CN101955922A

CN101955922A - 一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表达

Info

Publication number: CN101955922A
Application number: CN 201010248207
Authority: CN
Inventors: 肖亚中; 房伟; 方泽民; 张学成; 彭惠; 洪宇植
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2010-08-02
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2011-01-26

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表达，该葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶是具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的多肽，其基因编码序列如SEQ ID No：1所示。本发明还公开了含有该葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的表达菌株。本发明所述的β-葡萄糖苷酶来自海洋未培养微生物，具有较好的葡萄糖耐受性，可以改善木质纤维素的发酵工艺，并且可生产出高达20-30％浓度的果汁；其葡萄糖抑制常数为1000mM，本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶在pH6-9范围内具有好的稳定性。

Description

一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表达

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，以及该葡苷酶在大肠杆菌中的表达。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)属于外切水解酶类，是一类在亲核分子间催化转移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的残基之间打断β-1，4-糖苷键。β-葡萄糖苷酶是一类重要的工业用酶，潜在应用广泛，在众多生物技术生产过程中具有重要的应用价值。它是食品工业中重要的风味酶，可以水解水果中的风味前体物——β-糖苷，释放出挥发性糖苷配基，充任水果风味增香酶的角色；β-葡萄糖苷酶兼具有糖苷转移酶的活性，可以用于合成新的糖配体；β-葡萄糖苷酶可以与其他几种纤维素降解酶协同作用，将纤维素降解成葡糖糖，后者能为产能微生物利用，进而炼制生成燃料乙醇等能源物质。

在β-葡萄糖苷酶工业应用过程中，人们发现，非葡萄糖敏感的β-葡萄糖苷酶降解纤维素的速度更快，可以改善木质纤维素的发酵工艺；并且，利用葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，可生产出20-30％浓度的果汁(Waldron CR，Becker-Vallone CA，and Eveleigh DE.Isolation and characterization of a cellulolytic actinomycete Microbispora bispora.Appl.Microbiol.Biotechnol.1986，24：477-486.)。然而，一般情况下，β-葡萄糖苷酶对其水解产物葡萄糖异常敏感，极低浓度的葡萄糖就能够反馈抑制β-葡萄糖苷酶的活性。β-葡萄糖苷酶对葡萄糖的抑制常数K_i一般为0.5mM-100mM(Watanabe T，Sato S，Yoshioka T，et al.Purification and properties of Aspergillus niger β-glucosidase.J.Biochem.1992，209：651-659；Woodward J and Wiseman A.Fungal and other β-D-glucosidases：their properties and applications.Enzyme Microb.Technol.1982，4：73-79.)，仅有极少数的β-葡萄糖苷酶具有较高的葡萄糖耐受浓度(Christine R，Jean-Michel S，Marie-Jose V，et al.Purification，characterization，and subatrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β-glucosidase from Aspergillus niger.Applied and Environmental Microbiology.1998，64(10)：3607-3614.)。

发明内容

本发明提供一种具有工业应用价值的新型葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，表达该β-葡萄糖苷酶基因的工程菌株以及β-葡萄糖苷酶蛋白的制备方法。

本发明提供一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶(基因命名为Bgl1A)，原始来源于中国南海海洋海水未培养微生物，具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID No：1；

(2)序列表中的SEQ ID No：1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。

一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

(2)序列表中的SEQ ID No：2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。

本发明的目的还在于提供含有上述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达载体。

本发明的目的还在于提供含有上述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的宿主菌。

本发明的目的还在于提供上述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶蛋白的制备方法。

含有上述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达载体的构建方法，包括以包含葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的BAC载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并与pMD18-T质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1A)的pMD18-T重组质粒，用Nde I和Xho I双酶切所得的pMD18-T重组质粒和表达质粒载体，然后用T4连接酶将酶切后的bgl1A与表达质粒载体连接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgl1A基因的工程菌株；其中所述引物为：

P1：5′-GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3′

P2：5′-CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3′

上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。

上述构建方法中所述宿主菌是指E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coli JM109或E.coli Rosetta等。

下面以表达质粒载体pET22b(+)、E.coli BL21(DE3)为例，具体介绍含有本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达菌株的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)以包含葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的BAC载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：

P1：5′-GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3′

P2：5′-CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3′

(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1A)的pMD18-T重组质粒；

(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18-T重组质粒和pET22质粒，然后用T4连接酶将酶切后的bgl1A与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgl1A基因的工程菌株BL21(DE3)。

与现有的葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶相比，本发明具有的优点为：(1)本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因来自于海洋未培养微生物；(2)本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受常数K_i为1000mM。高葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶可以改善木质纤维素的发酵工艺，并且可生产出高达20-30％浓度的果汁；(3)本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶在pH6-9范围内具有好的稳定性；

保藏说明：本发明的菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/PET22b(+)bgl1A已送往中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)保藏，保藏中心地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山；菌株保藏编号为CCTCC M 2010161，保藏日期为：2010年6月25日。

附图说明

图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱；

图1中1为分子量标准；2为PCR扩增产物。

图2为本发明表达载体pET22b(+)/bgl1A质粒的鉴定电泳图谱

图2中1为分子量标准；2为pET22b(+)/bgl1A质粒；3为经过Nde I/Xho I双酶切的pET22b(+)/bgl1A；4为经过Nde I/Xho I双酶切的pET22b(+)；5为重组pET22b(+)/bgl1A质粒PCR扩增产物。

图3为本发明Bgl1A蛋白表达电泳图谱。

图3中1为E.coli BL21(DE3)空细胞在0.75mM IPTG诱导下的全菌蛋白；2为E.coliBL21(DE3)/bgl1A未进行诱导的全菌蛋白；3为E.coli BL21(DE3)/bgl1A在0.75mM IPTG诱导下的全菌蛋白；4为纯化的Bgl1A。

图4为本发明Bgl1A葡萄糖耐受曲线。

具体实施方式

(一)、含有本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的表达菌株的构建

下列实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

1、含有本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的阳性克隆的筛选及全长基因的获得

从中国南海海洋表层海水100L(24°21′17 N，118°08′59 E)，分离微生物并提取基因组，分离提取方法同申请号为CN200810024342.1，按照试剂盒(购自Epicentre公司)提供的说明构建宏基因组文库。(Chu XM，He HZ，Guo CQ，Sun BL，2008.Identification of two novel esterases from a marine metagenomic library derived from South China Sea.Appli.Microbiol.Biotechnol.80，615-625.)得到的单克隆放置于384孔板并于-70℃保存。

用平板功能筛选的方法，利用96针复制器(96 pin replicator，NUNC)将保存在384孔板上的单克隆菌株复制到含有氯霉素(12.5mg/L)、0.1％七叶苷和0.25％的柠檬酸铁铵的活性LB固体平板上，将平板在37℃倒置培养20h，菌落周围显示黑色的为阳性克隆。提取阳性克隆质粒，命名为p42H12，重新转化E.coli EPI300感受态细胞，并进行活性筛选，菌落周围再次显示黑色的确定为阳性克隆质粒。

为了获得全长β-葡萄糖苷酶基因，采用亚克隆方法对p42H12上的β-葡萄糖苷酶基因进行定位。阳性克隆质粒先用Sau3A I(TaKaRa)进行限制性部分酶切，控制酶切时间，收集2-5kb长度酶切片段，然后用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将收集的DNA片段与经过BamH I酶切过的pUC19载体连接(Fermentas)，16℃连接8h后连接产物热激转化E.coli DH5α感受态细胞。转化细胞涂布在含有氨苄青霉素(100mg/L)、0.1％七叶苷和0.25％的柠檬酸铁铵的活性LB固体平板上，将平板在37℃倒置培养20h，菌落周围显示黑色的为阳性克隆。挑取阳性克隆，送上海生工生物工程公司测序，获得编码DNA序列。得到的序列利用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)寻找编码β-葡萄糖苷酶基因的开放阅读框，得到一个长度为1329bp的开放阅读框，编码β-葡萄糖苷酶基因(命名为bgl1A)。

2、葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的扩增

根据1中获得的bgl1A基因序列，设计一对寡核苷酸引物P1和P2，其序列为：

P1：5′-GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3′

P2：5′-CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3′

在引物的5′分别引入Nde I和Xho I酶切位点，以步骤1抽提的阳性克隆质粒p42H12为模板，扩增葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因。PCR程序如下：第一阶段变性94℃，5min；第二阶段变性94℃，50sec，退火60℃，50sec，延伸72℃，90sec，共进行25个循环；第三阶段延伸72℃，10min。得到的PCR产物用1％琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到的葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

3、表达载体的构建

将步骤2中得到PCR扩增产物，与pMD18-T质粒连接(TaKaRa)，建立如下酶切体系：25ng pMD18-T载体，50ng PCR扩增产物，5ul ligation mix，补水至10ul，16℃连接1h。连接产物热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1A)的pMD18-T重组质粒；用Nde I和Xho I双酶切所得的pMD18-T重组质粒和pET22b(+)载体，然后用T4连接酶将酶切后的bgl1A与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系：25ng pET22b(+)载体，50ngbgl1A酶切片段，3ul 10×ligation buffer，1ul T4 DNA连接酶(TaKaRa)，补水至30ul，16℃连接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否突变，挑选序列正确的转化子得到含有本发明bgl1A基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A。(二)、含本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因工程菌的表达与蛋白纯化

将(一)中获得的基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD600＝0.6(UNICOUV2102紫外可见分光光度计，以培养LB培养基为空白)；加入终浓度为0.75mM的IPTG进行诱导，并于30℃、180rpm条件下继续培养5小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的Binding buffer，350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液。全菌蛋白SDS-PAGE显示蛋白表达量占全菌蛋白的50％以上。

粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度为60mM，洗脱10个柱体积。得到的蛋白经过检测达到SDS-PAGE纯度，如图3所示。

以pNPG为底物，纯化的葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶Bgl1A的最适pH为6.5，酶在pH5.5-7.5范围内能够显示80％以上的酶活力。酶在pH6.0-9.0范围内有较高的稳定性，30℃条件下保温1h仍然能够维持原酶活力的60％以上。Bgl1A在15℃-55℃范围内均能显示催化活性，其最适温度为40℃。

当反应体系中葡萄糖终浓度低于400mM时，葡萄糖的存在对酶活力由促进作用。当葡萄糖浓度为100mM时促进作用最强，达到原酶活力的130％。随着葡萄糖浓度的不断升高，酶活力逐渐受到抑制，葡萄糖对Bgl1A抑制的Ki为1000mM，如图4所示。

Claims

1.一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其基因编码具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID No：1；

(3)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述基因编码的葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：2；

3.含有权利要求1所述的细菌漆酶基因的重组表达载体。

4.含有权利要求1所述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的宿主菌。

5.含有权利要求1所述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)以包含葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的BAC(细菌人工染色体载体(Bacterial Artificial Chromosome，)载体DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：

P1：5′-GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3′

P2：5′-CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3′

(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18-T重组质粒和pET22质粒，然后用T4连接酶将酶切后的bgl1A与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgl1A基因的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A。

6.葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于：

将根据权利1所述的核酸分子或根据权利3或5所述的载体转移到微生物宿主细胞中用于表达核酸分子，或利用根据权利4所述的表达宿主表达核酸分子；以及任选的从宿主细胞中分泌所表达的多肽。

E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，放置于37℃、250rpm条件下培养至OD₆₀₀＝0.6；加入终浓度为0.75mM的IPTG进行诱导，并于30℃、180rpm条件下继续培养5小时；4℃、8000g离心收集菌体，加入0.1倍菌液体积的Binding buffer，350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到粗酶液，所述粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化，得到高纯蛋白。