JP2010057517A - リコンビナーゼ発現細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡを提供することに在る。
【解決手段】酵母由来ＦＬＰをコードする塩基配列において、ＦＬＰ蛋白質のアミノ酸をコードするコドンを置換することにより、酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更されることによる、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡが得られる。
【選択図】なし
【解決手段】酵母由来ＦＬＰをコードする塩基配列において、ＦＬＰ蛋白質のアミノ酸をコードするコドンを置換することにより、酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更されることによる、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡが得られる。
【選択図】なし
Description
本発明は、リコンビナーゼ発現細胞およびかかる細胞を用いる組換えウイルスベクターの作製方法に関する。
動物細胞への遺伝子導入用または遺伝子治療用のウイルスベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス等が用いられている。これらのウイルスベクターを遺伝子治療に用いる場合、その安全性の観点から、ウイルスにコードされる蛋白質がなるべく発現しない構造のベクターが望まれている。
レトロウイルスベクターにおいては、ウイルスの増殖に必要なすべての蛋白質を供給するウイルス産生細胞が樹立されている。一方、アデノウイルスベクターやヘルペスウイルスベクターでは、ウイルスにコードされる蛋白質の種類の多さおよびその蛋白質の細胞毒性の問題から、ウイルスの複製に必要なすべての蛋白質を供給するウイルス産生細胞は樹立されていない。その代替法として、これらのウイルスベクター作製においては、ヘルパーウイルスを使用する方法が用いられている。その方法は、目的の遺伝子を挿入したベクター側のウイルスは、ウイルスの増殖に必須の遺伝子の一部またはすべてを除いてあるため、ベクター単独では増殖できないが、ヘルパーウイルスからウイルスの増殖に必要なウイルス蛋白質を供給することにより、ヘルパーウイルスとともにベクターも増殖させるというものである。このヘルパーウイルスを用いる方法により、アデノウイルスベクター（非特許文献１）やヘルペスウイルスベクター（非特許文献２）が作製されている。
ヘルパーウイルスを用いるウイルスベクター作製法での課題の一つは、目的ウイルスベクターに対してヘルパーウイルスの量をいかに減らすかという点である。そのため、アデノウイルスベクターでは、パッケージング配列の変異株由来のヘルパーウイルスを用いてヘルパーウイルスＤＮＡのウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）へのパッケージング効率を下げ、ヘルパーウイルスの増殖速度を遅くした工夫や（非特許文献３）、ヘルパーウイルスのパッケージング配列の両側にリコンビナーゼＣｒｅの認識配列であるｌｏｘＰ配列を挿入し、このヘルパーウイルスをリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞に感染させることによりパッケージング配列を除く工夫（非特許文献４）等がなされている。
特に、後者の方法において、リコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞は重要であり、Ｃｒｅを恒常的に発現するいくつかの細胞株が報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。しかし、リコンビナーゼＣｒｅは、動物細胞に対して細胞毒性を有するため、恒常的にＣｒｅを発現する細胞株は樹立できるものの、高発現プロモーターの制御下にＣｒｅを大量に発現する安定な細胞株は樹立しにくいと考えられている（非特許文献８）。
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Lieber et. al., J. Virol. Vol.70. 8944-8960 (1996)
Lieber et. al. J. Virol. Vol.70. 8944-8960 (1996)
本発明の目的は、種々のウイルスベクターの作製のために用いる、Ｃｒｅを高発現する細胞を提供することにある。本発明のさらなる目的は、かかる細胞を使用して、より効率的な組換えウイルスベクターの作製方法を提供することにある。
Ｃｒｅ蛋白質に限らず、細胞毒性を有する蛋白質を恒常的に発現する細胞株を樹立しようとする場合、一般に高発現プロモーター下流に当該蛋白質遺伝子を組み込んだプラスミド等で細胞を形質転換しても、当該蛋白質を高レベルで安定に発現する細胞株は得にくく、当該蛋白質の毒性が細胞にとって許容レベル以下の量の蛋白質を発現する細胞株しか得られないことが多い。
一方、薬剤等により蛋白質の発現を誘導するプロモーターも知られている。しかし、一般にこのような誘導型のプロモーターは、恒常的に発現する強力なプロモーターに較べれば、そのプロモーター活性は弱いことが知られている。
Ｃｒｅ蛋白質に限らず、細胞毒性を有する蛋白質を恒常的に発現する細胞株を樹立しようとする場合、一般に高発現プロモーター下流に当該蛋白質遺伝子を組み込んだプラスミド等で細胞を形質転換しても、当該蛋白質を高レベルで安定に発現する細胞株は得にくく、当該蛋白質の毒性が細胞にとって許容レベル以下の量の蛋白質を発現する細胞株しか得られないことが多い。
一方、薬剤等により蛋白質の発現を誘導するプロモーターも知られている。しかし、一般にこのような誘導型のプロモーターは、恒常的に発現する強力なプロモーターに較べれば、そのプロモーター活性は弱いことが知られている。
そこで、本発明者らは、強力なプロモーターからＣｒｅ蛋白質を発現する安定な細胞株を得るための手段として、プロモーターとＣｒｅ遺伝子との間にリコンビナーゼＦＬＰの認識配列およびスタッファーＤＮＡを挿入することにより、Ｃｒｅ蛋白質の発現を制御することに成功した。この細胞株は、リコンビナーゼＦＬＰが存在しない場合にはＣｒｅ蛋白質がほとんど発現しないため、Ｃｒｅの細胞毒性が回避でき、ＦＬＰ存在下では強力なプロモーターからＣｒｅ蛋白質が高発現する。
すなわち、本発明の要旨は、
（１）リコンビナーゼＦＬＰの存在下でＦＬＰ依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞、
（２）前記（１）記載の細胞に、リコンビナーゼＦＬＰを導入することによりリコンビナーゼＣｒｅを発現させる方法、
（３）リコンビナーゼＦＬＰの存在下でＦＬＰ依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞を用いることを特徴とする、組換えウイルスベクターの製造方法、
（４）前記（２）および前記（３）記載の方法を用いた組換えアデノウイルスベクターの製造方法、
ならびに
（５）酵母由来ＦＬＰをコードする塩基配列において、ＦＬＰ蛋白質のアミノ酸をコードするコドンを置換することにより、酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更されることによる、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡ、
に関する。
（１）リコンビナーゼＦＬＰの存在下でＦＬＰ依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞、
（２）前記（１）記載の細胞に、リコンビナーゼＦＬＰを導入することによりリコンビナーゼＣｒｅを発現させる方法、
（３）リコンビナーゼＦＬＰの存在下でＦＬＰ依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞を用いることを特徴とする、組換えウイルスベクターの製造方法、
（４）前記（２）および前記（３）記載の方法を用いた組換えアデノウイルスベクターの製造方法、
ならびに
（５）酵母由来ＦＬＰをコードする塩基配列において、ＦＬＰ蛋白質のアミノ酸をコードするコドンを置換することにより、酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更されることによる、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡ、
に関する。
本発明により、組換えウイルスベクター、特に、組換えアデノウイルスベクターの製造に有用な細胞が提供される。本発明により、組換えウイルスベクターの製造が効率的に行なわれ、遺伝子治療の分野で利用可能な組換えウイルスベクターの供給が容易になる。更に、本発明により、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
本発明において、「リコンビナーゼＦＬＰ」とは、酵母(Saccharomyces cerevisiae)の２ミクロンＤＮＡによりコードされ、２つのＦＬＰの認識配列（ＦＲＴ）間の部位特異的組換え反応を行なう酵素である（Babineau et. al.,J. Biol. Chem., Vol. 260, 12313-12319 (1985)) 。ＦＬＰは、２つの同一方向のＦＲＴに挟まれたＤＮＡを切り出すことが可能である。ＦＲＴは３４ｂｐからなる塩基配列 (Jayaram et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 82. 5875-5879 (1985))であり、本発明においては、「ＦＬＰの認識配列」とは、ＦＲＴを含む塩基配列であれば特に限定されない。
本発明において、「リコンビナーゼＦＬＰの存在下でＦＬＰ依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する」とは、リコンビナーゼＦＬＰの非存在下ではリコンビナーゼＣｒｅが発現できないように構築されたＤＮＡをゲノム中に有する細胞が、リコンビナーゼＦＬＰの存在下では、２つの同一方向のＦＲＴに挟まれたＤＮＡを切り出すことにより、リコンビナーゼＣｒｅの発現を開始することをいう。
本発明において「リコンビナーゼＣｒｅ」とは、大腸菌のバクテリオファージＰ１がコードし、バクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ配列（Abremskiら、J. Biol. Chem. 1509 −1514 (1984) ；および Hoessら、Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 81、1026−1029 (1984))を基質とする、特異的なＤＮＡ組換え酵素であり、ｌｏｘＰ配列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全工程を行なう。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認識配列となる。
本発明において「リコンビナーゼＣｒｅ」とは、大腸菌のバクテリオファージＰ１がコードし、バクテリオファージＰ１内のｌｏｘＰ配列（Abremskiら、J. Biol. Chem. 1509 −1514 (1984) ；および Hoessら、Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 81、1026−1029 (1984))を基質とする、特異的なＤＮＡ組換え酵素であり、ｌｏｘＰ配列を認識し、この配列間でＤＮＡの切断、鎖の交換と結合の全工程を行なう。即ち、ｌｏｘＰ配列がリコンビナーゼＣｒｅの認識配列となる。
リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子は、バクテリオファージＰ１のＤＮＡのリコンビナーゼ遺伝子をコードする部分を、例えば、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法を用いて増幅してプラスミドにクローニングしたもの（例えば、ｐＵＣＣｒｅ（特開平８−８４５８９号公報））から適当な制限酵素により切り出して使用することができる。
本発明においては、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子配列の５’側または３’側の末端に核移行シグナル配列を接続させていることが好ましい。これは、細胞質で合成されたリコンビナーゼＣｒｅがその認識配列であるｌｏｘＰ配列を有するＤＮＡに効果的に作用するには、核内に移行する必要があり、核移行シグナル配列はこれを促進する（Daniel Kalderon ら、Cell. 39、499-509 (1984)) からである。核移行シグナル配列を有するＣｒｅ遺伝子は、プラスミドｐＳＲＮＣｒｅ(Kanegae Y. et. al., Nucleic Acid Res., Vol.23, 3816-3821 (1995)) 等から得ることができる。
本発明の細胞のゲノムに存在する前記構築ＤＮＡは、具体的には、プロモーター、リコンビナーゼＦＬＰの認識配列、スタッファー配列、リコンビナーゼＦＬＰの認識配列、リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子配列を上流からこの順に含む。
前記プロモーターとしては、哺乳動物細胞で機能する限り特に限定されないが、その例として、ＳＲαプロモーター(Molecular and Cellular Biology, Vol.8, 466-472 (1991)) 、ＥＦ−１αプロモーター(Gene, Vol.91, 217-223 (1990))、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。
前記プロモーターとしては、哺乳動物細胞で機能する限り特に限定されないが、その例として、ＳＲαプロモーター(Molecular and Cellular Biology, Vol.8, 466-472 (1991)) 、ＥＦ−１αプロモーター(Gene, Vol.91, 217-223 (1990))、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。
しかし本発明には、ＣＡＧプロモーターが特に有利に用いられる。このプロモーターは、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβグロビンのスプライシングアクセプターおよびポリＡ配列からなるハイブリドプロモーター（ＣＡＧプロモーター）であり、高発現ベクターとして特開平３−１６８０８７号公報に開示されている。その調製は同公報に記載されているｐＣＡＧＧＳ（特開平３−１６８０８７号公報、１３頁２０行〜２０頁１４行および２２頁１行〜２５頁６行）から制限酵素ＳａｌＩ、ＨｉｎｄIII で切り出すことにより行なうことができ、本発明に利用することができる。また、市販のプラスミドから適当な制限酵素で切り出して用いることもできる。
リコンビナーゼＦＬＰの認識配列とは、前記したように、ＦＲＴを含む塩基配列であれば特に限定されない。当該配列は、ＤＮＡ合成装置により合成して用いることができる。
前記スタッファー配列とは、２つの同一方向のリコンビナーゼＦＬＰの認識配列に挟まれた塩基配列をいい、ＦＬＰの存在下では環状に切り出される配列である。
前記スタッファー配列とは、２つの同一方向のリコンビナーゼＦＬＰの認識配列に挟まれた塩基配列をいい、ＦＬＰの存在下では環状に切り出される配列である。
スタッファー配列は、Ｃｒｅ遺伝子の発現を阻止する配列であれば特に制限はないが、細胞をトランスフェクションして目的のＤＮＡが組み込まれたかどうかを確認することができるように、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含有することが好ましく、哺乳動物細胞の選択に好適に用いられるネオマイシン耐性遺伝子がより好ましい。また、スタッファー配列は、薬剤耐性遺伝子を効率的に発現させ、下流に位置するリコンビナーゼＣｒｅ遺伝子が発現しないように、薬剤耐性遺伝子の下流にポリＡ配列をも含むことがさらに好ましい。ポリＡ配列としては、特に限定されるものではないが、ＳＶ４０由来のポリＡ配列、ウサギβグロビンのポリＡ配列等が挙げられる。これらの薬剤耐性遺伝子およびポリＡ配列は、市販のプラスミドから入手可能である。
リコンビナーゼＣｒｅ遺伝子の下流に用いられるポリＡ配列としては、特に限定されるものでないが、ウサギβグロビン由来のものが好ましい。
本発明の細胞を調製するために用いる細胞としては、目的のウイルスベクターの増殖に適した細胞であれば特に限定されない。
本発明の細胞を調製するために用いる細胞としては、目的のウイルスベクターの増殖に適した細胞であれば特に限定されない。
本発明の細胞をアデノウイルスベクター作製に用いる場合は、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子を発現する細胞を用いることが望ましい。Ｅ１Ａ遺伝子を発現する細胞は、既存の方法(Imler et. al.Gene Ther. Vol. 3. 75-84 (1996)) 等により作製できるが、Ｅ１Ａ遺伝子を持続的に発現しているヒト胎児腎由来細胞株２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）がより好ましい。しかしながら、当該細胞がＥ１Ａ遺伝子のみを発現している必要はなく、他のアデノウイルス遺伝子やその他の遺伝子を発現していてもよい。
以下、２９３細胞を用いて、リコンビナーゼＦＬＰの存在下でＦＬＰ依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞の調製方法の一例を説明する。
〔１〕３４ｂｐのＦＲＴ配列を含有し、制限酵素ＳｗａＩ部位を導入するために合成された５４ｂｐのＤＮＡ（配列番号：１）を同じ方向に２個含み、かつ、２個のＦＲＴ配列間にＳｗａＩ部位を有するプラスミドを構築する。以下、本発明においては、ＳｗａＩ部位を導入したプラスミド等が好適に用いられる。
〔２〕プラスミドｐＣＡＬＮＬＺ（Y. Kanegae et. al., Gene, Vol.181, 207-212 (1996) 、図１Ａ）) からネオマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０のポリＡ配列を含む断片を調製し、前記〔１〕で得られたプラスミドのＳｗａＩ部位に挿入して、当該断片の両端にＦＲＴ配列を有するプラスミドｐＵＦＮＦ（図１Ｂ）を得る。
〔３〕ＣＡＧプロモーターおよびウサギβ−グロビンポリＡ配列の供給源であるプラスミドｐＣＡＬＮＬｗ（Kanegae Y. et. al., Gene, Vol.181, 207-212 (1996))のＳｗａＩ部位に２７塩基の合成ポリリンカー（配列番号：２) を挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮＬ５（図１Ｃ）を得る。前記〔２〕で得られたｐＵＦＮＦからＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０のポリＡ配列／ＦＲＴ配列を含む断片を調製し、前記ｐＣＡＬＮＬ５由来のＣＡＧプロモーターを含む断片と連結し、プラスミドｐＣＡＦＮＦ５を得る。このプラスミドは、ｐＣＡＬＮＬ５の２つのｌｏｘＰ配列それぞれがＦＲＴ配列に置換された構造を有する。
〔４〕プラスミドｐＳＲＮＣｒｅ(Kanegae Y. et. al., Nucleic Acid Res., Vol.23, 3816-3821 (1995)) から核移行シグナルを付加したＣｒｅ遺伝子（ＮＣｒｅ）を含む断片を調製し、前記〔３〕で得られたｐＣＡＦＮＦ５のＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＦＮＦＮＣｒｅ（図２）を得る。
〔５〕２９３細胞に前記〔４〕で得られたｐＣＡＦＮＦＮＣｒｅをトランスフェクション（リン酸カルシウム共沈法）後、Ｇ４１８（ネオマイシン誘導体）耐性細胞をシングルクローン化し、本発明の細胞（２９３ＦＮＣｒｅ細胞）を得る。
このようにして得られた２９３ＦＮＣｒｅ細胞等の本発明の細胞は、当該細胞にリコンビナーゼＦＬＰ遺伝子またはＦＬＰ蛋白質を導入することにより、リコンビナーゼＣｒｅを高発現することができる。リコンビナーゼＦＬＰ遺伝子の導入方法としては、プラスミドを直接またはトランスフェクションにより導入する方法、ウイルスベクターを用いる方法、リポソーム法などが挙げられる。２９３ＦＮＣｒｅ細胞等のアデノウイルスの増殖に適した細胞の場合は、ＦＬＰ遺伝子はアデノウイルスベクターを用いて導入するのがより好ましい。
２９３ＦＮＣｒｅ細胞等の本発明の細胞は、ヘルパーウイルスを用いるウイルスベクターの作製に利用できる。２９３ＦＮＣｒｅ細胞を用いた組換えアデノウイルスベクターの作製を例として、以下にその具体的な方法を示す。
アデノウイルスの逆方向反復配列（inverted terminal repeat: ITR)とパッケージング配列のみを有し、他のすべてのアデノウイルスゲノムが外来遺伝子に置換された組換えアデノウイルスベクター（目的ウイルス）は、それ単独では増殖することができないため、ヘルパーウイルスの共存下に増殖させる。その際、ヘルパーウイルスの増殖を抑制するため、ヘルパーウイルスのパッケージング配列の両端にｌｏｘＰ配列を挿入しておき、このヘルパーウイルスと目的ウイルスまたは目的ウイルスのＤＮＡを含むプラスミドとをＣｒｅ発現２９３細胞に感染またはトランスフェクションすることにより、ヘルパーウイルスのパッケージング配列を欠失させ、その増殖を抑制し、目的ウイルスの割合を高める試みがなされている(Parks et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93. 13565-13570 (1996))。この場合、Ｃｒｅの発現量が高いほど効率的にヘルパーウイルスのパッケージング配列が除かれ、目的ウイルスの割合が高くなると考えられる。
本発明の２９３ＦＮＣｒｅ細胞は、ＦＬＰ発現組換えアデノウイルスと共に用いることにより、Ｃｒｅ発現２９３細胞を代替でき、恒常的にＣｒｅを発現する２９３細胞よりも大量のＣｒｅを発現することができる。したがって、Ｃｒｅ発現２９３細胞よりも効率的にヘルパーウイルスのパッケージング配列を除くことができ、目的ウイルスの割合を高めることができる。その際、ＦＬＰ発現アデノウイルス自体のパッケージング配列の両端にｌｏｘＰ配列を挿入しておけば、このアデノウイルスはＦＬＰを供給するだけでなく、ヘルパーウイルスとして作用させることができる。
本発明の２９３ＦＮＣｒｅ細胞等の細胞は、組換えアデノウイルスベクター作製だけでなく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製にも用いることができる。以下に２９３ＦＮＣｒｅ細胞を用いたＡＡＶベクター作製の例を挙げる。
ＡＡＶベクターの作製には、ＡＡＶのベクタープラスミドと共に、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを２９３細胞等の細胞に感染させる必要がある(Berns et. al., Adv. Virus. Res., Vol. 32, 243-306 (1987))。ヘルパーウイルスとして用いたアデノウイルスは、ＡＡＶベクター生成後に、熱失活等の操作によりＡＡＶベクターから除く必要があるため、ヘルパーウイルス自体は増殖しない方が望ましい。
ＡＡＶベクターの作製には、ＡＡＶのベクタープラスミドと共に、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを２９３細胞等の細胞に感染させる必要がある(Berns et. al., Adv. Virus. Res., Vol. 32, 243-306 (1987))。ヘルパーウイルスとして用いたアデノウイルスは、ＡＡＶベクター生成後に、熱失活等の操作によりＡＡＶベクターから除く必要があるため、ヘルパーウイルス自体は増殖しない方が望ましい。
本発明の２９３ＦＮＣｒｅ細胞をＡＡＶ産生細胞として、パッケージング配列の両端にｌｏｘＰ配列を挿入したＦＬＰ発現アデノウイルスをヘルパーウイルスとして用いることにより、ヘルパーウイルスはＡＡＶの増殖に必要な蛋白質を供給するがそれ自体は感染粒子にパッケージングされないため、効率的にＡＡＶベクターを製造することができる。
さらに、本発明の細胞は、ヘルパーウイルスを用いる他のウイルスベクター作製にも応用できる。その例として、ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。ヘルペスウイルスの増殖に適した細胞を、２９３ＦＮＣｒｅ細胞と同様な方法で形質転換し、ＦＬＰ依存的にＣｒｅを発現するようにしておく一方、ヘルパーウイルスは、パッケージング配列の両端にｌｏｘＰ配列を挿入しておく。目的遺伝子を有するベクタープラスミドをＦＬＰ依存的にＣｒｅを発現する細胞にトランスフェクションし、ヘルパーウイルスを感染させ、何らかの方法で細胞にＦＬＰを発現させることにより、ヘルパーウイルスはパッケージング配列が除かれるため増殖せず、目的のベクターウイルスのみが得られる。細胞にＦＬＰ蛋白質を発現させる例として、ヘルパーウイルスにＦＬＰの発現単位を挿入しておく方法が挙げられる。
また、リコンビナーゼＦＬＰは、Ｃｒｅと同様のDNA組換え反応を行う酵素であるが、ヒトを含む細胞由来細胞にＦＬＰ遺伝子を導入しても、動物細胞の培養を行う通常の温度（37℃）では、ＦＬＰ蛋白質が十分には産生されていない可能性が示されている。中野らの報告では、高発現プロモーターである前述のＣＡＧプロモーター下流に連結したＦＬＰ遺伝子を、高発現ベクターであるアデノウイルスベクターに挿入し、当該ベクターを培養動物細胞に感染させても、ＦＬＰ蛋白質が十分には産生されない可能性が示された（平成１１年度日本癌学会発表演題番号２４６３）。ＦＬＰ遺伝子の発現に用いたプロモーターは、高発現プロモーターであるＣＡＧプロモーターであることより、ＦＬＰ蛋白質が十分には産生されない原因は、転写段階ではなく翻訳段階が律速になっていることが推測される。ＦＬＰ遺伝子を動物培養細胞に導入することにより発現したＦＬＰ蛋白質を十分に機能させるためには、動物細胞でのＦＬＰ蛋白質の発現量を増加させることが必須である。
そこで、本発明者らは、酵母由来の蛋白質であるＦＬＰのコドンを、酵母で好適に用いられるコドンの比率から、ヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更することにより、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰ蛋白質の翻訳効率を増強させることを考案した。すなわち、酵母由来ＦＬＰをコードする塩基配列において、ＦＬＰ蛋白質のアミノ酸をコードするコドンを置換することにより、酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更されることによる、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡを見出した。
本発明において、「酵母において好適に用いられるコドンの比率」とは、各アミノ酸をコードする複数のコドンのうち、酵母の遺伝子における各コドンの使用頻度のことを示し、その値は既存の文献（Wada K. et. al., Nucleic Acids Res., Vol.18, Suppl. 2367-2411 (1990)）などに開示されている。その具体例を表１に示す。表１の「酵母遺伝子標準値」は、上記文献に記載された酵母（S. cerevisiae）の遺伝子における各コドンの使用頻度をアミノ酸ごとに表示したものである。同様に、「ヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率」とは、ヒト遺伝子での各コドンの使用頻度のことを示し、その具体的な値を表１の「ヒト遺伝子標準値」に示す。
本明細書において、「酵母において好適に用いられるコドンの比率」のことを単に「酵母型コドン」、「ヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率」のことを単に「ヒト型コドン」と称する場合がある。
本発明において、「酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更される」とは、ある蛋白質のアミノ酸配列を変化させずに、その使用コドンを置換することにより、各コドンの使用頻度を表１の「ヒト遺伝子標準値」に近づけることである。「ヒト遺伝子標準値」に近づける割合に特に制限はなく、ヒト型コドンへの置換によりヒトを含む動物細胞でのＦＬＰ蛋白質の翻訳効率が増強するという特徴を満たせば良い。
本発明において、「酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更される」とは、ある蛋白質のアミノ酸配列を変化させずに、その使用コドンを置換することにより、各コドンの使用頻度を表１の「ヒト遺伝子標準値」に近づけることである。「ヒト遺伝子標準値」に近づける割合に特に制限はなく、ヒト型コドンへの置換によりヒトを含む動物細胞でのＦＬＰ蛋白質の翻訳効率が増強するという特徴を満たせば良い。
本発明において、「ヒト型コドン」に置換したＦＬＰの塩基配列の例（配列番号：５）を図４ならびに表１に示す。表１ならびに本明細書中で「酵母型ＦＬＰ」とは酵母由来の本来の塩基配列を有するFLPを示し、「ヒト型ＦＬＰ」とは、その塩基配列を「ヒト型コドン」に置換した塩基配列を有するＦＬＰのことを示す。表１に示した「酵母型ＦＬＰ」と「ヒト型ＦＬＰ」とを例として、「酵母型コドン」から「ヒト型コドン」への置換について、さらに詳細に説明する。
例えば、システインには「ＴＧＴ」と「ＴＧＣ」の２種類のコドンが使用され、表１において、ＦＬＰには５個のシステインが存在し、酵母型ＦＬＰでは全て「ＴＧＴ」のコドンが用いられている。この５個の「ＴＧＴ」のコドンのうち３個を「ＴＧＣ」のコドンに置換することにより、「ＴＧＴ」コドンの割合は40%となり「ヒト遺伝子標準値」にほぼ等しくなる。この様にして、ＦＬＰ蛋白質全体のアミノ酸のコドンを「ヒト遺伝子標準値」にできるだけ近づけることが、本発明の「ヒト型コドン」への置換である。
ただし、機械的に「ヒト遺伝子標準値」に近づけるようにコドンを置換するのではなく、例えば、同一アミノ酸が連続する場合には同一コドンを用いずに、２番目以降のアミノ酸のコドンを変え同一コドンが連続しないようにするなどの工夫も本発明に含まれる。
ただし、機械的に「ヒト遺伝子標準値」に近づけるようにコドンを置換するのではなく、例えば、同一アミノ酸が連続する場合には同一コドンを用いずに、２番目以降のアミノ酸のコドンを変え同一コドンが連続しないようにするなどの工夫も本発明に含まれる。
本発明の「ヒト型コドン」に置換したＦＬＰは、さらにその5’末端をKozak配列に一致させるのが好ましい。Kozak配列とは、脊椎動物の遺伝子の翻訳開始点の前後に高頻度に認められる塩基配列のことであり、その詳細は既存の文献に開示されている（Kozak M., Nucleic Acids Res., Vol.9, 5233-5262 (1981)、Kozak M., J. Cell Biol., Vol. 108, 229-241 (1989)など）。
本発明の「ヒト型コドン」に置換したFLPは、さらに37℃での酵素活性を増加させるためのアミノ酸の置換を含んでいても良い。ＦＬＰの酵素活性の至適温度は30℃であり、動物細胞の培養を行う通常の温度（37℃）では、酵素活性が低下することが知られている（Buchholz F. et. al., ucleic Acids Res. Vol. 24. 4256-4262 (1996)）。ＦＬＰ蛋白質の37℃での酵素活性を増加させるための工夫としては、ＦＬＰ蛋白質の４つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することにより、その活性を増加させたとの報告がなされている（Buchholz F, et. al., Nat. Biotechnol. Vol.16, 657-662 (1998)）。より具体的には、ＦＬＰのアミノ酸配列の２番目がプロリンからセリンへ、33番目がロイシンからセリンへ、108番目がチロシンからアスパラギンへ、294番目がセリンからプロリンへ置換されている。表１ならびに図４に示した、本発明におけるヒト型ＦＬＰの例はこれら４アミノ酸の置換を含む。
次に、本発明のヒト型コドンに置換した塩基配列のＦＬＰを含むＤＮＡの調整法について、図４に示した塩基配列を有するヒト型ＦＬＰを例として述べる。図４の塩基配列に対応する30〜40塩基からなるＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を合成する。その際、両鎖が重なるような配列のＤＮＡとしておく。また、プラスミドにクローニングするため、５’末端側にPstIサイト、３’末端側にKpnIサイトを付加しておく。ヒト型ＦＬＰ遺伝子には、EcoRVならびにHindIIIサイトが各一ヶ所存在するので、PstI−EcoRV断片、EcoRV−HindIII断片、HindIII−KpnI断片に相当するＤＮＡを各々アニーリング後別々のプラスミドにクローニングし、次いでこれらの断片を連結しＦＬＰ全長を含むプラスミドを構築する。
このようにして調製したヒト型ＦＬＰ遺伝子を含むＤＮＡは、動物細胞で発現可能な適当なプロモーター下流に連結後、プラスミドＤＮＡの形でヒトもしくは動物細胞に遺伝子導入しても良いし、ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入しても良い。
ヒトもしくは動物細胞に遺伝子導入したＦＬＰ蛋白質の発現量の増加を確認する方法は、特に制限はなく、ＦＬＰ蛋白質そのものの量を測定する方法、ＦＬＰ蛋白質の機能を測定する方法などが挙げられる。ＦＬＰ蛋白質そのものの量を測定する方法としては、抗ＦＬＰ抗体を用いたウエスタンブロット法などが挙げられる。ＦＬＰ蛋白質の機能を測定する方法としては、ＦＬＰ蛋白質を含む細胞破砕液を酵素溶液として用いてＦＲＴ配列を含む基質ＤＮＡの組換え効率を測定する方法や、細胞にＦＬＰ遺伝子とともに基質ＤＮＡを同時に導入し、基質ＤＮＡが組換えを起こすことにより細胞に何らかの性質が現れるような測定方法を用いてもよい。後者の例として、プロモーター／ＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ポリＡ配列／ＦＲＴ配列／ｌａｃＺ遺伝子／ポリＡ配列の構造を有する基質ＤＮＡを用い、ｌａｃＺ遺伝子産物であるβ−ガラクトシダーゼの活性を測定する方法が挙げられる。
ヒトもしくは動物細胞に遺伝子導入したＦＬＰ蛋白質の発現量の増加を確認する方法は、特に制限はなく、ＦＬＰ蛋白質そのものの量を測定する方法、ＦＬＰ蛋白質の機能を測定する方法などが挙げられる。ＦＬＰ蛋白質そのものの量を測定する方法としては、抗ＦＬＰ抗体を用いたウエスタンブロット法などが挙げられる。ＦＬＰ蛋白質の機能を測定する方法としては、ＦＬＰ蛋白質を含む細胞破砕液を酵素溶液として用いてＦＲＴ配列を含む基質ＤＮＡの組換え効率を測定する方法や、細胞にＦＬＰ遺伝子とともに基質ＤＮＡを同時に導入し、基質ＤＮＡが組換えを起こすことにより細胞に何らかの性質が現れるような測定方法を用いてもよい。後者の例として、プロモーター／ＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ポリＡ配列／ＦＲＴ配列／ｌａｃＺ遺伝子／ポリＡ配列の構造を有する基質ＤＮＡを用い、ｌａｃＺ遺伝子産物であるβ−ガラクトシダーゼの活性を測定する方法が挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分野における通常の変更ができることは言うまでもない。なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞等を取り扱う諸操作は、特に断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis ら編、第２版 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory」に記載の方法に準じて行なった。
本実施例で用いたコスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔ(Kanegae Y. et. al., Nucleic acid Res., Vol.23, 3816-3821 (1995)) およびｐＡｘｃｗ（特開平８−３０８５８５号公報、１５頁、ｐＡｄｅｘｌｃｗはｐＡｘｃｗと同一である）は、アデノウイルスＥ１およびＥ３遺伝子以外のアデノウイルス５型ゲノムの大部分を含むベクターである。また、ｐＡｘＣＡｗｔは、Ｅ１遺伝子欠失部位にＣＡＧプロモーターが導入され、かつプロモーターとポリＡ配列との間にクローニング部位が存在する。ｐＡｘｃｗは、Ｅ１遺伝子欠失部位にＣｌａＩおよびＳｗａＩ部位のみが挿入されている。
実施例１
ＦＬＰ蛋白質依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞株（２９３ＦＮＣｒｅ細胞）の作製
動物細胞の染色体上に、ＣＡＧプロモーター／ＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列／ＦＲＴ配列／核移行シグナル付きＣｒｅ遺伝子／β−グロビンポリＡ配列の構造を有するＤＮＡが挿入された細胞株を得るために、以下の操作を行なった。
ＦＬＰ蛋白質依存的にリコンビナーゼＣｒｅを発現する細胞株（２９３ＦＮＣｒｅ細胞）の作製
動物細胞の染色体上に、ＣＡＧプロモーター／ＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列／ＦＲＴ配列／核移行シグナル付きＣｒｅ遺伝子／β−グロビンポリＡ配列の構造を有するＤＮＡが挿入された細胞株を得るために、以下の操作を行なった。
３４ｂｐのＦＲＴ配列を含む５４塩基の合成ＤＮＡ（配列番号：１）およびその相補鎖をプラスミドｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に挿入し、ＦＲＴ配列が同方向に２個挿入され、かつ２個のＦＲＴ配列間にＳｗａＩ部位を有するプラスミドｐＵＦｗＦ（２．８ｋｂ）を得た。
プラスミドｐＣＡＬＮＬＺ（Y. Kanegae et. al., Gene, Vol.181, 207-212 (1996) 、図１Ａ）) をＭｌｕＩおよびＸｈｏＩで消化後平滑化したネオマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０のポリＡ配列を含む断片を、ｐＵＦｗＦのＳｗａＩ部位に挿入したプラスミドｐＵＦＮＦ（図１Ｂ）を得た。
プラスミドｐＣＡＬＮＬＺ（Y. Kanegae et. al., Gene, Vol.181, 207-212 (1996) 、図１Ａ）) をＭｌｕＩおよびＸｈｏＩで消化後平滑化したネオマイシン耐性遺伝子とＳＶ４０のポリＡ配列を含む断片を、ｐＵＦｗＦのＳｗａＩ部位に挿入したプラスミドｐＵＦＮＦ（図１Ｂ）を得た。
プラスミドｐＣＡＬＮＬｗ（Kanegae Y. et. al., Gene, Vol.181, 207-212 (1996))のＳｗａＩ部位に２７塩基の合成ポリリンカー(5'-AAA TTG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG-3'、配列番号：２) およびその相補鎖を挿入し、プラスミドｐＣＡＬＮＬ５（図１Ｃ）を得た。ｐＵＦＮＦをＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し平滑化したＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０のポリＡ配列／ＦＲＴ配列を含む約１．２ｋｂの断片を、ｐＣＡＬＮＬ５をＭｌｕＩおよびＸｈｏＩで消化後平滑化したＣＡＧプロモーターを含む約４．９ｋｂの断片と連結し、プラスミドｐＣＡＦＮＦ５（６．１ｋｂ）を得た。
プラスミドｐＳＲＮＣｒｅ(Kanegae Y. et. al., Nucleic Acid Res., Vol.23, 3816-3821 (1995)) をＰｓｔＩおよびＸｂａＩで消化後平滑化した核移行シグナルを付加したＣｒｅ遺伝子（ＮＣｒｅ）を含む１．２ｋｂの断片を、ｐＣＡＦＮＦ５のＳｗａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＣＡＦＮＦＮＣｒｅ（図２）を得た。
２９３細胞をｐＣＡＦＮＦＮＣｒｅで形質転換（リン酸カルシウム共沈法）後、Ｇ４１８（ネオマイシン誘導体）耐性細胞をシングルクローン化し、複数の細胞株（２９３ＦＮＣｒｅ細胞）を得た。
実施例２
リコンビナーゼＦＬＰ発現プラスミドおよび組換えアデノウイルスの作製
リコンビナーゼＦＬＰの翻訳開始コドンの前後の塩基配列をＫｏｚａｋ配列に合わせたプラスミドを得るため、以下の操作を行った。
リコンビナーゼＦＬＰ発現プラスミドおよび組換えアデノウイルスの作製
リコンビナーゼＦＬＰの翻訳開始コドンの前後の塩基配列をＫｏｚａｋ配列に合わせたプラスミドを得るため、以下の操作を行った。
（ａ）プラスミドｐＵＣＦＬＰは、酵母(Saccharomyces cerevisiae)の２ミクロンＤＮＡ（６３１８ｂｐ：James et al.,Nature, Vol. 286, 860-865 (1980))のＳｐｈＩ部位（５５６８番目）からＸｂａＩ部位（７０３番目）までのＦＬＰ遺伝子全長を含む断片（１４５７ｂｐ）が、プラスミドｐＵＣ１９のＳｐｈＩ−ＸｂａＩ部位間に挿入されたプラスミドである。ｐＵＣＦＬＰをＸｂａＩおよびＳｐｈＩで消化し、ＦＬＰ遺伝子全長を含む約１．５ｋｂの断片を得た。
（ｂ）５’末端突出側がＨｉｎｄ III切断部位と、もう一方の末端がＳｐｈＩ切断部位と結合可能で、かつ翻訳開始コドンの上流にＰｓｔＩ部位を有する以下の配列の合成ＤＮＡアダプターを調製した。
5'-AG CTT CTG CAG CAG ACC GTG CAT CAT G-3' （配列番号：３）
3'-A GAC GTC GTC TGG CAC GTA-5' （配列番号：４）
（ａ）および（ｂ）の両ＤＮＡをｐＵＣ１９のＨｉｎｄ III−ＸｂａＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＵＫＦＬＰ（４．１ｋｂ）を得た。
ｐＵＫＦＬＰをＰｓｔＩおよびＦｓｐＩで消化後平滑化したＦＬＰコード領域を含む１．４ｋｂの断片を、コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのプロモーターとポリＡ配列との間のＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘＣＡＦＬＰを得た。
5'-AG CTT CTG CAG CAG ACC GTG CAT CAT G-3' （配列番号：３）
3'-A GAC GTC GTC TGG CAC GTA-5' （配列番号：４）
（ａ）および（ｂ）の両ＤＮＡをｐＵＣ１９のＨｉｎｄ III−ＸｂａＩ部位間に挿入し、プラスミドｐＵＫＦＬＰ（４．１ｋｂ）を得た。
ｐＵＫＦＬＰをＰｓｔＩおよびＦｓｐＩで消化後平滑化したＦＬＰコード領域を含む１．４ｋｂの断片を、コスミドベクターｐＡｘＣＡｗｔのプロモーターとポリＡ配列との間のＳｗａＩ部位に挿入し、コスミドベクターｐＡｘＣＡＦＬＰを得た。
前記ｐＡｘＣＡＦＬＰをＳａｌＩ消化後、自己ライゲーションさせ、アデノウイルスＤＮＡの大部分を除いた（左端約０．４ｋｂを含む）ＦＬＰ発現プラスミドｐｘＣＡＦＬＰ（図３Ａ）を得た。また同様に、ｐＡｘＣＡｗｔをＳａｌＩ消化後自己ライゲーションさせたプラスミドｐｘＣＡｗｔ（図３Ｂ）も作製した。ｐｘＣＡｗｔは、実施例３においてｐｘＣＡＦＬＰの陰性対照プラスミドとして用いる。
ｐＡｘＣＡＦＬＰとアデノウイルスＤＮＡ−末端蛋白質複合体とを既知の方法(Miyake et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. Vol.93, 1320-1324 (1996)および特開平７−２９８８７７号公報）に従いリン酸カルシウム共沈法で２９３細胞を形質転換し、目的のＦＬＰ発現組換えアデノウイルスＡｘＣＡＦＬＰ（Ｅ１およびＥ３遺伝子欠失）を得た。
実施例３
２９３ＦＮＣｒｅ細胞のＦＬＰ蛋白質に依存したＣｒｅ蛋白質の発現
（１） Ｃｒｅ蛋白質に依存してｌａｃＺ遺伝子を発現するプラスミドの作製
コスミドベクターｐＡｘＣＡＬＮＬＺ(Kanegae et. al., Nucleic Acid Res., Vol.23, 3816-3821 (1995))は、コスミドベクターｐＡｘｃｗのＥ１遺伝子欠失部位に、ＣＡＧプロモーター／ｌｏｘＰ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列／ｌｏｘＰ配列／大腸菌ｌａｃＺ遺伝子／β−グロビンのポリＡ配列が挿入されたコスミドである。ｐＡｘＣＡＬＮＬＺをＳａｌＩ消化後自己ライゲーションさせ、アデノウイルスＤＮＡの大部分を除いた（左端約０．４ｋｂを含む）プラスミドｐｘＣＡＬＮＬＺ（図３Ｃ）を作製した。ｐｘＣＡＬＮＬＺは、Ｃｒｅ蛋白質に依存してｌａｃＺ遺伝子を発現するベクターである。
２９３ＦＮＣｒｅ細胞のＦＬＰ蛋白質に依存したＣｒｅ蛋白質の発現
（１） Ｃｒｅ蛋白質に依存してｌａｃＺ遺伝子を発現するプラスミドの作製
コスミドベクターｐＡｘＣＡＬＮＬＺ(Kanegae et. al., Nucleic Acid Res., Vol.23, 3816-3821 (1995))は、コスミドベクターｐＡｘｃｗのＥ１遺伝子欠失部位に、ＣＡＧプロモーター／ｌｏｘＰ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列／ｌｏｘＰ配列／大腸菌ｌａｃＺ遺伝子／β−グロビンのポリＡ配列が挿入されたコスミドである。ｐＡｘＣＡＬＮＬＺをＳａｌＩ消化後自己ライゲーションさせ、アデノウイルスＤＮＡの大部分を除いた（左端約０．４ｋｂを含む）プラスミドｐｘＣＡＬＮＬＺ（図３Ｃ）を作製した。ｐｘＣＡＬＮＬＺは、Ｃｒｅ蛋白質に依存してｌａｃＺ遺伝子を発現するベクターである。
（２）２９３ＦＮＣｒｅ細胞のＦＬＰ蛋白質に依存したＣｒｅ蛋白質の発現
２９３ＦＮＣｒｅ細胞がＦＬＰ蛋白質依存的にＣｒｅ蛋白質を発現することの確認は、実施例２で作製したプラスミドｐｘＣＡＦＬＰとプラスミドｐｘＣＡＬＮＬＺとのコ・トランスフェクション法により行なった。その原理は、ｐｘＣＡＦＬＰにより発現したＦＬＰ蛋白質が２９３ＦＮＣｒｅ細胞の染色体に作用し、２個のＦＲＴ配列間のスタッファー配列（ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡ配列）を切り出し、ＣＡＧプロモーターからＣｒｅ蛋白質が発現する。発現したＣｒｅ蛋白質が、プラスミドｐｘＣＡＬＮＬＺの２個のｌｏｘＰ配列間のスタッファー配列（ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡ配列）を切り出すことにより、ｌａｃＺ遺伝子が発現する。したがって、これらの２つのプラスミドをコ・トランスフェクションした細胞がｌａｃＺ遺伝子を発現すれば、２９３ＦＮＣｒｅ細胞がＦＬＰ蛋白質依存的にＣｒｅ蛋白質を発現することの証明となる。以下に、実験方法の詳細および結果を示す。
２９３ＦＮＣｒｅ細胞がＦＬＰ蛋白質依存的にＣｒｅ蛋白質を発現することの確認は、実施例２で作製したプラスミドｐｘＣＡＦＬＰとプラスミドｐｘＣＡＬＮＬＺとのコ・トランスフェクション法により行なった。その原理は、ｐｘＣＡＦＬＰにより発現したＦＬＰ蛋白質が２９３ＦＮＣｒｅ細胞の染色体に作用し、２個のＦＲＴ配列間のスタッファー配列（ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡ配列）を切り出し、ＣＡＧプロモーターからＣｒｅ蛋白質が発現する。発現したＣｒｅ蛋白質が、プラスミドｐｘＣＡＬＮＬＺの２個のｌｏｘＰ配列間のスタッファー配列（ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリＡ配列）を切り出すことにより、ｌａｃＺ遺伝子が発現する。したがって、これらの２つのプラスミドをコ・トランスフェクションした細胞がｌａｃＺ遺伝子を発現すれば、２９３ＦＮＣｒｅ細胞がＦＬＰ蛋白質依存的にＣｒｅ蛋白質を発現することの証明となる。以下に、実験方法の詳細および結果を示す。
実施例１で得た２９３ＦＮＣｒｅ細胞のクローンのうちの６クローン（＃１、＃２、＃３、＃６、＃８および＃９）を６穴プレートで培養し、０．５μｇのｐｘＣＡＦＬＰと０．５μｇのｐｘＣＡＬＮＬＺとをリン酸カルシウム共沈法にてコ・トランスフェクションした。陰性対照として、ｐｘＣＡＦＬＰの代わりに実施例２で作製したｐｘＣＡｗｔを用いた。
３日後、培養液を除き、ＰＢＳ（−）で細胞面を洗浄後、０．２５％グルタルアルデヒド液を加え、４℃で１０分間細胞を固定後、再度ＰＢＳ（−）で洗浄した。発現したβ−ガラクトシダーゼを同定するため、Ｘ−Ｇａｌ染色液（５ｍＭフェリシアン化カリウム／５ｍＭフェロシアン化カリウム／２ｍＭ塩化マグネシウム／１mg/ml Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）／ＰＢＳ（−））を加えて５時間染色した。
以上の実験の結果、＃１、＃３、＃６および＃９の４クローンは、ｐｘＣＡｗｔとｐｘＣＡＬＮＬＺとをコ・トランスフェクションした場合は、β−ガラクトシダーゼを発現し、青く染色された細胞は数％以下であったが、ｐｘＣＡＦＬＰとｐｘＣＡＬＮＬＺとをコ・トランスフェクションすると、約５０％の細胞が青く染色された。したがって、これらの４クローンは、プロモーターとＣｒｅ遺伝子との間に、−ＦＲＴ配列／ネオマイシン耐性遺伝子／ＳＶ４０ポリＡ配列／ＦＲＴ配列−が正確に挿入され、ＦＬＰ蛋白質依存的にＣｒｅ蛋白質を高発現することが証明された。
本発明により、組換えウイルスベクター、特に、組換えアデノウイルスベクターの製造に有用な細胞が提供される。本発明により、組換えウイルスベクターの製造が効率的に行なわれ、遺伝子治療の分野で利用可能な組換えウイルスベクターの供給が容易になる。
配列番号：１の塩基配列は、ＦＬＰの認識配列である。
配列番号：２の塩基配列は、ポリリンカーである。
配列番号：３の塩基配列は、アダプターのセンス鎖である。
配列番号：４の塩基配列は、アダプターのアンチセンス鎖である。
配列番号：５の塩基配列は、ヒト型ＦＬＰ全配列である。
配列番号：２の塩基配列は、ポリリンカーである。
配列番号：３の塩基配列は、アダプターのセンス鎖である。
配列番号：４の塩基配列は、アダプターのアンチセンス鎖である。
配列番号：５の塩基配列は、ヒト型ＦＬＰ全配列である。
Claims (5)
- 酵母由来ＦＬＰをコードする塩基配列において、ＦＬＰ蛋白質のアミノ酸をコードするコドンを置換することにより、酵母において好適に用いられるコドンの比率がヒトにおいて好適に用いられるコドンの比率に変更されることによる、ヒトを含む動物細胞でのＦＬＰタンパク質の翻訳効率が増強された改変塩基配列を有するＤＮＡ。
- ＦＬＰをコードする塩基配列の５’末端領域がＫｏｚａｋ配列に一致する請求項２記載のＤＮＡ。
- ３７℃におけるＦＬＰ蛋白質の翻訳効率が増強されている請求項１または２記載のＤＮＡ。
- ＦＬＰのアミノ酸配列中、２番目がセリン、３３番目がセリン、１０８番目がアスパラギン、および２９４番目がプロリンである、請求項１から３のいずれか記載のＤＮＡ。
- 配列番号：５の塩基配列である請求項４記載のＤＮＡ。
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