WO2017217453A1 - セルラーゼ - Google Patents
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Classifications
-
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- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
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- C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
Abstract
Description
[1]
キシラナーゼの糖質結合モジュールを有し、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質。
[2]
キシラナーゼの糖質結合モジュールとセルラーゼの触媒ドメインを有するタンパク質である、前記タンパク質。
[3]
前記糖質結合モジュールが、糖質結合モジュールのファミリー1に分類される糖質結合モジュールである、前記タンパク質。
[4]
前記糖質結合モジュールが、Xyl10Aの糖質結合モジュールである、前記タンパク質。
[5]
前記糖質結合モジュールが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質:
(a)配列番号16の375位~403位のアミノ酸配列;
(b)配列番号16の375位~403位のアミノ酸配列において、1~5個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含み、セルロース系基質に対する結合能を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号16の375位~403位のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、セルロース系基質に対する結合能を有するアミノ酸配列。
[6]
前記触媒ドメインが、β-グルコシダーゼの触媒ドメインである、前記タンパク質。
[7]
前記触媒ドメインが、グリコシドハイドロラーゼのファミリー3に分類されるセルラーゼの触媒ドメインである、前記タンパク質。
[8]
前記触媒ドメインが、Bgl3Aの触媒ドメインである、前記タンパク質。
[9]
前記触媒ドメインが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のアミノ酸配列を含む、前記タンパク質:
(a)配列番号11の25位~601位のアミノ酸配列;
(b)配列番号11の25位~601位のアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含み、セルラーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号11の25位~601位のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、セルラーゼ活性を有するアミノ酸配列。
[10]
前記糖質結合モジュールと前記触媒ドメインとの間にリンカー領域を有する、前記タンパク質。
[11]
フィブロネクチンIII型様ドメインを有する、前記タンパク質。
[12]
前記触媒ドメインが由来するセルラーゼの固有の糖質結合モジュールを有さない、前記タンパク質。
[13]
下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、前記タンパク質:
(a)配列番号34または36に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号34または36に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号34または36に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質。
[14]
前記タンパク質をコードする遺伝子。
[15]
前記遺伝子を搭載するベクター。
[16]
前記遺伝子を有する宿主。
[17]
細菌または真菌である、前記宿主。
[18]
前記タンパク質でセルロース系基質を処理することを含む、糖化物の製造方法。
[19]
前記セルロース系基質が植物バイオマスである、前記方法。
本発明は、キメラ酵素およびそれをコードする遺伝子を提供する。本発明により提供されるキメラ酵素(以下、単に「キメラ酵素」ともいう)は、キシラナーゼ(xylanase)の糖質結合モジュール(carbohydrate binding module;CBM)を有するセルラーゼ(cellulase)である。また、キメラ酵素は、言い換えると、キシラナーゼのCBMを有し、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質である。キメラ酵素をコードする遺伝子を「キメラ酵素遺伝子」ともいう。
「セルラーゼ」とは、セルロースの分解に関与する酵素の総称である。「セルラーゼ」とは、具体的には、β-D-グルカン中のβ-1,4グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。同活性を「セルラーゼ活性」ともいう。β-D-グルカンとしては、セルロースや、その分解物として生じ得るセロビオース等のセロオリゴ糖類が挙げられる。
「キシラナーゼ」とは、キシランの分解に関与する酵素の総称である。「キシラナーゼ」とは、具体的には、キシラン中のβ-1,4グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を有するタンパク質という(EC 3.2.1.8)。同活性を「キシラナーゼ活性」ともいう。キシラナーゼ活性は、例えば、公知の手法により測定することができる。キシラナーゼ活性は、例えば、キシランを基質として酵素反応を行い、生成する還元糖量を指標として、決定することができる。
キメラ酵素は、キシラナーゼのCBMを有し、且つ、セルラーゼ活性を有するように構成される。キメラ酵素は、キシラナーゼのCBMを有すること以外は、例えば、上記例示したセルラーゼもしくはその保存的バリアントと同一のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質であってよい。「アミノ酸配列の一部」は、キメラ酵素が所望のセルラーゼ活性を有する限り、特に制限されない。「アミノ酸配列の一部」としては、セルラーゼの触媒ドメイン(catalytic domain)が挙げられる。すなわち、キメラ酵素は、セルラーゼの触媒ドメインを有していてよい。すなわち、キメラ酵素は、具体的には、キシラナーゼのCBMとセルラーゼの触媒ドメインを有するタンパク質であってよい。キメラ酵素は、セルラーゼの触媒ドメインを有することによりセルラーゼ活性を有し得る。
キメラ酵素は、キメラ酵素遺伝子を有する宿主に同遺伝子を発現させることにより製造できる。キメラ酵素遺伝子を有する宿主は、同遺伝子を適当な宿主に導入することにより取得できる。なお、「キメラ酵素遺伝子を宿主に導入する」ことには、同遺伝子の全体を宿主に導入する場合に限られず、宿主の染色体上のセルラーゼ遺伝子やキシラナーゼ遺伝子等の遺伝子をキメラ酵素をコードするように改変することも含まれる。なお、キメラ酵素遺伝子を有する宿主を、「キメラ酵素を有する宿主」ともいう。
キメラ酵素は、例えば、セルロースの分解に利用できる。具体的には、例えば、キメラ酵素を利用してセルロース系基質に含まれるセルロース成分を糖化することにより、グルコース等のセルロース分解物を含有する糖化液が得られる。すなわち、本発明は、キメラ酵素でセルロース系基質を処理することを含む、セルロース系基質の糖化方法を提供する。同方法の一態様は、キメラ酵素でセルロース系基質を処理することを含む、糖化物の製造方法である。
(A)第1のセルロース系基質を酵素糖化して得られた、遊離の糖化酵素を含有する第1の糖化液と、第2のセルロース系基質とを接触させる工程、
(B)前記工程(A)の後に、前記第2のセルロース系基質を回収する工程、
(C)前記工程(B)の後に、前記第2のセルロース系基質を酵素糖化し第2の糖化液を得る工程。
(1-1)Talaromyces cellulolyticus F09ΔcreA株の構築
Talaromyces cellulolyticus S6-25株(NITE BP-01685。以下、S6-25株と記載)を親株として、以下の手順で遺伝子組み換え用の親株T. cellulolyticus F09株を構築した。
F09ΔcreA株を、12 g/L Potato Dextrose Broth(Difco)、20 g/L Bacto Agar(Difco)を含む培地に接種し、30℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いて得たアガーディスク1個を、20 mL の20 g/L グルコース、24 g/L KH2PO4、5 g/L (NH4)2SO4、2 g/L Urea、1.2 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L ZnSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・5H2O、0.01 g/L CuSO4・5H2O、1 g/L Corn steep liquor(C4648, SIGMA)、1 g/L Tween 80を含む液体培地に接種し、30℃、220 rpmで5日間旋回培養にて前培養を行なった。次に、15 mLの前培養液を、ジャーファーメンター中の300 mLの15 g/L グルコース、12 g/L KH2PO4、10 g/L (NH4)2SO4、1.2 g/L MgSO4・7H2O、0.01 g/L ZnSO4・7H2O、0.01 g/L MnSO4・5H2O、0.01 g/L CuSO4・5H2O、5 g/L Corn steep liquor、1 g/L Tween 80、0.5 mL/L ディスホームGD(日油)を含む液体培地に植菌し、培養温度を30℃、通気量を1/2 vvmとし、撹拌により溶存酸素濃度を飽和濃度に対し5%以上に制御し、アンモニアガスを用いて培養pHを5に制御しながら、78時間の流加培養を行った。流加液の組成は360 g/L Glucose、60 g/L Cellobiose、0.5 mL/L ディスホームGDとし、流加液は培養開始22時間後から連続的に流加した。培養開始72時間後に培養液をサンプリングし、遠心分離(15000 rpmで5分間)して上清を得た。得られた上清を酵素液とした。
バガスはカッティングミル(SM100, Retsch、スクリーン0.75 mm)を用いて粉砕した。バガスを水に7%(w/v)で混合して一晩浸漬させた後、バッチ式小型水熱処理装置(070-07013, オーエムラボテック)で水熱処理を行った。水熱処理は、攪拌速度を200 rpmで一定とし、200℃で15分行った。水熱処理後の水熱処理スラリーは、濾紙(5C, Advantec)を用いた吸引ろ過で固液分離し、水で洗浄した。得られた固形分を水熱処理バガスとした。
50 mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.1)中に、5%(w/v)相当の水熱処理バガスと、20%(v/v)相当の酵素液(T. cellulolyticus F09ΔcreA株の培養上清)を添加し、50℃で24時間振とうしながら反応させた。次いで、5%(w/v)相当の水熱処理バガスを追加してよく混合してから遠心分離して(15000 rpmで5分間)して上清を得、酵素回収後サンプルとした。また、50 mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH5.1)中に20%(v/v)相当の酵素液(T. cellulolyticus F09ΔcreA株の培養上清)を添加したものを糖化反応前サンプルとした。
(3-1)キメラ酵素生産株の構築
図2に示すようにT. cellulolyticusのBgl3AのC末端に存在するCBMを含む領域をT. cellulolyticusのXyl10AのCBMを含む領域で置換した2種類のキメラ酵素(Bgl3A-10LC及びBgl3A-10C)をデザインした。これらのキメラ酵素、野生型のBgl3A(Bgl3Awt)、並びにリンカー領域及びCBMを欠失したBgl3A(Bgl3AΔLC)をそれぞれ分泌発現する株を構築するために、以下の方法で4種の発現プラスミドpANC239、pANC247、pANC248、pANC244を構築した。
Y239株、Y247株、Y248株、Y244株を、それぞれ、12 g/L Potato Dextrose Broth(Difco)、20 g/L Bacto Agar(Difco)を含む培地に接種し、30℃で培養を行った。寒天培地上に形成させたコロニーの端付近をストローで打ち抜いて得たアガーディスク1個を、フラスコ中の10 mL の20 g/Lの可溶化デンプン、24 g/L KH2PO4、1 g/L Tween 80, 5 g/L (NH4)2SO4、1.2 g/L MgSO4・7H2O、0.8 g/L ureaを含む培地に接種し、30℃、220 rpmで5日間旋回培養にて培養を行なった。
培養後、培養液を遠心分離して上清を得た。得られた培養上清中に各Bgl3Aが含まれていることをSDS-PAGEおよびクロマトグラフィーで確認した。これらの培養上清をHiPrep 26/10脱塩クロマトグラフィー(GE Healthcare)を用いて脱塩後、Resource Q陰イオン交換クロマトグラフィー(GE Healthcare)及びResource ISO疎水カラムクロマトグラフィー(GE Healthcare)に供して各Bgl3AがSDS-PAGEで単一のバンドで検出されるまで精製した。
各精製酵素(精製した各Bgl3A)の活性を、pNP-β-D-Glucoseを基質として測定した。1 Uの酵素活性は、1分間に1μmolのpNP(p-ニトロフェノール)を生成する酵素活性として定義した。その結果、Bgl3A-10LC、Bgl3A-10C、Bgl3AΔLCは、いずれも、Bgl3Awtとほぼ同等の比活性を示した(表1)。本結果は、CBMやリンカーの置換または欠失がBgl3Aの触媒ドメインの機能にほとんど影響を及ぼさないことを示す。
各精製酵素(精製した各Bgl3A)のセルロース系基質への結合能の評価は、50 mM酢酸Na (pH 5.0)に懸濁した2%アビセル、3%ディスクミル粉砕稲わら、2%水熱処理バガスを基質に用いて行った。各基質懸濁液1 mLに1 mg/mLの各精製酵素を10μL添加し、45℃で2時間保温後、上清中に残存するBgl3A活性をpNP-β-D-Glucoseを用いて測定した。コントロールとして、各基質懸濁液の上清1 mLに1 mg/mLの各精製酵素を10μL添加し、30℃で2時間保温後、溶液中に残存するBgl3A活性をpNP-β-D-Glucoseを用いて測定した。セルロース系基質との反応後上清の活性を、コントロールで得られた活性を100とした場合の相対活性として求めた。当該相対活性が低い程、セルロース系基質に結合した比率が高いことを示す。結果を表2に示す。CBMを保持しているBgl3A(Bgl3Awt, Bgl3A-10LC, Bgl3A-10C)は、バガス>アビセル>稲わらの順に高い比率で結合した。一方、CBMを保持しないBgl3AΔLCはいずれのセルロース系基質にもほとんど結合しなかった。よって、Bgl3Aのセルロース系基質への結合は、CBMに依存していることが分かった。また、キシラナーゼ(Xyl10A)のCBMが導入されたBgl3A-10LC及びBgl3A-10Cは、セルラーゼの固有のCBMを保持するBgl3Awtよりも、アビセルに対して約2.2倍、稲わらに対して約2.5、バガスに対して1.6~2.8倍高い結合能を示した。これらの結果は、Xyl10AのCBMがセルロース系基質への高い結合能に寄与していることを示す。
50 mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 5.1)中に、5 %(w/v)相当の水熱処理バガスと、T. cellulolyticus F09ΔcreA株の培養上清(実施例(2))および各精製Bgl3Aを添加し、50℃で24時間振とうしながら反応させた。T. cellulolyticus培養上清の添加量は5.92 mg-protein/g-バガスTSとし、各精製Bgl3Aの添加量は0.592 mg-protein/g-バガスTSとした。反応24時間後に上清を回収し、バイオッテクアナライザーAS-310(サクラエスアイ)にてグルコース濃度を測定した。その結果を表3に示す。Bgl3A添加なしの区(T. cellulolyticus培養上清のみを添加した区)と比較して各精製Bgl3A添加区(T. cellulolyticus培養上清と各精製Bgl3Aを添加した区)では生成グルコース濃度が上昇していることが認められたが、各精製Bgl3A添加区間での生成グルコース濃度に差は認められなかった。この結果は、CBMの置換または欠失によってセルロース系基質に対する糖化能が変化していないことを示している。また、この結果は、Bgl3Aのセルロース系基質に対する結合能が向上することによってセルロース系基質に対する糖化能が低下していないことも示している。以上のことから、酵素回収に有利なセルロース系基質に対する結合能の高いキメラ酵素を、セルロース系基質に対する糖化能を落とさずに構築できることが示された。
配列番号1:Talaromyces cellulolyticusのpyrF遺伝子の塩基配列
配列番号2:Talaromyces cellulolyticusのcreA遺伝子の塩基配列
配列番号3~8:プライマー
配列番号9:Talaromyces cellulolyticusのCbh1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号10:Talaromyces cellulolyticusのCbh2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号11:Talaromyces cellulolyticusのBgl3Aタンパク質のアミノ酸配列
配列番号12:Talaromyces cellulolyticusのEg5Aタンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:Talaromyces cellulolyticusのEg5X1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号14:Talaromyces cellulolyticusのEg5X2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号15:Talaromyces cellulolyticusのEg7Bタンパク質のアミノ酸配列
配列番号16:Talaromyces cellulolyticusのXyl10Aタンパク質のアミノ酸配列
配列番号17~24:プライマー
配列番号25:Talaromyces cellulolyticusのcbh1遺伝子の塩基配列
配列番号26:Talaromyces cellulolyticusのcbh2遺伝子の塩基配列
配列番号27:Talaromyces cellulolyticusのbgl3A遺伝子の塩基配列
配列番号28:Talaromyces cellulolyticusのeg5A遺伝子の塩基配列
配列番号29:Talaromyces cellulolyticusのeg5X1遺伝子の塩基配列
配列番号30:Talaromyces cellulolyticusのeg5X2遺伝子の塩基配列
配列番号31:Talaromyces cellulolyticusのeg7B遺伝子の塩基配列
配列番号32:Talaromyces cellulolyticusのxyl10A遺伝子の塩基配列
配列番号33:Bgl3A-10LCをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号34:Bgl3A-10LCのアミノ酸配列
配列番号35:Bgl3A-10Cをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号36:Bgl3A-10Cのアミノ酸配列
配列番号37:Bgl3A-ΔLCをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号38:Bgl3A-ΔLCのアミノ酸配列
Claims (19)
- キシラナーゼの糖質結合モジュールを有し、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質。
- キシラナーゼの糖質結合モジュールとセルラーゼの触媒ドメインを有するタンパク質である、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記糖質結合モジュールが、糖質結合モジュールのファミリー1に分類される糖質結合モジュールである、請求項1または2に記載のタンパク質。
- 前記糖質結合モジュールが、Xyl10Aの糖質結合モジュールである、請求項1~3のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記糖質結合モジュールが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載のタンパク質:
(a)配列番号16の375位~403位のアミノ酸配列;
(b)配列番号16の375位~403位のアミノ酸配列において、1~5個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含み、セルロース系基質に対する結合能を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号16の375位~403位のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、セルロース系基質に対する結合能を有するアミノ酸配列。 - 前記触媒ドメインが、β-グルコシダーゼの触媒ドメインである、請求項2~5のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記触媒ドメインが、グリコシドハイドロラーゼのファミリー3に分類されるセルラーゼの触媒ドメインである、請求項2~6のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記触媒ドメインが、Bgl3Aの触媒ドメインである、請求項2~7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記触媒ドメインが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のアミノ酸配列を含む、請求項2~8のいずれか1項に記載のタンパク質:
(a)配列番号11の25位~601位のアミノ酸配列;
(b)配列番号11の25位~601位のアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含み、セルラーゼ活性を有するアミノ酸配列;
(c)配列番号11の25位~601位のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、セルラーゼ活性を有するアミノ酸配列。 - 前記糖質結合モジュールと前記触媒ドメインとの間にリンカー領域を有する、請求項2~9のいずれか1項に記載のタンパク質。
- フィブロネクチンIII型様ドメインを有する、請求項2~10のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記触媒ドメインが由来するセルラーゼの固有の糖質結合モジュールを有さない、請求項2~11のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、請求項1~12のいずれか1項に記載のタンパク質:
(a)配列番号34または36に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号34または36に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質;
(c)配列番号34または36に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、セルラーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1~13のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項14に記載の遺伝子を搭載するベクター。
- 請求項14に記載の遺伝子を有する宿主。
- 細菌または真菌である、請求項16に記載の宿主。
- 請求項1~13のいずれか1項に記載のタンパク質でセルロース系基質を処理することを含む、糖化物の製造方法。
- 前記セルロース系基質が植物バイオマスである、請求項18に記載の方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019059404A1 (ja) * | 2017-09-25 | 2019-03-28 | 味の素株式会社 | タンパク質の製造法および二糖の製造法 |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010098951A (ja) * | 2008-10-21 | 2010-05-06 | Hitachi Zosen Corp | セルロース糖化酵素の簡易的回収・再利用方法 |
JP2010516296A (ja) * | 2007-01-30 | 2010-05-20 | ヴェレニウム コーポレイション | リグノセルロース性物質を処理する酵素、前記をコードする核酸並びに前記を製造及び使用する方法 |
WO2011065449A1 (ja) * | 2009-11-27 | 2011-06-03 | 三井化学株式会社 | 単糖製造方法 |
JP2014217312A (ja) * | 2013-05-08 | 2014-11-20 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Acremoniumcellulolyticus(アクレモニウム・セルロリティカス)由来のβ−グルコシダーゼ及びその利用 |
WO2016043281A1 (ja) * | 2014-09-18 | 2016-03-24 | 味の素株式会社 | セルロース系原料の酵素糖化装置 |
-
2016
- 2016-06-14 JP JP2016118330A patent/JP2019134683A/ja active Pending
-
2017
- 2017-06-14 BR BR112018074950A patent/BR112018074950A2/pt unknown
- 2017-06-14 WO PCT/JP2017/021959 patent/WO2017217453A1/ja active Application Filing
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010516296A (ja) * | 2007-01-30 | 2010-05-20 | ヴェレニウム コーポレイション | リグノセルロース性物質を処理する酵素、前記をコードする核酸並びに前記を製造及び使用する方法 |
JP2010098951A (ja) * | 2008-10-21 | 2010-05-06 | Hitachi Zosen Corp | セルロース糖化酵素の簡易的回収・再利用方法 |
WO2011065449A1 (ja) * | 2009-11-27 | 2011-06-03 | 三井化学株式会社 | 単糖製造方法 |
JP2014217312A (ja) * | 2013-05-08 | 2014-11-20 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Acremoniumcellulolyticus(アクレモニウム・セルロリティカス)由来のβ−グルコシダーゼ及びその利用 |
WO2016043281A1 (ja) * | 2014-09-18 | 2016-03-24 | 味の素株式会社 | セルロース系原料の酵素糖化装置 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
BAE, H.-J. ET AL.: "A comparative study between an endoglucanase IV and its fused protein complex Cel5-CBM6", FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 227, no. 2, 2003, pages 175 - 181, XP002405962 * |
BOMMARIUS, A. S. ET AL.: "Protein engineering of cellulases", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 29, 2014, pages 139 - 145, XP055448792 * |
ICHIKAWA, S. ET AL.: "Carbohydrate-binding modules influence substrate specificity of an endoglucanase from Clostridium thermocellum", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 80, no. 1, January 2016 (2016-01-01), pages 188 - 192, XP055448779 * |
INOUE, H. ET AL.: "Contribution of a family 1 carbohydrate-binding module in thermostable glycoside hydrolase 10 xylanase from Talaromyces cellulolyticus toward synergistic enzymatic hydrolysis of lignocellulose, Biotechnol", BIOFUELS, vol. 8, no. 1, 2015, pages 77, XP021223379 * |
WALKER, J. A. ET AL.: "Multifunctional cellulose catalysis targeted by fusion to different carbohydrate-binding modules, Biotechnol", BIOFUELS, vol. 8, no. 1, 2015, pages 220, XP055448789 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019059404A1 (ja) * | 2017-09-25 | 2019-03-28 | 味の素株式会社 | タンパク質の製造法および二糖の製造法 |
US11384379B2 (en) | 2017-09-25 | 2022-07-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing a protein and disaccharide using a Talaromyces cellulolyticus |
WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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