UA75041C2 - Use of ferment of phospholipiddiacyglycerintransferase as catalyst in the process of biosynthetic producing triacylglycerin - Google Patents
Use of ferment of phospholipiddiacyglycerintransferase as catalyst in the process of biosynthetic producing triacylglycerin Download PDFInfo
- Publication number
- UA75041C2 UA75041C2 UA2001107429A UA2001107429A UA75041C2 UA 75041 C2 UA75041 C2 UA 75041C2 UA 2001107429 A UA2001107429 A UA 2001107429A UA 2001107429 A UA2001107429 A UA 2001107429A UA 75041 C2 UA75041 C2 UA 75041C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- fdat
- zeo
- sequence
- tag
- gene
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 title claims abstract 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 title abstract 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 17
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 62
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 53
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 53
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 53
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 39
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 claims description 31
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 25
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 abstract description 31
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 12
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 76
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 42
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 40
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 39
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 37
- 210000001589 microsome Anatomy 0.000 description 28
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 27
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 22
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 22
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 22
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 21
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 19
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- -1 hydroxy fatty acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108030002650 Phospholipid:diacylglycerol acyltransferases Proteins 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 125000001117 oleyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N (Z)-Geraniol Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C/CO GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N 0.000 description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 5
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 5
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 4
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100499137 Arabidopsis thaliana DGAT1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 3
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100008883 Oryza sativa subsp. japonica DGAT1-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- WBHHMMIMDMUBKC-XLNAKTSKSA-N ricinelaidic acid Chemical compound CCCCCC[C@@H](O)C\C=C\CCCCCCCC(O)=O WBHHMMIMDMUBKC-XLNAKTSKSA-N 0.000 description 3
- FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N ricinoleic acid Natural products CCCCCCC(O[Si](C)(C)C)CC=CCCCCCCCC(=O)OC FEUQNCSVHBHROZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- CCPPLLJZDQAOHD-BEBBCNLGSA-N (-)-vernolic acid Chemical compound CCCCC[C@@H]1O[C@@H]1C\C=C/CCCCCCCC(O)=O CCPPLLJZDQAOHD-BEBBCNLGSA-N 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000006810 Caesalpinia ciliata Nutrition 0.000 description 2
- 241000059739 Caesalpinia ciliata Species 0.000 description 2
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710136418 NADPH-dependent 1-acyldihydroxyacetone phosphate reductase Proteins 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N heptadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O KEMQGTRYUADPNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- RJMUSRYZPJIFPJ-UHFFFAOYSA-N niclosamide Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1Cl RJMUSRYZPJIFPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000005830 nonesterified fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003656 ricinoleic acid Drugs 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- CCPPLLJZDQAOHD-FLIBITNWSA-N vernolic acid Chemical class CCCCCC1OC1C\C=C/CCCCCCCC(O)=O CCPPLLJZDQAOHD-FLIBITNWSA-N 0.000 description 2
- CCPPLLJZDQAOHD-UHFFFAOYSA-N vernolic acid Natural products CCCCCC1OC1CC=CCCCCCCCC(O)=O CCPPLLJZDQAOHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZUAKSAWRVFBPE-UHFFFAOYSA-N 2-methylheptadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(C)C(O)=O IZUAKSAWRVFBPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-M CDP-choline(1-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)O[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 RZZPDXZPRHQOCG-OJAKKHQRSA-M 0.000 description 1
- 101100346156 Caenorhabditis elegans moe-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 102000013444 Diacylglycerol Cholinephosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 description 1
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 1
- 101710088427 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85C Proteins 0.000 description 1
- 108010051225 Diacylglycerol cholinephosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 240000003133 Elaeis guineensis Species 0.000 description 1
- 235000001950 Elaeis guineensis Nutrition 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N Ergosterol Natural products CC(C)[C@@H](C)C=C[C@H](C)[C@H]1CC[C@H]2C3=CC=C4C[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@@H]3CC[C@]12C DNVPQKQSNYMLRS-NXVQYWJNSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102000001494 Sterol O-Acyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010054082 Sterol O-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150059448 cdk7 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960001284 citicoline Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000002137 ergosterols Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001030 gas--liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000005217 methyl ethers Chemical class 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000002889 oleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003209 petroleum derivative Substances 0.000 description 1
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000010666 regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Chemical class 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 101150072397 trk2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Опис винаходу
Даний винахід стосується виділення, ідентифікації і характеристики рекомбінантних молекул ДНК, що 2 кодують ферменти, які каталізують перенос жирних кислот від фосфоліпідів до діацилгліцерину в біосинтетичному шляху одержання триацилгліцерину.
Триацилгліцерин (ТАГ) є найбільш розповсюдженим у природі джерелом енергії, що має ліпідну основу.
Вважається, що основний шлях синтезу ТАГ включає три послідовних переноси ацильної групи від ацил-СоА до гліцеринового скелету |1, 2). Протягом багатьох років ацил-СоА: діацилгліцерин ацилтрансфераза (ДАГАТ), що 70 каталізує реакцію переносу третьої ацил-групи, вважалася єдиним ферментом, який приймає участь у синтез
ТАГ. Він переводить діацилгліцерин (ДАГ) із синтезу ліпіду мембрани в ТАГ (21. Гени, що кодують цей фермент, були недавно ідентифіковані як у мишей |З), так і в рослинах |4, 5), і було показано, що закодовані білки аналогічні адцил-СоА: холестерин ацилтрансферазі (АХАТ). Також нещодавно повідомлялося, що в масляному грибі МогііегеМа гатаппіапа існує інша ДАГАТ, яка не корелює ні з ДАГАТ миші, ні із сімейством генів АХАТ чи 72 Іншим відомим геном ІЄЇ.
Даний винахід відноситься до нового типу ферментів і генів для трансформації, що кодують ці ферменти.
Більш конкретно, винахід стосується до використання генів, що кодують не описаний раніше тип ферментів, тут і далі позначених як фосфоліпід: діацилгліцерин ацилтрансферази (ФДАТ), причому ці ферменти каталізують ацил-СоА-незалежну реакцію. Зазначений тип генів, експресується окремо в трансгенних організмах, збільшить загальну кількість масла (триацилгліцеринів), виробленого в клітині. При експресії в трансгенних організмах гени ФДАТ у комбінації з геном для синтезу рідкої жирної кислоти підвищать рівень рідких жирних кислот у триацилгліцеринах.
У світі існує значний інтерес до одержання хімічної сировини, такої як жирні кислоти, для промислових цілей з поновлюваних рослинних ресурсів, а не з непоновлюваних нафтопродуктів. Ця концепція має велику с привабливість для виробників і споживачів на основі консервації ресурсів і забезпечує значні можливості для Ге) розвитку нових промислових культур для сільського господарства.
Існує різноманітна безліч рідких жирних кислот в оліях з диких видів рослин, що добре охарактеризовані.
Багато які з цих кислот мають промисловий потенціал, що привело до інтересу до одомашнювання значимих видів рослин для забезпечення агропромислового виробництва конкретних жирних кислот. --
Розвиток методів генної інженерії разом з більш глибоким розумінням біосинтезу рідких жирних кислот «Її уможливлює перенос генів, що кодують ключові ферменти, які беруть участь у синтезі конкретної жирної кислоти, з диких видів в одомашнені олійні культури. Таким шляхом окремі жирні кислоти можна одержувати з о високим ступенем чистоти і у великих кількостях при помірній вартості. ою
В усіх культурах типу рапсу, соняшника, олійної пальми і т.д. олія (тобто триацилгліцерини) є найбільш 325 цінним продуктом насіння або плодів, а інші компоненти, такі як крохмаль, білок і волокно вважаються - побічними і менш цінними продуктами. Збільшення кількості олії відносно ваги за рахунок інших сполук олійної культури збільшить цінність цієї культури. Як би роботу генів, що регулюють напрямок відновленого вуглецю у виробництво олії, можна було регулювати вбік посилення, клітина акумулювала б більшу кількість олії за « рахунок інших продуктів. Такі гени можна використовувати не тільки в клітинах, що продукують велику кількість З олії, таких як клітини олійних культур, але при їхній допомозі можна також індукувати значне продукування с олії в культурах з низьким чи помірним її вмістом, наприклад у сої, вівсі, кукурудзі, картоплі, цукровому
Із» буряку, ріпі, а також у мікроорганізмах.
Багато які з рідких жирних кислот, що представляють інтерес, наприклад, жирні кислоти з ланцюгом середньої довжини, гідрокси- жирні кислоти, епокси- жирні кислоти й ацетилен-жирні кислоти, за фізичними властивостями сильно відрізняються від звичайних жирних кислот рослин. У даному винаході виявлено, що у і видах рослин, які в природі акумулюють рідкі жирні кислоти в олії насіння (тобто в триацилгліцерині), ці 4! кислоти в мембранних (фосфо)ліпідах насіння відсутні чи присутні в дуже невеликих кількостях. Низька концентрація цих кислот у мембранних ліпідах, ймовірно, обумовлює певну функцію мембрани і, таким чином, о певні функції клітини. Одним з аспектів винаходу є те, що насіння трансгенних культур можна змусити «їз» 20 накопичувати великі кількості рідких жирних кислот, якщо ці кислоти ефективно видаляються з ліпідів мембрани і направляються в триацилгліцерини насіння. та Винахідниками виявлений новий клас ферментів рослин, каталізуючих перенос жирних кислот від фосфоліпідів до діацилгліцерину в синтезі триацилгліцерину через ацил-СоА-незалежну реакцію, також виявлено, що ці ферменти (фосфоліпід: діацилгліцерин ацилтрансферази, скорочено ФДАТ) беруть участь у 25 видаленні гідроксильованих, епоксигенованих жирних кислот, а також, можливо, інших рідких жирних кислот,
ГФ) таких як жирні кислоти з ланцюгом середньої довжини, з фосфоліпідів рослин. юю Було показано, що ця ферментативна реакція наявна в мікросомальних препаратах їх хлібопекарських дріжджів (Засспаготусез сегемівіае). Даний винахід далі стосується ферменту, що включає амінокислотну послідовність, наведену нижче під позначенням 5ЕО ІЮО Мо2, чи до його функціонального фрагмента, похідного, 60 алелі, чи гомологу ізоферменту. Був отриманий так званий "нокаутний" мутант дріжджів, дефектний за відповідним геном, і було показано, що в мікросомальних мембранах мутанта цілком повністю відсутня активність ФДАТ. У такий спосіб було доведено, що порушений ген кодує фермент ФДАТ (послідовності ЗЕО ІЮ
МО і 2). Крім того, цей фермент ФДАТ характеризується амінокислотною послідовністю, позначеною далі ЗЕО ІЮ
Мо2, що містить ліпазну ділянку консервативної послідовності ЕХКУУМЕА. бо Цей винахід також стосується ферменту, що включає амінокислотну послідовність, позначену ЗЕО ІЮ Мота,
2Ь чи Ба, чи його функціонального фрагменту, похідного, алелі, чи гомолога ізофермента.
Далі були ідентифіковані гени і/чи білки, що відповідають за раніше не відому функцію, і вони розглядаються як складові сутності даного винаходу. Був ідентифікований ген з Зспігозасспаготусез ротре,
ЗРВС776.14 (послідовність ЗЕО ІЮ Мо3), і передбачувана відкрита рамка зчитування ЗРВС776.14, САА22887 (послідовність ЗЕО ІЮО Мо13). Далі були ідентифіковані геномні послідовності Агарідорзіз (пайапа (послідовності
ЗЕ ІО Мо4, 10 і 11), що кодують передбачувані білки, а також були ідентифіковані передбачувана відкрита рамка зчитування ААС80628 з локусу АС 004557 А. ІНаійапа (послідовність ЗЕО ІЮ Мо14) і передбачувана відкрита рамка зчитування ААЮ10668 з локусу АС 003027 А. (Ппайійапа (послідовність 5260 ІЮ Мо15). 70 Також були ідентифіковані частково відсеквенований кДНК клон з Меийгозрога сгазза (послідовність ЗЕО ІЮ
Мо9) і клон Леа тауз, що містить ЕБТ (Ехргеззей Зедцепсе Тад -маркерна експресована послідовність), (послідовність ЗЕО ІЮ Мо7) і відповідна передбачувана амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮО Мов). Крім того, були ідентифіковані два кДНК клони, ЕБТ клон Агарідорзіз (пайапа (послідовність ЗЕ 10 Мо5 і відповідна передбачена амінокислотна послідовність ЗЕО ІЮ Моб) і Е5ЗТ клон І усорегвісоп езсшепіцт (послідовність ЗЕО ІЮ 7/5 Ме12). Далі, ферменти, позначені ФДАТ, що кодуються амінокислотною послідовністю з групи, що включає послідовності під номерами 5ЕО ІЮО мога, За, 56, 6 і 7р0, що містять ліпазну ділянку ЕХКУУМЕА, розглядаються як такі, що складають суть винаходу. Крім того, фермент, що включає амінокислотну послідовність, яка кодується нуклеотидною послідовністю, її частиною, похідним, алелем чи гомологом із групи, що включає послідовності під номерами 5ЕО ІЮО Мої, 16, 3, ЗБ, 4, 4а, 46, 5, 565, 6бБ, 7, 860, 9, 95, 10, 10Б, 11, 116 чи 12 чи функціональний фрагмент, похідне, алель, гомолог або ізофермент амінокислотної послідовності, що кодує фермент, складають суть винаходу.
Під функціональним фрагментом даного ферменту розуміють будь-яку поліпептидну послідовність, що виявляє специфічну ферментну активність фосфоліпід: діацилгліцерин ацилтрансферази (ФДАТ). Довжина функціонального фрагмента може варіювати в межах від 660-110 амінокислот до 660-250 амінокислот, сч переважно від 6604-50 до 660-100 амінокислот, причому "базове число" 660 амінокислот відноситься в даному випадку до поліпептидного ланцюга ферменту ФДАТ (послідовність ЗЕО ІЮ Мо2), що кодується нуклеотидною о послідовністю ЗЕ ІЮ Мо1. Отже, "базове число" функціональної повної довжини ферменту може варіювати в залежності від кодуючої нуклеотидної послідовності.
Під частиною даної нуклеотидної послідовності розуміють будь-яку нуклеотидну послідовність, що кодує ч поліпептид, який має специфічну активність фосфоліпід: діацилгліцерин ацилтрансферази (ФДАТ). Довжина частини нуклеотидної послідовності може варіювати в широкому діапазоні кількох сотень нуклеотидів, М грунтуючись на кодуючій області гена, чи висококонсервативної послідовності. Наприклад, довжина варіює в «3 межах від 1900-10 до 1900-1000 нуклеотидів, переважно від 1900-50 до 1900-7000, краще від 1900-1100 до 1900-5000 нуклеотидів, причому "базове число" 1900 нуклеотидов відповідає в даному випадку кодуючій що нуклеотидній послідовності ферменту ФДАТ ЗЕО ІЮО Мо1. Отже, "базове число" функціональної повної довжини че гена може варіювати.
Під алельним варіантом даної нуклеотидної послідовності розуміють будь-яку іншу нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид з функціонально еквівалентною активністю. До алелей відносяться, як « варіанти даної нуклеотидної послідовності, які зустрічаються в природі, так і синтетичні нуклеотидні послідовності, отримані за методами, відомими в даній області техніки. Також розглядаються змінені - с нуклеотидні послідовності, що приводять до ферменту зі зміненою активністю і/чи регуляцією або стійкому до и специфічних інгібіторів. Даний винахід далі включає природні чи синтетичні мутації раніше виділеної "» нуклеотидної послідовності. До цих мутацій відносяться заміна, додавання, делеція, інверсія або вставка одного чи більше нуклеотидів.
Під гомологічною нуклеотидною послідовністю розуміють комплементарну послідовність і/чи послідовність, -і що специфічно гібридизується з даної нуклеотидною послідовністю. Гібридизовані послідовності включають сл подібні нуклеотидні послідовності з групи ДНК чи РНК, що специфічно взаємодіють з даними нуклеотидними послідовностями в принаймні помірно жорстких умовах, відомих у даній області техніки. Кращим необмежуючим («в) прикладом жорстких умов гібридизації є наступні: гібридизація в 6 Х розчині хлориду натрію/цитрату натрію їх 50 (555) при температурі близько 452 з наступним відмиванням один чи більше разів у розчині 0.2хХ55, 0.196 505 при 50-60. Також сюди відносяться короткі нуклеотидні послідовності, наприклад довжиною від 10 до 30 -ь нуклеотидів, переважно від 12 до 15 нуклеотидів. Також сюди відносяться праймери і гібридизаційні зонди.
Гомологічна послідовність, що складає суть даного винаходу - це послідовність, що принаймні на 4095, переважно принаймні на 50-6095, краще принаймні на 7095, 8095 чи 9095, і краще принаймні на 9595, 9695, 9790, го 9895 або 9995 чи більше гомологічна нуклеотидній послідовності під номером ЗЕО І Мо1.
ГФ! Усі вищенаведені визначення вірні для амінокислотних послідовностей і функціональних ферментів і можуть бути легко трансформовані фахівцями в даній області техніки. о Під ізоферментами розуміють ферменти з такою ж чи подібною субстратною специфічністю і/чи каталітичною активністю, але іншою первинною структурою. 60 З одного боку, даний винахід спрямований на послідовності нуклеїнових кислот, що кодують ФДАТ. Сюди відносяться як послідовності, що кодують біологічно активні ФДАТ, так і послідовності, що використовуються як зонди, вектори для трансформації або проміжних конструкцій при клонуванні. Кодуюча ФДАТ послідовність може кодувати повну чи часткову послідовність, в залежності від цілей. Враховуються повна геномна послідовність або її частина, послідовність КДНК, попередник ФДАТ і зріла ФДАТ. 65 Далі винахід включає нуклеотидну послідовність, обрану з групи, що складаться з послідовностей під номерами ЗЕО ІО Мо1, 165, 3, ЗБ, 4, 4а, 95, 10, 106 або 11 чи їхніх частин, похідних, алелей чи гомологів.
Винахід стосується також неповної нуклеотидної послідовності, що відповідає нуклеотидній послідовності повної довжини з групи послідовностей під номерами 5ЕО ІЮО Мо1, 5, 560, 6бБ, 7, 860, 9, 116 чи 12 або їхніх частин, похідних, алелей чи гомологів. Крім того, нуклеотидна послідовність, що включає послідовність, принаймні, на 4095 гомологичну нуклеотидній послідовності з групи послідовностей під номерами ЗЕО ІЮ Мо, 16, З, ЗБ, 4, 4а, 4р, 5, 50, 6бБ, 7, 85, 9, 96, 10, 106, 11, 115 чи 12, також розглядається в обсязі винаходу.
Винахід стосується також генноінженерної конструкції, що включає описані нуклеотидні послідовності даного винаходу, оперативно зв'язаної з гетерологічною нуклеїновою кислотою. Термін "оперативно зв'язана" означає послідовну організацію, наприклад із промотору, що кодує послідовності, термінатора і/чи інших регуляторних /о елементів, причому кожен елемент може виконувати свою функцію при експресії нуклеотидної послідовності.
Далі, в об'ємі винаходу розглядається вектор, що включає описану нуклеотидну послідовність даного винаходу. Сюди відноситься як вектор експресії, так і вектор, що включає додатково ген селективного маркера учи нуклеотидні послідовності для реплікації в клітині хазяїна і/чи інтеграції в геном клітини хазяїна.
З іншого боку, даний винахід стосується способу одержання ФДАТ у клітині хазяїна або її потомстві, /5 Включаючи генетично змінене насіння олійних культур, дріжджі і цвілеві гриби або будь-які інші накопичуючі олію організми, шляхом експресії конструкції в клітині. Клітини, що містять ФДАТ як результат продукування кодуючої ФДАТ послідовності, також розглядаються як такі, що складають суть винаходу.
Далі винахід включає трансгенну клітину або організм, що містять описану нуклеотидну послідовність і/чи описану генноінженерну конструкцію і/чи описаний вектор. Далі предметом даного винаходу є трансгенна клітина або організм, які являють собою еукаріотичну клітину або організм. Кращими трансгенними клітинами або організмом є дріжджова клітина або клітина чи рослини або рослина. Даний винахід далі включає описану трансгенну клітину або організм зі зміненим біосинтетичним шляхом одержання триацилгліцерина. Трансгенна клітина або організм, що мають змінений вміст олії також включені в об'єм винаходу.
Далі винахід включає трансгенну клітину або організм, в яких активність ФДАТ змінена. Ця змінена сч об активність ФДАТ характеризується зміною в експресії гена, каталітичної активності і/чи регуляції активності ферменту. Більш того, трансгенна клітина або організм включені в даний винахід, причому змінений і) біосинтетичний шлях одержання триацилгліцерину характеризується запобіганням нагромадження небажаних жирних кислот у ліпідах мембрани. З іншого боку, цей винахід стосується також способів використання послідовності ДНК, що кодує ФДАТ, для збільшення вмісту олії в клітині. «- зо Інший аспект винаходу стосується переводу великих кількостей рідких жирних кислот у триацилгліцерин, синтезований у клітині, шляхом введення послідовності ДНК, що кодує ФДАТ, яка специфічно видаляє ці жирні « кислоти з ліпідів мембрани і переводить їх у триацилгліцерин. Клітини рослин з такою модифікацією також о розглядаються в об'ємі винаходу.
Далі, винахід включає спосіб одержання триацилгліцерину, що включає вирощування описаної трансгенної о
Зв Клітини або організму в умовах, при яких експресуються описана нуклеотидна послідовність і при яких в ча описаних трансгенних клітинах працює зазначений фермент, що каталізує перенос жирних кислот від фосфоліпідів до діацилгліцерину з утворенням триацилгліцерину.
Крім того, триацилгліцерини, які одержують описаним вище способом, включені в область даного винаходу.
Крім того, об'єктом винаходу є використання описаної нуклеотидної послідовності і/чи описаного ферменту « для одержання триацилгліцерину і/чи триацилгліцеринів з рідкими жирними кислотами. Використання описаної з с нуклеотидної послідовності і/чи описаного ферменту для трансформації будь-якої клітини або організму з метою . експресування в цій клітині або організмі що приводить до зміненого, переважно зрослого, вмісту олії в и? клітині або організмі, розглядається в об'ємі даного винаходу.
ФДАТ цього винаходу включає будь-яку амінокислотну послідовність, таку як білок, поліпептид або пептидний
Фрагмент, одержану з мікроорганізму, тваринного чи рослинного джерела, і виявляє здатність каталізувати -І одержання триацилгліцерину з фосфоліпіду і діацилгліцерину в умовах роботи ферменту. Під "умовами роботи ферменту" розуміють будь-які необхідні умови, можливі в навколишнім середовищі (наприклад, такі фактори як о температура, рН, відсутність інгібуючих речовин), що дозволяють ферменту функціонувати. о З приведених тут специфічних послідовностей можна одержати інші ФДАТ. Крім того, очевидно, що можна 5р одержати природні і синтетичні ФДАТ, використовуючи модифіковані амінокислотні послідовності і вихідні пи матеріали для моделювання синтетичних білків із приведених як приклад ФДАТ і з ФДАТ, які одержують при шк використанні приведених як приклад послідовностей. Модифіковані амінокислотні послідовності включають послідовності, що були мутовані, укорочені, збільшені чи змінені подібним чином, у тому випадку, якщо послідовності були частково або повністю синтезовані. Послідовності, що фактично отримані з препаратів дв рослин або ідентичні їм, або кодують ідентичні білки, незалежно від способу, використаного для одержання білка або послідовності, розглядаються як отримані природним шляхом.
Ф) Далі, для пошуку і виявлення "гомологічних" чи "взаємозв'язаних" ФДАТ з різних рослинних і мікробних ка джерел можна використовувати нуклеотидні послідовності-зонди (ДНК чи РНК) цього винаходу.
Далі, очевидно, що фахівець у даній області техніки за допомогою інформації, приведеної в даний заявці, бо Може ідентифікувати активність ФДАТ у будь-якому організмі, очистити фермент з цією активністю і у такий спосіб ідентифікувати "негомологічну" амінокислотну послідовність, що кодує такий фермент.
Даний винахід можна, власне кажучи, охарактеризувати наступними аспектами: 1. Використання гена ФДАТ (геномний клон або кДНК) для трансформації. 2. Використання молекули ДНК за п.1, де зазначена ДНК використовується для трансформації будь-якого 65 організму з метою експресування в даному організмі й одержання активного рекомбінантного ферменту ФДАТ для збільшення вмісту олії в організмі.
З. Використання молекули ДНК за п.1, де зазначена ДНК використовується для трансформації будь-якого організму з метою запобігання нагромадження небажаних жирних кислот у ліпідах мембрани. 4. Використання за п.ї7, де зазначений ген ФДАТ використовується для трансформації трансгенних накопичуючих олію організмів, розроблених для одержання будь-якої рідкої жирної кислоти, яка є шкідливою при вмісті у великих кількостях у ліпідах мембрани, до таких кислот відносяться жирні кислоти з ланцюгом середньої довжини, гідроксильовані жирні кислоти, епоксигеновані жирні кислоти й ацетиленові жирні кислоти. 5. Використання за п.1, де зазначений ген ФДАТ використовується для трансформації організмів, і де /о зазначені організми схрещують з іншими накопичуючими олію організмами, розробленими для одержання будь-якої рідкої жирної кислоти, яка є шкідливою при вмісті у великих кількостях у ліпідах мембрани, до таких кислот відносяться жирні кислоти з ланцюгом середньої довжини, гідроксильовані жирні кислоти, епоксигеновані жирні кислоти й ацетиленові жирні кислоти. б. Використання за п.1, де фермент, що кодується зазначеним геном ФДАТ чи кДНК, кодує ФДАТ з /5 вираженою ацил-специфічністю. 7. Використання за п.1, де зазначений ген або кКДНК, що кодують ФДАТ, отримані з Засспаготусез сегемізає або містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, які на 3095 чи більше ідентичні амінокислотній послідовності ФДАТ, приведеній під номером ЗЕО ІЮ Мо2. 8. Використання за п.1, де зазначений ген або кКДНК, що кодують ФДАТ, отримані з Засспаготусез сегемізає го чи містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, які на 4095 чи більше ідентичні амінокислотній послідовності ФДАТ, приведеній під номером ЗЕО ІЮ Мо2. 9. Використання за п.1, де зазначений ген або кКДНК, що кодують ФДАТ, отримані з Засспаготусез сегемізає чи містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, які на 6095 чи більше ідентичні амінокислотній послідовності ФДАТ, приведеній під номером ЗЕО ІЮ Мо2. с 10. Використання за п.1, де зазначений ген або кКДНК, що кодують ФДАТ, отримані з Засспаготусез сегемізає чи містять нуклеотидні послідовності, кодують амінокислотні послідовності, на 8095 чи більше ідентичні о амінокислотній послідовності ФДАТ, приведеній під номером ЗЕ ІЮ Мо2. 11. Використання за п.1, де зазначений ген або кКДНК, що кодують ФДАТ, отримані з рослин або містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності, які на 4095 чи більше ідентичні - зо амінокислотній послідовності ФДАТ з Агарідорзівз (пайапа чи білку, що кодується повнорозмірною копією часткових кКДНК клонів 7еа тауз, І усорегісоп езсшщепішт чи Меийгозрога сгазза. - 12. Трансгенні накопичуючі олію організми, що включають у свій геном ген ФДАТ, перенесений методом о рекомбінантних ДНК чи соматичною гібридизацією. 13. Трансгенні накопичуючі олію організми за п.12, що включають у свій геном ген ФДАТ, що має особливу о субстратну специфічність до рідких жирних кислот, і ген зазначеної рідкої жирної кислоти. ї- 14. Трансгенні організми за п. 12 чи 13 із групи, що включає грибки, рослини і тварин. 15. Трансгенні організми за п. 12 чи 13 із групи, що включає сільськогосподарські рослини. 16. Трансгенні організми за п.12 чи 13 із групи, що включає сільськогосподарські рослини, причому зазначений ген ФДАТ експресується під контролем промотору, специфічного для органу накопичення. « 17. Трансгенні організми за п.12 чи 13 із групи, що включає сільськогосподарські рослини, причому пт) с зазначений ген ФДАТ експресується під контролем промотору з насіння. 18. Олії з організмів за п. 12-17. ;» 19. Спосіб зміни ацил-специфічності ФДАТ шляхом зміни нуклеотидної послідовності кодуючого гена, що зустрічається в природі, і, як наслідок такої зміни - одержання гена, що кодує фермент із новою ацил-специфічністю. -І 20. Білок, що кодується молекулою ДНК за п.1 чи його функціональний фрагмент. 21. Білок за п.20, позначений як фосфоліпід: діацилгліцерин ацилтрансфераза. о 22. Білок за п.21 з вираженою ацил-специфічністю. о 23. Білок за п.22 з амінокислотною послідовністю, приведеною далі під номерами ЗЕО ІЮО Мо2, 13, 14 чи 15 (ї білки, що кодуються повнорозмірними чи частковими генами, приведеними далі під номерами ЗЕО ІО Мої, 3, 4, пи 5, 7, 9, 190, 11 чи 12) чи амінокислотна послідовність, що принаймні на 3095 гомологична зазначеній шк амінокислотній послідовності. 24. Білок за п.23, виділений з Засспаготусез сегемізає.
Загальні методи:
Дріжджові штами і плазміди. У роботі використовували дикі штами дріжджів ЕМ1679 (МАТо, піз3-А200 (ец2-лА1 їрі-Аб шгаз-52) чи МУЗОЗ3-1А (МАТо АОЕ2-1 сап1-100 Піз3-11,15 Іеш2-3,112 (гр1-1 ишгаЗ-1) (7). Штам
ЕМКТО04-04С(АЇ) з порушенням УМКООвж::КапмхХ2, співгенний штаму ЕМ1679, був отриманий з колекції о Еипгозсап (8). Фрагмент довжиною 2751 пари основ, що містить ген УМКООВм, із фланкуючою ДНК у 583 пари ко основ з 5 кінця і 183 пари основ з 3 кінці був ампліфікований з геномною ДНК УУЗ303-1А при використанні
Тад-полімерази і послідовностей 5-ТСТССАТСТТСТОСААААССТ-3 і 5-ССТОТСАААААССТТСТОСТО-3" у якості бо праймерів. Продукт ПЦР очищали за допомогою електрофорезу в агарозному гелі і клонували за сайтом Есокі у плазміду рВішезсгірі (ррішезсгіріраа). Для дослідження комплементації клонований фрагмент вирізували з рВійезсгірі за сайтами НіпаП-Зас і клонували за сайтами НіпаПй-Зас у плазміду ре! 39 |9), отримана плазміда позначена як руО5Б1. Для зверхекспресії гена ФДАТ фрагмент ЕсокК! довжиною 2202 пари основ із плазміди рВінпезстірі, що містить тільки 24 пари основ 5'і-рланкуючої ДНК, клонували за сайтом Ватні у вектор експресії 65 ОА 1-ТРК2 р.)МО2 (12), отримана конструкція позначена як риза.,
Мікросомальні препарати. Мікросоми з насіння соняшника, що розвиваються, (Неїїапіпив аппицв), Кісіпив соттипів і Стеріз раіаезііпа одержували за способом, описаним Зіобагі і Зіутпе |11). Для одержання мікросом дріжджів 1г дріжджових клітин (свіжа вага) ресуспендували у вмл крижаного буфера (20мМ Ттів-СІ, рН 7.9, 10мММ
МасІі», 1ММ ЗДТА, 595 (об'ємних) гліцерину, 1мМ ДТТ, 0.3М сульфату амонію) у скляній пробірці об'ємом 12мл. У до цю пробірку додавали 4мл скляних бусин (діаметр 0.45-0.5мм), потім пробірку інтенсивно струшували (ЗхбОс) у гомогенізаторі клітин МК (В. Вгашп МеіІзипдеп Ас, Німеччина). Гомогенізовану суспензію центрифугували при 20000х9 протягом 15хв при 62С, отриманий супернатант знову центрифугували при 100000х9 протягом 2г при бас. Осад, отриманий при 100000х9, ресуспендували в 0.1М розчині фосфату калію (рН 7.2) і зберігали при -8026.
Далі цей препарат названий неочищеною мікросомальною дріжджовою фракцією.
Ліпідні субстрати. Радіоактивно мічені рицінолеїнову (12-гідрокси-9-октадециленову) і вернолеву (12,13-епокси-9-октадециленову) кислоти одержували ферментативно з (1- "С|олеїнової кислоти |і
І1- "СІлінолевої кислоти відповідно шляхом інкубації з мікросомальними препаратами з Вісіпиз соттипів і
Стгеріз раїаезііпа, відповідно (12). Синтез фосфатидилхолінів (ФХ) чи фосфатидилетаноламінів (ФЕ) 19 з 14с-міченими ацильними групами в положенні зп-2 проводили при використанні або ферментативного |13), або синтетичного (14 ацилювання | ""С|олеїнової, | "СІ|рицинолеїнової чи |"С|вернолевої кислот. Діолеїл-ФХ, мічені за положенням зп-1, синтезували з зп-1-| "С|олеїл-лізо-ФХ і неміченої олеїнової кислоти, як описано в роботі (14). Зп-1-олеїл-зп-2-| "СІрицинолеїл-ДАГ синтезували з ФХ дією фосфоліпази С типу ХІ з Е Сегецз 2о (Зідта СНетіса! Со.), як описано в роботі (15). Моновернолеїл- і дивернолеїл-ДАГ синтезували з ТАГ, екстрагованих з насіння Еирпогріа Іадазсае, при використанні ТАГ-ліпази (Кігпориз аїгтпі2и2, Зідта Спетісаї!
Со.), як описано раніше (16). Монорицинолеїл-ТАГ синтезували за тим же способом при використанні ТАГ, екстрагованого з касторових бобів.
Ліпідний аналіз. Для визначення загальної ліпідного складу дріжджів клітини збирали з 4Омл рідкої с ов Культури, розбивали в шейкері зі скляними бусинами й екстрагували в хлороформ, як описано Відн і бСуег (17), потім проводили поділ за допомогою тонкошарової хроматографії в суміші гексана/диетилового ефіру/оцтової о кислоти (80:20:11) при використанні попередньо покритих пластин із силікагелем 60 (МегсК). Області ліпідів виявляли швидкою експозицією з парами І» і ідентифікували за допомогою відповідних стандартів. З пластин вирізували полярні ліпіди, стерінові ефіри і триацилгліцерини, а також залишені мінорні ліпідні класи, що «- зо називаються іншими ліпідами. Метилові ефіри жирних кислот одержували нагріванням сухого вирізаного матеріалу при 8593 протягом бОхв у 295 (об'єм/об'єм) сірчаній кислоті в безводному метанолі. Метилові ефіри в екстрагували гексаном і аналізували ГРХ на 50мх0.32мм кварцевій колонці СР-УУах58-СВ (Спготораск), як ав! внутрішній стандарт використовували метилгептадеканову кислоту. Кількісно оцінювали вміст жирних кислот у кожній фракції, ії цю величину використовували для обчислення відносної кількості кожного класу ліпідів. Для о визначення загального вмісту ліпідів аліквоти по З мл із дріжджових культур збирали центрифугуванням і їч- отримані осади промивали дистильованою водою і ліофилізували. Визначали вагу сухих клітин і кількісно оцінювали вміст жирних кислот за допомогою ГРХ аналізу після перетворення метилових ефірів, як це описано вище. Потім обчислювали вміст ліпідів як нмоль жирної кислоти (ЖК) на мг сухої ваги дріжджів. «
Ферментативні дослідження. Аліквоти неочищених мікросомальних фракцій (що відповідають 1Онмоль мікросомальних ФХ) з насіння рослин, що розвиваються, або дріжджових клітин ліофилізували протягом ночі. ДО щей с висушених мікросомів потім додавали Помічені субстратні ліпіди, розчинені в бензолі. Бензол упарювали в ц потоці Мо, залишаючи ліпіди в прямому контакті з мембранами, і додавали 0.1мл 50ОММ фосфату калію (рН 7.2). ,» Суспензію ретельно перемішували і інкубували при 302 протягом визначеного періоду часу, до ООхв. З реакційної суміші ліпіди екстрагували за допомогою хлороформу і розділяли за допомогою тонкошарової
Хроматографії в суміші гексана/диетилового ефіру/оцтової кислоти (35:70:1.5) на пластинах із силікагелем 60 -і (Мегск). Радіоактивні ліпіди виявляли і кількісно оцінювали на пластинах за допомогою електронної сл радіоавтографії (іпаіапі (тадег, Раскага, ОБ).
Культивування дріжджів. Дріжджові клітини вирощували при 282С у роторному шейкері в рідкому середовищі («в МРО (195 дріжджового екстракту, 295 пептону, 295 глюкози), синтетичному середовищі |181, що містить 290 (об'єм/ ї» 50 об'єм) гліцерину і 295 (об'єм/об'єм) етанолу, чи в мінімальному середовищі (19), що містить 16 г/л гліцерину.
Даний винахід далі характеризується наступними прикладами, що не є обмежуючими: -з Ацил-СоА-незалежний синтез ТАГ мікросомами олійного насіння. В олійному насінні виявляють велику кількість рідких жирних кислот (20). Багато які з цих жирних кислот, такі як рицинолеїнова (21) і вернолева (22) кислоти, синтезуються при використанні в якості безпосереднього попередника фосфатидилхоліну (ФХ) з олеїловою чи линолевою групами, етерифікованими за зп-2- положенням, відповідно. Однак, хоча ФХ може бути о субстратом для синтезу рідких жирних кислот і є основним мембранним ліпідом в насінні, рідкі жирні кислоти рідко виявляють у мембранах. Замість цього вони в основному включаються в ТАГ. Таким чином, в олійному іме) насінні, що накопичує рідкі жирні кислоти, повиннен існувати механізм ефективного і селективного переносу цих рідких ацильних груп від ФХ до ТАГ. Реакція переносу біохімічно охарактеризована для насіння касторових бобів 60 (Кісіпив соттипів) і Стерів раїаевіїпа, рослин, що накопичують великі кількості рисинолеїнової і вернолевої кислот відповідно, і соняшника (Неїїапійиз аппицйв), рослини, що містить в олії насіння тільки звичайні жирні кислоти. Неочищені мікросомальні фракції з насіння, що розвивається, інкубували з ФХ, у якого за в5п-2 положенням олеїлова, рицинолеїлова і вернолева групи є ""С-міченими. Після інкубації ліпіди екстрагували й аналізували за допомогою тонкошарової хроматографії. Було виявлено, що кількість радіоактивності, що бо включилася в нейтральну ліпідну фракцію, лінійно зростала протягом 4 годин (дані не наведені). Розподіл
Г"СІідцильних груп всередині нейтральної ліпідної фракції аналізували через 8Охв (Фіг.1). Цікаво, що кількість і розподіл радіоактивності між різними нейтральними ліпідами сильно залежала як від виду рослин, так і від типу | "СІацильного ланцюга. Так, у мікросомах соняшника більшість радіоактивності включилося в ДАГ, в незалежності від типу |"СІацильної групи. Навпротивагу, у мікросомах ВК. соттипіз | "СІрицинолеїлова і
Г"СІвернолеві групи переважно включилися в ТАГ, в той час як | "СІолеїлові групи в основному виявлені в ДАГ.
І нарешті, у мікросомах С. раїаевіїпйа тільки |"С)|вернолеві групи включилися в ТАГ, у той час як
І ""СіІрицинолеїлові групи в основному виявлені у виді вільних жирних кислот, а | "СІолеїлові групи - у ДАГ. Це 70 показує, що високі іп мімо рівні рицинолеїнової кислоти і вернолевої кислоти в ТАГ фракції К. соттипів і С.
Раїгезііпа, відповідно, пояснюються ефективним і селективним переносом відповідних ацильних груп від ФХ до
ТАГ у цих організмах.
Іп мійго синтез триацилгліцеринів у мікросомальних препаратах касторових бобів, що розвиваються, приведений у таблиці 1. таб, тр од; доданої | Срациптрупив ТАП о
І Доданий суботратний риемчений ніде рента | ОНА | Вон уаетАв | зОНамеютає її ЗеНТАа
Арно СіриценопейАР о дижвернолейдАЄ 17410015 55 20 пд тиною 24 пшшшрву жочв ся суттю поведе вано ік шк 1 п иекеюья «Ду лю 20 2
Бмонат Ствишнажх Немає 3 3-1 8810-8602 ЖЕ р сшентняйде нео водне саопвтев ретян новні сю офсет ко зростан сно ян фс то по АД во пнини
Со моно Сррицаневетях диелеШеДА тт Вт тет нят жтттятнк рент тттнн 1 5 5
Ге моноі м сррицинепе-еЖ о монерицинеленЯАЄ 1 БИ. 040.6 0.0 т ну кри по 1200128
ІСмонотСррицинслетльих дитрицинапетдає с 1 ор 05 г ГбменочОГрицинопенном і моноверноленндАє, |. 60, 3, 5.4 09 .. В 0. 01 0 1
ГЄменоусррициноменнфх. | диверненвіидАЄ.. 1 6. 1. 008 1 0-й 1 вв 1
ФДАТ: новий фермент, що каталізує ацил-СоА незалежний синтез ТАГ. Було перевірено, чи може ДАГ служити як ацильним донором, так і адильним акцептором у реакціях, що каталізуються мікросомами олійного насіння. Для цього немічений дивернолеїл-ДАГ інкубували або з вп-1-олеїл-вп-2-| ""СІрицинолеїл-ДАГ, або з «- 30 8вп-1-олеїл-8п-2-| "СІ|рицмнолеїл-ФХ у присутності мікросом Б. соттипів. Синтез молекул ТАГ, що містять як «
І ""СіІрицинолеїлову, так і вернолеву групи, був у 5 разів вище, коли ацил-донором служив ("СІрицинолеїл-ФХ, в порівнянні з | ""СІрицинолеїл-ДАГ (Фіг.18). Ці дані припускають, що ФХ є безпосереднім ацил-донором, а.
ДАГ-ацил-акцептором в ацил-СоА незалежному утворенні ТАГ мікросомами олійного насіння. Таким чином, ця ю реакція каталізуєтся новим ферментом, що був названий фосфоліпід: діацилгліцерин ацилтрансфераза (ФДАТ).
Зо Активність ФДАТ и мікросомах дріжджів. Дріжджові клітини дикого типу культивували в умовах, при яких в. індукується синтез ТАГ. З цих клітин одержували мікросомальні мембрани, інкубували з вп-2-І7СІ-рицинолеїл-ФХ і ДАГ і аналізували утворені ""С-мічені продукти. Було виявлено, що отримані з ФХ
І ""СІрицинолеїлові групи всередині нейтральної ліпідної фракції в основному знаходилися у вигляді вільних « жирних кислот або ТАГ, і що кількість синтезованого ТАГ залежало від кількості введеного в реакцію ДАГ З7З (Фіг.2). іп міго синтез ТАГ, що містить як рицинолеїлову, так |! вернолеву групи, типу ТАГ, не наявного іп с мімо, з екзогенного доданого вп-2-| "СІрицинолеїл-ФХ і неміченого вернолеїл-ДАГ (Фіг.2, доріжка 3) очевидно :з» демонструє наявність у дріжджових мікросомальних мембранах ацил-СоА незалежного синтезу ТАГ, що включає
ФХ і ДАГ як субстрати. Отже, синтез ТАГ у дріжджах може каталізуватися ферментом, аналогічним ФДАТ, виявленої в рослинах. -1 Ген, що кодує ФДАТ у дріжджах. Відомий ген (УМКООвм/) дріжджового генома, але нічого невідомо про функцію УМКООВМУ, крім того, що ген не є необхідним для росту в нормальних умовах. Мікросомальні мембрани 1 одержували з дріжджового штаму ЕМКТО04-04С(АЇ)) (8), у якому цей ген з невідомою функцією був порушений. о Активність ФДАТ у мікросомах досліджували при використанні ФХ із радіоактивно міченими жирними кислотами в положенні 8зп-2. У штамі з порушеним геном активність повністю була відсутня (Фіг.2 доріжка 4). Має значення т» той факт, що активність можна частково відновити присутністю УМКООВМУУ в одноколійній плазміді рОб1 (Фіг.2 щ доріжка 5). Крім того, ацильні групи фосфатидилетаноламіну (ФЕ) ефективно включалися в ТАГ мікросомами з дикого штаму, у той час як у мутантному штамі включення з цього субстрату не відбувалося (дані не приведені).
Це показує, що УМКООВУУ кодує дріжджову ФДАТ, яка каталізує перенос ацильної групи з зп-2-положення фосфоліпідів до ДАГ, утворюючої в такий спосіб ТАГ. Варто помітити, що з радіоактивних ФХ не утворювалися холестеринові ефіри, навіть при інкубаціях з додаванням ергостеринів, а також порушення гена УМКООВМУУ не
ГФ) впливало на кількість радіоактивних вільних жирних кислот, що утворюються з ФХ (дані не приведені). Це вказує з на те, що ФДАТ не має здатності синтезувати холестериновий ефір або фосфоліпазну активність.
Підвищений вміст ТАГ у клітинах дріжджів зі зверхекспресією ФДАТ. Ефект зверхекспресії гена, що кодує во ФДАТ, вивчали шляхом трансформації дріжджового штаму дикого типу плазмідою риБЗ4, в якій ген експресується з промотору СА 1:ТРК2, що індукується галактозою. Як контроль використовували клітини, що містять порожній вектор експресії. Клітини вирощували в синтетичному середовищі з гліцерином і етанолом, експресію гена індукували або через 2 години (рання логарифмічна фаза), або через 25 годин (стаціонарна фаза) додаванням галактози. Потім клітини інкубували протягом ще 21 години, після чого їх збирали і проводили б дослідження. Було виявлено, що зверхекспресія ФДАТ не спричиняє значного впливу на показник росту, визначений за оптичною щільністю. Однак, у штамі зі зверхекспресією ФДАТ загальний вміст ліпідів,
вимірюваний як мкмоль жирних кислот на мг сухої ваги дріжджів, був на 4795 (у логарифмічній фазі) або на 2995 (у стаціонарній фазі) вище, ніж у контролі. Крім того, зверхекспресія ФДАТ не впливала на вміст полярних ліпідів або стеринового ефіру. Навпаки, підвищений вміст ліпідів у цих клітинах цілком залежить від підвищеного вмісту ТАГ (Фіг.ЗА, В). Так кількість ТАГ зросла в 2 рази в клітинах, зверхекспресуючих ФДАТ, у ранній логарифмічній фазі і на 4095 у клітинах у стаціонарній фазі. Слід зазначити, що при зверхекспресії ФДАТ значне підвищення вмісту ТАГ досягалося навіть в умовах (тобто в стаціонарній фазі), коли індукується ДАГАТ і значно сприяє синтезу ТАГ. Активність ФДАТ іп міо, досліджена в мікросомах зі штаму, зверхекспресуючого
ФДАТ, була в 7 разів вище, ніж у контрольному штамі, це спостереження співпадає з підвищеними рівнями ТАГ, 7/0 що спостерігалися іп мімо (Фіг.3С). Ці результати ясно вказують на потенційне використання гена ФДАТ для підвищення вмісту олії в трансгених організмах.
Субстратна специфічність дріжджової ФДАТ. Субстратну специфічність дріжджової ФДАТ досліджували за допомогою мікросом, отриманих зі штаму, зверхекспресуючого ФДАТ (Фіг.4). Рівень синтезу ТАГ в умовах, приведених на Фіг.4, з діолеїл-ФХ як ацил-донора, складав 0.15нмоль у хвилину на мг білка. За умови, коли 75 обидві олеїл-групи ФХ є міченими, у даних умовах експерименту було можливо виявити перенос 11пмоль/хв
Г"СІолеїл-ланцюги в ТАГ і утворення 15пмоль/хв лізо-ФХ. У мікросомах зі штаму, дефіцитного за ФДАТ, не було виявлено ТАГ, а лізо-ФХ був виявлений у слідових кількостях, що припускає, що дріжджова ФДАТ каталізує утворення еквімолярних кількостей ТАГ і лізо-ФХ при наявності ФХ і ДАГ в якості субстратів. Той факт, що лізо-ФХ утвориться в трохи більших кількостях, ніж ТАГ, може пояснюватися присутністю в дріжджових
Ммікросомах фосфоліпази, яка продукує лізо-ФХ і неетерифіковані жирні кислоти з ФХ.
Специфічність дріжджової ФДАТ стосовно різних положень ацил-групи досліджували шляхом інкубації мікросом з діолеїл-ФХ, у якого | "С)ацильна група знаходиться або в положенні зп-1 (Фіг.4А смуга 2), або в положенні зп-2 (Фіг4А смуга 3). Було виявлено, що в першому випадку основним ""С-міченим продуктом був лізо-ФХ, а в останньому - ТАГ. Був зроблений висновок про те, що дріжджова ФДАТ має специфічність до С переносу ацил-групи з положення зп-2 фосфоліпіду до ДАГ, при цьому утворяться зп-1-лізо-ФХ і ТАГ. У даних о умовах дослідження з з8п-1-міченого ФХ зворотною дією СОР-холін (цитидиндифосфат-холін): холін фосфотрансферази утворяться слідові кількості 14С-міченого ДАГ. Цей мічений ДАГ може бути далі перетворений у ТАГ дією ФДАТ. Отже, неможливо відрізнити, чи утворяться мінорні кількості міченого ТАГ у присутності діолеїл-ФХ, що несе | "СІацил-групу в зп-1 положенні, чи синтезуються прямо з взп-1-міченого ФХ - під дією ФДАТ, що також може діяти за зп-1 положенням, чи він спочатку переводиться в зп-1-мічений ДАГ і «І потім ацилюється ФДАТ зі строгою селективністю до переносу ацил-групп за зп-2-положенням ФХ. Разом ці факти вказують на те, що ФДАТ, що кодуються УМКООВм, катализує перенос ацил-групи від 5п-2 положення ФХ о до ДАГ, при цьому утворяться ТАГ і лізо-ФХ. ю
Далі вивчали субстратну специфічність ФДАТ стосовно головної групи ацил-донора, переносимій ацильній
Зо групі і адильним ланцюгам акцепторної молекули ДАГ. ФХ і ФЕ є двома основними мембранними ліпідами 5. - сегемівіде, і, як показано на Фіг4АВ (смуги 1 і 2), у реакції, зо каталізується ФДАТ, діолеїл-ФЕ в якості ацил-донора приблизно в 4 рази більш ефективний, ніж діолеїл-ФХ. Крім того, рівень переносу ацильної групи сильно залежить від типу переносимо) ацил-групи. Так, рицинолеїл-група в положенні 5п-2 ФХ переноситься в «
ТАГ у 2.5 рази більш ефективно, ніж олеїл-група в тому ж положенні (Фіг.48, смуги 1 і 3). Навпаки, дріжджова - 70 ФДАТ переносить вернолеву й олеїлову групи однаково ефективно (Фіг.АВ, смуги 1 і 4). Ацильній ланцюг с акцепторної молекули ДАГ також впливає на ефективність реакції. Так, ДАГ з рицинолеїловою чи вернолевою з» групою є більш ефективним ацил-акцептором, ніж діолеїл-даг (Фіг.48, смуги 1, 5 і 6). Разом ці результати ясно показують, що ефективність переносу ацильної групи, катализованого ФДАТ, сильно залежить від властивостей субстратних ліпідів.
Гени ФДАТ. Нуклеотидні і амінокислотні послідовності декількох генів ФДАТ приведені під номерами 5ЕО ІЮ 7 Мо1-15. Подальші умовні і/чи часткові послідовності приведені під номерами ЗЕО ІЮО Мот1а-5а і 156-116 відповідно. ос Одна з геномних послідовностей Агарідорвзів (ЗЕО ІЮ Мо4) ідентифікована в ЕЗТ кКДНК клоні Агабідорзіз, Т04806.
Цей кДНК клон повністю охарактеризований, нуклеотидна послідовність приведена під номером ЗЕО ІЮ Моб. о Грунтуючись на гомології послідовностей КДНКТО4806 і геномній послідовності Агабідорвів (наійапа (ЗЕО ІЮ Мод), «» 20 можна помітити, що в положенні 417 в кКДНК клоні присутній додатковий А (дані не приведені). При виключенні ах цього нуклеотида вийде амінокислотна послідовність, закодована в послідовності під номером ЗЕО ІЮ Моб. 7" Підвищенний вміст ТАГ у насінні Агарідорзіз (Найапа, експресують дріжхджову ФДАТ. Для експресії гена дріжджовий ФДАТ у Агабрідорзіз (пайапа фрагмент ЕсокК!І із плазміди рВіезсгіріРОАТ клонували разом з паріп-промотором (25) у вектор рОоРТМ-КАМ (26). Відбирали плазміду (роМарРбАТ) з геном дріжджової ФДАТ у правильній орієнтації і трансформували їй Аадгорасіегішт (Штеїасіеп5. Ці бактерії використовували для
ГФ) трансформації рослин соЇштбіа Агарідорвіз (Наійапа ІЗ-24)| методом кореневої трансформації (27). Як контроль використовували рослини, трансформовані порожнім вектором. о Збирали насіння першого покоління (Т1) і пророщували на середовищі, що містить канаміцин. Від окремих рослин збирали насіння другого покоління (12) і досліджували вміст у них жирних кислот шляхом кількісної 60 оцінки метилових ефірів цих кислот методом газо-рідинної хроматографії після метилювання насіння 290 сірчаною кислотою в метанолі при 8592 протягом 1.5 години. Як внутрішній стандарт при кількісній оцінці використовували метилові ефіри гептадеканової кислоти.
Після трансформації роМарРбАТ від однієї рослини Т1 (26-14) одержали сім рослин 12, з яких З рослини дали насіння зі статистично (за двостороннім критерієм з табличною поправкою) більш високим вмістом олії в бо порівнянні з насіннями, отриманими від рослин 12, що походять від рослини Т1 (32-4), трансформованого порожнім вектором (таблиця 2). ; ни и о: ЕІ 1000 ит нн и о ЕСЕ о винну 1900 тв 100 вну ни и о ЕС нн й
ПИ ПЕ ИН ПОСТ ЕТ) нн и ЕЕ В ЕС кону 2о 100 оту пиши ни ли По пи ЕЕ нин пи І НН ЕТ
У переліку послідовностей: Ге депотіс ОМА - геномная ДНК о сОМА- кдНК
ФІГ.
Метаболізм ""С-міченого ФХ в нейтральну ліпідну фракцію мікросомами рослин. (А) Мікросоми з насіння соняшника, що розвивається, К. соттипіз і С. раІаевзііпа інкубували протягом 8Охв при 309С із ФХ (8 нмоль) з ж олеїновою групою в вп-1 положенні і ""С-міченою олеїновою, рицинолеїновою чи вернолевою кислотою в « положенні 85п-2. Методом тонкошарової хроматографії з наступною електронною радіоавтографією кількісно оцінювали радіоактивність, що включилася в ТАГ (незаштриховані смуги), ДАГ (зафарбовані смуги) і о неетерифіковані жирні кислоти (заштриховані смуги), дані приведені у відсотках від внесеного міченого юку субстрату. (В) Іп міго синтез ТАГ, що несе дві вернолеві й одну | "СІрицинолеїлову групи, мікросомами з В. соттипів. В якості субстрату додавали немічений дивернолеїл-ДАГ (бнмоль) разом або з ї- вп-1-олеїл-взп-2-| "СІрицинолеїл-ДАГ (0.А4нмоль, 7700 (розп/хв)у/нмоль), або з вп-1-олеїл-вп-2-| "СІ|рицинолеїл-ФХ (О.4нмоль, 7700 (розп/хв)у/нмоль). Мікросоми інкубували із субстратами протягом ЗОхв при 302, після чого відбирали зразки для ліпідного аналізу, як описано в розділі "загальні методи". Приведено середні значення « 70 ДВОХ експериментів. -о
ФІГ.2. с Активність ФДАТ у дріжджових мікросомах, визначена за допомогою радіоавтографії нейтральних ліпідних :з» продуктів, розділених ТШХ. Досліджували активність ФДАТ мікросомальних мембран (ІОнмоль ФХ) із дріжджового штаму дикого типу ЕМ1679 (доріжки 1-3), співгенного дріжджового штаму (ЕМКТО04-04С(АЇ)) з Порушеним геном УМкоООвВмУ (доріжка 4) або того ж штаму з порушенням, трансформованого плазмідою рО51, що - містить ген УМКООвм після його нативного промотору (доріжка 5). В якості субстрату використовували 2нмоль вп-1-олеїл-вп-2-І| "СІрицинолеїл-ФХ разом або з Бнмоль одіолег-ДАГ (доріжки 2, 4 і 5) або з о гас-олеїл-вернолеїл-ДАГ (доріжка 3). Дослідження ферменту і ліпідний аналіз проводили, як описано в розділі о Матеріали і Методи. Клітини попередньо культивували протягом 20г у рідкому середовищі УРО, збирали і 5о ресуспендували в рівному об'ємі мінімального середовища (19), що містить 16бг/л гліцерину. Потім клітини ве вирощували ще 24 години і збирали. Селекцію за плазмідою проводили вирощуванням клітин у синтетичному як середовищі без урацилу (18). Скорочення: 1-ОН-ТАС, монорицинолеїл-ТАГ; /1-ОН-1-ер-ТАб, монорицинолеїлмоноверноліл-ТАГ; ОН-ЕРА, неетерифікована рицинолеїнова кислота.
ФІГ.3.
Вміст ліпідів (А. В) і активність ФДАТ (С) М дріжджових клітинах зі звеохекспресією ФДАТ. Ген ФДАТ у плазміді рО54 зверхекспресувався з індукованого галактозою промотору СА 1-ТРК2 у штамі дикого типу
Ф) МУ303-1А (7). Експресію індукували після (А) 2 годин або (В) 25 годин росту додаванням галактози до кінцевої ка концентрації 2905 (вага/об'єм). Потім клітини інкубували ще 22 години і збирали. Кількість ліпідів у зібраних клітинах визначали ГРХ аналізом жирних кислот і виражали в мкмоль жирних кислот на мг сухої ваги в ТАГ бо (незаштрихована смуга), полярних ліпідах (заштрихована смуга), стеринових ефірах (зафарбована смуга) чи в інших ліпідах (смуга в смужку). Приведено середні значення результатів для трьох незалежних культур дріжджів. (С) Іп міго синтез ТАГ мікросомами, отриманими з дріжджових клітин, що містять або порожній вектор (вектор), або плазміду з ФДАТ («ФДАТ). Клітини вирощували так само, як зазначено в описі Фіг.ЗА. До аліквот мікросом (ЛОнмоль ФХ) додавали субстратні ліпіди діолеїл-ДАГ (2.5нмоль) і взп-1-олеїл-вп-2-|7СІ-олеїл-ФХ (2нмоль) і 65 проводили інкубацію при 2823 протягом 1Охв. Кількість мітки, що включилася в ТАГ, визначали електронною радіоавтографією. Приведено середні значення результатів двох експериментів.
ФІГ.4.
Субстратна специфічність дріжджової ФДАТ. Активність ФДАТ досліджували інкубацією аліквот ліофілізованих мікросом (ЛОнмоль ФХ) із субстратними ліпідами при 302С протягом 1Охв (А) чи ЗУОхв (В). В
ЯКОСТІ субстрату використовували немічений ДАГ (2.5нмоль) разом з різними міченими фосфоліпідами, як показано на малюнку. (А) Специфічність дріжджової ФДАТ до зп-положення стосовно субстрату -ацил-донору.
Діолеїл-ДАГ разом з 0/0 вп-1-/7СІолеїл-вп-2-| "С|олеїл-ФХ (ди-/7СІ-ФХ), / вп-1-1 Я Солеїл-вп-2-олеїл-фх (вп1-12СІ-ФХ) чи. вп-1-олеїл-вп-2-(СІолеїл-ФХ. (вп2-(7СІ-ФХ). (В) Специфічність дріжджової ФДАТ стосовно головної групи фосфоліпіду й ацил-групи фосфоліпіду, а також до діацилгліцерину. Діолеїл-ДАГ разом з 70. вп-1-олеїл-вп-2-| "СІолеїл-ФХ (олеїл-ФХ), вп-1-олеїл-вп-2-І| "СІ|олеїл-ФЕ (олеїл-ФЕ), вп-1-олеїл-вп-2-| "С|рицинолеїл-ФХ (рицинолеїл-ФХ) чи вп-1-олеїл-зп-2-І"СІ|верноліл-ФХ (верноліл-ФХ). В експериментах, наведених у двох крайніх праворуч смугах, використовували монорицинолеїл-ДАГ (рицинолеїл-ДАГ) чи моно-вернолеїл-ДАГ (вернолеїл-ДАГ) разом з зп-1-олеїл-вп-2-|"С|олеїл-ФХ. Мітку, що включилася в ТАГ (зафарбовані смуги) і лізо-ФХ (ЛФХ, незафарбовані смуги), кількісно оцінювали за допомогою т електронної радіоавтографії. Приведено середні значення результатів двох експериментів. Використовували мікросоми з клітин М/У303-1А, зверхекспресуючих ген ФДАТ із промотору САЇ 1-ТРК2, як це зазначено в описі
Фіг.3. Експресію індукували в ранній стаціонарній фазі і збирали клітини після додаткового нарощування протягом 24 годин.
ТАБ:
Іп мйго синтез триацилгліцеринів у мікросомальних препаратах з касторових бобів, що розвиваються.
Аліквоти мікросом (20нмоль ФХ) ліофилізували і додавали субстратні ліпіди в бензольному розчині: (А) 0.4нмоль
Г'СІ-ДАГ (7760 (розп/хв)у/нмоль) і, де зазначено, 1.6бнмоль неміченого ДАГ; (В) О.4нмоль | СІ-ДАГ (7760 (розп/хву/нмоль) і Бнмоль неміченого ди-рицинолеїл-ФХ і (С) 0.25нмоль | 7С1-ФХ (4000 (розп/хву/нмоль) і Бнмоль с неміченого ДАГ. Бензол упарювали М» і додавали 0.1мл 50мММ розчину фосфату калію, ретельно перемішували і інкубували при 302 протягом (А) 2Охв; (В) і (С) ЗОхв. Дослідження зупиняли екстракцією ліпідів у хлороформ. (8)
Потім ліпіди розділяли за допомогою тонкошарової хроматографії на пластинах з силікагелем 60 (Мегек;
Багтвіаді, Септапу) у суміші гексана/диетилового ефіру/оцтової кислоти 35:70:1.5. Візуалізували радіоактивні ліпіди і кількісно оцінювали радіоактивність на пластині за допомогою електронної радіоавтографії (іпвіапі пе зр їтацдег, Раскага, 05). Приведено середні значення результатів двох експериментів.
Радіоактивність у різних типах утворених триацилгліцеринів (ТАГ). Використовувані скорочення: 1-ОН-, - моно-рицинолеїл; 2-ОН, ди-рицинолеїл-; 3-ОН-, тририцинолеїл;. 1-ОН-1-мег-, моно-рицинолеїл-моновернолеїл-; (у 1-ОН-2-мег-, монорицинолеїл-дивернолеїл-. Радіоактивно мічені ДАГ і ФХ одержували ферментативним шляхом.
Радіоактивно мічена рицинолеїл-група знаходиться в в5п-2-положенні ліпіду, а немічена олеїл-група - у о
Зв 8п-1-положенні. Немічений ДАГ з вернолеїл- чи рицинолеїл-ланцюгами одержували дією ТАГ ліпази (б) наолію М.
Еирпогріа іадазсае чи касторового бобу відповідно. Синтетичний ди-рицинолеїл-ФХ люб'язно наданий
Меїаропішт Адгіріоз (Італія).
ТАБ.2:
Загальна кількість жирних кислот на мг насіння рослин 12, отриманих від окремих рослин АгабБідорвів «
ВРаїапа, трансформованих геном дріжджової ФДАТ під контролем паріп промотору (26-14) чи трансформованих у с порожнім вектором (32-4). . їж статистичне розходження між контрольними рослинами і рослинами, трансформованими ФДАТ за и? двостороннім критерієм з табличною поправкою при «-5.
Опис послідовностей :
ЗЕ 10 Мо1: Послідовність геномної ДНК і передбачувана амінокислотна послідовність гена ФДАТ -І зЗасспаготусевз сегемізае, УМКООВм, номер у СепВапк 7277 1623 і 13139, ІЮ номер нуклеотидної послідовності 1302481. і-й ЗЕ 10 Мо2: Амінокислотна послідовність у передбачуваній відкритій рамці зчитування УМКООвжм з ав! засспаготусев сегемізає.
ЗЕО ІЮ Мое3: Послідовність геномної ДНК гена БРВС776.14 Зспігозасспаготусез ротре. шк ЗЕО ІЮ Мо4: Послідовність геномної ДНК частини локусу Агарідорвзіз (паіапа, номер у СепВапк АВОО6704. - М ЗЕО ІЮ Моб: Нуклеотидна послідовність КДНК клону Агарідорвзіз (пайапа, номер СепВапк Т04806, ІЮ номер нуклеотидної послідовності 315966.
ЗЕО ІЮО Моб: Передбачена амінокислотна послідовність КДНК клону, Агабрідорзіз (Наіапа, номер у СепВапк МО4806.
ЗЕО ІЮ Мо7: Нуклеотидна й амінокислотна послідовності ЕТ клону 7еа тауз, номер у СепВапк АІ491339, ІЮ
Ф) номер нуклеотидної послідовності 4388167. ко ЗЕО ІЮ Мо8: Передбачена амінокислотна послідовність ЕЗТ клону 7еа тауз, номер у СепВапк АІ491339, І номер нуклеотидної послідовності 4388167. во ЗЕО ІЮ Ме9: Послідовність ДНК частини Е5Т клону Меозрога сгазза МУ071, номер у СепВапк АІЗО8644, І номер нуклеотидної послідовності 4241729.
ЗЕО ІЮ Мо10: Послідовність геномної ДНК частини локусу Агабідорвзіз (Наіапа, номер у СепВапк АСО04557.
ЗЕО ІЮ Мо11: Послідовність геномної ДНК частини локусу Агабідорвзіз (Наіапа, номер у СепВапк АСОО3027.
ЗЕО ІЮ Мо12: Послідовність ДНК частини кДНК клону І усорегвісоп езсцшепішт, номер у СепВапк АІ486635. 65 ЗЕО ІО Мо13: Амінокислотна послідовність передбачуваної відкритої рамки зчитування САА22887 гена
ЗРВС776.14 Зспігозасспаготусевз ротре.
ЗЕО ІЮ Мо14: Амінокислотна послідовність передбачуваної відкритої рамки зчитування ААС80628 Агабрідорзіз
Інаїііапа, отриманої з локусу, Агарідорзів (Наіапа з номером у СепВапк АСО04557.
ЗЕ 10 Мо 15: Амінокислотна послідовність передбачуваної відкритої рамки зчитування ААС80628
Агабрідорзіз ІНаііапа, отриманої з локусу Агарідорзіз (Наіапа з номером у СепВапк АСОО3027.
Додаткові умовні в/чи часткові послідовності:
ЗЕО ІЮ Моїа: Амінокислотна послідовність дріжджової відкритої рамки зчитування (ОКЕ) УМКООбм з зЗасспаготусез сегемізає.
ЗЕО ІЮ Мога: Амінокислотна послідовність області геномної послідовності Агарідорвів (Наійапа (АСО04557). 70 ЗЕО ІЮ МоЗа: Амінокислотна послідовність області геномної послідовності Агарідорзіз (Наіапа (АВО0О6704).
ЗЕО ІЮ Мода: Послідовність геномної ДНК і відповідна амінокислотна послідовність дріжджової ОКЕ УМКООвм з засспаготусез сегемізає.
ЗЕО ІЮ Моба: Амінокислотна послідовність дріжджової ОКЕ УМКООВм з Засспаготусез сегемізає, отримана з відповідної послідовності геномної ДНК.
ЗЕО ІЮО Мо1рб: Геномна послідовність ДНК гена ФДАТ ЗБасспаготусез сегемізае УМКООвж, ІЮ номер нуклеотидної послідовності в СепВапк 1302481, і передбачувана амінокислотна послідовність.
ЗЕО ІЮ Мо2р: Передбачувана амінокислотна послідовність дріжджового гена УМКООвм/ з Засспаготусевз сегемізає.
ЗЕО ІЮ МозБр: Послідовність геномної ДНК гена 5РВСТ776.14 з 5спіговасспаготусевз ротре.
ЗЕО ІЮ Мо4Бр: Послідовність геномної ДНК частини локусу Агабрідорвзізв ІНаійапа, номер у СепВапк АВОО6704.
ЗЕО ІЮ Мо5р: Нуклеотидна послідовність і відповідна амінокислотна послідовність ЕТ клону Агабрідорзів
Іпаіїапа, номер у СепВапк Т04806, Ю номер 315966.
ЗЕО ІЮО Мобр: Нуклеотидна й амінокислотна послідовності КДНК клону 7еа тауз, ІЮО номер у СепВапк 4388167. с
ЗЕО ІЮ Мо7р: Амінокислотна послідовність кДНК клону 7еа таувз, ІО номер у СепВапк 4388167.
ЗЕО ІЮ Мов8Бр: Послідовність ДНК частини кКДНК клону Меигозрога сгазза М/0701, ІО номер 4241729. і)
ЗЕО ІО Мо9р: Послідовність геномної ДНК частини локусу Агабрідорзів (пайапа з номером у СепВапк
АСОО04557.
ЗЕО ІО Мо10р: Послідовність геномної ДНК частини локусу Агарідорвзів (Шайапа з номером у бепВапк зо АСОО3027.
ЗЕО ІО Мо11р: Послідовність ДНК частини кКДНК клону Іусорегвісоп езсшепішт з номером у СепВапк -
АІ486635. о
Посилальні матеріали, згадані в описі: 1. ВеїІ, К. М. « СоІіетап, К. А. (1980) Аппи. Кеу. Віоспет. 49. 459-487. Щео, 2. Зіутпе, 5. 5 Зіорай, К. (1987) іп Те Біоспетівігу ої ріапів: а сотргепепзіме ігеаівіе. Мої. 9, еа. ї-
ЗішШштрі, Р. К. (Асадетіс Ргезв, Мем ХогК), рр. 175-214. 3. Сазев. 5. еї аі. (1998) Ргос. Маїй). Асад сі. ОА 95,13018-13023. 4. Норрз, О. Н., Гм, С. 8. Нійв, М. у). (1999) РЕВ5 І ей. 452.145-9 5. 20иц, 9.. Меї, У., УчаКо, С. Китаг, А., Зеїмага), 0. 5 Тауїог, Ю. С (1999) РіІапі у). 19, 645-653. « б. І агаігара!, К., НамуКіпе, О., Маї, 9У., 5 МУадпег, М. (1999) Абрвігасі ргезепієй аї (Ше Віоспет. Мої. Ріапі ств) с Еацу Асідз СіІусегоїїрідв Зутровзішт, Зоцій І аКе Тапое, ОА.
Й 7. Тротазв. В. 9. 8 Коїйзіеїп, К. (1989) Сеї! 56, 619-630. а 8. Епііап. К.-О. 85 Кобег, Р. (1998) Мей. Місгобіо! 26, 431-449. 9. Кепт, І, де Мопіідпу, ., Уипа, К. 8 І асгоціе, Р. (1990) Сепе 88,149-157. 10. Коппе, Н., Сагірего, М., Ни, .-2. 5. Мепіїп, у. 0. (1991) Мої. СеїІ. Вісі. 11, 4876-4884. -І 11. обра, К. 5 5іутпе, 5. (1990) іп Мейпоа іп Ріапі Віоспетівігу, мо! 4, едв. Нагмоса. 9. Ї 85 Вомжуег. У). К. (Асадетіс ргезв, І опдоп), рр. 19-46. 1 12. Вайг, М., 5тйй, М. А., Уопезоп, І, (обГ, А. К. 5 Біутпе, 5. (1991) Віоспет. 9. 280,507-514. о 13. Вапаз, А., допапззоп, Ї. 5 5іутпе, 5. (1992) Ріапі 5сіепсе 84,137-144. 14. Капаа, Р. 5 УМеїІв, М. А. (1981) . І ріа. Кев. 22. 877-879. о 15. Фан, 0., ЕК, В. 5 Біутпе. 5. (1998) Ріапі Рпузіо! 117, 197-205. шк 16. іобагі, К., Мапспва, М. 5 Гептап М, Оапідміві. А. 5 Біутпе, 5. (1997) Ріапіа 203, 58-66. 17. Відн, Е. б. 5 буег, МУ. 9. (1959) Сап. 9. Віоспет. РНузіо!. 37, 911-917. 18. Зпегтап, РГ., Ріпк, с. МК. « Ніскв. 9. В. (1986) іп Іарогагу Соцгзе Мапиаі! їог Меїйодз іп Уеавг дв Зепепіїсв (Соїа Зргіпу Нагрог І арогафюгу) 19. Меезіегв, Р. А. Е. Р., Ниї|регів, 0. М. М. апа Еддіпк. 0. (1996; Аррі. Місгобіо! Віогеснпої. 45, 575-579. (Ф) 20. мап де со, Б. 9)., Бох, В. б. «5 БоттегміШе, С (1993), іп І ірій тейароїївт іп ріапів, ед. Мооге, Т. 5. ка (СКС Ргеззв, Іпс.), рр. 91-126. 21. мап де / со, Р. ., Вгоцп, Р.. Тигпег, 5. « ЗоттегміШе, 5. (1995) Ргос. Маї). Асад 5сі ОБА 95.6743-6747. во 22. ее, М. ІГептап, М., Вапаз, А., Ваг, М., Зіпуй, 5., ЗсПпмеігег, М., Міїввоп, К., І ЩШепрего, С,
Банідміві. А., зиттезоп, Р-0., 5ібаані, 5., Огееп, А., апа Біутпе. 5. (1998) Зсіепсе 280. 915-918. 23. Тпотрзоп, 9. О., сірзоп, Т. ., Ріемупіак. Р., Уеаптоицдіп, ГЕ. 5 Ніддіпв, Ю. б. (1997) Мисі. Асідв Кев. 24. 4876-4882. 24. Зайои. М. 8. Меї. М. (1987) Мої. Віо! Емо! 4, 406-425. 65 25. ЗМаїрего, К., ЄПегвігот, М.. дозеївзоп, І, 5 Кавк, І (1993) Ріапі Мо). Віо!. 23, 671 26. ВескКег, О., Кетрег, Е., Зспеїі, 9., Мавіеггоп, К. (1992) РіІапі Мо). Віо! 20, 1195
27. ШО.
Маїмекепз, М.
Мап Мопіади, апа Мап І изрецепз (1988) Ргос.
Май). Асад. 5сі.
О.5.А. 85, 5536
Claims (1)
- Формула винаходуЗастосування ферменту, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка включає 5ЕО ІЮ Мо1, 5ЕО ІЮО Мо3, ЗЕО ІЮ Мо4, 5ЕО ІО Моб, як каталізатора в ацил-СоА-незалежній реакції переносу жирних кислот з фосфоліпідів в діацилгліцерин в процесі біосинтетичного одержання триацилгліцерину.с о «-« «в) ІС) і - ші с з-І 1 («в) їз 50 -Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99106656 | 1999-04-01 | ||
| EP99111321 | 1999-06-10 | ||
| PCT/EP2000/002701 WO2000060095A2 (en) | 1999-04-01 | 2000-03-28 | Enzymes of the biosynthetic pathway for the production of triacylglycerol and recombinant dna molecules encoding these enzymes |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA75041C2 true UA75041C2 (en) | 2006-03-15 |
Family
ID=26152952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2001107429A UA75041C2 (en) | 1999-04-01 | 2000-03-28 | Use of ferment of phospholipiddiacyglycerintransferase as catalyst in the process of biosynthetic producing triacylglycerin |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7427593B1 (uk) |
| EP (1) | EP1165803B1 (uk) |
| JP (1) | JP2002541783A (uk) |
| CN (1) | CN1230541C (uk) |
| AT (1) | ATE356213T1 (uk) |
| AU (1) | AU777031B2 (uk) |
| BR (1) | BR0009510A (uk) |
| CA (1) | CA2366187C (uk) |
| CZ (1) | CZ20013529A3 (uk) |
| DE (1) | DE60033793T2 (uk) |
| ES (1) | ES2283294T3 (uk) |
| HU (1) | HUP0200480A3 (uk) |
| IL (1) | IL145307A (uk) |
| MX (1) | MXPA01009577A (uk) |
| NO (1) | NO20014716L (uk) |
| PL (1) | PL351260A1 (uk) |
| RU (1) | RU2272073C2 (uk) |
| SK (1) | SK13872001A3 (uk) |
| TR (1) | TR200102859T2 (uk) |
| UA (1) | UA75041C2 (uk) |
| WO (1) | WO2000060095A2 (uk) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1372599A (zh) * | 1999-08-30 | 2002-10-02 | 孟山都技术有限责任公司 | 植物甾醇酰基转移酰 |
| US20020119138A1 (en) | 2001-02-26 | 2002-08-29 | Sylvaine Cases | Diacylglycerol o-acyltransferase 2alpha (DGAT2alpha) |
| US7045326B2 (en) | 2001-02-23 | 2006-05-16 | The Regents Of The University Of California | Mono- and diacylglycerol acyltransferases and methods of use thereof |
| EP1425398A2 (en) * | 2001-08-30 | 2004-06-09 | Bijam Biosciences Limited | Enzymes involved in the triacylglycerol biosynthesis in the cytosol of eukaryotes |
| EP1458859A1 (en) * | 2001-12-17 | 2004-09-22 | E. I. du Pont de Nemours and Company | Phospholipid:diacylglycerol acyltransferases |
| DE50308174D1 (de) * | 2002-03-30 | 2007-10-25 | Basf Plant Science Gmbh | Expression von phospholipid:diacylglycerin-acyltransferase (pdat) zur herstellung von pflanzlichen speicherlipiden enthaltend mehrfach ungesättigte fettsäuren |
| SE0201581D0 (sv) | 2002-05-29 | 2002-05-29 | Scandinavian Biotechnology Res | New improved acyltransferase |
| ATE495259T1 (de) | 2002-07-10 | 2011-01-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verwendung eines gens um den ölgehalt in pflanzen zu erhöhen |
| US7267976B2 (en) | 2003-07-02 | 2007-09-11 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts |
| WO2005005617A1 (en) * | 2003-07-09 | 2005-01-20 | National University Of Singapore | Triacylglycerol-deficient fission yeast and its uses |
| US7550286B2 (en) | 2004-11-04 | 2009-06-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Docosahexaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica |
| US7273746B2 (en) | 2004-11-04 | 2007-09-25 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms |
| JP4803584B2 (ja) * | 2006-02-08 | 2011-10-26 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 脂質生産性の高い形質転換微生物 |
| CN101516181B (zh) | 2006-07-14 | 2015-09-30 | 联邦科学技术研究组织 | 改变水稻的脂肪酸组成 |
| WO2010009500A1 (en) | 2008-07-21 | 2010-01-28 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved vegetable oils and uses therefor |
| CN102202498B (zh) | 2008-07-21 | 2016-09-07 | 澳大利亚联邦科学与工业研究组织 | 改良的棉籽油及应用 |
| US8394621B2 (en) * | 2008-10-23 | 2013-03-12 | Matrix Genetrics, LLC | Modified photosynthetic microorganisms for producing triglycerides |
| AU2009330014A1 (en) * | 2008-12-23 | 2011-08-11 | Matrix Genetics, Llc | Modified photosynthetic microorganisms with reduced glycogen and their use in producing carbon-based products |
| BR112012015410A2 (pt) | 2009-12-21 | 2016-11-29 | Suntory Holdings Ltd | genes diacilglicerol aciltransferase e uso dos mesmos. |
| KR101530765B1 (ko) * | 2010-02-03 | 2015-06-29 | 산토리 홀딩스 가부시키가이샤 | 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 호몰로그와 그 이용 |
| WO2011127069A1 (en) | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Targeted Growth, Inc. | Modified photosynthetic microorganisms for producing lipids |
| FI122886B (fi) | 2010-06-24 | 2012-08-31 | Valtion Teknillinen | Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa |
| CN103201379B (zh) | 2010-06-28 | 2015-08-19 | 联邦科学技术研究组织 | 生产脂质的方法 |
| JP5800311B2 (ja) * | 2011-01-27 | 2015-10-28 | 国立大学法人東京工業大学 | 植物油脂の製造方法 |
| CN102492742A (zh) * | 2011-04-27 | 2012-06-13 | 北京大学 | 促进植物营养组织中异位产三酰甘油的培养基及其应用 |
| EP2768954B1 (en) * | 2011-10-19 | 2018-12-05 | Massachusetts Institute of Technology | Engineered microbes and methods for microbial oil production |
| US11639507B2 (en) | 2011-12-27 | 2023-05-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Processes for producing lipids |
| US8809026B2 (en) | 2011-12-27 | 2014-08-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Processes for producing lipids |
| MY196561A (en) | 2011-12-27 | 2023-04-19 | Commw Scient Ind Res Org | Processes for Producing Lipids |
| NZ631696A (en) | 2012-04-25 | 2017-02-24 | Grains Res & Dev Corp | High oleic acid oils |
| BR112014031827A2 (pt) * | 2012-06-19 | 2017-06-27 | Du Pont | produção aprimorada de ácidos graxos poli-insaturados por coexpressão de acil- coa: lisofosfatidilcolina aciltransferases e fosfolipídeo: diacilglicerol aciltransferases. |
| EP4303288A3 (en) | 2014-07-07 | 2024-03-06 | Nuseed Global Innovation Ltd | Processes for producing industrial products from plant lipids |
| JP6580912B2 (ja) | 2015-09-11 | 2019-09-25 | 花王株式会社 | 脂質の製造方法 |
| CN110462043A (zh) | 2016-09-02 | 2019-11-15 | 联邦科学技术研究组织 | 具有修饰的性状的植物 |
| CN110386966A (zh) * | 2018-04-23 | 2019-10-29 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种含有叶绿体转运肽的基因序列的应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9510927D0 (en) * | 1995-05-31 | 1995-07-26 | Ca Nat Research Council | Plant and seed oil modification |
| CN1266460A (zh) * | 1997-06-05 | 2000-09-13 | 卡尔金有限责任公司 | 二酰甘油酰基转移酶蛋白 |
| EP1135473A2 (en) * | 1998-12-02 | 2001-09-26 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Sequenzes of a putative plant diacylglycerol acyltransferases |
| US7157619B1 (en) * | 1999-08-30 | 2007-01-02 | Monsanto Technology, L.L.C. | Plant sterol acyltransferases |
| US6791008B1 (en) * | 1999-11-12 | 2004-09-14 | Scandinavian Biotechnology Research (Scanbi) Ab | Use of a class of enzymes and their encoding genes to increase the oil content in transgenic organisms |
| CA2389391C (en) * | 1999-11-12 | 2011-07-05 | Antoni Banas | Use of a class of enzymes and their encoding genes to increase the oil content in transgenic organisms |
-
2000
- 2000-03-28 CN CNB008059985A patent/CN1230541C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-28 EP EP00917001A patent/EP1165803B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-28 CZ CZ20013529A patent/CZ20013529A3/cs unknown
- 2000-03-28 HU HU0200480A patent/HUP0200480A3/hu unknown
- 2000-03-28 JP JP2000609586A patent/JP2002541783A/ja not_active Withdrawn
- 2000-03-28 PL PL00351260A patent/PL351260A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-03-28 SK SK1387-2001A patent/SK13872001A3/sk unknown
- 2000-03-28 CA CA2366187A patent/CA2366187C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-28 DE DE60033793T patent/DE60033793T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-28 ES ES00917001T patent/ES2283294T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-28 RU RU2001129499/13A patent/RU2272073C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-03-28 AT AT00917001T patent/ATE356213T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-03-28 MX MXPA01009577A patent/MXPA01009577A/es active IP Right Grant
- 2000-03-28 TR TR2001/02859T patent/TR200102859T2/xx unknown
- 2000-03-28 AU AU38147/00A patent/AU777031B2/en not_active Ceased
- 2000-03-28 WO PCT/EP2000/002701 patent/WO2000060095A2/en active IP Right Grant
- 2000-03-28 UA UA2001107429A patent/UA75041C2/uk unknown
- 2000-03-28 BR BR0009510-9A patent/BR0009510A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-03-28 IL IL145307A patent/IL145307A/en active IP Right Grant
- 2000-03-30 US US09/537,710 patent/US7427593B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-09-28 NO NO20014716A patent/NO20014716L/no not_active Application Discontinuation
-
2007
- 2007-02-27 US US11/679,791 patent/US7635582B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7427593B1 (en) | 2008-09-23 |
| IL145307A (en) | 2007-12-03 |
| AU3814700A (en) | 2000-10-23 |
| TR200102859T2 (tr) | 2002-01-21 |
| HUP0200480A2 (hu) | 2002-07-29 |
| US20080160592A1 (en) | 2008-07-03 |
| WO2000060095A2 (en) | 2000-10-12 |
| IL145307A0 (en) | 2002-06-30 |
| EP1165803B1 (en) | 2007-03-07 |
| BR0009510A (pt) | 2002-04-23 |
| NO20014716D0 (no) | 2001-09-28 |
| MXPA01009577A (es) | 2003-07-21 |
| NO20014716L (no) | 2001-11-28 |
| JP2002541783A (ja) | 2002-12-10 |
| EP1165803A2 (en) | 2002-01-02 |
| CN1230541C (zh) | 2005-12-07 |
| ES2283294T3 (es) | 2007-11-01 |
| DE60033793T2 (de) | 2007-12-06 |
| CA2366187A1 (en) | 2000-10-12 |
| HUP0200480A3 (en) | 2009-08-28 |
| ATE356213T1 (de) | 2007-03-15 |
| CA2366187C (en) | 2010-05-25 |
| CZ20013529A3 (cs) | 2002-02-13 |
| CN1362994A (zh) | 2002-08-07 |
| DE60033793D1 (de) | 2007-04-19 |
| PL351260A1 (en) | 2003-04-07 |
| SK13872001A3 (sk) | 2002-06-04 |
| WO2000060095A3 (en) | 2001-02-01 |
| US7635582B2 (en) | 2009-12-22 |
| RU2272073C2 (ru) | 2006-03-20 |
| AU777031B2 (en) | 2004-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA75041C2 (en) | Use of ferment of phospholipiddiacyglycerintransferase as catalyst in the process of biosynthetic producing triacylglycerin | |
| Kroon et al. | Identification and functional expression of a type 2 acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase (DGAT2) in developing castor bean seeds which has high homology to the major triglyceride biosynthetic enzyme of fungi and animals | |
| US10557114B2 (en) | Thioesterases and cells for production of tailored oils | |
| Brown et al. | Isolation and characterisation of a maize cDNA that complements a 1-acyl sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase mutant of Escherichia coli and encodes a protein which has similarities to other acyltransferases | |
| Haselier et al. | Two closely related genes of Arabidopsis encode plastidial cytidinediphosphate diacylglycerol synthases essential for photoautotrophic growth | |
| AU2014236763B2 (en) | Thioesterases and cells for production of tailored oils | |
| US8101818B2 (en) | Enhancement of hydroxy fatty acid accumulation in oilseed plants | |
| US20160251685A1 (en) | Thioesterases and cells for production of tailored oils | |
| Yu et al. | Cloning and functional analysis of two type 1 diacylglycerol acyltransferases from Vernonia galamensis | |
| WO2023212726A2 (en) | Regiospecific incorporation of fatty acids in triglyceride oil | |
| US20210207177A1 (en) | Methods for the production of methacrylates | |
| CN102016046A (zh) | 用于区别性调节膜脂和种子油中脂肪酸不饱和性的组合物和方法 | |
| Monks et al. | Characterization of soybean choline kinase cDNAs and their expression in yeast and Escherichia coli | |
| CA2170611A1 (en) | Glycerin-3-phosphate-dehydrogenase (gpdh) | |
| Shockey et al. | Assessing the biotechnological potential of cotton type-1 and type-2 diacylglycerol acyltransferases in transgenic systems | |
| CA2389391C (en) | Use of a class of enzymes and their encoding genes to increase the oil content in transgenic organisms | |
| AU1276400A (en) | Gene coding for an acyltranferase of oil seed rape and uses thereof | |
| BR112020023394A2 (pt) | esterol aciltransferases modificadas | |
| KR100703113B1 (ko) | 트리아실글리세롤 생산을 위한 생합성 경로에 이용되는 신규 효소 및 이를 코딩하는 재조합 ｄｎａ 분자 | |
| EP1099761A1 (en) | Use of a class of enzymes to increase the oil content in transgenic organisms |