CN115806953A - 一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT基因及其克隆表达与应用 - Google Patents
一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT基因及其克隆表达与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种没食子酸1‑β‑葡萄糖基转移酶TbUGGT基因及其克隆表达与应用。所述没食子酸1‑β‑葡萄糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明实现了体外酶催化方式合成1‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖，能够以绿色、高效的方式催化没食子酸和尿苷二磷酸葡萄糖合成1‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖。克服了通过植化分离方法或者化学合成方法获得1‑没食子酰‑β‑D‑葡萄糖时存在的产量低、效率低、操作繁琐、环境污染严重、成本高等缺陷。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT、编码所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段、含有所述基因片段的重组表达载体、一种基因工程化的宿主细胞、所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的克隆表达方法、一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的制备方法，以及一种制备1-没食子酰-β-D-葡萄糖的方法。
背景技术
没食子酸(gallic acid，GA)，又名3,4,5-三羟基苯甲酸，在漆树、栗子、橡树皮等植物中含量较为丰富，被用做食品添加剂、药物以及工业材料等的生产中。没食子酸的生物合成路径尚未完全明确，多数研究认为没食子酸主要由莽草酸途径的中间产物形成且主要围绕高等植物进行研究。没食子酸在植物体内含量丰富，在酵母及大肠杆菌等微生物体内微量存在。是一种巨大的可再生资源。
菱是桃金娘目菱科菱属的一年生水生草本漂浮植物，主要分布于热带、温带等地区。菱的非食用部位可作为传统中药用于清热解毒以及治疗胃溃疡、食管癌、痢疾等一些常见疾病。目前已从菱中鉴定出众多酚类化合物，如没食子酸、咖啡酸、柚皮素、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖以及五没食子酰葡萄糖等，这些酚类化合物在抗氧化、抗炎、抗癌等方面都具有一定的生理活性。目前，来源于菱的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶尚未有研究报道。
菱中所含的丰富的没食子酰-β-D-葡萄糖种类表明其含有众多相关酶类，没食子酰-β-D-葡萄糖的生物合成需要1-没食子酰基葡萄糖作为活性酰基供体，1-没食子酰基葡萄糖是没食子酰-β-D-葡萄糖生物合成路径上的一种关键化合物，其由一分子没食子酸和一分子二磷酸尿苷葡萄糖反应生成。因此，对负责1-没食子酰基葡萄糖生物合成的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT进行研究，有助于解析后续多没食子酰-β-D-葡萄糖的生物合成途径，对利用生物合成途径获取1-没食子酰基葡萄糖具有重要的指导意义。
综上所述，当前亟需一种能够获得菱中与没食子酸-β-D-葡萄糖基转移酶相关的基因以及通过原核表达的方式成功得到菱中与没食子酸-β-D-葡萄糖基转移酶相关的蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡糖基转移酶TbUGGT、基因及其克隆表达与应用。该基因来源于植物Trapa bispinosa Roxb.，重组TbUGGT酶具有酶活性。
本发明的第一方面提供一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。该糖基转移酶可催化没食子酸合成1-没食子酰-β-D-葡萄糖，命名为TbUGGT。
MGSESSLVHVFLVSFPAQGHVNPLLRLGKRLASKGLLVTFTTPESIGKQMRKASNIGDQPAPVGDGFIRFEFFEDGWDEDEPRRQDLDQYLPQLEKVGKVIIPEMIRRNAEQGRPISCLINNPFIPWVSDVAQSLGLPSAMLWVQSCACFAAYYHYYHDLVPFPSETAMEIDVQLPCMPLLKHDEVPSFLYPTTPYPFLRRAILGQYKNLDRPFCILLDTFQELEHEIVEYMSKICPIKTVGPLFKNPRAPNAAVKGDFVKADYDCIRWLDSKPPASVVYVSFGSVVYLKQDQWDEIAYGLLNSGVNFLWVMKPPHKDSGYTLLKLPEGLLEKAGERAKVVEWSPQEQVLAHPATACFVTHCGWNSSMEALTSGMPVVAFPQWGDQVTDAKYLVDVFKVGLRMCRGEAEDKLITRDVVERCLREATVGHKAVEMKENALRWKTAAEAAFVEGGSSDRNIHAFVDEVRRRSVELTASKPAAAAEPTAEAADANGKVEPVP(SEQ ID NO：1)
本发明的第二方面提供一种编码所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
5’-ATGGGAAGTGAATCATCTCTAGTACACGTTTTCTTGGTATCTTTCCCGGCGCAGGGCCACGTGAATCCGTTGCTGCGTCTGGGTAAGCGCCTGGCGTCCAAGGGTTTGCTTGTCACGTTTACCACCCCGGAATCCATTGGTAAGCAAATGCGTAAAGCGTCCAACATCGGCGACCAGCCGGCGCCAGTGGGCGACGGCTTTATCCGCTTTGAATTTTTCGAGGACGGTTGGGATGAGGACGAGCCGCGTCGTCAGGACCTGGATCAGTACCTCCCACAACTGGAAAAAGTGGGCAAAGTCATTATCCCGGAAATGATTCGTCGTAACGCGGAACAAGGTCGTCCGATTAGCTGCCTGATTAACAACCCGTTCATCCCGTGGGTGTCGGATGTTGCACAGAGCCTGGGCTTGCCGTCTGCGATGCTGTGGGTTCAAAGCTGCGCATGTTTTGCGGCGTACTACCACTATTACCACGACCTAGTGCCGTTCCCATCTGAAACCGCAATGGAAATCGACGTGCAGCTGCCGTGTATGCCGCTGCTTAAGCACGATGAGGTTCCGTCGTTCTTGTACCCGACCACTCCGTACCCGTTCCTGCGCAGAGCGATTCTGGGCCAGTATAAAAACCTCGACCGTCCGTTCTGCATCCTGCTGGACACCTTTCAAGAATTGGAGCACGAAATTGTTGAGTATATGAGCAAGATCTGCCCGATCAAAACCGTTGGTCCGCTGTTTAAGAACCCGAGAGCACCGAACGCTGCGGTTAAAGGCGACTTCGTGAAAGCCGATTATGATTGTATCCGTTGGCTGGACAGCAAGCCGCCTGCAAGTGTTGTTTATGTAAGCTTTGGTAGCGTCGTTTACCTCAAGCAGGATCAATGGGACGAGATCGCATACGGCCTGTTGAATAGCGGCGTTAATTTTCTGTGGGTCATGAAGCCGCCACATAAAGATAGCGGTTATACCCTGTTGAAGCTGCCGGAAGGCTTACTTGAGAAGGCGGGTGAACGTGCAAAAGTTGTGGAGTGGTCCCCGCAAGAGCAGGTTCTGGCGCACCCGGCTACCGCCTGCTTCGTGACGCATTGCGGTTGGAATAGTAGCATGGAAGCGCTGACTAGCGGTATGCCTGTTGTGGCCTTTCCGCAGTGGGGTGACCAAGTCACCGATGCAAAATATTTGGTTGATGTTTTTAAAGTGGGGCTGCGTATGTGTCGTGGTGAAGCTGAGGATAAACTGATCACCCGTGATGTGGTGGAGCGCTGCCTGCGGGAAGCCACCGTTGGCCATAAAGCTGTGGAGATGAAAGAAAACGCCCTGCGCTGGAAAACCGCGGCCGAGGCCGCGTTCGTAGAGGGTGGTTCTAGCGACCGCAACATTCATGCATTCGTGGACGAAGTTCGTCGCCGTAGCGTCGAGCTGACGGCGTCCAAGCCGGCGGCTGCGGCTGAGCCAACGGCTGAGGCAGCGGATGCGAATGGTAAGGTGGAACCGGTGCCCTAA-3’(SEQ IDNO：2)
本发明的第三方面提供一种重组表达载体，含有所述的编码所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段。
本发明的第四方面提供一种基因工程化的宿主细胞，所述宿主细胞为转化了所述的重组表达载体的宿主细胞，或者为基因组上整合了所述的基因片段的宿主细胞，及其后代细胞。
进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五方面提供所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的克隆表达方法，包括如下步骤：
(1)以菱(Trapa bispinosa Roxb.)总RNA反转录后的cDNA为模板，通过PCR扩增获得所述的编码所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段；
(2)将步骤(1)得到的基因片段克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转入表达系统中进行异源表达；最后经纯化得到所述没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT。
根据本发明一种优选实施方式，所述PCR扩增所用的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO：3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5’-ATGGGTTCCGAGTCCTCGC-3’(SEQ ID NO：3)
5’-TCACGGGACCGGCTCTACC-3’(SEQ ID NO：4)
根据本发明一种优选实施方式，将步骤(1)得到的基因片段克隆入表达载体中构建重组表达载体的方法包括：在步骤(1)得到的基因片段的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Not I的酶切位点；将经EcoR I和Not I双酶切的基因片段插入同样经EcoR I和Not I双酶切的大肠杆菌表达载体pET28a，获得重组表达载体。
根据本发明一种具体实施方式，所述的糖基转移酶TbUGGT基因的克隆表达方法，包括如下步骤：
步骤1，PCR扩增SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
步骤2，构建质粒载体如pET28a-oriTbUGGT：
将PCR扩增的DNA序列和pET-28a载体用同样的限制性内切酶EcoRI和Not I进行双酶切，用T4 DNA连接酶连接回收纯化的酶切产物，得到质粒载体pET28a-oriTbUGGT；
步骤3，测序重组质粒载体pET28a-oriTbUGGT的碱基序列；
步骤4，构建质粒载体如pET28a-TbUGGT；
步骤5，构建克隆菌株pET28a-TbUGGT-E.coli DH5α；
将质粒载体pET28a-TbUGGT转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，经菌落PCR筛选并测序确定为目标菌株；
步骤6，构建表达菌株pET28a-TbUGGT-BL21(DE3)；
将克隆菌株pET28a-TbUGGT-E.coli DH5α提取出来的质粒转化至E.coli BL21(DE3)，挑选阳性转化子直接克隆培养，得到重组表达菌株pET28a-TbUGGT-BL21(DE3)；
步骤8，体外诱导表达：
将重组表达菌株pET28a-TbUGGT-BL21(DE3)接入5mL含卡那霉素的LB培养基中，于25-40℃过夜培养10-20h后，按1％的接种量接种到100mL含卡那霉素的LB培养基中，当OD600＝0.4-0.6时，加入终浓度为0.1-1mM的IPTG，于16-25℃，150-250rpm低温诱导16-24h；
步骤9，没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶获得
体外诱导表达结束后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2s间隔3s，然后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集上清液，即得粗酶液TbUGGT；
步骤10，粗酶液的纯化
取经过滤去除杂质的粗酶液上镍柱，平衡3次后用含50mM咪唑的洗涤液洗涤，待目标蛋白都吸附在镍柱上后，换用含500mM咪唑的洗脱液洗脱目标蛋白并进行收集，将收集得到的目标蛋白取样进行10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得纯化TbUGGT酶液。
本发明的第六方面提供所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的制备方法，包括：培养所述的宿主细胞，从培养物中获得所述没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT。
本发明的第七方面提供一种制备1-没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，所述方法包括：利用所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT催化没食子酸和尿苷二磷酸葡萄糖生成1-没食子酰-β-D-葡萄糖。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明首次从植物菱中获得对没食子酸具有催化能力的糖基转移酶，具体地，通过构建没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT原核表达载体和克隆表达方法，成功获得分子量约为59.6kDa的酶蛋白，蛋白表达效果好，具有酶活性，且制备过程简单，为TbUGGT功能研究提供了简便方法。
2、本发明实现了体外酶催化方式合成1-没食子酰-β-D-葡萄糖，能够以绿色、高效的方式催化没食子酸和尿苷二磷酸葡萄糖合成1-没食子酰-β-D-葡萄糖。克服了通过植化分离方法或者化学合成方法获得1-没食子酰-β-D-葡萄糖时存在的产量低、效率低、操作繁琐、环境污染严重、成本高等缺陷。
3、本发明为1-没食子酰-β-D-葡萄糖的糖基化合成提供了一种重要的工具酶，能够为1-没食子酰-β-D-葡萄糖的合成工业带来巨大的经济效益。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明中TbUGGT基因的PCR扩增产物电泳结果，其中，M：DNA marker；C1：PCR产物。
图2为本发明中TbUGGT基因重组质粒图谱。
图3为本发明中重组质粒pET28a-TbUGGT的电泳图，其中，M：DNAmarker；C1：重组质粒双酶切；C2：重组质粒。
图4为本发明中没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的SDS-PAGE检测结果，其中，M：蛋白Marker；C1：未诱导的含重组质粒的全菌蛋白；C2：未诱导的含空载体的全菌蛋白；C3：诱导后含重组质粒的全菌蛋白；C4：诱导后含空载体的全菌蛋白。
图5为本发明中纯化后的TbUGGT重组蛋白的SDS-PAGE结果，其中，M：蛋白Marker；CL1：菌体破碎前上清；CL2：经浓缩的纯化蛋白。
图6为本发明中重组TbUGGT酶活性的HPLC测定；图中，(a)对照组；(b)βG标准品；(c)实验组。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下述实例中所用到的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT基因的扩增
本发明依据本实验室前期获得的菱转录组测序数据，从中筛选出没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因序列并设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)获得了菱没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因序列。
利用PCR技术，以菱总RNA反转录后的cDNA为模板，采用Primer 5.0软件设计引物，分别为：上游引物TbUGGT-F(SEQ ID NO.4)：5’-ATGGGTTCCGAGTCCTCGC-3’；下游引物TbUGGT-R(SEQ ID NO.5)：5’-TCACGGGACCGGCTCTACC-3’。
PCR反应体系：
| 模板 | 200ng |
| PrimeSTAR HS(Premix) | 25μL |
| 上游引物 | 10pmol |
| 下游引物 | 10pmol |
| RNase dH<sub>2</sub>O | 加至50μL |
PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸97s，循环扩增30次；循环结束后于72℃下延伸10min。
PCR反应结束后以1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1500bp处有一明亮条带，即为没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT基因片段，PCR结果如附图1所示。其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。本发明所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶基因TbUGGT编码499个氨基酸，分子量约为55.8kDa，具有如SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。
实施例2质粒载体pET28a-oriTbUGGT和pET28a-TbUGGT的构建及克隆菌株pET28a-oriTbUGGT-E.coli DH5α和pET28a-TbUGGT-E.coli DH5α的制备
1、使用OMEGA公司PCR纯化试剂盒对实施例1得到的PCR产物进行纯化回收。
2、添加酶切位点至上述回收的产物，5’端添加的酶切位点为EcoR I，3’端添加的酶切位点为Not I。
3、构建质粒载体pET28a-oriTbUGGT
将PCR得到的DNA序列和pET-28a载体用同样的限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切消化，酶切产物经回收纯化，并用TaKaRa公司的T4DNA连接酶连接，得到质粒载体pET28a-oriTbUGGT。
4、构建克隆菌株pET28a-oriTbUGGT-E.coli DH5α
将质粒载体pET28a-oriTbUGGT转化至E.coli DH5α，选取阳性克隆子并转移至液体培养基培养，用OMEGA质粒抽提试剂盒提取重组质粒。
5、构建克隆菌株pET28a-TbUGGT-E.coli DH5α
测序重组质粒pET28a-oriTbUGGT并进行密码子优化，依据实施例2的方法将优化后的基因序列TbUGGT连接至pET-28a载体上，得到重组质粒pET28a-TbUGGT，其质粒谱图如图2所示，并构建克隆菌株pET28a-TbUGGT-E.coli DH5α。
连接反应体系：
连接反应的条件为：混匀后在16℃下过夜连接。
实施例3构建重组表达菌株pET28a-TbUGGT-BL21(DE3)
1、菌株培养：将已构建的重组质粒pET28a-TbUGGT从克隆宿主中提取出来，双酶切验证结果如图3所示，将重组质粒再转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞。转化操作如上述实施例2中的转化步骤。最终挑取1-2个单菌落接种到含有卡那霉素的终浓度为50mM的5mLLB液体培养基中，37℃下过夜培养。
2、主培养：培养12-16h后按1％接种量转移至100mL含相应抗性的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.4-0.6。
3、诱导表达：加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导菌体细胞，在25℃下220rpm低温诱导8-12h。
4、收集全细胞：诱导完成后，于4℃，6000rpm下离心15min收集菌体，用10mL PBS混匀后于超声波破碎处理10min，至液体出现透明。
5、可溶性TbUGGT酶的提取：将上述菌液于12000rpm，4℃离心10min，取上清液即为可溶性蛋白，即本发明所述酶TbUGGT。
6、SDS-PAGE电泳检测表达的目的蛋白：结果如图4和图5所示。可以确认蛋白的成功表达。
实施例4没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的酶活测定
1、酶促反应体系及反应条件
酶促反应总体系为100μL，底物为0.5mM的没食子酸和2.5mM的尿苷二磷酸葡萄糖，缓冲环境为100mM含0.1％β-巯基乙醇的MES缓冲液，实验组中加入适量纯化后的酶液，对照组中不加入酶液。30℃下反应3h后加入等体积甲醇终止反应并用高效液相色谱进行检测。
2、酶促产物液相检测条件及方法
色谱柱：安捷伦C18色谱柱；流动相：1％乙酸水(A)和乙腈(B)；进样量：20μL；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：280nm。液相方法为：0-10min，3％-5％ B；10-15min，5％-50％ B；15-25min，50％-5％B；25-30min，5％-3％ B；30-35min，3％ B。将1-没食子酰-β-D-葡萄糖标准品液相图同酶促反应后的液相图进行对比，从图6的(a)-(c)可以看出，图6的(c)中出现了酶促反应产物1-没食子酰-β-D-葡萄糖的特征峰，表明该酶具有酶活性。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNo：1所示。
2.一种编码权利要求1所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段。
4.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为转化了权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞，或者为基因组上整合了权利要求2所述的基因片段的宿主细胞，及其后代细胞。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.权利要求1所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的克隆表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以菱(Trapa bispinosa Roxb.)总RNA反转录后的cDNA为模板，通过PCR扩增获得权利要求2所述的编码所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的基因片段；
(2)将步骤(1)得到的基因片段克隆入表达载体中构建重组表达载体；再将所述的重组表达载体转入表达系统中进行异源表达；最后经纯化得到所述没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT。
7.根据权利要求6所述的克隆表达方法，其特征在于，所述PCR扩增所用的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
8.根据权利要求6所述的克隆表达方法，其特征在于，将步骤(1)得到的基因片段克隆入表达载体中构建重组表达载体的方法包括：在步骤(1)得到的基因片段的两端分别引入限制性内切酶EcoR I和Not I的酶切位点；将经EcoR I和Not I双酶切的基因片段插入同样经EcoR I和Not I双酶切的大肠杆菌表达载体pET28a，获得重组表达载体。
9.权利要求1所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT的制备方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求4所述的宿主细胞，从培养物中获得所述没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT。
10.一种制备1-没食子酰-β-D-葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1所述的没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT催化没食子酸和尿苷二磷酸葡萄糖生成1-没食子酰-β-D-葡萄糖。
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