EP1131438A1 - Gene codant pour une acyltransferase de colza, et ses utilisations - Google Patents
Gene codant pour une acyltransferase de colza, et ses utilisationsInfo
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Abstract
L'invention concerne une séquence d'acide nucléique codant pour une acyltransférase lysophosphatidique de colza. Cette séquence est utilisable notamment pour la transformation de végétaux, afin de réguler la teneur en acides gras des triglycérides produits par ceux-ci.
Description
GENE CODANT POUR UNE ACYLTRANSFERASE DE COLZA, ET SES UTILISATIONS L'invention est relative à l'identification et au clonage d'un gène codant pour une acyltransférase, et à ses utilisations.
Les glycérolipides (glycolipides, phospholipi- des, et triacylglycérides) constituent chez les végétaux la majeure partie des lipides. Leur précurseur commun est le sn- 1 , 2-diacylglycerol-3-phosphate ou acide phosphati- dique (PA), résultant de l' estérification des positions sn-1 et sn-2 du glycéroi-3-phosphate (G3P) par des acides gras. La sn-glycérol-3-phosphare acyltransférase (GPAT) (E.C 2.3.1.15) catalyse l'acylation de la position sn-1 du G3P pour former le sn-l-acylglycérol-3-phosphate ou acide lysophosphatidique (LPA) . Le LPA est ensuite utilisé comme substrat par la l-acyl-sπ-glycérol-3-phosphate acyltransférase ou acyltransférase lysophosphatidique (LPAAT) (E.C.2.3.1.51) qui acyle la position sn-2 du gly- cérol. Dans la synthèse des triacylglycérides, qui cons- tituent l'essentiel des lipides de réserve, intervient une troisième enzyme, la sn-1 , 2-diacylglycérol acyltransférase ou diacylglycérol acyltransférase (DAGAT) qui catalyse l'acylation de la position sn-3 .
Les lipides végétaux sont utilisés actuelle- ment dans des domaines très variés, de l'alimentation à l'industrie chimique, et il est souhaitable de disposer de plantes produisant des lipides spécifiquement adaptés à l'utilisation envisagée. Dans ce but, on cherche notamment à modifier la composition en acides gras des glycé- rolipides, et en particulier des triacylglycérides.
Par exemple, dans le cas du colza [Brassica napus) , on utilise pour l'huile alimentaire, les plantes ayant la teneur la plus faible possible en acide érucique. En revanche, on recherche une teneur élevée en acide érucique chez les plantes produisant des huiles destinées à l'utilisation industrielle.
La composition des glycérolipides en acides gras dépend essentiellement, d'une part de la répartition quantitative et qualitative des acides gras produits par la plante, et d'autre part de la spécificité de substrat des acyltransférases vis-à-vis de ces acides gras. Pour contrôler cette composition, il a été proposé d'agir séparément ou conjointement sur ces deux facteurs, en intervenant :
- au niveau de la biosynthèse des acides gras, pour favoriser ou au contraire inhiber la production d'un ou plusieurs acides gras spécifiques, et éventuellement pour induire la synthèse de nouveaux acides gras ;
- au niveau de l'acylation du G3P, pour modifier sa spécificité dans le sens souhaité. Dans le cas du colza, les variétés les plus riches en acide érucique actuellement disponibles produisent une huile dans laquelle l'acide érucique représente au plus 50 à 60% des acides gras totaux. L'analyse des triacylglycérides des graines issues de ces variétés a montré que cet acide est présent quasi exclusivement aux positions sn-1 et sn-3 ; cette répartition sélective a été attribuée à la spécificité de substrat de la LPAAT de colza, qui exclurait les acides gras à très longue chaîne (>C20) ; ceci limite la teneur en acide érucique des triacylglycérides de graines de colza à un seuil théorique maximal de 66% des acides gras totaux.
Dans le but de s'affranchir de cette limitation, le gène d'une LPAAT de Limnanthes alba capable d'incorporer l'acide érucique en position sn-2 a été ex- primé dans les graines d'une variété de colza à taux élevé en acide érucique. Cependant, bien qu'une incorporation d'acide érucique en position sn-2 ait effectivement été observée dans les triacylglycérides des graines de ce colza transgénique, cette incorporation est restée fai- ble ; en outre, la quantité totale d'acide érucique incorporée dans ces triacylglycérides n' était pas supé-
rieure a celle des plantes témoin non transformées [LASSNER et al., Plant Physiol. 109:1389-1394,(1995)].
Ce résultat pourrait s'expliquer, en dehors de l'éventualité d'une production limitante d'acide eruci- que, par une faible spécificité de la LPPAT exogène de Limnan tnes , qui, outre l'acide érucique, pourrait également incorporer de l'acide oleique, et également par l'existence d'une compétition entre l'activité LPAAT exogène et une activité LPAAT endogène du colza, qu'il se- rait nécessaire d' inhiber pour augmenter l'incorporation d' aciαe érucique.
Jusqu'à présent, on ne disposait que de peu d'informations sur l'enzyme ou les enzymes responsable (s ) de l'activité LPAAT chez le colza. Les LPAAT sont en ef- fet des enzymes membranaires, difficiles a purifier sous forme active.
A l'exception de la LPAAT de noix de coco [KNUTZON et al., Plant Physiol. 109:999-1006, (1995)], qui a ete purifiée a partir des membranes de l'albumen, et dont le gène a ete ultérieurement isole par criblage d'une banque d'ADNc, les LPAAT végétales delà identifiées ont pour la plupart ete caractérisées par des techniques αe génétique moléculaire. Il s'agit αe la LPAAT de mais [BROWN et al., Plant Mol Biol., 26:211-223, (1994)], des LPAAT de Limnanthes [BROWN et al., Plant Mol. Biol., 29:267-278,. (1995) ; HANKE et al., Eur. J. Biochem. 232:806-810, (1995) ] .
Afin de permettre l'amélioration du contrôle de l'acylation en position sn-2, les Inventeurs ont en- trepris de caractériser la ou les enzymes impliquée (s) dans l'activité LPAAT chez le colza.
Ils sont ainsi parvenus a isoler une séquence d'ADN de Brassica napus codant pour une LPAAT plastidiale fonctionnelle ; cette LPAAT sera dénommée ci-apres BAT2 (Brassica Acyl-Transferase 2) .
Une séquence d'acide nucléique comprenant la séquence codant pour BAT2 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, et la séquence polypeptidique déduite est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2.
2 codons ATG pouvant constituer des sites potentiels d' initiation de la traduction sont présents sur la séquence SEQ ID .NO : 1 ; le polypeptide de 344 acides aminés débutant au résidu méthionine en position 16 de la séquence SEQ ID NO : 2 est suffisant pour l'activité LPAAT.
L'analyse de la séquence en acides aminés de BAT2 par le logiciel pSORT suggère la présence d'une séquence signal comprise dans les 95 acides aminés N- terminaux de la séquence SEQ ID NO: 2. Cette séquence signal est impliquée dans l'adressage de la LPPAT BAT2 dans la membrane plastidiale.
La séquence de la protéine mature active est comprise dans les 279 acides aminés C-terminaux. La comparaison, à l'aide du logiciel BLASTX2
[GISH et al., Nat. Genêt., 31:266-272, (1994)] entre la séquence peptidique de BAT2, et les séquences peptidiques de LPAAT précédemment connues, fait apparaître une très faible homologie (au maximum 20% d'identité) lorsque la comparaison est effectuée sur l'ensemble de la séquence.
Sur certaines régions de la séquence, on observe une homologie plus importante. La figure 1 représente l'alignement de la séquence 187-302 de BAT2 avec les séquences des LPAAT présentant la plus forte homolo- gie. Les scores les plus importants sont observés avec :
- le produit du gène 5LC1 de S . cerevisiae (P33333) [NAGIAC et al. J. Biol. Chertw, 268:22145-22163, (1993)] : 32% d'identité et 51% d'équivalence, sur un alignement de 204 acides aminés ; - la LPAAT microsomale des graines de Limnan- thes (Q42870) [HANKE et al., Eur. J. Biochem. , 232:806-810,
(1995) ; LASSNER et al., Plant Physiol. 109:1389-1394, (1995) ; BROWN et al., Plant Mol. Biol., 29:267- 278,. (1995)] : 30% d'identité et 54% d'équivalence, sur un alignement de 182 acides aminés ; - la LPAAT d' endosperme de noix de coco
(Q42670) [KNUTZON et al., Plant Physiol. 109:999-1006, (1995)] : 31% d'identité et 47% d'équivalence, sur un alignement de 229 acides aminés ; la LPAAT hypothétique de Synechocystis, (P74498) : 30% d'identité et 55% d'équivalence, sur un alignement de 143 acides aminés ;
- la protéine plsC de E . Coli (P26647) : 31% d'identité et 50% d'équivalence, sur un alignement de 115 acides aminés. La présente invention a pour objet un fragment d'acide nucléique comprenant : a) une séquence codant pour une LPAAT végétale dont la séquence peptidique présente au moins 20%, de préférence au moins 30% et avantageusement au moins 50 à 95% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 ; et/ou b) une séquence complémentaire de la séquence codante a) ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ladite séquence codante code pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO: 2.
L' invention englobe également des fragments de plus de 20pb, et de préférence de plus de 30pb, d'une séquence codante telle que définie ci-dessus, ou capables de s'hybrider spécifiquement en conditions stringentes, avec ladite séquence. Ceci inclut en particulier les fragments de toute séquence codant pour le polypeptide SEQ ID NO: 2, ou de sa séquence complémentaire, à l'exception des fragments constitués par un oligonucléo- tide codant pour l'une des séquences peptidiques suivan- tes (code 1 lettre) :
FPEGTRS ;
PFKKGA ; qui sont communes à des LPAATs de séquences antérieurement connues, ou des fragments complémentaires dudit oligonucléotide . Des fragments d'acide nucléique conformes à
1 ' invention peuvent en particulier être utilisés comme amorces et/ou sondes, pour détecter et cloner des séquences codant pour des LPAATs plastidiales, de colza ou d'autres végétaux, ainsi que des séquences codant pour des LPAATs de colza ou d'autres espèces, notamment de crucifères, exprimées dans des compartiments cellulaires autres que les plastes, en particulier le réticulum endo- plasmique .
Les analyses effectuées par transfert de Sou- thern et par RFLP, en utilisant comme sonde d'hybridation en conditions stringentes l'ADNc de BAT2, marqué au 32p. montrent la présence dans le génome du colza, ainsi que dans le génome d' A. thaliana , d'au moins 2 exemplaires homologues du gène BAT2 , et permettent de supposer que ce gène fait partie d'une famille multigenique comprenant 4 membres .
La présente invention a également pour objet : les vecteurs recombinants résultant de l'insertion d'au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention, dans un vecteur approprié ; avantageusement, il s'agit de vecteurs d'expression dans lesquels le fragment d'acide nucléique conforme à l'invention est inséré sous contrôle transcriptionnel de séquences de régulation (telles que promoteur et/ou termina- teur) fonctionnelles dans une cellule-hôte dans laquelle on souhaite exprimer ledit fragment .
- les cellules-hôtes, procaryotes ou eucaryo- tes, et les organismes pluricellulaires, en particulier des cellules végétales et des végétaux, transformés par au moins un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention.
L'invention englobe également la LPAAT recombinante ou les fragments de LPAAT recombinante, résultant de l'expression dans une cellule-hôte, de la séquence codant pour ladite LPAAT ou ledit fragment, portée par un fragment d'acide nucléique conforme à l'invention. La LPAAT recombinante conforme a l'invention, ou ses fragments, peuvent par exemple être utilises pour produire des anticorps anti-LPAAT, permettant le criblage de banques d'expression d'ADNc dans le cadre de la détection et du clonage d'autres LPAATs.
Des ragments d' acide nucléique conformes à l'invention peuvent avantageusement être utilisés, en orientation sens ou antisens, pour produire des plantes transgéniques, notamment à partir de colza ou d'autres plantes oléagineuses, afin de réguler l'activité LPAAT chez la plante ainsi transformée, et agir sur la composition en acides gras des lipides, et en particulier des triacylglycérides, produits par cette plante.
La présente invention englobe également les plantes transgéniques produites de la sorte.
Ces plantes peuvent être obtenues par les techniques habituelles, connues en elles-mêmes, de trans- genese végétale. Selon l'utilisation envisagée, une séquence d' aciαe nucléique conforme a l'invention peut être placée sous contrôle d'un promoteur mductible ou d'un promoteur constitutif, d'un promoteur ubiquitaire, ou d'un promoteur tissu-spécifîque . Ces plantes peuvent également contenir d'autres transgènes, préférentiellement des transgènes dérives de gènes impliques dans la biosyn- thèse des lipides.
On peut en particulier obtenir : des plantes transgéniques, exprimant au moins une séquence conforme à l'invention codant pour une LPAAT fonctionnelle, en lieu et place d'une ou plusieurs séquences codant des LPAAT endogènes, ou en supplément de celles-ci ;
- des plantes transgéniques exprimant au moins une séquence conforme à l'invention en orientation antisens, afin d'inhiber l'expression des LPAAT endogènes homologues, et favoriser ainsi l'activité d'autres LPAATs, d'origine endogène ou exogène.
Par exemple :
- pour produire des colzas transgéniques à teneur élevée en acide érucique, on peut co-transformer le colza avec d'une part une séquence d'ADN codant pour une LPAAT incorporant preferentiellement l'acide érucique en position sn-2 , telle que la LPAAT de Limnanthβs alba [LASSNER et al., (1995), publication précitée], et d' autre part une séquence d' cide nucléique conforme à l'invention en orientation antisens, afin d'inhiber au moins en partie, la production de LPAAT endogène entrant en compétition avec l'activité de la LPAAT exogène de Limnant es ;
- pour augmenter la teneur globale des graines en triglycérides, on peut transformer le colza avec une séquence d'ADN conforme à l'invention, codant pour une LPAAT plastidiale délétée de sa séquence d'adressage dans les plastes ;
- pour augmenter la teneur en acides gras saturés, en particulier en acide palmitique, on peut co- transformer le colza avec une séquence d'ADN conforme à l'invention, codant pour une LPAAT plastidiale délétée de sa séquence d'adressage dans les chloroplastes, et avec un ou plusieurs gènes d' ACP-thioestérases utilisant preferentiellement des palmitoyl-ACP comme substrats. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'identification, et le clonage d'un gène codant pour la LPAAT BAT2 de Brassica naous .
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE L'ADNc D'UNE LPAAT DE COLZA
Pour rechercher la présence de gènes codant pour des LPAAT, une banque d'ADNc d'embryons immatures de colza a été criblée par complémentation hétérologue de la mutation du gène plsC de la souche JC201 d 'E. Coll [COLEMAN, J. Biol. Chem. , 265:17215-17221, (1990)]. Cette mutation ponctuelle - confère aux mutants JC201 un phéno- type thermosensible, du fait de l' inactivation à tempéra- ture élevée de la LPAAT codée par le gène plsC. Ces mutants poussent bien à 30°C, difficilement à 37°C et pas du tout à 42-44°C.
Pour le criblage, une banque de phagemides dérivée de 2 x 106 clones prélevés sur une banque d'ADNc d'embryons immatures de colza clones dans le vecteur lambda ZAPII (STRATAGENE) , a été construite en utilisant le kit « ExAssist » (STRATAGENE) .
Les bactéries sont transformées par électropo- ration avec ces phagemides, puis cultivées sur LB agar, en présence d' ampicilline et d' IPTG (isopropyl-β-D- galactothiopyranoside) . Les bactéries qui poussent à 42°C sont sélectionnées. L'ADN plasmidique des clones capables de pousser à 42°C a été analysé par PCR, pour déterminer la taille de l' insert. Après 3 cycles de transformation suivie de sélection, environ 85% des clones contiennent un insert de 1,2 kb environ. Le séquencage des extrémités des inserts de 4 de ces clones montre qu' ils sont identiques . L'un de ces clones, dénommé pBAT2, a été entièrement séquence. EXEMPLE 2 : SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE DE BAT2 ET SEQUENCE PEPTIDIQUE DEDUITE.
L'ADNc du clone pBAT2 comprend une séquence de
1155pb suivie d'une queue poly(A) de 18 résidus. Cette séquence comprend une phase unique de lecture ouverte, correspondant à un polypeptide de 351 acides aminés, qui représente une protéine de fusion, comprenant 344 acides
aminés de la séquence de pBAT2, et une partie de la séquence de la β-galactosidase du vecteur de clonage. La séquence qui est représentée sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 1, comprend en outre une partie de la séquence genomique (nucleotides 1 à 79 de la séquence SEQ ID NO : 1) située en amont de la séquence d'ADNc de pBAT2.
2 codons ATG pouvant constituer des sites potentiels d' initiation de la traduction ont été localisé sur la séquence SEQ ID NO: 1 ; si le premier d'entre eux (position 58 de la séquence SEQ ID NO: 1) est utilisé, le produit de traduction de la séquence SEQ ID NO: 1 est un polypeptide de 359 acides aminés, dont le poids moléculaire et le pi théoriques sont respectivement de 39,6 kDa, et d'environ 9,8 ; ce polypeptide est représenté sur la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 2. Si l'initiation de la traduction s'effectue au niveau du 2ème codon ATG (position 103 de la séquence SEQ ID NO: 1), le produit de traduction est un polypep- tide de 344 acides aminés, dont le poids moléculaire théorique est d'environ 37,9 kDa.
L'analyse de la séquence en acides aminés de BAT2 par le logiciel pSORT suggère la présence d'un pep- tide signal d'environ 80 à 95 résidus. Cette séquence si- gnal potentielle est riche en serine, en alanine, en va- line, et en acides aminés basiques, ce qui est caractéristique des séquences d'adressage vers la membrane des chloroplastes .
L'analyse de la séquence polypeptidique indi- que également la présence de deux domaines transmembra- naires potentiels, respectivement situés entre les acides aminés 124 à 140, et 219 à 235.
Les séquences consensus des LPAAT (FPEGTRS et PFKKGA) , sont respectivement situées aux positions 273- 279 et 286-291 de la séquence SEQ ID NO: 2 ; une séquence correspondant à la séquence consensus NHXXXXD, qui est
conservée chez toutes les acyltransférases membranaires connues jusqu'à présent, est localisée aux positions 202- 208 de la séquence SEQ ID NO: 2.
EXEMPLE 3 : ACTIVITE ENZYMATIQUE DE LA PROTEINE CODEE PAR L' INSERT D'ADNC DE pBAT2
Pour vérifier que la protéine codée par
1' insert de pBAT2 possédait effectivement une activité
LPAAT, la capacité de cette protéine à incorporer l'acide oléique ou de l'acide palmitique en position sn-2 du LPA, a été testée.
La souche E . col i JC201 transformée avec pBAT2, et à titre de témoins, la souche E . col i JC201 non-transformée, ou transformée avec le vecteur (pBSK) dépourvu de l' insert d'ADNc de BAT2 , sont mises en culture à 30°C jusqu'à une densité optique de 0,5.
Après induction par l'IPTG, et culture pendant
3 h à 30°C, les bactéries sont lysées et fractionnées et l'activité spécifique LPAAT est mesurée, sur les extraits membranaires bruts, en présence d' oléoyl-CoA ( 1-1 C) ou de palmitoyl-CoA(l-14C) , selon le protocole de CAO et al.
[Plant Physiol., 9:1199-1206, (1990)] .
Les résultats sont illustrés par le tableau I ci-dessous, qui indique l'activité spécifique, en pmol d'acide phosphatidique formées/mg de protéine/heure. TABLEAU I
Les extraits membranaires de la culture transformée avec pBAT2 présentent une activité LPAAT supérieure à celle des extraits membranaires obtenus à partir de la culture non-transformée, ou transformée avec le vecteur pBSK, ce qui montre que l'activité LPAAT est effectivement restaurée par le produit de traduction de 1' insert de pBAT2.
EXEMPLE 4 : LOCALISATION CELLULAIRE DE BAT2
La localisation plasti ique suggérée par l'analyse de séquence de BAT2 a été vérifiée en testant la capacité de chloroplastes de pois isolés à importer BAT2.
Dans ce but, l'ADNc du clone pBAT2 a été transcrit in vitro , en utilisant l'ARN polymérase T3 ; le transcrit est traduit en système acellulaire de germe de blé, en présence de méthionine marquée au j5S. On obtient ainsi un produit de traduction d'environ 40 kDa. Ce produit est incubé avec des chloroplastes isolés de pois. Après l' incubation, les chloroplastes sont traités à la protéase et fractionnés, selon le protocole décrit par BROCK et al. [Plant Mol. Biol. 23(4), 717, (1993)], et les différentes fractions analysées par electrophorese pour rechercher le produit marqué au 35S.
Les résultats de cette analyse montrent que le produit de traduction de BAT2 est importé dans les chloroplastes de pois, et clivé en une protéine de 32 kDa qui est essentiellement localisée dans la fraction membra- naire, et un peptide signal de 8kDa.
Ces résultats confirment que la protéine BAT2 est bien synthétisée avec un peptide signal dont le rôle est d' importer la protéine dans la membrane des chloro- plastes. Le précurseur a une masse apparente d'environ 40 kDa et le peptide signal d'environ 8 kDa. EXEMPLE 5 : LOCALISATION DE L'EXPRESSION DU GENE BAT2
L'expression du gène BAT2 a été étudiée dans différents organes de B . napus et d'A. t aliana . L'étude a été effectuée par transfert de Northern, en utilisant une sonde correspondant à la séquence codante de BAT2, sur des ARN totaux de tiges, de racines, de feuilles, de fleurs, de graines en cours de développement [28 JAP (jours après pollinisation) ] , et de graines sèches.
Dans chacun des tissus de B . napus et d'A. thaliana testés, on observe l'hybridation de la sonde avec un transcrit d'environ 1,3 kb chez B . napus, et avec un transcrit d'environ 1 kb chez A. thaliana . L'intensité du signal d'hybridation est similaire dans tous les tissus, y compris les tissus non-photosynthétiques contenant des plastes autres que les chloroplastes. L'observation d'une hybridation dans les .graines matures, indique en outre que le messager de BAT2 demeure stable lors de la maturation de la graine.
Claims
REVENDICATIONS
1) Fragment d'acide nucléique comprenant : a) une séquence codant pour une LPAAT végétale dont la séquence peptidique présente au moins 20% d'identité avec la séquence SEQ ID NO: 2 ; et/ou b) une séquence complémentaire de la séquence codante a) ci-dessus.
2) Fragment d'acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite séquence codante code pour le polypeptide de séquence SEQ ID NO : 2.
3) Fragment d'acide nucléique de plus de 20pb, capable de s'hybrider spécifiquement en conditions strin- gentes avec une séquence codante telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 2, à l'exception des fragments constitués par un oligonucleotide codant pour l'une des séquences peptidiques suivantes : FPEGTRS ; PFKKGA ; ou par son complémentaire. 4) Vecteur recombinant contenant un fragment d' acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3.
5) Cellule transformée par au moins un fragment d' acide nucléique selon une quelconque des revendi- cations 1 à 3.
6) Cellule transformée selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale.
7) Plante transgénique transformée par au moins un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3.
8) Utilisation d'un fragment d'acide nucléique selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour réguler l'activité LPAAT chez une plante. 9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ladite plante est le colza.
10) Utilisation selon une quelconque des revendications 8 ou 9, caractérisée en ce que ledit fragment d'acide nucléique est utilisé en orientation antisens . 11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ledit fragment d'acide nucléique est utilisé pour exprimer une LPAAT fonctionnelle.
12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite LPAAT est délétée de sa sé- quence d'adressage dans les plastes.
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