PT1230373E - Utilização de uma classe de enzimas e seus genes de codificação para aumentar o teor de óleo em organismos transgénicos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Utilização de uma classe de enzimas e seus genes de codificação para aumentar o teor de óleo em organismos transgénicos"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de uma nova enzima e seu gene de codificação, para transformação. Mais especificamente, a invenção refere-se à utilização de um gene que codifica para uma enzima com actividade de acil-coA:diacilglicerol-aciltransferase. Este gene expresso sozinho em organismos transgénicos irá aumentar a quantidade total de óleo (i.e. triacilgliceróis) que é produzida.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Nas culturas produtoras de óleo, como colza, girassol, palma, etc., o óleo (i.e. triacilgliceróis) é o produto mais valioso das sementes ou frutos e outros compostos, como amido, proteina e fibra são considerados como produtos secundários, de menor valor. Melhorar a quantidade de óleo numa base ponderai à custa de outros compostos nas culturas produtoras de óleo iria assim aumentar o valor da cultura. Se as enzimas que regulam a alocação do carbono reduzido para a produção de óleo puderem ser supra-reguladas por sobre-expressão, as células irão acumular mais óleo à custa de outros produtos. Esta abordagem poderia não só ser utilizada para aumentar o teor de óleo em organismos que já produzem uma quantidade elevada de óleo, tais como as culturas produtoras de óleo, como poderia também levar a uma produção de óleo significativa em culturas contendo quantidades moderadas ou baixas de óleo, tais como soja, aveia, milho, batata, açúcar, beterraba e nabo, bem como em microorganismos. O desenvolvimento em tecnologias de engenharia genética combinadas com uma melhor compreensão da biossintese de triacilgliceróis torna agora possível transferir genes que codificam para enzimas chave envolvidas na síntese de triacilgliceróis de uma espécie de planta selvagem ou organismos de outros reinos, para culturas de sementes 2

ΕΡ 1 230 373 /PT produtoras de óleo domesticadas. Deste modo, os triacilgliceróis podem ser produzidos com uma pureza elevada e em grande quantidade, a custos moderados. É conhecido que a biossíntese de triacilgliceróis (TAG) em tecidos que acumulam gordura em animais (Bell & Coleman, 1983) e plantas (Cao & Huang, 1986, Martin & Wilson 1983), bem como a acumulação de óleo em organismos microbianos, tais como bactérias (Ekundayo & Packter, 1994), leveduras e outros fungos (Ratledge 1989) podem ser catalisadas por acil-CoA:diacilglicerol-aciltransferases (DAGAT), enzimas que transferem um grupo acilo de acil-CoA para diacilglicerol, formando assim TAG.

Durante os últimos anos, os genes que codificam para DAGAT, foram identificados em animais (Cases et al., 1998), plantas (Hobbs et al., 1999; Lardizabal et al., 2000) e em micróbios (Lardizabal et al., 1999). Estas DAGAT pertencem a duas familias de proteínas não relacionadas. O primeiro tipo de DAGAT que foi caracterizado, DAGAT A, até agora só foi encontrado em animais (Cases et al., 1998) e plantas (Hobbs et al., 1999). Estes genes têm semelhanças de sequência com genes que codificam para acil-CoA:colesterol-aciltransferase (ACAT) . A DAGAT A de ratinho tem 20% de identidade de sequência de aminoácidos com a ACAT de ratinho (Cases et al., 1998). No entanto, as DAGAT A de plantas e animais são mais semelhantes umas com as outras do que com a ACAT. Assim, a DAGAT A de ratinho tem 38% de identidade de sequência de aminoácidos com a DAGAT A de Arabidopsis thaliana (Hobbs et al., 1999). Também é aproximadamente 80% idêntica à proteina tipo ACAT humana, ARGPl, tendo sido sugerido que está envolvida na síntese de TAG (Oelkers et al., 1998), indicando que a ARGPl é uma DAGAT A. A levedura S. cerevisiae contém 2 genes com semelhança de sequência com ACAT, AREI e ARE2 (Yang et al., 1996). As proteínas codificadas têm aproximadamente 24% de identidade global de sequência de aminoácidos com a ACAT de ratinho e 15% de identidade com a DAGAT A de ratinho. Deve notar-se que elas são mais semelhantes uma à outra (45% de identidade de aminoácidos) do que a ACAT ou DAGAT de eucariotas superiores. 3

ΕΡ 1 230 373 /PT Não é possível classificá-las como ACAT ou DAGAT putativas com base apenas em semelhança de sequência, uma vez que as suas distâncias evolutivas de ambos os grupos de enzimas de eucariotas superiores são semelhantes. No entanto, algumas experiências mostraram que ambas, Arei e Are2, são ACAT, que em conjunto são responsáveis por toda a síntese de ésteres de esterol que ocorre na levedura (Yang et ai., 1996; Yu et al., 1996). O possível envolvimento de Arei e Are2 na síntese de TAG também foi estudado (Yang et al., 1996; Yu et al., 1996). A partir destes estudos, concluiu-se que a Arei e Are2 não estão envolvidas na síntese de TAG. Assim, não há antecedentes na arte que mostrem que a Arei é uma enzima de síntese de TAG, nem se pode concluir, com base nas homologias com sequências do tipo ACAT já publicadas que a Arei é uma DAGAT (Lassner e Ruezinsky, 1999). A segunda família de enzimas DAGAT, a família DAGAT B, não está relacionada com nenhumas outras proteínas conhecidas. Estas enzimas não apresentam nenhuma homologia de sequência com proteínas DAGAT A do tipo ACAT de ratinho e plantas (Lardizabal et al., 2000) ou com quaisquer outras proteínas conhecidas.

As DAGAT A e B não são as únicas enzimas que contribuem para a biossíntese de TAG. A TAG também pode ser sintetizada por uma reacção independente de acil-CoA. Assim, a nova enzima fosfolípido:diacilglicerol-aciltransferase (PDAT) catalisa a formação de TAG por transferência de um grupo acilo da posição sn-2 de um fosfolípido para DAG (Dahlqvist et al., 1999; Stáhl, 1999) .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção descreve a identificação de um gene que codifica para uma enzima que é parcialmente responsável pela acumulação de TAG em leveduras.

Num aspecto, a presente invenção refere-se à utilização deste gene em construções de ADN recombinante para dirigir a transcrição e tradução da sequência de diacilglicerol-aciltransferase da presente invenção num organismo hospedeiro ou sua progénie, tal como uma planta produtora de óleo. As 4

ΕΡ 1 230 373 /PT células e organismos contendo a diacilglicerol-aciltransferase como resultado da produção da sequência de codificação de aciltransferase, também estão incluídas no âmbito da invenção.

Tem particular interesse a expressão de sequências nucleotídicas da presente invenção a partir de regiões de iniciação da transcrição que são preferencialmente expressas em tecidos de semente de plantas. É contemplado que a sequência de genes possa ser sintetizada, em especial quando há interesse em proporcionar codões preferidos pela planta.

Numa concretização diferente, a presente invenção também se refere a métodos para utilizar uma sequência de ADN que codifica para a referida proteína da presente invenção, para aumentar o teor de óleo nas células de diferentes plantas produtoras de óleo.

Além disso, a invenção possibilita um processo para a produção de triacilglicerol que compreende crescer células ou organismos transgénicos sob condições em que qualquer das sequências nucleotídicas discutidas acima é expressa, de forma a produzir uma enzima nestas células com a capacidade para transferir um ácido gordo de acil-CoA para diacilglicerol, formando assim um triacilglicerol. A presente invenção pode ser essencialmente caracterizada pelos seguintes aspectos: 1. Utilização de uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma enzima que catalisa a transferência de um ácido gordo de acil-CoA para diacilglicerol, para a produção de triacilglicerol (TAG) por transformação genética de um organismo produtor de óleo com a referida sequência, de modo a ser expressa neste organismo e resultar numa enzima activa, de modo a aumentar o teor de óleo do organismo. A sequência de ácido nucleico é derivada da sequência apresentada em SEQ ID NO:l, do gene AREI de Saccharomyces cerevisiae (clone genómico ou ADNc), ou de uma sequência de ácido nucleico ou ADNc que contém sequências nucleotídicas que codificam para uma proteína com uma sequência de aminoácidos 5

ΕΡ 1 230 373 /PT que é 60% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2. 2. Organismo transgénico compreendendo, no seu genoma ou num plasmideo, uma sequência de ácido nucleico de acordo com o acima exposto, transferida por tecnologia de ADN recombinante. Os organismos transgénicos são seleccionados do grupo constituído por fungos, plantas e animais. De preferência, os organismos transgénicos são plantas agrícolas e de preferência a referida sequência nucleotídica é expressa sob o controlo de um promotor específico de órgão de armazenamento.

Alternativamente, a sequência nucleotídica é expressa sob o controlo de um promotor específico de sementes. 3. Uma proteína codificada por uma molécula de ADN de acordo com a SEQ ID NO:l ou um seu fragmento funcional (enzimaticamente activo). Alternativamente, a proteína é produzida num organismo como especificado no aspecto 2, que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de homologia com a referida sequência de aminoácidos. De preferência, a proteína é isolada de Saccharomyces cerevisiae. 4. Utilização de uma proteína como especificado no aspecto 3, na produção de triacilgliceróis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção agora descrita de um modo geral será mais bem compreendida com referência às figuras e exemplos seguintes que são incluídos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção.

Descrição das Figuras

Figura 1. Actividade de DAGAT in vivo numa estirpe de levedura (SCY62) que sobre-expressa o gene AREI.

Testaram-se alíquotas de membranas microssómicas preparadas a partir da estirpe de controlo (pista A) ou da estirpe que sobre-expressa AREI (pista B), quanto a actividade de DAGAT de acordo com o método A descrito em materiais e métodos. O triacilglicerol radioactivo sintetizado foi 6

ΕΡ 1 230 373 /PT visualizado e quantificado em cpm (números entre parêntesis) na placa de TLC, por autorradiografia electrónica (Instant Imager, Packard, EUA). Abreviaturas utilizadas na figura: Triacilglicerol (TAG) e ácidos gordos não esterifiçados (FA)

Figura 2. Actividade de DAGAT in vitro num mutante duplo PDAT DAGAT B, um mutante triplo PDAT DAGAT B AREI e no mesmo mutante triplo contendo um plasmídeo que sobre-expressa o gene AREI.

Os triacilgliceróis (TAG) sintetizados em microssomas a partir do mutante duplo, H1226 (pista A), mutante triplo, H1236 (pista B) e do mesmo mutante triplo contendo um plasmídeo que sobre-expressa o gene AREI (pista C) foram visualizados numa placa de TLC por autorradiografia electrónica (Instant Imager, Packard, EUA) . BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQ ID: SEQ ID NO:l: Sequência de ADN genómico do gene AREI de Saccharomyces cerevisiae, ORF YCR048W. SEQ ID NO:2: Sequência de aminoácidos da sequência de leitura aberta YCR048W de Saccharomyces cerevisiae.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - A acumulação de triacilgliceróis é reduzida em células de levedura que não possuem o gene AREI

Materiais e métodos

Estirpes de levedura. As estirpes de levedura utilizadas neste estudo eram congénicas com o ruído de fundo de W303-1A (Thomas & Rothstein, 1989). Produziu-se uma estirpe mutante arei, Hllll, com o genótipo MATctarel-Δ: :HIS3 ADE2 can 1-100 leu2-3,112 trpl-1 ura3-l, cruzando as duas estirpes SCY60 (MATaarel-Δ::HIS3 ade2-l can 1-100 leu2-3, 112 trpl-1 ura3-l) e SCY61 (MATaare2^: -.LEU2ADE2 can 1-100 his3-ll, 15 trpl-1 ura3-l) (Yang et al., 1996) e dissecando as tétradas. Como controlo do tipo selvagem utilizámos SCY62 (MATaADE2 can 1-100 his 3-11,15 leu2-3 trpl-1 ura3-l) (Yang et al., 1996). As estirpes mutantes de levedura que foram rompidas em YNR008w e YOR245c que codificam para DAGAT B e PDAT de levedura, respectivamente e o gene AREI foram construídos através de uma série de transformações de levedura 7

ΕΡ 1 230 373 /PT utilizando o método de acetato de litio. Os fragmentos de ADN lineares utilizados para romper os genes YOR245c e YNR008w foram criados como se segue. Construiram-se iniciadores específicos para YOR245c (300 bases a montante, CAGCATTGACGTAATGGGAA, e jusante AAAGCCAAAAAGAGAAGGACA, do gene) e o gene foi sintetizado utilizando PCR a partir de ADN genómico de SCY62. As extremidades do fragmento de PCR foram tornadas lisas e ligadas em pUC119 previamente clivado com a enzima de restrição Smai. O plasmideo resultante, YOR245c-pUC 119, foi então digerido com Clal/StuI e desfosforilado para impedir a ligação de novo. O marcador KanMX4 foi obtido por digestão do plasmideo pFA6a com Smal/Sacl. O fragmento KanMX4 de extremidades lisas foi então ligado no vector YOR245c-pUC119 entre os sitios de Ciai e StuI, na fase de leitura aberta de YOR245c. Obteve-se por fim um fragmento linear contendo a cassete de rompimento resultante YOR245c::KanMX4, por clivagem com BamHI/Ndel. O fragmento linear utilizado para romper o gene YNR008w foi construído de um modo semelhante ao fragmento YOR245c::KanMX4. O gene YNR008w foi amplificado a partir do ADN genómico SCY62, clonado no vector pBluescript (Dahlqvist et al., 2000) e digerido com as enzimas de restrição Bbsl/Munl. O marcador TRPl foi então ligado entre os sitios de Bbsl e Muni no plasmideo YNR008w-pBluescript e obteve-se um fragmento linear contendo a cassete de rompimento, por digestão com BamHI/PstI. O mutante de PDAT único, H1079, com o genótipo MATapdat-Δ::TRPl ADE2 leu2-3, 112 ura3-l his3-ll,15 trpl-1, foi produzido transformando a estirpe do tipo selvagem SCY62 com o fragmento linear YNR008w::TRPl. Construiu-se o mutante duplo PDAT DAGATB, H1226 com o genótipo MATapdat-Δ::TRPl dagat B-Δ::KanMX4 ADE2 leu2-3, 112 ura3~l his3-ll,15 trpl-1 de um modo idêntico, transformando H1079 com o fragmento linear YOR245c::KanMX4. Produziu-se um mutante duplo ARE1POAT, H1224, com o genótipo MATaarel-Δ::HIS3 pdat-Δ::TRP1 ADE2 can 1-100 leu2-3,112 ura3-l trpl-1 transformando Hllll com o fragmento linear YNR008w::TRP1. A estirpe mutante tripla, H1236 com o genótipo MATaarel-Δ::HIS3 pdat-Δ::TRP1 dagat B-Δ::KanMX4 ADE2 leu2-3,112 ura3-l trpl-1 foi construída transformando H1224 com o fragmento linear YOR245c::KanMX4.

Cultura de leveduras. Cultivaram-se células de levedura a 28 ou 30°C num agitador rotativo, em meio YPD líquido 8

ΕΡ 1 230 373 /PT (extracto de levedura a 1%, peptona a 2%, glucose a 2%) . As células transformadas foram crescidas em meio sintético (Sherman et al., 1986) sem uracilo e suplementado com glicerol a 2% (v/v) e etanol a 2% (v/v).

Análise de lípidos. 0 teor de lípidos das células de levedura foi determinado como descrito por Dahlqvist et al. (2000) e é apresentado como nmol de ácido gordo (FA) por mg de peso seco de levedura.

Resultados O teor de lípidos de uma estirpe de levedura mutante (SCT60) em que o gene AREI foi rompido, foi analisado e comparado com células de levedura do tipo selvagem (SCY62) a diferentes fases de crescimento. Em células mutantes arei, colhidas na fase exponencial após 10 horas de cultura, a quantidade total de lípido, medida como nmol FA por peso seco de levedura, não era significativamente diferente da levedura do tipo selvagem (tabela 1), nem a quantidade de ácidos gordos acumulados em TAG diferia muito entre o tipo selvagem e o mutante arei. O efeito do rompimento de arei na acumulação de óleo em células em fase estacionária foi analisado numa experiência em que as células de levedura foram previamente cultivadas durante 24 h em meio YPD liquido. As células foram então recolhidas e ressuspensas em meio mínimo (Meesters et al., 1996) suplementado com glicerol 16 g/1, até ao volume original da cultura de crescimento. Neste meio mínimo suplementado com glicerol, as células de levedura entram em fase estacionária sob condições adequadas para acumulação de TAG. Após cultura durante 24 h, as células foram recolhidas e a sua composição lipídica foi determinada. O teor total de lípidos no mutante arei era 15% inferior ao do tipo selvagem. A quantidade de TAG no mutante arei era quase 40% inferior à do tipo selvagem, enquanto que o teor de lípidos polares não diferia significativamente entre o mutante arei e a levedura do tipo selvagem (tabela 1).

Verificou-se recentemente que dois outros genes, YNR008w e YOR254c (Stáhl, 1999; Dahlqvist et al., 2000; Lardizabal et al., 2000) estão envolvidos na síntese de TAG em levedura. Estes genes codificam para uma proteína PDAT e DAGAT B, respectivamente. Produziu-se uma estirpe de levedura com 9

ΕΡ 1 230 373 /PT rompimento em todos os três genes (AREI, YNR008w e YOR254c) e uma estirpe de levedura com rompimento apenas nos genes PDAT e DAGAT B e estas foram designadas por mutante triplo e duplo, respectivamente. O teor de TAG do mutante duplo era de 48% em relação ao tipo selvagem (tabela 2), enquanto que a quantidade de TAG acumulado no mutante triplo era apenas 4% do nivel na levedura do tipo selvagem. Comparando as quantidades de TAG acumulado nos mutantes duplo e triplo é claro que a proteína Arei contribui para a síntese de TAG em levedura.

Em resumo, esta experiência mostra claramente que o produto do gene AREI contribui para a acumulação de TAG na levedura.

Tabela 1. Teor de lípidos em células de levedura mutantes AREI (SCY60) e do tipo selvagem (SCY62) . A acumulação de lípido em levedura com rompimento no gene AREI (mutante arei) foi analisada em diferentes fases de crescimento e comparada com a levedura do tipo selvagem de controlo. A composição de lípidos das células em crescimento exponencial foi analisada após 10 horas de cultura em meio YPD, a 28°C. As células de levedura em fase estacionária foram preparadas por pré-cultura das células em meio YPD líquido durante 24 horas a 28°C; após o que as células foram recolhidas, ressuspensas em meio minimo (Meesters et al., 1996) suplementado com glicerol 16 g/1 e cultivadas por mais 24 horas, a 28°C. O teor de ésteres de esterol, TAG, outros lípidos neutros e lípidos polares foi determinado como nmol de ácidos gordos (FA) por mg de peso seco de levedura. SCY62 (nmol FA/mg) 10 h 48h SCY60 (nmol FA/mg) 10 h 48h Ésteres de esterol 15 24 12 19 Triacilglicerol 6 44 8 28 Outros lípidos neutros 4 6 4 5 Lípidos polares 65 74 63 74 Lípidos totais 90 148 87 126 10

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Tabela 2. Teor de lípidos na estirpe mutante dupla PDAT DAGATB (H1226), na estirpe mutante tripla PDAT DAGATB AREI (H1236) e em células de levedura do tipo selvagem (SCY62) . As diferentes estirpes de levedura, todas elas contendo o plasmideo de expressão vazio pJN92 (Ronne et al., 1991) foram cultivadas em meio YNB ao qual se adicionou galactose a 2% (v/v) a uma Αεοο de 4. As células foram recolhidas após mais 22 horas de crescimento e o teor de ésteres de esterol, TAG, outros lipidos neutros e lipidos polares, foi determinado como nmol de ácidos gordos (FA) por mg de peso seco de levedura. SCY62 (nmol FA/mg) H1226 (nmol FA/mg) H1236 (nmol FA/mg) Ésteres de esterol 13 10 1 Triacilglicerol 163 78 7 Outros lípidos neutros 17 16 41 Lípidos polares 58 66 44 Lípidos totais 251 170 87

exemplo 2 - A acumulação de triacllgllcerol está aumentada em células de levedura que sobre-expressam o gene AREI

Materials e métodos

Para a sobre-expressão induzida do gene AREI, clonou-se um fragmento Ehel/Ecl 136II de 2001 pb do plasmideo YEP 3-16 (Yang et al., 1996) no sitio BamEl do vector de expressão GALl pJN92 (Ronne et al., 1991) produzindo assim pUS5. A estirpe de levedura do tipo selvagem SCY62 (Mata ADE2 can 1-100 hls3-ll,5 leu2-3 trpl-1 ura3-l) (Yang et al., 1996) foi transformada com o pUS5 e cultivada a 28°C num agitador rotativo em meio sintético (Sherman et al., 1986) sem uracilo e suplementado com glicerol a 2% (v/v) e etanol a 2% (v/v) . O promotor GALl foi induzido após 43 h de crescimento por adição de galactose na concentração final de 2% (p/v). As células foram recolhidas após mais 24 horas de crescimento. As células do tipo selvagem (SCY62) transformadas com o vector vazio, pJN92 e cultivadas sob condições idênticas foram utilizadas como controlo. O teor de lipidos das células de levedura foi determinado como descrito por Dahlqvist et al. (2000) e é apresentado como nmol de ácido gordo (FA) por mg de peso seco de levedura. 11

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Resultados O efeito da sobre-expressão do gene AREI na acumulação de lípidos foi estudado transformando a levedura do tipo selvagem (estirpe SCY62) com um plasmídeo que contém o gene AREI sob o controlo do promotor GALl induzido por galactose (Tabela 3). A sobre-expressão do gene AREI a partir deste promotor não teve nenhum efeito forte na taxa de crescimento, tal como determinado por medição da densidade óptica. No entanto, o teor de lípidos totais em células de levedura que sobre-expressam AREI era 1,4 vezes maior do que na levedura de controlo transformada com um vector de expressão vazio (Tabela 3) . O teor de lípidos elevado em células de levedura que sobre-expressam AREI é essencialmente devido a um aumento de 50% no teor de TAG, mas a quantidade de ésteres de esterol também aumentou significativamente nestas células, em comparação com o controlo. Estes resultados demonstram claramente que o produto de gene de AREI, além do seu envolvimento anteriormente referido na síntese de ésteres de esterol (Yang et al., 1996), também está envolvido na síntese de TAG. Os níveis elevados de TAG alcançados nas células que sobre-expressam AREI também demonstram claramente a utilidade potencial do gene AREI para aumentar o teor de óleo em organismos transgénicos.

Tabela 3. Teor de lípidos em células de levedura que sobre-expressam o gene AREI. Cultivaram-se células de levedura (SCY62) transformadas com o gene AREI sob o controlo do promotor GALl no vector pJN92, como descrito na secção de materiais e métodos. As células de levedura (SCY62) transformadas com um vector vazio, cultivadas sob condições idênticas, foram utilizadas como controlo. As células foram recolhidas e o teor de esteróis, triacilgliceróis, outros lípidos neutros e lípidos polares foi determinado como nmol de ácidos gordos (FA) por mg de peso seco de levedura. SCY62 (nmol FA/mg) SCY62 que sobre-expressa arei (nmol FA/mg) Ésteres de esterol 19 27 Triacilglicerol 160 239 Outros lípidos neutros 30 32 Lípidos polares 48 56 Lípidos totais 257 354 12

ΕΡ 1 230 373 /PT EXEMPLO 3-0 produto do gene AREI tem actividade de diacilglicerol-aciltransferase

Materiais e métodos

Analisou-se a actividade in vitro de diacilglicerol-aciltransferase (DAGAT) em fracções microssómicas preparadas a partir de células de levedura, utilizando um dos seguintes métodos. Método A: Transformou-se uma levedura do tipo selvagem (estirpe SCY62) com um plasmideo (pUS5) contendo o gene AREI sob o controlo de um promotor GALl (descrito em materiais e métodos no Exemplo 2). A levedura transformada foi cultivada a 28°C em meio YNB definido, sem uracilo. A expressão do gene AREI foi induzida por adição de galactose a 2% (v/v), após 8 horas de crescimento e as células foram recolhidas após mais 17 horas. Prepararam-se membranas microssómicas a partir da levedura transformada, ressuspendendo 1 g de levedura (peso fresco) em 8 ml de tampão arrefecido em gelo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, glicerol a 5% (v/v), DTT 1 mM, sulfato de amónio 0,3 M) num tubo de vidro de 12 ml, ao qual se adicionaram 4 ml de pérolas de vidro (diâmetro 0,45-0,5 mm). 0 tubo de vidro foi agitado vigorosamente (3 x 60 s) com um homogeneizador de células MSK (B. Braun Melsungen AG, Alemanha). A suspensão foi centrifugada a 20 000 g durante 15 min a 6°C e o sobrenadante resultante foi centrifugado a 100 000 g durante 2 h a 6°C. O sedimento resultante, contendo membranas microssómicas, foi ressuspenso num tampão fosfato de K 0,1 M (pH 7,2) e armazenado a -80°C. A actividade de DAGAT foi analisada em aliquotas de membranas microssómicas (50 μΐ), correspondendo a 10 nmol de f osf atidilcolina a que se adicionou 1 pmol de dioleoil-PG 0,25 pmol de dioleoil-DAG emulsionados em 50 μΐ de tampão contendo HEPES-NaOH 190 mM, pH 7,5, MgCl2 125 mM, CHAPS 30 mM, BSA 2,5 mg/ml e 2 nmol de [14C]-palmitoil-coA (2775 dpm/nmol). A mistura reaccional foi incubada a 30°C durante 30 min. Os lipidos foram em seguida extraídos em clorofórmio e separados utilizando cromatografia em camada fina em 60 placas de sílica gel, em hexano/éter dietílico/ácido acético (80:20:1). Os lipidos radioactivos foram visualizados e quantificados nas placas por autorradiografia electrónica (Instant Imager, Packard, EUA). 13

ΕΡ 1 230 373 /PT Método B: O mutante duplo PDAT DAGAT B (H1226) e o mutante triplo PDAT DAGATB AREI (H1236), descritos em Materiais e Métodos no Exemplo 1, foram transformados com o plasmideo de expressão vazio (pJN92) . Produziu-se um transf ormante que expressa o gene AREI sob o controlo do promotor GALl, transformando o mutante triplo H1236 com o plasmideo pUS5 (descrito em materiais e métodos no Exemplo 2) . Todos os transformantes de levedura foram cultivados em meio YNB a que se adicionou galactose a 2% (v/v), a uma A60o de 4. As células foram recolhidas após mais 6 horas de crescimento e prepararam-se microssomas utilizando uma modificação do procedimento de Dahlqvist et al. (2000). As células de levedura (0,2 g) foram ressuspensas em 1,5 ml de tampão arrefecido em gelo (Tris-HCl 20 mM pH 7,0, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, glicerol a 5% (v/v), DTT 1 mM, sulfato de amónio 0,3 M) num tubo Eppendorf de 2 ml contendo 0,2 ml de pérolas de vidro (0,45-0,5 mm de diâmetro). O tubo foi agitado vigorosamente (3 x 60 s) num homogeneizador de células (Mini Bead Beater). A levedura homogeneizada foi centrifugada a 1350 x g durante 20 min a 4°C e o sobrenadante resultante foi subsequentemente centrifugado a 150.000 x g durante lha 4°C. O sedimento foi ressuspenso em fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,2) e armazenado a -80°C. Adicionou-se di-hexanoil-DAG (5 nmol) dissolvido em clorofórmio a microtubos e o clorofórmio foi evaporado sob uma corrente de N2. Adicionaram-se aos tubos aliquotas (90 μΐ) de fracções microssómicas correspondentes a 150 pg de proteína, num tampão que consiste de HEPES 50 mM (pH 7,2), MgCl2 5 mM e BSA 1 mg/ml e a suspensão foi bem misturada. Por fim, adicionaram-se 10 μΐ de [14C]-plamitoíl-CoA (20 nmol, 5000 dpm/mmol) e as misturas foram incubadas a 30°C durante 15 min. Os lípidos foram extraídos da mistura reaccional em clorofórmio (Bligh & Dyer 1959) e separados por TLC em 60 placas de sílica gel (Merck) . A placa de TLC foi primeiro desenvolvida em clorofórmio/metanol/ácido acético/água (85:15:10:3,5) para 80 mm. A placa seca foi então desenvolvida em hexano/éter dietílico/ácido acético (80:20:1,5) para 180 mm. Os lípidos radioactivos forma visualizados e quantificados nas placas por autorradiografia electrónica (Instant Imager, Packard). 14

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Resultados

Testaram-se membranas microssómicas preparadas a partir de levedura transformada que sobre-expressa o gene AREI e de levedura de controlo transformada com um plasmídeo vazio (pJN92) quanto a actividade de DAGAT, de acordo com o método A de Materiais e Métodos. A quantidade de TAG radiomarcado sintetizado a partir de [14C]palmitoil-CoA em membranas microssómicas preparadas a partir do organismo que sobre-expressa AREI aumentou em 66% em comparação com a levedura de controlo (Fig. 1). A actividade de DAGAT também foi testada em membranas microssómicas preparadas a partir de células da estirpe de mutante duplo PDAT DAGATB (Hl226) e da estirpe de mutante triplo PDAT DAGAT AREI (Hl236) (Método B). No mutante duplo, com um gene AREI funcional, sintetizou-se TAG com duas cadeias hexanoilo e uma [14C] palmitoilo, a partir de di-hexanoíl-DAG e [14C]-palmitoil-CoA adicionados. Esta sintese era muito pouco detectável no mutante triplo (Figura 2), no qual o gene AREI foi rompido. No entanto, a sintese in vitro de TAG foi recuperada em células de mutante triplo transformadas com um plasmideo que expressa o gene AREI. Isto mostra claramente que a sintese in vitro de TAG nestes mutantes de levedura se correlaciona com a presença de um gene AREI funcional e que a proteína codificada pelo gene AREI possui actividade de DAGAT.

EXEMPLO 4 - A acumulação de triacilglicerol está aumentada em sementes de Arabidopis thaliana que expressam o gene AREI

Materials e métodos O gene AREI foi amplificado a partir do genoma de levedura utilizando a enzima de verificação polimerase pfu (Promega). Introduziu-se um sítio de enzima de restrição EcoRl e Xbalf respectivamente nas extremidades 5' e 3' deste fragmento, para permitir a clonagem direccional do fragmento. O fragmento de PCR foi clonado no vector pBluescript (Stratagene). A inserção derivada deste plasmídeo foi então clonada a jusante de um fragmento promotor de napina (Stálberg et al., 1993) no vector pPGTV-KAN (Becker et al., 1993). Este plasmídeo foi transformado em Agrobacterium estirpe GV3301. As células de Agrobacterium transformadas foram em seguida utilizadas para transformar explantes de raiz de Arabidopsis thaliana (Valvekens et al., 1992). O teor de lípidos em 15

ΕΡ 1 230 373 /PT sementes de Arabidopsis foi determinado por metilação de ácidos gordos. Os ácidos gordos no óleo de aproximadamente 2-3 mg de sementes foram metilados em 2 ml de H2SO4 a 2% (v/v) em metanol seco, durante 90 min, a 90°C. Os ésteres de metilo de ácidos gordos foram extraídos com hexano e analisados por GLC através de uma coluna de silica fundida CP-Wax58-CB de 50 m x 0,32 mm (Chrompack), utilizou-se ácido metil-heptadecanóico como padrão interno.

Resultados

Transformou-se A. thaliana com o gene AREI sob o controlo de um promotor de napina, que é especifico de sementes e activo durante a fase principal de acumulação de óleo. O teor de óleo foi analisado em sementes de plantas T2 individuais, derivadas de quatro fenómenos de transformação independentes (Tabela 4). Os resultados mostraram que nas três linhas entre 50% e 100% das plantas T2 produziram sementes com teores de óleo elevados, estatisticamente significativos, em comparação com o teor de óleo nas sementes das plantas de controlo. O teor de óleo estava aumentado em até 18% nas sementes que expressam AREI. Uma linha (28-1) tinha o mesmo teor de óleo que as sementes das plantas de controlo.

Tabela 4. Acumulação de óleo em sementes de Arabidopsis thaliana transformadas com o gene AREI.

Cultivaram-se plantas T2 transformadas com o gene AREI sob o controlo do promotor de napina e plantas de controlo transformadas com um vector vazio numa câmara de crescimento, sob condições controladas. O teor de óleo em sementes maduras destas plantas foi determinado por análises de GLC e é apresentado como nmol de ácidos gordos (FA) por mg de semente.

Transformantes

Controlo 28-1 28-2 28-3 28-4 Número de plantas T2 analisadas 4 6 2 6 11 Número de plantas T2 com um teor de óleo na semente significativamente aumentado* 0 2 3 9 nmol FA por mg de semente em plantas T2 com o teor de óleo mais elevado 1535+114 1562+28 1753+53 1641+82 1818+18 * calculado com o teste de dois lados da diferença média a a=5 e com base no teor médio de óleo de 4 plantas de controlo. 16

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

1) INFORMAÇÃO GERAL

i) REQUERENTE: Scandinavian Biotechnology Research AB ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Utilização de uma classe de enzimas e seus genes de codificação para aumentar o teor de óleo em organismos transgénicos iii) Número de sequências: 2 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: A) COMPRIMENTO: 1833 bases B) TIPO: ácido nucleico c) TIPO DE CADEIA: simples D) TOPOLOGIA: linear

ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATGACGGAGA CTAAGGATTT GTTGCAAGAC GAAGAGTTTC TTAAGATCCG 50 CAGACTCAAT TCCGCAGAAG CCAACAAACG GCATTCGGTC ACGTACGATA 100 ACGTGATCCT GCCACAGGAG TCCATGGAGG TTTCGCCACG GTCGTCTACC 150 ACGTCGCTGG TGGAGCCAGT GGAGTCGACT GAAGGAGTGG AGTCGACTGA 200 250

GGCGGAACGT GTGGCAGGGA AGCAGGAGCA GGAGGAGGAG TACCCTGTGG 17

ΕΡ 1 230 373 /PT ACGCCCACAT GCAAAAGTAC CTTTCACACC TGAAGAGCAA GTCTCGGTCG 300 AGGTTCCACC GAAAGGATGC TAGCAAGTAT GTGTCGTTTT TTGGGGACGT 350 GAGTTTTGAT CCTCGCCCCA CGCTCCTGGA CAGCGCCATC AACGTGCCCT 400 TCCAGACGAC TTTCAAAGGT CCGGTGCTGG AGAAACAGCT CAAAAATTTA 450 CAGTTGACAA AGACCAAGAC CAAGGCCACG GTGAAGACTA CGGTGAAGAC 500 TACGGAGAAA ACGGACAAGG CAGATGCCCC CCCAGGAGAA AAACTGGAGT 550 CGAACTTTTC AGGGATCTAC GTGTTCGCAT GGATGTTCTT GGGCTGGATA €00 GCCATCAGGT GCTGCACAGA TTACTATGCG TCGTACGGCA GTGCATGGAA 650 TAAGCTGGAA ATCGTGCAGT ACATGACAAC GGACTTGTTC ACGATCGCAA 700 TGTTGGACTT GGCAATGTTC CTGTGCACTT TCTTCGTGGT TTTCGTGCAC 750 TGGCTGGTGA AAAAGCGGAT CATCAACTGG AAGTGGACTG GGTTCGTTGC 800 AGTGAGCATC TTCGAGTTGG CTTTCATCCC CGTGACGTTC CCCATTTACG 850 TCTACTACTT TGATTTCAAC TGGGTCACGA GAATCTTCCT GTTCCTGCAC 900 TCCGTGGTGT TTGTTATGAA GAGCCACTCG TTTGCCTTTT ACAACGGGTA 950 TCTTTGGGAC ATAAAGCAGG AACTCGAGTA CTCTTCCAAA CAGTTGCAAA 1000 AATACAAGGA ATCTTTGTCC CCAGAGACCC GCGAGATTCT GCAAAAAAGT 1050 TGCGACTTTT GCCTTTTCGA ATTGAACTAC CAGACCAAGG ATAACGACTT 1100 18

ΕΡ 1 230 373 /PT CCCCAACAAC ATCAGTTGCA GCAATTTCTT CATGTTCTGT TTGTTCCCCG 1150 TCCTCGTGTA CCAGATCAAC TACCCAAGAA CGTCGCGCAT CAGATGGAGG 1200 TATGTGTTGG AGAAGGTGTG CGCCATCATT GGCACCATCT TCCTCATGAT 1250 GGTCACGGCA CAGTTCTTCA TGCACCCGGT GGCCATGCGC TGTATCCAGT 1300 TCCACAACAC GCCCACCTTC GGCGGCTGGA TCCCCGCCAC GCAAGAGTGG 1350 TTCCACCTGC TCTTCGACAT GATTCCGGGC TTCACTGTTC TGTACATGCT 1400 CACGTTTTAC ATGATATGGG ACGCTTTATT GAATTGCGTG GCGGAGTTGA 1450 CCAGGTTTGC GGACAGATAT TTCTACGGCG ACTGGTGGAA TTGCGTTTCG 1500 TTTGAAGAGT TTAGCAGAAT CTGGAACGTC CCCGTTCACA AATTTTTACT 1550 AAGACACGTG TACCACAGCT CCATGGGCGC ATTGCATTTG AGCAAGAGCC 1600 AAGCTACATT ATTTACTTTT TTCTTGAGTG CCGTGTTCCA CGAAATGGCC 1650 ATGTTCGCCA TTTTCAGAAG GGTTAGAGGA TATCTGTTCA TGTTCCAACT 1700 GTCGCAGTTT GTGTGGACTG CTTTGAGCAA CACCAAGTTT CTACGGGCAA 1750 GACCGCAGTT GTCCAACGTT GTCTTTTCGT TTGGTGTCTG TTCAGGGCCC 1800 AGTATCATTA TGACGTTGTA CCTGACCTTA TGA 1833 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: A) COMPRIMENTO: 610 aminoácidos B) TIPO: aminoácido D) TOPOLOGIA: linear ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 19

ΕΡ 1 230 373 /PT iii) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Thr Glu Thr Lys Asp Leu Leu Gin Asp Glu Glu Phe Leu Lys Ile 1 5 10 15 Arg Arg Leu Asn Ser Ala Glu Ala Asn Lys Arg His Ser Vai Thr Tyr 20 25 30 Asp Asn Vai Ile Leu Pro Gin Glu Ser Met Glu Vai Ser Pro Arg Ser 35 40 45 JCi mu- J.HA Thr Ser T ucu Vai *. VJXU Pro Tí_ 1 vai Glu Ser Thr Glu Gly Vai Glu 50 55 60 Ser Thr Glu Ala Glu Arg Vai Ala Gly Lys Gin Glu Gin Glu Glu Glu 65 70 75 80 Tyr Pro Vai Asp Ala His Met Gin Lys Tyr Leu Ser His Leu Lys Ser 85 90 95 Lys Ser Arg Ser Arg Phe His Arg Lys Asp Ala Ser Lys Tyr Vai Ser 100 105 1 1 Λ uv Phe Phe Gly Asp Vai Ser Phe Asp Pro Arg Pro Thr Leu Leu Asp Ser 115 120 125 Ala Xle Asn Vai Pro Phe Gin Thr Thr Phe Lys Gly Pro Vai Leu Glu 130 135 140 Lys Gin Leu Lys Asn Leu Gin Leu Thr Lys Thr Lys Thr Lys Ala Thr 145 150 155 160 Vai Lys Thr Thr Vai Lys Thr Thr Glu Lys Thr Asp Lys Ala Asp Ala 165 170 175 Pro Pro Gly Glu Lys Leu Glu Ser Asn Phe Ser Gly Ile Tyr Vai Phe 180 185 190 Ala Trp Met Phe Leu Gly Trp Ile Ala Ile Arg Cys Cys Thr Asp Tyr 195 200 205 20

ΕΡ 1 230 373 /PT

Tyr Ala Ser Tyr Gly Ser Ala Trp Asn Lys Leu Glu Ile Val Gin Tyr 210 215 220 Met Thr Thr Asp Leu Phe Thr Ile Ala Met Leu Asp Leu Ala Met Phe 225 230 235 240 Leu Cys Thr Phe Phe Val Val Phe Val His Trp Leu Val Lys Lys Arg 245 250 255 Ile Ile Asn Trp Lys Trp Thr Gly Phe Val Ala Val Ser lie Phe Glu 260 265 270 Leu Ala Phe Ile Pro Val Thr Phe Pro Ile Tyr Val Tyr Tyr Phe Asp 275 280 285 Phe Asn Trp Val Thr Arg Ile Phe Leu Phe Leu His Ser Val Val Phe 290 295 300 Vai Met Lys Ser His Ser Phe Ala Phe Tyr Asn Gly Tyr Leu Trp Asp 305 310 315 320 Ile Lys Gin Glu Leu Glu Tyr Ser Ser Lys Gin Leu Gin Lys Tyr Lys 325 330 335 Glu Ser Leu Ser Pro Glu Thr Arg Glu Ile Leu Gin Lys Ser Cys Asp 340 345 350 Phe Cys Leu Phe Glu Leu Asn Tyr Gin Thr Lys Asp Asn Asp Phe Pro 355 360 365 Asn Asn Ile Ser Cys Ser Asn Phe Phe Met Phe Cys Leu Phe Pro Val 370 375 380 Leu Vai Tyr Gin Ile Asn Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Ile Arg Trp Arg 385 390 395 400 Tyr vai Leu Glu Lys Val Cys Ala Ile Ile Gly Thr Ile Phe Leu Met 4 05 410 415 Met Val Thr Ala Gin Phe Phe Met His Pro Val Ala Met Arg Cys Ile 420 425 430 Gin Phe His Asn Thr Pro Thr Phe Gly Gly Trp Ile Pro Ala Thr Gin 435 440 445 Glu Trp Phe His Leu Leu Phe Asp Met Ile Pro Gly Phe Thr Val Leu 450 455 460 Tyr Met Leu Thr Phe Tyr Met Ile Trp Asp Ala Leu Leu Asn Cys Val 465 470 475 480 Ala Glu Leu Thr Arg Phe Ala Asp Arg Tyr Phe Tyr Gly Asp Trp Trp 485 490 495 Asn Cys Val Ser Phe Glu Glu Phe Ser Arg Ile Trp Asn Val Pro Val 500 505 510 His Lys Phe Leu Leu Arg His Val Tyr His Ser Ser Met Gly Ala Leu 515 520 525 21

ΕΡ 1 230 373 /PT

His Leu Ser Lys Ser Gin Ala Thr Leu Phe Thr Phe Phe Leu Ser Ala 530 535 540 Vai Phe His Glu Met Ala Met Phe Ala Ile Phe Arg Arg Vai Arg Gly 545 550 555 560 Tyr Leu Phe Met Phe Gin Leu Ser Gin Phe Vai Trp Thr Ala Leu Ser 565 570 575 Asn Thr Lys Phe Leu Arg Ala Arg Pro Gin Leu Ser Asn Vai Vai Phe 580 585 590 Ser Phe Gly Vai Cys Ser Gly Pro Ser Ile Ile Met Thr Leu Tyr Leu 595 600 605

Thr Leu 610

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Lisboa

Claims (11)

1. ΕΡ 1 230 373 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para aumentar o teor de óleo de uma planta produtora de óleo, compreendendo: transformar a referida planta com uma sequência nucleotídica de modo a que o organismo expresse uma enzima que catalisa a transferência de um ácido gordo de acil-CoA para diacilglicerol, para a produção de triacilglicerol (TAG) e em que a referida enzima compreende a SEQ ID NO:2.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a referida sequência nucleotídica compreende a SEQ ID NO:l.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a referida sequência nucleotídica é de um gene AREI de Saccharomyces cerevisiae.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a referida sequência nucleotídica é transferida por tecnologia de ADN recombinante.
5. 5. Planta transgénica compreendendo um plasmídeo ou genoma contendo uma sequência nucleotídica que codifica para uma enzima que catalisa a transferência de um ácido gordo de acil-CoA para diacilglicerol, para a produção de triacilglicerol (TAG), em que a referida sequência nucleotídica é derivada da SEQ ID N0:1 ou do gene AREI de Saccharomyces cerevisiae e a referida sequência nucleotídica codifica para uma enzima com uma sequência de aminoácidos que compreende a SEQ ID NO:2
6. 6. Planta transgénica de acordo com a reivindicação 5, em que a referida planta é uma planta agrícola.
7. 7. Planta transgénica de acordo com a reivindicação 6, em que a referida planta é uma cultura de semente produtora de óleo.
8. 8. Planta transgénica de acordo com qualquer uma das reivindicações 5-7, em que a referida sequência nucleotídica é expressa sob o controlo de um promotor específico de um órgão de armazenamento. ΕΡ 1 230 373 /PT 2/2
9. 9. Planta transgénica de acordo com a reivindicação 8, em que a referida sequência nucleotídica é expressa sob o controlo de um promotor específico de sementes.
10. 10. Método para aumentar o teor de óleo de um organismo produtor de óleo, compreendendo: transformar o referido organismo seleccionado do grupo constituído por Arabidopsis e levedura com uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:l ou o gene AREI, de modo a que o referido organismo expresse uma enzima e catalise a transferência de um ácido gordo de acil-CoA para diacilglicerol, para a produção de triacilglicerol (TAG), em que a referida enzima compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.
11. 11. Método para aumentar o teor de óleo de uma planta produtora de óleo, compreendendo: transformar a referida planta com uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO:l ou o gene AREI, de modo a que o referido organismo expresse uma enzima e catalise a transferência de um ácido gordo de acil-CoA para diacilglicerol, para a produção de triacilglicerol (TAG), em que a referida enzima compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2. Lisboa,