ES2280261T3 - Utilizacion de una clase de enzimas y de sus genes codificantes para aumentar el contenido de aceite de organismos transgenicos. - Google Patents
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Abstract
Un método para aumentar el contenido en aceite de una planta productora de aceite que comprende:
Description
Utilización de una clase de enzimas y de sus
genes codificantes para aumentar el contenido de aceite de
organismos transgénicos.
La presente invención se refiere al uso de una
nueva enzima y el gen que la codifica para transformación. Más
específicamente, la invención se refiere al uso de un gen que
codifica una enzima con actividad acil-CoA:
diacilglicerol aciltransferasa. Este gen expresado en solitario en
organismos transgénicos aumentará la cantidad total de aceite (es
decir, triacilgliceroles) que se produce.
En los cultivos de aceite como colza, girasol,
aceite de palma, etc., el aceite (es decir, los triacilgliceroles)
constituye el producto más valioso de las semillas o frutos y los
demás compuestos, como el almidón, las proteínas y la fibra, se
consideran como subproductos de menos valor. Por lo tanto, el hecho
de potenciar la cantidad del aceite en función de su peso a
expensas de los demás compuestos en los cultivos de aceite
aumentaría el valor del cultivo. Si se puede regular para su
optimización por sobreexpresión las enzimas que regulan la
alocación de carbón reducido en la producción de aceite, las células
acumularán más aceite a expensas de los demás productos. Este
método se podría utilizar no solamente para aumentar el contenido en
aceite en organismos que ya producen un alto nivel de aceite, como
son los cultivos de aceite, sino que también podría llevar a una
significativa producción de aceite en cultivos que contienen un bajo
contenido en aceite o un contenido moderado en aceite, tales como
soja, avena, maíz, patata, remolacha azucarera y nabos, así como en
microorganismos.
El desarrollo de la tecnología de ingeniería
genética combinado con la mayor comprensión de la biosíntesis de
los triacilgliceroles ha hecho posible ahora transferir genes que
codifican las enzimas clave relacionadas con la síntesis de los
triacilgliceroles a partir de especies vegetales silvestres u
organismos de otros reinos en cultivos de semillas de aceite
domesticadas. En este sentido, los triacilgliceroles se pueden
producir con una alta pureza y calidad a un coste moderado.
Se sabe que la biosíntesis de triacilgliceroles
(TAG) en tejidos que acumulan grasas en animales (Bell &
Coleman, 1983) y plantas (Cao & Huang, 1986, Martin &
Wilson 1983), así como la acumulación de aceite en organismos
microbiales como bacterias (Ekundayo & Packter, 1994), levaduras
y otros hongos (Ratledge 1989) pueden catalizarse mediante
acil-CoA: diacilglicerol aciltransferasas (DAGATs),
enzimas que transfieren un grupo acilo desde el
acilo-CoA a diacilglicerol, formando así TAG.
Durante los últimos años, se han identificado
genes que codifican DAGATs en animales (Cases y cols., 1998),
plantas (Hobbs y cols., 1999, Lardizabal y cols., 2000) y en
microbios (Lardizabal y cols. 1999). Dichas DAGATs pertenecen a dos
familias de proteínas no relacionadas.
El primer tipo de DAGAT que se caracterizó,
DAGAT A se ha encontrado hasta ahora solamente en animales (Cases y
cols., 1998) y plantas (Hobbs, y cols., 1999). Estos genes presentan
similitudes de secuencia con los genes que codifican
acil-CoA: colesterol aciltransferasa (ACAT). La
DAGAT A de ratón es idéntica en un 20% de la secuencia de
aminoácidos a ACAT de ratón (Cases y cols., 1998). No obstante, las
DAGAT A de plantas y animales son más similares entre sí que a
ACAT. Según esto, DAGAT A de ratón es idéntica en un 38% de la
secuencia de aminoácidos a DAGAT A de Arabidopsis thaliana
(Hobbs, y cols., 1999). También es idéntica en aproximadamente un
80% a proteína ARGP1 de tipo ACAT humana, lo que ha hecho pensar en
su relación con la síntesis de TAG (Oelkers y cols., 1998), lo que
indica que ARGP1 es una DAGAT A.
Las levaduras S. cerevisiae contienen 2
genes con una similitud de secuencia a ACAT, ARE1 y
ARE2 (Yang y cols., 1996). Las proteínas codificadas son
idénticas en aproximadamente un 24% de la secuencia de aminoácido
total a la ACAT de ratón y son idénticas en un 15% a la DAGAT A de
ratón. Debe advertirse que ambas son más similares entre sí
(idénticas en un 45% de la secuencia de aminoácido) que a las ACATs
o DAGATs de eucariotas superiores. No es posible clasificarlas como
ACATs o DAGATs putativas únicamente en función de las similitudes
de secuencia, ya que sus distancias evolutivas desde ambos grupos de
enzimas eucarióticas superiores son similares. Sin embargo, los
experimentos han demostrado que tanto Are1 como Are2 son ACATs, que
en combinación son responsables de toda la síntesis de éster de
esterol que tiene lugar en la levadura (Yang y cols., 1996; Yu y
cols., 1996). La posible implicación de Are1 y Are2 en la síntesis
de TAG también ha sido estudiada (Yang y cols., 1996; Yu y cols.,
1996). A partir de estos estudios, se ha llegado a la conclusión de
que Are1 y Are2 no están relacionadas con la síntesis de TAG. Por lo
tanto, no existe técnica anterior que demuestre que Are1 es una
enzima de síntesis de TAG, ni tampoco se puede concluir, en función
de las homologías con las secuencias de tipo ACAT ya publicadas que
Are1 es una DAGAT (Lassner y Ruezinsky, 1999).
La segunda familia de enzimas DAGAT, la familia
DAGAT B, no tiene relación con ninguna otra proteína conocida.
Estas enzimas no presentan homología de secuencia con ACAT de ratón
ni vegetal como las proteínas DAGAT A (Lardizabal y cols., 2000) ni
con ninguna otra proteína conocida.
DAGAT A y B no son las únicas enzimas que
contribuyen a la biosíntesis de TAG. TAG puede sintetizarse también
a través de una reacción independiente de Acil-CoA.
Por consiguiente, la recién descubierta enzima fosfolípido:
diacilglicerol aciltransferasa (PDAT) cataliza la formación de TAG
por transferencia de un grupo acilo desde la posición
sn-2 del fosfololípido a DAG (Dahlqvist y cols.,
1999, St\ring{a}hl, 1999).
La invención describe la identificación de un
gen que codifica una enzima que es parcialmente responsable de la
acumulación de TAG en levaduras.
En uno de sus aspectos, la presente invención se
refiere al uso de este gen en constructos de ADN recombinante para
dirigir la transcripción y traducción de la secuencia de
diacilglicerol aciltransferasa de la presente invención en un
organismo huésped o progenie del mismo, como por ejemplo una planta
productora de aceite. Las células y organismos que contienen la
diacilglicerol aciltransferasa como resultado de la producción la
secuencia que codifica aciltransferasa también se incluyen dentro
del marco de la invención.
Reviste un especial interés la expresión de las
secuencias de nucleótido de la presente invención a partir de las
regiones de iniciación de transcripción que se expresan
preferentemente en los tejidos de la semilla de la planta. Se
contempla también la posibilidad de sintetizar la secuencia
genética, sobre todo cuando interesa proporcionar codones
preferibles de la planta.
En otro modo de realización, la presente
invención se refiere también a métodos de uso de una secuencia de
ADN que codifica dicha proteína según la presente invención para
aumentar el contenido en aceite dentro de las células de diferentes
plantas productoras de aceite.
Asimismo, la invención hace posible un proceso
para la producción de triacilglicerol, que comprende el desarrollo
de células y organismos transgénicos en condiciones en virtud de las
cuales se expresa cualquiera de las secuencias de nucleótido
indicadas con el fin de producir una enzima en estas células con la
capacidad de transferir un ácido graso desde
acil-CoA a diacilglicerol, para formar así un
triacilglicerol.
La presente invención puede caracterizarse
esencialmente según los siguientes aspectos.
1. Uso de una secuencia de ácido nucleico que
codifica una enzima que cataliza la transferencia de un ácido graso
desde acil-CoA en diacilglicerol para la producción
de triacilglicerol (TAG) por transformación genética de un
organismo productor de aceite con dicha secuencia con el fin de
expresarse en este organismo y tener como resultado una enzima
activa con el fin de aumentar el contenido en aceite del
organismo.
La secuencia de ácido nucleico se deriva de la
secuencia que se muestra en SEQ ID NO. 1, del gen ARE1 de
Saccharomyces cerevisiae (clon genómico o ADNc) o de una
secuencia de ácido nucleico o ADNc que contienen secuencias de
nucleótido que codifican una proteína con una secuencia de
aminoácido que es idéntico en un 60% o más de la secuencia de
aminoácido tal como se presenta en SEQ. ID. NO. 2.
2. Organismos transgénicos que comprenden, en su
genoma o en un plásmido, una secuencia de ácido nucleico según lo
anterior, transferida por tecnología de ADN recombinante. Los
organismos transgénicos se seleccionan del grupo que consiste en
hongos, plantas y animales. Preferiblemente, las plantas agrícolas
de organismos transgénicos y, preferiblemente, dicha secuencia de
nucleótido, se expresa bajo el control de un promotor específico de
órgano en almacenamiento. Alternativamente, la secuencia de
nucleótido se expresa bajo el control de un promotor específico de
semilla.
3. Una proteína codificada por una molécula de
ADN según la SEQ ID NO. 1. o un fragmento funcional de la misma
(enzimáticamente activa). Alternativamente, la proteína producida en
un organismo tal como se especifica en el punto 2, que tiene la
secuencia de aminoácido expuesta en SEQ ID NO. 2 o una secuencia de
aminoácido con al menos un 60% de homología con dicha secuencia de
aminoácido. Preferiblemente, se aisla la proteína a partir de
Saccharomyces cerevisiae.
4. Uso de una proteína tal como se especifica en
el punto 3 para la producción de triacilgliceroles.
A continuación, la invención que se ha descrito
de forma general se comprenderá mejor haciendo referencia a los
siguientes gráficos y ejemplos, que quedan incluidos con fines
ilustrativos únicamente, sin pretender con ello limitar el alcance
de la presente invención.
\newpage
Figura
1
Se sometieron a ensayo partes alícuotas de
membranas microsomales preparadas de la cepa de control (línea A) o
la cepa de sobreexpresión ARE1 (línea B) para determinar su
actividad DAGAT con arreglo al método A descrito en Material y
Métodos. Se visualizó el triacilglicerol radioactivo sintetizado y
se cuantificó como cpm (cifras entre paréntesis) en la placa de TLC
por autorradioagrafía electrónica (Instant Imager, Packard, US).
Abreviaturas utilizadas en la figura: triacilglicerol (TAG) y ácidos
grasos sin esterificar (FA).
Figura
2
Se visualizaron los triacilgliceroles
radioactivos (TAG) sintetizados en microsomas a partir del mutante
doble H1226 (línea A), mutante triple, H1236 (línea B) y el mismo
mutante triple que contenía un plásmido que sobreexpresaba el gen
ARE1 (línea C) sobre una placa de TLC por autorradioagrafía
electrónica (Instant Imager, Packard, US).
SEQ ID NO. 1: Secuencia de ADN genómico de gen
ARE1 de Saccharomyces cerevisiae, ORF YCR048W.
SEQ ID NO. 2: La secuencia de aminoácido del
marco de lectura abierto YCR048W de Saccharomyces
cerevisiae.
Cepas de levadura. Las cepas de levadura
utilizadas en este estudio fueron congénicas con el antecedente
genético (background) W303-1A (Thomas &
Rothstein, 1989). Se generó una cepa mutante are1, H1111, con
el genotipo MAT \alpha are1-\Delta::HIS3 ADE2
can 1-100 leu2-3, 112
trpl-1 ura3-1, cruzando las dos
cepas SCY60 (MAT\alpha are1-\Delta::HIS3
ade2-1 can 1-100
leu2-3, 112 trpl-1
ura3-1) y SCY61 (MAT a
are2-\Delta::lEU2 ADE2 can 1-100
his3-11,15
trpl-1-ura3-1)
(Yang y cols., 1996) y diseccionando tetradas. Como control de tipo
silvestre se utilizó SCY62 (MAT a ADE2 can 1-100
his3-11,15 leu2-3
trpl-1 ura3-1) (Yang y cols.,
1996). Las cepas mutantes de levadura se interrumpieron en YNR008w
y YOR245c que codificaban DAGAT B y PDAT de levadura,
respectivamente y se construyeron los genes ARE1 a través de una
serie de transformaciones de levadura utilizando el método de
acetato de litio. Se crearon los fragmentos de ADN lineal
utilizados para la interrupción de los genes YOR245c y YNR008w del
siguiente modo. Se construyeron cebadores específicos para YOR245c
(300 bases corriente arriba, CAGCATTGACGTAATGGGAA y corriente abajo
AAAGCCAAAAAGAGAAGGACA, del gen) y se sintetizó el gen utilizando
PCR a partir del ADN genómico de SCY62. El fragmento por PCR se
remató romo y se ligó en pUC119 previamente segmentado con la enzima
de restricción SmaI. El plásmido resultante,
YOR245c-pUC119, fue digerido a continuación con
ClaI/StuI y fue desfosforilado para impedir la
religación. Se obtuvo el marcador KanMX4 por digestión del plásmido
pFA6a mediante SmaI/SacI. A continuación, se ligó el
fragmento KanMX4 romo hacia el vector YOR245c-pUC119
entre los sitios ClaI y StuI dentro del marco de
lectura abierto YOR245c. Se obtuvo finalmente un fragmento lineal
que contenía el casete de interrupción YOR245c::KanMX4 resultante a
través de la segmentación mediante BamHI/NdeI. Se
construyó el fragmento lineal para interrumpir el gen YNR008w de
manera similar al fragmento YOR245c::KanMX4. Se amplificó el gen
YNR008w a partir de ADN genómico de SCY62, clonado en el vector
pBluescript (Dahlqvist y cols., 2000) y se digirió con la enzima de
restricción BbsI/MunI. A continuación, se ligó el
marcador TRP1 entre los sitios BbsI y MunI en
el plásmido YNR008w-pBluescript, y se obtuvo un
fragmento lineal que contenía el casete de interrupción por
digestión con BamHI/PstI. Se generó el mutante simple
PDAT, H1079, con el genotipo MATa pdat-\Delta::TRP1
ADE2 leu2-3, 112 ura3-1
his3-11,15 trpl-1 transformando
la cepa de tipo silvestres SCY62 con el fragmento YNR008w::TRP1
lineal. Se construyó el mutante doble PDAT DAGAT B, 1226, con el
genotipo MATa pdat-\Delta::TRP1 dagat
b-\Delta::KanMX4 ADE2 leu2-3,112
ura3-1 his3-11,15
trpl-1, de forma idéntica transformando H1079
con el fragmento YOR245c::KanMX4 lineal. Se generó un mutante doble
PDAT ARE1, H1224, con el genotipo MAT\alpha
are1-\Delta::HIS3 pdat-\Delta::TRP1 ADE 2 can
1-100 leu2-3, 112
ura3-1 trp1-1 por transformación
de H1111 con el fragmento YNR008w::TRP1 lineal. Se construyó la
cepa mutante triple, H1236, con el genotipo MAT\alpha
are1-\Delta::HIS3 pdta-\Delta::TRP1 dagat
B-\Delta::KanMX4 ADE2 leu2-3,112
ura3-1 trpl-1 transformando
H1224 con el fragmento YOR245c::KanMX4 lineal.
\newpage
Cultivos de levadura. Se cultivaron
células de levadura a 28 y 30ºC en un mecanismo de agitación
rotatorio en un medio YPD líquido (1% extracto de levadura, 2% de
peptona, 2% de glucosa). Se desarrollaron las células transformadas
en medio sintético (Sherman y cols., 1986) que carecía de uracilo y
se suplementó con 2% (vol/vol) de glicerol y 2% (vol/vol)
etanol.
Análisis de lípidos. Se determinó el
contenido en lípidos de las células de levadura tal como describe
Dahlqvist y cols. (2000) que se presenta como nmoles de ácido graso
(FA) por mg de peso de levadura en seco.
Se analizó el contenido en lípidos de la cepa de
levadura mutante (SCY60), en la que se había interrumpido el gen
ARE1, y se comparó con las células de levadura de tipo
silvestre (SCY62) en diferentes etapas de crecimiento. En las
células mutantes are1, recogidas en la fase exponencial al
cabo de 10 horas de cultivo, la cantidad total de lípidos, medida
como nmoles FA por peso de levadura en seco, no fue
significativamente diferente de la de la levadura de tipo
silvestre (tabla 1) ni tampoco difirió fuertemente la cantidad de
ácidos grasos acumulados en TAG entre el tipo silvestre y el mutante
are1. El efecto de la interrupción are1 en la
acumulación de aceite en células en fase estacionaria fue analizado
en un experimento en el que las células de levadura fueron
pre-cultivadas durante 24 horas en un medio YPD
líquido. A continuación, se recogieron las células y se volvieron a
suspender en medio mínimo (Meesters y cols., 1996), se suplementaron
con 16 g/l de glicerol, hasta el volumen original del cultivo de
crecimiento. En este medio mínimo suplementado con glicerol, las
células de levadura entrarán en una fase estacionaria en condiciones
adecuadas para la acumulación de TAG. Tras un posterior cultivo
durante 24 horas, se recogieron las células y se determinó su
composición de lípidos. El contenido total de lípidos en el mutante
are1 fue 15% menos que en el tipo silvestre. La cantidad de
TAG en el mutante are1 fue casi 40% más bajo que que en el
tipo silvestre, mientras que el contenido en lípidos polares no
difirió significativamente entre el mutante are1 y la
levadura de tipo silvestre
(tabla 1).
(tabla 1).
Recientemente se ha demostrado que otros dos
genes, YNR008w y YOR254c (Stahl, 1999, Dahlqvist, y cols., 2000; M
Lardizabal y cols., 2000) tienen relación con la síntesis de TAG en
levaduras. Estos genes codifican una proteína PDAT y DAGAT B,
respectivamente. Se obtuvo una cepa de levadura interrumpida en los
tres genes (ARE1, YNR008w y Yor254c) y una cepa de levadura con
interrupciones solamente en los genes PDAT y DAGAT B, que se
denominan aquí mutante triple y doble respectivamente. El contenido
en TAG del mutante doble fue 48% del tipo silvestre (tabla 2),
mientras que la cantidad del TAG acumulado en el mutante triple fue
solamente 4% del nivel en la levadura de tipo silvestre. Al comparar
las cantidades de TAG acumulado en los mutantes doble y triple está
claro que la proteína Are1 contribuye a la síntesis de TAG en
levaduras.
En resumen, estos experimentos demuestran
claramente que la producción del gen ARE1 contribuye a la
acumulación de TAG en proteínas.
Tabla 1. Contenido en lípidos en el mutante
ARE1 (SCY60) y células de levadura de tipo silvestre
(SCY62).
Se analizó la acumulación de lípidos en levadura
interrumpida en el gen ARE1 (mutante are1) en
diferentes etapas de crecimiento y se comparó con la levadura de
tipo silvestre de control. Se analizó la composición de lípidos de
las células en crecimiento exponencial al cabo de 10 horas de
cultivo en medio YPD a 28ºC. Se prepararon células de levadura en
fase estacionaria por pre-cultivo de las células en
medio YPD líquido durante 24 horas a 28ºC, tras lo cual se
recogieron las células, se resuspendieron en medio mínimo (Meesters
y cols., 1996), se suplementaron con 16 g/l de glicerol y se
cultivaron durante 24 horas más a 28ºC. Se determinó el contenido en
ésteres de esterol, TAG, otros lípidos neutros y lípidos polares
como nmoles de ácidos grasos (FA) por mg de peso de la levadura
en
seco.
seco.
\newpage
Tabla 2. Contenido en lípidos en la cepa
mutante doble PDAT DAGAT B (H1226), en la cepa mutante triple PDAT
DAGAT B ARE1 (H1236) y en células de levadura de tipo silvestre
(SCY62).
Se cultivaron las diferentes cepas de levadura,
que contenían todas ellas plásmido de expresión vacío pJN92 (Ronne
y cols, 1991), en medio YNB al que se añadió 2% (v/v) de galactosa a
una A_{600} de 4. Se recogieron las células al cabo de 22 horas
más de crecimiento y se determinó el contenido de ésteres de
esterol, TAG, otros lípidos neutros y lípidos polares como nmoles
de ácidos grasos (FA) por mg de peso de levadura en seco.
Ejemplo
2
Para la sobreexpresión inducida del gen
ARE1, se clonó un fragmento 2001 bp
EheI/Ecl136II del plásmido YEP 3-16
(Yang y cols., 1996) en el sitio BamHI del vector de
expresión GAL1 pJN92 (Ronne y cols., 1991), generando así
pUS5. Se transformó la cepa de levadura de tipo silvestre SCY62
(MATa ADE2 can 1-200 his3-11,15
leu2-3 trpl-1
ura3-1) (Yang y cols., 1996) con el pUS5 y se
cultivó a 28ºC en un mecanismo de agitación rotatorio en un medio
sintético (Sherman y cols., 1986) que carecía de uracilo y
suplementado con 2% (vol/vol) de glicerol y 2% (vol/vol) de etanol.
Se indujo el promotor GAL1 al cabo de 43 horas de
crecimiento por adición de 2% (peso/vol) de concentración final de
galactosa. Se recogieron las células al cabo de 24 horas más de
crecimiento. Las células de tipo silvestre (SCY62) transformadas con
el vector vacío, pJN92, y se cultivaron en condiciones idénticas
fueron utilizadas como control. Se determinó el contenido en
lípidos de las células de levadura tal como describe Dahlqvist y
cols. (2000) y se presenta como nmoles de ácido graso (FA) por mg de
peso de levadura en
seco.
seco.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió el efecto de la sobreexpresión del
gen ARE1 en la acumulación de lípidos por transformación de
la levadura de tipo silvestre (cepa SCY62) con un plásmido que
contenía gen ARE1 bajo el control de promotor GAL1
inducido por galactosa (Tabla 3). La sobreexpresión del gen
ARE1 desde este promotor no tuvo ningún efecto fuerte sobre
la velocidad de crecimiento según se determinó por las medidas de
densidad óptica. No obstante, el contenido en lípidos total en las
células de levadura que sobreexpresaron ARE1 fue 1,4 veces
más alto que en la levadura de control transformada con un vector de
expresión vacío (Tabla 3). El elevado contenido en lípidos en las
células de levadura que sobreexpresan ARE1 se debe sobre todo
a un aumento del 50% en el contenido de TAG, pero la cantidad de
ésteres de esterol también aumentó significativamente en estas
células, en comparación con el control. Estos resultados demuestran
claramente que el producto genético de ARE1, además de estar
relacionado tal como se ha descrito en la síntesis de ésteres de
esterol (Yang y cols., 1996), tiene relación también con la
síntesis de TAG. Los elevados niveles de TAG conseguidos en las
células de sobreexpresión de ARE1 también demuestra
claramente el uso potencial del gen ARE1 en el aumento del
contenido en aceite en organismos
transgénicos.
transgénicos.
\newpage
Tabla 3. Contenido en lípidos en células de
levadura que sobreexpresan el gen ARE1.
Se cultivaron células de levadura (SCY 62)
transformadas con el gen ARE1 bajo el control del promotor
GAL1 en el vector pJN92, tal como se describe en la sección
de Material y Método. Se utilizaron como control células de levadura
(SCY62), transformadas con un vector vacío, cultivadas en
condiciones idénticas. Se recogieron las células y se determinó el
contenido en ésteres de esterol, triacilgliceroles, otros lípidos
neutros y lípidos polares como nmoles de ácidos grasos (FA) por mg
de peso de levadura en seco.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se analizó la actividad de diacilglicerol
aciltransferasa (DAGAT) in vitro, en fracciones microsomales
preparadas de células de levadura, utilizando uno de los siguientes
métodos.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
A
Se transformó una levadura de tipo silvestre
(cepa SCY62) con un plásmido (pUS5) que contenía el gen ARE1
bajo el control de un promotor GAL1 (descrito en Material y
Métodos en el ejemplo 2). Se cultivó la levadura transformada a 28ºC
en medio YNB definido que carecía de uracilo. Se indujo la expresión
del gen ARE1 por adición de 2% (v/v) de galactosa al cabo de
8 horas de crecimiento y se recogieron las células al cabo de 17
horas más. Se prepararon membranas microsomales de la levadura
transformada resuspendiendo 1 g de levadura (peso reciente) en 8 ml
de tampón enfriado con hielo (Tris-Cl 20 mM, pH 7,9,
10 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EDTA, 5% (v/v) de glicerol, 1 mM DTT,
0,3 M sulfato de amonio) en un tubo de vidrio de 12 ml en el que se
introdujeron 4 ml de perlas de vidrio (diámetro 0,45 - 0,5 mm). Se
agitó fuertemente el tubo de vidrio (3 x 60 s) con una
homogeneizadora de células MSK (B. Braun Melsungen, AG, Alemania).
Se centrifugó la suspensión a 20.000 g durante 15 minutos a 6ºC y
se centrifugó el sobrenadante resultante a 100.000 g durante 2 horas
a 6ºC. Se resuspendió el aglomerado resultante, que contenía
membranas microsomales en 0,1 M de tampón K-fosfato
(pH 7,2) y se almacenó a -80ºC. Se analizó la actividad DAGAT en
partes alícuotas de membranas microsomales (50 \mul), que
correspondía a 10 nmoles de fosfatidilcolina, a lo que se añadió 1
\mumol de dioleíl-PG y 0,25 \mumoles de
dioleíl-DAG emulsionado en 50 \mul de tampón que
contenía 190 mM de HEPES-NaOH, pH 7,5, 125 mM de
MgCl_{2}, 30 mM de CHAPS, 2,5 mg/ml de BSA y 2 nmoles
[^{14}C]-palmitoíl-CoA (2775
dpm/nmoles). Se incubó la mezcla de reacción a 30ºC durante 30
minutos. A continuación, se extrajeron los lípidos en cloroformo y
se separaron utilizando 60 placas de cromatografía de capa fina
sobre gel de sílice en hexano/éter dietílico/ácido acético
(80:20:1). Se visualizaron los lípidos radioactivos y se determinó
cuantitativamente en las placas por autorradioagrafía electrónica
(Instant Imager, Packard,
US).
US).
\vskip1.000000\baselineskip
Método
B
Se transformaron el mutante doble PDAT DAGAT B
(H1226) y el mutante triple PDAT DAGAT B ARE1 (H1236)
descritos en Material y Métodos del ejemplo 1, con el plásmido de
expresión vacío (pJN92). Se generó un transformante que expresaba el
gen ARE1 bajo el control del promotor GAL1
transformando el mutante triple H1236 con el plásmido pUS5
(descrito en Material y Métodos del ejemplo 2). Se cultivaron todos
los transformantes de levadura en medio YNB al que se añadió 2%
(v/v) de galactosa a una A_{600} de 4. Se recogieron las células
tras 6 horas más de crecimiento y se prepararon microsomas
utilizando una modificación del procedimiento de Dahlqvist y cols.
(2000). Se volvieron a suspender las células de levadura (0,2 g) en
1,5 ml de tampón enfriado con hielo (20 mM de
Tris-Cl, pH 7,9, 10 mM de MgCl_{2}, 1 mM de EDTA,
5% (v/v) de glicerol, 1 mM de DTT, 0,3 M de sulfato de amonio) en un
tubo Eppendorf de 2 ml que contenía 0,2 ml de perlas de vidrio
(0,45-0,5 mm de diámetro). Se agitó fuertemente el
tubo (3 x 60 s) en una homogeneizadora de células (Mini Bead
Beater). Se centrifugó la levadura homogenizada a 1350 x g durante
20 minutos a 4ºC, y a continuación, se centrifugó el sobrenadante
resultante a 150.000 x g durante 1 hora a 4ºC. Se resuspendió el
aglomerado en 0,1 M de fosfato potásico (pH 7,2) y se almacenó a
-80ºC. Se añadió dihexanoíl-DAG (5 nmoles) disuelto
en cloroformo a los micro tubos y se evaporó el cloroformo bajo una
corriente de N_{2}. Se añadieron partes alícuotas (90 \mul) de
fracciones microsomales que correspondían a 150 \mug de proteínas,
en un tampón que consistió en 50 mM de HEPES (pH 7,2), 5 mM de
MgCl_{2}, y 1 mg/ml de BSA a los tubos y se mezcló a fondo la
suspensión. Finalmente, se añadieron 10 \mul de
[^{14}C]-palmitoíl-CoA (20 nmoles,
5000 dpm/nmol) y se incubó la mezcla a 30ºC durante 15 min. Se
extrajeron los lípidos de la mezcla de reacción con cloroformo
(Bligh & Dyer, 1959) y se separaron por TLC sobre 60 placas de
gel de sílice (Merck). La placa de TLC se reveló primero en
cloroformo/metanol/ácido acético/agua (85:15:10:3,5) para 80 mm. A
continuación, se reveló la placa seca en hexano/éter dietílico/ácido
acético (80:20:1,5) durante 180 mm. Se visualizaron los lípidos
radioactivos y se determinaron cuantitativamente en las placas por
autorradiografía electrónica (Instant Imager,
Packard).
Packard).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron a ensayo las membranas
microsomales preparadas a partir de levadura transformada de
sobreexpresión de gen ARE1 y de levadura de control
transformada con un plásmido vacío (pJN92) para determinar la
actividad DAGAT con arreglo al Método A en Materiales y Métodos. La
cantidad de TAG radioetiquetado sintetizado a partir de
[^{14}C]palmitoíl-CoA en membranas
cromosomales preparadas a partir del agente de sobreexpresión
ARE1 aumentó con un 66% en comparación con la levadura de
control (Fig. 1. Se sometió a ensayo también la actividad DAGAT en
membranas microsomales preparadas a partir de células de cepa
mutante doble PDAT DAGAT B (H1226) y la cepa mutante triple PDAT
DAGAT B ARE1 (H1236) (método B). En el mutante doble, con gen
ARE1 funcional, se sintetizó TAG con dos hexanoílos y una
cadena [^{14}C]palmitoílo, a partir de
dihexanoíl-DAG añadido y
[^{14}C]palmitoíl-CoA. Esta síntesis fue
apenas detectable en el mutante triple (figura 2) en el que se
interrumpió el gen ARE1. No obstante, la síntesis in
vitro de TAG fue restaurada en células mutantes triples
transformadas con un plásmido que expresaba el gen ARE1. Esto
demuestra claramente que la síntesis in vitro de TAG en estos
mutantes de levadura se corresponde con un gen ARE1 funcional
y que la proteína codificada con el gen ARE1 posee
actividad
DAGAT.
DAGAT.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se amplificó el gen ARE1 a partir del
genoma de levadura utilizando la enzima de lectura de prueba
polimerasa pfu (Promega). Se introdujo un sitio de enzima de
restricción EcoRI y XbaI respectivamente en los
extremos 5' y 3' de este fragmento para permitir la clonación
direccional del fragmento. Se clonó el fragmento PCR en el vector
pBluescript (Stratagene). A continuación, se clonó el inserto
derivado de este plásmido corriente abajo de un fragmento de
promotor napin (Stalberg y col.s, 1993) en el vector
pPGTV-KAN (Becker y cols., 1993). Se transformó este
plásmido en la cepa Agrobacterium GV3301. A continuación, se
utilizaron las células de Agrobacterium transformadas para
transformar explantes de raíz de Arabidopsis thaliana
(Valvekens y cols., 1992). Se determinó el contenido de lípidos en
semillas de Arabidopsis por metilación de ácidos grasos. Se
metilaron los ácidos grasos en el aceite de aproximadamente
2-3mg de semillas en 2 ml de 2% (vol/vol) de
H_{2}SO_{4} en metanol seco durante 90 minutos a 90ºC. Se
extrajeron los ésteres metílicos de ácidos graso con hexano y se
analizaron por GLC a través de una columna de sílice condensada con
CP-Wax58-CB de 50 m x 0,32 mm
(chrompack), se utilizó ácido metilheptadecnoico como patrón
interno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformó A. thaliana como el gen
ARE1 bajo el control de un promotor napin, que es específico
de siembra y activo durante la fase principal de acumulación de
aceite. Se analizó el contenido en aceite en semillas de plantas T2
simples derivadas de cuatro eventos de transformación independientes
(Tabla 4). Los resultados demostraron que en tres líneas entre 50%
y 100% de las plantas T2 generaron semillas con un contenido en
aceite elevado significativo estadísticamente en comparación con el
contenido aceite de las semillas de las plantas de control. El
contenido en aceite se elevó en hasta un 18% en las semillas que
expresaban ARE1. Una línea (28-1) tenía el
mismo contenido en aceite que las plantas de control.
\newpage
Tabla 4. Acumulación de aceite en semillas de
Arabidopsis thaliana transformada con el gen ARE1
Se cultivaron plantas T2 con gen ARE1
bajo el control del promotor napin y plantas de control
transformadas con un vector vacío en una cámara de cultivo en
condiciones controladas. Se determinó el contenido en aceite de
semillas maduras de estas plantas por análisis de GLC y se
presentaron como nmoles de ácido graso (FA) por mg de semilla.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
* \begin{minipage}[t]{146mm} Calculado con la prueba bilateral
de diferencia media a \alpha = 5 y en función del contenido medio
en aceite de 4 plantas de control.
\end{minipage} \cr}
\vskip1.000000\baselineskip
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1. INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- AUTOR DE LA SOLICITUD: Scandinavian Biotechnology Research AB
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Uso de una clase de enzimas y sus genes de codificación para aumentar el contenido en aceite en organismos transgénicos.
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- Número de secuencias 2
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN PARA SECUENCIA ID NO 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD 1833 bases
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- TIPO DE HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- A)
- LONGITUD: 610 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- ii)
- TIPO MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- iii)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Un método para aumentar el contenido en
aceite de una planta productora de aceite que comprende:
transformar dicha planta con una secuencia de
nucleótido de manera que dicho organismo exprese una enzima que
cataliza la transferencia de un ácido graso desde
acil-CoA a diacilglicerol para la producción de
triacilglicerol (TAG) y comprendiendo dicha enzima la SEQ ID NO
2.
2. El método según la reivindicación 2, en el
que dicha secuencia de nucleótido comprende SEQ ID NO 1.
3. El método según la reivindicación 2, en el
que dicha secuencia de nucleótido es a partir de un gen ARE1
de Accharomyces cerevisiae.
4. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que dicha secuencia de
nucleótido se transfiere mediante tecnología de ADN
recombinante.
5. Una planta transgénica que comprende un
plásmido o genoma que contiene una secuencia de nucleótido que
codifica una enzima que cataliza la transferencia de un ácido graso
desde acil-CoA a diacilglicerol para la producción
de triacilglicerol (TAG), derivándose dicha secuencia de nucleótido
de la SEQ ID. NO 1 o gen ARE1 de Saccharomyces
cerevisiae y codificando dicha secuencia de nucleótido una
enzima que tiene una secuencia de aminoácido que comprende SEQ ID
NO 2.
6. La planta transgénica según la reivindicación
5, siendo dicha planta una planta agrícola.
7. La planta transgénica según la reivindicación
6, siendo dicha planta un cultivo de semilla oleosa.
8. La planta transgénica según cualquiera de las
reivindicaciones 5-7, expresándose dicha secuencia
de nucleótido bajo el control de un promotor específico de órgano en
almacenamiento.
9. La planta transgénica según la reivindicación
8, en la que dicha secuencia de nucleótido se expresa bajo el
control de un promotor específico de semilla.
10. Un método para aumentar el contenido en
aceite de un organismo productor de aceite que comprende transformar
dicho organismo seleccionado del grupo que consiste en
Arabidopsis y levadura con una secuencia de nucleótido que
comprende SEQ ID NO 1 o gen ARE1 de manera que dicho
organismo exprese una enzima y catalice la transferencia de un
ácido graso de acil-CoA a diacilglicerol para la
producción de triacilglicerol (TAG), comprendiendo dicha enzima una
secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.2
11. Un método para aumentar el contenido en
aceite de una planta productora de aceite que comprende transformar
dicha planta con una secuencia de nucleótido que comprende SEQ ID NO
1 o gen ARE1 de manera que dicho organismo exprese una
enzima y catalice la transferencia de un ácido graso de
acil-CoA a diacilglicerol para la producción de
triacilglicerol (TAG), comprendiendo dicha enzima una secuencia de
aminoácido de SEQ ID No. 2.
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