rovnakú alebo podobnú substrátovú špecifickosť a/alebo katalytickú aktivitu, ale majú inú primárnu štruktúru.

V prvom uskutočnení sa tento vynález týka sekvencii nukleových kyselín, ktoré kódujú PDAT. To zahŕňa sekvencie, ktoré kódujú biologicky aktívne PDAT ako aj sekvencie, ktoré sa majú používať ako sondy, vektory na transformáciu alebo klonovacie intermediáty. Kódovacia sekvencia PDAT môže kódovať úplnú alebo čiastočnú sekvenciu v závislosti od zamýšľaného použitia. Uvažuje sa celá génomická sekvencia, sekvencia cDNA, prekurzorové PDAT alebo zrelá PDAT alebo ich časť.

Ďalej je zahrnutá nukleotidová sekvencia vybraná zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 1, 3, 4, 10, 11, 19, 21,23, 24, 29 alebo 30 alebo jej časť, derivát, alela alebo homológ. Vynález sa týka aj čiastočnej nukleotidovej sekvencie zodpovedajúcej nukleotidovej sekvencii plnej dĺžky vybranej zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 5, 7, 9,12, 25, 26, 28 alebo 31 alebo jej časti, derivátu, alely alebo homológu. V rozsahu vynálezu sa uvažuje aj nukleotidová sekvencia obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 40 % homoiogická s nukleotidovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 1,3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21,23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 alebo 31.

Ί

Predložený vynález sa týka aj génového konštruktu obsahujúceho uvedené nukleotidové sekvencie podľa predloženého vynálezu, ktorý je funkčne pripojený na heterológnu nukleovú kyselinu.

Pojem funkčne pripojený znamená sériovú organizáciu napr. promótora, kódovacej sekvencie, terminátora a/alebo ďalších regulačných prvkov, pričom každý prvok môže plniť svoju pôvodnú funkciu počas expresie nukleotidovej sekvencie.

Ďalej sa v predloženom vynáleze uvažuje vektor pozostávajúci z uvedenej nukleotidovej sekvencie podľa predloženého vynálezu. To zahŕňa aj expresný vektor ako aj vektor ďalej obsahujúci vyberateľný markerový gén a/alebo nukleotidové sekvencie pre replikáciu v hostiteľskej bunke a/alebo integráciu do genómu hostiteľskej bunky.

Podľa iného aspektu sa tento vynález týka spôsobu produkcie PDAT v hostiteľskej bunke alebo jej potomstve vrátane geneticky modifikovaných olejnatých semien, kvasníc a plesní alebo akéhokoľvek iného organizmu akumulujúceho olej, expresiou konštruktu v bunke. Bunky obsahujúce PDAT ako výsledok produkcie sekvencie kódujúcej PDAT sa tiež uvažujú v rámci rozsahu vynálezu.

Ďalej sa vynález týka transgenickej bunky alebo organizmu obsahujúceho uvedenú nukleotidovú sekvenciu a/alebo uvedený génový konštrukt a/alebo uvedený vektor. Cieľom predloženého vynálezu je ďalej transgenická bunka alebo organizmus, pričom ide o eukaryotickú bunku alebo organizmus. Transgenická bunka alebo organizmus je s výhodou kvasnicová bunka alebo rastlinná bunka alebo rastlina. Predložený vynález sa ďalej týka uvedenej transgenickej bunky alebo organizmu so zmenenou biosyntetickou dráhou na výrobu triacylglycerolu.

V rozsahu predloženého vynálezu sa uvažuje aj transgenická bunka alebo organizmus so zmeneným obsahom oleja.

Vynález sa ďalej týka transgenickej bunky alebo organizmu, v ktorých je zmenená aktivita PDAT. Táto zmenená aktivita PDAT je charakterizovaná zmenou v génovej expresii, katalytickej aktivite a/alebo regulácii aktivity enzýmu.

V predloženom vynáleze je zahrnutá aj transgenická bunka alebo organizmus, kde zmenená syntetická dráha na produkciu triacylglycerolu sa vyznačuje zabránením akumulácie nežiaducich mastných kyselín v membránových lipidoch.

V inom uskutočnení sa tento vynález týka aj spôsobov používania sekvencii DNA kódujúcich PDAT na zvýšenie obsahu oleja v rámci bunky.

Ďalší aspekt vynálezu sa týka zabudovania vysokých množstiev vzácnych mastných kyselín v triacylglycerole produkovanom v rámci bunky zavedením sekvencie DNA produkujúcej PDAT, ktorá špecificky odstraňuje tieto mastné kyseliny z membránových lipidov bunky a preorientuje ich do triacylglycerolu. Uvažujú satú aj rastlinné bunky majúce takú modifikáciu.

Vynález sa ďalej týka postupu na výrobu triacylglycerolu pozostávajúceho z pestovania uvedenej transgenickej bunky alebo organizmu za podmienok, pri ktorých sa uvedená nukleotidová sekvencia exprimuje a kedy uvedené transgenické bunky obsahujúce uvedený enzým katalyzujúci transfer mastných kyselín z fosfolipidov na diacylglycerol tvoriac triacylglycerol.

Ďalej sú v rozsahu predloženého vynálezu zahrnuté triacylglyceroly pripravené vyššie uvedeným postupom.

Cieľom predloženého vynálezu je ďalej použitie tejto nukleotidovej sekvencie a/alebo uvedeného enzýmu na prípravu triacylglycerolu a/alebo triacylglycerolov so vzácnymi mastnými kyselinami. Použitie uvedenej nukleotidovej sekvencie a/alebo uvedeného enzýmu podľa predloženého vynálezu na transformáciu akéhokoľvek bunkového organizmu, aby sa exprimoval v tejto bunke alebo organizme a viedol k zmenenému, s výhodou zvýšenému obsahu oleja v tomto bunkovom organizme, sa tiež zahŕňa do rozsahu predloženého vynálezu.

PDAT podľa tohto vynálezu zahŕňa akúkoľvek sekvenciu aminokyselín, napríklad proteín, polypeptid alebo peptidový fragment získateľný z mikroorganizmu, zvieracieho alebo rastlinného zdroja, ktorá demonštruje schopnosť katalyzovať produkciu triacylglycerolu z fosfolipidu a diacylglycerolu za enzymatických reakčných podmienok. Pod „enzymatickými reakčnými podmienkami“ sa rozumie, že v prostredí sú k dispozícii akékoľvek potrebné podmienky (napr. faktory ako teplota, pH, neprítomnosť inhibujúcich látok), ktoré umožnia enzýmu fungovať.

Ďalšie PDAT možno získať zo špecifických sekvencií tu poskytnutých. Navyše bude zrejmé, že možno získať prírodné a syntetické PDAT vrátane modifikovaných amínokyselinových sekvencií a východiskových látok pre modelovanie syntetického proteínu z uvedených PDAT a z PDAT, ktoré sa získajú použitím takých uvedených sekvencií. Modifikované aminokyselinové sekvencie zahŕňajú sekvencie, ktoré boli mutované, skrátené, predĺžené a podobne, bez ohľadu na to, či boli také sekvencie čiastočne alebo plne syntetizované. Sekvencie, ktoré sú skutočne vyčistené z rastlinných prípravkov, alebo sú identické, alebo kódujú identické proteíny, bez ohľadu na metódu použitú na získanie proteínu alebo sekvencie, sa rovnako považujú za prírodné odvodené.

Ďalej sondy nukleových kyselín (DNA a RNA) podľa predloženého vynálezu možno použiť na skríning a získanie „homologických“ alebo „príbuzných“ PDAT z radu rastlinných a mikrobiálnych zdrojov.

Ďalej je tiež zrejmé, že odborník v danej oblasti môže s informáciami poskytnutými v tejto prihláške v akomkoľvek organizme identifikovať aktivitu PDAT, vyčistiť enzým s touto aktivitou a tým identifikovať „nehomologickú“ sekvenciu nukleových kyselín kódujúcu taký enzým.

Predložený vynález možno v zásade charakterizovať nasledujúcimi aspektmi:

1. Použitie génu PDAT (genomický kloň alebo cDNA) na transformáciu.

2. Použitie molekuly DNA podľa položky 1, kde táto DNA sa používa na transformáciu akéhokoľvek organizmu, aby sa exprimovala v tomto organizme a viedla k aktívnemu rekombinantnému enzýmu PDAT, aby sa zvýšil obsah oleja v organizme.

3. Použitie molekuly DNA podľa položky 1, kde táto DNA sa používa na transformáciu akéhokoľvek organizmu, aby sa zabránilo akumulácii nežiaducich mastných kyselín v membránových lipidoch.

4. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén PDAT sa používa na transformovanie transgenických organizmov akumulujúcich olej modifikovaných tak, aby produkovali akúkoľvek vzácnu mastnú kyselinu, ktorá je škodlivá, ak je prítomná vo vysokých množstvách v membránových lipidoch, napríklad mastné kyseliny so stredne dlhým reťazcom, hydroxylované mastné kyseliny, epoxidované mastné kyseliny a acetylénové mastné kyseliny.

5. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén PDAT sa používa na transformovanie organizmov a kde tieto organizmy sú krížené s inými organizmami akumulujúcimi olej modifikovanými tak, aby produkovali akúkoľvek vzácnu mastnú kyselinu, ktorá je škodlivá, ak je prítomná vo vysokých množstvách v membránových lipidoch, medzi ktoré patria mastné kyseliny so stredne dlhým reťazcom, hydroxylované mastné kyseliny, epoxidované mastné kyseliny a acetylénové mastné kyseliny.

6. Použitie podľa položky 1, kde enzým kódovaný uvedeným génom PDAT alebo cDNA kóduje PDAT so zreteľnou acylovou špecifickosťou.

7. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén alebo cDNA kódujúce PDAT sú odvodené od Saccharomyces cerevisiae, alebo obsahujú nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinovú sekvenciu na 30 % alebo viac identickú s aminokyselinovou sekvenciou PDAT tak, ako je prezentovaná v sekvencii č. 2.

8. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén alebo cDNA kódujúce PDAT sú odvodené od Saccharomyces cerevisiae, alebo obsahujú nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinovú sekvenciu na 40 % alebo viac identickú s aminokyselinovou sekvenciou PDAT tak, ako je prezentovaná v sekvencii č. 2.

9. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén alebo cDNA kódujúce PDAT sú odvodené od Saccharomyces cerevisiae, alebo obsahujú nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinovú sekvenciu na 60 % alebo viac identickú s aminokyselinovou sekvenciou PDAT tak, ako je prezentovaná v sekvencii č. 2.

10. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén alebo cDNA kódujúce PDAT sú odvodené od Saccharomyces cerevisiae, alebo obsahujú nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinovú sekvenciu na 80 % alebo viac. identickú s aminokyselinovou sekvenciou PDAT tak, ako je prezentovaná v sekvencii č. 2.

11. Použitie podľa položky 1, kde uvedený gén alebo cDNA kódujúce PDAT sú odvodené z rastlín alebo obsahujú nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinovú sekvenciu na 40 % alebo viac identickú s aminokyselinovou sekvenciou PDAT z Arabidopsis thaliana alebo s proteínom kódovaným náprotivkom plnej dĺžky čiastočných klonov cDNA Zea mays, Lycopericon esculentum alebo Neurospora crassa.

12. Transgenické organizmy akumulujúce olej obsahujúce vo svojom genóme gén PDAT prenesený technológiou rekombinantnej DNA alebo somatickou hybridizáciou.

13. Transgenické organizmy akumulujúce olej podľa položky 12 obsahujúce vo svojom genóme gén PDAT majúci špecifickosť pre substráty s konkrétnou vzácnou mastnou kyselinou a gén pre danú vzácnu mastnú kyselinu.

14. Transgenické organizmy podľa položky 12 alebo 13, ktoré sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z húb, rastlín a zvierat.

15. Transgenické organizmy podľa položky 12 alebo 13, ktoré sú vybrané zo skupiny poľnohospodárskych rastlín.

16. Transgenické organizmy podľa položky 12 alebo 13, ktoré sú vybrané zo skupiny poľnohospodárskych rastlín a kde je uvedený gén PDAT exprimovaný pod kontrolou promótora špecifického pre zásobný orgán.

17. Transgenické organizmy podľa položky 12 alebo 13, ktoré sú vybrané zo skupiny poľnohospodárskych rastlín a kde je uvedený gén PDAT exprimovaný pod kontrolou semenového promótora.

18. Oleje z organizmov podľa položky 12 až 17.

19. Spôsob zmeny acylovej špecifickosti PDAT zmenením nukleotídovej sekvencie prírodné sa vyskytujúceho kódujúceho génu a v dôsledku tejto zmeny vytvorením génu kódujúceho enzým s novou acylovou špecifickosťou.

20. Proteín kódovaný molekulou DNA podľa položky 1 alebo jej funkčným fragmentom.

21. Proteín podľa položky 20 označený ako fosfolipid:diacylglycerol acyltransferáza.

22. Proteín podľa položky 21, ktorý má zreteľnú acylovú špecifickosť.

23. Proteín podľa položky 13 majúci aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekvencií č. 2, 13, 14 alebo 15 (a proteíny kódované génmi plnej dĺžky alebo čiastočnými génmi definovanými v sekvencií č. 1, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 11 alebo 12) alebo aminokyselinová sekvencia s najmenej 30% homológiou s uvedenou aminokyselinovou sekvenciou.

24. Proteín podľa položky 23 izolovaný zo Saccharomyces cerevisiae.

Všeobecné metódy:

Kmene kvasníc a plazmidy. Použitými štandardnými kmeňmi kvasníc boli buď FY1679 (MATa his3-A200 Ieu2-A1 trp1-A6 ura3-52) alebo W303-1A (MATa ADE2-1 can1-100 his3-11,15 Ieu2~3,112 trp1-1 ura3-1) (7). Kmeň FVKT00404C(AL) s poruchou YNR008w::KanMX2, ktorý je kongenický s FY1679, sa získal zo zbierky Euroscarf (8). 2751 bp fragment obsahujúci gén YNR008w s 583 bp 5' a 183 bp 3' priľahlej DNA bol amplifikovaný z W303-1A genomickej DNA pomocou Taq polymerázy s 5'-TCTCCATCTTCTGCAAAACCT-3' a 5'CCTGTCAAAAACCTTCTCCTC-3¹ ako primérmi. Získaný produkt PCR sa vyčistil elektroforézou v agarovom géle a klonoval sa do miesta EcoRV na pBluescript (pbluescript-pdat). Na komplementačné experimenty sa klonovaný fragment uvoľnil z pBluescript pomocou štiepenia s Hin<5\\\-Sac\ a potom sa klonoval medzi miestami Hind\l\ a Sací v pFL39 (9), čím sa generoval pUS1. Pre nadmernú expresiu génu PDAT sa klonoval 2202 bp EcoRI fragment z plazmidu pBluscript, ktorý obsahuje len 24 bp 5' priľahlej DNA do miesta BamHI na expresnom vektore GAL1-TPK2 pJN92 (12), čím sa generoval pUS4.

Mikrozomálne prípravky. Mikrozómy z rozvíjajúcich sa semien slnečnice (Helianthus annuus), Ricinus communis a Crepis palaestina boli pripravené pomocou postupu podľa Stobarta a Stymneho (11). Aby sa získali kvasnicové mikrozómy, 1 g kvasnicových buniek (hmotnosť v čerstvom stave) sa resuspendoval v 8 ml ľadovo studeného tlmivého roztoku (20 mM Tris-CI, pH 7,9, 10 mM MgCI₂, 1 mM EDTA, 5% objemových glycerol, 1 mM DTT, 0,3 M síran amónny) v 12 ml sklenej skúmavke. Do tejto skúmavky sa pridalo 4 ml sklených guliek (priemer 0,45 - 0,5 mm) a skúmavka sa potom intenzívne pretrepávala (3 x 60 s) v homogenizátore buniek MSK (B. Braun Melsungen AG, Nemecko). Homogenizovaná suspenzia sa centrifugovala pri 20 000 x g počas 15 min pri 6 °C a získaný supernatant sa znova centrifugoval pri 100 000 x g počas 2 h pri 6 °C. 100 000 x g peleta sa resuspendovala v 0,1 M fosforečnane draselnom (pH 7,2) a uložila sa pri -80 °C. Ďalej sa označuje ako surová kvasnicová mikrozomálna frakcia.

Lipidové substráty. Rádioaktívne označená kyselina ricínolejová (12hydroxy-9-oktadecénová) avernolová (12,13-epoxy-9-oktadecénová) sa syntetizovali enzymaticky z kyseliny [1 -¹⁴C]olejovej, resp. kyseliny [1-¹⁴C]linolovej inkubáciou s mikrozomálnymi prípravkami zo semien Ricinus communis, resp. Crepis palaestina (12). Syntéza fosfatidylcholínov (PC) alebo fosfatidyletanolamínov (PE) sacylovými skupinami označenými pomocou ¹⁴C v polohe sn-2 sa uskutočnila pomocou buď enzymatickej (13) alebo syntetickej (14) acylácie kyseliny [¹⁴C]olejovej, [¹⁴C]ricínolejovej alebo [¹⁴C]vernolovej. Dioleoyl-PC, ktorý bol označený v polohe sn-1, bol syntetizovaný z sn-1-[¹⁴C]oleoyl-lyzo-PC a neoznačenej kyseliny olejovej podľa popisu v (14). Sn-1-oleoyl-sn-2[¹⁴C]ricínoleoyl-DAG bol syntetizovaný z PC pôsobením fosfolipázy C typu XI z B. Cereus (Sigma Chemical Co.) podľa popisu v (15). Monovernoloyl- a divernoleoylDAG boli syntetizované z TAG extrahovaného zo semien Euphorbia lagascae, pomocou TAG-lipázy (Rizhopus arrhizus, Sigma Chemical Co.) podľa publikovaného popisu (16). Monoricínoleoyl-TAG bol syntetizovaný podľa toho istého postupu pomocou TAG extrahovaného z ricínového semena.

Analýza lipidov. Celkové lipidové zloženie kvasníc bolo určené z buniek odobraných zo 40 ml kvapalnej kultúry, rozbitých v trepačke so sklenenými guľkami a extrahovaných do chloroformu podľa popisu Bligha a Dyera (17), ktoré sa potom oddelili tenkovrstvovou chromatografiou v zmesi hexánu, dietyléteru a kyseliny octovej (80:20:1) pomocou hotových platničiek so silikagélom 60 (Merck). Oblasti lipidov boli lokalizované krátkym vystavením pôsobeniu pár l₂ a identifikované pomocou príslušných štandardov. Z platničiek sa vyrezali polárne lipidy, sterolové estery a triacylglyceroly, ako aj ostávajúce menšie lipidové triedy označované ako iné lipidy. Metylestery mastných kyselín boli pripravené zahrievaním suchého vyrezaného materiálu na 85 °C počas 60 min v 2 % (objem/objem) kyseline sírovej v suchom metanole. Metylestery boli extrahované hexánom a analyzované pomocou GLC cez 50 m x 0,32 mm kremennú kolónu CP-Wax58-CB (Chrompack) s kyselinou metylheptadekánovou ako interným štandardom. Obsah mastných kyselín v každej frakcii bol kvantifikovaný a použitý na výpočet relatívneho množstva každej lipidovej triedy. Aby sa určil celkový obsah lipidov, 3 ml alikvóty z kvasnicových kultúr sa oddelili centrifugovaním a získané pelety sa premyli destilovanou vodou a lyofilizovali. Hmotnosť vysušených buniek a obsah mastných kyselín sa kvantifikovali pomocou GLC analýz po konverzii na metylestery podľa vyššie uvedeného postupu. Obsah lipidov sa potom vypočítal v nmol mastných kyselín (FA-fatty acid) na mg suchej hmotnosti kvasníc.

Enzýmové skúšky. Alikvóty surových mikrozomálnych frakcií (zodpovedajúce 10 nmoi mikrozomálneho PC) z rozvíjajúcich sa rastlinných alebo kvasnicových buniek sa lyofilizovali cez noc. K vysušeným mikrozómom sa potom pridali substrátové lipidy označené pomocou ¹⁴C rozpustené v benzéne. Benzén sa odparil pod prúdom N₂, pričom lipidy ostali v priamom kontakte s membránami, a pridalo sa 0,1 ml 50 mM fosforečnanu draselného (pH 7,2). Suspenzia sa dôkladne pomiešala a inkubovala pri 30 °C v priebehu uvedeného času až do 90 min. Lipidy sa extrahovali z reakčnej zmesi pomocou chloroformu a oddelili sa tenkovrstvovou chromatografiou v zmesi hexánu, dietyléteru a kyseliny octovej (35:70:1,5) pomocou platničiek so silikagélom 60 (Merck). Rádioaktívne lipidy sa zviditeľnili a kvantifikovali na platničkách elektronickou autorádiografiou (Instant Imager, Packard, USA).

Kultivácia kvasníc. Bunky kvasníc sa kultivovali pri 28 °C na rotačnej trepačke v kvapalnom médiu YPD (1 % extraktu kvasníc, 2 % peptónu, 2 % glukózy), v syntetickom médiu (18) obsahujúcom 2% (objem/objem) glycerolu a 2 % (objem/objem) etanolu, alebo v minimálnom médiu (19) obsahujúcom 16 g/l glycerolu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predložený vynález je ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré neobmedzujú jeho rozsah:

Syntéza TAG nezávislá od Acyl-CoA mikrozómami olejnatých semien.

V olejnatých semenách možno nájsť veľký počet vzácnych mastných kyselín (20). Mnohé z týchto kyselín, napríklad kyselina ricínolejová (21) avernolová (22), sa syntetizujú pomocou fosfatidylcholínu (PC) s oleoylovými alebo linoleoylovými skupinami esterifikovanými v polohe sn-2 ako bezprostredným prekurzorom. Hoci však PC môže byť substrátom pre syntézu vzácnych mastných kyselín a je významným membránovým lipidom v semenách, vzácne mastné kyseliny sa v membránach nachádzajú zriedka. Namiesto toho sú zabudované najmä do TAG.

V olejnatých semenách, ktoré akumulujú také vzácne mastné kyseliny, musí preto existovať mechanizmus účinného a selektívneho transferu týchto vzácnych acylových skupín z PC na TAG. Táto reakcia transferu bola biochemický charakterizovaná v semenách z ricínu (Ricinus communis) a Crepis palaestina, teda rastlín, ktoré akumulujú vysoké hladiny kyseliny ricínolejovej, resp. vernolovej, a zo slnečnice (Helianthus annuus), teda rastliny, ktorá má vo svojom semenovom oleji len bežné mastné kyseliny. Surové mikrozomálne frakcie z rozvíjajúcich sa semien sa inkubovali s PC s oleoylovými, ricínoleoylovými alebo vernoloylovými skupinami označenými pomocou ¹⁴C v polohe sn-2. Po inkubácii sa lipidy extrahovali a analyzovali tenkovrstvovou chromatografiou. Zistili sme, že množstvo rádioaktivity, ktorá bola zabudovaná do neutrálnej lipidovej frakcie, stúpalo lineárne v priebehu 4 hodín (dáta nezobrazené). Distribúcia [¹⁴C]acylových skupín v rámci neutrálnej lipidovej frakcie sa analyzovala po 80 min (obrázok 1). Zaujímavé je, že množstvo a distribúcia rádioaktivity medzi rôznymi neutrálnymi lipidmi intenzívne záviseli od druhu rastliny a od typu [¹⁴Cjacylového reťazca. Slnečnicové mikrozómy zabudovali väčšinu značky do DAG bez ohľadu na typ [¹⁴C]acylovej skupiny. Naproti tomu mikrozómy R. communis prednostne zabudovávali [¹⁴C]ricínoleoylové a [¹⁴C]vernoloylové skupiny do TAG, zatiaľ čo [¹⁴C]oleylové skupiny sa našli väčšinou v DAG. Mikrozómy C. palaestina zabudovávali do TAG len [¹⁴C]vernolyolové skupiny, pričom [¹⁴C]ricínoleylové skupiny sa našli väčšinou ako voľné mastné kyseliny a [¹⁴C]oleylové skupiny v DAG. To ukazuje, že vysoké in vivo hladiny kyseliny ricínolejovej, resp. kyseliny vernolovej v TAG R. communis a

C. palaestina možno vysvetliť účinným a selektívnym transferom zodpovedajúcich acylových skupín z PC do TAG v týchto organizmoch.

In vitro syntéza triacylglycerolov v mikrozomálnych prípravkoch rozvíjajúcich sa ricínových semien je sumarizovaná v tabuľke 1.

PDAT: nový enzým, ktorý katalyzuje syntézu TAG nezávislú od acyl-CoA,

Skúmalo sa, či by DAG mohol slúžiť ako donor acylov a súčasne ako akceptor acylov v reakciách katalyzovaných mikrozómami olejnatých semien. Preto sa neoznačený divernoloyl-DAG inkuboval s sn-1-oleoyl-sn-2-[^l4C]ricinoleoyl-DAG alebo sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]ricínoleoyl-PC za prítomnosti mikrozómov R. communis. Syntéza molekúl TAG obsahujúcich [¹⁴C]ricínoleoylové aj vernoloylové skupiny bola 5 krát vyššia, keď [¹⁴C]ricínoleoyl-PC slúžil ako donor acylov v porovnaní s [¹⁴C]ricínoleoyl-DAG (obrázok 1B). Tieto údaje výrazne naznačujú, že PC je bezprostredným donorom acylov a DAG je akceptorom acylov v tvorbe TAG nezávislej od acyl-CoA mikrozómami olejnatých semien. Táto reakcia je teda katalyzovaná novým enzýmom, ktorý nazývame fosfolipid : diacylglycerol acyltransferáza (PDAT).

Aktivita PDAT v kvasnicových mikrozómoch. Bunky kvasníc štandardného typu sa kultivovali za podmienok, pri ktorých sa indukuje syntéza TAG. Z týchto buniek sa pripravili mikrozomálne membrány a inkubovali sa s sn-2-[¹⁴C]ricínoleoyl-PC a DAG a analyzovali sa vzniknuté produkty označené ¹⁴C. Od PC odvodené [¹⁴C]ricínoleoylové skupiny v rámci neutrálnej lipidovej frakcie sa našli najmä vo voľných mastných kyselinách alebo TAG a tiež množstvo syntetizovaného TAG bolo závislé od množstva DAG, ktoré sa pridalo do reakcie (obrázok 2). In vitro syntéza TAG obsahujúceho ricínoleoylové a vernoloylové skupiny, čo je druh TAG nenachádzajúci sa in vivo, z exogénne pridaného sn-2[¹⁴C]ricínoleoyl-PC a neoznačeného vernoloyl-DAG (obrázok 2, dráha 3) jasne demonštruje existenciu syntézy TAG nezávislej od acyl-CoA zahŕňajúcej PC a DAG ako substráty v kvasnicových mikrozomálnych membránach. Vzhľadom na to môže byť syntéza TAG v kvasniciach katalyzovaná enzýmom podobným PDAT nachádzajúcej sa v rastlinách.

Gén kódujúci PDAT v kvasniciach

Gén v kvasnicovom genóme (YNR008w) je známy, ale nič nie je známe o funkcii YNR008w okrem toho, že gén nie je esenciálny pre rast za normálnych okolností. Mikrozomálne membrány boli pripravené z kvasnicového kmeňa FVKT004-04C(AL) (8), v ktorom bol tento gén s neznámou funkciou narušený. Aktivita PDAT v mikrozómoch bola určená pomocou PC s rádioaktívne označenými mastnými kyselinami v polohe sn-2. Zistilo sa, že táto aktivita úplne chýbala v narušenom kmeni (obrázok 2, dráha 4). Významné je, že aktivitu bolo možné čiastočne obnoviť prítomnosťou YNR008W na jedinom kópiovom plazmide pUS1 (obrázok 2, dráha 5). Navyše acylové skupiny fosfatidyletanolamínu (PE) sa účinne zabudovávali do TAG mikrozómami z kmeňa štandardného typu, zatiaľ čo v mutantnom kmeni sa nevyskytlo žiadne zabudovanie z tohto substrátu (údaje nezobrazené). To ukazuje, že YNR008w kóduje kvasnicovú PDAT, ktorá katalyzuje transfer acylovej skupiny z polohy sn-2 fosfolipidov na DAG, čím vzniká TAG. Treba poznamenať, že z rádioaktívneho PC sa netvorili žiadne estery cholesterolu, dokonca ani pri inkubáciách s pridanými ergosterolmi a rovnako množstvo rádioaktívnych voľných mastných kyselín tvorených z PC nebolo ovplyvnené narušením génu YNR008w (údaje nezobrazené). To demonštruje, že kvasnicová PDAT nemá aktivity syntézy cholesterolových esterov alebo fosfolipázové aktivity.

Zvýšený obsah TAG v bunkách kvasníc, ktoré nadmerne exprimujú PDAT.

Účinok nadmernej expresie génu kódujúceho PDAT bol študovaný transformovaním štandardného kmeňa kvasníc plazmidom pUS4, v ktorom sa gén exprimuje zgalaktózou indukovaného promótora GAL1:TPK2. Ako kontrola sa použili bunky obsahujúce prázdny expresný vektor. Bunky sa kultivovali v syntetickom glycerol-etanolovom médiu a expresia génu sa indukovala buď po 2 hodinách (skorá logaritmická fáza) alebo 25 hodín (stacionárna fáza) pridaním galaktózy. Bunky sa inkubovali ďalších 21 hodín, na čo sa oddelili a uskutočnili sa testy. Zistili sme, že nadmerná expresia PDAT nemala žiadny signifikantný účinok na rýchlosť rastu určenú optickou hustotou. Avšak celkový obsah lipidov meraný v pmol mastných kyselín na mg suchej hmotnosti kvasníc bol o 47 % (logaritmická fáza) alebo o 29 % (stacionárna fáza) vyšší u kmeňa nadmerne exprimujúceho PDAT ako v kontrole. Navyše obsah polárnych lipidov a sterolesterov nebol nadmernou expresiou PDAT ovplyvnený. Namiesto toho bol zvýšený obsah lipidov v týchto bunkách výlučne spôsobený zvýšeným obsahom TAG (obrázok 3A, B) Množstvo TAG bolo takto zvýšené dvakrát v bunkách nadmerne exprimujúcich PDAT v skorej logaritmickej fáze a o 40 % v stacionárnej fáze. Je zaujímavé, že signifikantné zvýšenie v obsahu TAG sa dosiahlo nadmernou expresiou PDAT dokonca za podmienok (t.j. v stacionárnej fáze), kde sa indukuje DAGAT a tým signifikantné prispieva k syntéze TAG. Aktivita PDAT in vitro hodnotená v mikrozómoch z kmeňa nadmerne exprimujúceho PDAT bola 7-násobne vyššia ako v kontrolnom kmeni, čo je zistenie, ktoré je konzistentné so zvýšenými hladinami TAG, ktoré sme pozorovali in vivo (obrázok 3C). Tieto výsledky jasne demonštrujú potenciálne použitie génu PDAT pri zvyšovaní obsahu oleja v transgénnych organizmoch.

Substrátová špecifickosť PDAT z kvasníc. Substrátová špecifickosť kvasnicovej PDAT bola analyzovaná pomocou mikrozómov pripravených z kmeňa nadmerne exprimujúceho PDAT (pozrite obrázok 4). Rýchlosť syntézy TAG za podmienok daných v obrázku 4 s di-oleoyl-PC ako donorom acylov bola 0,15 nmol za minútu a mg proteínu. S oboma oleoylovými skupinami PC označenými bolo možné za daných analytických podmienok zistiť transfer 11 pmol/min [¹⁴C]oleoylového reťazca do TAG a vznik 15 pmol/min lyzo-PC. V mikrozómoch z reťazca chudobného na PDAT sa nezistil vôbec žiadny TAG a len stopové množstvá lyzo-PC, čo výrazne naznačuje, že kvasnicová PDAT katalyzuje vznik ekvimolárnych množstiev TAG a lyzo-PC pri zásobovaní PC a DAG ako substrátmi. Skutočnosť, že vzniká o niečo viac lyzo-PC ako TAG, možno vysvetliť prítomnosťou fosfolipázy v kvasnicových mikrozómoch, ktorá produkuje lyzo-PC a neesterifikované mastné kyseliny z PC.

Špecifickosť kvasnicovej PDAT pre rôzne polohy acylových skupín sa skúmala inkubáciou mikrozómov s di-oleoyl-PC nesúcim [¹⁴C]acylovú skupinu buď v polohe sn-1 (obrázok 4A, stĺpec 2) alebo v polohe sn-2 (obrázok 4A, stĺpec 3). Zistili sme, že významný produkt označený pomocou ¹⁴C vzniknutý v prvom prípade bol lyzo-PC a v druhom prípade TAG. Konštatujeme, že kvasnicová PDAT má špecifickosť pre transfer acylových skupín z polohy sn-2 fosfolipidu na DAG, čím vzniká sn-1-lyzo-PC a TAG. Za daných analytických podmienok vznikajú stopové množstvá DAG označeného ¹⁴C z PC označeného v polohe sn-1 reverzibilným pôsobením CDP-cholín : cholín fosfotransferázy. Tento označený DAG sa potom môže ďalej konvertovať na TAG aktivitou PDAT. Preto nie je možné rozlíšiť, či sa malé množstvá označeného TAG, ktorý vzniká za prítomnosti dioleoyl-PC nesúceho [¹⁴Cjacylovú skupinu v polohe sn-1, syntetizujú priamo z PC označeného v polohe sn-1 pomocou PDAT, ktorá môže pôsobiť aj na polohu sn-1, alebo či sa najprv konvertuje na DAG označený v polohe sn-1 a potom sa acyluje pomocou PDAT s prísnou selektivitou na transfer acylových skupín v polohe sn-2 PC. S prihliadnutím na uvedené sa ukazuje, že PDAT kódovaná génom YNR008w katalyzuje transfer acylu z polohy sn-2 v PC na DAG, čím spôsobuje tvorbu TAG a lyzo-PC.

Substrátová špecifickosť kvasnicovej PDAT sa ďalej analyzovala vzhľadom na hlavovú skupinu acylového donora, prenesenú acylovú skupinu aacylové reťazce akceptorovej molekuly DAG. Dva významné membránové lipidy S. cerevisiae sú PC a PE a ako ukazuje obrázok 4B (stĺpce 1 a 2), dioleoyl-PE je takmer 4-násobne účinnejší ako dioleoyl-PC ako donor acylov v reakcii katalyzovanej pomocou PDAT. Navyše rýchlosť prenosu acylu výrazne závisí od typu acylovej skupiny, ktorá sa prenáša. Ricínoleoylová skupina v polohe sn-2 v PC je teda 2,5 krát účinnejšie prenášaná na TAG ako oleoylová skupina v tej istej polohe (obrázok 4B, stĺpce 1 a 3). Naproti tomu kvasnicová PDAT nemá žiadnu preferenciu pre transfer vernoloylových skupín oproti oleoylovým skupinám (obrázok 4B, stĺpce 1 a 4). Acylový reťazec akceptorovej molekuly DAG tiež ovplyvňuje účinnosť reakcie. DAG s ricínoleoylovou alebo vernoloylovou skupinou je teda účinnejším akceptorom acylov ako dioleoyl-DAG (obrázok 4B, stĺpce 1,5a 6). Vzhľadom na uvedené tieto výsledky jasne ukazujú, že účinnosť transferu acylu katalyzovaného pomocou PDAT výrazne závisí od vlastností substrátových lipidov.

Gény PDAT. Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie niekoľkých génov PDAT sú uvedené ako sekvencia č. 1 až 15. Ďalšie provizórne a/alebo čiastočné sekvencie sú dané ako sekvencia č. 16 až 20 a 21 až 31. Jedna zgenomických sekvencii Arabidopsis (sekvencia č. 4) identifikovala kloň cDNA Arabidopsis EST;

Τ04806. Tento kloň cDNA bol plne charakterizovaný a nukleotidová sekvencia je daná ako sekvencia č. 5. Na základe sekvenčnej homológie sekvencie cDNA T04806 a genomickej DNA Arabidopsis thaliana (sekvencia č. 4) je zrejmé, že v pozícii 417 vklone cDNA je prítomné ďalšie A (dáta nezobrazené). Vylúčením tohto nukleotidu by sa získala aminokyselinová sekvencia zobrazená ako sekvencia č. 12.

Zvýšený obsah TAG v semenách Arabidopsis thaliana, ktoré exprimujú kvasnicovú PDAT. Aby sa exprimoval kvasnicový gén PDAT v Arabidopsis thaliana, fragment EcoRI z pBluescript-PDAT bol klonovaný spolu s napin promótorom (25) do vektora pGPTV-KAN (26). Plazmid (pGNapPDAT) majúci kvasnicový gén PDAT v správnej orientácii bol identifikovaný a transformovaný do Agrobacterium tumefaciens. Tieto baktérie sa použili na transformáciu rastlín Arabidopsis thaliana Columbia (C-24) pomocou metódy transformácie koreňov (27). Ako kontroly sa použili rastliny transformované prázdnym vektorom.

Zozbierali sa semená prvej generácie (T1) a nechali sa vyklíčiť na médiu obsahujúcom kanamycín. Semená druhej generácie (T2) sa zhromaždili z jednotlivých rastlín a ich obsah mastných kyselín sa analyzoval kvantifikáciou ich metylesterov plynovo-kvapalinovou chromatografiou po metylácii semien 2 % kyselinou sírovou v metanole pri 85 °C v priebehu 1,5 hodiny. Kvantifikácia sa uskutočnila pomocou metylesterov heptadekánovej kyseliny ako interného štandardu.

Z transformácie s pGNapPDAT sa z jednej T1 rastliny (26-14) získalo sedem T2 rastlín, z ktorých 3 rastliny zarodili semená so štatisticky (v dvojstrannom teste stredného rozdielu) vyšším obsahom oleja ako semená z T2 rastlín generovaných z T1 rastliny 32-4 transformovanej prázdnym vektorom (tabuľka 2).

Odkazy na literatúru citované v popise:

1. Bell, R. M. & Coleman, R. A. (1980) Annu. Rev. Biochem. 49, 459-487.

2. Stymne, S. & Stobart, K. (1987) in The biochemistry ofplants: a comprehensive treatsie, zv. 9, red. Stumpf, P. K. (Academic Press, New York), s. 175-214.

3. Cases, S. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13018-13023.

4. Hobbs, D. H., Lu, C. & Hills, M. J. (1999) FESS Letí. 452, 145-9

5. Zou, J., Wei, Y., Jako, C., Kumar, A., Selvaraj, G. & Taylor, D. C. (1999) Plánt J. 19, 645-653.

6. Lardizabal, K., Hawkins, D., Mai, J., & Wagner, N. (1999) Abstrakt prezentovaný na sympóziu „Biochem. Mol. Plánt Fatty Acids Glycerolipids Symposium“, South Lake Tahoe, USA.

7. Thomas, B. J. & Rothstein, R. (1989) Celí 56, 619-630.

8. Entian, K.-D. & Kotter, P. (1998) Meth. Microbiol. 26, 431-449.

9. Kern, L., de Montigny, J., Jund, R. & Lacroute, F. (1990) Gene 88,149-157.

10. Ronne, H., Carlberg, M., Hu, G.-Z. & Nehlin, J. O. (1991) Mol. Celí. Biol. 11, 4876-4884.

11. Stobart, K. & Stymne, S. (1990) in Method in Plánt Biochemistry, zv. 4, red. Harwood, J. L. & Bowyer, J. R. (Academic press, London), s. 19-46.

12. Bafor, M., Smith, M. A., Jonsson, L., Stobrt, A. K. & Stymne, S. (1991) Biochem. J. 280, 507-514.

13. Banas, A., Johansson, I. & Stymne, S. (1992) Plánt Science 84,137-144.

14. Kanda, P. & Wells, M. A. (1981) J. Lipid. Res. 22, 877-879.

15. Stahl, U., Ek, B. & Stymne, S. (1998) Plánt Physiol. 117,197-205.

16. Stobart, K., Mancha, M. & Lenman M, Dahlqvist, A. & Stymne, S. (1997) Planta 203, 58-66.

17. Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917.

18. Sherman, F., Fink, G. R. & Hicks, J. B. (1986) in Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genentics (Cold Spring Harbor Laboratory)

19. Meesters, P. A. E. P., Huijberts, G. N. M. and Eggink, G. (1996,) Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 575-579.

20. van de Loo, F. J., Fox, B. G. & Sommerville, C. (1993), in Lipid metabolism in plants, ed. Moore, T. S. (CRC Press, Inc.), s. 91-126.

21. van de Loo, F. J., Broun, P., Turner, S. & Sommerviiie, S. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6743-6747.

22. Lee, M., Lenman, M., Banas, A., Bafor, M., Singh, S., Schweizer, M., Nilsson, R., Liljenberg, C., Dahlqvist, A., Gummeson, P-O., Sjodahl, S., Green, A., a Stymne, S. (1998) Science 280, 915-918.

23. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. & Higgins, D. G. (1997) Nucl. Acids Res. 24, 4876-4882.

24. Saitou, N. & Nei, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.

25. Stalberg, K., Ellerstrom, M., Josefsson, L., & Rask, L. (1993) Plánt Mol. Biol. 23, 671

26. Becker, D., Kemper, E., Schell, J., Masterson, R. (1992) Plánt Mol. Biol. 20, 1195

27. D. Valvekens, M. Van Montagu, and Van Lusbettens (1988) Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 85, 5536

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1

Metabolizmus PC označeného pomocou ¹⁴C do neutrálnej lipidovei frakcie rastlinnými mikrozómami. (A) Mikrozómy z rozvíjajúcich sa semien slnečnice, R. communis a C. palaestina, sa inkubovali 80 min pri 30 °C s PC (8 nmol) s kyselinou olejovou v polohe sn-1 a buď kyselinou olejovou, ricínolejovou alebo vernolovou označenou pomocou ¹⁴C v polohe sn-2. Rádioaktivita zabudovaná do TAG (prázdne stĺpce), DAG (plné stĺpce) a neesterifikované mastné kyseliny (štvorčekované stĺpce) sa kvantif i kovala pomocou tenkovrstvovej chromatografie nasledovanej elektronickou autorádiografiou a je zobrazená ako percento pridaného označeného substrátu. (B) Syntéza in vitro TAG majúceho dve vernoloylové a jednu [¹⁴C]ricínoleoylovú skupinu mikrozómami z R. communis. Pridanými substrátmi bol neoznačený divernoloyl-DAG (5 nmol) spolu s buď sn-1 oleoyl-sn-2-[¹⁴C]ricínoleoyl-DAG (0,4 nmol, 7700 dpm/nmol) alebo sn-1-oleoyl-sn-2[¹⁴CJricínoleoyl-PC (0,4 nmol, 7700 dpm/nmol). Mikrozómy sa inkubovali so substrátmi počas 30 min pri 30 °C, na čo sa odobrali vzorky na analýzu lipidov podľa popisu v časti „všeobecné metódy“. Zobrazené dáta sú priemermi dvoch experimentov.

Obrázok 2

Aktivita PDAT v kvasnicových mikrozómoch vizualizovaná autorádioqrámom neutrálnych lipidových produktov separovaných na TLC. Mikrozomálne membrány (10 nmol PC) z kongenického kmeňa kvasníc (FVKT004-04C(AL)), ktorý má narušený gén YNR008w (dráha 4), alebo ten istý narušený kmeň transformovaný plazmidom pUS1 obsahujúci gén YNR008W za svojím natívnym promótorom (dráha 5), sa analyzovali na aktivitu PDAT. Ako substráty sme použili 2 nmol sn-1oleoyl-sn-2-[¹⁴C]ricínoleoyl-PC spolu s buď 5 nmol dioleoyl-DAG (dráhy 2, 4 a 5) alebo rac-oleoyl-vernoleoyl-DAG (dráha 3). Enzymatické analýza a lipidová analýza sa uskutočnila podľa popisu v časti „Materiály a metódy“. Bunky sa predkultivovali počas 20 h v kvapalnom médiu YPD, oddelili a resuspendovali v rovnakom objeme minimálneho média (19) obsahujúceho 16 g/l glycerolu. Bunky sa potom kultivovali ďalších 24 h a potom sa oddelili. Selekcia na plazmid sa udržiavala kultivovaním transformovaných buniek v syntetickom médiu bez uracilu (18). Skratky: 1-OHTAG, monoricínoleoyl-TAG; 1-OH-l-ep-TAG, monoricínoleoyl-monovernoloyl-TAG; OH-FA, neesterifikovaná ricínolejová kyselina.

Obrázok 3

Obsah lipidov (A, B) a aktivita PDAT (C) v bunkách kvasníc nadmerne exprimujúcich PDAT. Gén PDAT v plazmide pUS4 bol nadmerne exprimovaný zgalaktózou indukovaného promótora GAL1-TPK2 v kmeni štandardného typu W303-1A (7). Jeho expresia bola indukovaná po (A) 2 hodinách alebo (B) 25 hodinách kultivácie pridaním 2 % konečnej koncentrácie (hmotnosť/objem) galaktózy. Bunky sa potom inkubovali ďalších 22 hodín a oddelili sa. Množstvo lipidov v oddelených bunkách sa určilo GĽC analýzou obsahu mastných kyselín a je prezentované v μπιοΙ mastných kyselín na mg suchej hmotnosti buď vTAG (prázdny stĺpec), polárnych lipidoch (štvorčekovaný stĺpec), sterolových esteroch (plný stĺpec) alebo iných lipidoch (šrafovaný stĺpec). Zobrazené dáta sú stredné hodnoty výsledkov s troma nezávislými kultúrami kvasníc. (C) In vitro syntéza TAG mikrozómami pripravenými z kvasnicových buniek obsahujúcich buď prázdny vektor (vektor) alebo plazmid PDAT (+ PDAT). Bunky boli kultivované ako na obrázku 3A. Substrátové lipidy dioleoyl-DAG (2,5 nmol) a sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]oleoyl-PC (2 nmol) sa pridali do alikvótov mikrozómov (10 nmol PC), ktoré sa potom inkubovali 10 min pri 28 °C. Množstvo značky zabudované do TAG sa kvantif i kovalo elektronickou autorádiografiou. Zobrazené výsledky sú priemernými hodnotami z dvoch experimentov.

Obrázok 4

Substrátová špecifickosť PDAT z kvasníc. Aktivita PDAT sa testovala inkubovaním alikvótov lyofilizovaných mikrozómov (10 nmol PC) so substrátovými lipidmi pri 30 °C počas 10 min (panel A) alebo 90 min (panel B). Ako substrát sa použil neoznačený DAG (2,5 nmol) spolu s rôznymi označenými fosfolipidmi, ako je uvedené na obrázku. (A) Špecifickosť vzhľadom na sn-polohu kvasnicovej PDAT vzhľadom na substrát - donor acylu. Dioleoyl-DAG spolu s buď sn-1-[¹⁴C]oleoyl-sn2-[¹⁴C]oleoyl-PC (di-[¹⁴C]-PC), sn-1-[¹⁴C]oleoyl-sn-2-oleoyl-PC (sn-[¹⁴C]-PC) alebo sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]oleoyl-PC (sn2-[¹⁴C]-PC). (B) Špecifickosť kvasnicovej PDAT vzhľadom na fosfolipidovú hlavovú skupinu a acylové zloženie fosfolipidu ako aj diacylglycerolu. Dioleoyl-DAG spolu s buď sn-1 -oleoyl-sn-2-[¹⁴C]oleoyl-PC (oleoylPC), sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]oleoyl-PE (oleoyl-PE), sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]ricinoleoylPC (ricinoleoyl-PC) alebo sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]vernoloyl-PC (vernoloyl-PC). V experimentoch prezentovaných na 2 stĺpcoch celkom vpravo sa použil monoricínoleoyl-DAG (ricínoleoyl-DAG) alebo mono-vernoloyl-DAG (vernoloylDAG) spolu s sn-1-oleoyl-sn-2-[¹⁴C]-oleoyl-PC. Značka, ktorá bola zabudovaná do TAG (plné stĺpce) a lyzo-PC (LPC, prázdne stĺpce), sa kvantifikovala pomocou elektronickej autorádiografie. Zobrazené výsledky sú priemernými hodnotami z dvoch experimentov. Použité mikrozómy pochádzali z buniek W303-1A nadmerne exprimujúcich gén PDAT z promótora GAĽ1-TPK2, ako je popísané na obrázku 3. Expresia sa indukovala v skorej stacionárnej fáze a bunky sa oddelili po ďalších 24 hodinách.

Tabuľka 1:

In vitro syntéza triacylqlycerolov v mikrozomálnych prípravkov rozvíjajúceho sa ricínu. Alikvóty mikrozómov (20 nmol PC) sa lyofilizovali a pridali sa substrátové lipidy v benzénovom roztoku: (A) 0,4 nmol [¹⁴C]-DAG (7760 dpm/nmol) a kde je uvedené, 1,6 nmol neoznačeného DAG; (B) 0,4 nmol [¹⁴C]-DAG (7760 dpm/nmol) a 5 nmol neoznačeného di-ricínoleoyl-PC a (C) 0,25 nmol [¹⁴C]-PC (4000 dpm/nmol) a 5 nmol neoznačeného DAG. Benzén sa odparil pomocou N₂ a pridalo sa 0,1 ml 50 mM fosforečnanu draselného, zmes sa dôkladne zamiešala a inkubovala pri 30 °C (A) 20 min; (B) a (C) 30 min. Testy sa ukončili extrakciou lipidov v chloroforme. Lipidy sa potom oddelili tenkovrstvovou chromatografiou na platničkách so silikagélom 60 (Merck; Darmstadt, Nemecko) v zmesi hexán, dietyléter, kyselina octová 35:70:1,5. Rádioaktívne lipidy sa vizualizovali a rádioaktivita sa kvantifikovala na platničke elektronickou autorádiografiou (Instant Imager, Packard, USA). Výsledky sú prezentované ako priemerné hodnoty z dvoch experimentov.

Rádioaktivita v rôznych vytvorených triacylglyceroloch (TAG). Použité skratky: 1-OH-, mono-ricínoleoyl-; 2-OH, di-ricínoleoyl-; 3-OH-, triricínoleoyl; 1-OH1-ver-, mono-ricínoleoly-monovernoleoyl-; 1-OH-2-ver-, mono-ricínoleoyldivernoleoyl-. Rádioaktívne označený DAG a PC boli pripravené enzymaticky. Rádioaktívne označená ricínoleylová skupina je pripojená v polohe sn-2 lipidu a neoznačená oleoylová skupina v polohe sn-1. Neoznačený DAG s vernoleoylovými alebo ricínoleoylovými reťazcami boli pripravené pôsobením TAG lipázy (6) na olej Euphorbia lagascae alebo ricín. Syntetický di-ricínoleoyl-PC láskavo poskytla firma Metapontum Agribios (Taliansko).

Tabuľka 2

Celkové mastné kyseliny na mg T2 semien zhromaždených z individuálnych rastlín Arabidopsis thaliana transformovaných kvasnicovým génom PDAT pod kontrolou napin promótora (26-14) alebo transformované prázdnym vektorom (324).

* = štatistický rozdiel medzi kontrolnými rastlinami a rastlinami transformovanými pomocou PDAT v dvojstrannom teste stredného rozdielu pri a =

5.

Popis označení sekvencii:

Sekvencia č. 1: Genomická DNA sekvencia a navrhovaná aminokyselinová sekvencia génu PDAT Saccharomyces cerevisiae, YNR008w, s prírastkovým číslom GenBank Z71623 a Y13139 a s identifikačným číslom nukleotidu 1302481.

Sekvencia č. 2: Aminokyselinová sekvencia navrhovaného otvoreného čítacieho rámca YNR008w zo Saccharomyces cerevisiae.

Sekvencia č. 3: Genomická DNA sekvencia génu Schizosaccharomyces pombe SPBC776.14.

Sekvencia č. 4: Genomická DNA sekvencia časti lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GenBank AB006704.

Sekvencia č. 5: Nukleotidová sekvencia klonu cDNA Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GenBank T04806 a identifikačným číslom nukleotidu 315966.

Sekvencia č. 6: Predikovaná aminokyselinová sekvencia klonu cDNA Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GenBank T04806.

Sekvencia č. 7: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia klonu cDNA Zea mays s prírastkovým číslom GenBank AI491339 a identifikačným číslom nukleotidu 4388167.

Sekvencia č. 8: Predikovaná aminokyselinová sekvencia klonu cDNA Zea mays s prírastkovým číslom GenBank AI491339 a identifikačným číslom nukleotidu 4388167.

Sekvencia č. 9: DNA sekvencia časti klonu W07G tNeurospora crassa EST s prírastkovým číslom GenBank AI398644 a identifikačným číslom nukleotidu 4241729.

Sekvencia č. 10: Genomická DNA sekvencia časti lokusu Arabidopsis thaliana, prírastkové číslo AC004557.

Sekvencia č. 11: Genomická DNA sekvencia časti lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GenBank AC003027.

Sekvencia č. 12: DNA sekvencia časti klonu cDNA Lycopersicon esculentum s prírastkovým číslom GenBank AI486635.

Sekvencia č. 13: Aminokyselinová sekvencia putatívneho otvoreného čítacieho rámca CAA22887 génu Schizosaccharomyces pombe SPBC776.14.

Sekvencia č. 14: Aminokyselinová sekvencia putatívneho otvoreného rámca

AAC80628 Arabidopsis thaliana odvodená od lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GenBank AC004557.

Sekvencia č. 15: Aminokyselinová sekvencia putatívneho otvoreného rámca AAD10668 Arabidopsis thaliana odvodená od lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GenBank AC003027.

Ďalšie provizórne a/alebo čiastočné sekvencie sú definované cez nasledujúce čísla sekvencií:

Sekvencia č. 16: Aminokyselinová sekvencia kvasnicového ORF YNR008w zo Saccharomyces cerevisiae.

Sekvencia č. 17: Aminokyselinová sekvencia regiónu genomickej sekvencie Arabidopsis thaliana (AC0Q4557).

Sekvencia č. 18: Aminokyselinová sekvencia regiónu genomickej sekvencie Arabidopsis thaliana (AB006704).

Sekvencia č. 19: Zodpovedajúca genomická DNA sekvencia a aminokyselinová sekvencia kvasnicového ORF YNR008w zo Saccharomyces cerevisiae.

Sekvencia č. 20: Aminokyselinová sekvencia kvasnicového ORF YNR008w zo Saccharomyces cerevisiae odvodená od zodpovedajúcej DNA sekvencie.

Sekvencia č. 21: Genomická DNA sekvencia génu PDAT Saccharomyces cerevisiae, YNR008w, identifikačné číslo nukleotidu GeneBank 1302481, a navrhovaná aminokyselinová sekvencia YNR008w.

Sekvencia č. 22: Navrhovaná aminokyselinová sekvencia kvasnicového génu YNR008w zo Saccharomyces cerevisiae.

Sekvencia č. 23: Genomická DNA sekvencia génu Schizosaccharomyces pombe SPBC776.14.

Sekvencia č. 24: Génomická DNA sekvencia časti lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GeneBank AB006704.

Sekvencia č. 25: Nukleotidová sekvencia a zodpovedajúca aminokyselinová sekvencia klonu EST Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GeneBank T04806 a identifikačným číslom nukleotidu 315966.

Sekvencia č. 26: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia klonu cDNA Zea mays s identifikačným číslom GeneBank 4388167.

Sekvencia č. 27: Aminokyselinová sekvencia klonu cDNA Zea mays s identifikačným číslom GeneBank 4388167.

Sekvencia č. 28: DNA sekvencia časti klonu cDNA Neurospora crassa W07G1, identifikačné číslo 4241729.

Sekvencia č. 29: Génomická DNA sekvencia časti lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GeneBank AC004557.

Sekvencia č. 30: Génomická DNA sekvencia časti lokusu Arabidopsis thaliana s prírastkovým číslom GeneBank AC003027.

Sekvencia č. 31: DNA sekvencia časti klonu cDNA Lycopersicon esculentum s prírastkovým číslom GeneBank AI486635.

Claims (58)

1. Enzým katalyzujúci v reakcii nezávislej od acyl-CoA transfer mastných kyselín z fosfolipidov na diacylglycerol v biosyntetickej dráhe na produkciu triacyiglycerolu.

2. Enzým podľa nároku 1 obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekvencii č. 2 alebo jej funkčný fragment, derivát, alelu, homológ alebo izoenzým.

3. Enzým podľa nárokov 1 alebo 2 označený ako fosfolipid:diacylglycerol acyltransferáza (PDAT).

4. Enzým podľa nárokov 1 až 3 obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu definovanú v sekvencii č. 16, 20 alebo 22 alebo jej funkčný fragment, derivát, alelu, homológ alebo izoenzým.

5. Enzým podľa nárokov 1 až 4 obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 6, 8, 13, 14, 17, 18, 25 alebo 27 alebo jej funkčný fragment, derivát, alelu, homológ alebo izoenzým.

6. Enzým podľa nárokov 1 až 5 obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu kódovanú cez nukleotidovú sekvenciu, jej časť, derivát, alelu alebo homológ, vybranú zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii č. 1,3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 alebo 31 alebo funkčného fragmentu, derivátu, alely, homológu alebo izoenzýmu aminokyselinovej sekvencie kódujúcej tento enzým.

7. Nukleotidová sekvencia kódujúca enzým katalyzujúci v reakcii nezávislej od acyl-CoA transfer mastných kyselín z fosfolipidov na diacylglycerol v biosyntetickej dráhe na produkciu triacyiglycerolu.

8. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 7 kódujúca enzým označený ako fosfolipid:diacylglycerol acyltransferáza (PDAT).

9. Nukleotidová sekvencia podľa nárokov 7 alebo 8 vybraná zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 1, 3, 4, 10, 11, 19, 21,23, 24, 29 alebo 30 alebo jej časť, derivát, alela alebo homológ.

10. Čiastočná nukleotidová sekvencia zodpovedajúca nukleotídovej sekvencii plnej dĺžky podľa nárokov 7 až 9 vybranej zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 5, 7, 9,12, 25, 26, 28 alebo 31 alebo jej časť, derivát, alela alebo homológ.

11. Nukleotidová sekvencia podľa nárokov 7 až 10 obsahujúca nukleotídovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 40 % homologická s nukleotídovou sekvenciou vybranou zo skupiny pozostávajúcej zo sekvencii definovaných v sekvencii č. 1,3, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 19, 21,23, 24, 25, 26, 28, 29, 30 alebo 31.

12. Génový konštrukt obsahujúci nukleotídovú sekvenciu podľa nárokov 7 až 11 funkčne pripojenú na heterológnu nukleovú kyselinu.

13. Vektor obsahujúci nukleotídovú sekvenciu podľa nárokov 7 až 11 alebo génový konštrukt podľa nároku 12.

14. Vektor podľa nároku 13, ktorý je expresným vektorom.

15. Vektor podľa nárokov 13 alebo 14 ďalej obsahujúci vyberateľný markerový gén a/alebo nukleotidové sekvencie pre replikáciu v hostiteľskej bunke alebo integráciu do genómu hostiteľskej bunky.

16. Transgenická bunka alebo organizmus obsahujúci nukleotídovú sekvenciu podľa nárokov 7 až 11 a/alebo génový konštrukt podľa nároku 12 a/alebo vektor podľa nárokov 13 až 15.

17. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nároku 16, ktoré sú eukaryotickou bunkou alebo organizmom.

18. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nárokov 16 alebo 17, ktorou je kvasnicová bunka alebo rastlinná bunka alebo rastlina.

19. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nároku 16 až 18 majúci zmenenú biosyntetickú dráhu na produkciu triacylglycerolu.

20. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nárokov 16 až 19 majúci zmenený obsah oleja.

21. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nárokov 16 až 20, kde je zmenená aktivita PDAT.

22. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nárokov 16 až 21, kde zmenená aktivita PDAT je charakterizovaná zmenou v génovej expresii, katalytickej aktivite a/alebo regulácii aktivity enzýmu.

23. Transgenická bunka alebo organizmus podľa nárokov 16 až 22, kde zmenená syntetická dráha na produkciu triacylglycerolu sa vyznačuje zabránením akumulácie nežiaducich mastných kyselín v membránových lipidoch.

24. Postup na výrobu triacylglycerolu zahŕňajúci pestovanie transgenickej bunky alebo organizmu podľa nárokov 16 až 23 za podmienok, pri ktorých sa exprimuje nukleotidová sekvencia podľa nárokov 7 až 11.

25. Triacylglyceroly vyrábané postupom podľa nároku 24.

26. Použitie nukleotídovej sekvencie podľa nárokov 7 až 11 a/alebo enzýmu podľa nárokov 1 až 6 na výrobu triacylglycerolu a/alebo triacylglycerolov so vzácnymi mastnými kyselinami.

27. Použitie nukleotídovej sekvencie podľa nárokov 7 až 11 a/alebo enzýmu podľa nárokov 1 až 6 na transformáciu akejkoľvek bunky alebo organizmu s cieľom expresie v tejto bunke alebo organizmu a získanie zmeneného, s výhodou zvýšeného obsahu oleja v tejto bunke alebo organizme.

Obr Ί x

X <o -a- cn o <?VJ- - Ι^ο/ΰνΜλ'[νοηουι?!·* A /Q '<*

O o CD .C < < < 43 CQ ί- Q LL <D α s Έ CD Q.

o

JK

O oo .«o

E ^3

E

E o

o q:

O

CO %>_/o °^O_S^ %

7θ, o

</<

C o<

^γ^ο.

C<-y ?x

CL,

Tfr (tpfitrvpjsí y₀) sfoih>& bľ?í><fu.pri(E x/6

Obr. 2.

1-OH-TAG

1-QH-1-ep-TAG

GH-FA

Obrí) μίτιοί FA / mg wMíh Lmwc vector + PDAT o o o o o ó ŕo ώ

J μ mol FA / mg sn/ýce iwm, o o o o bo ώ

-1-1-1--1 vector

S8SS8

CD + PDAT

5- ω m s:

i

s.

(pmol/min)

Ý/6

Obr. ý o_

CD

O i

O

O

Tabuľka 1

0 < H ± O h- O cn LO 'ť CO có 1 1 1 1 in T“ cn ľ có 0 < h- k- o > CM ± O OJ LO xŕ 1 1 t- 1 1 1 1 1 o oo 0 < H k- ω > i 0,9 O 1 CO ΙΌ V T— 1 T“ o 1 1 1 1 1 T— t— 0 < H -OH -r- CO N. LO 00 cm cm O ’tf q CO co ’φ T— o CM T“ t— T— CM có ÓJ t— cn t— V““ 0 < H Ž O CO CM CO 00 CO_ LO o r- cm CO O co CO LO co co 0 0 0 0 < < < < c\? Q Q 1 0 Q 0 Q 1 0 tj >. < O >s < >» < 0 < o. '>, oleo oleo Q 1 >> 0. 1 0 < o ω o yl-D oleo Q 1 >> I— c . CD >O co c CZ o Φ noleo Q CZ noleo CZ noleo > c o ’k- 1 ΙΘΛ- ô c 1 >. o -ricí -vei kup neozr ono ono Q > 1 o u c TJ co CD o ono O *k_ ono -ver Ui E E TJ Ť5^- >N E Ό E tj o '$· 0 0 0 0 o CL < < < < O O O O O o cyl l-D l-D l-D l-D CL l-P yl-P l-P l-P l-P CO >> >, >. >. >. >» >. 1 I—1 o o o o O o o o o o b o CD (D (D (D (D CD CD (D CD (D v . O O O O O O O o O o *—’ .C c C C C C C c C JZ -C 'CO 32 O o O o O _O o 32 4—* W xa 1 1 1 k_ 1 1 1 1 1 1 1 c CO b' b' b' b' b b' b' o b' b ZJ TJ· ’J· 'Ť ’k_ (ZJ 1 1 1 z_. T-u ‘T“' u__, Z-J •“T“* CL '>. o o o o o o o o o o CZ CZ c c CZ c c CZ c c c 0^ CO o o o o o o o o o o ô TJ E E E E E E E E E E E Q < < < < CQ O O O O O

6/6

Tabuľka 2

Rastlina T1 Číslo rastliny T2 nmol mastných kyselín na mg semena štandardná odchýlka 32-4 1 1277 ±11 (n=2) 4 1261 ±63 (n=3) 5 1369 ±17 (n=3) 6 1312 ±53 (n=4) 7 1197 ±54 (n=5) 8 1240 ±78 (n=4) 9 1283 ±54 (n=5) 10 1381 ±35 (n=5) 26-14 1 1444 ±110 (n=4) 2 1617* ±109 (n=4) 3 1374 ±37 (n=2) 5 1562* ±70 (n=4) 6 1393 ±77 (n=4) 7 1433 ±98 (n=4) 8 1581* +82 (n=4)

1/58

Zoznam sekvencii <110> BASF AG <!20>Nová trieda enzýmov v biosyntetickej dráhe pre produkciu triacylglycerolu a rekombinantné molekuly DNA kódujúce tieto enzýmy.

<130> BASF-NAE-3377-99-Sept-2000 <140> PCT/EP 00/02701 <141> 2000-03-23 <160> 31 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1986 <212> genomic DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220>

<221> CDS <222> (1)..(1983) <400> 1

atg Met 1 ggc Gly aca Thr ctg Leu ttt Phe 5 ega Arg aga aat gtc Val cag C-ln 10 aac Asn caa aag agt gat Asp 15 tet Ser 48 Arg Asn Gin Lys Ser gat gaa aac S3t aaa ggg ggt tet gtt cat aac aag ega gsg age aga 96 Asp Glu Asn Asn 20 Lys Gly Gly Ser Val 25 His Asn Lys Arg Glu 30 Ser Arg aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat aag aga aga agg ggt 144 Asn His íle 35 His His Gin Gin Gly 40 Leu Gly His Lys Arg 45 Arg Arg Gly att agt ggc agt gca aaa 303 aat gag cgt ggc 3 3 ä gat ttc gac agg 192 íle Ser ' 50 Gly Ser Ala Lys Arg 55 Asn Glu Arg Gly Lys 60 Asp Phe Asp Arg aaa aga gac ggg aac ggt aga aaa cgt tgg aga gat tcc aga aga ctg 240 Lys 65 Arg Asp Gly Asn Gly 70 Arg Lys Arg Trp Arg 75 Asp Ser Arg Arg Leu 80 att ttc att ctt ggt gca ttc tta ggt gta ctt ttg ccg ttt age ttt 288 íle Phe íle Leu Gly 85 Ala Phe Leu Gly Val 90 Leu Leu Pro Phe Ser 95 Phe ggc get tat cat gtt cat aat age gat age gac ttg ttt gac aac ttt 336 Gly Ala Tyr His 100 Val His Asn Ser Asp 105 Ser Asp Leu Phe Asp 110 Asn Phe gta aat ttt gat tca ctt aaa gtg tat ttg gat gat tgg aaa gat gtt 384 Val Asn Phe 115 Asp Ser Leu Lys Val 120 Tyr Leu Asp Asp Trp 125 Lys Asp Val

2/58

432

ctc Leu cca Pro 130 caa ggt ata íle agt Ser tcg Ser 135 ttt Phe att íle gat Asp gat Asp att Ilé 140 cag Gin get Ala ggt Gly aac Asn Gin Gly tac tcc aca tet tet tta gat gat ctc agt gaa aat ttt gcc gtt ggt Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly 145 150 155 160 aaa caa ctc tta cgt gat tat aat atc gag gcc 3.ČLČL cat cct gtt gta Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn íle Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175 atg gtt cct ggt gtc att tet acg gga att gaa age tgg gga gtt att Met Val Pro Gly Val íle Ser Thr Gly íle Glu Ser Trp Gly Val íle 180 185 190 gga gac gat gag' tgc gat agt tet gcg cat ttt cgt aaa cgg ctg tgg Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205 gga agt ttt tac atg ctg aga aca atg gtt atg gat aaa gtt tgt tgg Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220 ttg aaa cat gta atg tta gat cct gaa aca ggt ctg gac cca ccg aac Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240 ttt acg cta cgt gca gca cag ggc ttc gaa tca act gat tat ttc atc Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe íle 245 250 255 gca ggg tat tgg att tgg aac aaa gtt ttc caa aat ctg gga gta att Ala Gly Tyr Trp íle Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val íle 260 265 270 ggc tat gaa CCC ' aat aaa atg acg agt get gcg Ú 5. t gat tgg agg ctt Gly Tyr Glu Pro A.sn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285 gca tat tta gat cta gaa aga ege gat agg tac ttt acg aag cta aag A.la Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 290 295 300 gaa caa atc gaa ctg ttt cat caa ttg agt ggt gaa aaa gtt tgt tta Glu Gin íle Glu Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 310 315 320 att gga cat tet atg ggt tet cag att atc ttt tac ttt atg aaa tgg íle Gly His Ser Met Gly Sér Gin íle íle Phe Tyr Phe Met Lys Trp 325 330 335 gtc gag get gaa ggc cct ctt .tac ggt aat ggt ggt cgt ggc' tgg gtt Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 350

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

3/58

aac Asn gaa Glu cac His 355 ata gat íle Asp tca ttc att íle 360 aat gca gca ggg acg ctt ctg Leu ggc Gly 1104 Ser Phe Asn Ala Ala Gly Thr 365 Leu get cca aag gca gtt cca get cta att agt ggt gaa atg 333 gat acc 1152 Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu íle Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 370 375 380 att caa tta aat acg tta gcc atg tat ggt ttg gaa aag ttc ttc tca 1200 íle Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 385 390 395 400 aga att gag aga gta aaa atg tta caa acg tgg ggt ggt ata cca tca 1248 Arg íle Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly íle Pro Ser 405 410 415 atg cta cca aag gga gaa gag gtc at t tgg ggg gat atg aag tca tet 1296 Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val íle Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430 tca gag gat gca ttg aat aac aac act gac aca tac ggc aat ttc att 1344 Ser Glu A.sp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe íle 435 440 445 ega ttt gaa agg aat acg agc gat get ttc 33C 333 aat ttg aca atg 1392 Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys Asn Leu Thr Met 450 455 460 SSg gac gcc att aac atg aca tta tcg ata tca cct gaa tgg ctc C33 1440 Lys Asp Ala íle Asn Met Thr Leu Ser íle Ser Pro Glu Trp Leu Gin 465 470 475 480 aga 303 gta cat gag cag tac tcg ttc ggc tat tcc aag aat gaa CJ33 1488 Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 485 490 495 gag tta aga GO-Ô aat gag cta cac cac aag cac tgg tcg aat cca atg 1536 Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser A.sn Pro Met 500 505 510 gsa gta cca ctt cca gaa get ccc cac atg aaa atc tat tgt ata tac 1584 Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys íle Tyr Cys íle Tyr 515 520 525 ggg gtg aac aac cca act gaa agg gca tat gta tat aag gaa gag gat 1632 C-ly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 gac tcc tet get ctg aat ttg acc atc gac tac gaa agc aag C33 cct 1680 Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr íle Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 545 550 555 560 gta ttc ctc acc gag ggg gac gga acc gtt ccg ctc gtg gcg cat tca 1728 Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 565 570 575 atg tgt cac aaa tgg gcc cag ggt get tca ccg tac aac cct gcc gga 1776 Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 585 590

1824

4/58

att aac gtt act att gtg gaa atg aaa cac cag cca gat ega ttt gat íle Asn Val 595 Thr íle Val Glu Met 600 Lys His Gin Pro Asp 605 Arg Phe Asp ata cgt ggt gga gca aaa agc gcc gaa cac gta gac atc ctc ggc agc íle Arg 610 Gly Gly Ala Lys Ser 615 Ala Glu His Val Asp 620 íle Leu Gly Ser gcg gag ttg aac gat tac atc ttg aaa att gca agc ggt aat ggc gat Ala 625 Glu Leu Asn Asp Tyr 630 íle Leu Lys íle Ala 635 Ser Gly Asn Gly Asp 640 ctc gtc gag cca cgc caa ttg tct aat ttg agc cag tgg gtt tct cag Leu Val Glu Pro Arg 645 Gin Leu Ser Asn Leu 650 Ser Gin Trp Val Ser 655 Gin

1872

1920

1968 atg ccc ttc cca atg taa Met Pro Phe Pro Met

660

1986

5/58 <210> 2 <211> 661 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2

Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gin Asn Gin Lys Ser Asp Ser 15 10 15

Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg 20 . 25 30

Asn His íle His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg' Gly 35 40 45 íle Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg 50 55 60

Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 '70 75 80 íle Phe íle Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 95

Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe 100 105 110

Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val 115 120 125

Leu Pro Gin Gly íle Ser Ser Phe íle Asp Asp íle Gin Ala Gly Asn 130 135 140

Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly

145 150 155 . 160

Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn íle Glu Ala Lys His Pro Val Val

165 170 175

Met Val Pro Gly Val íle Ser Thr Gly íle Glu Ser Trp Gly Val íle 180 185 190

Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205

Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220

Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn

225 230 235 240

Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe íle

245 250 255

Ala Gly Tyr Trp íle Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val íle 260 265 270

Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285

6/58

Ala Tyr 290 Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 295 300 Glu C-ln íle Glu Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 310 315 320 íle Gly His Ser Met Gly Ser Gin íle íle Phe Tyr Phe Met Lys Trp 325 330 335 Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 350 Asn Glu His íle Asp Ser Phe íle Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 355 360 365 Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu íle Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 370 375 380 íle Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 385 390 395 400 Arg íle Glu Arg Val Lys Met Léu Gin Thr Trp Gly Gly íle Pro Ser 405 410 415 Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val íle Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430 Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe íle 435 440 445 Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys Asn Leu Thr Met 450 455 460 Lys Asp Ala íle Asn Met Thr Leu Ser íle Ser Pro Glu Trp Leu Gin 465 470 475 480 Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu C-lu 485 490 495 Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 500 505 510 Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys íle Tyr Cys íle Tyr 515 520 525 Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr íle Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 545 550 555 560 Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 565 570 575 Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 585 590 íle Asn Val Thr íle Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605

7/58

íle Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp íle Leu Gly Ser 610 615 620 Ala Glu Leu Asn Asp Tyr íle Leu Lys íle' Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625 630 635 640 Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin 645 650 655 Met Pro Phe Pro Met

660

8/58 <210> 3 <211> 2312 <212> genomic DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 3 atggcgtctt ccaagaagag caaaactcat aagaaaaaga aagaagtcaa atctcctatc gacttaccaa attcaaagaa accaactcgc gctttgagtg agcaaccttc agcgtccgaa acacaatctg tttcaaataa atcaagaaaa tctaaatttg gaaaaagatt gaattttata ttgggcgcta ttttgggaat atgcggtgct ttttttttcg ctgttggaga cgacaatgct gttttcgacc ctgctacgtt agataaattt gggaatatgc taggctcttc agacttgttt gatgacatta aaggatattt atcttataat gtgtttaagg atgcaccttt tactacggac aagccttcgc agtctcctag cggaaatgaa gttcaagttg gtcttgatat gtacaatgag ggatatcgaa gtgaccatcc tgttattatg gttcctggtg ttatcagctc aggattagaa agttggtcgt ttaataattg ctcgattcct tactttagga aacgtctttg gggtagctgg tctatgctga aggcaatgtt ccttgacaag caatgctggc ttgaacattt aatgcttgat aaaaaaaccg gcttggatcc gaagggaatt aagctgcgag cagctcaggg gtttgaagca gctgattttt ttatcacggg ctattggatt tggagtaaag taattgaaaa ccttgctgca attggttatg agcctaataa catgttaagt gcttcttacg attggcggtt atcatatgca satttagagg aacgtgataa atatttttca aagttaaaaa tgttcattga gtacagcaac attgtacata agaaaaaggt agtgttgatt tctcactcca tgggttcaca ggttacgtac tattttttta agtgggttga agctgagggc tacggaaatg gtggaccgac ttgggttaat gatcatattg aagcatttat aaatgtgagt ctcgatggtt gtttgactac gtttctaact tttgaataga tatcgggatc tttgattgga gcacccaaaa cagtggcagc gcttttatcg ggtgaaatga aagatacagg tattgtaatt acattaaaca tgttaatatt taatttttgc taaccgtttt aagctcaatt gaatcagttt tcggtctatg ggtaagcaat aaattgttga gatttgttac taatttactg tttagtttgg aaaaattttt- ttcccgttct gaggtatatt caaaaataca aatgtgctct actttttcta acttttaata gagagccatg atggttcgca ctatgggagg agttagttct atgcttccta aaggaggcga tgttgtatgg ggaaatgcca gttgggtaag aaatatgtgc tgttaatttt ttattaatat ttaggctcca gatgatctta atcaaacaaa tttttccaat ggtgcaatta ttcgatatag agaagacatt gataaggacc acgatgaatt tgacatagat gatgcattac aatttttaaa aaatgttaca gatgacgatt ttaaagtcat gctagcgaaa aattattccc acggtcttgc ttggactgaa aaagaagtgt taaaaaataa cgaaatgccg tctaaatgga taaatccgct agaagtaaga acattaaagt tactaaatta tactaaccca aatagactag tcttccttat gctcctgata tgaaaattta ttgcgttcac ggggtcggaa aaccaactga gagaggttat tattatacta ataatcctga ggggcaacct gtcattgatt cctcggttaa tgatggaaca aaagttgaaa atgtgagaga atttatgttt caaacattct attaactgtt ttattagggt attgttatgg atgatggtga tggaacttta ccaatattag cccttggttt ggtgtgcaat aaagtttggc aaacaaaaag gtttaatcct gctaatacaa gtatcacaaa ttatgaaatc aagcatgaac ctgctgcgtt tgatctgaga ggaggacctc gctcggcaga acacgtcgat atacttggac attcagagct aaatgtatgt tcattttacc ttacaaattt ctattactaa ctcttgaaat aaggaaatta ttttaaaagt ttcatcaggc catggtgact cggtaccaaa ccgttatata tcagatatcc agtacggaca taagttttgt agattgcaat taactaacta accgaacagg gaaataataa atgagataaa tctcgataaa cctagaaatt aa

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2312

9/58 <210> 4 <211> 3685 <212> genomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 atgcccctta ttcatcggaa aaagccgacg gagaaaccat cgacgccgcc atctgaagag 60 gtggtgcacg atgaggattc gcaaaagaaa ccacacgaat cttccaaatc ccaccataag 120 aaatcgaacg gaggagggaa gtggtcgtgc atcgattctt gttgttggtt cattgggtgt 180 gtgtgtgtaa cctggtggtt tcttctcttc ctttacaacg caatgcctgc gagcttccct 240 cagtatgtaa cggagcgaat cacgggtcct ttgcctgacc cgcccggtgt taagctcaaa 300 aaagaaggtc ttaaggcgaa acatcctgtt gtcttcattc ctgggattgt caccggtggg 360 ctcgagcttt gggaaggcaa acaatgcgct gatggtttat ttagaaaacg tttgtggggt 420 · ggaacttttg gtgaagtcta caaaaggtga gctcaacaat tctcactctt cctttatatt 480 gggatttgga ttggatctga tgagatcacg cacttgttgc ttcttcaaca tcactcaaac 540 tttaattcca tgtttgtctg tcttactctt tacttttttt tttttttgat gtgaaacgc.t 600 attttcttaa gagactattt ctgtatgtgt aaggtaagcg ttccaaggac gtaattggct 660 tggactattt ctgtttgatt gttaacttta ggatataaaa tagctgcctt ggaatttcaa 720 gtcatcttat tgccaaatct gttgctagac atgccctaga gtccgttcat aacaagttac 780 ttcctttact gtcgttgcgt gtagatttag ctttgtgtag cgtataatga agtagtgttt 840 tatgttttgt tgggaataga gaagttctaa ctacatctgt ggaaagtgtg ttcaggctgt 900 gatagaggac tgttgcttta ttattcaact atgtatatgt gtaättaaag ctagttcctt 960 tttgatcttt cagctcaatg tgcttttctc aatttttttc tcaatttcaa agtttcacat 1020 cgagtttatt cacatgtctt gaatttcgtc catcctcgtt ctgttatcca gctttgaact 1080 cctcccgacc ctgctatgga tatattaaaa aaaaagtgtt ttgtgggttg catctttgtt 1140 acgatctgca tcttcttctt tcggctcagt gttcatgttt ttgctatggt agagatgggc 1200 aatgttattg ttgatggtaa cagtggtata gttgatagta tcttaactaa tcaattatct 1260 ctttgattca ggcctctatg ttgggtggaa cacatgtcac ttgacaatga aactgggttg 1320 gatccagctg gtattagagt tcgagctgta tcaggactcg tggctgctga ctactttgct 1380 cctggctact ttgtctgggc agtgctgatt gctaaccttg cacatattgg atatgaagag 1440 aaaaatatgt acatggctgc atatgactgg cggctttcgt ttcagaacac agaggttctt 1500 ttctcatcgt tctttctatt attctgttcc atgttacgtt tctttcttca ttacttaagg 1560 cttaaatatg tttcatgttg aattaatagg tacgtgatca gactcttagc cgtatgaaaa 1620 gtaatataga gttgatggtt tctaccaacg gtggaaaaaa agcagttata gttccgcatt 1630 ccatgggggt cttgtatttt ctacatttta tgaagtgggt tgaggcacca gctcctctgg 1740 gtggcggggg tgggccagat tggtgtgcaa agtatattaa ggcggtgatg aacattggtg 1800 gaccatttct tggtgttcca aaagctgttg cagggctttt ctctgctgaa gcaaaggatg 1860 ttgcagttgc caggtattga atatctgctt atacttttga tgatcagaac cttggctctg 1920 gaactcaaag ttattctact aaatatcaat tctaataaca ttgctatatt atcgctgcaa 1980 ctgacattgg ttgattattt ttgctgctta tgtaactgaa actctcttga gattagacaa 2040 atgatgaatt gataattctt acgcattgct ctgtgatgac cagtttctta gcttcgacga 2100 taacatttgt catactgtct tttggagggc attgaatttt gctatggaaa gcgctggagc 2160 ttccatgctt gcattcttta ccaattagcg ttattctgct tctttcaatt ttcttgtata 2220 tgcatctatg gtcttttatt tcttcttaat taaagactcg ttggattagt tgctctatta 2280 gtcacttggt tccttaatat agaactttac tttcttcgaa aattgcagag cgattgcccc 2340 aggattctta gacaccgata tatttagact tcagaccttg cagcatgtaa tgagaatgac 2400 acgcacatgg gactcaacaa tgtctatgtt accgaaggga ggtgacacga tatggggcgg 2460 gcttgattgg tcaccggaga aaggccacac ctgttgtggg aaaaagcaaa agaacaacga 2520 aacttgtggt gaagcaggtg aaaacggagt ttccaagaaa agtcctgtta actatggaag 2580 gatgatatct tttgggaaag aagtagcaga ggctgcgcca tctgagatta ataatattga 2640 ttttcgagta aggacatata aatcataata aaccttgtac attttgtgat tgtatgatga 2700 atatctgtac attttatctg gtgaagggtg ctgtcaaagg tcagagtatc ccaaatcaca 2760 cctgtcgtga cgtgtggaca gagtaccatg acatgggaat tgctgggatc aaagctatcg 2820 ctgagtataa ggtctacact gctggtgaag ctatagatct actacattat gttgctccta 2880 agatgatggc gčgtggtgcc gctcatttct cttatggaat tgctgatgat ttggatgaca 2940 ccaagtatca agatcccaaa tactggtcaa atccgttaga gacaaagtaa gtgatttctt 3000 gattccaact gtatccttcg tcctgatgca ttatcagtct ttttgttttc ggtcttgttg 3060 gatatggttt tcagcccaaa gcttacaaag ctgtttctga gcctttctca aaaaggcttg 3120 ctcagtaata ttgaggtgct aaagttgata catgtgactc ttgcttataa atcctccgtt 3180

10/58 tggtttgttc tgctttttca gattaccgaa tgctcctgag atggaaatct actcattata 3240 cggagtgggg ataccaacgg aacgagcata cgtatacaag cttaaccagt ctcccgacag 3300 ttgcatcccc tttcagatat tcacttctgc tcacgaggag gacgaagata gctgtctgaa 3360 agcaggagtt tacaatgtgg atggggatga aacagtaccc gtcctaagtg ccgggtacat 3420 gtgtgcaaaa gcgtggcgtg gcaagacaag attcaačcct tccggaatca agacttatat 3480 aagagaatac aatcactctc cgccggctaa cctgttggaa gggcgcggga cgcagagtgg 3540 tgcccatgtt gatatcatgg gaaactttgc tttgatcgaa gatatcatga gggttgccgc 3600 cggaggtaac gggtctgata taggacatga ccaggtccac tctggcatat ttgaatggtc 3660 ggagcgtatt gacctgaagc tgtga 3685

11/58 <210> 5 <211> 2427' <212> cDNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 5 agaaacagct ctttgtctct ctcgactgat ctaacaatcc ctaatctgtg ttctaaattc ctggacgaga tttgacaaag tccgtatagc ttaacctggt ttaatttcaa gtgacagata tgccccttat tcatcggaaa aagccgacgg agaaaccatc gacgccgcca tctgaagagg tggtgcacga tgaggattcg caaaagaaac cacacgaatc ttccaaatcc caccataaga aatcgaacgg aggagggaag tggtcgtgca tcgattcttg ttgttggttc attgggtgtg tgtgtgtaac ctggtggttt cttctcttcc tttacaacgc aatgcctgcg agcttccctc agtatgtaac ggagcgaatc acgggtcctt tgcctgaccc gcccggtgtt aagctcaaaa aaagaaggtc ttaaggcgaa acatcctgtt gtcttcattc ctgggattgt caccggtggg ctcgagcttt gggaaggcaa acaatgcgct gatggtttat ttagaaaacg tttgtggggt ggaacttttg gtgaagtcta caaaaggcct ctatgttggg tggaacacat gtcacttgac aatgaaactg ggttggatcc agctggtatt agagttcgag ctgtatcagg actcgtggct gctgactact ttgctcctgg ctactttgtc tgggcagtgc tgattgctaa ccttgcacat attggatatg aagagaaaaa tatgtacatg gctgcatatg actggcggct ttcgtttcag aacacagagg tacgtgatca gactcttagc cgtatgaaaa gtaatataga gttgatggtt tctaccaacg gtggaaaaaa agcagttata gttccgcatt ccatgggggt cttgtatttt ctacatttta tgaagtgggt tgaggcacca gctcctctgg gtggcggggg tgggccagat tggtgtgcaa agtatattaa ggcggtgatg aacattggtg gaccatttct tggtgttcca aaagctgttg cagggctttt ctctgctgaa gcaaaggatg ttgcagttgc cagagcgatt gccccaggat tcttagacac cgatatattt agacttcaga ccttgcagca tgtaatgaga atgacacgca catgggactc aacaatgtct atgttaccga agggaggtga cacgatatgg ggcgggcttg attggtcacc ggagaaaggc cacacctgtt gtgggaaaaa gcaaaagaac aacgaaactt gtggtgaagc aggtgaaaac ggagtttcca agaaaagtcc tgttaactat ggaaggatga tatcttttgg gaaagaagta gcagaggcig cgccatctga gattaataat attgattttc gaggtgctgt caaaggtcag agtatcccaa atcacacctg tcgtgacgtg tggacagagt accatgacat gggaattgct gggatcaaag ctatcgctga gtataaggtc tacactgctg gtgaagctat agatctacta cattatgttg ctcctaagat gatggcgcgt ggtgccgctc atttctctta tggaattgct gatgatttgg atgacaccaa gtatcaagat cccaaatact ggtcaaatcc gttagagaca aaattaccga atgctcctga gatggaaatc tactcattat acggagtggg gataccaacg gaacgagcat acgtatacaa gcttaaccag tctcccgaca gttgcatccc ctttcagata ttcacttctg ctcacgagga ggacgaagat agctgtctga aagcaggagt ttacaatgtg gatggggatg aaacagtacc cgtcctaagt gccgggtaca tgtgtgcaaa agcgtggcgt ggcaagacaa gattcaaccc ttccggaatc aagacttata taagagaata caatcactct ccgccggcta acctgttgga agggcgcggg acgcagagtg gcgcccatgt tgatatcatg ggaaactttg ctttgatcga agatatcatg agggttgccg ccggaggtaa cgggtctgat ataggacatg accaggtcca ctctggcata tttgaatggt cggagcgtat tgacctgaag ctgtgaatat catgatctct ttaagctgtc ctgtcagctt atgtgaatcc aatactttga aagagagatc atcatcaatt catcatcatc gtcatcatca tgatgctcaa ctcacaaaga agcctgagaa tgatactttg gtgcgaaatt ctcaatacct ctttaatatt cttattgaat gtaaattata caatcctatc taatgtttga acgataacac aaaacttgct gcngccatgt ttgtttgtct tgtcaaaagc atcaatttgt gggttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2427

12/58 <210> 6 <211> 671 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 6

Met 1 Pro Leu íle His 5 Arg Lys Lys Pro Ser Glu Glu 20 Val Val His Asp Glu Ser Ser 35 Lys Ser His His Lys 40 Ser Cys 50 íle Asp Ser Cys Cys 55 Trp Trp 65 Trp Phe Leu Leu Phe 70 Leu Tyr Gin Tyr Val Thr Glu 85 Arg íle Thr Val Lys Leu Lys 100 Lys Glu Gly Leu íle Pro Gly 115 íle Val Thr Gly Gly 120 Cys Ala 130 Asp Gly Leu Phe Arg 13 5 Lys Glu 145 Val Tyr Lys Arg Pro 150 Leu Cys Asn Glu Thr Gly Leu 165 Asp Pro Ala Gly Leu Val Ala 180 Ala Asp Tyr Phe Val Leu íle 195 Ala Asn Leu Ala His 200 Tyr Met 210 Ala Ala Tyr Asp Trp 215 Arg Arg 225 Asp Gin Thr Leu Ser 230 Arg Met Ser Thr Asn Gly Gly 245 Lys Lys Al a Val Leu Tyr Phe 260 Leu His Phe Met Leu Gly Gly 275 Gly Gly Gly Pro Asp 280

Pro Thr Glu Lys Pro Ser Thr Pro 10 15

Glu Asp Ser Gin Lys Lys Pro His 25 30

Lys Ser Asn Gly Gly Gly Lys Trp 45

Phe íle Gly Cys Val Cys Val Thr 60

Asn Ala Met Pro Ala Ser Phe Pro 75 80

Gly Pro Leu Pro Asp Pro Pro Gly 90 95

Lys Ala Lys His Pro Val Val Phe 105 110

Leu Glu Leu Trp Glu Gly Lys Gin 125

Arg Leu Trp Gly Gly Thr Phe Gly 140

Trp Val Glu His Met Ser Leu Asp 155 160

Gly íle Arg Val Arg Ala Val Ser 170 175

Ala Pro Gly Tyr Phe Val Trp Ala 185 190 íle Gly Tyr Glu Glu Lys Asn Met 205

Leu Ser Phe Gin Asn Thr Glu Val 220

Lys Ser Asn íle Glu Leu Met Val 235 240

Val íle Val Pro His Ser Met Gly 250 255

Lys Trp Val Glu Ala Pro Ala Pro 265 270

Trp Cys Ala Lys Tyr íle Lys Ala 285

13/58

Val Met Asn íle Gly Gly Pro Phe Leu Gly Val Pro Lys Ala Val Ala 290 295 300 Gly Leu Phe Ser Ala Glu Ala Lys Asp Val ' Ala Val Ala Arg Ala íle 305 310 315 320 Ala Pro Gly Phe Leu Asp Thr Asp íle Phe Arg Leu Gin Thr Leu Gin 325 330 335 His Val Met Arg Met Thr Arg Thr Trp Asp Ser Thr Met Ser Met Leu 340 345 350 Pro Lys Gly Gly Asp Thr íle Trp Gly Gly Leu Asp Trp Ser Pro Glu 355 360 365 Lys Gly His Thr Cys Cys Gly Lys Lys Gin Lys Asn Asn Glu Thr Cys 370 375 380 Gly Glu Ala Gly Glu Asn Gly Val Ser Lys Lys Ser Pro Val Asn Tyr 385 390 395 400 Gly Arg Met íle Ser Phe Gly Lys Glu Val Ala Glu Ala Ala Pro Ser 405 410 415 Glu íle Asn Asn íle Asp Phe Arg Gly Ala Val Lys Gly Gin Ser íle 420 425 430 Pro Asn His Thr Cys Arg Asp Val Trp Thr Glu Tyr His Asp Met Gly 435 440 445 íle Ala Gly íle Lys Ala íle Ala Glu Tyr Lys Val Tyr Thr Ala Gly 450 455 460 Glu Ala íle Asp Leu Leu His Tyr Val Ala Pro Lys Met Met Ala Arg 465 470 475 480 Gly Ala Ala His Phe Ser’ Tyr Gly íle Ala Asp Asp Leu Asp Asp Thr 485 490 495 Lys Tyr C-ln Asp Pro Lys Tyr Trp Ser Asn Pro Leu C-lu Thr Lys Leu 500 505 510 Pro Asn Ala Pro Glu Met Glu íle Tyr Ser Leu Tyr C-ly Val Gly íle 515 520 525 Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Leu Asn Gin Ser Pro Asp Ser 530 '535 540 Cys íle Pro Phe Gin íle Phe Thr Ser Ala His Glu Glu Asp Glu Asp 545 550 555 560 Ser Cys Leu Lys Ala Gly Val Tyr Asn Val Asp Gly Asp Glu Thr Val 565 570 57 5 Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Ala Trp Arg Gly Lys

580 585 590

Thr Arg Phe Asn Pro Ser Gly íle Lys Thr Tyr íle Arg Glu Tyr Asn 595 600 605

14/58

His Ser 610 Pro Pro Ala Asn Leu 615 Leu Ala 625 His Val Asp íle Met 630 Gly Asn Arg Val Ala Ala Gly 645 Gly Asn Gly His Ser Gly íle Phe Glu Trp Ser

Glu Gly Arg Gly 620 Thr Gin Ser Gly Phe Ala Leu 635 íle Glu Asp íle Met 640 Ser Asp 650 íle Gly His Asp Gin 655 Val Glu 665 Arg íle Asp Leu Lys 670 Leu

660

15/58 <2'10> 7 <211> 643 <212> cDNA <213> Zea mays <220>

<221> CDS <222> (1). . (402) <400> 7

cgg Arg 1 gag aaa ata get get Ala ttg aag Leu Lys ggg ggt Gly Gly 10 gtt tac Val Tyr tta Leu gcc Ala gat Asp 15 ggt Gly 48 Glu Lys íle Ala 5 gat gaa act gtt cca gtt ctt agt gcg ggc tac atg tgt gcg aaa gga 96 Asp Glu Thr Val Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr’ Met Cys Ala Lys Gly 20 25 30 tgg cgt ggc 333 act cgt ttc age cct gcc ggc age aag act tac gtg 144 Trp Arg Gly Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 40 45 3cj3 gaa tac age cat tcg cca CCC tet act ctc ctg ga3 ggc agg ggc 192 Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 60 acc cag age ggt gca cat gtt gat ata atg ggg aac ttt get cta att 240 Thr Gin Ser Gly Ala His Val Asp íle Met Gly Asn Phe Ala Leu íle 65 70 75 80 gag gac gtc atc aga ata get get ggg gca acc ggt gag gaa att ggt 288 Glu Asp Val íle Arg íle Ala Ala Gly Ala Thr Gly Glu Glu íle Gly 85 90 95 ggc gat cag gtt tat tca gat ata ttc aag tgg tca gag aaa atc aaa 336 Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp íle Phe Lys Trp Ser Glu Lys íle Lys 100 105 110 ttg 333 ttg taa cct atg gga agt taa aga agt gcc gac ccg ttt att 384 Leu Lys Leu 115 gcg ttc caa agt gtc ctg ccťgagtgca i ictctggatt ttgcttaaat 432

attgtaattt ttcacgcttc attcgtccct ttgtcaaatt tacatttgac aggacgccaa 492 tgcgatacga tgttgtaccg ctattttcag cattgtatat taaactgtac aggtgtaagt 552 tgcaťttgcc agctgaaatt gtgtagtcgt tttctttacg atttaatanc aagtggcgga 612 gcagtgcccc aagcnaaaaa aaaaaaaaaa a.

643

16/58 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Zea mays <400> 8

Arg Glu Lys 1 Ile Ala Ala Leu Lys Gly Gly Val Tyr Leu Ala Asp Gly 5 10 15 Asp Glu Thr Val Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Gly 20 25 30 Trp Arg Gly Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 40 45 Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 60 Thr Gin Ser Gly Ala His Val Asp íle Met Gly Asn Phe Ala Leu íle 65 70 75 80 Glu Asp Val íle Arg íle Ala Ala Gly Ala Thr Gly Glu Glu íle Gly 85 90 95 Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp íle Phe Lys Trp Ser Glu Lys Ile Lys 100 105 110 Leu Lys Leu 115

17/58 <210> 9 <211> 616 <212> cDNA <213> Neurospora crassa <400> 9 ggtggcgaag acganggcgg aagttggagg ctaacgagaa tgacnctcgg agatggatct 60 accctctaga gacacgacta ccnttgcacc cagcctcaag gtntacngtt tntatgggta 120 ggaagccgac ggagcgagcc tacatctatc tggcgcccga tcccgggacg acaacgcatc 180 tttagatgac gatcgatacg actttgactn aggggcacat tgaccacggt gtgattttgg 240 gcgaaggcga tggcacagtg aaccttatga gtttggggta cctgtgcaat aaggggtgga 300 aaatgaagag atacaatcct gcgggctcaa aaataaccgt ggtcgagatg ccgcatgaac 360 cagaacggtt caatccgaga ggagggccga atacggcgga tcacgtggat attctaggaa 420 ggcagaatct aaacgagtac attcttaaag tggcggcagg tcgaggcgat acaattgagg 480 attttattac tagtaatatt cttaaatatg tagaaaaggt tgaaatttat gaagagtaat 540 taaatacggc acataggtta ctcaatagta tgactaatta aaaaaaaatt ttttttctaa 600 aaaaaaaaaa aaaaaa 616

18/58 <210> 10 <211> 1562 <212> aenomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 10 atgaaaaaaa tatcttcaca ttattcggta gtcatagcga tactcgttgt ggtgacgatg 60 acctcgatgt gtcaagctgt gggtagcaac gtgtaccctt tgattctggt tccaggaaac 120 ggaggtaacc agctagaggt acggctggac agagaataca agccaagtag tgtctggtgt 180 agcagctggt tatatccgat tcataagaag agtggtggat ggtttaggct atggttcgat 240 gcagcagtgt tattgtctcc cttcaccagg tgcttcagcg atcgaatgat gttgtactat 300 gaccctgatt tggatgatta ccaaaatgct cctggtgtcc aaacccgggt tcctcatttc 360 ggttcgacca aatcacttct atacctcgac cctcgtctcc ggttagtact ttccaagata 420 tatcattttg ggacatttgc ataatgaaca aaatagacat aaatttgggg gattattgtt 480 atatcaatat ccatttatat gctagtcggt aatgtgagtg ttatgttagt atagttaatg 540 tgagtgttat gtgattttcc attttaaatg aagctagaaa gttgtcgttt aataatgttg 600 ctatgtcatg agaattataa ggacactatg taaatgtagc ttaataataa ggtttgattt 660 gcagagatgc cacatcttac atggaacatt tggtgaaagc tctagagaaa aaatgcgggt 720 atgttaacga ccaaaccatc ctaggagctc catatgattt caggtacggc ctggctgctt 780 cgggccaccc gtcccgtgta gcctcacagt tcctacaaga cctcaaacaa ttggtggaaa 840 aaactagcag cgagaacgaa ggaaagccag tgatactcct ctcccatagc ctaggaggac 900 ttttcgtcct ccatttcctc aaccgtacca ccccttcatg gcgccgcaag tacatcaaac 960 actttgttgc actcgctgcg ccatggggtg ggacgatctc tcagatgaag acatttgctt 1020 ctggcaacac actcggtgtc cctttagtta accctttgct ggtcagacgg catcagagga 1080 cctccgagag taaccaatgg ctacttčcat ctaccaaagt gtttcacgac agaactaaac 1140 cgcttgtcgt aactccccag gttaactaca cagcttacga gatggatcgg ttttttgcag 1200 acattggatt ctcacaagga gttgtgcctt acaagacaag agtgttgcct ttaacagagg 1260 agctgatgac tccgggagtg ccagtcactt gcatatatgg gagaggagtt gatacaccgg 1320 aggttttgat gtatggaaaa ggaggattcg ataagcaacc agagattaag tatggagatg 1380 gagatgggac ggttaatttg gcgagcttag cagctttgaa agtcgatagc ttgaacaccg 1440 tagagattga tggagtttcg catacatcta tacttaaaga cgagatcgca cttaaagaga 1500 ttatgaagca gatttcaatt attaattatg aattagccaa tgttaatgcc gtcaatgaat 1560 ga 1562

19/58 <210> 11 <211> 3896 <212> grenomic DNA <213> Aradidopsis thaliana <400> 11 atgggagcga attcgaaatc agtaacggct tccttcaccg tcatcgccgt ttttttcttg 60 atttgcggtg gccgaactgc ggtggaggat gagaccgagt ttcacggcga ctactcgaag 120 ctatcgggta taatcattcc gggatttgcg tcgacacagc tacgagcgtg gtcgatcctt 180 gactgtccat acactccgtt ggacttcaat ccgctcgacc tcgtatggct agacaccact 240 aaggtccgtg atcttcattt ccttcgctcc ttattctgtc ggtcgagtca cttgttgatg 300 aattccaagc gaaatatagc aatgaagcat gtctcgtctc tcttattgat tcgttcatta 360 gtcaacagtg acgcttctga atctgagttt agagtcatat aaaacagctg actcggcgag 420 tgtttcccat cgcttttggt tcgctaaatg tagcgcaatg aatgtgtaat tagtctgcgc 480 tttttattca actagatctg caagtttttc agagtgctca atagtagtta gaaaatgtta 540 ggtcatttta cttgtgcatt gtgattcttt tggttgttgc ttactgatcg acgtgatgga 600 tggtttacag cttctttctg ctgtcaactg ctggtttaag tgtatggtgc tagatcctta 660 taatcaaaca gaccatcccg agtgtaagtc acggcctgac agtggtcttt cagccatcac 720 agaattggat ccaggttaca taacaggtag tttcggattt ttctttcttt tgagttttct 780 tcaatttgat atcatcttgt tgtgatataa tatggctaag ttcattaatt tggtcaattt 840 tcaggtcctc tttctactgt ctggaaagag tggcttaagt ggtgtgttga gtttggtata 900 gaagcaaatg caattgtcgc tgttccatac gattggagat tgtcaccaac caaattggaa 960 gagcgtgacc tttactttca caagcfccaag ttagtcctta tcaggctaat gtcttttatc 1020 ttctcttttt atgtaagata agctaagagc tctggtcgtc ttcctttttg caggttgacc 1080 tttgaaactg ctttaaaact ccgtggcggc ccttctatag tatttgccca ttcaatgggt 1140 aataatgtct tcagatactt tctggaatgg ctgaggctag aaattgcacc aaaacattat 1200 ttgaagcggc ttgatcagca tatccatgct tatttcgctg ttggtaccgg cctactatcc 1260 ttaagttacc attttatttt ttctctaatt gggggagtta tgttgtgact tactggattg 1320 agcĽcgatac ctgatttgtt gttgatttag gagctcctct tcttggttct gttgaggcaa 1380 tcaaatctac tctctctggt gtaacgtttg gccttcctgt ttctgaggtg acctctgact 1440 tctctttagt tttaagtagt tgatatcaac caggtcttat aactcactgg attttccttt 1500 tgaaagtatt acttttgtta attgaactgc tgtacgcgat atggtatctg tagatcttga 1560 agtgctagtt atcaaagaac atattgtggg tagtatacct gtcagcggcc ttagctaata 1620 caaccaaacc acatgtacac tgatttagtt ttcagattat tatggtagac tttaagttga 1680 gaagaaactt tgactgaaat ctttttattt taataggcta tgatttgttt attgaaatca 1740 tgtgacatat tgacatgcgc ttctcatgtt ttttgttggc aaggcttcag ggaactgctc 1800 ggttgttgtc caattctttt gcgtcgtcat tgtggcttat gccattttca aagaattgca 1860 agggtgataa cacattctgg acgcattttt ctgggggtgc tgcaaagaaa gataagcgcg 1920 tacaccactg tgatgaagag gaatatcaat caaaatattc tggctggccg acaaatatta 1980 ttaacattga aattccttcc actagcggtt agactctgta tatgcaactg taacactaac 2040 aaaagtttca ccaagaatgt tcactctcat atttcgttcc tttgatgtgt atccatcagt 2100 tacagaaaca gctctagtca acatgaccag catggaatgt ggccttccca cccttttgtc 2160 tttcacagcc cgtgaactag cagatgggac tcttttcaaa gcaatagaag actatgaccc 2220 agatagcaag aggatgttac accagttaaa gaagtacgta cctttctttg tgataagaaa 2280 tattgctcat cgatcatcac ttgctggctt cttgtacgtc aaattgtttt gtttaaatct 2340 ctatatcaat tgttcatatg ctttgtcttt cttactataa gaaacaagta taatcagaaa 2400 ccttattatt gattatcagt tctctcctta tattatggaa tgtctttttc gtttacagtt 2460 atgaatgcaa aagggggtat tttagttgat tgattctctc attctctagt ttgttttgac 2520 taatagcgtc aattttgttt ttctagcaaa tctttgtgaa ttafcatataa catgctaact 2580 atacttttca ggttgtatca tgatgaccct gtttttaatc ctctgactcc ttgggagaga 2640 ccacctataa aaaatgtatt ttgcatatat ggtgctcatc taaagacaga ggtatgatgc 2700 attctcaata tcacattatg cgttgacttt gttattatat tccccatttg gtttgcaata 2760 tctttttgaa ttatgattta tcttctccct tgcatcttat gctattaagc gttaaaggta 2820 ctaaatgtat gaagctgtct gtcataggtt ggttattact ttgccccaag tggcaaacct 2880 tatcctgata attggatcat cacggatatc atttatgaaa ctgaaggttc cctcgtgtca 2940 aggtaatttt ccgcaatggc agaagtaaaa caggaaggca aagtcttctg tatcagtcta 3000 gtggcatgtt atctcagttg cataagcaaa ttattaaaca actaaaattt aagtactttt 3060 ttatcattcc ttttgagctt agtggatgat cagtggctta aagtgggaag aggtgttgca 3120 tgaaacatga cacttgtatc aaagataact agcaaaacaa aactaaccca tttctgaatt 3180

20/58 tcatattatt aggagtagtc gtgcttttaa aaaatttgtt ttaagaaacc gaaaaactag 3240 ttcatatctt gattgtgcaa tatctgcagg tctggaactg tggttgatgg gaacgctgga 3300 cctataactg gggatgagac ggtaacctca gaagttggtt ttgaaattat cttcttgcaa 3360 actactgaag actaagataa tacttgcttc tggaacactg cttgctatgt tctctagtac 3420 actgcaatat tgactctccg ctacttttat tgattatgaa attgatctct tataggtacc 3480 ctatcattca ctctcttggt gcaagaattg gctcggacct aaagttaaca taacaatggc 3540 tccccaggta ctctttttta gttcctcacc ttatatagat caaactttaa gtgtactttt 3600 ctggttatgt gttgatttac ctccaatttg ttctttctaa aaatcatata tctctgtact 3660 cctcaagaac ttgtattaat ctaaacgaga ttctcattgg gaaaataaaa caacagccag 3720 aacacgatgg aagcgacgta catgtggaac taaatgttga tcatgagcat gggtcagaca 3780 tcatagctaa catgacaaaa gcaccaaggg ttaagtacat aaccttttat gaagactctg 3840 agagcattcc ggggaagaga accgcagtct gggagcttga taaaagtggg tattaa 3896

21/58 <210> 12 <211> 709 <212> cDNA <213> Lycopersicon esculentum <400> 12 ctggggccaa aagtgaacat aacaaggaca ccacagtcag agcatgatgt tcagatgtac 60 aagtgcatct aaatatagag catcaacatg gtgaagatat cattcccaat atgacaaagt 120 tacctacaat gaagtacata acctattatg aggattctga aagttttcca gggacaagaa 180 cagcagtttg ggagcttgat aaagcaaatc acaggaacat tgtcagatct ccagctttga 240 tgcgggagct gtggcttgag atgtggcatg atattcatcc tgataaaaag tccaagtttg 300 ttacaaaagg tggtgtctga tcctcactat tttcttctat aaatgtttga gtttgtattg 360 acattgtaag tattgcaaca aaaagcaaag cgtgggcctc tgagggatga ggactgctat 420 tgggattacg ggaaagctcg atgtgcatgg gctgaacatt gtgaatacag gttagaatat 480 tcaaattata ttttgcaaaa tattctcttt ttgtgtattt aggccacctt tccccggtca 540 caacgatgca gatatgtatt cggggatgtt cacctgggac agagttgcag attgaagagt 600 tctacatctc acatcctgtc acactatgtg tgatatttaa gaaactttgt ttggcggaac 660 aacaagtttg cacaaacatt tgaagaagaa agcgaaatga ttcagagag 709

22/58 <210> 13 <211> 623 <212> PRT <213 > Schizosaccharomyces pombe <400> 13

Met 1 Ala Ser Ser Lys Lys 5 Ser Lys Thr His 10 Lys Lys Lys Lys Glu 15 Val Lys Ser Pro íle Asp Leu Pro Asn Ser Lys Lys Pro Thr Arg Ala Leu 20 25 30 Ser Glu Gin Pro Ser Ala Ser Glu Thr Gin Ser Val Ser Asn Lys Ser 35 40 45 Arg Lys Ser Lys Phe Gly Lys Arg Leu Asn Phe íle Leu Gly Ala íle 50 55 60 Leu Gly íle Cys Gly Ala Phe Phe Phe Ala Val Gly Asp Asp Asn Ala 65 70 75 80 Val Phe Asp Pro Ala Thr Leu Asp Lys Phe Gly Asn Met Leu Gly Ser 85 90 95 Ser Asp Leu Phe Asp Asp íle Lys Gly Tyr Leu Ser Tyr Asn Val Phe 100 105 110 Lys Asp Ala Pro Phe Thr Thr Asp Lys Pro Ser Gin Ser Pro Ser Gly 115 120 125 Asn Glu Val Gin Val Gly Leu Asp Met Tyr Asn Glu Gly Tyr Arg Ser 130 135 140 Asp His Pro Val íle Met Val Pro C-ly Val íle Ser Ser Gly Leu Glu 145 150 155 160 Ser Trp Ser Phe Asn Asn Cys Ser íle Pro Tyr Phe Arg Lys Arg Leu 165 170 175 Trp Gly Ser Trp Ser Met Leu Lys Ala Met Phe Leu Asp Lys C-ln Cys 180 185 190 Trp Leu Glu His Leu Met Leu Asp Lys Lys Thr Gly Leu A.sp Pro Lys 195 200 205 Gly íle Lys Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ala Ala Asp Phe Phe 210 215 220 íle Thr Gly Tyr Trp íle Trp Ser Lys Val íle Glu Asn Leu Ala Ala 225 230 235 240 íle Gly Tyr Glu Pro Asn Asn Met Leu Ser Ala Ser Tyr Asp Trp Arg 245 250 255 Leu Ser Tyr Ala Asn Leu Glu Glu Arg Asp Lys Tyr Phe Ser Lys Leu 260 265 270

23/58

Lys Met Phe 275 íle Glu Tyr Ser Asn íle 280 Val His Lys Lys 285 Lys Val Val Leu íle Ser His Ser Met Gly Ser Gin Val Thr Tyr Tyr Phe Phe Lys 290 295 300 Trp Val Glu Ala Glu Gly Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Thr Trp Val Asn 305 310 315 320 Asp His íle Glu Ala Phe íle Asn íle Ser Gly Ser Leu íle Gly Ala 325 330 335 Pro Lys Thr Val Ala Ala Leu Leu Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr Gly 340 345 350 íle Val íle Thr Leu Asn íle Leu Glu Lys Phe Phe Ser Arg Ser Glu 355 360 365 Arg Ala Met Met Val Arg Thr Met Gly Gly Val Ser Ser Met Leu Pro 370 375 380 Lys Gly Gly Asp Val Ala Pro Asp Asp Leu Asn Gin Thr Asn Phe Ser 385 390 395 400 Asn Gly Ala íle íle Arg Tyr Arg Glu Asp íle Asp Lys Asp His Asp 405 410 415 Glu Phe Asp íle Asp Asp Ala Leu C-ln Phe Leu Lys Asn Val Thr Asp 420 425 430 Asp Asp Phe Lys Val Met Leu Al a Lys Asn Tyr Ser His C-ly Leu Ala 435 440 445 Trp Thr Glu Lys Glu Val Leu Lys Asn Asn Glu Met Pro Ser Lys Trp 450 455 460 Íle Asn Pro Leu Glu Thr Ser Leu Pro Tyr Ala Pro Asp Met Lys íle 465 470 475 480 Tyr Cys Val His Gly Val Gly Lys Pro Thr Glu Arg Gly Tyr Tyr Tyr 485 490 495 Thr Asn Asn Pro Glu Gly Gin Pro Val íle Asp Ser Ser Val Asn Asp 500 505 510 Gly Thr Lys Val Glu Asn Gly íle Val Met Asp Asp Gly Asp Gly Thr 515 520 525 Leu Pro íle Leu Ala Leu Gly Leu Val Cys Asn Lys Val Trp Gin Thr 530 535 540 Lys Arg Phe Asn Pro Ala Asn Thr Ser íle Thr Asn Tyr Glu íle Lys 545 550 555 560 His Glu Pro Ála Ala Phe Asp Leu Arg Gly Gly Pro Arg Ser Ala Glu

565 570 575

24/58

His Val Asp 'íle 580 Leu Gly His Ser Glu 585 Leu Asn Glu íle íle 590 Leu Lys Val Ser Ser Gly His Gly Asp Ser Val Pro Asn Arg Tyr íle Ser Asp

595 600 605 íle Gin Glu íle íle Asn Glu íle Asn Leu Asp Lys Pro Arg Asn 610 615 620

25/58 <210> 14 <211> 432 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 14

Met 1 Lys Lys íle Ser 5 Ser His Tyr Val Val Thr Met 20 Thr Ser Met Cys Pro Leu íle 35 Leu Val Pro Gly Asn 40 Leu Asp 50 Arg Glu Tyr Lys Pro 55 Ser Tvr 65 Pro íle His Lys Lys 70 Ser Gly Ala Ala Val Leu Leu 85 Ser Pro Phe Met Leu Tyr Tyr 100 Asp Pro Asp Leu Val Gin Thr 115 Arg Val Pro His Phe 120 Leu Asp 130 Pro Arg Leu Arg Asp 135 Ala Lys 145 Ala Leu Glu Lys Lys 150 Cys Gly Gly Ala Pro Tyr Asp 165 Phe Arg Tyr Ser Arg Val Ala 180 Ser Gin Phe Leu Lys Thr Ser 195 Ser Glu Asn Glu Gly 200 Ser Leu 210 Gly Gly Leu Phe Val 215 Leu Ser 225 Trp Arg Arg Lys Tyr 230 íle Lys Trp Gly Gly Thr íle 245 Ser Gin Met Leu Gly Val Pro 260 Leu Val Asn Pro Thr Ser Glu 275 Ser Asn Gin Trp Leu 280

Ser Val Val íle Ala íle Leu Val 10 15

Gin Ala Val Gly Ser Asn Val Tyr 25 30

Gly Gly Asn Gin Leu Glu Val Arg 45

Ser Val Trp Cys Ser Ser Trp Leu 60

Gly Trp Phe Arg Leu Trp Phe Asp 75 80

Thr Arg Cys Phe Ser Asp Arg Met 90 95

Asp Asp Tvr Gin Asn Ala Pro Gly 105 ’ 110

Gly Ser Thr Lys Ser Leu Leu Tyr 125

Thr Ser Tyr Met Glu His Leu Val 140

Tyr Val Asn Asp Gin Thr íle Leu 155 160

Gly Leu Ala Ala Ser Gly His Pro 170 175

Gin Asp Leu Lys Gin Leu Val Glu 185 190

Lys Pro Val íle Leu Leu Ser His 205

His Phe Leu Asn Arg Thr Thr Pro 220

His Phe Val Ala Leu Ala Ala Pro 235 240

Lys Thr Phe Ala Ser Gly Asn Thr 250 255

Leu Leu Val Arg Arg His Gin Arg 265 270

Leu Pro Ser Thr Lys Val Phe His 285

26/58

Asp Arg 290 Thr Lys Pro Leu Val 295 Val Tyr 305 Glu Met Asp Arg Phe 310 Phe Ala Val Pro Tyr Lys Thr 325 Arg Val Leu Pro Gly Val Pro 340 Val Thr Cys íle Glu Val Leu 355 Met Tyr Gly Lys Gly 360 Lys Tyr 370 Gly Asp Gly Asp Gly 375 Thr Leu 385 Lys Val Asp Ser Leu 390 Asn Thr Thr Ser íle Leu Lys 405 Asp Glu íle íle Ser íle íle Asn Tyr Glu Leu

Thr Pro Gin Val Asn Tyr Thr Ala 300

Asp íle'Gly Phe Ser Gin Gly Val 315 320

Pro Leu Thr Glu Glu Leu Met Thr 330 335

Tyr Gly Arg Gly Val Asp Thr Pro 345 350

Gly Phe Asp Lys Gin Pro Glu íle 365

Val Asn Leu Ala Ser Leu Ala Ala 380

Val Glu íle Asp Gly Val Ser His . 395 400

Ala Leu Lys Glu íle Met Lys Gin 410 415

Ala Asn Val Asn Ala Val Asn Glu 425 430

420

27/58 <210> 15 <211> 552 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 15

Met Gly Ala Asn Ser Lys Ser 1 5

Val Phe Phe Leu Íle Cys Gly ²⁰

Glu Phe His Gly Asp Tyr Ser 35

Phe Ala Ser Thr Gin'Leu Arg 50 55

Thr Pro Leu Asp Phe Asn Pro 65 70

Lys Leu Leu Ser Ala Val Asn ⁸⁵

Pro Tyr Asn Gin Thr Asp His 100

Gly Leu Ser Ala íle Thr Glu 115

Leu Ser Thr Val Trp Lys Glu 130 135 íle Glu Ala Asn Ala íle Val 145 150

Pro Thr Lys Leu Glu Glu Arg 165

Thr Phe Glu Thr Ala Leu Lys 180

Ala His Ser Met Gly Asn Asn 195

Arg Leu Glu íle Ala Pro Lys 210 215 íle His Ala Tyr Phe Ala Val 225 230

Ala íle Lys Ser Thr Leu Ser 245

Glu Gly Thr Ala Arg Leu Leu 260

Thr Ala 10 Ser Phe Thr Val íle 15 Ala Arg 25 Thr Ala Val Glu Asp 30 Glu Thr Leu Ser Gly íle íle 45 íle Pro Gly Trp Ser íle Leu 60 Asp Cys Pro Tyr Asp Leu Val 75 Trp Leu Asp Thr Thr 80 Trp Phe 90 Lys Cys Met Val Leu 95 Asp Glu 105 Cys Lys Ser Arg Pro 110 Asp Ser Asp Pro Gly Tyr íle 125 Thr Gly Pro Leu Lys Trp Cys 140 Val Glu Phe Gly Val Pro Tyr 155 Asp Trp Arg Leu Ser 160 Leu Tyr 170 Phe His Lys Leu Lys 175 Leu Arg 185 Gly Gly Pro Ser íle 190 Val Phe Phe Arg Tyr Phe Leu 205 Glu Trp Leu Tyr Leu Lys Trp 220 Leu Asp Gin His Ala Pro Leu 235 Leu Gly Ser Val Glu 240 Val Thr 250 Phe Gly Leu Pro Val 255 Ser Asn Ser Phe Ala Ser Ser Leu Trp

265 270

Leu Met Pro Phe Ser Lys Asn Cys Lys Gly Asp Asn Thr Phe Trp Thr 275 280 285

28/58

His Phe Ser Gly Gly Ala Ala Lys Lys Asp Lys Arg Val Tyr His Cys 290 295 300

Asp Glu Glu Glu Tyr Gin Ser Lys Tyr Ser' Gly Trp Pro Thr Asn íle

305 310 315 320 íle Asn íle Glu íle Pro Ser Thr Ser Ala Arg Glu Leu Ala Asp Gly

325 330 335

Thr Leu Phe Lys Ala íle Glu Asp Tyr Asp Pro Asp Ser Lys Arg Met 340 345 350

Leu His Gin Leu Lys Lys Tyr Val Pro Phe Phe Val íle Arg Asn íle 355 360 365

Ala His Arg Ser Ser Leu Ala Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Asp Pro 370 375 380

Val Phe Asn Pro Leu Thr Pro Trp Glu Arg Pro Pro íle Lys Asn Val

385 390 395 400

Phe Cys íle Tyr Gly Ala His Leu Lys Thr Glu Val Gly Tyr Tyr Phe

405 410 415

Ala Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Pro Asp Asn Trp íle íle Thr Asp íle 420 425 430 íle Tyr Glu Thr Glu Gly Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Thr Val Val 435 440 445

Asp Gly Asn Ala Gly Pro íle Thr Gly Asp Glu Thr Val Pro Tyr His 450 455 460

Ser Leu Ser Trp Cys Lys Asn Trp Leu Gly Pro Lys Val Asn íle Thr

465 470 475 480

Met Ala Pro Gin íle Leu íle Gly Lys íle Lys Gin Gin Pro Glu His

485 490 495

Asp Gly Ser Asp Val His Val Glu Leu Asn Val Asp His Glu His Gly 500 505 510

Ser Asp íle íle Ala Asn Met Thr Lys Ala Pro Arg Val Lys Tyr íle 515 520 525

Thr Phe Tyr Glu Asp Ser Glu Ser íle Pro Gly Lys Arg Thr Ala Val 530 535 540

Trp Glu Leu Asp Lys Ser Gly Tyr

545 550

29/58

<210> 16 <211> 661 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 16

Met 1 Gly Thr Leu Phe 5 A.rg Arg Asn Val Gin 10 Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His 20 25 Asn His íle His His Gin Gin Gly Leu Gly 35 40 íle Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg 50 55 Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp 65 70 íle Phe íle Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val 85 90 Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser 100 105 Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu 115 120 Leu Pro Gin Gly íle Ser Ser Phe íle Asp 130 135 Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser 145 150 Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn íle Glu 165 170 Met Val Pro Gly Val íle Ser Thr Gly íle 180 185 Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His 195 200 Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val 210 215 Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr 225 230 Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu 245 250 Ala Gly Tyr Ťrp íle Trp Asn Lys Val Phe 260 265 Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala 275 280

Asn Gin Lys Ser Asp 15 Asn Lys Arg Glu 30 Ser His Lys Arg 45 Arg Arg Gly Lys 60 Asp Phe Asp Arg 75 Asp Ser Arg Arg Leu Leu Pro Phe Ser 95 Asp Leu Phe Asp 110 Asn Asp Asp Trp 125 Lys A.sp Asp íle 140 Gin Ala Gly Glu 155 Asn Phe Ala Val Ala Lys His Pro Val 175 Glu Ser Trp Gly 190 Val Phe Arg Lys 205 Arg Leu Met Asp 220 Lys Val Cys Gly 235 Leu Asp Pro Pro Ser Thr Asp Tyr Phe 255 Gin Asn Leu Gly 270 Val Ala Tyr Asp Trp Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Leu

Phe

Phe

Val

Asn

Gly

160

Val íle

Trp

Trp

Asn

240 íle íle

Leu

285

30/58

Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys 300 Leu Lys 290 295 Glu Gin íle Glu Leu Phe His Gin Leu Ser' Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 310 315 320 íle Gly His Ser Met Gly Ser Gin íle íle Phe Tyr Phe Met Lys Trp 325 330 335 Val Glu Ala Glu C-ly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 350 Asn Glu His íle Asp Ser Phe íle Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 355 360 365 Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu íle Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 370 375 380 íle Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu C-lu Lys Phe Phe Ser 385 390 395 400 Arg íle Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly íle Pro Ser 405 410 415 Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val íle Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430 Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly Asn Phe íle 435 440 445 Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys A.sn Leu Thr Met 450 455 460 Lys Asp Ala íle Asn Met Thr Leu Ser íle Ser Pro Glu Trp Leu Gin 465 470 475 480 Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 485 490 495 Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 500 505 510 Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys íle Tyr Cys íle Tyr 515 520 525 Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr íle Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 545 550 555 560 Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 565 570 575 Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly

580 585 590 íle Asn Val Thr íle Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605

31/58

íle Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp íle Leu Gly Ser 610 615 620 Ala C-lu Leu Asn Asp Tyr íle Leu Lys íle' Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625 630 635 640 Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin

645 650 655

Met Pro Phe Pro Met 660

32/58 <210> 17 <211> 387 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 17

Val Gly Ser Asn Val Tyr Pro Leu íle Leu Val Pro Gly Asn 15 10

Asn Gin Leu Glu Val Arg Leu Asp Arg Glu Tyr Lys Pro Ser 20 25 30

Trp Cys Ser Ser Trp Leu Tyr Pro íle His Lys Lys Ser Gly 35 40 45

Phe Arg Leu Trp Phe Asp Ala Ala Val Leu Leu Ser Pro Phe 50 55 60

Cys Phe Ser Asp Arg Met Met Leu Tyr Tyr Asp Pro Asp Leu 65 70 75

Tyr Gin Asn Ala Pro Gly Val Gin Thr Arg Val Pro · His Phe 85 90

Thr Lys Ser Leu Leu Tyr Leu Asp Pro Arg Leu Arg Asp Ala 100 105 110

Tyr Met Glu His Leu Val Lys Ala Leu Glu Lys Lys Cys Gly 115 120 125

Asn Asp Gin Thr íle Leu Gly Ala Pro Tyr Asp Phe Arg Tyr 130 135 140

Ala Ala Ser Gly His Pro Ser Arg Val Ala Ser Gin Phe Leu 145 150 155

Leu Lys Gin Leu Val Glu Lys Thr Ser Ser Glu Asn Glu Gly 165 170 .

Val íle Leu Leu Ser His Ser Leu Gly Gly Leu Phe Val Leu 180 185 190

Leu Asn-Arg Thr Thr Pro Ser Trp Arg Arg Lys Tyr íle Lys 195 200 205

Val Ala Leu Ala Ala Pro Trp Gly Gly Thr íle Ser Gin Met 210 215 220

Phe Ala Ser Gly Asn Thr Leu Gly Val Pro Leu Val Asn Pro 225 230 235

Val Arg Arg His Gin Arg Thr Ser Glu Ser Asn Gin Trp Leu 245 250

Ser Thr Lys Val Phe His Asp Arg Thr Lys Pro Leu Val Val 260 265 270

Gin Val Asn Tyr Thr Ala Tyr Glu Met Asp Arg Phe Phe Ala 275 280 285

Gly Gly

Ser Val

Gly Trp

Thr Arg

Asp Asp 80

Gly Ser 95

Thr Ser

Tyr Val

Gly Leu

Gin Asp 160

Lys Pro 175

His Phe

His Phe

Lys Thr

Leu Leu 240

Leu Pro 255

Thr Pro

Asp íle

33/58

Gly Phe Ser 290 Gin Gly Val Val 295 Pro Tyr Lys Thr Arg 300 Val Leu Pro Leu Thr Glu Glu Leu Met Thr Pro Gly Val Pro 'Val Thr Cys íle Tyr Gly 305 310 315 320 Arg Gly Val Asp Thr Pro Glu Val Leu Met Tyr Gly Lys Gly Gly Phe 325 330 335 Asp Lys Gin Pro Glu íle Lys Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Thr Val Asn 340 345 350 Leu Ala Ser Leu Ala Ala Leu Lys Val Asp Ser Leu Asn Thr Val Glu 355 360 365 íle Asp Gly Val Ser His Thr Ser íle Leu Lys Asp Glu íle Ala Leu

370 375 380

Lys Glu íle 385

34/58 <210> 18 <211> 389 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 18

Leu Lys Lys Glu Gly Leu Lys Ala 1 5

Gly Íle Val Thr Gly Gly Leu Glu 20

Asp Gly Leu Phe Arg Lys Arg Leu 35 40

Val Glu His Met Ser Leu Asp Asn 50 55 íle Arg Val Arg Ala Val Ser Gly 65 70

Pro Gly Tyr Phe Val Trp Ala Val 85

Gly Tyr Glu Glu Lys Asn Met Tyr 100

Ser Phe Gin Asn Thr Glu Arg Asp 115 120

Asn íle Glu Leu Met Val Ser Thr 130 135

Val Pro His Ser Met Gly Val Leu 145 150

Val Glu Ala Pro Ala Pro Leu Gly 165

Ala Lys Tyr íle Lys Ala Val Met 180

Val Pro Lys Ala Val Ala Gly Leu 195 200

Arg Met Thr Arg Thr Trp Asp Ser 210 215

Gly Asp Thr íle Trp Gly Gly Leu 225 230

Ala Pro Glu Met Glu íle Tyr Ser 245

Glu Arg Ala Tyr Val’ Tyr Lys Leu 260

Pro Phe Gin íle Phe Thr Ser Ala 275 280

Lys His Pro Val Val Phe íle Pro 10 15

Leu Trp Glu Gly Lys Gin Cys Ala 25 30

Trp Gly Gly Thr Phe Leu Cys Trp 45

Glu Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly 60

Leu Val Ala Ala Asp Tyr Phe Ala 75 80

Leu íle Ala Asn Leu Ala His íle 90 95

Met Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 105 110

Gin Thr Leu Ser Arg Met Lys Ser 125

Asn Gly Gly Lys Lys Ala Val íle 140

Tyr Phe Leu His Phe Met Lys Trp 155 160.

Gly Gly Gly Gly Pro Asp Trp Cys 170 175

Asn íle Gly Gly Pro Phe Leu Gly 185 190

Phe Ser Ala Glu Ala Lys Asp Met 205

Thr Met Ser Met Leu Pro Lys Gly 220

Asp Trp Ser Pro Glu Leu Pro Asn 235 240

Leu Tyr Gly Val Gly íle Pro Thr 250 255

Asn Gin Ser Pro Asp Ser Cys íle 265 270

His Glu Glu Asp Glu Asp Ser Cys 285

35/58

Leu Lys 290 Ala Gly Val Tyr Asn Val Asp Gly Asp Glu Thr Val Pro Val 295 300 Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Ala Trp Arg Gly Lys 'Thr Arg 305 310 315 '320 Phe Asn Pro Ser Gly íle Lys Thr Tyr íle Arg Glu Tyr Asn His Ser 325 330 335 Pro Pro Ala Asn Leu Leu Glu Gly Arg Gly Thr Gin Ser Gly Ala His 340 345 350 Val Asp íle Met Gly Asn Phe Ala Leu íle Glu Asp íle Met Arg Val 355 360 365 Ala Ala Gly Gly Asn Gly Ser Asp íle Gly His A.sp Gin Val His Ser

370 375 380

Gly íle Phe Glu Trp 385

36/58 <210> 19 <211> 1986 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220>

<221> CDS <222> (1)..(1983) <400> 19

atg ggc aca ctg ttt ega aga aat gtc cag aac caa aag agt gat tct Met 1 Gly Thr Leu Phe 5 Arg Arg Asn Val Gin 10 Asn Gin Lys Ser Asp 15 Ser gat gaa aac aat 333 ggg ggt tct gtt cat aac aag ega gag agc aga Asp Glu Asn Asn 20 Lys Gly Gly Ser Val 25 His Asn Lys Arg Glu 30 Ser Arg aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat 33CJ aga aga agg ggt Asn His íle 35 His His Gin Gin Gly 40 Leu Gly His Lys Arg 45 Arg Arg Gly att agt ggc agt gca aaa aga aat gag cgt ggc aaa gat ttc gac agg lle Ser 50 Gly Ser Ala Lys Arg 55 Asn Glu Arg Gly Lys 60 Asp Phe Asp Arg aaa aga gac ggg aac ggt □os 333 cgt tgg aga gat tcc aga aga ctg Lys 65 Arg Ašp C-ly Asn Gly 70 Arg Lys Arg Trp Arg 75 Asp Ser Arg Arg Leu 80 att ttc att ctt ggt gca ttc tta ggt gta ctt ttg ccg ttt agc ttt íle Phe íle Leu Gly 85 Ala Phe Leu Gly Val 90 Leu Leu Pro Phe Ser 95 Phe ggc get tat cat gtt cat aat agc gat agc gac ttg ttt gac 33C ttt Gly Ala Tyr His 100 Val His Asn Ser Asp 105 Ser Asp Leu Phe Asp 110 Asn Phe gta aat ttt gat tca ctt aaa gtg tat ttg gat gat tgg aaa gat gtt Val Asn Phe 115 Asp Ser Leu Lys Val 120 Tyr Leu Asp Asp Trp 125 Lys Asp Val ctc cca caa ggt ata agt tcg ttt att gat gat att cag get ggt aac Leu Pro 130 Gin Gly íle Ser Ser 135 Phe lle Asp Asp íle 140 Gin Ala C-ly Asn tac tcc aca tct tct tta gat gat ctc agt gaa aat ttt gcc gtt ggt Tyr 145 Ser Thr Ser Ser Leu 150 Asp Asp Leu Ser Glu 155 Asn Phe Ala Val Gly 160 aaa caa ctc tta cgt gat tat aat atc gag gcc 333 cat cct gtt gta Lys Gin Leu Leu Arg 165 Asp Tyr Asn íle Glu 170 Ala Lys His Pro Val 175 Val atg gtt cct ggt gtc att tct acg gga att gaa agc tgg gga gtt att Met Val Pro Gly 180 Val íle Ser Thr Gly 185 íle Glu Ser Trp Gly 190 Val íle

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

37/58

gga gac' Gly Asp gat Asp 195 gag Glu tgc Cys gat Asp agt Ser tet Ser 200 gcg Ala cat His ttt Phe cgt Arg aaa cgg ctg tgg Trp 624 Lys 205 Arg Leu gga agt ttt tac atg ctg aga aca atg gtt' atg gat aaa gtt tgt tgg 672 Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220 ttg aaa cat gta atg tta gat cct gaa aca ggt ctg gac cca ccg aac 720 Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr .Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240 ttt acg cta cgt gca gca cag ggc ttc gaa tca act gat tat ttc atc 768 Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe íle 245 250 255 gca ggg tat tgg att tgg aac cSa gtt ttc caa aat ctg gga gta att 816 Ala Gly Tyr Trp íle Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val íle 260 265 270 ggc tat gaa CCC aat aaa atg acg agt get gcg tat gat tgg ágg ctt 864 Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285 gca tat tta gat cta gaa aga cgc gat agg tac ttt acg aag cta aag 912 Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 290 295 300 gaa caa atc gaa ctg ttt cat C5.5. ttg agt ggt gaa 333 gtt tgt tta 960 Glu C-ln íle Glu Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 310 315 320 att gga cat tet atg ggt tet cag att atc ttt tac ttt atg aaa tgg 1008 íle Gly His Ser Met Gly Ser Gin íle íle Phe Tyr Phe Met Lys Trp 325 330 335 gtc gag get gaa ggc cct ctt tac ggt aat ggt ggt cgt ggc tgg gtt 1056 Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 350 aac gaa cac ata gat tca ttc att aat gca gca ggg acg ctt ctg ggc 1104 Asn Glu His íle Asp Ser Phe íle Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 355 360 365 get cca aag gca gtt cca get cta att agt ggt gaa atg 533 gat acc 1152 Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu íle Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 370 375 380 att caa tta aat acg tta gcc atg tat ggt ttg gaa aag ttc ttc tca 1200 íle Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 385 390 395 400 aga att gag aga gta aaa atg tta caa acg tgg ggt ggt ata cca tca 1248 Arg íle Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly íle Pro Ser 405 410 415 atg cta cca aag gga gaa gag gtc att tgg ggg gat atg aag tca tet 1296 Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val íle Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430

38/58

1344

tca gag gat gca ttg aat aac aac act gac aca tac ggc aat ttc att Ser Glu Asp 435 Ala Leu Asn Asn Asn 440 Thr Asp Thr Tyr Gly 445 Asn Phe íle ega ttt gaa agg aat acg agc gat get ttc' aac aaa aat ttg aca atg Arg Phe 450 Glu Arg Asn Thr Ser 455 Asp Ala Phe Asn Lys 460 Asn Leu Thr Met aaa gac gcc att aac atg aca tta tcg ata tca cct gaa tgg ctc caa Lys 465 Asp Ala Ile Asn Met 470 Thr Leu Ser Ile Ser 475 Pro Glu Trp Leu Gin 480 aga 3. g s. gta cat gag cag tac tcg ttc ggc tat tcc aag aat gaa gaa Arg Arg Val His Glu 485 Gin Tyr Ser Phe Gly 490 Tyr Ser Lýs Asn Glu 495 Glu gag tta aga 3äa aat gag cta cac cac aag cac tgg tcg aat cca atg Glu Leu Arg Lys 500 Asn Glu Leu His His 505 Lys His Trp Ser Asn 510 Pro Met gaa gta cca ctt cca gaa get ccc cac atg aaa atc tat tgt ata tac Glu Val Pro 515 Leu Pro Glu Ala Pro 520 His Met Lys Ile Tyr 525 Cys íle Tyr ggg gtg aac aac cca act gaa agg gca tat gta tat aag gaa gag gat Gly Val 530 Asn Asn Pro Thr Glu 535 Arg Ala Tyr Val Tyr 540 Lys Glu Glu Asp gac tcc tet get ctg aat ttg acc atc gac tac gaa agc aag C53 cct Asp 545 Ser Ser Ala Leu Asn 550 Leu Thr Ile Asp Tyr 555 Glu Ser Lys Gin Pro 560 gta ttc ctc acc gag ggg gac gga acc gtt ccg ctc gtg gcg cat tca Val Phe Leu Thr Glu 565 Gly Asp Gly Thr Val 570 Pro Leu Val Ala His 575 Ser atg tgt cac 335 tgg gcc cag ggt get tca ccg tac aac cct gcc gga Met Cys His Lys 580 Trp Ala Gin Gly Ala 585 Ser Pro Tyr Asn Pro 590 Ala Gly atc aac gtt act att gtg gaa atg 5.53 cac cag cca gat ega ttt gat Ile Asn Val 595 Thr íle Val Glu Met 600 Lys His Gin Pro Asp 605 Arg Phe Asp ata cgt ggt gga gca aaa agc gcc gaa cac gta gac atc ctc ggc agc íle Arg 610 Gly Gly Ala Lys Ser 615 Ala Glu His Val Asp 620 íle Leu Gly Ser gcg gag ttg aac gat tac atc ttg aaa att gca agc ggt aat ggc gat Ala 625 Glu Leu Asn Asp Tyr 630 íle Leu Lys íle Ala 635 Ser Gly Asn Gly Asp 640 ctc gtc gag cca cgc caa ttg tet aat ttg agc cag tgg gtt tet cag Leu Val Glu Pro Arg 645 Gin Leu Ser Asn Leu 650 Ser Gin Trp Val Ser 655 Gin

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968 atg ccc ttc cca atg taa Met Pro Phe Pro Met

660

1986

39/58

<210> 20 <211> 661 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 20

Met 1 Gly Thr Leu Phe 5 Arg Arg Asn Val Gin 10 Asn Gin Lys Ser Asp 15 Ser Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg 20 25 30 Asn His íle His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly 35 40 45 íle Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp Arg 50 55 60 Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 70 75 80 íle Phe íle Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 95 Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe 100 105 110 Val Asn Phe Asp Sér Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val 115 120 125 Leu Pro Gin Gly íle Ser Ser Phe íle Asp Asp íle Gin Ala Gly Asn 130 135 140 Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly 145 150 155 160 Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn íle Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175 Met Val Pro Gly Val íle Ser Thr Gly íle Glu Ser Trp Gly Val íle 180 185 190 Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205 Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220 Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240 Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe íle 245 250 255 Ala Gly Tyr Trp íle Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val íle 260 265 270 Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285

40/58

Ala Tyr 290 Leu Asp Leu Glu Arg 295 Arg Asp Arg Tyr Phe 300 Thr Lys Leu Lys Glu 305 Gin íle Glu Leu Phe 310 His Gin Leu Ser' Gly 315 Glu Lys Val Cys Leu 320 Íle Gly His Ser Met 325 C-ly Ser Gin íle íle 330 Phe Tyr Phe Met Lys 335 Trp Val Glu Ala Glu 340 Gly Pro Leu Tyr Gly 345 Asn Gly Gly Arg Gly 350 Trp Val Asn Glu His 355 íle Asp Ser Phe íle 360 Asn Ala Ala Gly Thr 365 Leu Leu Gly Ala Pro 370 Lys Ala Val Pro Ala 375 Leu íle Ser Gly Glu 380 Met Lys Asp Thr íle 385 Gin Leu Asn Thr Leu 390 Ala Met Tyr Gly Leu 395 Glu Lys Phe Phe Ser 400 Arg íle Glu Arg Val 405 Lys Met Leu Gin Thr 410 Trp Gly C-ly íle Pro 415 Ser Met Leu Pro Lys 420 Gly Glu Glu Val íle 425 Trp Gly Asp Met Lys 430 Ser Ser Ser Glu Asp 435 Ala Leu Asn Asn Asn 440 Thr Asp Thr Tyr Gly 445 Asn Phe íle Arg Phe 450 Glu Arg Asn Thr Ser 455 Asp Ala Phe Asn Lys 460 Asn Leu Thr Met Lys 465 Asp Ala íle Asn Met 470 Thr Leu Ser íle Ser 475 Pro Glu Trp Leu Gin 480 Arg Arg Val His Glu 485 Gin Tyr Ser Phe Gly 490 Tyr Ser Lys Asn Glu 495 Glu Glu Leu Arg Lys 500 Asn Glu Leu His His 505 Lys His Trp Ser Asn 510 Pro Met Glu Val Pro 515 Leu Pro Glu Ala Pro 520 His Met Lys íle Tyr 525 Cys íle Tyr Gly Val 530 Asn Asn Pro Thr Glu 535 Arg Ala Tyr Val Tyr 540 Lys Glu Glu Asp Asp 545 Ser Ser Ala Leu Asn 550 Leu Thr íle Asp Tyr 555 Glu Ser Lys Gin Pro 560 Val Phe Leu Thr Glu 565 Gly Asp Gly Thr Val 570 Pro Leu Val Ala His 575 Ser Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly

580 585 590 íle Asn Val Thr íle Val Gin Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605

41/58

íle Arg 610 Gly Gly Ala Lys Ser 615 Ala Glu His Val Asp 620 íle Leu Gly Ser Ala 62 5 Glu Leu Asn Asp Tyr 630 íle Leu Lys íle Ala 635 Ser Gly Asn Gly Asp 640 Leu Val Glu Pro Arg 645 Gin Leu Ser Asn Leu 650 Ser C-ln Trp Val Ser 655 Gin Met Pro Phe Pro Met

660

42/58 <210> 21 <211> 1986 <212 > DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220>

<221> CDS <222> (1)..(1983) <400> 21

atg Met 1 ggc Gly aca ctg ttt Phe 5 ega Arg aga Arg aat Asn gtc Val cag Gin 10 aac Asn C33 Gin 33CJ Lys agt Ser gat Asp 15 tet Ser 48 Thr Leu gat gaa aac aat aaa ggg ggt tet gtt cat aac aag ega gag age aga 96 Asp Glu Asn Asn 20 Lys Gly Gly Ser Val 25 His Asn Lys Arg Glu 30 Ser Arg aac cac att cat cat caa cag gga tta ggc cat aag aga aga agg ggt 144 Asn His íle 35 His His Gin Gin Gly 40 Leu Gly His Lys Arg 45 Arg Arg Gly att agt ggc agt gca aaa aga aat gag cgt ggc aaa gat ttc gac agg 192 íle Ser 50 Gly Ser Ala Lys Arg 55 Asn Glu Arg Gly Lys 60 Asp Phe Asp Arg 333. aga gac ggg 33C ggt aga aaa cgt tgg aga gat tcc aga aga ctg 240 Lys 65 Arg Asp Gly Asn Gly 70 Arg Lys Arg Trp Arg 75 Asp Ser Arg Arg Leu 80 att ttc att ctt ggt gca ttc 113 ggt gta ctt ttg ccg ttt age ttt 288 íle Phe íle Leu Gly 85 Ala Phe Leu Gly Val 90 Leu Leu Pro Phe Ser 95 Phe ggc get tat cat gtt cat aat age gat age gac ttg ttt gac aac ttt 336 Gly Ala Tyr His 100 Val His Asn Ser Asp 105 Ser Asp Leu Phe Asp 110 Asn Phe gta aat ttt gat tca ctt aaa gtg tat ttg gat gat tgg aaa gat gtt 384 Val Asn Phe 115 Asp Ser Leu Lys Val 120 Tyr Leu Asp Asp Trp 125 Lys Asp Val ctc cca caa ggt ata agt tcg ttt att gat gat att cag get ggt aac 432 Leu Pro 130 Gin Gly íle Ser Ser 135 Phe íle Asp Asp íle 140 Gin Ala Gly Asn tac tcc aca tet tet tta gat gat ctc agt gaa aat ttt gcc gtt ggt 480 Tyr 145 Ser Thr Ser Ser Leu 150 Asp Asp Leu Ser Glu 155 Asn Phe Ala Val Gly 160 333 caa ctc tta cgt gat tat aat atc gag gcc aaa cat cct gtt gta 528 Lys Gin Leu Leu Arg 165 Asp Tyr Asn íle Glu 170 Ala Lys His Pro Val 175 Val atg gtt cct ggt gtc att tet acg gga att gaa age tgg gga gtt att 576 Met Val Pro Gly 180 Val íle Ser Thr Gly 185 íle Glu Ser Trp Gly 190 Val íle

43/58

624

gga gac Gly Asp gat gag tgc Asp Glu Cys 195 gat Asp agt Ser tet gcg cat ttt cgt aaa cgg •ctg Leu tgg Trp Ser 200 Ala His Phe Arg Lys 205 Arg gga agt ttt tac atg ctg aga aca atg gtt atg gat aaa gtt tgt tgg Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220 ttg 333 cat gta atg tta gat cct gaa aca ggt ctg gac cca ccg aac Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240 ttt acg cta cgt gca gca cag ggc ttc gaa tca act gat tat ttc atc Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Ašp Tyr Phe íle 245 250 255 gca ggg tat tgg att tgg aac 533 gtt ttc caa aat ctg gga gta att Ala Gly Tyr Trp íle Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val íle 260 265 270 ggc tat gaa ccc aat aaa atg acg agt get gcg tat gat tgg agg ctt Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285 gca tat tta gat cta gaa aga ege gat agg tac ttt acg 33Cf cta aag Ala Tyr Leu Asp Leu Glu Arg Arg Asp Arg Tyr Phe Thr Lys Leu Lys 290 295 300 gaa caa atc gaa ctg ttt cat caa ttg agt ggt gaa aaa gtt tgt tta C-lu Gin íle Glu Leu Phe His Gin Leu Ser Gly Glu Lys Val Cys Leu 305 310 315 320 att gga cat tet atg ggt tet cag att atc ttt tac ttt atg aaa tgg íle Gly His Ser Met Gly Ser Gin íle íle Phe Tyr Phe Met Lys Trp 325 330 335 gtc gag get gaa ggc cct ctt tac ggt aat ggt ggt cgt ggc tgg gtt Val Glu Ala Glu Gly Pro Leu Tyr Gly Asn Gly Gly Arg Gly Trp Val 340 345 3 50 aac gaa cac ata gat tca ttc att aat gca gca ggg acg ctt ctg ggc Asn Glu His íle Asp Ser Phe íle Asn Ala Ala Gly Thr Leu Leu Gly 355 360 365 get cca aag gca gtt cca get cta att agt ggt gaa atg aaa gat acc Ala Pro Lys Ala Val Pro Ala Leu íle Ser Gly Glu Met Lys Asp Thr 370 375 380 att caa tta aat acg tta gcc atg tat ggt ttg gaa aag ttc ttc tca íle Gin Leu Asn Thr Leu Ala Met Tyr Gly Leu Glu Lys Phe Phe Ser 385 390 395 400 aga att gag aga gta aaa atg tta caa acg tgg ggt ggt ata cca tca Arg íle Glu Arg Val Lys Met Leu Gin Thr Trp Gly Gly íle Pro Ser 405 410 415 atg cta cca aag gga gaa gag gtc att tgg ggg gat atg aag tca tet Met Leu Pro Lys Gly Glu Glu Val íle Trp Gly Asp Met Lys Ser Ser 420 425 430

672

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

44/58

1344

tca gag gat gca ttg aat aac aac act gac aca tac ggc aat ttc att Ser Glu Asp Ala Leu Asn Asn Asn Thr Asp Thr Tyr Gly A.sn Phe íle 435 440 445 ega ttt gaa agg aat acg age gat get ttc aac 333 33t ttg aca atg Arg Phe Glu Arg Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Lys Asn Leu Thr Met 450 455 460 aaa gac gcc att aac atg aca tta tcg ata tca cct gaa tgg ctc caa Lys Asp Ala íle Asn Met Thr Leu Ser íle Ser Pro Glu Trp Leu Gin 465 470 475 480 aga aga gta cat gag cag tac tcg ttc ggc tat tcc aag aat gaa gaa Arg Arg Val His Glu Gin Tyr Ser Phe Gly Tyr Ser Lys Asn Glu Glu 485 490 495 gag tta aga aaa aat gag cta cac cac aag cac tgg tcg aat cca atg Glu Leu Arg Lys Asn Glu Leu His His Lys His Trp Ser Asn Pro Met 500 505 510 gaa gta cca ctt cca gaa get ccc cac atg £g3 atc tat tgt ata tac Glu Val Pro Leu Pro Glu Ala Pro His Met Lys íle Tyr Cys. íle Tyr 515 520 525 ggg gtg aac äcC cca act gaa agg gca tat gta t.2t aag gaa gag gat Gly Val Asn Asn Pro Thr Glu Arg Ala Tyr Val Tyr Lys Glu Glu Asp 530 535 540 gac tcc tet get ctg aat ttg acc atc gac tac gaa age aag caa cct Asp Ser Ser Ala Leu Asn Leu Thr íle Asp Tyr Glu Ser Lys Gin Pro 545 550 555 560 gta ttc ctc acc gag ggg gac gga acc gtt ccg ctc gtg gcg cat tca Val Phe Leu Thr Glu Gly Asp Gly Thr Val Pro Leu Val Ala His Ser 565 570 575 atg tgt cac 2. ô. 3 tgg gcc cag ggt get tca ccg tac aac cct gcc gga Met Cys His Lys Trp Ala Gin Gly Ala Ser Pro Tyr Asn Pro Ala Gly 580 585 590 att aac gtt act att gtg gaa atg aaa cac cag cca gat ega ttt gat íle Asn Val Thr íle Val Glu Met Lys His Gin Pro Asp Arg Phe Asp 595 600 605 ata cgt ggt gga gca aaa age gcc gaa cac gta gac atc ctc ggc age íle Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp íle Leu Gly Ser 610 615 620 gcg gag ttg aac gat tac atc ttg 333 att gca age ggt aat ggc gat Ala Glu Leu Asn Asp Tyr íle Leu Lys íle Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625 630 635 640 ctc gtc gag cca ege caa ttg tet aat ttg age cag tgg gtt tet cag Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin 645 650 655

1392

1440

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968 atg ccc ttc cca atg taa Met Pro Phe Pro Met

660

1986

45/58 <210> 22 <211> 661' <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 22

Met 1 C-ly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gin Asn Gin Lys Ser Asp 15 Ser 5 10 Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg 20 25 30 Asn His íle His His Gin Gin Gly Leu Gly His Lys Arg Arg Arg Gly 35 40 45 íle Ser Gly Ser Ala Lys Arg Asn Glu Arg Gly Lys Asp Phe Asp A.rg 50 55 60 Lys Arg Asp Gly Asn Gly Arg Lys Arg Trp Arg Asp Ser Arg Arg Leu 65 70 75 80 íle Phe íle Leu Gly Ala Phe Leu Gly Val Leu Leu Pro Phe Ser Phe 85 90 95 Gly Ala Tyr His Val His Asn Ser Asp Ser Asp Leu Phe Asp Asn Phe 100 105 110 Val Asn Phe Asp Ser Leu Lys Val Tyr Leu Asp Asp Trp Lys Asp Val 115 120 125 Leu Pro Gin Gly íle Ser Ser Phe íle Asp Asp íle Gin Ala Gly Asn 130 135 140 Tyr Ser Thr Ser Ser Leu Asp Asp Leu Ser Glu Asn Phe Ala Val Gly 145 150 155 160 Lys Gin Leu Leu Arg Asp Tyr Asn íle Glu Ala Lys His Pro Val Val 165 170 175 Met Val Pro Gly Val íle Ser Thr Gly íle Glu Ser Trp Gly Val íle 180 185 190 Gly Asp Asp Glu Cys Asp Ser Ser Ala His Phe Arg Lys Arg Leu Trp 195 200 205 Gly Ser Phe Tyr Met Leu Arg Thr Met Val Met Asp Lys Val Cys Trp 210 215 220 Leu Lys His Val Met Leu Asp Pro Glu Thr Gly Leu Asp Pro Pro Asn 225 230 235 240 Phe Thr Leu Arg Ala Ala Gin Gly Phe Glu Ser Thr Asp Tyr Phe íle 245 250 255 Ala Gly Tyr Trp íle Trp Asn Lys Val Phe Gin Asn Leu Gly Val íle 260 265 270 Gly Tyr Glu Pro Asn Lys Met Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Trp Arg Leu 275 280 285

46/58

Ala Tyr 290

Glu Gin 305 íle Gly

Val Glu

Asn.Glu

Ala Pro 370 íle Gin 385

Arg íle

Met Leu

Ser Glu

Arg Phe 450

Lys Asp 465

Arg Arg

Glu Leu

Glu Val

Gly Val 530

Asp Ser 545

Val Phe

Met Cys íle Asn

Leu Asp íle Glu

His Ser

Ala Glu 340

His íle 355

Lys Ala

Leu Asn

Glu Arg

Pro Lys 420

Asp Ala 435

Glu Arg

Ala íle

Val His

Arg Lys 500

Pro Leu 515

Asn Asn

Ser Ala

Leu Thr

His Lys 580

Val Thr 595

Leu Glu

Leu Phe 310

Met Gly 325

Gly Pro

Asp Ser

Val Pro

Thr Leu 390

Val Lys 405

Gly Glu

Leu.Asn

Asn Thr

Asn Met 470

Glu Gin 485

Asn Glu

Pro Glu

Pro Thr

Leu Asn 550

Glu Gly 565

Trp Ala íle Val

Arg Arg 295

His Gin

Ser Gin

Leu Tyr

Phe íle 360

Ala Leu 375

Ala Met

Met Leu

Glu Val

Asn Asn 440

Ser Asp 455

Thr Leu

Tyr Ser

Leu His

Ala Pro 520

Glu Arg 535

Leu Thr

Asp Gly

Gin Gly

Glu Met 600

Asp Arg

Leu Ser íle íle 330

Gly Asn 345

Asn Ala íle Ser .Tyr Gly

Gin Thr 410 íle Trp 425

Thr Asp

Ala Phe

Ser íle

Phe Gly 490

His Lys 505

His Met

Ala Tyr íle Asp

Thr Val 570

Ala Ser 585

Lys His

Tyr Phe 300 •Gly Glu 315

Phe Tyr

Gly Gly

Ala Gly

Gly Glu 380

Leu Glu 395

Trp Gly

Gly'Asp

Thr Tyr

Asn Lys 460

Ser Pro 475

Tyr Ser

His Trp

Lys íle

Val Tyr 540

Tyr Glu 555

Pro Leu

Pro Tyr

Gin Pro

Thr Lys

Lys Val

Phe Met

Arg Gly 350

Thr Leu 365

Met Lys

Lys Phe

Gly íle

Met Lys 430

Gly Asn 445

Asn Leu

Glu Trp

Lys Asn

Ser Asn 510

Tyr Cys 525

Lys Glu

Ser Lys

Val Ala

Asn Pro 590

Asp Arg 605

Leu Lys

Cys Leu 320

Lys Trp 335

Trp Val

Leu Gly

Asp Thr

Phe Ser 400

Pro Ser 415

Ser Ser

Phe íle

Thr Met

Leu Gin 480

Glu Glu 495

Pro Met íle Tyr

Glu Asp

Gin Pro 560

His Ser 575

Ala Gly

Phe Asp

47/58

íle Arg Gly Gly Ala Lys Ser Ala Glu His Val Asp íle Leu Gly Ser 610’ 615 620 Ala Glu Leu Asn Asp Tyr íle Leu Lys íle Ala Ser Gly Asn Gly Asp 625 630 635 640 Leu Val Glu Pro Arg Gin Leu Ser Asn Leu Ser Gin Trp Val Ser Gin 645 650 655 Met Pro Phe Pro Met

660

48/58 <21Ο> 23 <211> 2312 <212> genomic DNA <213> Schizosaccharomyces pombe <400> 23 atggcgtctt ccaagaagag caaaactcat aagaaaaaga aagaagtcaa atctcctatc 60 gacttaccaa attcaaagaa accaactcgc gctttgagtg agcaaccttc agcgtccgaa 120 acacaatctg tttcaaataa atcaagaaaa tctaaatttg gaaaaagatt gaattttata 180 ttgggcgcta ttttgggaat atgcggtgct ttttttttcg ctgttggaga cgacaatgct 240 gttttcgacc ctgctacgtt agataaattt gggaatatgc taggctcttc agacttgttt 300 gatgacatta aaggatattt atcttataat gtgtttaagg atgcaccttt tactacggac 360 aagccttcgc agtctcctag cggaaatgaa gttcaagttg gtcttgatat gtacaatgag 420 ggatatcgaa gtgaccatcc tgttattatg gttcctggtg ttatcagctc aggattagaa 480 agttggtcgt ttaataattg ctcgattcct tactttagga aacgtctttg gggtagctgg 540 tctatgctga aggcaatgtt ccttgacaag caatgctggc ttgaacattt aatgcttgat 600 aaaaaaaccg gcttggatcc gaagggaatt aagctgcgag cagctcaggg gtttgaagca 660 gctgattttt ttatcacggg ctattggatt tggagtaaag taattgaaaa ccttgctgca 720 attggttatg agcctaataa catgttaagt gcttcttacg attggcggtt atcatatgca 780 aatttagagg aacgtgataa atatttttca aagttaaaaa tgttcattga gtacagcaac 840 attgtacata agaaaaaggt agtgttgatt tctcactcca tgggttcaca ggttacgtac 900 tattttttta agtgggttga agctgagggc tacggaaatg gtggaccgac ttgggttaat 960 gatcatattg aagcatttat aaatgtgagt ctcgatggtt gtttgactac gtttctaact 1020 tttgaataga tatcgggatc tttgattgga gcacccaaaa cagtggcagc gcttttatcg 1080 ggtgaaatga aagatacagg tattgtaatt acattaaaca tgttaatatt taatttttgc 1140 taaccgtttt aagctcaatt gaatcagttt tcggtctatg ggtaagcaat aaattgttga 1200 gatttgttac taatttactg tttagtttgg aaaaattttt ttcccgttct gaggtatatt 1260 caaaaataca aatgtgctct actttttcta acttttaata gagagccatg atggttcgca 1320 ctatgggagg agttagttct atgcttccta aaggaggcga tgttgtatgg ggaaatgcca 1380 gttgggtaag aaatatgtgc tgttaatttt ttattaatat ttaggctcca gatgatctta 1440 atcaaacaaa tttttccaat ggtgcaatta ttcgatatag agaagacatt gataaggacc 1500 acgatgaatt tgacatagat gatgcattac aatttttasa aaatgttaca gatgacgatt 1560 ttaaagtcat gctagcgaaa aattattccc acggtcttgc ttggactgaa aaagaagtgt 1620 taaaaaataa cgaaatgccg tctaaatgga taaatccgct agaagtaaga acattaaagt 1680 tactaaatta tactaaccca aatagactag tcttccttat gctcctgata tgaaaattta 1740 ttgcgttcac ggggtcggaa aaccaactga gagaggttat tattatacta ataatcctga 1800 ggggcaacct gtcattgatt cctcggttaa tgatggaaca aaagttgaaa atgtgagaga 1860 atttatgttt caaacattct attaactgtt ttattagggt attgttatgg atgatggtga 1920 tggaacttta ccaatattag cccttggttt ggtgtgcaat aaagtttggc aaacaaaaag 1980 gtttaatcct gctaatacaa gtatcacaaa ttatgaaatc aagcatgaac ctgctgcgtt 2040 tgatctgaga ggaggacctc gctcggcaga acacgtcgat atacttggac attcagagct 2100 aaatgtatgt tcattttacc ttacaaattt ctattactaa ctcttgaaat aaggaaatta 2160 ttttaaaagt ttcatcaggc catggtgact cggtaccaaa ccgttatata tcagatatcc 2220 agtacggaca taagttttgt agattgcaat taactaacta accgaacagg gaaataataa 2280 atgagataaa tctcgataaa cctagaaatt aa 2312

49/58 <210> 24 <211> 3685 <212> genomícDNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 24 atgcccctta ttcatcggaa aaagccgacg gagaaaccat cgacgccgcc atctgaagag 60 gtggtgcacg atgaggattc gcaaaagaaa ccacacgaat cttccaaatc ccaccataag 120 aaatcgaacg gaggagggaa gtggtcgtgc atcgattctt gttgttggtt cattgggtgt 180 gtgtgtgtaa cctggtggtt tcttctcttc ctttacaacg caatgcctgc gagcttccct 240 cagtatgtaa cggagcgaat cacgggtcct ttgcctgacc cgcccggtgt taagctcaaa 300 aaagaaggtc ttaaggcgaa acatcctgtt gtcttcattc ctgggattgt caccggtggg 360 ctcgagcttt gggaaggcaa acaatgcgct gatggtttat ttagaaaacg tttgtggggt 420 ggaacttttg gtgaagtcta caaaaggtga gctcaacaat tctcactctt. cctttatatt 480 gggatttgga ttggatctga tgagatcacg cacttgttgc ttcttcaaca tcactcaaac 540 tttaattcca tgtttgtctg tcttactctt tacttttttt tttttttgat gtgaaacgct 600 attttcttaa gagactattt ctgtatgtgt aaggtaagcg ttccaaggac gtaattggct 660 tggactattt ctgtttgatt gttaacttta ggatataaaa tagctgcctt ggaatttcaa 720 gtcatcttat tgccaaatct gttgctagac atgccctaga gtccgttcat aacaagttac 780 ttcctttact gtcgttgcgt gtagatttag ctttgtgtag cgtataatga agtagtgttt 840 tatgttttgt tgggaataga gaagttctaa ctacatctgt ggaaagtgtg ttcaggctgt 900 gatagaggac tgttgcttta ttattcaact atgtatatgt gtaattaaag ctagttcctt 960 tttgatcttt cagctcaatg tgcttttctc aatttttttc tcaatttcaa agtttcacat 1020 cgagtttatt cacatgtctt gaatttcgtc catcctcgtt ctgttatcca gctttgaact 1080 cctcccgacc ctgctatgga tatattaaaa aaaaagtgtt ttgtgggttg catctttgtt 1140 acgatctgca tcttcttctt tcggctcagt gttcatgttt ttgctatggt agagatgggc 1200 aatgttattg ttgatggtaa cagtggtata gttgatagta tcttaactaa tcaattatct 1260 ctttgattca ggcctctatg ttgggtggaa cacatgtcac ttgacaatga aactgggttg 1320 gatccagctg gtattagagt tcgagctgta tcaggactcg tggctgctga ctactttgct 1380 cctggctact ttgtctgggc agtgctgatt gctaaccttg cacatattgg atatgaagag 1440 aaaaatatgt acatggcrgc atatgactgg cggctttcgt ttcagaacac agaggttctt 1500 ttctcatcat tctttctatt attctgttcc atgttacgtt tctttcttca ttacttaagg 1560 cttaaatatg tttcatgttg aattaatagg tacgtgatca gactcttagc·cgtatgaaaa 1620 gtaatataga gttgatggtt tctaccaacg gtggaaaaaa agcagttata gttccgcatt 1680 ccatgggggt cttgtatttt ctacatttta tgaagtgggt tgaggcacca gctcctctgg 1740 gtggcggggg tgggccagat tggtgtgcaa agtatattaa ggcggtgatg aacattggtg 1800 gaccatttct tggtgttcca aaagctgttg cagggctttt ctctgctgaa gcaaaggatg 1860 ttgcagttgc caggtattga atatctgctt atacttttga tgatcagaac cttggctctg 1920 gaactcaaag ttattctact aaatatcaat tctaataaca ttgctatatt atcgctgcaa 1980 ctgacattgg ttgattattt ttgctgctta tgtaactgaa actctcttga gattagacaa 2040 atgatgaatt gataattctt acgcattgct ctgtgatgac cagtttctta gcttcgacga 2100 taacatttgt catactgtct tttggagggc attgaatttt gctatggaaa gcgctggagc 2160 ttccatgctt gcattcttta ccaattagcg ttattctgct tctttcaatt ttcttgtata 2220 tgcatctatg gtcttttatt tcttcttaat taaagactcg ttggattagt tgctctatta 2280 gtcacttggt tccttaatat agaactttac tttcttcgaa aattgcagag cgattgcccc 2340 aggattctta gacaccgata tatttagact tcagaccttg cagcatgtaa tgagaatgac 2400 acgcacatgg gactcaacaa tgtctatgtt accgaaggga ggtgacacga tatggggcgg 2450 gcttgattgg tcaccggaga aaggccacac ctgttgtggg aaaaagcaaa agaacaacga 2520 aacttgtggt gaagcaggtg aaaacggagt ttccaagaaa agtcctgtta actatggaag 2580 gatgatatct tttgggaaag aagtagcaga ggctgcgcca tctgagatta ataatattga 2640 ttttcgagta aggacatata aatcataata aaccttgtac attttgtgat tgtatgatga 2700 atatctgtac attttatctg gtgaagggtg ctgtcaaagg tcagagtatc ccaaatcaca 2760 cctgtcgtga cgtgtggaca gagtaccatg acatgggaat tgctgggatc aaagctatcg 2820 ctgagtataa ggtctacact gctggtgaag ctatagatct actacattat gttgctccta 2880 agatgatggc gcgtggtgcc gctcatttct cttatggaat tgctgatgat ttggatgaca 2940 ccaagtatca agatcccaaa tactggtcaa atccgttaga gacaaagtaa gtgatttctt 3000 gattccaact gtatccttcg tcctgatgca ttatcagtct ttttgttttc ggtcttgttg 3060 gatatggttt tcagctcaaa gcttacaaag ctgtttctga gcctttctca aaaaggcttg 3120 ctcagtaata ttgaggtgc.t aaagttgata catgtgactc ttgcttataa atcctccgtt 3180

50/58 tggtttgttc tgctttttca gattaccgaa tgctcctgag atggaaatct. actcattata 3240 cggagtgggg ataccaacgg aacgagcata cgtatacaag cttaaccagt ctcccgacag 3300 ttgcatcccc tttcagatat tcacttctgc tcacgaggag gacgaagata gctgtctgaa 3360 agcaggagtt tacaatgtgg atggggatga aacagtaccc gtcctaagtg ccgggtacat 3420 gtgtgcaaaa gcgtggcgtg gcaagacaag attcaaccct tccggaatca agacttatat 3480 aagagaatac aatcactctc cgccggctaa cctgttggaa gggcgcggga cgcagagtgg '3540 tgcccatgtt gatatcatgg gaaactttgc tttgatcgaa gatatcatga gggttgccgc 3600 cggaggtaac gggtctgata taggacatga ccaggtccac tctggcatat ttgaatggtc 3660 ggagcgtatt gacctgaagc tgtga 3685

51/58 <210> 25 <211> 402 <212> cDNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (120) . . (401) <400> 25 agaaacagct ctttgtctct ctcgactgat ctaacaatcc ctaatctgtg ttctaaattc 60 ctggacgaga tttgacaaag tccgtatagc ttaacctggt ttaatttcaa gtgacagat 119

atg Met 1 CCC Pro ctt Leu att íle cat His 5 cgg Arg aaa Lys aag Lys ccg acg gag aaa Lys cca Pro tcg Ser acg Thr 15 ccg Pro 167 Pro Thr 10 Glu cca tct gaa pag gtg gtg cac gat gag gat tcg caa aag aaa cca cac 215 Pro Ser Glu Glu Val Val His Asp Glu Asp Ser Gin Lys Lys Pro His 20 25 30 gaa tct tcc aaa tcc cac cat aag 1133 tcg aac gga gga ggg aag tgg 263 Glu Ser Ser Lys Ser His His Lys X33 Ser Asn Gly Gly Gly Lys Trp 35 40 45 tcg tgc atc gat tct tgt tgt tgg ttc att ggg tgt gtg tgt gta acc 311 Ser Cys íle Asp Ser Cys Cys Trp Phe íle Gly Cys Val Cys Val Thr 50 55 60 tgg tgg ttt ctt ctc ttc ctt tac aac gca atg cct gcg agc ttc cct 359 Trp Trp Phe Leu Leu Phe Leu Tyr A.sn Ala Met Pro Ala Ser Phe Pro 65 70 75 80 cag tat gta acg gag ccg aat cac gng tcc ttt gcc tta CCC g 4 02 Gin Tyr Val Thr Glu Pro Asn His Xaa Ser Phe Ala Leu Pro 85 90

52/58 <210> 26 <211> 643 <212> cDNA <213> Zea mays <220>

<221> CDS <222> (1) . . (402) <400> 26

tgg gag Arg Glu 1 aaa Lys ata get get Ala ttg Leu aag ggg ggt Lys Gly Gly 10 gtt tac tta Leu gcc gat ggt Gly 48 íle Ala 5 Val Tyr Ala Asp 15 gat gaa act gtt cca gtt ctt agt gcg ggc tac atg tgt gcg äoä gga 96 Asp Glu Thr Val Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Gly 20 25 30 tgg cgt ggc aaa act cgt ttc agc cct gcc ggc agc aag act tac gtg 144 Trp Arg Gly Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 40 45 aga gaa tac agc cat tcg cca CCC tet act ctc ctg gaa ggc agg ggc 192 Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 60 acc cag agc ggt gca cat gtt g3.u ata atg ggg aac ttt get cta att 240 Thr Gin Ser Gly Ala His Val Asp íle Met Gly Asn Phe Ala Leu Tie 65 70 75 80 gag gac gtc atc aga ata get get ggg gca acc ggt gag gaa att ggt 288 Glu Asp Val íle Arg íle Ala Ala Gly Ala Thr Gly Glu Glu íle Gly 85 90 95 ggc gať cag gtt tat tca gat ata ttc aag tgg tca gag aaa atc aaa 336 Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp íle Phe Lys Trp Ser Glu Lys íle Lys 100 105 110 ttg aaa ttg taa cct atg gga agt taa aga agt gcc gac ccg ttt att 384

Leu Lys Leu ¹¹⁵ gcg ttc caa agt gtc ctg cctgagtgca actctggatt ttgcttaaat 432 attgtaattt ttcacgcttc attcgtccct ttgtcaaatt tacatttgac aggacgccaa 492 tgcgatacga tgttgtaccg ctattttcag cattgtatat taaactgtac aggtgtaagt 552 tgcatttgcc agctgaaatt gtgtagtcgt tttctttacg atttaatanc aagtggcgga 612 gcagtgcccc aagcnaaaaa aaaaaaaaaa a

643

53/58

<210> 27 <211> 115 <212> PRT <213> Zea mays <400> 30

Arg Glu Lys 1 íle Ala Ala Leu Lys Gly Gly Val Tyr Leu Ala Asp Gly 5 10 15 Asp Glu Thr .Val Pro Val Leu Ser Ala Gly Tyr Met Cys Ala Lys Gly 20 25 30 Trp Arg Gly Lys Thr Arg Phe Ser Pro Ala Gly Ser Lys Thr Tyr Val 35 40 45 Arg Glu Tyr Ser His Ser Pro Pro Ser Thr Leu Leu Glu Gly Arg Gly 50 55 60 Thr Gin Ser Gly Ala Kis Val Asp íle Met Gly Asn Phe Ala Leu íle 65 ' 70 75 80 Glu Asp Val íle Arg íle Ala Ala Gly Ala Thr Gly Glu Glu íle Gly 85 SO 95 Gly Asp Gin Val Tyr Ser Asp íle Phe Lys Trp Ser Glu Lys íle Lys 100 105 110 Leu Lys Leu 115

54/58 <210> 28 <211> 516 <212> cDNA <213> Neurospora crassa <400> 28 ggtggcgaag acganggcgg aagttggagg ctaacgagaa tgacnctcgg agatggatct 60 accctctaga gacacgacta ccnttgcacc cagcctcaag gtntacngtt tntatgggta 120 ggaagccgac ggagcgagcc tacatctatc tggcgcccga tcccgggacg acaacgcatc 180 tttagatgac gatcgatacg actttgactn aggggcacat tgaccacggt gtgattttgg 240 gcgaaggcga tggcacagtg aaccttatga gtttggggta cctgtgcaat aaggggtgga 300 aaatgaagag atacaatcct gcgggctcaa aaataaccgt ggtcgagatg ccgcatgaac 360 cagaacggtt caatccgaga.ggagggccga atacggcgga cttaaätatg tagaaaaggt 420 tgaaatttat gaagagtaat taaatacggc acataggtta ctcaatagta tgactaatta 480 aaaaaaaatt ttttttctaa aaaaaaaaaa aaaaaa 516

55/58 <210> 29 <211> 1562 ' · <212> genomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 29 atgaaaaaaa tatcttcaca ttattcggta gtcatagcga tactcgttgt ggtgacgatg 60 acctcgatgt gtcaagctgt gggtagcaac gtgtaccctt tgattctggt tccaggaaac 120 ggaggtaacc agctagaggt acggctggac agagaataca agccaagtag tgtctggtgt 180 agcagctggt tatatccgat tcataagaag agtggtggat ggtttaggct atggttcgat 240 gcagcagtgt tattgtctcc cttcaccagg tgcttcagcg atcgaatgat gttgtactat 300 gaccctgatt tggatgatta ccaaaatgct cctggtgtcc aaacccgggt tcctcatttc 360 ggttcgacca aatcacttct atacctcgác cctcgtctcc ggttagtact ttccaagata 420 tatcattttg ggacatttgc ataatgaaca aaatagacat aaatttgggg gattattgtt 480 atatcaatat ccatttatat gctagtcggt aatgtgagtg ttatgttagt atagttaatg 540 tgagtgttat gtgattttcc attttaaatg aagctagaaa gttgtcgttt aataatgttg 600 ctatgtcatg agaattataa ggacactatg taaatgtagc ttaataataa ggtttgattt 660 gcagagatgc cacatcttac atggaacatt tggtgaaagc Ľctagagaaa aaatgcgggt 720 atgttaacga ccaaaccatc ctaggagctc catatgattt caggtacggc ctggctgctt 780 cgggccaccc gtcccgtgta gcctcacagt tcctacaaga cctcaaacaa ttggtggaaa 840 aaactagcag cgagaacgaa ggaaagccag tgatactcct ctcccatagc ctaggaggac 900 ttttcgtcct ccatttcctc aaccgtacca ccccttcatg gcgccgcaag tacatcaaac 960 actttgttgc actcgctgcg ccatggggtg ggacgatctc tcagatgaag acatttgctt 1020 ctggcaacac actcggtgtc cctttagtta accctttgct ggtcagacgg catcagagga 1080 cctccgagag taaccaatgg ctacttccat ctaccaaagt gtttcacgac agaacťaaac 1140 cgcttgtogt aactccccag gttaactaca cagcttacga gatggatcgg ttttttgcag 1200 acattggatt ctcacaagga gttgtgcctt acaagacaag agtgttgcct ttaacagagg 1260 agctgatgac tccgggagtg ccagtcactt gcatatatgg gagaggagtt gatacaccgg 1320 aggttttgat gtatggaaaa ggaggattcg ataagcaacc agagattaag tatggagatg 1380 gagatgggac ggttaatttg gcgagcttag cagctttgaa agtcgatagc ttgaacaccg 1440 tagagattga tggagtttcg catacatcta tacttaaaga cgagatcgcá cttaaagaga 1500 ttatgaagca gatttcaatt attaattatg aattagccaa tgttaatgcc gtcaatgaat 1560 ga 1562

56/58 <210> 30 <211> 3896 <212> genomic DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 30 atgggagcga attcgaaatc agtaacggct tccttcaccg tcatcgccgt ttttttcttg atttgcggtg gccgaactgc ggtggaggat gagaccgagt ttcacggcga ctactcgaag ctatcgggta taatcattcc gggatttgcg tcgacgcagc tacgagcgtg gtcgatcctt gactgtccat acactccgtt ggacttcaat ccgctcgacc tcgtatggct agacaccact aaggtccgtg atcttcattt ccttcgctcc ttattctgtc ggtcgagtca cttgttgatg aattccaagc gaaatatagc aatgaagcat gtctcgtctc tcttattgat tcgttcatta gtcaacagtg acgcttctga atctgagttt agagtcatat aaaacágctg actcggcgag tgtttcccat cgcttttggt tcgctaaatg tagcgcaatg aatgtgtaat tagtctgcgc tttttattca actagatctg caagtttttc agagtgctca atagtagtta gaaaatgtta ggtcatttta cttgtgcatt gtgattcttt tggttgttgc ttactgatcg acgtgatgga tggtttacag cttctttctg ctgtcaactg ctggtttaag tgtatggtgc tagatcctta taatcaaaca gaccatcccg agtgtaagtc acggcctgac agtggtcttt cagccatcac agaattggat ccaggttaca taacaggtag tttcggattt ttctttcttt tgagttttct tcaatttgat atcatcttgt tgtgatataa tatggctaag ttcattaatt tggtcaattt tcaggtcctc tttctactgt ctggaaagag tggcttaagt ggtgtgttga gtttggtata gaagcaaatg caattgtcgc tgttccatac gattggagat tgtcaccaac caaattggaa gagcgtgacc tttactttca caagctcaag ttagtcctta tcaggctaat gtcttttatc ttctcttttt atgtaagata agctaagagc tctggtcgtc ttcctttttg caggttgacc tttgaaactg ctttaaaact ccgtggcggc ccttctatag tatttgccca ttcaatgggt aataatgtct tcagatactt tctggaatgg ctgaggctag aaattgcacc aaaacattat ttgaagtggc ttgatcagca tatccatgct tatttcgctg ttggtaccgg cctactatcc ttaagttacc attttatttt ttctctaatt gggggagtta tgttgtgact tactggattg agctcgatac ctgatttgtt gttgatttag gagctcctct tcttggttct gttgaggcaa tcaaatctac tctctctggt gtaacgtttg gccttcctgt ttctgaggtg acctctgact tctctttagt tttaagtagt tgatatcaac caggtcttat aactcactgg attttccttt tgaaagtatt acttttgtta attgaactgc tgtacgcgat atggtatctg tagatcttga agtgctagtt atcaaagaac atattgtggg tagtatacct gtcagcggcc ttagctaata caaccaaacc acatgtacac tgatttagtt ttcagattat tatggtagac tttaagttga gaagaaactt tgactgaaat ctttttattt taataggcta tgatttgttt attgaaatca tgtgacatat tgacatgcgc ttctcatgtt ttttgttggc aaggcttcag ggaactgctc ggttgttgtc caattctttt gcgtcgtcat tgtggcttat gccattttca aagaattgca agggtgataa cacattctgg acgcattttt ctgggggtgc tgcaaagaaa gataagcgcg tataccactg tgatgaagag gaatatcaat caaaatattc tggctggccg acaaatatta ttaacattga aattccttcc actagcggtt agactctgta tatgcaactg taacactaac aaaagtttca ccaagaatgt tcactctcat atttcgttcc tttgatgtgt atccatcagt tacagaaaca gctctagtca acatgaccag catggaatgt ggccttccca cccttttgtc tttcacagcc cgtgaactag cagatgggac tcttttcaaa gcaatagaag actatgaccc agatagcaag aggatgttac accagttaaa gaagtacgta cctttctttg tgataagaaa tattgctcat cgatcatcac ttgctggctt cttgtacgtc aaattgtttt gtttaaatct ctatatcaat tgttcatatg ctttgtcttt cttactataa gaaacaagta taatcagaaa ccttattatt gattatcagt tctctcctta tattatggaa tgtctttttc gtttacagtt atgaatgcaa aagggggtat tttagttgat tgattctctc attctctagt ttgttttgac taatagcgtc aattttgttt ttctagcaaa tctttgtgaa ttatatataa catgctaact atacttttca ggttgtatca tgatgaccct gtttttaatc ctctgactcc ttgggagaga ccacctataa aaaatgtatt ttgcatatat ggtgctcatc taaagacaga ggtatgatgc attctcaata tcacattatg cgttgacttt gttattatat tccccatttg gtttgcaata tctttttgaa ttatgattta tcttctccct tgcatcttat gctattaagc gttaaaggta ctaaatgtat gaagctgtct gtcataggtt ggttattact ttgccccaag tggcaaacct tatcctgata attggatcat cacggatatc atttatgaaa ctgaaggttc cctcgtgtca aggtaatttt ccgcaatggc agaagtaaaa caggaaggca aagtcttctg tatcagtcta gtggcatgtt atctcagttg cataagcaaa ttattaaaca actaaaattt aagtactttt ttatcattcc ttttgagctt agtggatgat cagtggctta aagtgggaag aggtgttgca tgaaacatga cacttgtatc aaagataact agcaaaacaa aactaaccca tttctgaatt

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1360

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

57/58 tcatattatt aggagtagtc gtgcttttaa aaaatttgtt ttaagaaacc gaaaaactag 3240 ttcatatctt gattgtgcaa tatctgcagg tctggaactg tggttgatgg gaacgctgga 3300 cctataactg gggatgagac ggtaagctca gaagttggtt ttgaaattat cttcttgcaa 3360 actactgaag actaagataa tacttgcttc tggaacačtg cctgctatgt tctctagtac 3420 actgcaatat tgactctccg ctacttttat tgattatgaa attgatctct tataggtacc 3480 ctatcattca ctctcttggt gcaagaattg gctcggacct aaagttaaca taacaatggc 3540 tccccaggta ctctttttta gttcctcacc ttatatagat caaactttaa gtgtactttt 3600 ctggttatgt gttgatttac ctccaatttg ttctttctaa aaatcatata tctctgtact 3660 cctcaagaac ttgtattaat ctaaacgaga ttctcattgg gaaaataaaa caacagccag 3720 aacacgatgg aagcgacgta catgtggaac taaatgttga tcatgagcat gggtcagaca 3780 tcatagctaa catgacaaaa gcaccaaggg ttaagtacat aaccttttat gaagactctg 3840 agagcattcc ggggaagaga accgcagtct gggagcttga taaaagtggg tattaa 3896

58/58 <210> 31 <211> 709 <212> cDNA <213> tomato <400> 31 ctggggccaa aagtgaacat aacaaggaca ccacagtcag agcatgatgt tcagatgtac 60 aagtgcatct aaatatagag catcaacatg gtgaagatat cattcccaat atgacaaagt 120 tacctacaat gaagtacata acctattatg aggattctga aagttttcca gggacaagaa 180 cagcagtttg ggagcttgat aaagcaaatc acaggaacat tgtcagatct ccagctttga 240 tgcgggagct gtggcttgag atgtggcatg atattcatcc tgataaaaag tccaagtttg 300 ttacaaaagg tggtgtctga tcctcactat tttcttctat aaatgtttga gtttgtattg 360 acattgtaag tattgcaaca aaaagcaaag cgtgggcctc tgagggatga ggactgctat 420 tgggattacg ggaaagctcg atgtgcatgg gctgaacatt gtgaatacag gttagaatat 480 tcaaattata ttttgcaaaa tattctcttt ttgtgtattt aggccacctt tccccggtca 540 caacgatgca gatatgtatt cggggatgtt cacctgggac agagttgcag attgaagagt 600 tctacatctc acatcctgtc acactatgtg tgatatttaa gaaactttgt ttggcggaac 660 aacaagtttg cacaaacatt tgaagaagaa agcgaaatga ttcagagag 709