CN116790562A - 一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用 - Google Patents

一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶合成技术领域，涉及一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用。本发明提供了一种水解单宁合成酶，所述水解单宁合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述水解单宁合成酶能够实现水解单宁的合成，即CoSCPL3重组酶可以有效催化βG至PGG的四步反应。

Description

一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用
技术领域
本发明属于酶合成技术领域，具体涉及一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用。
背景技术
植物酰基转移酶(ATs)在许多植物代谢途径中发挥作用，特别是在多种酚类代谢途径中，促成了植物酚类化合物的多样性1，提高了植物在生物-和非生物-胁迫方面的耐受2-3。
涉及植物酚类酰基化酶类主要来源于两大酰基转移酶家族，依赖酰基辅酶A硫代酯作为酰基供体的BAHD酰基转移酶(BAHD-ATs)和依赖1-O-β-D-葡萄糖酯作为酰基供体的SCPL酰基转移酶(Serine carboxypeptidase-like proteins，SCPL-ATs)。
SCPL-ATs属于丝氨酸羧肽酶(Seinecarboxypeptidases,SCPs)大家族，是一类具有酰基转移酶活性的特殊分支(Clade 1A)。目前已报道SCPL-ATs参与了约10个物种中14种酰基衍生物的合成，包括没食子酰基-、芥子酰基-、异丁酰基-、阿魏酰-、咖啡酰-等衍生物4。
自从番茄(Lycopersiconpennellii)中发现第一个SCPL-AT以来5，SCPL-Ats的酶功能鉴定进展缓慢，迄今只有10多个植物SCPL-ATs功能被鉴定4，如拟南芥的芥子酰基胆碱转移酶(SCT)、芥子酰基花青素转移酶(SAT)、芥子酰基苹果酸转移酶(SMT)、芥子酰基芥子酸转移酶(SST)等。大量具有没食子酰基-、芥子酰基-、异丁酰基-、阿魏酰-、咖啡酰-等酰基衍生物结构的化合物合成途径和机制尚不清楚，这其中就包含水解单宁。
水解单宁广泛分布于植物界，是植物中最丰富的次生代谢物之一，参与植物抵抗植食性昆虫侵害6。水解单宁可以描述为没食子酸与中心多元醇(β-D-glucopyranose)的酯，或称为五没食子酰基葡萄糖的衍生物(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose)，主要分为两类，没食子鞣质(Gallotannins)和鞣花单宁(ellagitannins)。
但是尚没有水解单宁合成相关转移酶编码基因和功能的研究报道，这限制了植物水解单宁生物合成及调控研究。
参考文献：
1.Mugford,S.T.；Milkowski,C.,Serine carboxypeptidase-likeacyltransferases from plants.Methods Enzymol 2012,516,279-97.
2.Fraser,C.M.；Rider,L.W.；Chapple,C.,An expression and bioinformaticsanalysis of the Arabidopsis serine carboxypeptidase-like gene family.PlantPhysiol 2005,138(2),1136-48.
3.Ciarkowska,A.；Ostrowski,M.；Starzynska,E.；Jakubowska,A.,Plant SCPLacyltransferases:multiplicity of enzymes with various functions in secondarymetabolism.Phytochem Rev 2019,18(1),303-316.
4.Bontpart,T.；Cheynier,V.；Ageorges,A.；Terrier,N.,BAHD or SCPLacyltransferase？What a dilemma for acylation in the world of plant phenoliccompounds.New Phytol 2015,208(3),695-707.
5.Li,A.X.；Eannetta,N.；Ghangas,G.S.；Steffens,J.C.,Glucose polyesterbiosynthesis.Purification and characterization of a glucoseacyltransferase.Plant Physiol 1999,121(2),453-60.
6.Barbehenn,R.V.；Peter Constabel,C.,Tannins in plant-herbivoreinteractions.Phytochemistry 2011,72(13),1551-65.
发明内容
本发明的目的在于提供一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用。本发明所述水解单宁合成酶能够实现水解单宁的合成，即CoSCPL3重组酶可以有效催化βG至PGG的四步反应。
本发明提供了一种水解单宁合成酶，所述水解单宁合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述水解单宁合成酶的编码基因。
优选的是，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了所述水解单宁合成酶在合成水解单宁中的应用。
优选的是，所述水解单宁包括二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖和五没食子酰基葡萄糖。
本发明还提供了一种水解单宁的合成方法，包括以下步骤：
将没食子酰基供体底物和没食子酰基受体底物混合，在上述技术方案所述水解单宁合成酶的催化下，进行植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应，得到水解单宁。
优选的是，所述合成方法包括催化一没食子酰葡萄糖至五没食子酰基葡萄糖的四步反应。
优选的是，所述没食子酰基供体底物包括一没食子酰葡萄糖；所述没食子酰基受体底物包括一没食子酰葡萄糖、二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖或四没食子酰基葡萄糖。
优选的是，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的温度为40～50℃；所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的pH值为6.0～8.0。
本发明提供了一种水解单宁合成酶(CoSCPL3)。CoSCPL3重组酶可以有效催化βG至PGG的四步反应，即以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，分别以一没食子酰葡萄糖(βG)或二没食子酰基葡萄糖(DGG)或三没食子酰基葡萄糖(TGG)或四没食子酰基葡萄糖(TeGG)为没食子酰基受体底物，分别催化合成二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖或五没食子酰基葡萄糖。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成二没食子酰基葡萄糖结果图；
图2为本发明提供的质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成三没食子酰基葡萄糖结果图；
图3为本发明提供的质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成四没食子酰基葡萄糖结果图；
图4为本发明提供的质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成五没食子酰基葡萄糖结果图；
图5为本发明提供的CoSCPL3催化反应的最适条件的确定图。
具体实施方式
本发明提供了一种水解单宁合成酶，所述水解单宁合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：METSKQTINIPLCFRILLLLLLSHIAASSTIVTSLPGFNGTLPFSLETGYVGVGDMDDVQLFYYFVESQRNPAQDPLMLWLTGGPGCSCLSAFFYESGPVYFEFEGYKGGLPTLRLNEYTWTQRANILYVDAPVGTGFSYSESQEGYYVDDYKSAKQIYEFLRKWLKSHPEYLENNLYIGGDSYSGIIVPMLVQEIIDGNELGRQPNMNLQGYILGNPVTDSYVDDNSRIPFAHRLTLISEDLYRAAKASCNGDYVNIDNEDCELNMQAIDELILDINLIHVLEPYCGDASPRPHERKWRQRSLKEHSKDPLRLQPIGPAYFCRDYLYVLSEIWANNETVQEALNVRSGTAGVWQRCNGSLAYTKDVTSTIAYHQNLTAASLRALIYSGDHDMSVPHIGTQQWINTLNLTLSKVWRAWFVDAQVAGYVRRFTKDNYALTYATVKGAGHVAPEYKQKECYTMIDRWFAYYPL；
本发明首次公开一种水解单宁合成酶，命名为CoSCPL3(植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶)。
本发明还提供了上述技术方案所述水解单宁合成酶的编码基因。
在本发明中，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：ATGGAAACATCAAAGCAAACAATCAACATTCCACTCTGTTTTCGCATTCTTCTTCTGTTGTTGCTCTCTCACATTGCAGCCTCCAGCACCATCGTCACATCTTTACCCGGTTTTAATGGCACTCTTCCCTTCTCACTTGAGACCGGATATGTGGGTGTGGGTGACATGGATGATGTGCAGCTGTTTTACTATTTTGTGGAGTCTCAGAGGAACCCTGCTCAAGATCCTCTAATGCTTTGGCTTACCGGTGGCCCTGGCTGTTCTTGTCTATCTGCTTTCTTCTACGAAAGTGGTCCAGTATATTTCGAATTTGAGGGCTACAAAGGTGGCTTACCAACGTTGCGTTTAAACGAATATACATGGACTCAGCGCGCCAATATACTATATGTAGATGCACCTGTTGGGACTGGATTCTCTTACTCAGAATCCCAAGAAGGTTACTATGTGGATGACTATAAATCAGCAAAACAGATTTATGAATTTTTAAGAAAGTGGTTGAAGAGCCATCCTGAATATTTGGAAAATAATCTATACATTGGCGGCGATTCTTATTCAGGCATAATAGTACCAATGCTCGTTCAAGAGATCATCGATGGTAATGAATTGGGAAGGCAGCCAAATATGAACCTTCAAGGATATATTCTTGGAAATCCAGTGACAGATTCATATGTTGATGACAATTCAAGAATTCCATTTGCTCATAGGCTAACACTTATTTCTGAGGACCTGTATCGGGCAGCAAAAGCAAGTTGCAATGGTGATTATGTGAATATAGATAATGAAGATTGTGAATTAAATATGCAAGCCATTGATGAGTTGATCCTAGACATAAATTTGATACATGTTTTGGAACCTTATTGTGGGGACGCATCCCCAAGACCACATGAGCGAAAATGGCGTCAAAGATCTCTCAAAGAGCACTCTAAAGATCCCCTCCGCTTACAACCTATTGGTCCTGCATATTTTTGCCGGGATTACCTTTATGTTCTCTCCGAGATATGGGCAAATAACGAGACTGTCCAAGAAGCTCTCAATGTTCGATCGGGGACAGCAGGAGTTTGGCAGAGATGCAATGGCAGCTTAGCTTATACAAAGGATGTAACAAGTACTATCGCTTATCATCAGAATCTAACTGCAGCTTCCCTCCGAGCTTTGATATACAGTGGTGATCATGATATGTCAGTTCCACACATCGGTACTCAACAATGGATTAATACTCTAAATTTGACTCTGAGTAAAGTTTGGCGAGCATGGTTTGTCGATGCTCAAGTTGCAGGATATGTGAGGAGGTTTACAAAAGACAATTATGCTTTGACGTATGCAACTGTGAAGGGGGCAGGTCATGTAGCTCCAGAATACAAGCAAAAGGAATGTTACACCATGATCGATAGGTGGTTTGCTTATTATCCTCTGTAA。本发明从油茶鲜叶中分离获得上述如SEQ ID NO.2所示的参与水解单宁合成的基因，该基因编码一种酰基转移酶(水解单宁合成酶)，所述酰基转移酶可以有效催化从βG至PGG的水解单宁合成的关键四步反应，即以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基受体底物，合成二没食子酰基葡萄糖(DGG)；或以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以二没食子酰基葡萄糖(DGG)为没食子酰基受体底物，合成三没食子酰基葡萄糖(TGG)；或以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以三没食子酰基葡萄糖(TGG)为没食子酰基受体底物，合成四没食子酰基葡萄糖(TeGG)；或以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以四没食子酰基葡萄糖(TeGG)为没食子酰基受体底物，催化合成五没食子酰基葡萄糖。
本发明还提供了所述水解单宁合成酶在合成水解单宁中的应用。
在本发明中，所述水解单宁优选包括二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖和五没食子酰基葡萄糖中的一种或两种以上。具体的，在本发明中，经鉴定，所述二没食子酰基葡萄糖为1,6-O-二没食子酰基葡萄糖。在本发明中，经鉴定，所述四没食子酰基葡萄糖为1,2,3,6-O-四没食子酰基葡萄糖。在本发明中，经鉴定，所述五没食子酰基葡萄糖为1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖。
在本发明中，所述没食子酰基供体底物优选包括一没食子酰葡萄糖；所述没食子酰基受体底物优选包括一没食子酰葡萄糖、二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖或四没食子酰基葡萄糖。
本发明还提供了一种水解单宁的合成方法，包括以下步骤：
将没食子酰基供体底物和没食子酰基受体底物混合，在上述技术方案所述水解单宁合成酶的催化下，进行植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应，得到水解单宁。
在本发明中，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的反应体系中添加的水解单宁合成酶优选为水解单宁合成酶的重组酶粗酶液。在本发明中，所述重组酶粗酶液的制备方法包括以下步骤：克隆水解单宁合成酶的编码基因，将所述编码基因连T载体，转入大肠杆菌，测序正确后提取质粒。将所述质粒酶切，将水解单宁合成酶基因连接到pCAMBIA1305载体上，转化大肠杆菌，提取质粒，转化农杆菌。在本发明中，所述农杆菌优选为农杆菌感受态GV3101(pSoup19)。之后，本发明优选将所述农杆菌注射到本氏烟叶片中，在本氏烟叶片瞬时表达基因CoSCPL3。之后，本发明优选提取本氏烟叶片瞬时表达的CoSCPL3重组酶。所述提取方法优选包括以下步骤：取本氏烟叶片进行研磨，离心，收集上清液按照硫酸铵溶液饱和度表沉淀蛋白，加入硫酸铵，离心，收集沉淀。使用磷酸盐缓冲液溶解，离心，收集上清液，得到重组酶粗酶液。
在本发明中，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应优选在PBS缓冲液中进行。在本发明中，所述PBS优选为50mM的PBS缓冲液。在本发明中，所述PBS的pH值优选为6.0～8.0，更优选为7.0。在本发明中，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的温度为40～45℃，优选为45℃；所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的pH值优选为6.0～7.0。在本发明中，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的时间为3h。在本发明中，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应后，优选还包括用甲醇终止酶反应，12000rpm(10cm离心转子)离心去除沉淀，取上清液，所述上清液中含有水解单宁。上清液中的水解单宁，采取LC-MS方法进行检测和分析。
本发明的水解单宁合成酶可以有效催化从βG至PGG的水解单宁合成的关键四步反应。即以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基受体底物，合成二没食子酰基葡萄糖(DGG)；或以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以二没食子酰基葡萄糖(DGG)为没食子酰基受体底物，合成三没食子酰基葡萄糖(TGG)；或以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以三没食子酰基葡萄糖(TGG)为没食子酰基受体底物，合成四没食子酰基葡萄糖(TeGG)；或以一没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以四没食子酰基葡萄糖(TeGG)为没食子酰基受体底物，催化合成五没食子酰基葡萄糖。在本发明实施例中，每一步反应的反应体系，优选以总反应体系100μl计，包括50mM PBS，30μg CoSCPL3重组酶粗酶液，0.4mM没食子酰基供体底物(一没食子酰葡萄糖(βG))和0.4mM没食子酰基受体底物(一没食子酰葡萄糖(βG)或二没食子酰基葡萄糖(DGG)或三没食子酰基葡萄糖(TGG)或四没食子酰基葡萄糖(TeGG))，40～45℃水浴反应3h后，用等体积的甲醇终止酶反应，12000rpm离心20min(10cm直径转子)，充分去除沉淀，吸取50μl上清液至进样瓶中，收集的上清液即为酶反应产物。在本发明中，所述反应的过程优选加入维生素C，所述维生素C对植物体外水解单宁的合成反应具有保护作用。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种水解单宁合成酶和编码基因及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.克隆基因CoSCPL3
本发明根据油茶鲜叶转录组数据库基因注释信息，筛选得到1条在油茶鲜叶中表达量较高的SCPL基因，命名为油茶的CoSCPL3，利用Primer Premier 5.0软件设计ORF框上下游引物序列(Co3-ORF-F：ATGGAAACATCAAAGCAAAC(SEQ ID NO.3)；Co3-ORF-R：TTACAGAGGATAATAAGCAAAC(SEQ ID NO.4))。以油茶鲜叶cDNA为模板，利用TaKaRa公司的PrimerStar高保真聚合酶混合液进行PCR扩增，高保真反应体系25μl，高保真酶混合液11μl，cDNA模板0.5μl，上下游引物各1μl，ddH2O补齐至25μl；反应条件：98℃变性10s，62℃退火20s，72℃延伸45s，循环30次；72℃稳定6min，16℃结束。利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，并切取符合预测分子量的PCR条带。
连T载体测序：吸取2μl PCR扩增产物，0.5μl pEASY-Blunt Simple载体，吹打混匀轻微离心，水浴25℃反应15min。反应结束后加连接产物与25μl大肠杆菌Trans-T1混合，轻弹混匀，置于冰上冰浴30min，42℃水浴热激1min，置于冰上2min，加入200μl液体LB培养基，37℃摇床摇1h，将菌液均匀涂布在含50μg/mL卡那霉素抗生素的平板上，37℃培养箱倒置培养12h，挑取单菌落进行划线扩大培养，后进行PCR验证。菌落PCR验证总体系为12μl，其中包含2×Rapid Taq DNAmaster Mix 6μl，上述ORF框上下游引物各0.5μl，挑取单菌落，水补齐到12μl。菌落PCR反应程序：95℃热启动3min；95℃热变性15s，55℃退火15s，72℃延伸45s，循环30次；72℃稳定6min，6℃结束。利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，选择PCR鉴定为阳性的单菌落送公司测序，测序正确后，摇菌提质粒并-80℃保菌。
2.本氏烟叶片瞬时表达基因CoSCPL3的体系
构建载体：第一步，设计并合成接头引物。上游引物为GTCCGGAGCTAGCTCTAGAATGGAAACATCAAAGCAAAC(SEQ ID NO.5)。下游引物为CTTGCTCACCATGGATCCTTACAGAGGATAATAAGCAAAC(SEQ ID NO.6)。第二步，载体酶切。反应总体系为50μl：上述制备的携带CoSCPL3基因质粒1500ng，限制性XbaI和BamHI内切酶各1μl，Buffer 5μl，用灭菌去离子水补足至50μl，轻弹混匀轻微离心，37℃水浴过夜酶切，然后利用琼脂糖凝胶电泳分析酶切效果，并回收目的条带。第三步，酶切产物与pCAMBIA1305载体连接。反应总体系5μl：空载体质粒20ng，酶切产物10ng，反应缓冲液1μl，重组酶0.5μl，无菌水补齐至5μl，吹打均匀轻微离心，37℃反应30min。利用按照上述热激法将重组质粒转化大肠杆菌Trans-T1感受态，Amp+抗性的培养基筛选转化成功菌株，37℃培养箱培养12h后，挑取单菌落进行PCR验证，正确条带的单菌落，挑菌送公司测序。测序正确后摇菌提质粒，获得pCAMBIA1305-CoSCPL3融合质粒，将融合质粒按照实验室常规方法转化农杆菌感受态GV3101(pSoup19)，利用Rif和Kan+抗性培养基筛选阳性菌株。
本氏烟叶片瞬时表达基因CoSCPL3：活化上述农杆菌菌液，扩大培养20ml，待菌体在600nm波长下OD值约为1时，离心收集菌体，菌体用MES缓冲液重新悬浮3次后调整其OD600值范围在0.6～0.8，利用注射器将菌液注射到30天叶龄的本式烟叶片中。对照组用菌为不含CoSCPL3基因的农杆菌。对照组和处理组本氏烟暗培养一夜，后置于人工气候室培养3天。3天后收集对照组和处理组叶片放入自封袋，液氮冷冻后保存于-80℃冰箱。
3.提取本氏烟叶片瞬时表达的CoSCPL3重组酶
将本氏烟叶片置于加入液氮的冰盒中储存，而后放于预冷的研钵中充分研磨，加入等量的PVPP继续研磨，其间需一直加入液氮保持低温状态，待叶片研磨成粉后加入15mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0，内含0.15MNaCl)，使缓冲液均匀覆盖已磨好的本氏烟粉末，置于冰上等待约30min后化冻。化冻后继续置于冰上研磨7min，待磨成匀浆状后，将其全部转移至50ml离心管中，6500rpm，10℃低温离心10min，收集上清至新的50ml离心管中，用磷酸盐缓冲液定容至20ml，按照硫酸铵溶液饱和度表沉淀蛋白，根据体积比加入85％的硫酸铵后横置于冰上，用脱色摇床快速摇动使上清与硫酸铵充分混合3h，沉淀0～85％的蛋白，6500rpm 10℃低温离心10min收集沉淀。根据得到的沉淀量，用适量0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.0，内含0.15M NaCl)充分溶解沉淀，12000rpm，10℃低温离心10min收集上清液，此时的上清液即为提取的重组酶粗酶液，用于酶活检测及后续实验。
4.CoSCPL3酶活检测方法
酶活检测方法：为了确定重组蛋白的功能，将本氏烟叶片的粗蛋白使用如下反应体系进行酶活检测：总反应体系100μL，包括含30μg CoSCPL3重组酶的粗酶液(利用市售考马斯亮蓝试剂盒测定，粗酶液中总蛋白的含量为30μg)，0.4mM没食子酰基供体底物(1-O-没食子酰葡萄糖(βG))和0.4mM没食子酰基受体底物(1-O-没食子酰葡萄糖(βG)或1,6-O-二没食子酰基葡萄糖(DGG)或1,3,6-O-三没食子酰基葡萄糖(TGG)或1,2,3,6-O-四没食子酰基葡萄糖(TeGG))，4mM维生素C，用50mM PBS(pH6.0)溶液补齐反应溶液体积至100μL，40℃水浴反应3h后，用等体积的甲醇终止酶反应，12000rpm离心20min(10cm直径转子)，充分去除沉淀，吸取50μl上清液至进样瓶中，收集的上清液即为酶反应产物。酶反应产物用以下LC-MS方法检测分析。每个反应进行三次生物学重复。对照组酶液为空载转化本式烟提取的粗酶液。对照组反应体系除酶液不同以外，其他试剂和操作与处理组相同。
5.酶活产物的质谱分析(LC-MS分析)：安捷伦6545型Q-TOF-LC/MS液质联用仪系统，流动相A相为0.4％乙酸水，B相为100％乙腈，柱子型号Poroshell HPH-C18 column(2.7μm,4.6×100mm)，检测器波长设置280nm，340nm和520nm，进样量5μl，梯度洗脱方法从0～10min，B相从0.1％升至7％；10～22min，B相7％不变；22～25min，B相升至11％；25～30min，B相升至12％；30～31min，B相升至14％；31～43min，B相升至35％；43～45min，B相升至80％；45～47min，B相降至0.1％；47～52min，B相维持在0.1％平衡，共计52min，流速0.2ml/min，柱温40℃。质谱条件为电喷雾离子源，正/负离子模式，采集质荷比在79-1700的化合物，干燥气流速：8L/min，干燥气温度：325℃，雾化器压力45psi，毛细管电压3500V。根据标准品和特征离子碎片对产物峰进行分析和定量。
实施例2
1.CoSCPL3酶催化底物βG合成DGG
在实施例1所述方法中提到的水解单宁合成体外酶反应，以1-O-没食子酰葡萄糖(βG)为没食子酰基供体底物，以βG为没食子酰基受体底物，以本式烟叶片表达的CoSCPL3重组酶为反应酶开展体外酶活实验。
结果表明：在实验处理组酶反应体系中，通过LC-MS检测到了两个明显的酶产物峰(图1中的B)。根据对比标准品色谱图(图1中的D)，确定其中一个产物为1,6-O-二没食子酰基葡萄糖(1,6-DGG)。另一个产物峰，根据质谱鉴定化合物质核比信息(m/z483.0768)(图1中的E)，鉴定为二没食子酰基葡萄糖(DGG)，但因缺乏参考标准品，尚不能确定具体分子结构。而不含CoSCPL3酶对照反应体系(空载对照)中未检测到DGG产物峰(图1中的A)。综上所述，说明CoSCPL3重组酶催化βG合成了DGG。
图1为质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成二没食子酰基葡萄糖结果图。其中，(A)添加空载体转基因烟草叶片提取酶的酶反应体系，即不含油茶CoSCPL3的酶反应体系，其他反应条件和B组实验组一致；(B)含CoSCPL3重组酶的粗酶反应体系；(C)水解单宁对照标准化合物1-O-没食子酰葡萄糖(βG)、二没食子酰基葡萄糖(1,6-DGG)质谱图；(D)酶产物DGG的二级质谱鉴定图；(E)1,6-DGG化合物生物合成途径示意图。EIC(331，483)是LC-MS负离子模式下βG、DGG化合物的质核比[M-H]。酶反应底物为βG。
2.CoSCPL3酶催化底物βG和DGG合成TGG
在实施例1所述方法方案中提到的水解单宁合成体外酶反应，以βG为酰基供体底物，以1,6-O-二没食子酰基葡萄糖(1,6-DGG)为没食子酰基受体底物，以本式烟叶片表达的CoSCPL3重组酶为反应酶开展体外酶活实验。
结果表明：在实验处理组酶反应体系中，通过LC-MS检测到了一个明显的酶产物峰(图2中的B)。根据产物母离子(m/z 635.086)和子离子信息(m/z169.0137,465.0667)，确定该产物为一种三没食子酰基葡萄糖(TGG)。图2的C提供了1,3,6-TGG标准品质谱图。通过比对图2中的C，图2中的B酶反应产物TGG，并非1,3,6-TGG，因缺乏参考标准品，尚不能确定具体分子结构。而不含CoSCPL3酶对照反应体系(空载对照)中未检测到TGG产物峰(图2中的A)。综上所述，说明CoSCPL3重组酶催化底物βG合和DGG合成了TGG。
图2为质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成三没食子酰基葡萄糖结果图。其中，(A)添加空载体转基因烟草叶片提取酶的酶反应体系，即不含油茶CoSCPL3的酶反应体系，其他反应条件和B组实验组一致；(B)含CoSCPL3重组酶的粗酶反应体系；(C)水解单宁对照标准化合物1,6-二没食子酰基葡萄糖(1,6-DGG)、1-O-1,3,6-三没食子酰葡萄糖(1,3,6-TGG)质谱图；(D)酶产物TGG的二级质谱鉴定图。EIC(483，635)是LC-MS负离子模式下DG、TGG化合物的质核比[M-H]。酶反应底物为βG和1,6-DGG。
3.CoSCPL3酶催化底物βG和TGG合成TeGG
在实施例1所述方法方案中提到的水解单宁合成体外酶反应，以βG为没食子酰基供体底物，以1-O-1,3,6-三没食子酰葡萄糖(1,3,6-TGG)为没食子酰基受体底物，以本式烟叶片表达的CoSCPL3重组酶为反应酶开展体外酶活实验。
结果表明：在实验处理组酶反应体系中，通过LC-MS检测到了一个明显的酶产物峰(图3中的B)。根据产物母离子(m/z 787.0926)和子离子信息(m/z169.0137，465.0641，617.0749)，确定该产物为一种四没食子酰基葡萄糖(TeGG)。通过进一步比对标准物质谱信息(图3中的D)，确定该产物为1,2,3,6-O-四没食子酰基葡萄糖(1,2,3,6-TeGG)。而不含CoSCPL3酶对照反应体系(空载对照)中未检测到TeGG产物峰(图3中的A)。综上所述，说明CoSCPL3重组酶催化底物βG和TGG合成了TeGG。
图3为质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成四没食子酰基葡萄糖结果图。其中，(A)添加空载体转基因烟草叶片提取酶的酶反应体系，即不含油茶CoSCPL3的酶反应体系，其他反应条件和B组实验组一致；(B)含CoSCPL3重组酶的粗酶反应体系；(C)水解单宁对照标准化合物1-O-1,3,6-三没食子酰葡萄糖(1,3,6-TGG)、1,2,3,6-O-四没食子酰基葡萄糖(1,2,3,6-TeGG)质谱图；(D)酶产物TeGG的二级质谱鉴定图；(E)1,2,3,6-TeGG化合物生物合成途径示意图。EIC(635、787)是LC-MS负离子模式下TGG、TeGG化合物的质核比[M-H]。酶反应底物为βG和1,3,6-TGG。
4.CoSCPL3酶催化底物βG和TeGG合成PGG
在实施例1所述方法方案中提到的水解单宁合成体外酶反应，以βG为没食子酰基供体底物，以1,2,3,6-O-四没食子酰基葡萄糖(1,2,3,6-TeGG)为没食子酰基受体底物，以本式烟叶片表达的CoSCPL3重组酶为反应酶开展体外酶活实验。
结果表明：在实验处理组酶反应体系中，通过LC-MS检测到了一个明显的酶产物峰(图4中的B)。根据产物母离子(m/z 939.1033)和子离子信息(m/z169.0129,617.0746)，确定该产物为一种五没食子酰基葡萄糖(PGG)。通过进一步比对标准物质谱信息(图4中的D)，确定该产物为1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖(PGG)。而不含CoSCPL3酶对照反应体系(空载对照)中未检测到PGG产物峰(图4中的A)。综上所述，说明CoSCPL3重组酶催化底物βG和TeGG合成了PGG。
图4为质谱鉴定CoSCPL3重组酶催化合成五没食子酰基葡萄糖结果图。其中，(A)添加空载体转基因烟草叶片提取酶的酶反应体系，即不含油茶CoSCPL3的酶反应体系，其他反应条件和B组实验组一致；(B)含CoSCPL3重组酶的粗酶反应体系；(C)水解单宁对照标准化合物1,2,3,6-O-四没食子酰基葡萄糖(1,2,3,6-TeGG)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖(1,2,3,4,6-PGG)质谱图；(D)酶产物PGG的二级质谱鉴定图；(E)1,2,3,4,6-PGG化合物生物合成途径示意图。EIC(787、939)是LC-MS负离子模式下TeGG、PGG化合物的质核比[M-H]。图中红色峰为酶活产物峰，黑色峰为底物峰。酶反应底物为βG和1,2,3,6-TeGG。
综合1～4的实验结果表明：CoSCPL3重组酶可以有效催化βG至PGG的四步反应，该四步反应是水解单宁合成关键四个阶段的反应途径。
实施例3
CoSCPL3酶活催化最适反应条件的确定
为了进一步了解CoSCPL3酶催化特性。本发明以βG为反应底物，研究确定了CoSCPL3反应的最适pH和最适温度。由图可知，CoSCPL3蛋白催化合成1,6-DGG的最适pH范围为7.0，最适温度范围为45℃(图5)。
图5为CoSCPL3催化反应的最适条件的确定图。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种水解单宁合成酶，其特征在于，所述水解单宁合成酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述水解单宁合成酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.权利要求1所述水解单宁合成酶在合成水解单宁中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水解单宁包括二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖、四没食子酰基葡萄糖和五没食子酰基葡萄糖中的一种或两种以上。
6.一种水解单宁的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
将没食子酰基供体底物和没食子酰基受体底物混合，在权利要求1所述水解单宁合成酶的催化下，进行植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应，得到水解单宁。
7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括催化一没食子酰葡萄糖至五没食子酰基葡萄糖的四步反应。
8.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述没食子酰基供体底物包括一没食子酰葡萄糖；所述没食子酰基受体底物包括一没食子酰葡萄糖、二没食子酰基葡萄糖、三没食子酰基葡萄糖或四没食子酰基葡萄糖。
9.根据权利要求6或7所述的合成方法，其特征在于，所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的温度为40～50℃；所述植物丝氨酸羧肽酶样酰基转移反应的pH值为6.0～8.0。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102719413A (zh) * 2012-04-28 2012-10-10 中山大学 一种新型单宁酶及其应用
CN104878025A (zh) * 2015-06-01 2015-09-02 安徽农业大学 一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因及其编码蛋白和应用
CN115806953A (zh) * 2022-10-26 2023-03-17 武汉轻工大学 一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT基因及其克隆表达与应用
CN116240198A (zh) * 2023-03-22 2023-06-09 云南师范大学 一种新型单宁酶及其应用
CN116254243A (zh) * 2023-03-14 2023-06-13 中国科学院华南植物园 花青苷糖基转移酶和酰基转移酶及其编码基因和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102719413A (zh) * 2012-04-28 2012-10-10 中山大学 一种新型单宁酶及其应用
CN104878025A (zh) * 2015-06-01 2015-09-02 安徽农业大学 一种没食子酰葡萄糖基转移酶CsUGT84A22基因及其编码蛋白和应用
CN115806953A (zh) * 2022-10-26 2023-03-17 武汉轻工大学 一种没食子酸1-β-葡萄糖基转移酶TbUGGT基因及其克隆表达与应用
CN116254243A (zh) * 2023-03-14 2023-06-13 中国科学院华南植物园 花青苷糖基转移酶和酰基转移酶及其编码基因和应用
CN116240198A (zh) * 2023-03-22 2023-06-09 云南师范大学 一种新型单宁酶及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GONG, W.等: "Serine carboxypeptidase-like 18 [Camellia lanceoleosa]", NCBI数据库, 14 September 2022 (2022-09-14), pages 1 - 2 *

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