KR102131937B1 - YxaL 단백질 또는 이의 상동 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법 - Google Patents

YxaL 단백질 또는 이의 상동 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 YxaL 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법에 관한 것으로, YxaL 단백질은 재조합 형질전환 세포주에서 대량 및 구성적으로 발현될 수 있으며, 종자의 침지 처리에 적용할 경우, 뿌리의 발달이 개선되고, 뿌리의 성장에 관여하는 식물 유전자들의 발현이 식물의 성장에 유리하게 개선되므로, 식물의 성장 촉진을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

YxaL 단백질 또는 이의 상동 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법{Composition for Promoting Plant Growth containing YxaL Protein or Homologous Protein thereof and Mass Production Method of YxaL Protein}
본 발명은 YxaL 단백질 또는 이의 상동 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법에 관한 것이다.
식물은 다양한 외부 스트레스에 항상 노출되어 있으며, 이러한 스트레스에 의하여 토양으로부터 필요한 물질을 흡수하는 식물 뿌리의 능력 등이 상실된다. 이로 인해 식물은 충분한 비타민, 아미노산, 호르몬 등을 생산하지 못하게 되어, 생육, 발달 및 생산성에 문제가 발생하며, 이를 극복하기 위한 방안으로 식물의 성장에 도움을 주기 위한 식물 성장 촉진제가 개발되고 있다.
현재 사용되는 일반적인 식물 성장 촉진제의 주요 성분으로써, 식물호르몬, 부식산(humic acid), 해초 추출물 등이 사용되고 있으나, 현재 시판되고 있는 식물 성장 촉진제는 다양한 화학물질로 구성되어 있어, 그 효과가 명확하지 않다는 문제점이 존재한다.
한편, Bacillus subtilis 균주에서 DNA 헬리케이즈(helicase) PcrA와 상호작용하는 것으로 보고된 YxaL 단백질은 N-말단에 세포질막 통과를 위한 신호펩티드를 포함한다는 점에서, 세포 외 단백질인 YxaL과 세포 내 헬리케이즈 PcrA 또는 DNA 사이의 상호작용 부위를 예상하는 것은 어려운 문제로 남아있다. 또한, N-말단 신호 펩티드가 제거된 YxaL의 성숙부분은 베타-프로펠러 구조를 형성하는 반복적인 피롤로-퀴놀린퀴논(PQQ) 도메인을 포함할 것으로 예측되나, YxaL의 세포 내 위치 및 기능은 전혀 보고되지 않았다.
이에, 본 발명자들은 식물 성장 촉진제 및 이의 대량생산 방법을 개발하기 위한 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2000-0070495호
본 발명의 하나의 목적은 YxaL 단백질 또는 이의 상동(homologous) 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 DNA 단편; 및 상기 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 발현벡터가 도입된 YxaL 단백질 대량생산용 형질전환 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하여 YxaL 단백질을 과발현하는 단계를 포함하는 YxaL 단백질의 대량생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 YxaL 단백질 또는 이의 상동(homologous) 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서는 식물의 성장을 촉진하기 위해 사용할 수 있는 YxaL 단백질 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법이 제공된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "식물 성장 촉진"은 식물의 성장 및 대사의 개선을 말하며, 예를 들어, 식물의 새로운 성장, 뿌리의 발육 및 세포의 확장이 포함될 수 있다. 본 발명의 YxaL 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 뿌리의 발달을 개선하고, 뿌리의 성장에 관여하는 식물 유전자들의 발현을 식물의 성장에 유리하게 개선할 수 있으므로 식물의 성장 촉진을 위하여 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상동 단백질(homologous protein)"은 동일한 단백질로부터 파생된 단백질로써, 아미노산 배열 및 3차원 구조가 유사한 단백질을 말한다.
본 발명에서, YxaL 단백질 아미노산 서열의 상동성과 베타-프로펠러 모티브의 서열 및 위치를 비교하여, 두 가지 타입의 YxaL1과 YxaL2 공통서열로 구분하였으며, 아미노산 서열 상동성과 보존성이 높은 YxaL 단백질 타입은 표 1과 같이 확인되었다.
타입 아미노산 서열 서열번호
YxaL1
(415 아미노산 잔기)		 MKKKTASLRMKTLAAGAAVAAALSVGAVSDLPGAKWLHPAAAQAAETVFKQNHAASGFLAGRYDAQAMSPTMFNWSRESRFTSTADGALKWEKNVPANPQNGAGAAVDGDGTVFIQSKDGKLTAYHPDGTVKWVTENLGTTYTLTPVLGTNGVIYLPSHDKKLYFIDKETGNILTSVPLSGAPSSDAAIGSDGTLYVSTLDNYIYAIKPTSPSTWTQKWKFKTNGVVGSAPVLASNGTLYTATYNNIFYAINSGTGQVKWSKTTSNGFKGYPVIDRDGTVYAGNQDGNLYAYTSTGAVKWTFPLNGFSSSSLAIDHNGNVYIGSGSGELFSISKTGNMNWSFYTDGPVRTAPLIDADGNVYFGSDDKNVYAVDADGNEKWRYQTDSNVISSPVLAEDGTLYVGTYTKLLAFGAKK 서열번호 1
YxaL2
(394 아미노산 잔기)		 MKALIAGAAVAAAVSAGAVSDVPAAKVLQPAAAYAAETVFSQNNEASGFLTGRYDVQAMAPAMFNWSRESRFAGNTDGTLKWQNDIRTTPQNGAGAVIDGDGTVYLHSRDGEMKAFNPDGSVKWVTGNLGKTFTQSPVLGTNGVIYLASYDKKIYFIDKETGEILTTVPLSGGPSSETVIGSDGTLYFSTLDNYVHAIKPTSKSTWTERWKLKTNGVVSSVPVLAKNGTVYVGTYNNVFYAINSGTGQVKWSRTTSNAFKGYPVIDKDGTVYAGNQDGQLYAYTSTGSLKWTFPLNGFSSSSPAIDHNGNIYIGSGSGELFSISKNGDMNWSFYTDGPVRTAPLIDAKGTVYFGSDDMKVYAADANGNELWSYQTDSNVVSSPQLAEDGTLYIG 서열번호 2
한편, YxaL 타입 단백질들에 포함된 베타-프로펠러 및 모티브의 서열 및 위치(표 2)는 표 3과 같이 확인되었다.
구분 아미노산 서열 서열번호
PQQ 베타프로펠러 AXDXXTGDXXW 서열번호 3
모티브 --N----E--- -
-------K--- -
타입 모티브 아미노산 서열 YxaL 타입 아미노산 서열 중 위치 서열번호
YxaL1 YxaL1-1 FTSTADGALKW 81-91 서열번호 4
YxaL1-2 TAYHPDGTVKW 123-133 서열번호 5
YxaL1-3 FIDKETGNILT 165-175 서열번호 6
YxaL1-4 PTSPSTWTQKW 209-219 서열번호 7
YxaL1-5 AINSGTGQVKW 250-260 서열번호 8
YxaL1-6 YAYTSTGAVKW 290-300 서열번호 9
YxaL1-7 FSISKTGNMNW 330-340 서열번호 10
YxaL1-8 YAVDADGNEKW 370-380 서열번호 11
YxaL2 YxaL2-1 FAGNTDGTLKW 72-82 서열번호 12
YxaL2-2 KAFNPDGSVKW 114-124 서열번호 13
YxaL2-3 FIDKETGEILT 156-166 서열번호 14
YxaL2-4 PTSKSTWTERW 200-210 서열번호 15
YxaL2-5 AINSGTGQVKW 241-251 서열번호 16
YxaL2-6 YAYTSTGSLKW 281-291 서열번호 17
YxaL2-7 YAYTSTGSLKW 321-331 서열번호 18
YxaL2-8 YAADANGNELW 361-371 서열번호 19
YxaL 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 높고 동일한 베타-프로펠러 모티브들을 포함한 YxaL1 타입의 단백질이 Mycobacteroides abscessus subsp. massiliense BamB(NCBI accession no. SLA98061.1)로 명명되어 있으므로, YxaL 상동 단백질의 명칭과 유래한 세균의 종의 이름은 다르게 명시될 수 있다.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 YxaL 단백질 외에 식물 성장 촉진 활성을 나타내는 공지된 하나 이상의 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 식물의 종류 및 식물의 발달 정도에 따라 식물에 처리하는 양 및 기간을 달리하여 처리될 수 있다. 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 종자의 침지시 침지액에 첨가되어 사용될 수 있는데, 종자의 침지액에 첨가되어 사용될 경우, 0.01 내지 100㎎/ℓ의 농도로 첨가될 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 10㎎/ℓ의 농도로 첨가될 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5㎎/ℓ의 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물을 식물체의 유묘, 잎, 뿌리 또는 뿌리 주변의 흙에 살포하는 경우, 상기 살포는 식물체에 비료 또는 농약을 살포하기 전 또는 후에, 또는 비료 또는 농약과 함께, 또는 각각 처리될 수 있다. 상기 비료는 식물 재배 시 통상적으로 사용하는 무기질 또는 유기질 비료일 수 있으며, 예를 들어, 질소, 인산, 칼륨, 무기물 및/또는 미량원소가 포함된 것일 수 있다. 상기 무기물은 칼슘, 마그네슘, 황, 철 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 상기 미량원소는 망간, 구리, 아연, 붕소, 몰리브덴 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 농약은 식물 재배 시 통상적으로 사용하는 살균제, 살충제 및/또는 제초제일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단백질은 Bacillus velezensis 균주 유래일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Bacillus velezensis 균주는 토양 및 식물과 관련된 Bacillus amyloliequefaciens-siamensis-velezensis 그룹에 속하는 균주인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Bacillus velezensis 균주는 GH1-13 계통일 수 있다.
Bacillus velezensis GH1-13 균주 유래의 YxaL 단백질의 식물 성장 촉진 효과가 본 명세서에서 구체적으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물에 포함되는 YxaL 단백질은 Bacillus velezensis GH1-13 균주 유래인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 단백질은 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 20의 아미노산은 Bacillus velezensis GH1-13 균주에서 유래한 것으로써, 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 중, 세포막 신호 서열인 1-44번 아미노산을 제외한 45-415번의 아미노산 잔이로 이루어진 단백질이다(표 4).
구분 아미노산 서열 서열번호
Bacillus velezensis GH1-13 균주 유래 성숙 YxaL 아미노산 서열 MKKKTASLRMKTLAAGAAVAAALSVGAVSDLPGAKWLHPAAAQAAETVFKQNHAASGFLAGRYDAQAMSPTMFNWSRESRFTSTADGALKWEKNVPATPQNGAGAAVDGDGTVFIQSKDGKLTAYHPDGTVKWVTENLGTTYTLTPVLGTNGVIYLPSHDKKLYFIDKETGNILTSVPLSGAPSSDAAIGSDGTLYVSTLDNYIYAIKPTSPSTWTQKWKFKTNGVVGSAPVLASNGTLYTATYNNIFYAINSGTGQVKWSKTTSNGFKGYPVIDRDGTVYAGNQDGNLYAYTSTGAVKWTFPLNGFSSSSLAIDHNGNVYIGSGSGELFSISKTGNMNWSFYTDGPVRTAPLIDADGNVYFGSDDKNVYAVDADGNEKWRYQTDSNVISSPVLAEDGTLYVGTYTKLLAFGAKK 서열번호 20
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 상동 단백질은 서열번호 4 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
YxaL 단백질에 대한 상동 단백질에 있어서, 베타-프로펠러 모티브인 서열번호 4 내지 19의 아미노산 서열을 포함하는 상동 단백질은 YxaL 단백질과 같은 식물 성장 촉진 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 식물은 애기장대 또는 벼일 수 있다.
본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물에 포함된 YxaL 단백질의 애기장대 및 벼의 뿌리 발달 촉진효과 및 뿌리의 성장에 관여하는 식물 유전자들의 발현 개선효과가 본 명세서에서 구체적으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 식물 성장 촉진용 조성물은 식물, 예를 들어, 애기장대 및 벼의 성장 촉진을 위하여 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 DNA 단편; 및 상기 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 YxaL 단백질을 코딩하는 유전자, 구체적으로, 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 DNA 단편을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현벡터가 예를 들어, 대장균에 형질전환될 경우, yxaL 유전자의 구성적 발현을 유도할 수 있으므로, YxaL 단백질의 대량생산에 본 발명의 제조합 발현벡터가 유용하게 활용될 수 있다.
YxaL(45-415 아미노산 잔기) 유전자 염기서열을 PCR 증폭하고 클론닝하기 위하여, 서열번호 21 및 22의 프라이머 서열(표 5)을 사용할 수 있으며, 이를 가공하여 사용할 수 있다(서열번호 23 및 24).
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
YxaL forward GCGGAAACGGTATTTAAACAAAAT 서열번호 21
reverse TTATTTTTTTGCCCCGAATGCGA 서열번호 22
본 발명에서 사용되는 용어, "재조합 발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제원점(replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열(terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열(pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter(예를 들어, 인간 또는 마우스 CMV immediate-early 프로모터), U6 프로모터, EF1-alpha(elongation factor 1-a) 프로모터, EF1-alpha short(EFS) 프로모터, SV40 프로모터, 아데노바이러스 프로모터(major late promoter), pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, HSV의 tk 프로모터, SV40E1 프로모터, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory syncytial virus; RSV) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터(metallothionin promoter), β-액틴 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터, 인간 IL-2(human interleukin-2) 유전자 프로모터, 인간 림포톡신(human lymphotoxin) 유전자 프로모터 및 인간 GM-CSF(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 재조합 발현벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 사용되는 플라스미드(예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등), 파지(예를 들어, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, M13 등) 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 등) 등을 기본으로 하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 발현벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 Bacillus velezensis 균주는 GH1-13 계통일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 DNA 단편; 및 상기 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된 YxaL 단백질 대량생산용 형질전환 세포주를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환 세포주를 제조하기 위하여, 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 당 분야에서 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환 세포주로 사용될 수 있는 세포는 대장균일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양상은 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 DNA 단편; 및 상기 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현벡터로 대장균을 형질전환하여 YxaL 단백질을 과발현하는 단계를 포함하는 YxaL 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.
본 발명의 재조합 발현벡터가 도입된 본 발명의 형질전환 세포주는 재조합 발현벡터에 존재하는 yxaL 유전자의 구성적 발현에 의하여, YxaL 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 생산된 YxaL 단백질은 배지로 용출되므로, 본 발명의 형질전환 세포주의 배양 배지로부터 YxaL 단백질을 정제할 수 있으므로, 대량으로 YxaL 단백질을 생산하는데 유용하게 활용될 수 있다.
YxaL 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물 및 YxaL 단백질의 대량생산 방법에 따르면, YxaL 단백질은 재조합 형질전환 세포주에서 구성적으로 발현되어 배양 배지에서 수득될 수 있으며, 종자의 침지 처리에 적용할 경우, 뿌리의 발달이 개선되고, 뿌리의 성장에 관여하는 식물 유전자들의 발현이 식물의 성장에 유리하게 개선되므로, 식물의 성장 촉진을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 YxaL 상동성 단백질 서열의 계통학적 분석 결과를 나타낸 그림이다. 본 발명에서 사용한 Bacillus velezensis GH1-13 균주를 빨간색 원으로 표시하였다.
도 2는 재조합 단백질 생산 및 Ni NTA 아가로스 컬럼을 사용하여 성숙 YxaL 단백질의 정제를 나타낸 그림이다. (a)는 N-His TEV 절단 부위를 갖는 재조합 YxaL 단백질을 고농도의 이미다졸(50-250mM)로 단계적으로 용리하여 정제한 것을 나타낸 결과이고, (b)는 정제된 YxaL의 단백질의 크기 및 순도를 나타낸 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS PAGE 분석 결과이다.
도 3은 B. velezensis GH1-13 균주의 성장 곡선을 600nm(OD 600)의 광학 밀도로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 B. velezensis GH1-13 균주 배양 상등액에서 YxaL 단백질 위치를 결정하기 위한 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과이다. (a)는 YxaL 단백질이 세포에서 구성적으로 발현되어 세포 밖으로 분비됨을 나타낸 결과이고, (b)는 상등액 내에 1.6시간의 반감기를 갖는 약 100㎍/ℓ의 YxaL 단백질이 생성되었음을 나타낸 결과이다.
도 5는 B. velezensis GH1-13 균주의 각 성장단계 시간(5, 8, 12 및 24시간)에서, 16S rRNA 유전자에 대한 yxaL 유전자의 상대적인 전사 수준을 나타낸 결과이다.
도 6은 침지액에서 다양한 농도의 정제된 YxaL 단백질로 처리된 애기장대 종자의 발아율을 나타낸 그래프이다(각 군에 대해 n > 100).
도 7은 침지액에서 다양한 농도의 정제된 YxaL 단백질로 처리된 애기장대의 1주령 뿌리 길이를 나타낸 그래프이다(각 군에 대해 n > 30).
도 8은 침지액에서 1㎎/ℓ 농도의 정제된 YxaL 단백질로 처리된 애기장대의 1주령 뿌리 구조를 비교한 사진이다.
도 9는 벼 종자의 발달에 YxaL 단백질이 미치는 영향을 나타낸 결과이다. 침지액에서 다양한 농도의 정제된 YxaL 단백질로 처리된 벼의 1주령 뿌리의 (a) 모습을 나타낸 사진, (b) 원뿌리의 길이를 나타낸 그래프, 및 (c) 잔뿌리의 길이를 나타낸 그래프이다.
도 10은 침지액에서 다양한 농도의 정제된 YxaL 단백질로 처리된 애기장대의 1주령 뿌리에서 (a) IAA1, (b) GH3.3, (c) ACS11, 및 (d) AFB4의 상대적 발현 수준(ΔΔCq)을 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. YxaL 단백질의 식물 성장 촉진 효과 분석 방법
1-1. 균주 배양 및 측정
-80℃의 50% 글리세롤에서 보관한 냉동 군체(frozen stock)에서 Bacillus velezensis GH1-13 균주(도 1)를 재생시킨 후, TSB(trypticase soy broth)(BD, Sparks, USA) 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니를 25℃ 및 180rpm의 호기(aeration) 조건으로 TSB에서 배양하고 600nm(OD 600)의 광학 밀도로 균주의 성장을 측정하였다.
1-2. yxaL 유전자의 클로닝 및 단백질 정제
GH1-13 균주의 게놈 DNA를 Wizard® Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, USA)를 사용하여 추출하였다. 성숙 YxaL 단백질(45-415a.a.)을 코딩하는 DNA 단편을 하기 프라이머로 PCR에 의해 증폭시켰다(표 6).
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
YxaL forward GGC CCATGG CGGAAACGGTATTTAAACAAAAT 서열번호 23
reverse GGG CTCGAG TTATTTTTTTGCCCCGAATGCGA 서열번호 24
밑줄친 NcoI 및 XhoI 제한 효소 부위는 TEV 프로테아제 절단 부위에 연결된 N-His 태그를 갖는 pProEX-HTA 플라스미드와 호환가능하다. yxaL 유전자를 클로닝한 후, 생성된 pProEX-YxaL(N-His-TEV) 플라스미드를 대장균 균주 BL21(DE3)에 형질전환시켰으며, 상기 프라이머에 의해 증폭된 DNA 단편의 서열은 표 7과 같이 확인되었다.
구분 염기서열(5'→3') 서열번호
yxaL gene ATGGCGGAAACGGTATTTAAACAAAATCATGCGGCATCCGGTTTCTTGGCGGGACGGTATGACGCGCAGGCGATGTCTCCGACGATGTTCAACTGGTCAAGAGAAAGCCGGTTTACAAGCACTGCCGATGGCGCATTAAAATGGGAAAAGAATGTCCCGGCCACCCCTCAAAACGGTGCGGGAGCCGCGGTTGATGGGGACGGCACCGTATTTATTCAATCAAAAGACGGGAAGCTGACGGCGTATCATCCGGACGGTACTGTGAAATGGGTGACGGAAAACCTCGGGACGACCTATACGCTGACTCCGGTGCTCGGAACAAACGGTGTCATTTATCTTCCTTCTCACGATAAAAAACTATATTTCATCGACAAAGAAACCGGAAACATTTTAACATCGGTTCCGTTGAGCGGAGCGCCTAGTTCCGATGCGGCTATCGGCTCTGACGGCACGCTGTATGTGTCGACGCTGGATAACTATATCTATGCGATTAAACCGACGTCGCCTTCGACATGGACGCAAAAGTGGAAGTTTAAAACAAACGGCGTGGTCGGCTCCGCTCCCGTGTTAGCGTCAAACGGCACGCTGTATACGGCAACGTACAATAATATCTTTTACGCGATCAATTCCGGAACAGGCCAAGTGAAATGGTCAAAAACGACGTCCAACGGGTTTAAAGGCTATCCGGTTATTGATAGAGACGGCACCGTTTACGCCGGAAACCAGGACGGCAATTTATACGCCTATACATCAACGGGTGCTGTAAAGTGGACGTTCCCGTTAAACGGTTTCTCCAGCTCTTCATTAGCGATCGACCATAACGGCAATGTGTATATCGGTTCCGGAAGCGGCGAGCTGTTTTCCATCAGCAAAACCGGCAATATGAACTGGTCTTTCTATACGGACGGGCCTGTGAGAACGGCGCCGCTGATTGATGCGGACGGCAATGTGTACTTCGGTTCTGACGATAAAAATGTCTATGCGGTTGACGCTGACGGTAATGAAAAATGGCGCTATCAAACAGACAGCAATGTCATTTCCTCCCCGGTTCTGGCTGAAGACGGCACGCTCTATGTCGGCACTTATACGAAACTGCTCGCATTCGGGGCAAAAAAATAA 서열번호 25
형질전환은 37℃에서 진탕(200 rpm) 배양한 LB배지에서 지수성장한(탁도 600nm = 0.3) 상기 균주를 얼음으로 30분간 성장을 정지시킨 후에 4℃에서 원심분리(4,000rpm)하여 상층액을 제거한 후, TSS 배지 50㎖에 포함된 조성물(5g PEG8000, 1.5㎖ 1M MgCl2, 2.5㎖ DMSO 및 LB 배지)로 처리하여 얼음에 보관한 화학적 능력세포(competent cell)을 이용하여 수행하였다. yxaL 유전자가 클론닝된 플라스미드 DNA 1㎍을 108개의 콜로니를 형성할 수 있는 능력세포를 포함한 TSS배지 50㎕와 혼합하여 얼음에 30분간 보관한 후에, 41 내지 42℃에서 60초 가량 열 충격(heat shock)을 주고 5분간 얼음에서 안정시킨 후, 37℃로 미리 가열한 SOC 배지(1ℓ에 포함된 조성물: 20g 트립톤(tryptone), 5g 효모 추출물(yeast extract), 0.5g NaCl, 20mM MgCl2 및 20mM 포도당) 1㎖를 혼합하여 37℃에 배양하여 형질전환시켰다. YxaL 유전자 염기서열을 포함한 플라스미드로 형질 전환된 대장균 세포는 엠피실린(100㎎/ℓ)를 첨가한 LB 평판배지에서 자란 콜로니에서 추출한 플라스미드에 삽입된 DNA 염기서열을 분석하여 확인하였다.
형질전환된 세포를 37℃ 및 180rpm의 호기(aeration) 조건으로 100㎎ 암피실린을 함유한 1L의 LB 배지에서 ~0.5의 광학 밀도로 배양할 때, 1시간 동안 0.2mM IPTG를 처리하여 재조합 YxaL 단백질의 과발현을 유도하였다. 세포를 수확하고, 1mM 메르캅토에탄올(mercaptoethanol) 및 프로테아제 칵테일(protease cocktail)(Roche Diagnostics, Indianapolis, USA)로 처리한 후, 얼음물이 담긴 용기상에서 반복 초음파 처리(ultrasonication)하여 파쇄하였다.
단백질 정제는 4℃에서 수행되었다. 21,000×g에서 15분간 원심분리한 후, 상등액을 새로운 용기로 옮기고, 20mM 이미다졸 및 Ni NTA 아가로스(Qiagen, Hilden, Germany)와 혼합한 후, 회전진탕기(rotary shaker)에서 1시간 동안 교반하였다. 단백질-결합된 아가로스를 컬럼에 넣고, 1×PBS(NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g 및 1000㎖ 중 KH2PO4 0.24g, pH7.4) 중 25mM 이미다졸로 세척하고, 100 내지 150mM 이미다졸의 분획으로 YxaL(N-His-TEV) 단백질을 용출하였다.
G25 세파로스 탈염 칼럼(Sepharose desalting column)을 사용하여 버퍼를 1×PBS로 교환하고, 정제된 단백질을 His-tagged TEV 프로테아제와 100 : 1의 비율로 혼합하여, 재조합 단백질의 N-His-TEV 부위를 제거하였다. 이때, 재조합 단백질로부터 N-His-TEV 사이트를 제거하기 위해 TEV 프로테아제(N-His)로 분해하는 과정에서, Ni NTA 친화성 크로마토그래피를 반복적으로 수행하여 YxaL 단백질을 정제하였다.
1-3. 정제된 YxaL 단백질의 크기 및 순도 분석
정제된 단백질의 크기 및 순도는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 및 SDS PAGE 분석을 수행하여 분석하였다.
구체적으로, 크기 배제 크로마토그래피는 Ni-NTA 컬럼으로 정제한 단백질 농축액 2㎎을 GE Healthcare Life 사에서 제조한 SuperdexTM 200 컬럼에 주입하여 1×PBS 용액으로 분당 0.5㎖ 속도로 분리하면서 단백질 흡광도(280nm)를 측정하였고 매분(0.5㎖) 분획물들을 수집하여 수행하였다.
한편, 단백질 흡광도(280nm)를 보이는 분획물들의 일부(10㎕)를 5% 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)를 첨가한 Laemmli 완충액(소량의 bromophenol blue 지시약을 포함한 2% SDS, 10% glycerol, 25mM Tris/HCl 및 pH 6.8)과 동일한 양으로 혼합하여 95℃에서 15분간 가열하여 불활성화시킨 후에, Laemmli가 개발한 SDS PAGE방법에 따라 10% 아크릴아미드 겔을 조성하여 분석하였다.
1-4. 웨스턴 블롯팅
정제된 anti-YxaL IgG를 1차 항체(1 : 20,000로 희석)로 사용하고, HRP(horseradish peroxidase) 접합체(Abcam, Cambridge, UK) 및 웨스턴 블롯팅 검출 키트(Advansta, Menlo Park, USA)와 2차 chicken anti-rabbit IgG 항체를 사용하여 1차 항체를 검출하였다. Chemiluminescent 이미지는 ChemiDoc XRS 이미지 분석기(Biod-Rad, Hercules, USA)로 획득하였고, Molecular Dynamics ImageQuant 소프트웨어 버전 5.2(GE Healthcare Life Sciences)로 처리하였다.
1-5. 유전자 발현 분석
QuantiTect® Reverse Transcription Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 cDNA를 합성하고 Roche LightCycler® Nano 기기와 Qiagen QuantiTect® SYBR® Green PCR Kit를 사용하여 정량적 PCR(quantitative PCR: qPCR)을 수행하였다. 사용된 qPCR 프라이머는 표 8과 같다. 상대적 유전자 발현은 16S 및 18S rRNA 수준으로 qPCR 데이터를 표준화한 후, ΔΔCq 방법으로 계산되었다.
구분 프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
Bacillus velezensis strain GH1-13 yxaL forward GTTTCTTGGCGGGACGGT 서열번호 26
reverse AGCACCGGAGTCAGCGTA 서열번호 27
16S rRNA forward CCTACGGGAGGCAGCAGTAG 서열번호 28
reverse CAACAGAGCTTTACGATCCGAAA 서열번호 29
Arabidopsis Arabidopsis thaliana GH3.3 forward TCGGATAAAACCGATGAAGC 서열번호 30
reverse TCAACGACTCCTCCATTTCC 서열번호 31
IAA1 forward GGAAGTCACCAATGGGCTTA 서열번호 32
reverse GAGATATGGAGCTCCGTCCA 서열번호 33
AFB4 forward AATCGAGGACGAAGAAGCAA 서열번호 34
reverse TCTGCATTTCCACCATTTCA 서열번호 35
ACS11 forward CCCACTTGGAACCTCTACCA 서열번호 36
reverse ATCAAGCCAACACGAAATCC 서열번호 37
18S rRNA forward GCGTTTGAGAGGATGTGGCGGGGAAT 서열번호 38
reverse TAAATGCGTCCCTTCCATAAGTCGGG 서열번호 39
1-6. 식물 종자 처리 및 발아율 분석
애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 벼(Oryza sativa) 종자를 2% 하이포아염소산염(hypochloride) 및 0.05% Triton-X로 10분간 실온(25℃)에서 소독하고 멸균수로 여러 번 세척한 후, 침지액(soaking solution) 중 실시예 1-2에서 정제된 YxaL 단백질을 0 내지 100㎎/ℓ 범위의 농도로 준비하여, 실온에서 2시간 동안 처리하였다.
처리된 종자를 0.5% MS 배지 중 1% 수크로스 및 0.05% MES 버퍼(pH 5.7)가 첨가된 0.5% NuSieve GTG 아가로스(FMC Bioproduct, Rockland, USA) 플레이트에 플레이팅하고, 옥신(Indole-3-acetic acid)(Sigma, St Louis, USA)을 최종 농도 0.5μM로 첨가하거나 첨가하지 않았다.
애기장대 및 벼 종자의 발아율은 플래이팅 후 2일째에 현미경으로 발아된 종자를 계수하여 평가하였다
1-7. 통계분석
적어도 3회의 독립적으로 수행된 실험에 대한 데이터의 통계 분석은 Student's t-test 및 ANOVA 분석에 의하여 수행되었다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
실시예 2. B. velezensis GH1-13 균주 유래 YxaL 단백질 확인
실시예 1-2를 수행하여 YxaL 단백질 25㎎을 높은 수율로 수득하였다. 수득한 B. velezensis GH1-13 균주 유래 단백질이 YxaL 단백질이 맞는지 확인하기 위하여, 실시예 1-3을 수행하였다.
그 결과, 실시예 1-2에 의해 수득된 단백질은 39,784의 분자량을 갖는 단량체 단백질임을 확인하였다(도 2). 또한, YxaL 유전자 재조합 대장균 시스템에서 과발현하여 Ni NTA 컬럼과 TEV 단백질 분해효소를 이용하여 정제한, 상기 단백질의 아미노산 서열은 Bacillus velezensis GH1-13 균주에서 유래한 성숙한 YxaL 단백질의 아미노산 서열(45-415 아미노산 잔기; 서열번호 20)과 동일함을 확인하였다.
실시예 3. B. velezensis GH1-13 균주에서 yxaL 유전자의 구성적 발현 확인
B. velezensis GH1-13 균주의 성장 양상을 확인하기 위하여, 실시예 1-1을 수행하였다.
그 결과, B. velezensis GH1-13 균주는 인큐베이션 후, 5시간에서는 초기지수성장기(early-exponential phase), 8시간에서는 후기지수성장기 (late-exponential phase), 12시간에서는 초기정체성장기(early-stationary phase) 및 24시간에서는 정체성장기(stationary)가 나타내는 성장 곡선 형태로 성장함을 확인하였다(도 3).
한편, 위와 같이 확인된 각 시간에서, yxaL 유전자의 구성적 발현(constitutive expression) 및 YxaL 단백질의 존재 위치를 결정하기 위하여, 실시예 1-4 및 1-5를 수행하였다.
SDS PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과, YxaL 단백질이 세포에서 구성적으로 발현되어 세포 밖으로 분비되고(도 4a), 상등액 내에 1.6시간의 반감기를 갖는 약 100㎍/ℓ의 YxaL 단백질이 생성되었음을 확인하였다(도 4b). 또한, 이와 같은 결과는 RT-PCR 데이터(도 5)와도 일치함을 확인하였다.
즉, YxaL은 Fft를 갖는 신호-인식 입자 복합체와 Sec 단백질-분비 경로 사이의 협력에 의하여 세포질 막을 통과해 배지로 분비될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. YxaL 단백질의 식물 뿌리 성장 촉진 효과 확인
YxaL의 식물 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 실시예 1-6을 수행하여 애기장대 및 벼 종자의 발아율을 평가하였다.
그 결과, 배지에 옥신을 첨가하지 않은 경우, YxaL 단백질을 처리한 종자의 발아율과 YxaL 단백질이 처리되지 않은 종자의 발아율은 큰 차이를 보이지 않았으며, 배지에 옥신을 첨가한 경우에도 YxaL 단백질을 처리한 종자의 발아율과 YxaL 단백질이 처리되지 않은 종자의 발아율은 큰 차이를 보이지 않았다. 다만, 옥신이 첨가된 배지는 옥신이 첨가되지 않은 경우보다 발아율이 낮음을 확인하였다(도 6).
한편, 실시예 1-6에서 준비한 애기장대 및 벼 종자를 일주일 동안 배양한 뿌리의 길이 및 상태를 비교하였다.
그 결과, YxaL 단백질이 처리된 종자에서는, 배지의 옥신 첨가 유무에 상관없이 서로 유사한 길이의 뿌리가 형성되었으며, 이러한 뿌리 길이는, YxaL 단백질 미처리 종자의 뿌리 길이보다 유의적으로 긴 것을 확인하였다(도 7). 또한, YxaL 단백질이 처리된 종자에서는 YxaL 단백질이 처리되지 않은 종자에 비하여 곁뿌리(lateral root) 및 뿌리털(hair root)이 크게 증가되었다(도 8). 뿌리의 성장과 발달에 대한 YxaL 단백질의 유사한 효과는 쌀의 종자에서도 확인되었다(도 9).
위와 같은 결과를 통하여, YxaL 단백질은 식물 종자의 발아율에 영향을 미치지 않으면서, 식물 뿌리의 성장을 촉진할 수 있으며, 침지액 중 YxaL 단백질의 최적 농도는 1㎎/ℓ임을 확인하였다.
실시예 5. YxaL 단백질의 식물 유전자 발현 변화 효과 확인
YxaL 단백질의 식물 유전자 발현 변화 효과 확인하기 위하여, 실시예 1-6에서 준비한 애기장대 종자의 1 주령 뿌리에서 추출한 RNA에 대해, 실시예 1-5를 수행하여 식물 유전자 중, IAA1(auxin-responsive protein), GH3.3(indole-3-acetic acid amino synthetase), ACS11(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase) 및 AFB4(abscisic acid-responsive element binding factor)의 발현 변화를 평가하였다. 상기 식물 유전자들은 종자의 발아 초기 및 이후 단계에서 애기장대의 뿌리에 있는 옥신, 에틸렌 및 ABA(abscisic acid)에 반응한다.
그 결과, 배지의 옥신 첨가 유무에 상관없이, 10 내지 100㎍/ℓ 농도의 YxaL 단백질을 사용하여 종자를 침지할 경우, 애기장대 1 주령 뿌리의 ACS11 발현 수준은 YxaL 단백질 미처리 뿌리 대비 34.5배 증가한 반면, IAA1, GH3.3 및 ABF4의 발현 수준은 YxaL 단백질 미처리 뿌리 대비 감소되었음을 확인하였다(도 10). 다만, 옥신 보충 배지에서 YxaL 단백질 처리 종자를 배양할 경우, IAA1보다 GH3.3 및 AFB4의 억제가 더 강하게 나타났다.
위와 같은 결과를 통하여, YxaL 단백질은 옥신뿐만 아니라 식물 성장 및 발달을 위한 다른 신호 전달 경로에 영향을 주어 식물의 성장을 촉진시킬 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> DAEGU CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for Promoting Plant Growth containing YxaL Protein or Homologous Protein thereof and Mass Production Method of YxaL Protein <130> PN180290 <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Lys Lys Lys Thr Ala Ser Leu Arg Met Lys Thr Leu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Ser Val Gly Ala Val Ser Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Ala Lys Trp Leu His Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Val 35 40 45 Phe Lys Gln Asn His Ala Ala Ser Gly Phe Leu Ala Gly Arg Tyr Asp 50 55 60 Ala Gln Ala Met Ser Pro Thr Met Phe Asn Trp Ser Arg Glu Ser Arg 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ala Asp Gly Ala Leu Lys Trp Glu Lys Asn Val Pro 85 90 95 Ala Asn Pro Gln Asn Gly Ala Gly Ala Ala Val Asp Gly Asp Gly Thr 100 105 110 Val Phe Ile Gln Ser Lys Asp Gly Lys Leu Thr Ala Tyr His Pro Asp 115 120 125 Gly Thr Val Lys Trp Val Thr Glu Asn Leu Gly Thr Thr Tyr Thr Leu 130 135 140 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Gly Val Ile Tyr Leu Pro Ser His Asp 145 150 155 160 Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Asn Ile Leu Thr Ser 165 170 175 Val Pro Leu Ser Gly Ala Pro Ser Ser Asp Ala Ala Ile Gly Ser Asp 180 185 190 Gly Thr Leu Tyr Val Ser Thr Leu Asp Asn Tyr Ile Tyr Ala Ile Lys 195 200 205 Pro Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Gln Lys Trp Lys Phe Lys Thr Asn 210 215 220 Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Val Leu Ala Ser Asn Gly Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Ala Thr Tyr Asn Asn Ile Phe Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly 245 250 255 Gln Val Lys Trp Ser Lys Thr Thr Ser Asn Gly Phe Lys Gly Tyr Pro 260 265 270 Val Ile Asp Arg Asp Gly Thr Val Tyr Ala Gly Asn Gln Asp Gly Asn 275 280 285 Leu Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ala Val Lys Trp Thr Phe Pro Leu 290 295 300 Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ile Asp His Asn Gly Asn Val 305 310 315 320 Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Leu Phe Ser Ile Ser Lys Thr Gly 325 330 335 Asn Met Asn Trp Ser Phe Tyr Thr Asp Gly Pro Val Arg Thr Ala Pro 340 345 350 Leu Ile Asp Ala Asp Gly Asn Val Tyr Phe Gly Ser Asp Asp Lys Asn 355 360 365 Val Tyr Ala Val Asp Ala Asp Gly Asn Glu Lys Trp Arg Tyr Gln Thr 370 375 380 Asp Ser Asn Val Ile Ser Ser Pro Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Leu 385 390 395 400 Tyr Val Gly Thr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Phe Gly Ala Lys Lys 405 410 415 <210> 2 <211> 394 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 2 Met Lys Ala Leu Ile Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Ala Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Ala Val Ser Asp Val Pro Ala Ala Lys Val Leu Gln Pro Ala Ala 20 25 30 Ala Tyr Ala Ala Glu Thr Val Phe Ser Gln Asn Asn Glu Ala Ser Gly 35 40 45 Phe Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Val Gln Ala Met Ala Pro Ala Met Phe 50 55 60 Asn Trp Ser Arg Glu Ser Arg Phe Ala Gly Asn Thr Asp Gly Thr Leu 65 70 75 80 Lys Trp Gln Asn Asp Ile Arg Thr Thr Pro Gln Asn Gly Ala Gly Ala 85 90 95 Val Ile Asp Gly Asp Gly Thr Val Tyr Leu His Ser Arg Asp Gly Glu 100 105 110 Met Lys Ala Phe Asn Pro Asp Gly Ser Val Lys Trp Val Thr Gly Asn 115 120 125 Leu Gly Lys Thr Phe Thr Gln Ser Pro Val Leu Gly Thr Asn Gly Val 130 135 140 Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Asp Lys Lys Ile Tyr Phe Ile Asp Lys Glu 145 150 155 160 Thr Gly Glu Ile Leu Thr Thr Val Pro Leu Ser Gly Gly Pro Ser Ser 165 170 175 Glu Thr Val Ile Gly Ser Asp Gly Thr Leu Tyr Phe Ser Thr Leu Asp 180 185 190 Asn Tyr Val His Ala Ile Lys Pro Thr Ser Lys Ser Thr Trp Thr Glu 195 200 205 Arg Trp Lys Leu Lys Thr Asn Gly Val Val Ser Ser Val Pro Val Leu 210 215 220 Ala Lys Asn Gly Thr Val Tyr Val Gly Thr Tyr Asn Asn Val Phe Tyr 225 230 235 240 Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gln Val Lys Trp Ser Arg Thr Thr Ser 245 250 255 Asn Ala Phe Lys Gly Tyr Pro Val Ile Asp Lys Asp Gly Thr Val Tyr 260 265 270 Ala Gly Asn Gln Asp Gly Gln Leu Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ser 275 280 285 Leu Lys Trp Thr Phe Pro Leu Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ser Pro Ala 290 295 300 Ile Asp His Asn Gly Asn Ile Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Leu 305 310 315 320 Phe Ser Ile Ser Lys Asn Gly Asp Met Asn Trp Ser Phe Tyr Thr Asp 325 330 335 Gly Pro Val Arg Thr Ala Pro Leu Ile Asp Ala Lys Gly Thr Val Tyr 340 345 350 Phe Gly Ser Asp Asp Met Lys Val Tyr Ala Ala Asp Ala Asn Gly Asn 355 360 365 Glu Leu Trp Ser Tyr Gln Thr Asp Ser Asn Val Val Ser Ser Pro Gln 370 375 380 Leu Ala Glu Asp Gly Thr Leu Tyr Ile Gly 385 390 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 3 Ala Xaa Asp Xaa Xaa Thr Gly Asp Xaa Xaa Trp 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 4 Phe Thr Ser Thr Ala Asp Gly Ala Leu Lys Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 5 Thr Ala Tyr His Pro Asp Gly Thr Val Lys Trp 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 6 Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Asn Ile Leu Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 7 Pro Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Gln Lys Trp 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 8 Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gln Val Lys Trp 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 9 Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ala Val Lys Trp 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 10 Phe Ser Ile Ser Lys Thr Gly Asn Met Asn Trp 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 11 Tyr Ala Val Asp Ala Asp Gly Asn Glu Lys Trp 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 12 Phe Ala Gly Asn Thr Asp Gly Thr Leu Lys Trp 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 13 Lys Ala Phe Asn Pro Asp Gly Ser Val Lys Trp 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 14 Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Glu Ile Leu Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 15 Pro Thr Ser Lys Ser Thr Trp Thr Glu Arg Trp 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 16 Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly Gln Val Lys Trp 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 17 Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ser Leu Lys Trp 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 18 Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ser Leu Lys Trp 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 19 Tyr Ala Ala Asp Ala Asn Gly Asn Glu Leu Trp 1 5 10 <210> 20 <211> 415 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 20 Met Lys Lys Lys Thr Ala Ser Leu Arg Met Lys Thr Leu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Ser Val Gly Ala Val Ser Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Ala Lys Trp Leu His Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ala Glu Thr Val 35 40 45 Phe Lys Gln Asn His Ala Ala Ser Gly Phe Leu Ala Gly Arg Tyr Asp 50 55 60 Ala Gln Ala Met Ser Pro Thr Met Phe Asn Trp Ser Arg Glu Ser Arg 65 70 75 80 Phe Thr Ser Thr Ala Asp Gly Ala Leu Lys Trp Glu Lys Asn Val Pro 85 90 95 Ala Thr Pro Gln Asn Gly Ala Gly Ala Ala Val Asp Gly Asp Gly Thr 100 105 110 Val Phe Ile Gln Ser Lys Asp Gly Lys Leu Thr Ala Tyr His Pro Asp 115 120 125 Gly Thr Val Lys Trp Val Thr Glu Asn Leu Gly Thr Thr Tyr Thr Leu 130 135 140 Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Gly Val Ile Tyr Leu Pro Ser His Asp 145 150 155 160 Lys Lys Leu Tyr Phe Ile Asp Lys Glu Thr Gly Asn Ile Leu Thr Ser 165 170 175 Val Pro Leu Ser Gly Ala Pro Ser Ser Asp Ala Ala Ile Gly Ser Asp 180 185 190 Gly Thr Leu Tyr Val Ser Thr Leu Asp Asn Tyr Ile Tyr Ala Ile Lys 195 200 205 Pro Thr Ser Pro Ser Thr Trp Thr Gln Lys Trp Lys Phe Lys Thr Asn 210 215 220 Gly Val Val Gly Ser Ala Pro Val Leu Ala Ser Asn Gly Thr Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Ala Thr Tyr Asn Asn Ile Phe Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Thr Gly 245 250 255 Gln Val Lys Trp Ser Lys Thr Thr Ser Asn Gly Phe Lys Gly Tyr Pro 260 265 270 Val Ile Asp Arg Asp Gly Thr Val Tyr Ala Gly Asn Gln Asp Gly Asn 275 280 285 Leu Tyr Ala Tyr Thr Ser Thr Gly Ala Val Lys Trp Thr Phe Pro Leu 290 295 300 Asn Gly Phe Ser Ser Ser Ser Leu Ala Ile Asp His Asn Gly Asn Val 305 310 315 320 Tyr Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Leu Phe Ser Ile Ser Lys Thr Gly 325 330 335 Asn Met Asn Trp Ser Phe Tyr Thr Asp Gly Pro Val Arg Thr Ala Pro 340 345 350 Leu Ile Asp Ala Asp Gly Asn Val Tyr Phe Gly Ser Asp Asp Lys Asn 355 360 365 Val Tyr Ala Val Asp Ala Asp Gly Asn Glu Lys Trp Arg Tyr Gln Thr 370 375 380 Asp Ser Asn Val Ile Ser Ser Pro Val Leu Ala Glu Asp Gly Thr Leu 385 390 395 400 Tyr Val Gly Thr Tyr Thr Lys Leu Leu Ala Phe Gly Ala Lys Lys 405 410 415 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YxaL_forward <400> 21 gcggaaacgg tatttaaaca aaat 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YxaL_reverse <400> 22 ttattttttt gccccgaatg cga 23 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YxaL(Nco1)_forward <400> 23 ggcccatggc ggaaacggta tttaaacaaa at 32 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YxaL(Xho1)_reverse <400> 24 gggctcgagt tatttttttg ccccgaatgc ga 32 <210> 25 <211> 1119 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 25 atggcggaaa cggtatttaa acaaaatcat gcggcatccg gtttcttggc gggacggtat 60 gacgcgcagg cgatgtctcc gacgatgttc aactggtcaa gagaaagccg gtttacaagc 120 actgccgatg gcgcattaaa atgggaaaag aatgtcccgg ccacccctca aaacggtgcg 180 ggagccgcgg ttgatgggga cggcaccgta tttattcaat caaaagacgg gaagctgacg 240 gcgtatcatc cggacggtac tgtgaaatgg gtgacggaaa acctcgggac gacctatacg 300 ctgactccgg tgctcggaac aaacggtgtc atttatcttc cttctcacga taaaaaacta 360 tatttcatcg acaaagaaac cggaaacatt ttaacatcgg ttccgttgag cggagcgcct 420 agttccgatg cggctatcgg ctctgacggc acgctgtatg tgtcgacgct ggataactat 480 atctatgcga ttaaaccgac gtcgccttcg acatggacgc aaaagtggaa gtttaaaaca 540 aacggcgtgg tcggctccgc tcccgtgtta gcgtcaaacg gcacgctgta tacggcaacg 600 tacaataata tcttttacgc gatcaattcc ggaacaggcc aagtgaaatg gtcaaaaacg 660 acgtccaacg ggtttaaagg ctatccggtt attgatagag acggcaccgt ttacgccgga 720 aaccaggacg gcaatttata cgcctataca tcaacgggtg ctgtaaagtg gacgttcccg 780 ttaaacggtt tctccagctc ttcattagcg atcgaccata acggcaatgt gtatatcggt 840 tccggaagcg gcgagctgtt ttccatcagc aaaaccggca atatgaactg gtctttctat 900 acggacgggc ctgtgagaac ggcgccgctg attgatgcgg acggcaatgt gtacttcggt 960 tctgacgata aaaatgtcta tgcggttgac gctgacggta atgaaaaatg gcgctatcaa 1020 acagacagca atgtcatttc ctccccggtt ctggctgaag acggcacgct ctatgtcggc 1080 acttatacga aactgctcgc attcggggca aaaaaataa 1119 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YxaL(GH1-13)_forward <400> 26 gtttcttggc gggacggt 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YxaL(GH1-13)_reverse <400> 27 agcaccggag tcagcgta 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA(GH1-13)_forward <400> 28 cctacgggag gcagcagtag 20 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA(GH1-13)_reverse <400> 29 caacagagct ttacgatccg aaa 23 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH3.3_forward <400> 30 tcggataaaa ccgatgaagc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH3.3_reverse <400> 31 tcaacgactc ctccatttcc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAA1_forward <400> 32 ggaagtcacc aatgggctta 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IAA1_reverse <400> 33 gagatatgga gctccgtcca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFB4_forward <400> 34 aatcgaggac gaagaagcaa 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFB4_reverse <400> 35 tctgcatttc caccatttca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACS11_forward <400> 36 cccacttgga acctctacca 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACS11_reverse <400> 37 atcaagccaa cacgaaatcc 20 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA_forward <400> 38 gcgtttgaga ggatgtggcg gggaat 26 <210> 39 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA_reverse <400> 39 taaatgcgtc ccttccataa gtcggg 26

Claims (10)

  1. 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 YxaL 단백질을 포함하는 식물 성장 촉진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 Bacillus velezensis 균주 유래인 것인 식물 성장 촉진용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 Bacillus velezensis 균주는 GH1-13 계통인 것인 식물 성장 촉진용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 식물은 애기장대 또는 벼인 것인 식물 성장 촉진용 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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