RU2809554C1 - Трансформант дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий линалоол - Google Patents
Трансформант дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий линалоол Download PDFInfo
- Publication number
- RU2809554C1 RU2809554C1 RU2022130691A RU2022130691A RU2809554C1 RU 2809554 C1 RU2809554 C1 RU 2809554C1 RU 2022130691 A RU2022130691 A RU 2022130691A RU 2022130691 A RU2022130691 A RU 2022130691A RU 2809554 C1 RU2809554 C1 RU 2809554C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lipolytica
- gene
- linalool
- encoding
- plasmid
- Prior art date
Links
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 title claims abstract description 51
- CDOSHBSSFJOMGT-UHFFFAOYSA-N linalool Chemical compound CC(C)=CCCC(C)(O)C=C CDOSHBSSFJOMGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 239000001490 (3R)-3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol Substances 0.000 title claims abstract description 21
- CDOSHBSSFJOMGT-JTQLQIEISA-N (R)-linalool Natural products CC(C)=CCC[C@@](C)(O)C=C CDOSHBSSFJOMGT-JTQLQIEISA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 21
- 229930007744 linalool Natural products 0.000 title claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 101710195549 (S)-beta-macrocarpene synthase Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 244000298800 Actinidia arguta Species 0.000 claims abstract description 8
- 101150071502 ERG12 gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 240000001829 Catharanthus roseus Species 0.000 claims abstract description 6
- 101150084791 HMGR1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 235000016416 Actinidia arguta Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 101710158485 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101710125754 Farnesyl pyrophosphate synthase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108700040132 Mevalonate kinases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 claims abstract description 4
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 102100035111 Farnesyl pyrophosphate synthase Human genes 0.000 claims abstract description 3
- GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N Geranyl diphosphate Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/COP(O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N 0.000 claims abstract description 3
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 claims abstract description 3
- 102000002678 mevalonate kinase Human genes 0.000 claims abstract 2
- 101150082921 LIS gene Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 2
- 101150031251 ERG2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 52
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 8
- 101150084072 ERG20 gene Proteins 0.000 description 8
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- -1 hydroxy methyl-CoA Chemical compound 0.000 description 5
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 101001079635 Solanum tuberosum 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase 1 Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- CDOSHBSSFJOMGT-SNVBAGLBSA-N (S)-linalool Chemical compound CC(C)=CCC[C@](C)(O)C=C CDOSHBSSFJOMGT-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022259 Mevalonate kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 2
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 2
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100215634 Yarrowia lipolytica (strain CLIB 122 / E 150) XPR2 gene Proteins 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 2
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 2
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical group [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026105 3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100024088 40S ribosomal protein S7 Human genes 0.000 description 1
- IZSRJDGCGRAUAR-MROZADKFSA-N 5-dehydro-D-gluconic acid Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O IZSRJDGCGRAUAR-MROZADKFSA-N 0.000 description 1
- 108010006229 Acetyl-CoA C-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710190443 Acetyl-CoA carboxylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100039239 Amidophosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 101100119888 Arabidopsis thaliana FDM2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100434663 Bacillus subtilis (strain 168) fbaA gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021334 Bcl-2-related protein A1 Human genes 0.000 description 1
- 101001042041 Bos taurus Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102100023441 Centromere protein J Human genes 0.000 description 1
- 241000430885 Chromohalobacter sp. 560 Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 101150023395 DGA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100174653 Dictyostelium discoideum g6pd-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150099000 EXPA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 101100507308 Enterococcus faecalis mvaS gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100029095 Exportin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101150095274 FBA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150081655 GPM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028652 Gamma-enolase Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102100036669 Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000690200 Homo sapiens 40S ribosomal protein S7 Proteins 0.000 description 1
- 101000924474 Homo sapiens Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 101000907924 Homo sapiens Centromere protein J Proteins 0.000 description 1
- 101001058231 Homo sapiens Gamma-enolase Proteins 0.000 description 1
- 101001072574 Homo sapiens Glycerol-3-phosphate dehydrogenase [NAD(+)], cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 101000599886 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101100084403 Homo sapiens PRODH gene Proteins 0.000 description 1
- 101000987700 Homo sapiens Peroxisomal biogenesis factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000600189 Homo sapiens Peroxisomal membrane protein PEX16 Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000741885 Homo sapiens Protection of telomeres protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000693082 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase 11-interacting protein Proteins 0.000 description 1
- 101100054598 Hordeum vulgare ACL1.2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002284 Hydroxymethylglutaryl-CoA Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010000775 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase Proteins 0.000 description 1
- 101150067473 IDP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111679 ILV5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- 102100039905 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 102100037845 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710122479 Isocitrate lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100027665 Isopentenyl-diphosphate Delta-isomerase 1 Human genes 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000856710 Microbacterium paludicola Species 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150059359 POX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150053659 POX4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029577 Peroxisomal biogenesis factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100037479 Peroxisomal membrane protein PEX16 Human genes 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100028772 Proline dehydrogenase 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100038745 Protection of telomeres protein 1 Human genes 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101100119348 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) EXP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100382243 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YAT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101100269618 Streptococcus pneumoniae serotype 4 (strain ATCC BAA-334 / TIGR4) aliA gene Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150085516 ZWF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100029251 Zea mays PER2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N beta-D-glucosamine Chemical compound N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-QZABAPFNSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N beta-melibiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O1 DLRVVLDZNNYCBX-ZZFZYMBESA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 108700002148 exportin 1 Proteins 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 239000005454 flavour additive Substances 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 101150084612 gpmA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150046722 idh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- YAFQFNOUYXZVPZ-UHFFFAOYSA-N liproxstatin-1 Chemical compound ClC1=CC=CC(CNC=2C3(CCNCC3)NC3=CC=CC=C3N=2)=C1 YAFQFNOUYXZVPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N melezitose Chemical compound O([C@@]1(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O)CO)CO)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QWIZNVHXZXRPDR-WSCXOGSTSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 101150063973 tdh1 gene Proteins 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- 101150078419 zwf gene Proteins 0.000 description 1
- 101150026856 zwf2 gene Proteins 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен трансформант дрожжей Y. lipolytica, продуцирующий монотерпеноид линалоол, содержащий в составе хромосомы, по крайней мере, по одной копии каждого из следующих генов, ген HMGR1 Y. lipolytica, кодирующий 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктазу, ген ERG12 Y. lipolytica, кодирующий мевалонаткиназу, модифицированный ген ERG2F88W-N119W Y. lipolytica, кодирующий фарнезилпирофосфатсинтазу, кодон-оптимизированный ген CrGPPS Catharanthus roseus, кодирующий фермент геранилпирофосфат синтазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, и кодон-оптимизированный ген LIS Actinidia arguta, кодирующий линалоолсинтазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2. Также предложен штамм дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-5015, продуцирующий линалоол. Изобретение обеспечивает повышение продукции линалоола. 2 н.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 7 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области метаболической инженерии и биотехнологии и может быть использовано для получения продуцента линалоола с помощью дрожжей Yarrowia lipolytica.
Уровень техники
Yarrowia lipolytica являются одними из наиболее изученных не конвенциональных дрожжей, способных продуцировать важные метаболиты. В литературе (например, [1]) они рассматривают как клеточные фабрики для целого ряда производств, а в США имеют статус GRAS (в целом считаются безопасными) [2]. На данный момент дрожжи Y. lipolytica используются для промышленного производства двух видов пищевых и кормовых добавок: каротиноидов и масел, богатых полиненасыщенными жирными кислотами [3].
Линалоол - монотерпеноид с широким спектром биологической активности. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (США) линалоол признан безопасным (имеет статус GRAS) в качестве синтетического вкусового вещества и добавки в пищевых продуктах для человека, а также в качестве ингредиента в медицине и пищевых продуктах для животных [4]. Линалоол может находить применение в качестве ароматизатора и консерванта в косметических средствах, и антибактериального, противогрибкового или противовоспалительного средства в медицине.
Наиболее значимый результат в конструировании штамма-продуцента линалоола был получен на бактериях Pantoea ananatis [5]. Авторами во главе с Nitta был сконструирован генетически модифицированный штамм, в котором разрушен эндогенный оперон crtEXYIB-crtZ, отвечающий за синтез каротиноидов, делетирован нативный ген глюкозодегидрогеназы GCD и экспрессированны гены ацетил-КоА ацетилтрансферазы/гидрокси метил-КоА редуктазы mvaE и гидроксиметилглутарил-КоА синтазы mvaS из Enterococcus faecalis; мевалонат киназы MVK M. paludicola; линалоол синтазы LIS Actinidia arguta и линалоол синтазы A. arguta слитой с галофильной β-лактамазой из Chromohalobacter sp.560 с гексагистидином на N-конце, повышающий растворимость фермента в организме хозяина. В этом же исследовании при скрининге линалоол синтаз было выявлено, что LIS A. arguta оказывает наиболее положительное влияние на продукцию линалоола [6]. В периодической «двухфазной» ферментации с подпиткой, сконструированный штамм накапливал 10.9 г/л (S)-линалоола в ферментере. Однако, бактерии Р. ananatis являются патогенными для сельскохозяйственных культур и лесных пород деревьев, а также способны инфицировать человека [7].
Максимальный титр линалоола, полученный на сегодняшний день на рекомбинантных дрожжах Y. lipolytica, при ферментации в колбах составляет 6.96 мг/л [8]. Данный результат достигнут при использовании штамма, полученного путем сверхэкспрессии нативных генов 3-гидрокси-3-метилглютарил-КоА редуктазы HMGR1, изопентенилдифосфат дельта-изомеразы IDI1 и мутантного варианта гена фарнезилпирофосфатсинтазы с двумя аминокислотными заменами ERG20F88W-N119W и гетерологичной экспрессии кодон-оптимизированного для Y. lipolytica гена линалоол синтазы LIS A. arguta.
Технической проблемой, на решение которой направлено представленное изобретение является расширение арсенала микроорганизмов, продуцирующих линалоол.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом является получение трансформанта дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий линалоол.
Для достижения технического результата предложен Трансформант дрожжей Y. lipolytica, продуцирующий монотерпеноид линалоол, содержащий в составе хромосомы, по крайней мере, по одной копии каждого из следующих генов, ген HMGR1 Y. lipolytica, кодирующий 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктазу, ген ERG12 Y. lipolytica, кодирующий мевалонаткиназу, модифицированный ген ERG20F88W-N119W Y. lipolytica, кодирующий фарнезилпирофосфатсинтазу, кодон-оптимизированный ген CrGPPS Catharanthus roseus, кодирующий фермент геранилпирофосфат синтазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1 и кодон-оптимизированный ген LIS Actinidia arguta, кодирующий линалоолсинтазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.
Поставленная задача решена также тем, что предложен штамм дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-5015 - продуцент линалоола.
Конструирование экспрессионных кассет при получении трансформанта дрожжей осуществляют стандартными методами генетической инженерии [9] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами рода Yarrowia. В качестве промоторов могут быть использованы АСС1, ACL2, DGA1, GAPDH, GAPDHin, GPAT, GPD1, GPM1, ENO2, ЕХР1, EYD1, EYK1, FBA1, FBA1in, FASα, FASβ, HP4D, ICL1, IDH1, IDH2, IDP2, ILV5, LEU2, LEUm, PGK1, POT1, POX2, POX4, RPS7, TDH1, TEF1, TEFin, XPR2, YAT1,ZWF [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16].
В качестве терминаторов транскрипции могут быть использованы Асо3, CYC1, Guo, LIP1, LIP2, РЕХ3, РЕХ16, РЕХ20, РНO5, TEF1, ScADH1, ScPGK1, ScENO2, Tsynth2, Tsynth7, Tsynth8, Tsynth10, Tsynth22, Tsynth27, Tsynth30, XPR2 [15, 17, 18, 19, 16].
Введение генов может быть осуществлено как хромосомальной, так и эписомальной интеграцией, в качестве сайтов для гомологичной интеграции могут быть использованы последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей рода Yarrowia. В целях повышения эффективности экспрессии мРНК с интегрированных последовательностей при трансляции предпочтительно использовать гетерологичные гены, кодон-оптимизированные для дрожжей Y. lipolytica.
Трансформацию экспрессионной кассеты в клетки дрожжей Y. lipolytica осуществляют любым подходящим способом, в частности, методом электоропорации [20] или методом с использованием ацетата лития [21].
Краткое описание чертежей
фиг. 1 Схема экспрессионной кассеты IntF1-PTEFin-HMGR1
фиг. 2 Схема экспрессионной кассеты IntD4-PTEFin-ERG12
фиг. 3 Схема экспрессионной кассеты IntA2-PTEFin-ERG20F88W-N119W
фиг. 4 Схема экспрессионной кассеты IntB1-PTEFin-ERG20F88W-N119W
фиг. 5 Схема экспрессионной кассеты IntE12-PTEFin-LIS
фиг. 6 Схема экспрессионной кассеты IntE16-PTEFin-LIS
фиг. 7 Схема экспрессионной кассеты IntC14-PTEFin-LIS
фиг. 8 Схема экспрессионной кассеты IntC3-PTEFin-CrGPPS
Осуществление изобретения
Пример 1. Получение нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1
Здесь и далее все гетерологичные гены кодон-оптимизируют для Y. lipolytica с помощью онлайн программы GenSmart™ [22].
Укороченную (начиная со второго метионина (Met100)) версию гена CrGPPS С.roseus [23] кодон-оптимизируют и синтезируют в виде плазмиды pT-IntC3-CrGPPS (синтез осуществлен компанией «Twist Bioscience Corporation)) (США). С синтезированной плазмиды pT-IntC3-CrGPPS амплифицируют нуклеотидную последовательность по праймерам:
Полученную нуклеотидную последовательность очищают после электрофореза в 1% агарозном геле и секвенируют по праймерам CrGPPS-F/CrGPPS-R. Полученная последовательность приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.
Пример 2. Интеграция гена HMGR1 Y. lipolytica, кодирующего фермент 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктазу, в геном штамма-реципиента.
В качестве штамма-реципиента используют штамм линии W29 Y. lipolytica ВКПМ Y-4620 [25].
Конструируют экспрессионную плазмиду pARS-IntF1-TEFin-HMGR1, содержащую ген HMGR1 для интеграции в локус IntF1 на хромосоме F (положение 3863884-3865837 пн) с помощью CRISPR-Cas9 системы. Плазмиду pARS-IntF1-TEFin-HMGR1 получают на базе вспомогательной плазмиды pARS-IntF1-PromTerm-Cm, которую получают путем сборки 7 фрагментов по методу Гибсона.
Фрагмент 1 с фланком Up к локусу IntF1 (IntF1-Up) амплифицируют с геномной ДНК штамма Y. lipolytica W29 с помощью праймеров:
Фрагмент 2 с терминатором хрr2 (Тхрr2) амплифицируют с геномной ДНК штамма Y. lipolytica W29 с помощью праймеров:
Фрагмент 3 с промотером TEFin (PromTEFin) получают путем обработки вектора pTEFin-uno [24] эндонуклеазами рестрикции NheI и BpiI и очищают после электрофореза в 1% агарозном геле.
Фрагмент 4 с геном устойчивости к хлорамфениколу (Cm) амплифицируют с плазмиды pMW-att-Cm [25, С.39] с помощью праймеров:
Фрагмент 5 с терминатором teƒ (Ttef) амплифицируют с геномной ДНК штамма Y. lipolytica W29 с помощью праймеров:
Фрагмент 6 с фланком Down к локусу IntF1 (IntF1-Down) амплифицируют с геномной ДНК штамма Y. lipolytica W29 с помощью праймеров:
Фрагмент 7 получают обработкой вектора pARS-Cre-reverse (RU 2539744) эндонуклеазами рестрикции SacI и PvuII, очищают после электрофореза в 1% агарозном геле, обрабатывают Pfu-полимеразой для получения тупых концов.
После реакции сборки по Гибсону, смесь фрагментов трансформируют в Е. coli XL 1 (Blue). Плазмидную ДНК, выделенную из полученных клонов, проверяют рестрикционным анализом.
Для получения экспрессионной плазмиды pARS-IntF1-TEFin-HMGR1 фрагмент HMGR1 амплифицируют с геномной ДНК штамма Y. lipolytica W29 с помощью праймеров:
Вспомогательную плазмиду pARS-IntF1-PromTerm обрабатывают эндонуклеазой рестрикции AarI, очищают после электрофореза в 1% агарозном геле, обрабатывают щелочной фосфатазой для удаления 5'- и 3'-фосфатных групп с концов ДНК. Полученный фрагмент собирают методом Гибсона с ПЦР-фрагментом HMGR1 с получением плазмиды pARS-IntF1-TEFin-HMGR1.
Вспомогательную плазмиду pCNR-sgIntF1 для осуществления интеграции гена HMGR1 посредством CRISPR-Cas9 системы редактирования генома конструируют с помощью олигонуклеотида
на базе разработанной эписомальной плазмиды pCasNA-RK (Addgene ID: 175708) методом рекомбиниринга [25, С. 33].
Линеаризованный фрагмент ДНК IntF1-PTEFin-HMGRl (фиг. 1) получают путем обработки плазмиды pARS-IntF1-TEFin-HMGR1 эндонуклеазой рестрикции SmiI и используют совместно со вспомогательной кольцевой плазмидой pCNR-sgIntF1 для ко-трансформации штамма-реципиента Y. lipolytica ВКПМ Y-4620.
Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, сахароза - 1, агар - 1, вода - остальное) с добавлением нурсеотрицина (0,025 мас. %) по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину.
У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Получают трансформант 1 с кассетой IntF1-PTEFin-HMGR1, интегрированной в локус IntF1 на хромосоме F.
Пример 3. Интеграция гена ERG12 Y. lipolytica, кодирующего мевалонаткиназу
Интеграцию гена осуществляют в трансформант 1, полученный в примере 2.
Конструируют экспрессионную плазмиду pARS-IntD4-TEFin-ERG72, содержащую ген ERG12 для интеграции в локус IntD4 на хромосоме D (положение 1038596 - 1039926 пн) с помощью CRISPR-Cas9 системы. Плазмиду pARS-IntD4-TEFin-ERG12 получают на базе вспомогательной плазмиды pARS-IntD4-PromTerm-Cm. Плазмиду pARS-IntD4-PromTerm-Cm конструируют путем сборки 7 фрагментов по методу Гибсона. Все фрагменты получают с помощью ПЦР как описано в примере 1, за исключением фрагментов 1 и 6, получение которых описано ниже.
Фрагмент 1 (IntD4-UP) амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с использованием праймеров:
Фрагмент 6 (IntD4-Down) амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с использованием праймеров:
Ген ERG12 амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с помощью праймеров:
Плазмиду pARS-IntD4-PromTerm-Cm обрабатывают эндонуклеазой рестрикции AarI, очищают после электрофореза в 1% агарозном геле, обрабатывают щелочной фосфатазой для удаления 5'- и 3'-фосфатных групп с концов ДНК. Полученный фрагмент собирают по методу Гибсона с ПЦР-фрагментом ERG 12 с получением плазмиды pARS-IntD4-TEFin-ERG12.
Вспомогательную плазмиду pCNR-sgIntD4 для осуществления интеграции гена ERG12 с помощью CRISPR-Cas9 системы конструируют с помощью олигонуклеотида
на базе разработанной эписомальной плазмиды pCNR-RK методом рекомбиниринга.
Линеаризованный фрагмент ДНК IntD4-PTEFin-ERG12 (фиг. 2) получают путем обработки плазмиды pARS-IntD4-TEFin-ERG12 эндонуклеазой рестрикции SmiI и используют совместно с вспомогательной кольцевой плазмидой pCNR-sgIntD4 для ко-трансформации трансформанта 1 (пример 2). Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Получают трансформант 2 с кассетой IntD4-PTEFin-ERG12, интегрированной в локус IntD4 на хромосоме D.
Пример 4. Интеграция мутантного гена ERG20F88W-N119W Y. lipolytica, кодирующего фарнезил пирофосфат синтазу
Интеграцию гена осуществляют в трансформант 2, полученный в примере 3. Для этого конструируют экспрессионную плазмиду pARS-IntA2-ERG20F88W-N119W, содержащую мутированный вариант гена ERG20 Y. lipolytica с двумя заменами аминокислот F88W и N119W для интеграции в локус IntA2 на хромосоме А (положения 221472 -222858 п.н.) с помощью CRJSPR-Cas9 системы. Плазмиду pARS-IntA2-ERG20F88W-N119W получают на базе вспомогательной плазмиды pARS-IntA2-Prom-term. Плазмиду pARS-IntA2-Prom-term конструируют путем сборки 7 фрагментов по методу Гибсона. Все фрагменты получают с помощью ПЦР как описано в примере 1, за исключением фрагментов 1 и 6, получение которых описано ниже.
Фрагмент 1 (IntA2-UP) амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с использованием праймеров:
фрагмент 6 (IntA2-Down) амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с использованием праймеров:
Фрагмент fromTEFin-ERG20F88W-N119W-toTtef получают амплификацией с синтезированного в Twist Bioscience Corporation фрагмента ERG20F88W-N119W с использованием пар праймеров:
Полученный фрагмент fromTEFin-ERG20F88W-N119W-toTtef и плазмиду pARS-IntA2-Prom-term расщепляют эндонуклеазой рестрикции AarI и собирают методом Гибсона в единую плазмиду pARS-IntA2-ERG20F88W-N119W.
Вспомогательную плазмиду pCNR-sgIntA2 для осуществления интеграции гена ERG20F88W-N119W с помощью CRISPR-Cas9 системы конструируют с помощью олигонуклеотида
на базе разработанной эписомальной плазмиды pCNR-RK методом рекомбиниринга.
Линеаризованный фрагмент IntA2-ERG20F88W-N119W (фиг.3) получают путем обработки плазмиды pARS-IntA2-ERG20F88W-N119W эндонуклеазой рестрикции SmiI и ко-трансформируют совместно с вспомогательной плазмидой pCNR-sgIntA2 в трансформант 2 (пример 3).
Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Получают трансформант 3 с кассетой IntA2-ERG20F88W-N119W, интегрированной в локус IntA2 на хромосоме А.
Далее в полученный трансформант 3 осуществляют интеграцию второй копии гена ERQ20F88W-N119W. Для этого конструируют экспрессионную плазмиду pARS-IntB1-ERG20F88W-N119W, содержащую мутированный вариант гена ERG20 Y. lipolytica с двумя заменами аминокислот F88W и N119W для интеграции в локус IntB1 на хромосоме В (положения 118362 - 119703 п.н.) с помощью CRISPR-Cas9 системы. Плазмиду pARS-IntB1-ERG20F88W-N119W получают на базе вспомогательной плазмиды pARS-IntB1-Prom-term. Плазмиду pARS-IntB1-Prom-term конструируют путем сборки 7 фрагментов по методу Гибсона. Все фрагменты получают с помощью ПНР как описано в примере 1, за исключением фрагментов 1 и 6, получение которых описано ниже.
Фрагмент 1 (InB1-UP) амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с использованием праймеров:
фрагмент 6 (IntB1-Down) амплифицируют с геномной ДНК штамма W29 Y. lipolytica с использованием праймеров:
Фрагмент fromTEFin-ERG20F88W-N119W-toTtef и плазмиду pARS-IntB1-Prom-term расщепляют AarI, собирают методом Гибсона в единую плазмиду pARS-IntB1-ERG20F88W-N119W.
Вспомогательную плазмиду pCNR-sgIntB1 для осуществления интеграции гена ERG20F88W-N119W с помощью CRJSPR-Cas9 системы конструируют с помощью олигонуклеотида
на базе разработанной эписомальной плазмиды pCNR-RK методом рекомбиниринга.
Линеаризованный фрагмент IntB1-PTEFin-ERG20F88W-N119W (фиг. 4) получают путем обработки плазмиды pARS-IntBl-ERG20F88W-N119W эндонуклеазой рестрикции SmiI и ко-трансформируют совместно с вспомогательной плазмидой pCNR-sgIntB1 в трансформант 3 (пример 4). Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Получают трансформанты 4 с кассетой IntB1-PTEFin-ERG20F88W-N119W, интегрированной в локус IntB1 на хромосоме В.
Пример 5. Интеграция гена LIS Actinidia arguta, кодирующего линалоол синтазу
Интеграцию гена осуществляют в трансформант 4, полученный в примере 4. Для этого плазмиду pT-flIntE12-LIS, содержащую кодон-оптимизированный ген LIS из A. Argute (LIS, GenBank ID: GQ338153.1) для интеграции в хромосому Е (в положение 2831926 - 2833196 п. н.) с использованием CRISPR-Cas9 системы, синтезируют Twist Bioscience Corporation.
Линеаризованный фрагмент IntE12-PTEFin-LIS (фиг.5) получают обработкой плазмиды pT-flIntE12-LIS эндонуклеазой рестрикции SmiI и ко-трансформируют совместно с вспомогательной плазмидой pCNR-sgIntE12 (Addgene ID: 175636) в трансформант 4 (пример 5). Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Получают трансформант 5 с кассетой IntE12-PTEFin-LIS, интегрированной в локус IntE12 на хромосоме Е.
Далее в полученный трансформант 5, осуществляют интеграцию второй копии гена LIS. Для этого плазмиду pT-flIntE16-LIS, содержащую кодон-оптимизированный ген LIS из A. argute для интеграции в хромосому Е (в положение 3975493 - 3976833 п. н.) с использованием CPISPR-Cas9 системы, синтезируют Twist Bioscience Corporation.
Линеаризованный фрагмент IntE16-PTEFin-LIS (фиг.6) получают обработкой плазмиды pT-flIntE16-LIS эндонуклеазой рестрикции Smil и ко-трансформируют совместно с вспомогательной плазмидой pCNR-sgIntE16 (Addgene ID: 175637) в трансформант 5 (пример 6). Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Получают трансформант 6 с кассетой IntE16-PTEFin-LIS, интегрированной в локус IntE16 на хромосоме Е.
Далее в полученный трансформант 6, осуществляют интеграцию третьей копии гена LIS. Для этого плазмиду pT-IntC14-LIS, содержащую кодон-оптимизированный ген LIS из A. argute для интеграции в хромосому С (в положение 3133312 - 3135244 п.н.) с использованием CRISPR-Cas9 системы, синтезируют Twist Bioscience Corporation.
Линеаризованный фрагмент IntC14-PTEFin-LIS (фиг.7) получают обработкой плазмиды pT-flIntC14-LIS эндонуклеазой рестрикции Smil и ко-трансформируют совместно с вспомогательной плазмидой pCNR-sgIntC14 (Addgene ID: 175634) в трансформант 6 (пример 7). Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Отбирают трансформант 7 с кассетой IntC14-PTEFin-LIS, интегрированной в локус IntC14 на хромосоме С.
Пример 6. Интеграция гена CrGPPS Catharanthus roseus, кодирующего геранилпирофосфат синтазу
Интеграцию гена осуществляют в трансформант 7, полученный в примере 5. Вспомогательную плазмиду pCNR-sgIntC3 для осуществления интеграции гена CrGPPS с помощью CRISPR-Cas9 системы конструируют с помощью олигонуклеотида
TCGATGGGCCCCCGGTTCGATTCCGGGTCGGCGCAACTAACGCAGGAT CAAGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC (IntC3b-20bp-N) на базе разработанной эписомальной плазмиды pCNR-RK методом рекомбиниринга.
Линеаризованный фрагмент IntC3-PxEFin-CrGPPS (фиг. 8) получают обработкой плазмиды pT-IntC3-CrGPPS эндонуклеазой рестрикции SmiI и ко-трансформируют совместно с вспомогательной плазмидой pCNR-sgIntC3 в трансформант 7 (пример 8).
Трансформанты отбирают на среде YPSuc Nat по устойчивости к антибиотику нурсеотрицину. У трансформантов изолируют геномную ДНК и проводят ПЦР-анализ на правильность интеграции генетической кассеты по праймерам:
Отбирают трансформант 8 с кассетой IntC3-PTEFin-CrGPPS, интегрированной в локус IntC3 на хромосоме С. Отобранный трансформант депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» (117545 Москва, 1-ый Дорожный пр-д, д. 1) как штамм дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-5015.
Признаки штамма дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-5015
Культурально-морфологические признаки
Суточная культура в жидкой YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 1, глюкоза - 2, вода - остальное) среде представлена овальными, удлиненно-овальными, округлыми клетками размером 4,6-6,0×4,5-12,5 мкм. Почкование полярное или латеральное, на узком основании. К третьим суткам большинство клеток почкуются и образуют истинный и псевдомицелий.
При росте в жидкой среде YPD при 28°C в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. Колонии на мальтоагаре (возраст 1 неделя) белого цвета, пастообразные, слегка приподнятые в центре, морщинистые, с фестончатым краем. Штрих на мальтоагаре непрерывный, плоский, блестящий, белого цвета, пастообразный, края ровные, со временем становится складчатым. Спор не образует.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: сахарозу, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты, жирные кислоты и алканы. Не растет в безвитаминной среде, требует присутствия в среде тиамина, не требует биотина.
Оптимальное значение рН для роста 5,5-7,0. Не растет при 37°С. Максимальная температура роста 35°С. Разжижает желатин. Гидролизует мочевину.
Пример 7. Культивирование штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-5015 в колбах.
Культивирование штамма ВКПМ Y-5015 осуществляют в жидкой среде YPSuc9 (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 1, сахароза - 9, вода - остальное) в колбах (750 мл) с рабочим объемом 50 мл при 28°С и постоянном перемешивании (275 об/мин) в течение 5 суток с добавлением 5 мл изопропилмиристата на 2 сутки культивирования.
В качестве образца сравнения при культивировании используют трансформант 7 - предшественник штамма ВКПМ Y-5015 (отличающийся отсутствием гена CrGPPS).
После культивирования проводят экстракцию линоола, для чего в среду культивирования добавляют 2.5 мл изопропилмиристата. Полученный раствор перемешивают (200 об/мин) в течение 1 часа и центрифугируют. Концентрацию линалоола в органической фазе определяют с помощью системы ГХ/МС на приборе «Маэстро» (Interlab) (ГХ Agilent 7820А и МСД 5977, Agilent Technologies). Условия газохроматографического разделения: температура колонки: начальная 70°С в течение 2 мин и нагрев до 260°С со скоростью 15 град/мин; затем нагрев до 320°С со скоростью 30 град/мин и выдержкой при 320°С в течение 1 минуты. Газ-носитель - гелий. Ввод пробы с разделенным на 1/5 газом-носителем. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования 35-300 а.е. масс. Температура испарителя - 270°С. Температура интерфейса - 280°С, температура квадруполя - 150°С, источника -230°С. Ионизация электронным ударом, энергия ионизации 70 эВ. Объем вводимого образца: 1 мкл. К 130 мкл гексана добавляли 20 мкл навески изопропилмиристата (разведение в 7.5 раза).
Результаты культивирования трансформанта 7 и штамма ВКПМ Y-5015 приведены в табл. 1.
Полученные результаты показывают, что введение гена CrGPPS С. roseus в геном дрожжей Y. lipolytica позволяет получить повышение продукции линалоола в 2 раза.
Таким образом, продукция линалоола, образующаяся при культивировании штамма ВКПМ Y-5015, в 2,3 раза превосходит результат ранее описанных на дрожжах Y. lipolytica (6.96 мг/л) [8].
1. Miller K.K., Alper Н.S. (2019). Appl Microbiol Biotechnol, 103(23-24), 9251-9262. doi: 10.1007/s00253-019-10200-х
2. Groenewald M., Boekhout Т., et al. (2014). Crit Rev Microbiol, 40(3), 187-206. doi: 10.3109/1040841 X.2013.7703 86
3. Madzak C. (2021). J Fungi (Basel), 7(7). doi:10.3390/jof7070548
4. Haque I., Bashar A. Khalipha R., et al. (2021). International Journal of Evergreen Scientific Research. 03 (02), 105-118.
5. Nitta N., Tajima Y., et al. (2021). Microb Cell Fact, 20(1), 54. doi:10.l186/s12934-021-01543-0
6. Hoshino Y., Moriya M., et al. (2020). J Biotechnol, 324, 21-27. doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.09.021
7. Coutinho T.A., Venter S. (2009). Molecular Plant Pathology 10(3), 325-335N. doi:10.1111/J.1364-3703.2009.00542.X
8. Cao X., Wei L.J., et al. (2017). Bioresour Technol, 245(Pt B), 1641-1644. doi: 10.1016/j.biortech.2017.06.105
9. Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch E. Molecular Cloning: Laboratory Mannual, 2nd edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
10. Park Y.K., Korpys P., et al. (2019). FEMS Yeast Res, 79(1). doi: 10.1093/femsyr/foy 105
11. Kamineni A., Chen S., et al. (2020). FEMS Yeast Res, 20(5). doi: 10.1093/femsyr/foaa035
12. US 20060115881
13. Madzak C., Treton В., et al. (2000). JMol Microbiol Biotechnol, 2(2), 207-216.
14. Tai M., Stephanopoulos G. (2013). Metab Eng, 15, 1-9. doi:10.1016/j.ymben.2012.08.007
15. Darvishi F., Ariana M., et al. (2018). Appl Microbiol Biotechnol, 7(92(14), 5925-5938. doi: 10.1007/s00253 -018-9099-x
16. https://www.researchsquare.com/article/rs-1570357/v1
17. Curran, K.A., Morse, N.J., Markham, K.A., Wagman, A.M., Gupta, A., & Alper, H.S. (2015). ACS Synth Biol, 4(1), 824-832. doi:10.1021/sb5003357
18. Larroude M., Park Y.K., et al. (2019). Microb Biotechnol, 12(6), 1249-1259. doi:10.1111/1751-7915.13427
19. EP 2 649 887 В1
20. Yeast Metabolic Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 2014, 1152, 43-62. doi: 10.1007/978-1-4939-0563-8_3
21. Berardi E., Thomas D.Y. (1990) Current Genetics 18, 169-170. doi:10.1007/BF00312606
22. https://www.genscript.com/gensmart-free-gene-codon-optimization.html
23. Rai A., Smita S. S. et al. (2013). Mol Plant, 6(5), 1531-1549. doi:10.1093/mp/sst058
24. RU 2713124
25. Taratynova M.O., Kosikhina Y.M. et al. (2021). Biotekhnologiya, 37, 29-41. doi:10.21519/0234-2758-2021-37-3-29-41
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="en"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"
fileName="Yarrowia lipolytica, linalool_SEQ_ID1_2.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"
productionDate="2022-09-27">
<ApplicantFileReference>PCT/IB2022/99999</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>64738</ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">НИЦ «Курчатовский институт»
</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>NRC Kurchatov Institute</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Трансформант дрожжей Yarrowia
lipolytica, продуцирующий линалоол.</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>963</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..963</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yarrowia lipolytica</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtcgtcgcagaagtccccaaattagccagcgcagcagaatactttttca
agctgggcgttgagggcaagcgattccgacccaccgtccttctgctcatggccactgccatcgacgcccc
catcagtcgaactccccccgacacttcccttgacaccctgtccaccgagctgcgactccgacagcagtcc
attgccgagattactgagatgattcatgtggcttctctgttgcatgacgacgtgttggacgacgctgaga
ctcgacggggcattggctctctcaacttcgttatgggcaacaagctcgctgtcctcgcgggcgacttcct
gctgtctcgggcgtgtgttgcgctggcgtcgctaaagaacaccgaggttgttagcctactagcgaccgtt
gtcgaacatctggtcaccggcgaaaccatgcagatgaccaccactagcgaccagcggtgttccatggagt
actacatgcagaaaacctactacaagacagcgtccctgatttccaactcctgtaaggctattgctctgct
cgctggccagacctccgaggtcgccatgctcgcctacgagtacggcaagaacctcggcctcgccttccag
ctcattgacgacgtcctcgacttcaccggaacttcggcctcgctcggaaagggatccctctccgacattc
ggcatggaattgtcactgctcccattctgttcgctattgaggagttccccgagctgcgagctgtggtgga
cgagggattcgagaacccctacaacgtggacctggccctgcattaccttggaaagtcccgaggaatccag
cgaacacgagagcttgccatcaagcatgccaacctggcctctgacgccatcgactctctgcccgtgaccg
acgatgagcatgtcctccgatctcgacgagccctcgtcgagctcacccagcgagtcatcacccgacgaaa
gtag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1722</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1722</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Yarrowia lipolytica</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctctttcaaccgattctgcgtgtcctccctgctggctcccaacaact
ctccccagatctccaacgctccccgatctaccgctgtgccctccatgcccaccacccagaagtggtctat
taccgaggacctggccttcatctctaacccctccaagcagcacaaccaccagaccggctaccgaattttc
tccgacgagttctacctgaagcacgagaacaagctcaaggacgtccgacgagccctgcgagaggtggagg
agactcccctggagggcctcgtcatgattgacaccctgcagcgactcggtatcgactaccacttccaggg
agagattggagctctgctccagaagcagcagcgaatctctacctgcgactaccccgagcacgacctgttc
gaggtgtccacccgattccgactgctccgacaggagggtcacaacgtccccgccgacgtgttcaacaact
tccgagacaaggagggacgattcaagtctgagctgtcccgagacattcgaggtctgatgtccctctacga
ggcttcccagctgtccattcagggcgaggacatcctcgaccaggccgctgacttctcctctcagctgctc
tctggttgggctaccaacctggaccaccaccaggcccgactggtccgaaacgctctcacccacccctacc
acaagtccctcgccaccttcatggctcgaaacttcaactacgactgtaagggccagaacggttgggtcaa
caacctccaggagctcgccaagatggacctgaccatggtgcagtctatgcaccagaaggaggtcctccag
gtgtcccagtggtggaagggacgaggtctggctaacgagctgaagctcgtgcgaaaccagcccctgaagt
ggtacatgtggcctatggccgctctcaccgaccctcgattctctgaggagcgagtcgagctgaccaagcc
catctccttcatctacatcattgacgacatcttcgacgtgtacggaaccctcgaggagctgaccctcttc
accgacgccgtcaaccgatgggagctgaccgctgtggagcagctccctgactacatgaagatctgcttca
aggccctgtacgacatcaccaacgagattgcttacaagatctacaagaagcacggacgaaaccccattga
ctctctccgacgaacctgggcctccctgtgtaacgctttcctcgaggaggccaagtggttcgcttctggc
aacctgcccaaggccgaggagtacctcaagaacggtatcatttcctctggaatgcacgtcgtgaccgtcc
acatgttcttcctgctcggcggttgtttcaccgaggagtccgtcaacctggtggacgagcacgccggtat
cacctcctctatcgctaccattctgcgactctctgacgacctcggatccgccaaggacgaggaccaggac
ggatacgacggctcttacctggagtgctacctcaaggaccacaagggttcctctgtcgagaacgcccgag
aggaggtcatccgaatgatttccgacgcttggaagcgactgaacgaggagtgcctgtttcccaacccctt
ctctgccaccttccgaaagggatccctgaacatcgctcgaatggtgcccctcatgtactcttacgacgac
aaccacaacctgcccattctcgaggagcacatgaaaaccatgctgtacgactcctcttcctaa</INSDS
eq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (2)
1. Трансформант дрожжей Y. lipolytica, продуцирующий монотерпеноид линалоол, содержащий в составе хромосомы, по крайней мере, по одной копии каждого из следующих генов, ген HMGR1 Y. lipolytica, кодирующий 3-гидрокси-3-метилглютарил-кофермент А редуктазу, ген ERG12 Y. lipolytica, кодирующий мевалонаткиназу, модифицированный ген ERG2F88W-N119W Y. lipolytica, кодирующий фарнезилпирофосфатсинтазу, кодон-оптимизированный ген CrGPPS Catharanthus roseus, кодирующий фермент геранилпирофосфат синтазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1, и кодон-оптимизированный ген LIS Actinidia arguta, кодирующий линалоолсинтазу, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.
2. Штамм дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-5015 - продуцент линалоола.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2809554C1 true RU2809554C1 (ru) | 2023-12-12 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819537C1 (ru) * | 2023-12-19 | 2024-05-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент линалоола |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2015151182A (ru) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения изопреноидного соединения |
| US20220213513A1 (en) * | 2019-04-05 | 2022-07-07 | Biomedican, Inc. | Production of cannabinoids |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2015151182A (ru) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | Адзиномото Ко., Инк. | Способ получения изопреноидного соединения |
| US20220213513A1 (en) * | 2019-04-05 | 2022-07-07 | Biomedican, Inc. | Production of cannabinoids |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CAO X. ET AL. Enhancing linalool production by engineering oleaginous yeast Yarrowia lipolytica. Bioresour Technol. 2017 Dec; 245 (Pt B): 1641-1644. doi: 10.1016/j.biortech.2017.06.105. * |
| HOSHINO Y. ET AL. Stereospecific linalool production utilizing two-phase cultivation system in Pantoea ananatis. J Biotechnol. 2020 Dec 20; 324:21-27. doi: 10.1016/j.jbiotec.2020.09.021. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819537C1 (ru) * | 2023-12-19 | 2024-05-21 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент линалоола |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Multicopy integrants of crt genes and co-expression of AMP deaminase improve lycopene production in Yarrowia lipolytica | |
| US9476082B2 (en) | Method of producing isoprenoid compounds in yeast | |
| CN112831427B (zh) | 一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用 | |
| CA3137451A1 (en) | Methods and cells for microbial production of phytocannabinoids and phytocannabinoid precursors | |
| KR102170444B1 (ko) | 세포 소기관이 변이된 재조합 효모 및 이를 이용한 아이소프레노이드 생산 방법 | |
| CN106459949A (zh) | 补身醇合酶及生产补身醇的方法 | |
| CN110760453B (zh) | 一种高产乙酸苯乙酯的基因工程酵母菌株及其构建方法和生产乙酸苯乙酯的方法 | |
| CN115873836B (zh) | 一种橙花叔醇合成酶及应用 | |
| CN112646760B (zh) | 生产肌醇的工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN108998383B (zh) | 一种产芳樟醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用 | |
| Wang et al. | Enzyme and metabolic engineering strategies for biosynthesis of α-farnesene in Saccharomyces cerevisiae | |
| RU2809554C1 (ru) | Трансформант дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующий линалоол | |
| KR100701319B1 (ko) | 라이코펜 생산능이 향상된 대장균 및 그를 이용한 라이코펜의 생산방법 | |
| CN109628448B (zh) | 基于酿酒酵母crispr文库的工业酿酒酵母抗逆性改造 | |
| CN114525215B (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
| CN114426983B (zh) | 敲除谷氨酸棒杆菌中转录调控因子Ncgl0580生产5-氨基乙酰丙酸的方法 | |
| CN108949788B (zh) | 番茄红素合成相关基因及其应用 | |
| RU2794980C1 (ru) | Модифицированная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, обладающий активностью фитоен синтазы и геранилгеранилпирофосфат синтазы (варианты), ее использование при конструировании трансформантов дрожжей Yarrowia lipolytica, продуцирующих каротиноиды | |
| TWI290175B (en) | A method for promoting growth of gene recombinant cell and enhancing production of target gene product | |
| CN114672425B (zh) | 产α-古巴烯的重组酿酒酵母及其应用 | |
| RU2819537C1 (ru) | Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент линалоола | |
| CN115197954B (zh) | 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途 | |
| KR102646404B1 (ko) | 레티노익산의 미생물 생합성 | |
| CN118222600A (zh) | 一种基因工程菌及其制备方法和在合成花青素中的应用 | |
| CN114989996A (zh) | 一种产对羟基苯甲酸甲酯的基因工程菌及其应用 |