KR20010086404A

KR20010086404A - 레콤비나제 발현 세포

Info

Publication number: KR20010086404A
Application number: KR1020017004501A
Authority: KR
Inventors: 사이토이즈무; 카네가에유미
Original assignee: 다께우찌 마사야쓰; 스미또모 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 1998-10-12
Filing date: 1999-10-07
Publication date: 2001-09-10
Also published as: EP1122310A4; AU6005699A; WO2000022106A1; EP1895003A1; EP1122310A9; JP2010057517A; CA2346800A1; US20060003443A1; US20080319177A1; EP1122310A1; KR100717091B1; JP4478333B2

Abstract

FLP 에 의존하는 레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 발현하는 세포; 레콤비나제 FLP 를 상기 세포에 전달하여 레콤비나제 Cre 를 발현시키는 방법; FLP 에 의존하는 레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 발현시키는 세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 방법; 및 Cre 를 발현시키는 상기 방법을 사용하여 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법 및 상기 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 다른 방법.

Description

레콤비나제 발현 세포{CELLS EXPRESSING RECOMBINASE}

유전자의 동물 세포 도입용 또는 유전자 치료용 바이러스 벡터로서, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스, 허피스바이러스(herpesvirus) 등을 사용했다. 상기 바이러스 벡터는 유전자 치료에 사용될 경우, 안전성을 이유로 바이러스에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 최소화하는 구조의 벡터인 것이 바람직하다.

레트로바이러스의 경우, 바이러스 생장에 필요한 모든 단백질을 공급하는 바이러스 생성 세포를 구축했다. 반대로, 아데노바이러스 벡터 및 허피스바이러스 벡터의 경우, 바이러스에 의해 코딩되는 단백질의 유형이 너무 많이 존재하고 단백질에 의한 가능성 있는 세포독성의 문제 때문에, 바이러스 생장에 필요한 모든 단백질을 공급하는 바이러스 생성 세포는 구축하지 못했다. 대안적인 방법으로, 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하는 방법을 상기 바이러스의 구성에 사용한다. 상기 방법에서는 헬퍼 바이러스로부터 벡터 바이러스(생장에 필수적인 유전자의 부분 또는 전체가 제거되어서 만약 바이러스 단백질의 공급이 없다면 그 자체로는 증식할수 없음)로 바이러스 생장에 필요한 바이러스 단백질을 공급하게 하여, 상기 벡터가 헬퍼 바이러스와 함께 증식하게 한다. 헬퍼 바이러스를 사용하는 상기 방법에서, 아데노바이러스 벡터(Mitani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3854-3858, 1995) 및 허피스바이러스 벡터(Banerjee et al., Nature Medicine, 1: 1303-1308, 1995)를 구성했다.

헬퍼 바이러스를 사용하는 바이러스 벡터의 구성과 관련된 과제 중 하나는 원하는 바이러스 벡터의 양에 비해 헬퍼 바이러스의 양을 감소시키는 방법이다. 상기 목적으로, 아데노바이러스의 경우, 패키징(packaging) 서열 돌연변이체로부터 유래한 헬퍼 바이러스를 사용하여 바이러스 입자[비리온(virion)]로의 헬퍼 바이러스 DNA 의 패키징 효율을 감소시켜서, 헬퍼 바이러스의 생장 속도를 낮추는 시도(Kochanek et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5731-5736, 1996), 또는 패키징 서열 양쪽에 위치한 부위에 loxP 서열, 레콤비나제 Cre 의 인식 서열이 삽입된 헬퍼 바이러스를 레콤비나제 Cre 발현 세포에 감염시킴으로써 상기 헬퍼 바이러스의 패키징 서열을 제거하는 시도(Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 13565-13570, 1996) 등을 수행했다.

특히 후자의 방법에서, 레콤비나제 Cre 발현 세포가 중요하고, 그 결과 영구적으로 Cre 를 발현하는 몇몇 세포주가 보고되었다(Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 13565-13570, 1996; Chen et al., Somat. Cell Mol. Genet. 22: 477-488, 1996; Lieber et al., J. Virol. 70: 8944-8960, 1996). 그러나, 영구적으로 Cre 를 발현하는 세포주를 구축했을지라도, 레콤비나제 Cre 가 동물 세포에서세포독성을 갖기 때문에 높은 수준의 발현 프로모터의 조절하에 많은 양으로 Cre 를 발현하는 안정적인 세포주를 구축하기가 어려운 것으로 간주된다(Lieber et al., J. Virol. 70: 8944-8960, 1996).

본 발명은 레콤비나제 발현 세포 및 상기 세포를 이용하여 재조합 바이러스 벡터를 구성하는 방법에 관한 것이다.

도 1 은 플라스미드 pCALNLZ (A), 플라스미드 pUFNF (B), 및 플라스미드 pCALNL5 (C) 의 구조를 나타내는 도식적인 그림이다. 본 도면 중, CA Pro 는 CAG프로모터를 나타내고, Neo^R은 네오마이신 내성 유전자를 나타내고, SpA 는 SV40 폴리(A) 서열을 나타내고, GpA 는 β-글로빈 폴리(A) 서열을 나타낸다. 빗금친 영역은 loxP 서열을 나타내고, 어두운 영역은 FRT 서열을 나타낸다. Ap^R은 앰피실린 내성 유전자를 나타내고, ori 는 복제 기원을 나타낸다. X 는 제한 효소 XhoI 부위를 나타내고, M 은 제한 효소 MluI 부위를 나타낸다.

도 2 는 플라스미드 pCAFNFNCre 의 구조를 나타내는 도식적 그림이다. NCre 는 핵 위치화 신호를 갖는 Cre 유전자를 나타낸다.

도 3 은 플라스미드 pxCAFLP (A), 플라스미드 pxCAwt (B), 및 플라스미드 pxCALNLZ (C)의 구조를 나타내는 도식적 그림이다. 본 도면 중, 두꺼운 선의 영역은 아데노바이러스 게놈(약 0.4 kb)을 나타낸다.

도 4 는 사람화 FLP 의 뉴클레오티드 서열의 예를 나타낸다. 본 도면 중, 좌측 단의 수치는 1 번으로 설정된 번역 기원으로부터의 염기수를 나타낸다. 소문자는 효모 서열에서 치환된 염기를 나타내고, 밑줄 친 부분은 아미노산 서열이 대체된 부위를 나타낸다.

본 발명의 최적 수행 방식

본 발명에 있어서, "레콤비나제 FLP" 는 효모(사카로미세스 세레비세애 (Saccharomyces cereviceae))의 마이크론(micron) DNA 2 개에 의해 코딩되고 두개의 FLP 인식 서열 (FRT) 사이의 부위-특이적 재조합을 수행하는 효소이다 (Babineau et al., J. Biol. Chem. 260: 12313-12319, 1985). FLP 는 동일한 방향으로 두개의 FRT 사이에 위치한 DNA 서열을 절개할 수 있다. FRT 는 34 bp 를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다 (Jayaram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5874-5879, 1985). 본 발명에 있어서, "FLP 의 인식 서열"은 FRT 를 포함하는 뉴클레오티드 서열이면 특별히 제한받지 않는다.

본 발명에 있어서, "레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 FLP 에 의존적인 방식으로 발현함"은 레콤비나제 FLP 의 부존재하에 레콤비나제 Cre 를 발현할 수 없는 방식으로 구성된, 그의 게놈에 DNA 를 함유하는 세포가, 레콤비나제 FLP 의 존재하에 동일한 방향으로 두개의 FRT 사이에 위치한 DNA 서열을 절개함으로써 레콤비나제 Cre 를 발현시키기 시작하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "레콤비나제 Cre"는 이. 콜리(E. coli) 박테리오파지 P1 에 의해 코딩되는 특이적 DNA 레콤비나제이고 박테리오파지 P1 중 loxP 서열 (Abremski et al., J. Biol. Chem. 1509-1514, 1984; 및 Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 1026-1029, 1984)을 기질로 사용한다. 레콤비나제 Cre 는 loxP 서열을 인식하고 DNA 의 절단하고, 상기 서열의 가닥을 교환하고 결합시키는 총 절차를 수행한다. 따라서, loxP 서열은 레콤비나제 Cre 의 인식 서열이다.

레콤비나제 Cre 유전자는, 박테리오파지 P1 DNA 의 레콤비나제 유전자를 코딩하는 부분이 예를 들어 중합효소 사슬 반응 (PCR)을 사용하여 증폭되고 클로닝된 플라스미드[예를 들어, pUCCre 일본국 무심사 특허 공개(Japanese Unexamined Patent Publication) (Kokai) 제 8-84589 호]로부터 적절한 제한 효소로 절개될 수 있고, 그 이후 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 핵 위치화 신호가 레콤비나제 Cre 유전자 서열의 5'-말단 또는 3'-말단에 연결된다. 상기는 세포질에서 합성된 레콤비나제 Cre 가 그의 표적 인식 서열, 즉 loxP 서열을 갖는 DNA 상에 유효하게 작용하기 위해 핵으로 이동하는 것이 필요하고, 상기 이동은 핵 위치화 신호에 의해 촉진되기 때문이다 (Daniel Kalderon et al., Cell 39: 499-509, 1984). 핵 위치화 신호를 갖는 Cre 유전자는 플라스미드 pSRNCre (Kanegae Y. et al., Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821, 1995) 등으로부터 수득될 수 있다.

본 발명의 세포의 게놈에 존재하고 상기로 구성된 DNA 는 구체적으로 프로모터, 레콤비나제 FLP 의 인식 서열, 스터퍼 서열, 레콤비나제 FLP 의 인식 서열, 및 레콤비나제 Cre 유전자를 상류로부터 상기 순서로 포함한다.

상기 프로모터로서, 포유류 세포에서 작용한다면 SRα프로모터 (Molecular and Cellular Biology, 8: 466-472, 1991), EF-1α프로모터 (Gene 91: 217-223, 1990), CMV 프로모터 등을 언급할 수 있지만 상기에 제한하지는 않는다.

그러나, 본 발명에서 CAG 프로모터가 바람직하게 사용된다. 상기는 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터, 스플라이싱 수용체 및 토끼 β-글로빈의 폴리(A) 서열을 포함하는 혼성 프로모터 (CAG 프로모터)이고, 일본국 무심사 특허 공개 (Kokai) 제 3-168087 호에 높은 수준의 발현 프로모터로 개시되어 있다. 상기는 제한 효소 SalI 및 HindIII 로 절개됨으로써 공개 중 개시된 pCAGGS (일본국 무심사 특허 공개 (Kokai) 제 3-168087 호 제 13 쪽 제 20 행 내지 제 20 쪽 제 14 행, 및 제 22 쪽 제 1 행 내지 제 25 쪽 제 6 행)로부터 제조될 수 있고, 본 발명에 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기는 시판되는 적절한 제한 효소로 절개될 수 있고 사용될 수 있다.

레콤비나제 FLP 의 인식 서열로서, FRT 를 포함하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 상기와 같이 사용할 수 있다. DNA 합성기를 사용하여 상기 서열을 합성할 수 있다.

상기 스터퍼 서열은 동일한 방향으로 두개의 레콤비나제 FLP 의 인식 서열 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열, 및 FLP 의 존재하에 원형으로 절개되는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

스터퍼 서열은 Cre 유전자의 발현을 방해하지 않는한, 임의의 서열일 수 있지만, 세포를 트랜스펙팅한 후 원하는 DNA 의 통합을 확인하기 위해, 바람직하게는 약물 내성 유전자와 같은 마커(marker) 유전자, 더 바람직하게는 네오마이신 내성 유전자(바람직하게는 포유류의 세포를 선택하는데 사용됨)를 포함한다. 바람직하게는 스터퍼 서열은 폴리(A) 서열을 약물 내성 유전자의 하류에 포함하여 약물 내성 유전자가 효율적으로 발현될 수 있고, 그의 하류에 위치한 레콤비나제 Cre 유전자는 발현될 수 없다. 폴리(A) 서열로, SV40 으로부터 유래한 폴리(A) 서열, 토끼 β-글로빈의 폴리(A) 서열 등을 언급할 수 있지만, 상기에 제한되지는 않는다. 상기 약물 내성 유전자 및 폴리(A) 서열은 시판되고 있다.

레콤비나제 Cre 유전자의 하류에 사용된 폴리(A) 서열로, 토끼 β-글로빈으로부터 유래된 것을 사용할 수 있지만, 상기에 제한되지는 않는다.

본 발명의 세포를 제조하는데 사용한 세포로, 원하는 바이러스 벡터의 생장에 적합한 임의의 세포를 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 세포를 아데노바이러스 벡터를 구성하는데 사용할 경우, 아데노바이러스 E1A 유전자를 발현하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다. E1A 유전자를 발현하는 세포는 종래의 방법(Imler et al., Gene Ther. 3: 75-84, 1996) 등에 따라 구성할 수 있고, 사람 태아 신장-유래 세포주 293 세포(ATCC CRL1573)를 사용하는 것이 더 바람직하다. 그러나, 상기 세포는 E1A 유전자만을 발현하고 있을 필요가 없고, 다른 아데노바이러스 유전자 또는 다른 유전자를 발현시키고 있을 수 있다.

이제, 예로써, 레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 FLP 에 의존적인 방식으로 발현하는 세포의 제조 방법을 설명한다.

[1] 34 bp FRT 서열, 두개의 54 bp DNA(서열 번호 1)을 동일한 방향으로 포함하고, 제한 효소 SwaI 부위로의 도입용으로 플라스미드를 구성하고 합성한다 (SwaI 부위는 두개의 FRT 서열 사이에 있음). 본 발명에서, SwaI 부위를 도입한 플라스미드는 이후 바람직하게 사용된다.

[2] 플라스미드 pCALNLZ (Y. Kanegae et al., Gene 181: 207-212, 1996, 도 1A)로부터, 네오마이신 내성 유전자 및 SV40 폴리(A) 서열을 포함하는 절편을 제조하고 어어서 상기 [1]에서 수득한 플라스미드의 SwaI 부위에 삽입하여, 상기 절편이 양쪽 말단의 FRT 서열 사이에 위치한 플라스미드 pUFNF (도 1B)를 수득한다.

[3] 합성 27-염기 폴리링커(polylinker, 서열 번호 2)를 CAG 프로모터 및 토끼 β-글로빈 폴리(A) 서열의 공급원인 플라스미드 pCALNLw (Y. Kanegae et al.,Gene 181: 207-212, 1996)의 SwaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCALNL5 (도 1C)를 수득한다. 상기 [2]에서 수득한 pUFNF 로부터, FRT 서열/네오마이신 내성 유전자/SV40 폴리(A) 서열/FRT 서열을 포함하는 절편을 제조하고, 어어서 상기 pCALNL5-유래 CAG 프로모터를 포함하는 절편에 라이게이션하여 플라스미드 pCAFNF5 를 수득한다. 상기 플라스미드는 pCALNL5 의 두개의 loxP 서열 각각이 FRT 서열로 대체된 구조를 갖는다.

[4] 플라스미드 pSRNCre (Y. Kanegae et al.,Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821, 1995)로부터, 핵 위치화 신호가 첨가된 Cre 유전자 (NCre)를 포함하는 절편을 제조하고, 상기 [3]에서 수득한 pCAFNF5 의 SwaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCAFNFNCre (도 2)를 수득한다.

[5] 293 세포를 상기 [4]에서 수득한 pCAFNFNCre 로 트랜스펙션한 후(인산칼슘 공침전법), G418 (네오마이신 유도체) 내성 세포를 클로닝하여 본 발명의 세포 (293FNCre 세포)를 수득했다.

이로써 수득된 293FNCre 세포와 같은 본 발명의 세포는 레콤비나제 FLP 유전자 또는 FLP 단백질을 상기 세포에 도입함으로써 높은 수준으로 레콤비나제 Cre 를 발현할 수 있다. 레콤비나제 FLP 유전자를 도입하는 방법으로, 트랜스펙션에 의해 플라스미드를 직접 도입하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 리포솜 방법 등을 언급할 수 있다. 293FNCre 세포와 같은 아데노바이러스 생장에 적합한 세포에 대해, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 FLP 유전자를 도입한다.

293FNCre 세포와 같은 본 발명의 세포는 헬퍼 바이러스를 사용하는 바이러스벡터의 구성에 사용될 수 있다. 그 예로, 293FNCre 세포를 사용하여 재조합 아데노바이러스 벡터를 구성하는 것을 구체적으로 하기에 기술한다.

아데노 바이러스의 패키징 서열 및 역말단반복(inverted terminal repeat, ITR)만을 포함하고 모든 다른 아데노바이러스 게놈은 외래 유전자로 대체된 재조합 아데노바이러스 벡터 (원하는 바이러스)는 그 자체로 생장할 수 없고, 헬퍼 바이러스의 존재하에 생장하게 되어 있다. 이번에는, 헬퍼 바이러스의 생장을 억제하기 위해 loxP 서열을 헬퍼 바이러스의 패키징 서열 양 말단에 삽입하고, 이어서 Cre-발현 293 세포를 상기 헬퍼 바이러스 및 원하는 바이러스 또는 원하는 바이러스의 DNA 를 포함한 플라스미드로 감염시키거나 트랜스펙션시켜서, 헬퍼 바이러스의 패키징 서열을 제거하고, 그의 성장을 억제하여, 원하는 바이러스의 비를 증강시키는 방법을 시도했다 (Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 13565-13570, 1996). 이 경우, 발현된 Cre 의 양이 많을수록, 헬퍼 바이러스의 패키징 서열이 더 효율적으로 절개되어, 그 결과 원하는 바이러스의 비가 더 증강된다.

본 발명의 293FNCre 세포는 FLP-발현 재조합 아데노바이러스와 사용될 경우, Cre-발현 293 세포를 대체하여 영구적으로 Cre 를 발현하는 293 세포보다 더 많은 양으로 Cre 를 발현하는 결과를 낳는다. 따라서, 상기는 Cre-발현 293 세포보다 더 효율적으로 헬퍼 바이러스의 패키징 서열을 절개할 수 있어서 원하는 바이러스의 비가 증강될 수 있다. 이번에는, FLP-발현 아데노바이러스 그 자체의 패키징 서열의 양말단에 loxP 서열을 미리 삽입하여, 아데노바이러스가 FLP 를 공급할 수 있을 뿐만 아니라, 헬퍼 바이러스로 작용할 수 있다.

본 발명의 293FNCre 세포와 같은 세포는 재조합 아데노바이러스 벡터의 구성 및 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터의 구성에 사용될 수 있다. 하기는 293FNCre 세포를 사용하여 AAV 벡터를 구성하는 예이다.

AAV 벡터를 구성하기 위해, 헬퍼 바이러스로 아데노바이러스를 AAV 벡터 플라스미드와 함께 293 세포와 같은 세포에 감염시켜야 한다 (Berns et al., Adv. Virus. Res., 32: 243-306, 1987). 헬퍼 바이러스로 사용된 아데노바이러스는 AAV 벡터의 형성 후에 가열 불활성화와 같은 방법에 의해 AAV 벡터로부터 제거되어야 하기 때문에, 헬퍼 바이러스 그 자체는 성장하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 293FNCre 세포를 AAV-생성 세포로 사용하고, loxP 서열이 헬퍼 바이러스로 패키징 서열의 양 끝에 삽입된 FLP-발현 아데노바이러스를 사용하면, 헬퍼 바이러스는 AAV 의 생장에 필요한 단백질을 공급하지만, 헬퍼 바이러스 그 자체는 감염된 입자에 패키징되지 않고, 이로써 AAV 벡터가 효율적으로 생성될 수 있다.

나아가, 본 발명의 세포는 또한 헬퍼 바이러스를 사용하는 다른 바이러스를 구성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 허피스바이러스 벡터를 언급할 수 있다. 허피스바이러스의 생장에 적합한 세포를 293FNCre 세포에 대한 것과 유사한 방법으로 형질전환시켜서 Cre 가 FLP 에 의존적인 방식으로 발현될 수 있는 동안, loxP 서열이 헬퍼 바이러스 중 패키징 서열의 양 끝에 삽입된다. FLP 에 의존적인 방식으로 Cre 를 발현하는 세포를 원하는 유전자가 있는 벡터 플라스미드로 트랜스펙션하고, 또한 상기 세포를 헬퍼 바이러스로 감염시키고 세포를 일부 수단 또는 다른수단으로 FLP 를 발현하게 하고, 헬퍼 바이러스는 생장할 수 없게 하여 패키징 서열을 제거하고 원하는 벡터 바이러스를 수득할 수 있다. 세포가 FLP 단백질을 발현하게 하는 예로서, FLP 의 발현 단위를 헬퍼 바이러스에 삽입하는 방법을 언급할 수 있다.

레콤비나제 FLP 가 Cre 와 유사한 방식으로 DNA 재조합을 수행하는 효소이지만, 만약 FLP 유전자가 사람을 포함하는 세포에 삽입될지라도 동물 세포의 배양에 사용하는 상온(37℃)에서 FLP 단백질이 충분히 생성될 수 없다는 가능성이 나타났다. 나카노(Nakano) 등은 만약 높은 수준의 발현 프로모터인 상기의 CAG 프로모터의 하류에 라이게이션된 FLP 유전자를 높은 수준의 발현 벡터이기도 한 아데노바이러스 벡터에 삽입하고 배양된 동물 세포에 상기 벡터를 감염시킨다해도, FLP 단백질이 충분히 생성될 수 없다고 보고했다(1998 년 일본 암 학회(Japan Cancer Society Meeting)의 발표 제 2463 호). FLP 유전자의 발현에 사용되는 프로모터가 높은 수준의 발현 프로모터인 CAG 프로모터이기 때문에, 전사 단계가 아닌 번역 단계가 속도-제한 단계이다는 것은 FLP 단백질의 불충분한 생성으로 알 수 있다. FLP 유전자를 동물 세포에 도입함으로써 발현된 FLP 단백질의 전 기능을 알기 위해, 동물 세포 중 FLP 단백질의 발현량을 증가시키는 것이 필요하다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 효모로부터 유래되거나 바람직하게는 효모에서 사용되는 FLP 단백질의 코돈의 코돈비를 바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비로 변화시킴으로써 사람 세포를 포함한 동물 세포 중 FLP 단백질의 번역 효율을 증강시키는 것을 고안했다. 따라서, 본 발명자들은 효모-유래 FLP 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 FLP 단백질의 아미노산을 코딩하는 코돈을 대체하여, 바람직하게는 효모에서 사용되는 코돈비를 바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비로 변화시킴으로써 사람 세포를 포함하는 동물 세포 중 FLP 단백질의 번역 효율을 증강시키는 변형 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 서열을 수득했다.

본 발명에 있어서, "바람직하게는 효모에서 사용되는 코돈비"는 아미노산을 코딩하는 다수의 코돈 중 효모 유전자에 있는 각각의 코돈을 사용하는 빈도를 가리키고(코돈 관례), 그 값은 Wada K. et al., Nucleic Acids Res. 18(Suppl.): 2367-2411, 1990 과 같은 참고문헌에 개시되었다. 그의 구체적인 예는 표 1 에 나타낸다. 표 1 중 "효모 유전자의 표준값"은 상기 참고문헌에 기술된 효모(에스 세레비지애(S. cerevisiae) 유전자 중 각각의 아미노산에 대해 각각의 코돈을 사용하는 빈도를 나타낸다. 유사하게, "바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비"는 사람의 유전자 중 각각의 아미노산에 대해 각각의 코돈을 사용하는 빈도를 나타내고, 그의 구체적인 값은 "사람 유전자에 대한 표준값"으로 나타낸다.

본 발명에 있어서, "바람직하게는 효모에서 사용되는 코돈비"는 간단히 "효모형 코돈"으로 명시될 수 있고, "바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비"는 간단히 "사람형 코돈"으로 명시될 수 있다.

본 발명에 있어서, "바람직하게는 효모에서 사용되는 코돈비를 바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비로 변화시킨다"는 것은, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 사용된 코돈을 대체함으로써 각각의 코돈을 사용하는 빈도가 "사람 유전자에 대한 표준값"(표 1)에 더 가깝게 된다는 것을 의미한다. 사람형코돈을 변화시킴으로써 사람 세포를 포함한 동물 세포 중 FLP 단백질의 번역 효율을 증강시켜야 하는 요구를 충족시키면 "사람 유전자에 대한 표준값"에 더 가깝게 되는 비는 제한받지 않는다.

본 발명에 따라, "사람형 코돈"으로 변화된 FLP 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 5)의 예는 도 4 및 표 1 에 나타낸다. 표 1 및 본 명세서에서, "효모형 FLP"는 효모에서 유전된 뉴클레오티드 서열을 갖는 FLP 를 나타내고, "사람화 FLP"는 "사람형 코돈"으로 변한 뉴클레오티드 서열을 갖는 FLP 를 나타낸다. 표 1 에 나타낸 "효모형 FLP" 및 "사람화 FLP"에 관해서, 그 예로 "효모형 코돈"을 "사람형 코돈"으로 대체하는 것을 더 상세하게 설명한다.

예를 들어, 두개의 코돈 "TGT" 및 "TGC"는 시스테인으로 사용된다. 표 1 에서 알 수 있는 것처럼, FLP 중 5 개의 시스테인이 있고 효모형 FLP 는 오직 "TGT" 코돈만을 사용한다. 5 개의 "TGT" 코돈 중 3 개를 "TGC" 코돈으로 변화시킴으로써, "TGT" 코돈비는 대략 "사람 유전자에 대한 표준값"과 동일한 40% 가 된다. 이런 방법으로, 완전한 FLP 단백질의 아미노산의 코돈을 "사람 유전자에 대한 표준값"에 가깝게 하는 것은 본 발명의 "사람형 코돈"으로 대체하는 것을 의미한다.

그러나, "사람 유전자에 대한 표준값"에 가깝게 하기 위해 코돈을 기계적으로 대체하는 대신에, 동일한 아미노산이 연속적으로 존재할 경우, 동일한 코돈을 사용하지 않고 2 번째 아미노산 또는 이후의 코돈을 변화시켜서 동일한 코돈이 연속적으로 존재하지 않게 하는 수단이 본 발명에 포함된다.

"사람형 코돈"으로 변화시킨 본 발명의 FLP 중, 5'-말단은 바람직하게는 코작(Kozak) 서열에 따른다. 코작 서열은 척추 동물의 유전자의 번역 개시점 주위에 빈번하게 존재하는 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 상기는 문헌(Kozak M. Nucleic Acids Res. 9: 5233-5262, 1981; Kozak M., J. Cell Biol. 108: 229-241, 1989, 등)에 상세하게 기술되어 있다.

"사람형 코돈"으로 변한 FLP 는 또한 37℃ 에서 그의 효소 활성을 증가시키기 위한 아미노산 치환을 포함한다. FLP 효소 활성의 최적 온도는 30℃ 이고, 따라서 동물 세포를 배양하는 상온(37℃)에서는 FLP 의 효소 활성이 감소한다 (Buchholz F. et al., Nucleic Acids Res. 24: 4256-4262, 1996). 37℃ 에서 FLP 단백질의 효소 활성을 증강시키기 위해, FLP 단백질의 4 개의 아민노산을 다른 아미노산으로 대체하여 활성을 증강시켰다는 것이 보고되었다(Buchholz F. et al., Nat. Biotechnol. 16: 657-662, 1998). 더 구체적으로, FLP 아미노산 서열의 2 번째 아미노산은 프롤린에서 세린으로, 33 번째 아미노산은 류신에서 세린으로, 108 번째 아미노산은 티로신에서 아스파라긴으로, 294 번째 아미노산은 세린에서 프롤린으로 치환했다. 표 1 및 도 4 에 나타낸 본 발명의 사람화 FLP 의 예는 상기 4 개의 아미노산의 대체를 포함한다.

이어서, 그 예로, 본 발명의 사람형 코돈으로 변화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 FLP 를 포함하는 DNA 를 제조하는 방법을 도 4 에 나타낸 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 사람화 FLP 에 대해 기술한다. 도 4 에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 상응하는 30 내지 40 개의 염기를 포함하는 DNA 의 센스 및 안티센스 가닥을 합성한다. 이번에는, 양 가닥의 뉴클레오티드를 오버랩핑한다. 또한, 플라스미드로 클로닝하기 위해, PstI 부위를 5'-말단에 첨가하고, KpnI 부위를 3'-말단에 첨가한다. 사람화 FLP 유전자 중 EcoRV 및 HindIII 에 대한 각각의 부위가 있기 때문에 PstI-EcoRV 절편, EcoRV-HindIII 절편 및 HindIII-KpnI 절편에 상응하는 DNA 를 각각 어닐링하고 이어서 별도로 플라스미드로 클로닝하고, 어어서 상기 절편을 라이게이션하여 완전한 길이의 FLP 를 포함하는 플라스미드를 구성한다.

이로써 제조된 사람화 FLP 유전자를 포함하는 DNA 를 동물 세포에서 발현될 수 있는 적절한 프로모터의 하류에 라이게이션한 후, DNA 를 사람 또는 동물 세포에 플라스미드 DNA 형태로 형질도입할 수 있거나, 바이러스 벡터 바람직하게는 아데노바이러스 벡터로 형질도입할 수 있다.

사람 또는 동물 세포에 트랜스펙션된 FLP 단백질 발현량의 증강을 확인하는 방법은 FLP 단백질 그 자체를 측정하는 방법, FLP 단백질의 기능을 측정하는 방법 등을 포함하지만 상기에 제한되지는 않는다. FLP 단백질 발현량 그 자체를 측정하는 방법으로, 항-FLP 항체 등을 사용하는 웨스턴(Western) 블롯 방법을 언급할 수 있다. FLP 단백질의 기능을 측정하는 방법으로, 기질로 FRT 서열을 포함하는 DNA 를, 효소 용액으로 FLP 단백질을 포함하는 세포가 파열된 용액을 사용하는 재조합 효율 측정 방법, 세포에 FLP 유전자와 동시에 기질 DNA 를 도입하고, 기질 DNA 를 재조합시켜서 일부 특성 또는 다른 특성의 징후를 측정하는 방법을 사용할 수 있다. 후자의 경우에 대한 예로서, 프로모터/FRT 서열/네오마이신 내성 유전자/폴리(A) 서열/FRT 서열/lacZ 유전자/폴리(A) 서열의 구조를 갖는 기질 DNA 를 사용하고, 이어서 lacZ, β-갈락토시다제 등의 유전자 생성물의 활성을 측정하는 방법을 언급할 수 있다.

이제, 본 발명은 이후 실시예를 참조하여 더 자세히 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 어떤식으로든 실시예에 의해 제한받지 않고 해당 분야에 공지된 다양성 및 변형이 있을 수 있다는 것을 알아야 한다. 만약 그렇지 못하다면, 파지, 플라스미드, DNA, 각종 효소, 에셔리키아 콜리(Escherichia coli), 배양 배지 등을 다루는 방법은 "Molecular Cloning, A Laboratory Manual, edited by T. Maniatis, et al., Second edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory"에 기술된 것처럼수행했다.

실시예에 사용된 코스미드 벡터, pAxCAwt (Kanegae Y. et al., Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821, 1995) 및 pAxcw (일본국 무심사 특허 공개 (Kokai) 제 8-308585 호, 제 15 쪽, pAdexlcw 와 pAxcw 는 동일함)는 아데노바이러스 E1 및 E3 유전자외에 아데노바이러스형 5 게놈의 주요 부분을 포함하는 벡터이다. pAxCAwt 는 CAG 프로모터를 E1 유전자 결실 부위에 도입하고 프로모터와 폴리(A) 서열 사이에 클로닝 부위를 갖는다. pAxcw는 E1 유전자 결실 부위에 오직 삽입된 ClaI 및 SwaI 부위를 갖는다.

본 발명의 목적은 각종 바이러스 벡터를 구성하는데 사용하기 위해 높은 수준으로 Cre 를 발현하는 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 세포를 이용하여 재조합 바이러스 벡터를 구성하는 더 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

Cre 단백질을 포함하여 세포독성 단백질을 영구적으로 발현하는 세포주를 구축하는 경우, 통상, 높은 수준의 발현 프로모터의 하류에 상기 단백질의 유전자를 삽입한 플라스미드에 의해 세포가 형질전환되지만, 높은 수준으로 상기 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 수득하는 것은 어렵고, 대부분의 경우, 세포가 상기 단백질의 독성에 내성이 있는 수준으로 단백질을 발현하는 세포만이 수득된다.

반대로, 약물 등에 의해 유발되는 단백질의 발현을 유도하는 프로모터가 공지되어 있다. 그러나, 상기 유도성 프로모터의 활성은 통상 영구적으로 단백질을 발현하는 강한 프로모터의 활성보다 더 낮다고 공지되어 있다.

따라서, 강한 프로모터로부터 Cre 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 수득하기 위한 수단으로, 본 발명의 발명자들은 레콤비나제 FLP 의 인식 서열 및 스터퍼(stuffer) DNA 를 프로모터와 Cre 유전자 사이에 삽입하여, Cre 단백질의 발현을 성공적으로 조절했다. 상기는 레콤비나제 FLP 의 부존재하에 Cre 단백질을 거의 발현하지 않기 때문에, 상기 세포주는 Cre 의 세포독성을 피할 수 있고, 상기 세포주는 FLP 의 존재하에 강한 프로모터로부터 Cre 단백질을 높은 수준으로 발현할 수 있다.

따라서, 본 발명의 요지는 하기에 관한 것이다:

(1) 레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 FLP 에 의존적인 방식으로 발현하는 세포,

(2) 상기 (1)의 세포에 레콤비나제 FLP 를 도입함으로써 상기 세포가 레콤비나제 Cre 를 발현하게 하는 방법,

(3) FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 FLP 에 의존적인 방식으로 발현하는 세포를 사용하는 것을 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 제조 방법,

(4) 상기 (2) 및 (3)의 방법을 사용하여 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법, 및

(5) 바람직하게는 효모에서 사용되는 코돈비를 바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비로 변화시킴으로써 효모-유래 FLP 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 FLP 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 코돈을 대체하여, 사람 세포를 포함한 동물 세포 중 FLP 단백질의 번역 효율을 증강시킨 변형 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.

실시예 1 FLP 단백질에 의존적인 방식으로 레콤비나제 Cre 를 발현하는 세포주(293FNCre 세포)의 구성

동물 세포의 염색체에 CAG 프로모터/FRT 서열/네오마이신 내성 유전자/SV40 폴리(A) 서열/FRT 서열/핵 위치화 신호가 태깅된 Cre 유전자/β-글로빈 폴리(A) 서열 구조의 삽입 DNA 를 갖는 세포주를 수득하기 위해, 하기 방법을 따랐다.

34 bp 의 FRT 서열을 포함하는 54 개의 염기 및 그의 상보적 가닥으로 구성된 합성 DNA (서열 번호 1)를 플라스미드 pUC18 의 SmaI 부위에 삽입하여 동일한 방향으로 2 개의 FRT 서열 및 2 개의 FRT 서열 사이에 있는 SwaI 부위를 갖는 플라스미드 pUFwF (2.8 kb)를 수득했다.

플라스미드 pCALNLZ (Y. Kanegae et al., Gene 181: 207-212, 1996, 도 1A)를 MluI 및 XhoI 로 소화시키고 이어서 평활말단화시킴으로써 수득된 네오마이신내성 유전자 및 SV40 폴리(A) 서열을 포함하는 절편을 pUFwF 의 SwaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pUFNF (도 1B)를 수득했다.

염기 27 개의 합성 폴리링커 (5'-AAA TTG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG-3', 서열 번호 2) 및 그의 상보적인 가닥을 플라스미드 pCALNLw (Y. Kanegae et al., Gene 181: 207-212, 1996) 의 SwaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCALNL5 (도 1C)를 수득했다. pUFNF 를 BamHI 및 Asp718 로 소화시키고 평활말단화시킴으로써 수득된 FRT 서열/네오마이신 내성 유전자/SV40 폴리(A) 서열/FRT 서열을 포함하는 약 1.2 kb 의 절편을, pCALNL5 를 MluI 및 XhoI 로 소화시키고 평활말단화시킴으로써 수득한 CAG 프로모터를 포함하는 약 4.9 kb 의 절편에 라이게이션하여 플라스미드 pCAFNF5 (6.1 kb)를 수득했다.

플라스미드 pSRNCre (Y. Kanegae et al., Nucleic Acids Res. 23:3816-3821, 1995)를 PstI 및 XbaI 로 소화시키고 평활말단화시킴으로써 수득된 핵 위치화 신호가 첨가된 Cre 유전자 (NCre)를 포함하는 약 1.2 kb 의 절편을 pCAFNF5 의 SwaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pCAFNFNCre (도 2)를 수득했다.

293 세포를 pCAFNFNCre 로 트랜스펙션하고(인산칼슘 공침전법), 이어서 G418 (네오마이신 유도체) 내성 세포를 단일 클로닝하여 다수의 세포주 (293FNCre 세포)를 수득했다.

실시예2 레콤비나제 FLP-발현 플라스미드 및 재조합 아데노바이러스의 구성

레콤비나제 FLP 의 번역 개시 코돈 주위의 뉴클레오티드 서열이 코작 서열에 따르는 플라스미드를 수득하기 위해, 하기 방법을 따랐다:

(a) 플라스미드 pUCFLP 는 효모의 2 개의 마이크론 DNA 의 SphI 부위(5568 위치)에서 XbaI 부위(703 위치)까지의 완전한 길이의 FLP 유전자를 포함하는 절편(1457 bp)이 플라스미드 pUC19 의 SphI-XbaI 부위에 삽입된 플라스미드이다. pUCFLP 를 XbaI 및 SphI 로 소화시켜 완전한 길이의 FLP 유전자를 포함하는 약 1.5 kb 의 절편을 수득했다.

(b) 5'-말단 오버행(overhang)을 HindIII 절단 부위에 라이게이션하고 다른 말단은 SphI 절단 부위에 라이게이션할 수 있고, 번역 개시 코돈의 상류에 PstI 부위를 갖는 하기 서열의 합성 DNA 아답터(adaptor)를 합성했다.

5'-AG CTT CTG CAG CAG ACC GTG CAT CAT G-3' (서열 번호 3)

3'-A GAC GTC GTC TGG CAC GTA-5' (서열 번호 4)

(a) 및 (b)의 DNA 를 모두 pUC19 의 HindIII-XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pUKFLP (4.1kb)를 수득했다.

pUKFLP 를 PstI 및 FspI 로 소화시키고 평활말단화시킴으로써 수득한 FLP 코딩 영역을 포함하는 1.4 kb 의 절편을 코스미드 벡터 pAxCAwt 의 프로모터와 폴리(A) 서열 사이의 SwaI 부위에 삽입하여 코스미드 벡터 pAxCAFLP 를 수득했다.

상기 pAxCAFLP 를 SalI 로 소화시킨 후, 자가-라이게이션하여 아데노바이러스 DNA 의 대부분이 결실된(좌측 말단에 약 0.4 kb 를 포함함) FLP 발현 플라스미드 pxCAFLP (도 3A)를 수득했다. 유사하게, SalI 로 소화시킨 후 pxCAwt 를 자가-라이게이션한 플라스미드 pxCAwt (도 3B)를 또한 구성했다. pxCAwt 는 실시예 3 의 pxCAFLP 에 대해 네가티브 대조 플라스미드로 사용된다.

공지된 방법 (Miyake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 1320-1324, 1996)에 따라 인산칼슘 공침전법으로 pAxCAFLP 및 아데노바이러스 DNA-말단 단백질 복합체로 293 세포를 트랜스펙션하여 원하는 FLP-발현 재조합 아데노바이러스, AxCAFLP 를 수득했다 (E1 및 E3 유전자는 제거됨).

실시예 3 293FNCre 세포의 FLP 단백질에 의존적인 Cre 단백질의 발현 확인

(1) Cre 단백질에 의존적인 lacZ 유전자를 발현하는 플라스미드의 구성

코스미드 벡터 pAxCALNLZ (Kanegae et al., Nucleic Acids Res. 23: 3816-3821, 1995)는 CAG 프로모터/loxP 서열/네오마이신 내성 유전자/SV40 폴리(A) 서열/loxP 서열/이. 콜리 lacZ 유전자/β-글로빈 폴리(A) 서열이 코스미드 벡터 pAxcw 의 E1 유전자 결실 부위에 삽입된 코스미드이다. SalI 로 pAxCALNLZ 를 소화시킨 후, 자가-라이게이션시켜서 아데노바이러스 DNA 의 대부분이 제거된(좌측 말단에 약 0.4 kb 를 포함함) 플라스미드 pxCALNLZ (도 3C)를 구성했다. pxCALNLZ 는 Cre 단백질에 의존적인 lacZ 유전자를 발현하는 벡터이다.

(2) 293FNCre 세포의 FLP 단백질에 의존적인 Cre 단백질의 발현

FLP 단백질에 의존적인 방식으로 293FNCre 세포에 의해 Cre 단백질이 발현하는 것을 실시예 2 에서 구성한 플라스미드 pxCALNLZ 와 플라스미드 pxCAFLP 의 코트랜스펙션 방법으로 확인했다. 상기는 pxCAFLP 에 의해 발현되는 FLP 단백질이 293FNCre 세포의 염색체에 작용하고 이어서 2 개의 FRT 서열 사이의 스터퍼 서열(네오마이신 내성 유전자 및 SV40 폴리(A) 서열)을 절개하여 CAG 프로모터로부터 Cre 단백질을 발현시키는 원리를 기초로 한다. 발현된 Cre 단백질은 플라스미드pxCALNLZ 의 2 개의 loxP 서열 사이의 스터퍼 서열(네오마이신 내성 유전자 및 SV40 폴리(A) 서열)을 절개하여 lacZ 유전자를 발현시킨다. 따라서, 상기 2 개의 플라스미드가 코트랜스펙션된 세포에 의한 lcaZ 유전자의 발현은 293FNCre 세포가 FLP 단백질에 의존하는 방식으로 Cre 단백질을 발현한다는 증거를 제공해야 한다. 실험 방법 및 그 결과의 상세한 설명을 하기에 나타낸다.

실시예 1 에서 수득한 293FNCre 세포 클론 중, 6 개의 클론 (#1, #2, #3, #6, #8, 및 #9)를 6-웰 판에서 배양하고 세포를 pxCAFLP 0.5 ㎍ 및 pxCALNLZ 0.5 ㎍ 으로 인산칼슘 공침전법에 의해 트랜스펙션했다. 네가티브 대조로서, 실시예 2 에서 구성된 pxCAwt 를 pxCAFLP 대신에 사용했다.

3 일 후, 배양 액체를 제거하고, 세포 표면을 PBS(-)로 세척하고, 0.25% 글루타르알데히드 용액을 첨가하고, 세포를 4℃ 에서 10 분 동안 고정하고, 이어서 다시 PBS(-)로 세척했다. 발현된 β-갈락토시다제를 확인하기 위해, X-Gal 염색 용액 (5 mM 포타슘 페리시아니드/5 mM 포타슘 페로시아니드/2 mM 염화마그네슘/1 mg/ml X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시다제)/PBS(-))를 첨가하여 5 시간 동안 염색했다.

상기 실험의 결과로, 4 개의 클론 #1, #3, #6, 및 #9 에서, pxCAwt 및 pxCALNLZ 로 코트랜스펙션했을 때 β-갈락토시다제를 발현함으로써 파란색으로 염색된 세포의 비는 수% 또는 그 미만이었고, 반면에 세포를 pxCAFLP 및 pxCALNLZ 로 코트랜스펙션되었을 때 세포의 약 50% 가 파란색으로 염색되었다. 따라서, 상기 4 개의 클론 중, -FRT 서열/네오마이신 내성 유전자/SV40 폴리(A) 서열/FRT 서열-이프로모터와 Cre 유전자 사이에 정확하게 삽입되었고 FLP 단백질에 의존적인 방식으로 높은 수준으로 Cre 단백질을 발현한다는 것을 증명했다.

본 발명은 재조합 바이러스 벡터, 구체적으로 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조에 유용한 세포를 제공한다. 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 효율적으로 제조하게 하고, 유전자 치료 분야에서 이용가능한 재조합 바이러스 벡터의 공급을 용이하게 한다.

서열 목록 부재 텍스트

서열 번호 1 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 FLP 의 인식 서열이다.

서열 번호 2 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 폴리링커이다.

서열 번호 3 으로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 아답터의 센스 가닥이다.

서열 번호 4 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 아답터의 안티센스 가닥이다.

서열 번호 5 로 나타낸 뉴클레오티드 서열은 사람화 FLP 의 완전한 서열이다.

Claims

레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 FLP 에 의존적인 방식으로 발현하는 세포.
제 1 항에 있어서, 아데노바이러스 E1A 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 사람 태아 신장-유래 세포주 293 세포로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터, 레콤비나제 FLP 의 인식 서열, 스터퍼(stuffer) 서열, 레콤비나제 FLP 의 인식 서열, 및 레콤비나제 Cre 유전자 서열을 상류로부터 상기 순서로 그의 게놈에 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
제 4 항에 있어서, 프로모터가 시토메갈로바이러스 인핸서, 닭 β-액틴 프로모터, 스플라이싱 수용체 및 토끼 β-글로빈의 폴리(A) 서열을 포함하는 혼성 프로모터(CAG 프로모터)인 것을 특징으로 하는 세포.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 스터퍼 서열이 그의 하류에 위치한 Cre 유전자의 발현을 억제하도록 작용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 6 항에 있어서, Cre 유전자의 발현을 억제하도록 작용하는 뉴클레오티드 서열로서, 폴리(A) 서열, 또는 목적 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 폴리(A) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
제 7 항에 있어서, 목적 단백질이 약물 내성 유전자 생성물인 것을 특징으로 하는 세포.
제 8 항에 있어서, 약물 내성 유전자가 네오마이신 내성 유전자인 것을 특징으로 하는 세포.
제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 레콤비나제 Cre 유전자의 5'-말단 또는 3'-말단에 핵 위치화 신호를 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 세포 내로 레콤비나제 FLP 를 도입하여 레콤비나제 Cre 유전자를 발현시키는 방법.
제 11 항에 있어서, 레콤비나제 FLP 를 도입하는 방법에 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
재조합 바이러스 벡터의 제조 방법에 있어서, 레콤비나제 FLP 의 존재하에 레콤비나제 Cre 를 FLP 에 의존적인 방식으로 발현하는 세포의 사용을 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
재조합 아데노바이러스 벡터의 제조 방법에 있어서, 제 11 항 또는 제 12 항 및 제 13 항에 따른 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 그의 게놈 내에 레콤비나제 Cre 의 인식 서열, 아데노바이러스 패키징 서열, 및 레콤비나제 Cre 의 인식 서열을 상류로부터 상기 순서로 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
효모-유래 FLP 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 FLP 단백질의 아미노산을 코딩하는 코돈을 대체하여 바람직하게는 효모에서 사용되는 코돈비를 바람직하게는 사람에 있어서 사용되는 코돈비로 변화시킴으로써 사람 세포를 포함한 동물 세포 중 FLP 단백질의 번역 효율을 증강시킨 것을 특징으로 하는 변형 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
제 16 항에 있어서, FLP 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5'-말단 영역이 코작(Kozak) 서열에 따르는 것을 특징으로 하는 DNA.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 37℃ 에서 FLP 단백질의 번역 효율이 증강된 것을 특징으로 하는 DNA.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, FLP 의 아미노산 서열 중 2 번째 아미노산이 세린이고, 33 번째 아미노산이 세린이고, 108 번째 아미노산이 아스파라긴이고, 294 번째 아미노산이 프롤린인 것을 특징으로 하는 DNA.
제 19 항에 있어서, 서열 번호 5 로 나타낸 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 DNA.