CN102492742A - 促进植物营养组织中异位产三酰甘油的培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在植物叶组织中异位产三酰甘油的培养基及其应用。本发明提供了在植物营养组织中激活三酰甘油的异位代谢途径的因子在植物营养组织中异位合成三酰甘油中的应用。所述在植物营养组织中激活三酰甘油的异位代谢途径的因子为激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达的物质。所述激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达的物质为如下所述培养基。

Description

促进植物营养组织中异位产三酰甘油的培养基及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进植物营养组织中异位产三酰甘油的培养基及其应用。

背景技术

现代工业的发展使得全球对能源的需求量越来越大，而石油资源逐渐枯竭，矿物燃料的无节制开采和使用也引起了日益严重的能源危机和环境污染等问题。因此，可再生性环境友好生物柴油逐渐成为重要的清洁燃料之一。其中，植物油脂(plant oil)的主要成分三酰甘油(triacylglycerols，TAG)，是生物柴油的重要原料之一。然而，至今油料植物的油脂主要来源于种子，其油脂含量的进一步增加极其有限。因此，建立一套除种子外TAG在植物其他组织中异位合成代谢的研究体系，分离出TAG异位代谢调控的关键因子，探明其异位代谢的转换调控机制，将对废弃生物质资源的有效利用以及大幅度提高TAG的合成代谢水平都具有十分重要的前沿性科学理论意义和实际应用潜力。

TAG是由三个脂肪酸酯化到一个甘油分子上形成的，其合成发生在内质网中。自由脂肪酸穿过质体膜，在质体外膜中转变为酰基辅酶A进入内质网，在内质网中两分子的酰基辅酶A通过酯化反应与三磷酸甘油形成磷脂酸(phosphatidic acid，PA)，随后脱去磷酸集团形成二酰甘油(diacylglycerol，DAG)，随后二酰甘油酰基转移酶(即为TAG合成限速酶DGAT1，其核苷酸序列为genbank号的NM_127503)将二酰甘油(DAG)转化为三酰甘油。其中，DGAT1作为限速酶对TAG的最终合成起到了关键性的作用。

目前，改变植物体内TAG含量的研究多集中于种子胚发育早期转录因子LEC等基因的转化或通过改变TAG代谢过程中关键酶表达量的效应上。并表明通过脂类代谢途径中关键基因表达活性的改变可以调节脂类含量的增加，但其增加效果极其有限。另外，有关脂类代谢基因异位表达的研究尚处于初期阶段，对其异位表达的调控机理、特别是有关脂类代谢异位转换的调控因子、转换信号通路及其代谢转换的分子机制尚属空白。因此，确立一个有效转换TAG异位代谢途径的研究系统，是揭示TAG异位代谢机理，提高TAG合成水平的重要前提。

发明内容

本发明的一个目的是提供在植物营养组织中激活三酰甘油的异位代谢途径的因子的应用。

在上述的应用中，所述在植物营养组织中激活三酰甘油的异位代谢途径的因子为激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达的物质。

在上述应用中，所述激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达的物质为如下任一所述培养基。

在上述应用中的激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶与转录因子ABI4的结合体现；

其中，激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶启动子中两个CE1元件分别与转录因子ABI4的结合体现；

上述的三酰甘油合成限速酶启动子的序列为序列表中的序列4；

上述的转录因子ABI4的氨基酸序列为序列表中的序列1；

上述的CE1元件的核苷酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第9-13位或序列2的自5’末端第151-155位；

上述的转录因子ABI4的核苷酸序列具体为序列表中的序列3；

在上述应用中，所述植物为双子叶植物；在本发明的实施例中具体用的是拟南芥；而植物营养组织具体为幼苗。

本发明的第二个目的是提供一种提高产三酰甘油的植物的营养组织中异位合成三酰甘油的含量的培养基。

本发明提供的培养基，其为如下1)或2)：

1)所示的培养基由如下配比的19种物质组成：NH₄NO_3∶KNO₃∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO₄∶KCl∶KI∶H₃BO₃∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素：＝(0-0.035)mM∶(0-0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76-18.799)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L；

2)所示的培养基成分由如下配比的20种物质组成：NH₄NO_3∶KNO_3∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO_4∶KCl∶KI∶H₃BO_3∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素∶蔗糖＝(0-0.035)mM∶(0-0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76-18.799)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L∶(50-100)mM。

上述的1)所示的培养基成分具体可以为由如下配比的19种物质组成：NH₄NO_3∶KNO_3∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO_4∶KCl∶KI∶H₃BO_3∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素＝(0、0.0035或0.035)mM∶(0、0.0031或0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76、18.799或18.795)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L；

上述的2)所示的培养基成分具体可以由如下配比的20种物质组成：NH₄NO_3∶KNO_3∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO_4∶KCl∶KI∶H₃BO_3∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素∶蔗糖＝(0、0.0035或0.035)mM∶(0、0.0031或0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76、18.799或18.795)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L∶(50或100)mM。

本发明的第三个目的是提供一种提高产三酰甘油的植物的营养组织中异位合成三酰甘油的含量的培养基。

本发明提供的培养基，为如下1)或2)：

1)所示的培养基由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的19种物质组成：

所述NH₄NO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0-0.035)mM；

所述KNO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0-0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在1)所示的培养基中的浓度为0.17g/L；

所述KCl在1)所示的培养基中的浓度为(18.76-18.799)mM；

所述KI在1)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在1)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在1)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在1)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在1)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

2)所示的培养基其由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的20种物质组成：

所述NH₄NO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0-0.035)mM；

所述KNO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0-0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在2)所示的培养基中的浓度为0.17g/L；

所述KCl在2)所示的培养基中的浓度为(18.76-18.799)mM；

所述KI在2)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在2)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在2)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂0在2)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在2)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在2)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

所述蔗糖在2)所示的培养基中的浓度为(50-100)mM；

在上述培养基中，1)所示培养基和2)所示培养基中的所述溶剂均为水。

1)所示的培养基的所述溶质由如下终浓度的19种物质组成：

所述NH₄NO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0、0.0035或0.035)mM；

所述KNO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0、0.0031或0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在1)所示的培养基中的浓度为：0.17g/L；

所述KCl在1)所示的培养基中的浓度为(18.76、18.799或18.795)mM；

所述KI在1)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在1)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在1)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在1)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在1)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

2)所示的培养基由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的20种物质组成：

所述NH₄NO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0、0.0035或0.035)mM；

所述KNO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0、0.0031或0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在2)所示的培养基中的浓度为0.17g/L；

所述KCl在2)所示的培养基中的浓度为(18.76、18.799或18.795)mM；

所述KI在2)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在2)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在2)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在2)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在2)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

所述蔗糖在2)所示的培养基中的浓度为(50或100)mM；

在上述的培养基中，所述植物为双子叶植物，所述植物营养组织为幼苗，所述双子叶植物具体为拟南芥。

本发明的第三个目的是提供一种所述的培养基的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述的19种物质按照所述配比混合，得到所述培养基。

本发明的第四个目的是提供一种所述的培养基的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述溶质中的20种物质均溶于水达到所述终浓度，得到所述培养基。

本发明的第五个目的是提供一种在植物的营养组织中异位合成三酰甘油的方法。

本发明提供的方法，为将目的植物在任一上述的培养基中培养，收集所述目的植物的营养组织，用氯仿甲醇甲酸混合液抽提，收集有机相，即得到三酰甘油；

在上述方法中，所述氯仿甲醇甲酸混合液为将氯仿、甲醇和甲酸按照体积比为10∶1∶1混合得到的混合液；

在上述方法中，所述目的植物为双子叶植物，所述目的植物营养组织为幼苗，在本发明的实施例中具体用的双子叶植物具体为拟南芥。

本发明的实验证明，0.1mM N：50mM蔗糖MS培养基可以诱导拟南芥幼苗中异位合成贮藏脂类TAG，并且ABA信号转导途径对于激活TAG合成限速酶DGAT1的异位表达起关键作用。

附图说明

图1为60mM N以及0.1mM N培养条件下幼苗表型变化

图2为real time PCR检测DGAT1以及ABI4表达变化

图3为60mM N与0.1mM N培养条件下幼苗中TAG积累量的比较

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、低氮碳比培养条件下拟南芥幼苗表型

为了观察幼苗氮胁迫条件下的表型变化，选取0.1mM N含量的MS培养基和标准N含量(60mM)的MS培养基，并按照终浓度为50mM添加蔗糖，得到不同氮/碳比的培养基：60mM N：50mM蔗糖培养基和0.1mM N：50mM蔗糖培养基。为进一步观察植物激素ABA在低氮胁迫培养条件下所起作用，按照终浓度为10μM向60mM N：50mM蔗糖培养基中加入ABA(购自sigma)。

60mM N：50mM蔗糖培养基和0.1mM N：50mM蔗糖培养基的配方如下表1-5：

表1为20倍大量元素(g/L)

表2为200倍微量元素(g/L)

KI	0.166
		H3BO3	1.24
MnSO4·H2O	3.38
		ZnSO4·7H2O	1.72
Na2MoO4·2H2O	0.05
		CuSO4·5H2O	0.005
CoCl2·6H2O	0.005

表3为200倍Fe-EDTA(g/L)

FeSO4·7H2O	5.56
		Na2-EDTA·2H2O	7.46

表4为1000倍维生素B5(g/100mL)

myo-Iaositol	10
		Nicotinic acid	0.1
Pyridoxine-HCl	0.1
		Thiamme-HCl	1

表5为蔗糖(g/100mL)

上述的60mM N：50mM蔗糖培养基(60-50)经过换算单位也可以为如下：由如下终浓度的20种物质和水组成：NH₄NO₃的终浓度为0.035mM；KNO₃终浓度为0.031mM；CaCl₂·2H₂O的终浓度为0.44g/L；MgSO₄·7H₂O终浓度为0.37g/L；KH₂PO₄终浓度为：0.17g/L；KCl终浓度为18.795mM；KI终浓度为0.83mg/L；H₃BO₃终浓度为6.2mg/L；MnSO₄·H₂O终浓度为16.9mg/L；ZnSO₄·7H₂O终浓度为8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O终浓度为0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O终浓度为0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O终浓度为0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O终浓度为27.8mg/L；Na₂-EDTA·2H₂O终浓度为37.3mg/L；肌醇终浓度为0.1g/L；烟酸终浓度为1mg/L；吡哆醇终浓度为1mg/L；硫胺素终浓度为10mg/L；蔗糖终浓度为50mM。

上述的0.1mM N：50mM蔗糖培养基(0.1-50)经过换算单位也可以为如下：由如下终浓度的20种物质和水组成：NH₄NO₃的终浓度为0.0035mM；KNO₃终浓度为0.0031mM；CaCl₂·2H₂O的终浓度为0.44g/L；MgSO₄·7H₂O终浓度为0.37g/L；KH₂PO₄终浓度为：0.17g/L；KCl终浓度为18.799mM；KI终浓度为0.83mg/L；H₃BO₃终浓度为6.2mg/L；MnSO₄·H₂O终浓度为16.9mg/L；ZnSO₄·7H₂O终浓度为8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O终浓度为0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O终浓度为0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O终浓度为0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O终浓度为27.8mg/L；Na₂-EDTA·2H₂O终浓度为37.3mg/L；肌醇终浓度为0.1g/L；烟酸终浓度为1mg/L；吡哆醇终浓度为1mg/L；硫胺素终浓度为10mg/L；蔗糖终浓度为50mM。

60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA的培养基(60-50+ABA)：在60mM N：50mM蔗糖培养基中添加ABA，ABA的终浓度为10μM。

实施例2、低氮/碳比培养基促进了TAG的异位合成

一、低氮/碳比培养基对幼苗的影响

将拟南芥(Arabidopsis thaliana Columbia-0，种子购自Arabidopsis BiologicalResource Center(ABRC)。)分别在含有蔗糖的不同氮/碳比60mM N：50mM蔗糖培养基、0.1mM N：50mM蔗糖培养基和60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA的培养基培养(温度：22℃，光照条件：150μmolm^-2s^-2，光周期：16小时光照/8小时黑暗)7天，得到幼苗。

观察幼苗表型，如图1所示，图中bar＝2mm，可以看出氮浓度降低(0.1mM N：50mM蔗糖培养基)和外源ABA的添加(60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA的培养基)均引起幼苗褪绿黄化。由于幼苗子叶部分的表型十分相似，暗示在低氮处理下幼苗的表型可能是由于外源添加ABA所导致的。

二、低氮/碳比胁迫培养激活TAG合成限速酶基因的异位表达

首先为了研究营养条件改变导致拟南芥幼苗中积累TAG的变化，分别提取在60mMN：50mM蔗糖培养基、60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA培养基和0.1mM N：50mM蔗糖培养基下生长7天拟南芥幼苗总RNA，反转录得到cDNA。

分别对基因DGAT1(TAG合成限速酶的编码基因，引物如下表5)、ABI4(参与ABA信号转导途径基因，引物如下表5)进行RT-PCR鉴定，引物如下，实验重复三次，结果取平均值±标准差：

表5为所用PCR引物以及拟南芥基因TAIR序列号

表6为所用real time PCR反应体系如下：

模板cDNA	3μL
		引物1(2.5μM/L)	1μL
引物2(2.5μM/L)	1μL
		SYBR green Realtime PCR master minx	5μL

表7为所用PCR反应程序如下：

结果如图2所示：

从图中可以看出，60mM N：50mM蔗糖、60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA和0.1mMN：50mM蔗糖培养基培养的幼苗中DGAT1的相对表达量分别为1±0.0692、3.05±0.248394和4.9166±0.928056；图中数据来源于三个独立的生物学实验重复。

60mM N：50mM蔗糖、60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA和0.1mM N：50mM蔗糖培养基培养的幼苗中ABI4的相对表达量分别为1±0.133、1486.0405±170.54和191.87±34.10；图中数据来源于三个独立的生物学实验重复。

从图中看出，当N浓度降低时(0.1mM)以及外源添加ABA的条件下，DGAT1的表达量都有明显的升高和ABI4的表达量均有大幅度的升高。

上述实验说明：ABA可能参与了低氮条件下植物TAG合成的关键酶DGAT1的诱导调控作用。

ABA信号转导途径中的关键基因ABI4的表达量在0.1mM低氮和外源添加ABA的条件下明显增加。说明低氮培养条件打开了拟南芥幼苗中ABA信号转导途径，进一步说明激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶与转录因子ABI4的结合体现；其中，三酰甘油合成限速酶启动子的序列为序列表中的序列4；转录因子ABI4的氨基酸序列为序列表中的序列1；激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶与转录因子ABI4的结合体现；激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶启动子中两个CE1元件分别与转录因子ABI4的结合体现；三酰甘油合成限速酶启动子的序列为序列表中的序列4；转录因子ABI4的氨基酸序列为序列表中的序列1；CE1元件的核苷酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第9-13位或序列2的自5’末端第151-155位；转录因子ABI4的核苷酸序列为序列表中的序列3。

三、低氮胁迫培养条件下引起植物幼苗中TAG的大量累积

为了进一步确定在氮胁迫和外源施加ABA条件下幼苗中TAG含量的变化，分别提取在60mM N：50mM蔗糖培养基、60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA培养基和0.1mM N：50mM蔗糖的培养基中生长7天拟南芥幼苗总脂，分别测定TAG含量的变化。

1、植物总脂的提取

植物总脂提取及分离TAG方法如下：将1g植物幼苗精确称重后在液氮中速冻。将速冻的植物组织置于研钵中，加入液氮充分研磨。向研磨好的组织中加入12mL脂类提取液(氯仿∶甲醇∶甲酸＝10∶10∶1(v/v/v))，-20℃抽提过夜。10000g转速，4℃离心10分钟，将上清液转移到新的离心管中，沉淀中加入4.4mL抽提液(氯仿∶甲醇∶水＝5∶5∶1(v/v/v))重复抽提。随后10000g转速，4℃离心10分钟，将两次的上清液混合均匀后，加入6mL萃取液(0.2M H₃PO₄，1M KCL)洗涤沉淀后，于850g转速，4℃离心10分钟，溶液分层。下层有机相中即为植物总脂(脂类混合液)。

2、TAG含量的测定

1)薄层层析检测TAG含量

在烘干活化的硅胶G板上(Merck)，于距底部2cm处轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线，用毛细管将由上述1得到的脂类混合液点在薄板上，点样直径约在2mm，然后用冷风吹干。用分液漏斗配制200mL展层液(正己烷∶乙醚∶冰醋酸＝80∶20∶1(v/v/v))，强烈振摇使其充分混匀，静置后将展层液置于展开缸中，密闭静置30分钟，使展层液在展开缸中充分饱和。将已点样的硅胶板放入展层缸中，展层，至展层液前沿到达薄层顶端约2cm处时，即可取出硅胶板，记下展层剂前沿线，用冷风吹干。把硅胶板立即放入预先装置有数粒碘片的干净层析缸中，密闭约5分钟，已经展开的脂质成分将分别吸附碘蒸汽而显黄色斑点。

结果如图3A所示，可以看出，在60mM N：50mM蔗糖培养基(60-50)的培养条件下，生长7天的拟南芥叶组织中几乎检测不到TAG条带；

但在0.1mM N：50mM蔗糖培养基(0.1-50)和60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA的培养基(60-50+ABA)中均检测出明显的TAG条带。

2)甘油三脂测定试剂盒检测TAG

为了便于定量，同时采用甘油三脂测定试剂盒(购自普利来生物技术有限公司，产品目录号：E1003)进行了检测，操作方法如下：在酶标板中加入200μL工作液I，随后向反应孔中加入10μL由上述1得到的脂类混合液，混合均匀。与此同时制作TAG浓度标准曲线(试剂盒中内含标准品)。室温(25℃)静置10～15分钟后置于37℃反应5分钟。随后向样品中加入70μL工作液II，混合均匀。用日立U-3010型分光光度计测定各样品OD₄₉₂的值；制作标准曲线，分别计算植物样品中TAG的浓度。根据植物样品的质量，以干种子中TAG的含量为1，计算样品中TAG的相对含量。实验重复三次，结果取平均值±标准差，每种培养基得到的植物各取约100mg。

结果如图3B所示：60mM N：50mM蔗糖培养基、60mM N：50mM蔗糖培养基：10μM ABA和0.1mM N：50mM蔗糖培养基培养的幼苗中TAG含量分别为0.127±0.02、1.28±0.201和0.758±0.08；图中数据来源于三个独立的生物学重复实验。

3)尼罗红染色及激光共聚焦显微镜观察TAG

为了直接观察植物组织中的TAG变化，将不同培养基生长7天大的拟南芥幼苗浸泡于尼罗红工作液中，室温(25℃)黑暗处染色10分钟。用PBS缓冲液冲洗植株表面3次，每次5分钟，去掉非特异结合的染料。将整个植株制片，置于Leica TCS SP2型激光共聚焦显微镜下观察植株体内油滴积累情况。所用激发光为：488nm，发射光为550-670nm。尼罗红贮藏液(100×)为0.1％尼罗红(Molecular probs)的丙酮溶液(w/v)。尼罗红工作液的配制：在1mL PBS溶液中加入10μL尼罗红贮藏液，混合均匀后待用。

结果如图3C所示，在通常的60mM N：50mM蔗糖培养基(60-50)中生长7天的拟南芥幼苗中没有明显的TAG积累，而在60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA(60-50+ABA)和0.1mM N：50mM蔗糖的培养基(0.1-50)下生长7天拟南芥幼苗中出现明显的油滴结构。

从上述可以看出，在0.1mM N：50mM蔗糖培养基中和在60mM N：50mM蔗糖：10μM ABA中均观察到明显的TAG积累，约相当于干种子中TAG含量的80％(以干种子中TAG的含量为1)，在60mM N不添加蔗糖的培养基中生长7天的拟南芥幼苗中的TAG几乎检测不到(图2C)。进一步说明在低氮条件下TAG的异位累积与ABA有着密切关系。

Claims (10)

1.在植物营养组织中激活三酰甘油的异位代谢途径的因子在植物营养组织中异位合成三酰甘油中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述在植物营养组织中激活三酰甘油的异位代谢途径的因子为激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达的物质。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达的物质为如下权利要求5-8中任一所述培养基。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

所述激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶与转录因子ABI4的结合体现；

所述激活植物营养组织中三酰甘油合成限速酶表达是通过三酰甘油合成限速酶启动子中两个CE1元件分别与转录因子ABI4的结合体现；

所述三酰甘油合成限速酶启动子的序列为序列表中的序列4；

所述转录因子ABI4的氨基酸序列为序列表中的序列1；

所述CE1元件的核苷酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第9-13位或序列2的自5’末端第151-155位；

所述转录因子ABI4的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述植物为双子叶植物；

所述双子叶植物具体为拟南芥；

所述植物营养组织为幼苗。

5.一种提高产三酰甘油的植物的营养组织中异位合成三酰甘油的含量的培养基，其为如下1)或2)：

1)所示的培养基由如下配比的19种物质组成：NH₄NO_3∶KNO₃∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO₄∶KCl∶KI∶H₃BO₃∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素：＝(0-0.035)mM∶(0-0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76-18.799)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L；

2)所示的培养基由如下配比的20种物质组成：NH₄NO_3∶KNO_3∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO_4∶KCl∶KI∶H₃BO_3∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素∶蔗糖＝(0-0.035)mM∶(0-0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76-18.799)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L∶(50-100)mM。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于：

1)所示的培养基由如下配比的19种物质组成：NH₄NO_3∶KNO_3∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO_4∶KCl∶KI∶H₃BO_3∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素＝(0、0.0035或0.035)mM∶(0、0.0031或0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76、18.799或18.795)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L；

2)所示的培养基由如下配比的20种物质组成：NH₄NO_3∶KNO_3∶CaCl₂·2H₂O∶MgSO₄·7H₂O∶KH₂PO_4∶KCl∶KI∶H₃BO_3∶MnSO₄·H₂O∶ZnSO₄·7H₂O∶Na₂MoO₄·2H₂O∶CuSO₄·5H₂O∶CoCl₂·6H₂O∶FeSO₄·7H₂O∶Na₂-EDTA·2H₂O∶肌醇∶烟酸∶吡哆醇∶硫胺素∶蔗糖＝(0、0.0035或0.035)mM∶(0、0.0031或0.031)mM∶0.44g/L∶0.37g/L∶0.17g/L∶(18.76、18.799或18.795)mM∶0.83mg/L∶6.2mg/L∶16.9mg/L∶8.6mg/L∶0.25mg/L∶0.025mg/L∶0.025mg/L∶27.8mg/L∶37.3mg/L∶0.1g/L∶1mg/L∶1mg/L∶10mg/L∶(50或100)mM。

7.一种提高产三酰甘油的植物的营养组织中异位合成三酰甘油的含量的培养基，为如下1)或2)：

1)所示的培养基其由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的19种物质组成：

所述NH₄NO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0-0.035)mM；

所述KNO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0-0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在1)所示的培养基中的浓度为0.17g/L；

所述KCl在1)所示的培养基中的浓度为(18.76-18.799)mM；

所述KI在1)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在1)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在1)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在1)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在1)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

2)所示的培养基其由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的20种物质组成：

所述NH₄NO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0-0.035)mM；

所述KNO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0-0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在2)所示的培养基中的浓度为0.17g/L；

所述KCl在2)所示的培养基中的浓度为(18.76-18.799)mM；

所述KI在2)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在2)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在2)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在2)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在2)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

所述蔗糖在2)所示的培养基中的浓度为(50-100)mM；

1)所示培养基和2)所示培养基中的所述溶剂均为水。

8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于：

1)所示的培养基的所述溶质由如下终浓度的19种物质组成：

所述NH₄NO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0、0.0035或0.035)mM；

所述KNO₃在1)所示的培养基中的浓度为(0、0.0031或0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在1)所示的培养基中的浓度为：0.17g/L；

所述KCl在1)所示的培养基中的浓度为(18.76、18.799或18.795)mM；

所述KI在1)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在1)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在1)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在1)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在1)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在1)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在1)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在1)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在1)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

2)所示的培养基由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下终浓度的20种物质组成：

所述NH₄NO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0、0.0035或0.035)mM；

所述KNO₃在2)所示的培养基中的浓度为(0、0.0031或0.031)mM；

所述CaCl₂·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.44g/L；

所述MgSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.37g/L；

所述KH₂PO₄在2)所示的培养基中的浓度为0.17g/L；

所述KCl在2)所示的培养基中的浓度为(18.76、18.799或18.795)mM；

所述KI在2)所示的培养基中的浓度为0.83mg/L；

所述H₃BO₃在2)所示的培养基中的浓度为6.2mg/L；

所述MnSO₄·H₂O在2)所示的培养基中的浓度为16.9mg/L；

所述ZnSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为8.6mg/L；

所述Na₂MoO₄·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.25mg/L；

所述CuSO₄·5H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述CoCl₂·6H₂O在2)所示的培养基中的浓度为0.025mg/L；

所述FeSO₄·7H₂O在2)所示的培养基中的浓度为27.8mg/L；

所述Na₂-EDTA·2H₂O在2)所示的培养基中的浓度为37.3mg/L；

所述肌醇在2)所示的培养基中的浓度为0.1g/L；

所述烟酸在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述吡哆醇在2)所示的培养基中的浓度为1mg/L；

所述硫胺素在2)所示的培养基中的浓度为10mg/L；

所述蔗糖在2)所示的培养基中的浓度为(50或100)mM；

所述植物为双子叶植物，所述植物营养组织为幼苗，所述双子叶植物具体为拟南芥。

9.权利要求5或6所述的培养基的制备方法，包括如下步骤：将所述19种物质按照所述配比混合，得到所述培养基；

权利要求7或8所述的培养基的制备方法，包括如下步骤：将所述溶质中的20种物质均溶于水达到所述终浓度，得到所述培养基。

10.一种在植物的营养组织中异位合成三酰甘油的方法，为将目的植物在权利要求5-8中任一所述的培养基中培养，收集所述目的植物的营养组织，用氯仿甲醇甲酸混合液抽提，收集有机相，即得到三酰甘油；

所述氯仿甲醇甲酸混合液具体为将氯仿、甲醇和甲酸按照体积比为10∶∶1∶1混合得到混合液；

所述目的植物为双子叶植物，所述目的植物营养组织具体为幼苗，所述双子叶植物具体为拟南芥。

Images