ES2278399T3 - Metodo mejorado para la produccion y purificacion de vectores adenovirales. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a la necesidad de mejorar los rendimientos de vectores virales obtenidos mediante procedimientos de cultivo celular. En particular, se ha demostrado para adenovirus, la utilización de una velocidad de perfusión media-baja en una sistema de cultivo celular fijado para mejorar los rendimientos. En otras realizaciones, los inventores han demostrado que hay una producción de Ad-p53 mejorada con células cultivadas en un medio sin suero, y en particular en un cultivo en suspensión sin suero. También es importante para el aumento de rendimientos la utilización de una lisis por detergentes. Las combinación de estos aspectos de la invención permite la purificación del virus en una única etapa cromatográfica que da como resultado el virus purificado con una calidad similar a la de las preparaciones de doble banda CsCl utilizando ultracentrifugación.
Description
Método mejorado para la producción y
purificación de vectores adenovirales.
La presente invención se refiere de manera
general a los campos del cultivo celular y la producción de virus.
Más particularmente, concierne a métodos mejorados para el cultivo
de células de mamífero, la infección de esas células con adenovirus
y la producción de partículas de adenovirus infecciosas a partir de
los mismos.
En la actualidad se está evaluando, en la
práctica clínica, la capacidad de los vectores adenovirales, que
expresan proteínas terapéuticas, para tratar varias indicaciones del
cáncer, incluyendo cánceres de pulmón y cabeza y cuello. Debido a
que los estudios clínicos progresan, la demanda de vectores
adenovirales de calidad clínica está aumentando de manera
espectacular. La demanda anual prevista para un estudio clínico de
300 pacientes podría alcanzar, aproximadamente, 6 x 10^{14}
UFP.
Tradicionalmente, los adenovirus se producen en
matraces de cultivo tisular comercialmente disponibles o "fábricas
de células". Las células infectadas por virus se recogen y se
congelan-descongelan para liberar los virus de las
células en forma de lisado celular bruto. Entonces se purifica el
lisado celular bruto (CCL, crude cell lysate) producido mediante
ultracentrifugación en gradiente de CsCl doble. El rendimiento del
virus normalmente notificado de fábricas de células de 100 bandejas
individuales es aproximadamente de 6 x 10^{12} UFP. Claramente,
se hace inviable producir la cantidad requerida de virus usando este
proceso tradicional. Han de desarrollarse nuevos procesos de
purificación y producción escalables y que puedan validarse para
satisfacer la demanda creciente.
El rendimiento de purificación de la
ultracentrifugación en gradiente de CsCl es tan limitado que no
puede satisfacer la demanda de vectores adenovirales para
aplicaciones de terapia génica. Por tanto, con el fin de conseguir
la producción de vector adenoviral a gran escala, han de
desarrollarse métodos de purificación distintos de la
ultracentrifugación en gradiente de CsCl. Los informes sobre la
purificación cromatográfica de virus son muy limitados, a pesar de
la amplia aplicación de la cromatografía para la purificación de
proteínas recombinantes. Se ha evaluado la capacidad de la
cromatografía de exclusión por tamaño, intercambio iónico y de
afinidad para la purificación del retrovirus, virus de la
encefalitis trasmitido por garrapata, y virus vegetales con niveles
de éxito variables (Crooks, et al., 1990; Aboud, et
al., 1982; McGrath et al., 1978, Smith y Lee, 1978;
O'Neil y Balkovic, 1993). Se ha realizado aún menos investigación
sobre la purificación cromatográfica de adenovirus. Esta falta de
actividad de investigación puede atribuirse parcialmente a la
existencia del método eficaz, aunque no escalable, de purificación
por ultracentrifugación en gradiente de CsCl para los
adenovirus.
Recientemente, Huyghe et al. (1996),
véase también el documento WO96/27677 notificaron la purificación de
vector adenoviral usando cromatografía de intercambio iónico junto
con cromatografía de afinidad a quelatos metálicos. Se notificó una
pureza del virus similar a la de la ultracentrifugación en gradiente
de CsCl. Desafortunadamente, solamente se recuperó el 23% del virus
tras el proceso de purificación en columna doble. Los factores de
proceso que contribuyen a esta baja recuperación de virus son la
etapa de congelación/descongelación utilizada por los autores para
lisar las células con el fin de liberar el virus de las células y,
los dos procedimientos de purificación en
columna.
columna.
Nadeau, J. (1996), Biotechnology and
Bioengineering, 51, 613-623 y Garnier, A. (1994),
Cytotechnology, 15, 145-155 se refiere a una mejora
de la producción de proteína recombinante con el sistema de
expresión de adenovirus/2935 humano y a una aumento de la escala
del sistema de expresión de adenovirus para la producción de
proteína recombínate en células 2935 humanas, respectivamente.
Graham, F.L. y Prevec, L. (1991), Methods in Molecular Biology,
Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, editado por: E.F.
Murray, The Humana Press Inc., Clifton, NJ, capítulo 11, páginas
109-128 describe la purificación, titulación y
propagación del vector del adenovirus usando disolución madre de
virus bruto congelado tratada con bandeo con cloruro de cesio y
desoxicolato de sodio.
Claramente, existe una demanda de un método
escalable y eficaz de producción de vector adenoviral que recuperará
un alto rendimiento del producto para satisfacer la demanda siempre
creciente de tales productos.
La presente invención describe un nuevo proceso
para la producción y purificación de adenovirus tal como se
especifica en las reivindicaciones. Este nuevo proceso de producción
no sólo ofrece escalabilidad y capacidad de validación sino también
una pureza del virus comparable a la conseguida usando
ultracentrifugación en gradiente de CsCl.
Por tanto la presente invención proporciona un
método para producir un adenovirus que comprende hacer crecer las
células huésped en medios a una tasa de perfusión baja, infectar las
células huésped con un adenovirus, recoger y lisar las células
huésped para producir un lisado celular bruto, concentrar el lisado
celular bruto, cambiar el tampón del lisado celular bruto, y
reducir la concentración de ácidos nucleicos contaminantes en el
lisado celular bruto.
En realizaciones particulares, el método
comprende además aislar una partícula adenoviral del lisado usando
cromatografía. En determinadas realizaciones, el aislamiento
consiste esencialmente en una única etapa de cromatografía. En
otras realizaciones, la etapa de cromatografía es cromatografía de
intercambio iónico. En realizaciones particularmente preferidas, la
cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo a un intervalo
de pH de entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 10,0. En
realizaciones más preferidas, la cromatografía de intercambio
iónico es cromatografía de intercambio aniónico. En determinadas
realizaciones la cromatografía de intercambio aniónico utiliza
DEAE, TMAE, QAE, o PEI. En otras realizaciones preferidas, la
cromatografía de intercambio aniónico utiliza Toyopearl Super Q
650M, MonoQ, Source Q o Fractogel TMAE.
En determinadas realizaciones de la presente
invención la concentración de glucosa en los medios se mantiene
entre aproximadamente 0,7 y aproximadamente 1,7 g/l. En otras
realizaciones determinadas, cambiar el tampón implica una etapa de
diafiltración.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, el adenovirus comprende un vector adenoviral que codifica
para un constructo génico exógeno. En determinadas realizaciones de
este tipo, el constructo génico está operativamente unido a un
promotor. En realizaciones particulares, el promotor es SV40 IE, RSV
LTR, \beta-actina o CMV IE, tardío principal de
adenovirus, F9-1 de polioma, o tirosinasa. En
realizaciones particulares de la presente invención, el adenovirus
es un adenovirus incompetente para la replicación. En otras
realizaciones, el adenovirus carece al menos de una parte de la
región E1. En determinados aspectos, el adenovirus carece al menos
de una parte de la región E1A y/o E1B. En otras realizaciones, las
células huésped pueden complementar la replicación. En realizaciones
particularmente preferidas, las células huésped son células 293.
En una realización preferida de la presente
invención se contempla que el constructo génico exógeno codifica
para un gen terapéutico. Por ejemplo, el gen terapéutico puede
codificar para ras antisentido, myc antisentido,
raf antisentido, erb antisentido, src
antisentido, fms antisentido, jun antisentido,
trk antisentido ret antisentido, gsp
antisentido, hst antisentido, bcl antisentido,
abl antisentido, Rb, CFTR, p16, p21, p27, p57, p73,
C-CAM, APC, CTS-1, zac1, scFV
ras, DCC, NF-1, NF-2,
WT-1, MEN-I, MEN-II,
BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA2, IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11 IL-12, GM-CSF
G-CSF, timidina cinasa o p53.
En realizaciones particulares, las células se
lisan y se recogen usando un detergente no desnaturalizante. En
realizaciones preferidas el detergente puede ser Thesit®,
NP-40®, Tween-20®,
Brij-58®, Triton X®-100 u octilglucósido. En otros
aspectos determinados de la presente invención se trata el lisado
celular con Benzonase®, o Pulmozyme®.
En realizaciones particulares, el método
comprende además una etapa de concentración que emplea filtración a
través de membrana. En realizaciones particulares, la filtración es
filtración de flujo tangencial. En realizaciones preferidas, la
filtración puede utilizar una membrana de NMWC (Nominal Molecular
Weight cut-off (límite de peso molecular nominal) de
100 a 300K, celulosa regenerada o polietersulfona.
La presente invención describe también un
adenovirus producido según un proceso que comprende las etapas de
hacer crecer las células huésped en medios a una tasa de perfusión
baja, infectar las células huésped con un adenovirus, recoger y
lisar las células huésped para producir un lisado celular bruto,
concentrar el lisado celular bruto, cambiar el tampón del lisado
celular bruto, y reducir la concentración de los ácidos nucleicos
contaminantes en el lisado celular bruto.
Otros aspectos de la presente invención
describen un método para la purificación de un adenovirus que
comprende hacer crecer las células huésped, infectar las células
huésped con un adenovirus, recoger y lisar las células huésped
poniendo en contacto las células con un detergente no
desnaturalizante para producir un lisado celular bruto, concentrar
el lisado celular bruto, cambiar el tampón del lisado celular bruto,
y reducir la concentración de los ácidos nucleicos contaminantes en
el lisado celular bruto.
En realizaciones particulares, el detergente
puede ser Thesit®, NP-40®,
Tween-20®, Brij-58®, Triton
X-100® u octilglucósido. En realizaciones más
particulares el detergente está presente en la disolución de lisis
en una concentración de aproximadamente el 1%(p/v).
En otros aspectos de la presente invención se
describe un adenovirus producido según un proceso que comprende las
etapas de hacer crecer las células huésped, infectar las células
huésped con un adenovirus, recoger y lisar las células huésped
poniendo en contacto las células con un detergente para producir un
lisado celular bruto, concentrar el lisado celular bruto, cambiar
el tampón del lisado celular bruto, y reducir la concentración de
los ácidos nucleicos contaminantes en el lisado celular bruto.
Todavía en otra realización, la presente
invención describe un método para la purificación de un adenovirus
que comprende las etapas de hacer crecer las células huésped en
medios libres de suero; infectar dichas células huésped con un
adenovirus; recoger y lisar dichas células huésped para producir un
lisado celular bruto; concentrar dicho lisado celular bruto;
cambiar el tampón del lisado celular bruto; y reducir la
concentración de los ácidos nucleicos contaminantes en dicho lisado
celular bruto. En realizaciones preferidas, pueden hacerse crecer
las células independientemente como un cultivo en suspensión celular
o como un cultivo dependiente de anclaje.
En realizaciones particulares, las células
huésped se adaptan para el crecimiento en medios libres de suero.
En realizaciones más preferidas, la adaptación para el crecimiento
en medios libres de suero comprende una disminución secuencial del
contenido en suero bovino fetal de los medios de crecimiento. Más
particularmente, los medios libres de suero comprenden un contenido
en suero bovino fetal inferior al 0,03% v/v.
En otras realizaciones, el método comprende
además aislar una partícula adenoviral a partir de dicho lisado
usando cromatografía. En realizaciones preferidas, el aislamiento
consiste esencialmente en una única etapa de cromatografía.
También se describe, por la presente invención
un adenovirus producido según un proceso que comprende las etapas
de hacer crecer las células huésped en medios libres de suero;
infectar dichas células huésped con un adenovirus; recoger y lisar
dichas células huésped para producir un lisado celular bruto;
concentrar dicho lisado celular bruto; cambiar el tampón del lisado
celular bruto; y reducir la concentración de los ácidos nucleicos
contaminantes en dicho lisado celular bruto.
La presente invención describe además una célula
293 huésped adaptada para el crecimiento en medios libres de suero.
En determinados aspectos, la adaptación para el crecimiento en
medios libres de suero comprende una disminución secuencial del
contenido en suero bovino de los medios de crecimiento. En
realizaciones particulares, la célula se adapta para el crecimiento
en cultivo en suspensión. En realizaciones particulares, las células
de la presente invención se denominan células IT293SF. Estas
células se depositaron en la colección americana de cultivo tisular
(American Tissue Culture Collection (ATCC)) con el fin de satisfacer
los requisitos del tratado de Budapest sobre reconocimiento
internacional de los depósitos de microorganismos para los fines
del procedimiento de la patente. Las células se depositaron por el
Dr. Shuyuan Zhang en nombre de Introgen Therapeutics, Inc.
(Houston, Tx.), el 17 de noviembre de 1997. La línea celular IT293SF
se deriva de una adaptación de la línea celular 293 en cultivo en
suspensión libre de suero tal como se describe en el presente
documento. Las células pueden cultivarse en medios libres de suero
IS 293 (Irvine Scientific. Santa Ana, Ca.) complementados con
heparina 100 mg/l y pluronic F-68 al 0,1%, y son
permisivos para la infección por adenovirus humano.
Otros objetos, características y ventajas de la
presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente
descripción detallada.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar de manera
adicional determinados aspectos de la presente invención. La
invención puede entenderse mejor mediante referencia a uno o más de
estos dibujos en combinación con la descripción detallada de
realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
Figura 1A y Figura 1B. Perfiles de HPLC de las
disoluciones virales a partir de series de producción usando tasas
de perfusión del medio caracterizadas como "alta" (Figura 1A) y
"baja" (Figura 1B).
Figura 2. El perfil de HPLC del lisado celular
bruto (CCL) a partir de CellCube™ (línea continua A_{260}; línea
discontinua A_{280}).
Figura 3A, Figura 3B, Figura 3C, Figura 3D y
Figura 3E. Los perfiles de HPLC de las disoluciones de lisis a
partir de CellCube™ usando diferentes detergentes. Figura 3A
Thesit®. Figura 3B Triton®X-100. Figura 3C.
NP-40®. Figura 3D. Brij®80. Figura 3E. Tween®20.
Concentración del detergente: 1% (p/v) temperatura de lisis:
temperatura ambiente. (línea continua A_{260}; línea discontinua
A_{280}).
Figura 4A y Figura 4B. Los perfiles de HPLC de
la disolución de virus antes (Figura 4A) y después (Figura 4B) del
tratamiento con Benzonase. (línea continua A_{260}; línea
discontinua A_{280}).
Figura 5. El perfil de HPLC de la disolución de
virus después del tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 1M.
(línea continua A_{260}; línea discontinua A_{280}).
Figura 6. Purificación del virus AdCMVp53 en
condiciones del tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2
M, pH = 7,5.
Figura 7. Purificación del virus AdCMVp53 en
condiciones del tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2
M, pH = 9,0.
Figura 8A, Figura 8B, y Figura 8C. Análisis de
HPLC de las fracciones obtenidas durante la purificación. Figura 8A
fracción 3. Figura 8B fracción 4, Figura 8C fracción 8. (línea
continua A_{260}; línea discontinua A_{280}).
Figura 9. Purificación del virus AdCMVp53 en
condiciones del tampón A de Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,3
M, pH = 9.
Figura 10A, Figura 10B, Figura 10C, Figura 10D y
Figura 10E. Análisis de HPLC de fracciones de virus bruto obtenidas
durante la purificación y virus purificado en gradiente de CsCl.
Figura 10A disolución de virus bruto. Figura 10B Flujo a través.
Figura 10C. número pico 1. Figura 10D. número pico 2. Figura 10E.
virus purificado en CsCl. (línea continua A_{260}; línea
discontinua A_{280}).
Figura 11. Perfil de purificación en HPLC a
partir de una columna de 5 cm di.
Figura 12. Las proteínas estructurales de
adenovirus principales detectadas en SDS-PAGE.
Figura 13. La concentración de BSA en el virus
purificado como nivel detectado del ensayo de inmunotransferencia de
tipo Western.
Figura 14. El cromatograma para el material del
lisado celular bruto generado a partir del CellCube™.
Figura 15. El perfil de elución de la disolución
de virus tratado purificada usando el método de la presente
invención usando resina Toyopearl SuperQ.
Figura 16A y Figura 16B. Análisis de HPLC de la
fracción de virus a partir del protocolo de purificación. Fig 16A
perfiles de HPLC de la fracción de virus a partir de la primera
etapa de purificación. Figura 16B perfiles de HPLC de la fracción de
virus a partir de la segunda purificación. (línea continua
A_{260}; línea discontinua A_{280}).
Figura 17. Purificación de disolución de virus
Tween®harvest al 1% de virus con tasa de perfusión del medio
baja.
Figura 18. Análisis de HPLC de la fracción de
virus producida con tasa de perfusión del medio baja.
Figura 19A, Figura 19B y Figura 19C. Análisis
del virus purificado en columna. Figura 19A análisis
SDS-PAGE. Figura 19B inmunotransferencia de tipo
Western para BSA. Figura 19C inmunotransferencia en líneas de ácidos
nucleicos para determinar la concentración de ácido nucleico
contaminante.
Figura 20A, Figura 20B, Figura 20C, Figura 20D,
Figura 20E y Figura 20F. Estudio de la capacidad de la resina
Toyopearl SuperQ 650M. Figura 20A Flujo a través a partir de la
razón de carga de 1:1. Figura 20B. Virus purificado a partir de la
razón de carga de 1:1. Figura 20C Flujo a través de la razón de
carga de 2:1. Figura 20D. Virus purificado a partir de la razón de
carga de 2:1. Figura 20E Flujo a través a partir de la razón de
carga de 3:1. Figura 20F. Virus purificado a partir de la razón de
carga de 3:1. (línea continua A_{260}; línea discontinua
A_{280}).
Figura 21. Virus purificado en columna de
ultracentrifugación isopícnica en CsCl.
Figura 22. Los perfiles de HPLC de los virus
intactos presentes en el virus purificado en columna. A. Virus
intacto B. Virus defectuoso. (línea continua A_{260}; línea
discontinua A_{280}).
Figura 23. Un diagrama de flujo de la
purificación y producción para AdCMVp53.
Se ha demostrado que los vectores adenovirales
pueden usarse con éxito en la expresión génica eucariota y en el
desarrollo de vacunas. Recientemente, estudios en animales han
demostrado que los adenovirus recombinantes podrían usarse para
terapia génica. Estudios exitosos de la administración de adenovirus
recombinante a diferentes tejidos han probado la eficacia de
vectores adenovirales en tratamiento. Este éxito ha conducido al uso
de vectores de este tipo en ensayos clínicos en seres humanos. En
la actualidad existe un aumento en la demanda de la producción de
vectores adenovirales para usarse en diversos tratamientos. Las
técnicas actualmente disponibles son insuficientes para satisfacer
una demanda de este tipo. La presente invención proporciona métodos
para la producción de grandes cantidades de adenovirus para su uso
en tales tratamientos.
La presente invención implica un proceso que se
ha desarrollado para la producción y purificación de un adenovirus
recombinante de deficiente replicación. El proceso de producción se
basa en el uso de un biorreactor CellCube™ para el crecimiento
celular y la producción de virus. Se encontró que una tasa de
perfusión dada, usada durante las fases del crecimiento celular y
la producción de virus del cultivo, tiene un efecto significativo
sobre la purificación del virus aguas abajo. Más específicamente,
una tasa de perfusión baja a media mejora la producción de virus.
Además, la disolución de lisis compuesta del detergente tamponado,
usada para lisar células en el Cellcube™ al final de la fase de
producción de virus, también mejora el proceso. Con estas dos
ventajas, la disolución de virus bruto recogida puede purificarse
usando una única serie de cromatografía de intercambio iónico, tras
la concentración/diafiltración y tratamiento con nucleasa para
reducir la concentración de ácido nucleico contaminante en la
disolución de virus bruto. El virus purificado en columna tiene una
pureza equivalente con respecto al virus purificado en gradiente de
CsCl doble. La recuperación del producto viral en el proceso total
es del 70% \pm 10%. Ésta es una mejora significativa sobre los
resultados notificados por Huyghe et al. (1996). Comparada
con la ultracentrifugación en gradiente de CsCl doble, la
purificación en columna tiene la ventaja de ser más consistente,
escalable, validable, rápida y menos cara. Este nuevo proceso
representa una mejora significativa en la tecnología para la
fabricación de vectores adenovirales para terapia génica.
Por tanto, la presente invención está diseñada
para aprovecharse de estas mejoras en purificación y sistemas de
cultivo a gran escala con el fin de producir y purificar vectores
adenovirales. A continuación se exponen en detalle los diversos
componentes para un sistema de este tipo y los métodos para la
producción de adenovirus con los mismos.
En una realización preferida, la generación y
propagación de los vectores adenovirales dependen de una única
línea celular auxiliar, denominada 293, que se transformó a partir
de células de riñón embrionario humano mediante fragmentos de ADN
del serotipo 5 del adenovirus (Ad5) y expresa de manera estructural
proteínas E1 (Graham et al., 1977). Debido a que la región
E3 es prescindible en el genoma Ad (Jones y Shenk, 1978), los
vectores Ad habituales, con ayuda de las células 293, portan ADN
foráneo o bien en la E1, la E3 o bien ambas regiones (Graham y
Prevec, 1991; Bett et al., 1994).
También se describen líneas celulares
recombinantes que expresan parte del genoma adenoviral. Estas líneas
celulares pueden soportar la replicación de vectores recombinantes
de adenovirus y virus auxiliares que tienen defectos en
determinados genes adenovirales, es decir, son "permisivos"
para el crecimiento de estos virus y vectores. La célula
recombinante se denomina también como célula auxiliar debido a la
capacidad para complementar defectos en, y soportar la replicación
de, vectores adenovirales incompetentes para la replicación. El
prototipo para una célula auxiliar adenoviral es la línea celular
293, que contiene la región E1 adenoviral. Las células 293 soportan
la replicación de vectores adenovirales que carecen de funciones E1
proporcionando en trans los elementos activos de E1
necesarios para la replicación.
Las células auxiliares según la presente
invención se derivan de una célula de mamífero y, preferiblemente,
de una célula de primate tal como la célula de riñón embrionario
humano. Aunque se prefieren diversas células de primate y lo que
más se prefiere son células humanas o incluso de riñón embrionario
humano, cualquier tipo de célula que pueda soportar la replicación
de los virus sería aceptable en la puesta en práctica de la
invención. Otros tipos de células pueden incluir, pero no se
limitan a células Vero, células CHO o cualquier célula eucariota
para la que se establecen técnicas de cultivo tisular siempre que
las células sean permisivas para adenovirus. El término
"permisivo para adenovirus" significa que el adenovirus o
vector adenoviral puede completar todo el ciclo de vida intracelular
del virus dentro del entorno celular.
La célula auxiliar puede derivarse a partir de
una línea celular existente, por ejemplo, a partir de una línea
celular 293, o desarrollarse de novo. Tales células
auxiliares expresan los genes adenovirales necesarios para
complementar deleciones en trans en un genoma adenoviral o
que soporta la replicación de un, por otra parte, vector adenoviral
defectuoso, tal como el E1, E2, E4, E5 y funciones tardías. Una
parte en particular del genoma del adenovirus, la región E1, se ha
usado ya para generar líneas celulares complementarias. O bien
integradas o bien episomales, las partes del genoma del adenovirus
que carecen de un origen viral de replicación, cuando se introducen
en una línea celular, no se replicarán incluso cuando la célula se
superinfecta con adenovirus de tipo natural. Además, debido a que
la transcripción de la unidad tardía principal es tras la
replicación del ADN viral, las funciones tardías del adenovirus no
pueden expresarse suficientemente a partir de una línea celular.
Por tanto, las regiones E2, que se solapan con las funciones tardías
(L1-5), se proporcionarán por virus auxiliares y no
por la línea celular. Normalmente, una línea celular que puede
usarse para llevar a la práctica la presente invención expresará E1
y/o E4.
Tal como se utiliza en el presente documento, el
término célula "recombinante" pretende referirse a una célula
en la que se ha introducido un gen, tal como un gen del genoma
adenoviral o de otra célula. Por tanto, las células recombinantes
se distinguen de las células que se producen de manera natural que
no contienen un gen introducido de manera recombinante. Las células
recombinantes son por tanto células que tienen un gen o genes
introducidos a través de "la mano del hombre".
La replicación se determina poniendo en contacto
una capa de células no infectadas o de células infectadas con uno o
más virus auxiliares, con partículas de virus, seguido de la
incubación de las células. La formación de placas virales, o zonas
libres de células en la capa celular, es el resultado de la lisis
celular provocado por la expresión de determinados productos
virales. La lisis celular es un indicativo de la replicación
viral.
Ejemplos de otras líneas celulares de mamífero
útiles que pueden usarse con un virus competente para la replicación
o convertirse en células huésped complementarias para su uso con
virus deficientes en replicación son células Vero y HeLa y líneas
celulares de células de ovario de hámster chino, W138, BHK,
COS-7, HepG2, 3T3, RIN y MDCK.
En determinadas realizaciones, puede ser útil
emplear sistemas de selección que impiden el crecimiento de células
no deseadas. Esto puede lograrse en virtud de transformar
permanentemente una línea celular con un marcador seleccionable o
transduciendo o infectando una línea celular con un vector viral que
codifica para un marcador seleccionable. En cualquiera de las
situaciones, el cultivo de la célula transformada/transducida con
un compuesto selectivo o fármaco apropiado dará como resultado la
mejora, en la población celular, de las células que portan el
marcador.
Ejemplos de marcadores incluyen, pero no se
limitan a los genes de timidina cinasa del HSV, hipoxantina guanina
fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa, en
células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, la
resistencia al antimetabolito puede usarse como la base de la
selección para dhfr, que confiere resistencia al
metotrexato; gpt, que confiere resistencia al ácido
micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G418;
e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.
La adaptación a la retirada del suero de células
dependientes de anclaje a cultivos en suspensión libres de suero se
ha usado para la producción de proteínas recombinantes (Berg, 1993)
y vacunas virales (Perrin, 1995). Hasta recientemente ha habido
pocos informes sobre la adaptación de las células 293A a cultivos en
suspensión libres de suero. Gilbert informó de la adaptación de las
células 293A a cultivos en suspensión libres de suero para la
producción de proteína recombinante y adenovirus (Gilbert, 1996). Se
ha usado un método de adaptación similar para la adaptación de las
células A549 células al cultivo en suspensión libre de suero para la
producción de adenovirus (Morris et al., 1996). Los
rendimientos del virus específico de la célula, sin embargo, son
aproximadamente 5-10 veces inferiores a los
conseguidos en las células unidas originarias.
Usando el procedimiento de retirada del suero
similar, los inventores han adaptado con éxito las células 293A
células al cultivo en suspensión libre de suero (células 293SF). En
este procedimiento, se adaptaron las células 293 a un medio 293
comercialmente disponible disminuyendo de manera secuencial la
concentración de FBS en frascos T. Brevemente, la concentración
sérica inicial en los medios era aproximadamente como en los medios
FBS DMEM al 10% en un frasco T-75 y se adaptaron las
células a los medios libres de suero IS 293 en frascos T
disminuyendo la concentración de FBS en los medios de manera
secuencial. Tras 6 pases en los frascos T-75 se
calculó que el % de FBS era de aproximadamente el 0,019% y las
células 293. Las células se subcultivaron dos veces más en los
frascos T antes de transferirse a frascos centrifugadores. Los
resultados descritos a continuación en el presente documento
muestran que las células crecen satisfactoriamente en el medio libre
de suero (medio IS293, Irvine Scientific, Santa Ana, CA). El tiempo
de doblado promedio de las células fue de 18-24 h
consiguiendo concentraciones celulares estacionarias del orden de
4-10 x 10^{6} células/ml sin cambio del medio.
Se han usado dos metodologías para adaptar las
células 293 a cultivos en suspensión. Graham adaptó células 293A
células a cultivo en suspensión (células 293N3S) mediante 3 pases
consecutivos en ratones desnudos (Graham, 1987). Se encontró que
las células 293N3S en suspensión podían soportar vectores
adenovirales E1. Sin embargo, Garnier et al. (1994)
observaron que las células 293N35 tenían una fase de latencia
inicial relativamente larga en suspensión, una tasa de crecimiento
baja y una fuerte tendencia a aglutinarse.
El segundo método que se ha usado es una
adaptación gradual de las células 293A al crecimiento en suspensión
(Cold Spring Harbor Laboratories, células 293S). Garnier et
al. (1994) informaron del uso de células 293S para la
producción de proteínas recombinantes a partir de vectores
adenovirales. Los autores encontraron que las células 293S se
aglutinaban mucho menos en medios libres de calcio y que un cambio
por medio nuevo en el momento de la infección por virus podía
aumentar de manera significativa la producción de proteína. Se
encontró que la glucosa era el factor restrictivo en el cultivo sin
cambio del medio.
En la presente invención, las células 293
adaptadas para el crecimiento en condiciones libres de suero, se
adaptaron a un cultivo en suspensión. Se transfirieron las células a
un cultivo en suspensión centrifugado de 250 ml libre de suero
(volumen de trabajo 100 ml) para el cultivo en suspensión a una
densidad celular inicial de entre aproximadamente 1,18E+5 cv/ml y
aproximadamente 5,22E+5 cv/ml. Los medios pueden complementarse con
heparina para evitar la agregación de las células. Este sistema de
cultivo celular permite cierto aumento de la densidad celular,
mientras que se mantiene la viabilidad celular. Una vez que estas
células están creciendo en cultivo, las células se subcultivan en
los frascos centrifugados aproximadamente 7 pases más. Puede
observarse que se reduce progresivamente el tiempo de doblado de
las células hasta que al final de los pases sucesivos el tiempo de
doblado es aproximadamente de 1,3 días, es decir comparable a 1,2
días de las células en medios FBS al 10% en el cultivo celular
unido. En los medios IS 293 libres de suero complementados con
heparina casi todas las células existían como células individuales
que no formaban agregados de células en el cultivo en
suspensión.
La capacidad para producir vectores virales
infecciosos es cada vez más importante para la industria
farmacéutica, especialmente en el contexto de la terapia génica.
Durante la última década, los avances en biotecnología han
conducido a la producción de varios vectores virales importantes que
tienen posibles usos como tratamientos, vacunas y máquinas para la
producción de proteínas. El uso de vectores virales en cultivos de
mamífero tiene ventajas sobre las proteínas producidas en huéspedes
bacterianos u otras formas de vida inferior en su capacidad para
procesar de manera postraslacional estructuras de proteínas
complejas tales como plegamiento dependiente de disulfuro y
glicosilación.
El desarrollo del cultivo celular para la
producción de vectores de virus se ha ayudado enormemente del
desarrollo en biología molecular de técnicas para el diseño y la
construcción de sistemas de vectores altamente eficaces en cultivos
celulares de mamífero, una serie de marcadores de selección útiles,
esquemas de amplificación génica y un entendimiento más comprensivo
de los mecanismos celulares y bioquímicos implicados en obtener la
molécula biológicamente activa final a partir del vector
introducido.
Frecuentemente, los factores que afectan al lado
aguas abajo (en este caso, tras la lisis celular) del aumento de
escala de fabricación no se consideraron antes de seleccionar la
línea celular como el huésped para el sistema de expresión. Además,
el desarrollo de sistemas de biorreactor que pueden mantener
cultivos de muy alta densidad durante periodos prolongados de
tiempo no ha estado a la altura de la creciente demanda para el
aumento de la producción a precios más bajos.
La presente invención se aprovechará de la
tecnología de biorreactor recientemente disponible. Hacer crecer
células según la presente invención en un biorreactor permite la
producción a gran escala de células biológicamente activas de
manera completa que pueden infectarse por los vectores adenovirales
de la presente invención. Haciendo funcionar el sistema a una tasa
de perfusión baja y aplicando un esquema diferente para la
purificación de las partículas infectantes, la invención
proporciona una estrategia de purificación que es fácilmente
escalable para producir grandes cantidades de producto altamente
purificado.
Los biorreactores se han usado ampliamente para
la producción de productos biológicos a partir de tanto cultivos
celulares animales dependientes de anclaje como en suspensión. Las
células productoras usadas más ampliamente para la producción de
vector adenoviral son células de riñón embrionario humano
dependientes de anclaje (células 293). Los biorreactores que han de
desarrollarse para la producción de vector adenoviral deben tener la
característica de elevada área superficial de cultivo específico de
volumen con el fin de conseguir una alta densidad de células
productoras y alto rendimiento de virus. El cultivo celular sobre
microsoporte en un biorreactor de tanque agitado proporciona una
muy elevada área superficial de cultivo específico de volumen y se
ha usado para la producción de vacunas virales (Griffiths, 1986).
Además, los biorreactores de tanque agitado han demostrado
industrialmente ser escalables. El sistema de cultivo celular
CellCube™ de multiplaca fabricado por Coming-Costar
ofrece también una muy elevada área superficial de cultivo
específico de volumen. Las células crecen sobre ambas caras de las
placas de cultivo selladas una a otra herméticamente en forma de un
cubo compacto. A diferencia de los biorreactores de tanque agitado,
la unidad de cultivo Cellcube™ es desechable. Esto es muy deseable
en la producción de la etapa temprana del producto clínico debido a
los gastos de capital reducidos, costes de seguridad de calidad y
control de calidad asociados a los sistemas desechables. En
consideración a las ventajas ofrecidas por los diferentes sistemas,
se evaluó la capacidad tanto del biorreactor de tanque agitado como
del sistema Cellcube™ para la producción de adenovirus.
Las células humanas y animales pueden propagarse
in vitro de dos modos: como células no dependientes de
anclaje que crecen libremente en suspensión por toda la masa del
cultivo; o como células dependientes de anclaje que requieren unión
a un sustrato sólido para su propagación (es decir, un tipo de
monocapa de crecimiento celular).
Cultivos en suspensión o no dependientes de
anclaje a partir de líneas celulares establecidas continuas son los
medios más ampliamente utilizados de producción a gran escala de
células y productos celulares. El cultivo en suspensión a gran
escala basado en tecnología de fermentación microbiana (bacteriana y
de levadura) tiene claras ventajas para la fabricación de productos
de células de mamíferos. Los procesos son relativamente simples de
realizar y sencillos de aumentar a escala. Pueden proporcionarse
condiciones homogéneas en el reactor, lo que permite la
monitorización precisa y el control de la temperatura, oxígeno
disuelto y pH, y garantiza que pueden tomarse muestras
representativas del cultivo.
Sin embargo, las células cultivadas en
suspensión no pueden usarse siempre en la producción de agentes
biológicos. Aún se considera que los cultivos en suspensión tienen
potencial tumorígeno y por tanto su uso como sustratos para la
producción pone límites al uso de los productos resultantes en
aplicaciones en seres humanos y en veterinaria (Petricciani, 1985;
Larsson, 1987). Los virus propagados en cultivos en suspensión, en
contraposición a los cultivos dependientes de anclaje, pueden
algunas veces provocar cambios rápidos en los marcadores virales,
conduciendo a una inmunogenicidad reducida (Bahnemann, 1980).
Finalmente, algunas veces, incluso líneas celulares recombinantes
pueden secretar cantidades considerablemente mayores de productos
cuando se propagan como cultivos dependientes de anclaje, comparado
con la misma línea celular en suspensión (Nilsson y Mosbach, 1987).
Por estos motivos se usan mucho diferentes tipos de células
dependientes de anclaje en la producción de diferentes productos
biológicos.
Se acometió el cultivo en suspensión a gran
escala de cultivos de mamífero en tanques agitados. Se adaptaron
los instrumentos y los controles para los biorreactores, junto con
el diseño de los fermentadores, a partir de aplicaciones
microbianas relacionadas. Sin embargo, reconociendo el aumento de la
demanda de control de contaminación en los cultivos de mamífero de
crecimiento más lento, se ejecutaron rápidamente diseños asépticos
mejorados, mejorando la fiabilidad de estos reactores. Los
instrumentos y los controles son básicamente los mismos que se
encontraron en otros fermentadores, e incluyen controles de
agitación, temperatura, oxígeno disuelto y pH. Están disponibles
autoanalizadores y sondas más avanzadas para mediciones en línea o
fuera de línea de la turbidez (una función de las partículas
presentes), capacitancia (una función de las células viables
presentes), glucosa/lactato, carbonato/bicarbonato y dióxido de
carbono. Las densidades celulares máximas obtenibles en cultivos en
suspensión son relativamente bajas a aproximadamente
2-4 x 10^{6} células/ml de medio (que es inferior
a 1 mg de peso celular seco por ml), bastante por debajo de los
valores conseguidos en fermentación microbiana.
Dos diseños de reactor de cultivo en suspensión
son los más ampliamente utilizados en la industria debido a su
simplicidad y robustez de funcionamiento (el reactor con agitación y
el reactor de agitación por inyección de aire). El diseño del
reactor con agitación se ha utilizado con éxito en una escala de
capacidad de 8000 litros para la producción del interferón
(Phillips et al., 1985; Mizrahi, 1983). Se hacen crecer las
células en un tanque de acero inoxidable con una razón de la altura
con respecto al diámetro de 1:1 a 3:1. Normalmente se mezcla el
cultivo con uno o más agitadores, basados en discos de paletas o
modelos de hélice marina. Se han descrito sistemas agitadores que
ofrecen menos fuerzas de corte que las paletas. La agitación puede
impulsarse o bien directamente o bien indirectamente mediante
impulsos acoplados magnéticamente. Los impulsos indirectos reducen
el riesgo de contaminación microbiana a través de sellos sobre los
ejes del agitador.
El reactor de agitación por inyección de aire,
descrito también inicialmente para la fermentación microbiana y
adaptado posteriormente para el cultivo de mamífero, se basa en una
corriente de gas tanto para mezclar como para oxigenar el cultivo.
La corriente de gas entra en una sección ascendente del reactor e
impulsa la circulación. El gas se desprende en la superficie del
cultivo, provocando que el líquido más denso libre de burbujas de
gas se desplace hacia abajo en la sección del tubo vertical de
bajada del reactor. La ventaja principal de este diseño es la
simplicidad y la falta de necesidad de mezclado mecánico.
Normalmente, la razón de la altura con respecto al diámetro es
10:1. El reactor de agitación por inyección de aire se aumenta a
escala de manera relativamente fácil, tiene buena transferencia de
masa de gases y genera fuerzas de corte relativamente bajas.
La mayoría de los cultivos en suspensión a gran
escala funcionan como procesos discontinuos o de alimentación
discontinua ya que son los más sencillos realizar y de aumentar a
escala. Sin embargo, están disponibles procesos continuos basados
en principios de perfusión o quimiostato.
Un proceso discontinuo es un sistema cerrado en
el que se observa un perfil de crecimiento típico. Una fase de
latencia va seguida de fases exponencial, estacionaria y de
disminución. En un sistema de este tipo, el entorno está cambiando
continuamente a medida que los nutrientes se reducen y los
metabolitos se acumulan. Esto hace que un análisis de los factores
que influyen en la productividad y crecimiento celular, y por tanto
en la optimización del proceso, sea una tarea compleja. La
productividad de un proceso discontinuo puede aumentarse mediante
la alimentación controlada de nutrientes esenciales para prolongar
el ciclo de crecimiento. Un proceso de alimentación discontinua de
este tipo es aún un sistema cerrado, ya que no se eliminan las
células, productos y productos de desecho.
En lo que aún es un sistema cerrado, puede
conseguirse la perfusión del medio nuevo a través del cultivo
reteniendo las células con una variedad de dispositivos (por
ejemplo filtro de centrifugación (spin filter) de malla fina,
filtros de membrana de placa plana o fibra hueca, tubos de
sedimentación). Los cultivos en filtro de centrifugación pueden
producir densidades celulares de aproximadamente 5 x 10^{7}
células/ml. Un verdadero sistema abierto y el proceso de perfusión
más simple es el quimiostato en el que hay una entrada de flujo de
medio y una salida de flujo de células y productos. El medio de
cultivo se alimenta al reactor a una tasa constante y
predeterminada que mantiene la tasa de dilución del cultivo a un
valor inferior a la tasa máxima de crecimiento específico de las
células (para evitar el arrastre de la masa celular del reactor). El
fluido del cultivo, que contiene células y productos celulares y
subproductos, se elimina a la misma tasa.
Tradicionalmente, los cultivos celulares
dependientes de anclaje se propagan sobre el fondo de vasos de
plástico o vidrio pequeños. La reducida razón de la superficie con
respecto al volumen ofrecida por técnicas tradicionales y clásicas,
adecuadas para la escala de laboratorio, ha creado un
embotellamiento en la producción de células y productos celulares a
gran escala. En un intento por proporcionar sistemas que ofrezcan
grandes superficies accesibles para el crecimiento celular en un
volumen de cultivo pequeño, se han propuesto varias técnicas: el
sistema en frascos rotativos, el propagador de placas apiladas,
botellas de películas espiral, el sistema de fibras huecas, el
lecho fijo, el sistema intercambiador de placas, y carrete de tubos
de membrana. Debido a que estos sistemas no son de naturaleza
homogénea, y se basan algunas veces en procesos múltiples, sufren
los siguientes defectos - potencial limitado para aumentarse a
escala, dificultades para la toma de muestras celulares, potencial
limitado para medir y controlar parámetros del proceso esenciales y
dificultad para mantener homogéneas las condiciones del medio en
todo el
cultivo.
cultivo.
A pesar de estas desventajas, un proceso usado
comúnmente para la producción celular dependiente de anclaje a gran
escala es el frasco rotativo. Siendo poco más que un frasco T
grande, de diferente forma, la simplicidad del sistema lo hace muy
fiable y, por tanto, atractivo. Están disponibles robots
automatizados totalmente que pueden manejar miles de frascos
rotativos al día, eliminando por tanto el riesgo de contaminación e
inconsistencia asociado al manejo humano intenso requerido de otro
modo. Con cambios frecuentes de los medios, los cultivos en frascos
rotativos pueden conseguir densidades celulares próximas a 0,5 x
10^{6} células/cm^{2} (correspondiente a aproximadamente
10^{9} células/frasco o casi 10^{7} células/ml de medios de
cultivo).
\newpage
En un esfuerzo por vencer los defectos de los
procesos de cultivo tradicionales dependientes de anclaje, van
Wezel (1967) desarrolló el concepto de los sistemas de cultivo sobre
microsoporte. En este sistema, las células se propagan sobre la
superficie de partículas sólidas pequeñas suspendidas en el medio de
crecimiento mediante agitación lenta. Las células se unen a los
microsoportes y crecen gradualmente hasta la confluencia sobre la
superficie del microsoporte. De hecho, este sistema de cultivo a
gran escala mejora el cultivo dependiente de unión desde un proceso
de disco único hasta un proceso unitario en el que se han reunido
tanto el cultivo en suspensión como en monocapa. Por tanto, la
combinación de la superficie necesaria para que una célula crezca
con las ventajas del cultivo en suspensión homogénea aumenta la
producción.
Las ventajas de cultivos sobre microsoporte
sobre la mayoría de los otros métodos de cultivo a gran escala,
dependientes de anclaje, son varios aspectos. En primer lugar, los
cultivos sobre microsoporte ofrecen una alta razón de la superficie
con respecto al volumen (variable cambiando la concentración del
soporte) que conduce a altos rendimientos de densidad celular y un
potencial para obtener productos celulares altamente concentrados.
Los rendimientos celulares son de hasta 1-2 x
10^{7} células/ml cuando los cultivos se propagan en un modo de
reactor perfundido. En segundo lugar, las células pueden propagarse
en un vaso de proceso unitario, en lugar de usar muchos vasos
pequeños de baja productividad (es decir, frascos o platos). Esto da
como resultado una utilización mucho mejor del nutriente y un
ahorro considerable de medio de cultivo. Además, la propagación en
un único reactor conduce a la reducción de la necesidad de espacio
de las instalaciones y en el número de etapas de tratamiento
requeridas por célula, reduciendo así el coste del laboratorio y el
riesgo de contaminación. En tercer lugar, el cultivo en suspensión
sobre microsoporte homogéneo y bien mezclado hace posible
monitorizar y controlar las condiciones ambientales de control (por
ejemplo, pH, pO_{2}, y concentración de los componentes de
medio), conduciendo así a una recuperación de producto y propagación
celular más reproducible. En cuarto lugar, es posible tomar una
muestra representativa para observación microscópica, pruebas
químicas o enumeración. En quinto lugar, debido a que los
microsoportes sedimentan en suspensión rápidamente, puede hacerse
uso de un proceso alimentado discontinua o recogida de las células
de una manera relativamente fácil. En sexto lugar, el modo de la
propagación del cultivo dependiente de anclaje sobre los
microsoportes hace posible usar este sistema para otras
manipulaciones celulares, tales como transferencia celular sin el
uso de enzimas proteolíticas, cocultivo de células, transplante en
animales y perfusión del cultivo usando decantadores, columnas,
lechos fluidificados o fibras huecas para la retención del
microsoporte. En séptimo lugar, los cultivos sobre microsoporte se
aumentan a escala de manera relativamente fácil usando equipamiento
convencional usado para el cultivo de células animales y microbianas
en suspensión.
Un método que ha demostrado ser particularmente
útil para cultivar células de mamífero es la microencapsulación.
Las células de mamífero se retienen dentro de una membrana de
hidrogel semipermeable. Se forma una membrana porosa alrededor de
las células, permitiendo el intercambio de nutrientes, gases y
productos metabólicos con el medio en masa que rodea la cápsula. Se
han desarrollado varios métodos que son suaves, rápidos y no tóxicos
y en los que la membrana resultante es suficientemente porosa y
fuerte para sostener la masa celular creciente en todo el periodo
de cultivo. Todos estos métodos se basan en alginato soluble
gelificado mediante contacto de la gota con una disolución que
contiene calcio. Lim (1982, patente de los EE.UU. 4.352.883)
describe células concentradas en una disolución de alginato de
sodio aproximadamente al 1% que se fuerzan a través de un orificio
pequeño, formando gotas, y liberándose en una disolución de cloruro
de calcio aproximadamente al 1%. Luego se cuelan las gotas en una
capa de poliaminoácido que se une iónicamente al alginato de la
superficie. Finalmente vuelve a licuarse el alginato tratando la
gota en un agente quelante para eliminar los iones calcio. Otros
métodos usan células en una disolución de calcio para echarlas gota
a gota en una disolución de alginato, creando así una esfera de
alginato hueca. Un enfoque similar implica células en una disolución
de quitosano echada gota a gota en el alginato, creando también
esferas huecas.
Las células microencapsuladas se propagan
fácilmente en reactores de tanque agitado y, con tamaños de perlas
en el intervalo de 150-1500 \mum de diámetro, se
retienen fácilmente en un reactor perfundido usando una criba de
malla fina. La razón del volumen de la cápsula con respecto al
volumen total de los medios puede mantenerse tan denso como desde
1:2 hasta 1:10. Con densidades celulares intracapsulares de hasta
10^{8}, la densidad celular eficaz en el cultivo es de
1-5 x 10^{7}.
Las ventajas de la microencapsulación sobre
otros procesos incluyen la protección de los efectos perjudiciales
de los esfuerzos de corte que se producen a partir de la inyección
de vapor y agitación, la capacidad de retener fácilmente las perlas
para el fin de usar sistemas perfundidos, aumentar a escala es
relativamente sencillo y la capacidad de usar las perlas para
implantación.
La presente invención describe células que son
dependientes de anclaje por naturaleza. Las células 293, por
ejemplo, son dependientes de anclaje, y cuando se hacen crecer en
suspensión, las células se unirán entre sí y crecerán en grupos,
asfixiando finalmente las células en el núcleo interno de cada grupo
cuando alcanzan un tamaño que deja inestables las células del
núcleo en las condiciones de cultivo. Por tanto, se necesita un
medio eficaz de cultivo a gran escala de células dependientes de
anclaje con el fin de emplear de manera eficaz estas células para
generar grandes cantidades de adenovirus.
Los sistemas de unión perfundidos son una forma
preferida de la presente invención. Perfusión se refiere al flujo
continuo a una tasa constante, a través o sobre una población de
células (de una disolución de nutrientes fisiológica). Esto implica
la retención de las células dentro de la unidad de cultivo en
contraposición al cultivo de flujo continuo que arrastra las
células con los medios retirados (por ejemplo, quimiostato). La
idea de la perfusión se ha conocido desde el comienzo del siglo, y
se ha aplicado para mantener pequeñas piezas de tejido viables para
la observación microscópica extendida. La técnica se inició para
imitar el medio de las células in vivo en el que las células
se abastecen continuamente de sangre, plasma u otros fluidos
corporales. Sin perfusión, las células en cultivo pasan por fases
alternantes de alimentación e inanición, limitando así su
crecimiento y potencial metabólico.
El uso actual del cultivo perfundido es en
respuesta al reto de hacer crecer células a altas densidades (es
decir, 0,1-5 x 10^{8} células/ml). Con el fin de
aumentar las densidades por encima de 2-4 x 10^{6}
células/ml, ha de sustituirse constantemente el medio con un
suministro nuevo con el fin de compensar las deficiencias
nutricionales y eliminar los productos tóxicos. La perfusión permite
un control mucho mejor del entorno de cultivo (pH, pO_{2},
niveles de nutriente, etc.) y es un medio para incrementar de manera
significativa la utilización del área superficial en un cultivo para
la unión celular.
El desarrollo de un reactor de lecho fijo
perfundido usando una matriz de lecho de un material textil no
tejido ha proporcionado un medio para mantener un cultivo de
perfusión a densidades que exceden las 10^{8} células/ml del
volumen del lecho (CelliGen™, New Brunswick Scientific, Edison, NJ;
Wang et al., 1992; Wang et al., 1993; Wang et
al., 1994). Descrito brevemente, este reactor comprende un
reactor mejorado para el cultivo de células tanto dependientes de
anclaje como no dependientes de anclaje. El reactor está diseñado
como un lecho fijo con un medio para proporcionar la recirculación
interna. Preferiblemente, se coloca un soporte de matriz de fibra
en una cesta dentro del vaso del reactor. Una parte superior e
inferior de la cesta tiene orificios, permitiendo que el medio
fluya a través de la cesta. Un rotor especialmente diseñado
proporciona la recirculación del medio a través del espacio ocupado
por la matriz de fibra para garantizar un suministro uniforme del
nutriente y la eliminación de desechos. Esto garantiza
simultáneamente que una cantidad insignificante de la masa celular
total esté suspendida en el medio. La combinación de la cesta y la
recirculación proporciona también un flujo libre de burbujas del
medio oxigenado a través de la matriz de fibra. La matriz de fibra
es un material textil no tejido que tiene un diámetro de
"poro" de desde 10 \mum hasta 100 \mum, proporcionando un
alto volumen interno con volúmenes de poro correspondientes a de 1
a 20 veces los volúmenes de las células individuales.
En comparación con otros sistemas de cultivo,
este enfoque ofrece varias ventajas significativas. Con un soporte
de matriz de fibra, las fibras están protegidas frente al esfuerzo
mecánico de la agitación y espumación. El flujo de medio libre que
fluye a través de la cesta proporciona a las células niveles
regulados óptimos de oxígeno, pH y nutrientes. Los productos pueden
eliminarse de manera continua del cultivo y los productos recogidos
están libres de células y pueden producirse en medio bajo en
proteínas, lo que facilita las posteriores etapas de purificación.
Además, el diseño único de este sistema de reactor ofrece un modo
más sencillo de aumentar a escala el reactor. Actualmente, están
disponibles tamaños de hasta 30 litros. Versiones de cien litros y
300 litros están en desarrollo y los cálculos teóricos soportan
reactores de hasta 1000 litros. Esta tecnología se explica en
detalle en el documento WO 94/17178 (4 de agosto de 1994, Freedman
et al.)
El módulo Cellcube™
(Coming-Costar) proporciona una gran área
superficial estirénica para la inmovilización y el crecimiento del
sustrato unido a las células. Es un dispositivo estéril de un sólo
uso integralmente encapsulado que tiene una serie de placas de
cultivo paralelas unidas para crear espacios de flujo laminar
sellados entre placas adyacentes.
El módulo Cellcube™ tiene puertos de entrada y
de salida que son diagonalmente opuestos entre sí y ayudan a
regular el flujo de los medios. Durante los primeros pocos días de
crecimiento, el cultivo se satisface generalmente por los medios
contenidos en el sistema tras la siembra inicial. El tiempo entre la
siembra inicial y el principio de la perfusión de los medios
depende de la densidad de células en el inóculo de la siembra y la
tasa de crecimiento celular. La medición de la concentración de
nutriente en los medios en circulación es un buen indicador del
estado del cultivo. Cuando se establece un procedimiento puede ser
necesario monitorizar la composición de los nutrientes a varias
tasas de perfusión diferentes para determinar los parámetros de
funcionamiento más productivos y económicos.
Las células dentro del sistema alcanzan una
densidad de disolución mayor (células/ml) que en sistemas de cultivo
tradicionales. Muchos medios basales usados normalmente están
diseñados para soportar 1-2 x 10^{6}
células/ml/día. Un Cellcube™ típico, que se hace funcionar con una
superficie de 85.000 cm^{2}, contiene aproximadamente 6 l de
medio en el módulo. La densidad celular excede a menudo 10^{7}
células/ml en el vaso de cultivo. En confluencia, se requieren, por
día, 2-4 volúmenes de medio de reactor.
Los parámetros y el control del tiempo de la
fase de producción de los cultivos dependen del tipo y del uso de
una línea celular en particular. Muchos cultivos requieren un medio
diferente para la producción al que se requiere para la fase de
crecimiento del cultivo. La transición desde una fase hasta la otra
requerirá probablemente múltiples etapas de lavado en los cultivos
tradicionales. Sin embargo, el sistema Cellcube™ emplea un sistema
de perfusión. Uno de los beneficios de un sistema de este tipo es la
capacidad de proporcionar una transición suave entre diversas fases
de funcionamiento. El sistema de perfusión invalida la necesidad de
etapas de lavado tradicionales que tratan de eliminar los
componentes séricos en un medio de crecimiento.
En una realización a modo de ejemplo de la
presente invención, se usa el sistema CellCube™ para hacer crecer
células transfectadas con AdCMVp53. Se inocularon las células 293 en
el Cellcube™ según recomendación del fabricante. Las densidades
celulares de inoculación estaban en el intervalo de
1-1,5 x 10^{4}/cm^{2}. Se dejó crecer a las
células durante 7 días a 37ºC en condiciones de cultivo de pH =
7,20, saturación del aire OD = 60%. Se reguló la tasa de perfusión
del medio según la concentración de glucosa en el Cellcube™. Un día
antes de la infección viral, se cambió el medio para la perfusión
desde un tampón que comprende FBS al 10% hasta un tampón que
comprende FBS al 2%. En el día 8, se infectaron las células con
virus a una multiplicidad de infección (MDI) de 5. Se detuvo la
perfusión del medio durante 1 h inmediatamente después de la
infección que se reanudó entonces durante el periodo restante de la
fase de producción de virus. Se recogió el cultivo de
45-48 h tras la infección. Por supuesto estas
condiciones de cultivo son a modo de ejemplo y pueden variarse
según las necesidades nutricionales y requisitos de crecimiento de
una línea celular en particular. Tal variación puede realizarse sin
demasiada experimentación y se conoce bien por el experto habitual
en la técnica.
En realizaciones particulares, se producen
vectores adenovirales para terapia génica a partir del cultivo
dependiente de anclaje de células 293 (células 293A) tal como se
describió anteriormente. El aumento a escala de la producción del
vector adenoviral está limitado por la dependencia de anclaje de las
células 293A. Para facilitar el aumento a escala y satisfacer la
demanda futura de vectores adenovirales, se han dedicado esfuerzos
significativos al desarrollo de procesos de producción alternativos
que pueden aumentarse a escala. Los métodos incluyen hacer crecer
células 293A en cultivos sobre microsoporte y la adaptación de
células 293A productoras en cultivos en suspensión. Anteriormente
se han descrito técnicas de cultivo sobre microsoporte. Esta técnica
se basa en la unión de las células productoras sobre las
superficies de los microsoportes que están suspendidos en medios de
cultivo mediante agitación mecánica. El requisito de unión celular
puede presentar ciertas limitaciones para la escalabilidad de los
cultivos sobre microsoporte.
Además, las células 293 en suspensión
notificadas requieren la presencia de FBS al 5-10%
en los medios de cultivo para la producción de virus y el
crecimiento celular óptimo. Históricamente, la presencia de
proteínas de origen bovino en medios de cultivo celular ha dado
lugar a problemas legislativos, en especial, recientemente debido
al brote de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en alguno
países. Ha de desarrollarse un proceso de purificación aguas abajo
riguroso y complejo para eliminar del producto final las proteínas
contaminantes y cualquier virus adventicio. Se considera que el
desarrollo del cultivo en suspensión de 293 libre de suero es una
mejora del proceso principal para la producción del vector
adenoviral para terapia génica.
Los resultados de la producción de virus en
frascos centrifugados y en un biorreactor de tanque agitado de 3 l
indican que la productividad del virus específica de las células
293SF era aproximadamente de 2,5 x 10^{4} pv/célula, que es
aproximadamente el 60-90% de la de las células 293A.
Sin embargo, debido a la mayor concentración celular estacionaria,
la productividad del virus volumétrica del cultivo de 293SF es
esencialmente equivalente a la del cultivo de células 293A. Los
inventores han observado también que la producción de virus
aumentaba significativamente llevando a cabo un cambio por medio
nuevo en el momento de la infección por virus. Los inventores van a
evaluar los factores restrictivos en el medio.
Estos hallazgos permiten un proceso que puede
validarse fácilmente, eficaz y escalable para la producción de
vector adenoviral. Este método de adaptación no se limita solamente
a células 293A y será igualmente útil cuando se aplique a otras
células productoras de vectores adenovirales.
La infección adenoviral da como resultado la
lisis de las células que se infectan. Las características líticas
de la infección por adenovirus permiten dos modos diferentes de
producción de virus. Uno es recoger las células infectadas antes de
la lisis celular. El otro modo es recoger el sobrenadante de virus
tras la lisis celular completa por el virus producido. Para el
último modo, se requieren tiempos de incubación más largos con el
fin de conseguir la lisis celular completa. Este tiempo de
incubación prolongado tras la infección por virus crea una seria
preocupación sobre el aumento de la posibilidad de generación de
adenovirus competente para la replicación (ACR), particularmente
para los actuales vectores adenovirales de primera generación
(vector con deleción de E1). Por tanto, se eligió la recogida de
las células infectadas antes de la lisis celular como el modo de
producción de elección. La tabla 1 enumera los métodos más comunes
que se han usado para lisar células tras la recogida de las
células.
Las células están unidas mediante membranas. Con
el fin de liberar componentes de la célula, es necesario abrir las
células forzándolas. La manera más ventajosa en que esto puede
conseguirse, según la presente invención, es solubilizar las
membranas con el uso de detergentes. Los detergentes son moléculas
anfipáticas con un extremo apolar de naturaleza aromática o
alifática y un extremo polar que puede estar cargado o no cargado.
Los detergentes son más hidrófilos que los lípidos y por tanto
tienen mayor solubilidad en agua que los lípidos. Éstos permiten la
dispersión de compuestos insolubles en agua en medios acuosos y se
usan para aislar y purificar proteínas en una forma nativa.
Los detergentes pueden ser desnaturalizantes o
no desnaturalizantes. El primero puede ser aniónico, tal como
dodecilsulfato de sodio o catiónico tal como bromuro de
etiltrimetilamonio. Estos detergentes deterioran totalmente las
membranas y desnaturalizan la proteína rompiendo las interacciones
proteína-proteína. Los detergentes no
desnaturalizantes pueden dividirse en detergentes no aniónicos tales
como Triton®X-100, sales biliares tales como
colatos y detergentes zwitteriónicos tales como CHAPS. Los
zwitteriónicos contienen grupos tanto catiónicos como aniónicos en
la misma molécula, la carga eléctrica positiva se neutraliza por la
carga negativa sobre la molécula adyacente o la misma.
Los agentes desnaturalizantes tales como SDS se
unen a las proteínas como monómeros y la reacción se impulsa por el
equilibrio hasta que se satura. Por tanto, la concentración libre de
monómeros determina la concentración de detergente necesaria. La
unión de SDS es cooperativa, es decir, la unión de una molécula de
SDS aumenta la probabilidad de unión de otra molécula a esa
proteína, y transforma las proteínas en bastones cuya longitud es
proporcional a su peso molecular.
Los agentes no desnaturalizantes tales como
Triton®X-100 ni se unen a conformaciones nativas ni
tienen un mecanismo de unión cooperativo. Estos detergentes tienen
restos apolares voluminosos y rígidos que no penetran en proteínas
solubles en agua. Se unen a las partes hidrófobas de las proteínas.
Triton®X100 y otros detergentes no aniónicos de polioxietileno son
ineficaces para romper la interacción
proteína-proteína y pueden provocar agregaciones de
artefacto de proteínas. Estos detergentes, sin embargo, deterioran
las interacciones proteína-lípido pero son mucho
más suaves y pueden mantener la forma nativa y las capacidades
funcionales de las proteínas.
La eliminación del detergente puede intentarse
de varias maneras. La diálisis funciona bien con detergentes que
existen como monómeros. La diálisis es un tanto ineficaz con
detergentes que se agregan fácilmente para formar micelas ya que
las micelas son demasiado grandes para pasar por diálisis. La
cromatografía de intercambio iónico puede utilizarse para sortear
este problema. Se aplica la disolución de proteína deteriorada a una
columna de cromatografía de intercambio iónico y luego se lava la
columna con tampón menos detergente. El detergente se eliminará
como resultado del equilibrio del tampón con la disolución de
detergente. Alternativamente, la disolución de proteína puede
pasarse por un gradiente de densidad. Según la proteína sedimenta a
través de los gradientes, el detergente se soltará debido al
potencial químico.
A menudo, un único detergente no es lo
suficiente versátil para la solubilización y el análisis del medio
de proteínas encontradas en una célula. Las proteínas pueden
solubilizarse en un detergente y luego colocarse en otro detergente
adecuado para el análisis de la proteína. Las micelas de
detergente-proteína formadas en la primera etapa
deben separarse de las micelas de detergente puro. Cuando éstas se
añaden a un exceso del detergente para análisis, la proteína se
encuentra en micelas con ambos detergentes. La separación de micelas
de detergente-proteína puede lograrse con
cromatografía de filtración en gel o de intercambio iónico,
separaciones de tipo de densidad de flotación o diálisis.
Detergentes Triton®X: Esta familia de
detergentes (Triton®X-100, X114 y
NP-40) tienen las mismas características básicas
pero son diferentes en su naturaleza
hidrófoba-hidrófila específica. Todos estos
detergentes heterogéneos tienen una cadena de 8 carbonos ramificada
unida a un anillo aromático. Esta parte de la molécula aporta la
mayoría de la naturaleza hidrófoba del detergente. Los detergentes
Triton®X se usan para solubilizar proteínas de membrana en
condiciones no desnaturalizantes. La elección del detergente para
solubilizar las proteínas dependerá de la naturaleza hidrófoba de
la proteína que ha de solubilizarse. Las proteínas hidrófobas
requieren detergentes hidrófobos para solubilizarlas de manera
eficaz.
Triton®X-100 y
NP-40 son muy similares en estructura e
hidrofobicidad y son intercambiables en la mayoría de las
aplicaciones incluyendo lisis celular, disociación de proteínas por
deslipidación y solubilización de lípidos y proteínas de membrana.
De manera general, se usan 2 mg de detergente para solubilizar 1 mg
de proteína de membrana o 10 mg de detergente/1 mg de membrana
lipídica. Triton®X-114 es útil para separar las
proteínas hidrófobas de las hidrófilas.
Detergentes Brij®: Éstos son similares en
estructura a los detergentes Triton®X porque tienen longitudes
variables de cadenas de polioxietileno unidas a una cadena
hidrófoba. Sin embargo, a diferencia de los detergentes Triton®X,
los detergentes Brij® no tienen un anillo aromático y la longitud de
las cadenas de carbono puede variar. Los detergentes Brij® son
difíciles de eliminar de la disolución usando diálisis pero pueden
eliminarse mediante geles eliminadores de detergente. En lo que
Brij®58 es más similar a Triton®X100 es en sus características
hidrófobas/hidrófilas. Brij®-35 es un detergente comúnmente usado en
aplicaciones de HPLC.
Detergentes no iónicos dializables:
\eta-octil-\beta-D-glucósido
(octilglucopiranósido) y
\eta-octil-\beta-D-tioglucósido
(octiltioglucopiranósido, OTG) son detergentes no iónicos no
desnaturalizantes que se dializan fácilmente de la disolución.
Estos detergentes son útiles para solubilizar proteínas de membrana
y tienen baja absorbancia de UV a 280 nm. El octilglucósido tiene
una alta CMC de 23-25 mM y se ha usado en
concentraciones de 1,1-1,2% para solubilizar
proteínas de membrana.
El octiltioglucósido se sintetizó por primera
vez para ofrecer una alternativa al octilglucósido. El
octilglucósido es caro de fabricar y hay algunos problemas
inherentes a los sistemas biológicos ya que éste puede hidrolizarse
mediante \beta-glucosidasa.
Detergentes Tween®: Los detergentes
Tween® son detergentes no iónicos, no desnaturalizantes. Son ésteres
de polioxietilensorbitano de ácidos grasos. Los detergentes Tween®
20 y Tween® 80 se usan como agentes bloqueantes en aplicaciones
bioquímicas y se añaden normalmente a disoluciones de proteínas para
evitar la unión no específica a materiales hidrófobos tales como
plásticos o nitrocelulosa. Se han usado como agentes bloqueantes en
ELISA y aplicaciones de inmunotransferencia. De manera general,
estos detergentes se usan a concentraciones del
0,01-1,0% para evitar la unión no específica a
materiales hidrófobos.
Tween® 20 y otros detergentes no iónicos han
demostrado eliminar algunas proteínas de la superficie de la
nitrocelulosa. Tween® 80 se ha usado para solubilizar proteínas de
membrana, presentar la unión no específica de proteínas a placas de
cultivo tisular plásticas de múltiples pocillos y para reducir la
unión no específica mediante proteínas séricas y proteína A
biotinilada a placas de poliestireno en ELISA.
La diferencia entre estos detergentes es la
longitud de la cadena de ácido graso. Tween® 80 se deriva del ácido
oleico con una cadena C_{18} mientras que Tween® 20 se deriva del
ácido láurico con una cadena C_{12}. La cadena de ácido graso más
larga hace al detergente Tween® 80 menos hidrófilo que el detergente
Tween® 20. Ambos detergentes son muy solubles en agua.
Los detergentes Tween® son difíciles de eliminar
de la disolución mediante diálisis, pero Tween® 20 puede eliminarse
mediante geles eliminadores de detergente. La cadena de
polioxietileno encontrada en estos detergentes los hace
susceptibles de oxidación (formación de peróxido) tal como sucede
con los detergentes de las series Triton® X y Brij®.
Detergentes zwitteriónicos: El detergente
zwitteriónico, CHAPS, es una sulfobetaína derivada del ácido cólico.
Este detergente zwitteriónico es útil para la solubilización de
proteínas de membrana cuando la actividad de la proteína es
importante. Este detergente es útil en un amplio intervalo de pH (pH
2-12) y se elimina fácilmente de la disolución
mediante diálisis debido a altas CMC (8-10 mM). Este
detergente tiene bajas absorbancias a 280 nm haciéndolo útil cuando
es necesaria la monitorización de la proteína a esta longitud de
onda. CHAPS es compatible con el ensayo de la proteína BCA y puede
eliminarse de la disolución mediante gel eliminador de detergente.
Las proteínas pueden yodarse en presencia de CHAPS.
CHAPS se ha usado con éxito para solubilizar
receptores y proteínas de membrana intrínsecas y mantener la
capacidad funcional de la proteína. Cuando el citocromo
P-450 se solubiliza o bien en Triton®
X-100 o bien colato de sodio, se forman
agregados.
Se describen diversos métodos sin detergente tal
como sigue:
Congelación-descongelación:
Ésta ha sido una técnica ampliamente utilizada para lisar células de
un modo suave y eficaz. Las células por lo general se congelan
rápidamente en, por ejemplo, un baño de hielo seco/etanol hasta que
se congela completamente, entonces se transfiere a un baño a 37ºC
hasta que se descongela completamente. Se repite este ciclo varias
veces para conseguir la lisis celular completa.
Sonicación: Se ha encontrado que
oscilaciones ultrasónicas de alta frecuencia son útiles para el
deterioro de la célula. No se entiende totalmente el método por el
que las ondas ultrasónicas rompen las células pero se conoce que se
producen altas presiones transitorias cuando las suspensiones se
someten a vibración ultrasónica. La principal desventaja de esta
técnica es que se generan cantidades considerables de calor. Con el
fin de minimizar los efectos del calor se usan vasos de vidrio
específicamente diseñados para sostener la suspensión celular.
Tales diseños permiten que la suspensión se esparza desde la sonda
ultrasónica hasta el exterior del vaso en el que se enfría a la vez
que el frasco se suspende en hielo.
Extrusión a alta presión: Éste es un
método usado frecuentemente para deteriorar células microbianas. La
celda de presión francesa emplea presiones de 10,4 x 10^{7} Pa
(16.000 p.s.i) para romper las células forzándolas. Este aparato
consiste en una cámara de acero inoxidable que se abre hacia el
exterior por medio de una válvula cónica. La suspensión celular se
coloca en la cámara con la válvula cónica en posición cerrada. Tras
invertir la cámara, se abre la válvula y el pistón se coloca para
expulsar todo el aire de la cámara. Con la válvula en posición
cerrada, se devuelve la cámara a su posición original, se coloca
sobre una base sólida y se ejerce la presión requerida sobre el
pistón mediante una prensa hidráulica. Cuando se ha alcanzado la
presión, se abre levemente la válvula cónica para liberar
ligeramente la presión, y cuando las células se expanden, revientan.
La válvula se mantiene abierta mientras que se mantiene la presión,
de modo que hay un goteo de célula rota que puede recogerse.
Métodos de corte en sólido: El corte
mecánico con abrasivos puede conseguirse en agitadores Mickle que
hacen vibrar la suspensión enérgicamente (300-3000
veces/min) en presencia de perlas de vidrio de 500 nm de diámetro.
Este método puede dar como resultado daños en orgánulos. Un método
más controlado es usar una prensa Hughes en la que un pistón junta
la mayoría de las células con abrasivos o pasta ultracongelada de
células a través de una ranura de 0,25 mm de diámetro en la cámara
de presión. Pueden usarse presiones de hasta 5,5 x 10^{7} Pa (8000
p.s.i.) para lisar las preparaciones bacterianas.
Métodos de corte en líquido: Estos
métodos emplean mezcladoras, que usan paletas giratorias o de vaivén
de alta velocidad, homogenizadores que usan un movimiento
ascendente/descendente de un émbolo y una bola y microfluidizadores
o chorros incidentes que usan un pase de alta velocidad a través de
los tubos de pequeño diámetro o impacto de alta velocidad de dos
corrientes de fluido. Las paletas o las mezcladoras están inclinadas
a diferentes ángulos para permitir el mezclado eficaz. Normalmente
se hacen funcionar los homogenizadores con arranques cortos de alta
velocidad de pocos segundos para minimizar el calor local.
Generalmente estas técnicas no son adecuadas para células
microbianas, sino que normalmente es adecuado el corte en líquido
muy suave para deteriorar células animales.
Métodos hipotónicos/hipertónicos: Se
exponen las células a una disolución con una concentración de soluto
mucho menor (hipotónica) o mayor (hipertónica). La diferencia en la
concentración de soluto crea un gradiente de presión osmótica. El
flujo resultante de agua en la célula en un entorno hipotónico
provoca que las células se inflen y revienten. El flujo de agua
fuera de la célula provoca que las células se encojan y
posteriormente revienten.
\newpage
Un aspecto de la presente invención emplea
métodos de purificación del bruto de adenovirus a partir del lisado
celular. Estos métodos incluyen clarificación, concentración y
diafiltración. La etapa inicial de este proceso de purificación es
la clarificación del lisado celular para eliminar la materia
particulada grande, particularmente componentes celulares a partir
del lisado celular. La clarificación del lisado puede conseguirse
usando un filtro profundo o mediante filtración de flujo
tangencial. En una realización preferida de la presente invención,
se hace pasar el lisado celular a través de un filtro profundo, que
consiste en una columna compacta de material relativamente no
adsorbente (por ejemplo resinas de poliéster, arena, tierra
diatomácea, coloides, geles y similares). En la filtración de flujo
tangencial (TFF, tangencial flow filtration), la disolución de
lisado fluye a través de una superficie de la membrana que facilita
la retrodifusión de soluto desde la superficie de la membrana a la
disolución en masa. Generalmente se disponen las membranas en
diversos tipos de aparatos de filtro, que incluyen estructura y
placa de canal abierto, fibras huecas y túbulos.
Tras la clarificación y prefiltración del lisado
celular, en primer lugar se concentra el sobrenadante de virus
resultante y luego se cambia el tampón mediante diafiltración. Se
concentra el sobrenadante de virus mediante filtración de flujo
tangencial a través de una membrana de ultrafiltración de límite de
peso molecular nominal de 100-300K. La
ultrafiltración es un proceso convectivo modificado por la presión
que usa membranas semipermeables para separar especies por su
tamaño molecular, forma y/o carga. Separa los disolventes de los
solutos de diversos tamaños, independientemente del tamaño molecular
del soluto. La ultrafiltración es suave, eficaz y puede usarse
simultáneamente para concentrar y desalar disoluciones. Las
membranas de ultrafiltración tienen generalmente dos capas
distintas: una capa densa, fina (0,1-1,5 \mum),
con un diámetro de poro de 10-400 angstroms y una
subestructura abierta de huecos progresivamente mayores que se abren
ampliamente hacia la cara de permeado del filtro de
ultrafiltración. Por tanto, cualquier especie que pueda pasar a
través de los poros de la capa puede pasar libremente a través de
la membrana. Para la retención máxima de soluto, se selecciona una
membrana que tiene un límite de peso molecular nominal bastante por
debajo del de las especies que se retienen. En la concentración
macromolecular, la membrana enriquece el contenido de las especies
biológicas deseadas y proporciona el filtrado aclarado de
sustancias retenidas. Se eliminan de manera convectiva los
microsolutos con el disolvente. Según aumenta la concentración de
soluto retenido, la tasa de ultrafiltración disminuye.
La diafiltración o el cambio de tampón usando
ultrafiltros, es una manera ideal de eliminación y cambio de la
separación de sales, azúcares, y solventes no acuosos de especies
libres a unidas, eliminación de material de bajo peso molecular, o
cambio rápido de entornos de pH e iónicos. Los microsolutos se
eliminan lo más eficazmente añadiendo disolvente a la disolución
que se somete a ultrafiltración a una tasa igual a la tasa de
ultrafiltración. Esto lava las especies de la disolución en un
volumen constante, purificando las especies retenidas. La presente
invención utiliza una etapa de diafiltración para cambiar el tampón
del sobrenadante de virus antes del tratamiento con Benzonase®
tratamiento.
La presente invención emplea, en un ejemplo, la
infección adenoviral de células con el fin de generar vectores
terapéuticamente significativos. Normalmente, se expondrá el virus
simplemente a la célula huésped apropiada en condiciones
fisiológicas, permitiendo la captación del virus.
El adenovirus es particularmente adecuado para
su uso como vector de transferencia génica debido a su genoma de
ADN de tamaño medio, facilidad de manipulación, título alto, amplio
intervalo de célula diana, y alta infectividad. El genoma viral de
aproximadamente 36 kB está unido mediante repeticiones terminales
invertidas de (RTI) de 100-200 pares de bases (pb),
en las que están contenidos los elementos que actúan en cis
necesarios para el empaquetamiento y la replicación de ADN viral.
Las regiones temprana (E, early) y tardía (L, late) del genoma que
contienen unidades de transcripción diferentes se dividen por el
inicio de la replicación de ADN viral.
La región E1 (E1A y E1B) codifica para proteínas
responsables de la regulación de la transcripción del genoma viral
y algunos genes celulares. La expresión de la región E2 (E2A y E2B)
da como resultado la síntesis de las proteínas para la replicación
de ADN viral. Estas proteínas están implicadas en la replicación de
ADN, expresión génica tardía, y corte de la célula huésped (Renan,
1990). Los productos de los genes tardíos (L1, L2, L3, L4 y L5),
que incluyen la mayoría de las proteínas de la cápside viral, se
expresan solamente tras el procesamiento significativo de un solo
transcrito primario emitido por el promotor tardío principal (PTP).
El PTP (situado en 16,8 unidades de mapeo) es particularmente eficaz
durante la fase tardía de infección, y todo el ARNm emitido a
partir de este promotor presenta una secuencia líder triparental 5'
(LT) que los hace ser los ARNm preferidos para la traducción.
Con el fin de optimizar los adenovirus para la
terapia génica, es necesario maximizar la capacidad de carga de
modo que puedan incluirse grandes segmentos de ADN. También es muy
deseable reducir la toxicidad y reacción inmunológica asociada con
determinados productos adenovirales. La eliminación de grandes
partes del genoma adenoviral, y proporcionar los productos génicos
con deleciones en trans, mediante virus auxiliar y/o células
auxiliares, permite la inserción de grandes partes de ADN heterólogo
en el vector. Esta estrategia dará también como resultado toxicidad
reducida e inmunogenicidad de los productos génicos de
adenovirus.
El gran desplazamiento de ADN es posible ya que
todos los elementos en cis requeridos para la replicación
del ADN viral se localizan en las repeticiones terminales invertidas
(RTI) (100-200 pb) en cualquier extremo del genoma
viral lineal. Los plásmidos que contienen RTI pueden replicarse en
presencia de un adenovirus no defectuoso (Hay et al., 1984).
Por tanto, la inclusión de estos elementos en un vector adenoviral
debe permitir la replicación.
Además, la señal de empaquetamiento para la
encapsidación viral se localiza entre 194-385 pb
(0,5-1,1 unidades de mapeo) en el extremo izquierdo
del genoma viral (Hearing et al., 1987). Esta señal imita el
sitio de reconocimiento de proteínas en ADN de bacteriófago
\lambda, en el que una secuencia específica próxima al extremo
izquierdo, pero fuera de la secuencia del extremo cohesivo, media
la unión a proteínas que se requieren para la inserción del ADN en
la estructura primaria. Los vectores de sustitución E1 de Ad han
demostrado que un fragmento de 450 pb (0-1,25
unidades de ma-
peo) en el extremo izquierdo del genoma viral podía dirigir el empaquetamiento en células 293 (Levrero et al., 1991).
peo) en el extremo izquierdo del genoma viral podía dirigir el empaquetamiento en células 293 (Levrero et al., 1991).
Anteriormente se ha demostrado que determinadas
regiones del genoma adenoviral pueden incorporarse en el genoma de
células de mamífero y los genes codificados así expresados. Estas
líneas celulares pueden soportar la replicación de un vector
adenoviral que es deficiente en la función adenoviral codificada por
la línea celular. También ha habido informes de la complementación
de vectores adenovirales deficientes en replicación mediante
vectores "cooperantes", por ejemplo, virus de tipo natural o
mutantes condicionalmente defectuosos.
Los vectores adenovirales deficientes en
replicación pueden complementarse, en trans, mediante virus
auxiliares. Esta observación sola no permite el aislamiento de los
vectores deficientes en replicación, sin embargo, ya que la
presencia de virus auxiliar, necesaria para proporcionar funciones
de replicación, contaminaría cualquier preparación. Por tanto, se
necesitó un elemento adicional que añadiría especificidad a la
replicación y/o al empaquetamiento del vector deficiente en
replicación. Ese elemento, tal como se proporciona en la presente
invención, proviene de la función de empaquetamiento de
adenovirus.
Se ha demostrado que existe una señal de
empaquetamiento para adenovirus en el extremo izquierdo del mapa de
adenovirus convencional (Tibbetts, 1977). Estudios posteriores
demostraron que un mutante con una deleción en la región E1A
(194-358 pb) del genoma crecía poco incluso en una
línea celular que complementaba la función temprana (E1A) (Hearing
y Shenk, 1983). Cuando se recombinó un ADN adenoviral de
compensación (0-353 pb) en el extremo derecho del
mutante, el virus se empaquetó normalmente. Análisis mutacionales
adicionales identificaron un elemento dependiente de la posición,
repetido, corto, en el extremo izquierdo del genoma del Ad5. Se
encontró que una copia de la secuencia de repetición era suficiente
para el empaquetamiento eficaz si estuviera presente en cualquier
extremo del genoma, pero no cuando se movía hacia el interior de la
molécula de ADN del Ad5 (Hearing et al., 1987).
Usando versiones mutadas de la señal de
empaquetamiento, es posible crear virus auxiliares que se empaquetan
con eficacias variables. Normalmente, las mutaciones son deleciones
o mutaciones puntuales. Cuando los virus auxiliares con baja
eficacia de empaquetamiento se hacen crecer en células auxiliares,
el virus se empaqueta, aunque a tasas reducidas comparados con
virus de tipo natural, permitiendo así la propagación del auxiliar.
Cuando se hacen crecer estos virus auxiliares con virus que contiene
señales de empaquetamiento del tipo natural, sin embargo, se
reconocen preferentemente las señales de empaquetamiento de tipo
natural sobre las versiones con mutaciones. Dada una cantidad
limitante de factor de empaquetamiento, el virus que contiene las
señales de tipo natural se empaquetan de manera selectiva si se
compara con los auxiliares. Si la preferencia es lo suficientemente
grande, deben conseguirse disoluciones madre casi homogéneas.
En determinadas realizaciones, la presente
invención implica además la manipulación de vectores virales. Los
métodos de este tipo implican el uso de un constructo de vector que
contiene, por ejemplo, un ADN heterólogo que codifica para un gen
de interés y un medio para su expresión, la replica del vector en
una célula auxiliar apropiada, la obtención de partículas virales
producidas del mismo, y la infección de las células con las
partículas del virus recombinante. El gen podría codificar
simplemente para una proteína para la que se desean grandes
cantidades de la proteína, es decir, métodos de producción in
vitro a gran escala. Alternativamente, el gen podría ser un gen
terapéutico, por ejemplo para tratar células cancerígenas, para
expresar genes inmunomoduladores para combatir infecciones virales
o, para sustituir una función génica como resultado de un defecto
genético. En el contexto del vector de terapia génica, el gen será
un ADN heterólogo, que incluirá ADN derivado de un origen distinto
al genoma viral que proporciona la estructura principal del vector.
Finalmente, el virus puede actuar como una vacuna viral viva y
expresar un antígeno de interés para la producción de anticuerpos
contra él. El gen puede derivarse de una fuente procariota o
eucariota tal como una bacteria, un virus, una levadura, un
parásito, un vegetal, o incluso un animal. El ADN heterólogo puede
también derivarse de más de una fuente, es decir, un constructo
multigénico o una proteína de fusión. El ADN heterólogo puede
también incluir una secuencia reguladora que puede derivarse de una
fuente, y el gen de una fuente diferente.
El p53 está reconocido en la actualidad como un
gen supresor tumoral (Montenarh, 1992).
Se han encontrado altos niveles de p53 mutante
en muchas células transformadas mediante carcinogénesis química,
radiación ultravioleta y varios virus, incluyendo el SV40. El gen
p53 es una diana frecuente de inactivación mutacional en una amplia
variedad de tumores humanos y se ha documentado ya que es el gen más
frecuentemente mutado en cánceres humanos comunes (Mercer, 1992).
Está mutado en más del 50% de NSCLC (non-small cell
lung cancer (cáncer de células de pulmón no pequeñas)) humano
(Hollestein et al., 1991) y en un amplio espectro de otros
tumores.
El gen p53 codifica para una fosfoproteína de
393 aminoácidos que puede formar complejos con las proteínas
huéspedes tales como el antígeno T y E1B. La proteína se encuentra
en células y tejidos normales, pero a concentraciones que son
generalmente insignificantes en comparación con tejido tumoral o
células transformadas. De manera interesante, el p53 de tipo
natural parece ser importante en la regulación de la división y el
crecimiento celular. Se ha demostrado que en algunos casos, el p53
de tipo natural es antiproliferativo en líneas celulares tumorales
humanas. Por tanto, p53 puede actuar como un regulador negativo del
crecimiento celular (Weinberg, 1991) y puede suprimir directamente
el crecimiento celular incontrolado o activar indirectamente genes
que inhiben este crecimiento. Por tanto, la ausencia o inactivación
del p53 de tipo natural puede contribuir a la transformación. Sin
embargo, algunos estudios indican que la presencia del p53 mutante
puede ser necesaria para la expresión completa del potencial de
transformación del gen.
El p53 de tipo natural está reconocido como un
importante regulador del crecimiento en muchos tipos celulares. Las
mutaciones con cambio de sentido son comunes en el gen p53 y se sabe
que aparecen en al menos 30 codones distintos, creando a menudo
alelos dominantes que producen cambios en el fenotipo celular sin
una reducción hasta la homozigosis. Adicionalmente, muchos de estos
alelos negativos dominantes parecen tolerarse en el organismo y
pasar a la línea germinal. Diversos alelos mutantes parecen oscilar
desde alelos negativos dominantes disfuncionales en grado mínimo
hasta fuertemente penetrantes (Weinberg, 1991).
Casey y colegas han informado que la
transfección de ADN que codifica para el p53 de tipo natural en dos
líneas celulares de cáncer de mama humano, restablece el control de
la supresión del crecimiento en tales células (Casey et al.,
1991). Se ha demostrado también un efecto similar en la transfección
del p53 tipo natural, pero no mutante, en líneas celulares de tumor
de pulmón humano (Takahasi et al., 1992). El p53 aparece como
dominante sobre el gen mutante y seleccionará en contra de la
proliferación cuando se transfecte en células con el gen mutante.
La expresión normal del p53 transfectado no es perjudicial para las
células normales con el p53 de tipo natural endógeno. Por tanto,
los constructos de este tipo pueden tomarse por células normales
sin efectos adversos. Por tanto se propone que el tratamiento de
cánceres asociados al p53 con constructos de expresión del p53 de
tipo natural reducirá el número de células malignas o de su tasa de
crecimiento. Además, estudios recientes proponen que algunos
tumores de tipo natural del p53 son también sensibles a los efectos
de la expresión del p53 exógeno.
Las transiciones principales del ciclo celular
eucariota se desencadenan mediante cinasas dependientes de ciclina,
o CDK. Una CDK, la cinasa 4 dependiente de ciclina (CDK4), regula la
progresión a través de la fase G_{1}. La actividad de esta enzima
puede ser fosforilar Rb en la G_{1} tardía. La actividad de la
CDK4 se controla por una subunidad activante, la ciclina de tipo D
y por una subunidad inhibidora, por ejemplo el p16^{INK4}, que se
ha caracterizado bioquímicamente como una proteína que se une
específicamente a, y que inhibe la CDK4, y por tanto puede regular
las fosforilación de la Rb (Serrano et al., 1993; Serrano
et al., 1995). Debido a que la proteína p16^{INK4} es un
inhibidor de CDK4 (Serrano, 1993), la deleción de este gen puede
aumentar la actividad de la CDK4, dando como resultado la
hiperfosforilación de la proteína Rb. Se sabe también que el p16
regula la función de la CDK6.
El p16^{INK4} pertenece a una clase descrita
recientemente de proteínas inhibidoras de las CDK, que incluye
también al p16^{B}, al p21^{WAF1, \ CIP1, \ SDI1}, y al
p27^{KIP1}. El gen p16^{INK4} se encuentra en 9p21, una región
cromosómica que frecuentemente presenta deleciones en muchos tipos
de tumores. Las deleciones y mutaciones homozigotas del gen
p16^{INK4} son frecuentes en líneas celulares tumorales humanas.
Este indicio sugiere que el gen p16^{INK4} es un gen supresor
tumoral. Se ha cuestionado esta interpretación, sin embargo, por la
observación de que la frecuencia de las alteraciones del gen
p16^{INK4} es muy inferior en tumores no cultivados primarios que
en líneas celulares cultivadas (Caldas et al., 1994; Cheng
et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et
al., 1994a; Kamb et al.,1994b; Mori et al., 1994;
Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow
et al., 1994; Arap et al., 1995). La restauración de
la función del p16^{INK4} de tipo natural mediante la
transfección con un vector de expresión plasmídico redujo la
formación de colonias en algunas líneas celulares cancerígenas
humanas. (Okamoto, 1994; Arap, 1995).
El C-CAM se expresa en casi
todas las células epiteliales (Odin y Obrink, 1987). El
C-CAM, con un peso molecular aparente de 105 kD, se
aisló originariamente a partir de la membrana plasmática del
hepatocito de rata mediante su reacción con anticuerpos específicos
que neutralizan la agregación celular (Obrink, 1991). Estudios
recientes indican que, estructuralmente, el C-CAM
pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) y su
secuencia es altamente homóloga al antígeno carcinoembrionario
(CEA) (Lin y Guidotti, 1989). Usando un sistema de expresión de
baculovirus, Cheung et al. (1993a; 1993b y 1993c) demostraron
que el primer dominio de Ig del C-CAM es crítico
para la actividad de adhesión celular.
Se sabe que las moléculas de adhesión celular, o
CAM, están implicadas en una red compleja de interacciones
moleculares que regulan el desarrollo de órganos y la diferenciación
celular (Edelman, 1985). Datos recientes indican que la expresión
aberrante de los CAM puede estar implicada en la oncogenia de varios
neoplasmas; por ejemplo, la expresión disminuida de la
E-cadherina, que se expresa en su mayoría en células
epiteliales, está asociada a la progresión de varias clases de
neoplasmas (Edelman y Crossin, 1991; Frixen et al., 1991;
Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas
et al., 1992). Además, Giancotti y Ruoslahti (1990)
demostraron que la expresión creciente de la integrina
\alpha_{5}\beta_{1} mediante transferencia génica puede
reducir la tumorigenicidad de células de ovario de hámster chino
in vivo. Se ha demostrado que el C-CAM
suprime el crecimiento tumoral in vitro e in vivo.
Otros supresores tumorales que pueden emplearse
según la presente invención incluyen RB, APC, DCC,
NF-1, NF-2, WT-1,
MEN-I, MEN-II, zac1, p73, BRCA1,
VHL, FCC, MMAC1, MCC, p16, p21, p57, C-CAM, p27 y
BRCA2. Inductores de apoptosis, tales como las proteasas Bax, Bak,
Bcl-X_{s}, Bik, Bid, Harakiri, Ad E1B, Bad y
ICE-CED3, podrían encontrar utilidad, de manera
similar, según la presente invención.
Diversos genes de enzimas son de interés según
la presente invención. Tales enzimas incluyen la citosina
desaminasa, hipoxantina-guanina
fosforribosiltransferasa,
galactosa-1-fosfato
uridiltransferasa, fenilalanina hidoxilasa, glucocerebrosidasa,
esfingomielinasa,
\alpha-L-iduronidasa,
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
timidina cinasa del HSV y timidina cinasa humana.
Las hormonas son otro grupo de genes que pueden
usarse en los vectores descritos en el presente documento. Se
incluyen las hormonas del crecimiento, prolactina, coriomamotropina,
lutropina, folitropina, gonadotropina coriónica, tirotropina,
leptina, corticotropina (ACTH), angiotensina I y II,
\beta-endorfina,
\beta-melanotropina
(\beta-MSH), colecistocinina, endotelina I,
galanina, péptido inhibidor gástrico (GIP), glucagón, insulina,
lipotropinas, neurofisinas, somatostatina, calcitonina, péptido
relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), péptido
relacionado con el gen de la \beta-calcitonina,
hipercalcemia del factor de tumor maligno (1-40),
proteína relacionada con la hormona paratiroidea
(107-139) (PTH-rP), proteína
relacionada con la hormona paratiroidea
(107-111)(PTH-rP), péptido de tipo
glucagón (GLP-1), pancreastatina, péptido
pancreático, péptido YY, PHM, secretina, péptido intestinal
vasoactivo (VIP), oxitocina, vasopresina (AVP), vasotocina,
encefalinamida, metorfinamida, alfa-melanotropina
(alfa-MSH), factor natriurético auricular
(5-28) (ANF), amilina, componente P amiloide
(SAP-1), corticoliberina (CRH), factor de liberación
de la hormona del crecimiento (GHRH), luliberina (LHRH),
neuropéptido Y, sustancia K (neurocinina A), sustancia P y
tiroliberina (TRH).
Otras clases de genes que se consideran para
insertarse en los vectores de la presente invención incluyen
interleucinas y citocinas. Interleucina I (IL-1),
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11 IL-12, GM-CSF
y G-CSF.
Ejemplos de enfermedades para las que el
presente vector viral sería útil incluyen, pero no se limitan a,
deficiencia de adenosina desaminasa, deficiencia del factor IX de
coagulación sanguíneo humano en hemofilia B, y fibrosis quística,
que implicarían la sustitución del gen receptor transmembrana de la
fibrosis quística. Los vectores realizados en la presente invención
podrían usarse también para el tratamiento de trastornos
hiperproliferativos tales como artritis reumatoide o restenosis
mediante la transferencia de genes que codifican para inhibidores
de la angiogénesis o inhibidores del ciclo celular. La transferencia
de activadores de profármaco tales como el gen
HSV-TK puede usarse también en el tratamiento de
trastornos hiperproliferativos, incluyendo el cáncer.
Oncogenes tales como ras, myc, neu, raf, erb,
src, fms, jun, trk, ret, gsp, hst, bcl y abl son también
dianas adecuadas. Sin embargo, para fines terapéuticos, estos
oncogenes se expresarían como un ácido nucleico antisentido, de
modo que se inhibe la expresión del oncogén. El término "ácido
nucleico antisentido" se refiere a los oligonucleótidos que
complementan las secuencias de bases de ARN y ADN que codifican para
oncogén. Los oligonucleótidos antisentido, cuando se introducen en
una célula diana, se unen específicamente a su ácido nucleico diana
y afectan a la transcripción, procesado de ARN, transporte y/o
traducción. La selección como diana del ADN de cadena doble (ds)
con oligonucleótidos conduce a la formación de triple hélice; la
selección como diana del ARN conducirá a la formación de la doble
hélice.
Los constructos antisentido pueden diseñarse
para unirse al promotor y otras regiones de control, exones,
intrones o incluso uniones exón-intrón de un gen.
Pueden emplearse constructos de ARN antisentido, o ADN que codifica
para tales ARN antisentido, para inhibir la traducción o
transcripción génica o ambas, en una célula huésped, o bien in
vitro o bien in vivo, tal como en un animal huésped,
incluyendo un sujeto humano. Las secuencias de ácido nucleico que
comprenden "nucleótidos complementarios" son las que pueden
realizar el apareamiento de bases según el modelo complementario de
Watson-Crick habitual. Es decir, que las purinas más
grandes aparearán las bases con las pirimidinas más pequeñas para
formar solamente combinaciones de guanina apareada con citosina
(G:C) y adenina apareada con o bien timina (A:T), en el caso del
ADN, o adenina apareada con uracilo (A:U) en el caso del ARN.
Tal como se usan en el presente documento, los
términos "complementario" o "secuencias antisentido"
significan secuencias de ácido nucleico que son complementarios de
manera sustancial sobre toda su longitud y tienen muy pocos
apareamientos erróneos. Por ejemplo, las secuencias de ácidos
nucleicos de quince bases de longitud pueden denominarse
complementarias cuando tienen un nucleótido complementario en las
posiciones trece o catorce con solamente apareamientos erróneos
sencillos o dobles. Naturalmente, las secuencias de ácidos nucleicos
que son "completamente complementarias" serán secuencias de
ácidos nucleicos que son totalmente complementarias a lo largo de
toda su longitud y no tienen apareamientos de bases erróneos.
Mientras que puede emplearse toda o parte de la
secuencia génica en el contexto de la construcción antisentido,
estadísticamente, cualquier secuencia de 17 bases de longitud debe
aparecer solamente una vez en el genoma humano y, por tanto, bastar
para especificar una secuencia diana única. Aunque oligómeros más
cortos son más fáciles de producir y aumentan la accesibilidad
in vivo, gran número de otros factores están implicados en
la determinación de la especificidad de hibridación. Tanto la
afinidad de unión y la especificidad de la secuencia de un
oligonucleótido por su diana complementaria aumentan con la longitud
creciente. Se contempla que se usarán oligonucleótidos de 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más pares de bases. Puede
determinarse fácilmente si un ácido nucleico antisentido dado es
eficaz en la selección como objetivo del gen de la célula huésped
correspondiente, simplemente sometiendo a prueba a los constructos
in vitro para determinar si se afecta la función del gen
endógeno o si se afecta la expresión de los genes relacionados que
tienen secuencias complementarias.
En determinadas realizaciones, puede desearse
emplear constructos antisentido que incluyen otros elementos, por
ejemplo, los que incluyen C-5 propino pirimidinas.
Se ha demostrado que los oligonucleótidos que contienen análogos de
propino C-5 de uridina y citidina se unen al ARN con
gran afinidad y que son inhibidores antisentido potentes de la
expresión génica (Wagner et al., 1993).
Como alternativa al suministro antisentido
seleccionado como objetivo, pueden usarse ribozimas seleccionadas
como objetivo. El término "ribozima" se refiere a una enzima
basada en ARN que puede seleccionar como diana y escindir
secuencias de bases particulares en ARN y ADN oncogénico. Las
ribozimas pueden o bien dirigirse directamente a las células, en
forma de oligonucleótidos de ARN que incorporan secuencias de
ribozima, o introducirse en la célula como un constructo de
expresión que codifica para el ARN de ribozima deseado. Las
ribozimas pueden usarse y aplicarse casi del mismo modo que se
describió para los ácidos nucleicos antisentido.
Otros genes terapéuticos pueden incluir genes
que codifican para antígenos tales como antígenos virales, antígenos
bacterianos, antígenos fúngicos o antígenos parasitarios. Los virus
incluyen picornavirus, virus corona, togavirus, flavivirus,
rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus,
reovirus, retrovirus, papovavirus, parvovirus, herpesvirus,
poxvirus, hepadnavirus, y virus espongiforme. Las dianas virales
preferidas incluyen gripe, virus de herpes simple 1 y 2, sarampión,
viruela, poliomelitis o VIH. Los patógenos incluyen tripanosomas,
céstodos, nemátodos, helmintos. Además, pueden seleccionarse como
objetivo de este modo marcadores tumorales, tales como antígeno
fetal o antígeno específico de la próstata. Ejemplos preferidos
incluyen proteínas env de VIH y antígeno de superficie de hepatitis
B. La administración de un vector según la presente invención para
fines de vacunación requeriría que los antígenos asociados a vector
fueran suficientemente no inmunógenos para permitir la expresión a
largo plazo del transgén, para lo que se desearía una fuerte
respuesta inmune. Preferiblemente, la vacunación de un individuo
solamente se requeriría con poca frecuencia, tal como anual o
bienalmente, y proporcionaría protección inmunológica a largo plazo
frente al agente infeccioso.
Con el fin de que el vector viral afecte la
expresión de un transcrito que codifica para un gen terapéutico, el
polinucleótido que codifica para el gen terapéutico estará bajo
control transcripcional de un promotor y una señal de
poliadenilación. Un "promotor" se refiere a una secuencia de
ADN reconocida por el mecanismo sintético de la célula huésped, o
un mecanismo sintético introducido, que se requiere para iniciar la
transcripción específica de un gen. Una señal de poliadenilación se
refiere a una secuencia de ADN reconocida por el mecanismo
sintético de la célula huésped, o un mecanismo sintético introducido
que se requiere para dirigir la adición de una serie de nucleótidos
sobre el extremo del transcrito de ARNm para el tráfico y el
procesado apropiado del transcrito fuera del núcleo hacia el
citoplasma para la traducción. La frase "bajo control
transcripcional" significa que el promotor está en la posición
correcta en relación al polinucleótido para controlar la expresión y
la iniciación, mediante la ARN polimerasa, del polinucleótido.
El término promotor se usará en el presente
documento para referirse a un grupo de módulos de control
transcripcional que están agrupados alrededor del sitio de
iniciación para la ARN polimerasa II. Muchas de las reflexiones
sobre cómo están organizados los promotores derivan de análisis de
varios promotores virales, incluyendo las unidades de transcripción
temprana del SV40 y la timidina cinasa (tk) del HSV. Estos estudios,
que han aumentado por estudios más recientes, han demostrado que
los promotores están compuestos de módulos funcionales discretos,
que consisten cada uno en aproximadamente 7-20 pb de
ADN, y que contienen uno o más sitios de reconocimiento para
proteínas represoras o activadoras transcripcionales.
Al menos un modulo en cada promotor funciona
para situar el sitio de inicio para la síntesis de ARN. El ejemplo
de esto mejor conocido es la secuencia TATA, pero en algunos
promotores que carecen de una secuencia TATA, tales como el
promotor para el gen de la desoxinucleotidiltransferasa terminal de
mamífero y el promotor para los genes tardíos del SV40, un elemento
diferenciado que recubre el propio sitio de inicio ayuda a fijar el
lugar de la iniciación.
Los elementos promotores adicionales regulan la
frecuencia de iniciación transcripcional. Normalmente, éstos se
localizan en la región a 30-110 pb en el sentido de
5' del sitio de inicio, aunque recientemente se ha demostrado que
un número de promotores contienen también elementos funcionales en
el sentido de 3' del sitio de inicio. La separación entre los
elementos promotores es frecuentemente flexible, de modo que se
conserva la función promotora cuando se invierten los elementos o
se mueven uno en relación a otro. En el promotor de tk la
separación entre los elementos promotores puede aumentarse hasta 50
pb de separación antes de que la actividad comience a disminuir.
Dependiendo del promotor, parece que los elementos individuales
pueden funcionar o bien cooperativamente o bien independientemente
para activar la transcripción.
No se cree que sea crítico el promotor
particular que se emplea para controlar la expresión de un gen
terapéutico, siempre que este pueda expresar el polinucleótido en
la célula diana. Por tanto, si se selecciona como objetivo una
célula humana, es preferible situar la región que codifica al
polinucleótido adyacente a y bajo el control de un promotor que
puede expresarse en una célula humana. De manera general, un
promotor de este tipo puede incluir un promotor o bien viral o bien
humano. En la tabla 2 se proporciona una lista de promotores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor puede caracterizarse además como un
promotor inducible. Un promotor inducible es un promotor que es
inactivo o que muestra baja actividad excepto en presencia de una
sustancia inductora. Algunos ejemplos de promotores que pueden
incluirse como parte de la presente invención incluyen, pero no se
limitan a, MT II, MMTV, colagenasa, estromelisina, SV40, gen MX
murino, \alpha-2-macroglobulina,
gen h-2kb del MHC de clase I, HSP70, proliferina,
factor de necrosis tumoral, gen de la hormona \alpha estimulante
del tiroides. En la tabla 3 se muestran los inductores asociados.
Se entiende que puede usarse cualquier promotor inducible en la
puesta en práctica de la presente invención y que todos los
promotores de este tipo entrarían dentro del espíritu y del alcance
de la invención
reivindicada.
reivindicada.
\vskip1.000000\baselineskip
En diversas realizaciones, el promotor de genes
temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV), el promotor
temprano del SV40 y la repetición terminal larga del virus del
sarcoma de Rous pueden usarse para obtener alto nivel de expresión
del polinucleótido de interés. También se contempla el uso de otros
promotores de fago bacteriano o de células de mamíferos o virales
que se conocen bien en la técnica para conseguir la expresión de
polinucleótidos, siempre que los niveles de expresión sean
suficientes para producir un efecto inhibidor del crecimiento.
Empleando un promotor de propiedades muy
conocidas, pueden optimizarse el nivel y el patrón de expresión de
un polinucleótido tras las transfección. Por ejemplo, la selección
de un promotor que es activo en células específicas, tal como
tirosinasa (melanoma), alfa-fetoproteína y albúmina
(tumores hepáticos), CC10 (tumor pulmonar) y antígeno específico de
la próstata permitirá la expresión específica de tejido del gen
terapéutico.
Los potenciadores se detectaron originalamente
como elementos genéticos que aumentaban la transcripción a partir
de un promotor localizado en una posición distante sobre la misma
molécula de ADN. Esta capacidad de actuar en una larga distancia
tiene muy pocos precedentes en los estudios clásicos de regulación
transcripcional procariota. El trabajo posterior demostró que las
regiones de ADN con actividad potenciadora están organizadas casi
como los promotores. Es decir, están compuestas de muchos elementos
individuales, cada uno de los cuales se une a uno o más proteínas
transcripcionales.
La distinción básica entre potenciadores y
promotores es de funcionamiento. Una región potenciadora como un
todo debe poder estimular la transcripción desde una distancia; esta
necesidad no ha de ser cierta para una región promotora o sus
elementos componentes. Por otro lado, un promotor debe tener uno o
más elementos que dirigen la iniciación de la síntesis de ARN en un
sitio en particular y en una orientación en particular, mientras
que los potenciadores carecen de estas especificidades. Los
promotores y potenciadores están normalmente unos sobre otros y
contiguos, pareciendo a menudo que tienen una organización modular
muy similar.
Adicionalmente, cualquier combinación
promotor/potenciador (tal como por la base de datos de promotores
eucariotas (Eukaryotic Promotor Data Base (EPDB)) podría usarse
también para conducir la expresión de un constructo en particular.
El uso de un sistema de expresión citoplasmática de T3, T7 o SP6 es
otra realización posible. Las células eucariotas pueden soportar la
transcripción citoplasmática de determinados promotores de
bacteriófagos si se proporciona la polimerasa del bacteriófago
apropiada, o bien como parte del complejo de suministro o bien como
un vector de expresión genética adicional.
Donde se emplea un inserto de ADNc, normalmente
se deseará incluir una señal de poliadenilación para efectuar la
poliadenilación apropiada del transcripto del gen. No se cree que la
naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para la
puesta en práctica de éxito de la invención, y puede emplearse
cualquier secuencia de este tipo. Se ha encontrado que tales
señales de poliadenilación, como las del gen de la timidina cinasa
del virus del herpes simple, hormona del crecimiento bovina y SV40
funcionan bien en varias células diana.
Con el fin de crear las líneas celulares
cooperadoras de la presente invención, y de crear vectores de
adenovirus recombinantes para su uso con las mismas, deben
suministrarse diversos constructos genéticos (es decir ADN) a una
célula. Un modo de conseguirlo es por medio de transducciones
virales usando partículas virales infecciosas, por ejemplo,
mediante la trasformación con un vector de adenovirus de la presente
invención. Alternativamente, pueden emplearse virus del papiloma
bovino o retroviral, permitiendo los dos la transformación
permanente de una célula huésped con un/unos gen(es) de
interés. En otras situaciones, el ácido nucleico que va a
transferirse no es infeccioso, es decir, contenido en una partícula
de virus infecciosa. Este material genético debe basarse en métodos
no virales para su transferencia.
En la presente invención se contemplan también
varios métodos no virales para la transferencia de constructos de
expresión en células de mamífero cultivadas. Éstos incluyen
precipitación con fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, 1973;
Chen y Okayama, 1987; Rippe et al., 1990)
DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación
(Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et
al., 1984), microinyección directa (Harland y Weintraub, 1985),
liposomas con carga de ADN (Nicolau y Sene, 1982; Fraley et
al., 1979), sonicación celular (Fechheimer et al., 1987),
bombardeo de genes usando microproyectiles de alta velocidad (Yang
et al., 1990), y transfección mediada por receptores (Wu y
Wu, 1987; Wu y Wu, 1988).
Una vez que se ha suministrado el constructo en
la célula, el ácido nucleico que codifica para el gen terapéutico
puede situarse y expresarse en diferentes sitios. En determinadas
realizaciones, el ácido nucleico que codifica para el gen
terapéutico puede integrarse de manera estable en el genoma de la
célula. Esta integración puede estar en la orientación y posición
afín por medio de recombinación homóloga (sustitución génica) o
puede estar integrada en una posición no específica, aleatoria
(aumentación génica). Todavía en realizaciones adicionales, el
ácido nucleico puede mantenerse de manera estable en la célula como
un segmento episomal de ADN separado. Tales segmentos de ácido
nucleico o "episomas" codifican para secuencias suficientes
para permitir el mantenimiento y la replicación independiente de, o
en sincronización con, el ciclo de la célula huésped. Cómo se
suministra el constructo de expresión a una célula y dónde, en la
célula, permanece el ácido nucleico depende del tipo de constructo
de expresión empleado.
En una realización de la invención, el
constructo de expresión puede consistir simplemente en plásmidos o
ADN recombinante desnudo. La transferencia del constructo puede
realizarse mediante cualquiera de los métodos mencionados
anteriormente, que permeabilizan química o físicamente la membrana
celular. Esto es particularmente aplicable para la transferencia
in vitro, sin embargo, puede aplicarse también para su uso
in vivo. Dubensky et al. (1984) inyectaron con éxito
DNA del virus del polioma en forma de precipitados de CaPO_{4} en
el hígado y bazo de ratones recién nacidos y adultos demostrando
replicación viral activa e infección aguda. Benvenisty y Neshif
(1986) demostraron también que la inyección intraperitoneal de
plásmidos precipitados con CaPO4 da como resultado la expresión de
los genes transfectados. Se prevé que el ADN que codifica para CAM
puede también transferirse de manera in vivo y expresar
CAM.
Otra realización de la invención para transferir
un constructo de expresión de ADN desnudo en células puede implicar
el bombardeo de partículas. Este método depende de la capacidad de
acelerar los microproyectiles recubiertos de ADN a una velocidad
alta permitiéndoles perforar las membranas celulares y entrar en las
células sin matarlas (Klein et al., 1987). Se han
desarrollado varios dispositivos para acelerar partículas pequeñas.
Un dispositivo de este tipo se basa en una descarga de alto voltaje
para generar una corriente eléctrica, que, a su vez, proporciona la
fuerza motriz (Yang et al., 1990). Los microproyectiles
usados han consistido en sustancias biológicamente inertes tales
como tungsteno o perlas de oro.
En una realización adicional de la invención, el
constructo de expresión puede estar atrapado en un liposoma. Los
liposomas son estructuras vesiculares caracterizadas por una
membrana de bicapa fosfolipídica y un medio acuoso interno. Los
liposomas multilamelares tienen múltiples capas lipídicas separadas
mediante medio acuoso. Éstos se forman espontáneamente cuando los
fosfolípidos están suspendidos en un exceso de disolución acuosa.
Los componentes lipídicos se reorganizan ellos mismos antes de la
formación de estructuras cerradas y atrapan agua y solutos
disueltos entre las bicapas lipídicas (Ghosh y Bachhawat, 1991).
La expresión y el suministro de ácido nucleico
mediado por liposoma y expresión del ADN foráneo in vitro ha
sido de mucho éxito. Usando el gen de la
\beta-lactamasa, Wong et al. (1980)
demostraron la viabilidad de la expresión y el suministro mediado
por liposoma de ADN foráneo en células de hematoma, HeLa, y de
embrión de polluelo cultivadas. Nicolau et al. (1987)
completaron con éxito la transferencia génica mediada por liposoma
en ratas tras inyección intravenosa. También se incluyen diversos
enfoques comerciales que implican tecnología de
"lipofección".
En determinadas realizaciones de la invención,
el liposoma puede complejarse con un virus hemaglutinante (HVJ).
Esto ha demostrado facilitar la fusión con la membrana celular y
promover la entrada a la célula del ADN encapsulado en el liposoma
(Kaneda et al., 1989). En otras realizaciones, el liposoma
puede complejarse o emplearse en conjunción con proteínas
cromosómicas no histónicas nucleares (HMG-1) (Kato
et al., 1991). Todavía en realizaciones adicionales, el
liposoma puede complejarse o emplearse en conjunción con tanto HVJ
como HMG-1. Puesto que tales constructos de
expresión se han empleado con éxito en la transferencia y expresión
de ácido nucleico in vitro e in vivo, éstos son
aplicables a la presente invención.
Otros constructos de expresión que pueden
emplearse para suministrar un ácido nucleico que codifica para un
gen terapéutico en células son vehículos de suministro mediado por
receptor. Éstos se aprovechan de la captación selectiva de
macromoléculas mediante endocitosis mediada por receptor en casi
todas las células eucariotas. Debido a la distribución específica
de un tipo celular de diversos receptores, el suministro puede ser
altamente específico (Wu y Wu, 1993).
Los vehículos que seleccionan como objetivo
genes, mediados por receptor, consisten generalmente en dos
componentes: un ligando específico del receptor celular y un agente
de unión a ADN. Se han usado varios ligandos para la transferencia
génica mediada por receptor. Los ligandos caracterizados de manera
más extensiva son asialoorosomucoide (ASOR) (Wu y Wu, 1987) y de
transferencia (Wagner et al., 1990). Recientemente, se ha
usado también una neoglicoproteína sintética, que reconoce el mismo
receptor que ASOR, como un vehículo de suministro de genes (Ferkol
et al., 1993; Perales et al., 1994) y factor de
crecimiento epidérmico (FCE), para suministrar genes a células de
carcinoma escamoso (Myers, documento EPO 0273085).
En otras realizaciones, el vehículo de
suministro puede comprender un ligando y un liposoma. Por ejemplo,
Nicolau et al.(1987) emplearon lactosilceramida, un
asialogangliósido de galactosa terminal, incorporada en los
liposomas y observaron un aumento en la captación del gen de la
insulina por los hepatocitos. Por tanto, es viable que un ácido
nucleico que codifica para un gen terapéutico puede también
suministrarse a un tipo celular tal como células tumorales,
epiteliales o prostáticas por un número indeterminado de sistemas
receptor-ligando con o sin liposomas. Por ejemplo,
puede usarse el antígeno específico de la próstata humano (Watt
et al., 1986) como el receptor del suministro mediado de un
ácido nucleico en el tejido prostático.
La presente invención emplea nucleasas para
eliminar los ácidos nucleicos contaminantes. Nucleasas a modo de
ejemplo incluyen Benzonase®, Pulmozyme®; o cualquier otra ADNasa o
ARNasa usada comúnmente en la técnica.
Las enzimas tales como Benzonase® degradan al
ácido nucleico y no tienen actividad proteolítica. La capacidad de
Benzonase® para hidrolizar rápidamente los ácidos nucleicos hace a
la enzima ideal para reducir la viscosidad del lisado celular. Es
muy conocido que los ácidos nucleicos pueden adherirse a partículas
derivadas de células tales como virus. La adhesión puede afectar a
la separación debido a la aglomeración, cambio de tamaño de la
partícula o cambio de carga de la partícula, dando como resultado
poco, si es que algo, de producto que se recupera con un esquema de
purificación dado. Benzonase® es muy conveniente para reducir la
carga en ácido nucleico durante la purificación, eliminando así la
interferencia y mejorando el rendimiento.
Tal como todas las endonucleasas, Benzonase®
hidroliza los enlaces fosfodiéster internos entre nucleótidos
específicos. En la digestión completa, todos los ácidos nucleicos
libres presentes en disolución se reducen a oligonucleótidos de 2 a
4 bases de longitud.
Hay dos métodos de centrifugación en gradiente
de densidad, la técnica de tasa zonal y la técnica isopícnica
(igual densidad), y ambas pueden usarse cuando se requiere la
separación cuantitativa de todos los componentes de una mezcla de
partículas. Éstos se usan también para la determinación de
densidades de flotación y para la estimación de los coeficientes de
sedimentación.
La separación de partículas mediante la técnica
de tasa zonal se basa en las diferencias de tamaño o tasas de
sedimentación. La técnica implica estratificar cuidadosamente una
disolución de muestra por encima de un gradiente de densidad del
líquido realizado, excediendo la densidad más alta de éste la de las
partículas más densas que han de separarse. Luego se centrifuga la
muestra hasta que se efectúa el grado deseado de separación, es
decir, durante tiempo suficiente para que las partículas viajen a
través del gradiente para formar bandas o zonas discretas que se
espacian según las velocidades relativas de las partículas. Debido a
que la técnica es dependiente del tiempo, la centrifugación debe
terminarse antes de que cualquiera de las zonas separadas formen
gránulos en el fondo del tubo. El método se ha usado para la
separación de enzimas, hormonas, híbridos ARN-ADN,
subunidades ribosómicas, orgánulos subcelulares, para el análisis de
la distribución del tamaño de muestras de polisomas y para
fraccionamientos de lipoproteínas.
Se estratifica la muestra por encima de un
gradiente de densidad continuo que abarca todo el intervalo de
densidades de partícula que han de separarse. La densidad máxima del
gradiente, por tanto, debe exceder siempre la densidad de la
partícula más densa. Durante la centrifugación, se produce la
sedimentación de las partículas hasta que la densidad de flotación
de la partícula y la densidad del gradiente son iguales (es decir,
cuando p_{p} = p_{m} en la ecuación 2,12). En este punto, no se
produce sedimentación adicional, independientemente de cuánto
tiempo continúe la centrifugación, ya que las partículas están
flotando en un colchón de material que tiene una densidad mayor que
la suya.
La centrifugación isopícnica, en contraste con
la técnica de tasa zonal, es un método en equilibrio, las partículas
se bandean para formar zonas, cada una a su densidad de flotación
característica. En los casos en los que, quizá, no se requieren
todos los componentes de una mezcla de partículas, puede
seleccionarse un intervalo de gradiente en el que sedimentarán los
componentes indeseados de la mezcla en el fondo del tubo
centrifugador mientras que las partículas de interés sedimentan en
sus posiciones isopícnicas respectivas. Una técnica de este tipo
implica una combinación de los enfoques tanto de tasa zonal como
isopícnico.
La centrifugación isopícnica depende
exclusivamente de la densidad de flotación de la partícula y no de
su forma o tamaño y es independiente del tiempo. Por eso, las
proteínas solubles, que tienen una densidad muy similar (por
ejemplo, p = 1,3 g cm^{-3} en disolución de sacarosa), normalmente
no pueden separarse mediante este método, mientras que los
orgánulos celulares (por ejemplo, aparato de Golgi, p = 1,11 g
cm^{-3}, mitocondria, p = 1,19 g cm^{-3} y peroxisomas, p =
1,23 g cm^{-3} en disolución de sacarosa) pueden separarse
eficazmente.
Como alternativa a estratificar la mezcla de
partículas que ha de separarse por encima de un gradiente realizado,
se mezcla inicialmente la muestra con el medio del gradiente para
dar una disolución de densidad uniforme, el gradiente se
"autoforma", mediante el equilibrio de sedimentación, durante
la centrifugación. En este método (denominado como método de
isodensidad en equilibrio), se hace generalmente uso de las sales de
metales pesados (por ejemplo, cesio o rubidio), sacarosa, sílice
coloidal o metrizamida.
Se mezcla la muestra (por ejemplo, ADN) de
manera homogénea con, por ejemplo, una disolución concentrada de
cloruro de cesio. La centrifugación de la disolución de cloruro de
cesio concentrada da como resultado la sedimentación de las
moléculas de CsCl para formar un gradiente de concentración y por
tanto un gradiente de densidad. Las moléculas de la muestra (ADN),
que inicialmente estaban distribuidas uniformemente en todo el
tubo, ahora o bien suben o bien sedimentan hasta que alcanzan una
región en la que la densidad de la disolución es igual a su
densidad de flotación, es decir, su posición isopícnica, en la que
se agruparán para formar zonas. Esta técnica sufre la desventaja de
que a menudo se requieren tiempos de centrifugación muy largos (por
ejemplo, de 36 a 48 horas) para establecer el equilibrio. Sin
embargo, se usa comúnmente en la centrifugación analítica para
determinar la densidad de flotación de una partícula, la composición
de bases de ADN de cadena doble y para separar las formas circulares
de las lineales de ADN.
Muchas de las separaciones pueden mejorarse
aumentando las diferencias de densidad entre las diferentes formas
de ADN mediante la incorporación de isótopos pesados (por ejemplo,
^{15}N) durante la biosíntesis, una técnica usada por Leselson y
Stahl para dilucidad el mecanismo de replicación del ADN en
Esherichia coli, o mediante la unión de tintes o iones de
metales pesados tales como bromuro de etidio. Los gradientes
isopícnicos se han usado también para separar y purificar virus y
analizar lipoproteínas plasmáticas humanas.
En determinadas realizaciones de la invención,
será deseable producir adenovirus purificados. Las técnicas de
purificación se conocen bien por los expertos en la técnica. Estas
técnicas tienden a implicar el fraccionamiento del medio celular
para separar las partículas de adenovirus de otros componentes de la
mezcla. Teniendo separadas las partículas adenovirales de los otros
componentes, puede purificarse el adenovirus usando técnicas
electroforéticas y cromatográficas para conseguir la purificación
completa. Métodos analíticos particularmente convenientes para la
preparación de una partícula adenoviral pura de la presente
invención son cromatografía de interacambio iónico, cromatografía
de exclusión por tamaño; electroforesis en gel de poliacrilamida. Un
método de purificación particularmente eficaz que ha de emplearse
en conjunción con la presente invención es HPLC.
Determinados aspectos de la presente invención
incumben a la purificación, y en realizaciones particulares, a la
purificación sustancial de una partícula adenoviral. El término
"purificado" tal como se usa en el presente documento, se
refiere a una composición aislable de otros componentes, en la que
la partícula adenoviral se purifica hasta cualquier grado en
relación a su forma naturalmente obtenible. Por tanto, una partícula
adenoviral purificada se refiere también a un componente
adenoviral, libre del entorno en el que puede producirse
naturalmente.
Generalmente, "purificado" se referirá a
una partícula adenoviral que se ha sometido a fraccionamiento para
eliminar otros componentes diversos, y cuya composición conserva de
manera sustancial su actividad biológica expresada. Cuando se usa
el término "purificado de manera sustancial", esta designación
se referirá a una composición en la que la partícula, proteína o
péptido forma el componente principal de la composición, tal como
constituir aproximadamente el 50% o más de los constituyentes de la
composición.
Los expertos en la técnica conocerán diversos
métodos para cuantificar el grado de purificación de una proteína o
péptido a la luz de la presente descripción. Éstos incluyen, por
ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa,
o evaluar la cantidad de polipéptidos en una fracción mediante
análisis SDS/PAGE. Un método preferido para evaluar la pureza de
una fracción es calcular la actividad específica de la fracción,
para compararla con la actividad específica del extracto inicial, y
por tanto calcular el grado de pureza, evaluado en el presente
documento mediante un "índice de purificación de n veces". Las
unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad
dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida
para seguir la purificación y si la proteína o péptido expresado
muestra o no una actividad detectable.
No hay un requisito general de que el adenovirus
se proporcione siempre en su estado más purificado. De hecho, se
contempla que productos sustancialmente menos purificados tendrán
utilidad en determinadas realizaciones. Puede conseguirse la
purificación parcial usando menos etapas de purificación en
combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de
purificación general. Los métodos que muestran un grado inferior de
purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total
del producto proteico, o en el mantenimiento de la actividad de una
proteína expresada.
Se entiende, por supuesto, que pueden emplearse
técnicas cromatográficas y otras técnicas de purificación conocida
por los expertos en la técnica para purificar proteínas expresadas
por los vectores adenovirales de la presente invención. La
cromatografía de intercambio iónico y cromatografía líquida de alta
resolución son técnicas de purificación a modo de ejemplo empleadas
en la purificación de partículas adenovirales y se describen en más
detalle a continuación en el presente documento.
Cromatografía de intercambio iónico. El
principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que
la afinidad de una sustancia por el intercambiador depende tanto de
las propiedades eléctricas del material como de la afinidad
relativa de las otras sustancias cargadas en el disolvente. Por eso,
el material unido puede eluirse cambiando el pH, alterando así la
carga del material, o añadiendo materiales competidores, de los
cuales, las sales son sólo un ejemplo. Puesto que sustancias
diferentes tienen propiedades eléctricas diferentes, las
condiciones para liberar varían con cada especie molecular unida. En
general, para obtener una buena separación, los métodos de elección
son o bien elución en gradiente de fuerza iónica continuo o elución
progresiva. (A menudo no se usa un gradiente de pH solo, ya que es
difícil establecer un gradiente de pH sin aumentar simultáneamente
la fuerza iónica). Para un intercambiador aniónico, se aumenta
gradualmente o bien el pH y la fuerza iónica o bien se aumenta la
fuerza iónica sola. Para un intercambiador catiónico se aumentan
tanto el pH como la fuerza iónica. La elección real del
procedimiento de elución es normalmente un resultado de la prueba y
error y de las consideraciones de estabilidad. Por ejemplo, para
materiales inestables, lo mejor es mantener el pH bastante
constante.
Un intercambiador iónico es un sólido que tiene
grupos cargados unidos químicamente a los que los iones se unen
electrostáticamente; éste puede intercambiar estos iones por iones
en disolución acuosa. Los intercambiadores iónicos pueden usarse en
cromatografía en columna para separar las moléculas según su carga;
realmente, otras características de la molécula son normalmente
importantes de manera que el comportamiento cromatográfico es
sensible a la densidad de carga, distribución de la carga y el
tamaño de la molécula.
El principio de la cromatografía de intercambio
iónico es que las moléculas se adsorben a los intercambiadores
iónicos de manera reversible de manera que las moléculas pueden
unirse o eluirse cambiando el entorno iónico. La separación en
intercambiadores iónicos se consigue normalmente en dos fases:
primera, se unen las sustancias que han de separarse al
intercambiador, usando condiciones que proporcionan una unión fuerte
y estable; luego se eluye la columna con tampones de composición,
fuerza iónica o pH diferentes y los componentes del tampón compiten
por los sitios de unión con el material unido.
Un intercambiador iónico es normalmente una red
tridimensional o una matriz que contiene grupos cargados unidos
covalentemente. Si un grupo está cargado negativamente,
intercambiará iones positivos y es un intercambiador catiónico. Un
grupo típico usado en intercambiadores catiónicos es el grupo
sulfónico, SO_{3}^{-}. Si un H^{+} está unido al grupo, se
dice que el intercambiador está en la forma ácida; éste puede, por
ejemplo, intercambiar un H^{+} por un Na^{+} o dos H^{+} por
un Ca^{2+}. El grupo ácido sulfónico se denomina un
intercambiador catiónico fuertemente ácido. Otros grupos usados
comúnmente son carboxilo e hidroxilo fenólico, ambos
intercambiadores catiónicos débilmente ácidos. Si el grupo cargado
es positivo (por ejemplo, un grupo amino cuaternario) es un
intercambiador aniónico fuertemente básico. Los intercambiadores
aniónicos débilmente básicos más comunes son los grupos amino
alifáticos o aromáticos.
La matriz puede estar hecha de diversos
materiales. Materiales comúnmente usados son dextrano, celulosa,
agarosa y copolímeros de estireno y vinilbenceno en los que el
divinilbenceno tanto entrecruza las cadenas de poliestireno como
contiene los grupos cargados. La tabla 4 proporciona la composición
de muchos intercambiadores iónicos.
La capacidad total de un intercambiador iónico
mide su aptitud para tomar grupos intercambiables por miligramo de
peso en seco. Este número se distribuye por el fabricante, y es
importante porque, si se excede la capacidad, los iones pasarán a
través de la columna sin unirse.
\newpage
La capacidad disponible es la capacidad en
condiciones experimentales particulares (es decir, pH, fuerza
iónica). Por ejemplo, la magnitud a la que está cargado el
intercambiador iónico depende del pH (el efecto del pH es menor con
intercambiadores iónicos fuertes). Otro factor es la fuerza iónica,
ya que los iones pequeños próximos a los grupos cargados compiten
con la molécula de muestra por estos grupos. Esta competición es
bastante eficaz si la muestra es una macromolécula, ya que el
coeficiente de difusión más alto del ion pequeño significa un mayor
número de encuentros. Claramente, cuando aumenta la concentración
del tampón, la competición se hace más
reñida.
reñida.
La porosidad de la matriz es una característica
importante porque los grupos cargados están tanto dentro como fuera
de la matriz, y porque la matriz actúa también como un tamiz
molecular. Es posible que las moléculas grandes no puedan penetrar
los poros; de modo que la capacidad morirá con el aumento de las
dimensiones moleculares. La porosidad de las resinas basadas en
poliestireno se determina por la cantidad de entrecruzamiento por el
divinilbenceno (la porosidad disminuye con el aumento de las
cantidades de divinilbenceno). Con las series AG y Dower, el
porcentaje de divinilbenceno se indica mediante un número tras una
X, por tanto, Dowex 50-X8 es 8% de
divinilbenceno.
Los intercambiadores iónicos se presentan en una
variedad de tamaños de partícula, denominados tamaño de malla.
Malla más fina significa un aumento de la razón superficie con
respecto al volumen y por tanto un aumento de la capacidad y una
disminución del tiempo para que se produzca el intercambio para un
volumen dado del intercambiador. Por otro lado, malla fina
significa una tasa de flujo lenta, que puede aumentar el diseminado
difusional. El uso de partículas muy finas, de aproximadamente 10
\mum de diámetro y alta presión para mantener un flujo adecuado
se denomina cromatografía líquida de alta resolución o alta
presión o simplemente HPLC.
Una colección de intercambiadores de este tipo
que tienen tales propiedades diferentes (carga, capacidad,
porosidad, malla) hace difícil la selección del apropiado para
lograr una separación. En los siguientes ejemplos se describe cómo
decidir el tipo de material de la columna y las condiciones para la
unión y la elución.
Pueden realizarse varias elecciones cuando se
emplea cromatografía de intercambio iónico como técnica. La primera
elección que ha de hacerse es si el intercambiador ha de ser
aniónico o catiónico. Si los materiales que han de unirse a la
columna tienen una sola carga (es decir, o bien positiva o bien
negativa), la elección está clara. Sin embargo, muchas sustancias
(por ejemplo, proteínas, virus), portan cargas tanto negativas como
positivas, y la carga neta depende del pH. En tales casos, el factor
primario es la estabilidad de la sustancia a diversos valores de
pH. La mayoría de las proteínas tienen un intervalo de estabilidad
de pH (es decir, en el que no se desnaturalizan) en el que éstas
están cargadas positiva o negativamente. Por eso, si una proteína
es estable a valores de pH por encima del punto isoeléctrico, se
requiere un intercambiador catiónico.
La elección entre intercambiadores fuertes y
débiles se basa también en el efecto del pH sobre la carga y la
estabilidad. Por ejemplo, si se somete a cromatografía una sustancia
débilmente ionizada que requiere un pH muy bajo o alto para la
ionización, es necesario un intercambiador iónico fuerte ya que éste
funciona en todo el intervalo de pH. Si la sustancia es lábil, son
preferibles intercambiadores iónicos débiles, ya que los
intercambiadores fuertes pueden a menudo deformar una molécula tanto
que la molécula se desnaturaliza. El pH al que la sustancia es
estable debe, por supuesto, ser del mismo nivel que el estrecho
intervalo de pH en el que se carga un intercambiador débil en
particular. Los intercambiadores iónicos débiles son también
excelentes para la separación de moléculas con una carga alta de los
de carga pequeña, ya que los iones débilmente cargados no se unen.
Los intercambiadores débiles muestran también mayor resolución de
sustancias si las diferencias de carga son muy pequeñas. Si una
macromolécula tiene una carga muy fuerte, puede ser imposible
eluirla de un intercambiador fuerte y de nuevo puede ser preferible
un intercambiador débil. En general, los intercambiadores débiles
son más útiles que los intercambiadores fuertes.
Los intercambidores Sephadex y
Bio-gel ofrecen una ventaja particular para las
macromoléculas que son inestables en fuerza iónica baja. Ya que los
entrecruzamientos en estos materiales mantiene la insolubilidad de
la matriz incluso si la matriz es altamente polar, la densidad de
los grupos ionizables puede hacerse varias veces mayor de lo que es
posible con intercambiadores iónicos de celulosa. El aumento en la
densidad de carga significa un aumento en la afinidad, de modo que
puede llevarse a cabo la adsorción a fuerzas iónicas más altas. Por
otro lado, estos intercambiadores retienen algunas de sus
propiedades de tamizado molecular de modo que, algunas veces, las
diferencias en el peso molecular anulan la distribución producida
por las diferencias de carga; el efecto de tamizado molecular puede
también mejorar la separación.
Las moléculas pequeñas son las que mejor se
separan sobre matrices con tamaño de poro pequeño (alto grado de
entrecruzamiento) ya que la capacidad disponible es grande, mientras
que las macromoléculas necesitan tamaño de poro grande. Sin
embargo, excepto para el tipo Sephadex, la mayoría de los
intercambiadores iónicos no ofrecen la oportunidad de corresponder
la porosidad con el peso molecular.
Los intercambiadores iónicos de celulosa han
demostrado ser los mejores para purificar moléculas grandes tales
como proteínas y polinucleótidos. Esto es debido a que la matriz es
fibrosa, y por tanto, todos los grupos funcionales están sobre la
superficie y disponibles para, incluso, las moléculas más grandes.
En muchos casos, sin embargo, formas de perla, tales como
DEAE-Sephacel y DEAE-Biogel P son
más útiles debido a que hay una tasa de flujo mejor y el efecto de
tamizado molecular ayuda a la separación.
\newpage
La selección del tamaño de malla es siempre
difícil. El tamaño de malla pequeño mejora la resolución pero
disminuye la tasa de flujo, que aumenta la zona de diseminado y
disminuye la resolución. Por tanto, el tamaño de malla apropiado se
determina normalmente de manera empírica.
Debido a que los propios tampones consisten en
iones, pueden también intercambiarse, y el equilibrio de pH puede
verse afectado. Para evitar estos problemas, se adopta la regla de
los tampones: uso de tampones catiónicos con intercambiadores
aniónicos y tampones aniónicos con intercambiadores catiónicos.
Debido a que la fuerza iónica es un factor en la unión, debe
elegirse un tampón que tenga una capacidad de tamponación alta, de
modo que su fuerza iónica no sea demasiado alta. Además, para la
mejor resolución, se ha encontrado de manera general, que las
condiciones iónicas usadas para aplicar la muestra a la columna (las
denominadas condiciones de partida) deben estar próximas a las
usadas para eluir la columna.
La cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) se caracteriza por una separación muy rápida
con una resolución extraordinaria de los picos. Esto se consigue
mediante el uso de partículas muy finas y alta presión para
mantener una tasa de flujo adecuada. La separación puede lograrse en
cuestión de minutos, o como máximo una hora. Además, sólo se
necesita un volumen de muestra muy pequeño ya que las partículas son
tan pequeñas y compactas que el volumen inicial es una fracción muy
pequeña del volumen del lecho. Además, la concentración de la
muestra no necesita ser muy grande, ya que las bandas son tan
estrechas que hay muy poca dilución de la muestra.
Cuando las partículas virales de la presente
invención se purifiquen según los métodos expuestos anteriormente,
se administrarán, se prevé, in vitro, ex vivo o in
vivo. Por tanto, será deseable preparar el complejo como una
composición farmacéutica apropiada para la aplicación deseada.
Generalmente, esto conllevará preparar una composición farmacéutica
que esté esencialmente libre de pirógenos, así como de cualquier
otra impureza que puede ser perjudicial para humanos o animales.
Generalmente se deseará emplear tampones y sales apropiadas para
hacer estable al complejo y permitir la captación del complejo por
las células diana.
Las composiciones acuosas pueden comprender una
cantidad eficaz de constructo de expresión y ácido nucleico,
disuelta o dispersa en un medio acuoso o vehículo farmacéuticamente
aceptable. Tales composiciones pueden denominarse también inóculos.
Las frases "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se
refieren a composiciones y entidades moleculares que no producen
una reacción perjudicial, alérgica o adversa cuando se administran
a un animal, o a un ser humano, de modo apropiado. Tal como se usa
en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente
aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de
dispersión, recubrimientos, agentes antifúngicos y antibacterianos,
agentes de retraso de la absorción e isotónicos y similares. El uso
de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas
es muy conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier
agente o medio convencional es incompatible con el principio
activo, se prevé su uso en las composiciones terapéuticas. Pueden
incorporarse también principios activos complementarios a las
composiciones.
Las disoluciones de los principios activos como
sales farmacológicamente aceptables o bases libres pueden
prepararse en agua mezclada de manera adecuada con un tensioactivo,
tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones pueden prepararse
también en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los
mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y
uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el
crecimiento de microorganismos.
Las partículas virales pueden incluir
preparaciones farmacéuticas clásicas para su uso en regímenes
terapéuticos, incluyendo su administración a seres humanos. La
administración de composiciones terapéuticas puede ser por medio de
cualquier ruta común, siempre que el tejido diana esté disponible
por medio de esa ruta. Esto incluye oral, nasal, bucal, rectal,
vaginal o tópica. Alternativamente, la administración será inyección
ortotópica, subcutánea intradérmica, intramuscular,
intraperitoneal, o intravenosa. Tales composiciones se
administrarían normalmente como composiciones farmacéuticamente
aceptables que incluyen otros excipientes, tampones o vehículos
fisiológicamente aceptables. Para su aplicación contra tumores, se
prevé la inyección intratumoral directa, inyección de un lecho
tumoral extirpado, administración general o regional (es decir,
linfática). Puede desearse también realizar la perfusión continua
durante horas o días por medio de un catéter en el sitio enfermo, un
tumor o sitio del tumor.
Las composiciones terapéuticas pueden
administrase de manera ventajosa en forma de composiciones
inyectables o bien como disoluciones líquidas o suspensiones;
también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolución
en, o suspensión en líquido antes de la inyección. Estas
preparaciones pueden también emulsionarse. Una composición típica
para fines de este tipo comprende un soporte farmacéuticamente
aceptable. Por ejemplo, la composición puede contener
aproximadamente 100 mg de albúmina sérica humana por mililitro de
solución salina tamponada con fosfato. Otros vehículos
farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones acuosas,
excipientes no tóxicos, incluyendo sales, conservantes, tampones y
similares pueden usarse. Ejemplos de disolventes no acuosos son
propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal y ésteres orgánicos
inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos
incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, disoluciones
salinas, vehículos parenterales tales como cloruro de sodio,
dextrosa en Ringer, etc. Los vehículos intravenosos incluyen
regeneradores de nutrientes y fluidos. Los conservantes incluyen
agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases
inertes. El pH y la concentración exacta de los diversos componentes
de la composición farmacéutica se ajustan según parámetros muy
conocidos.
Formulaciones adicionales que son adecuadas para
administración oral. Las formulaciones orales incluyen tales
excipientes típicos como, por ejemplo, grados farmacéuticos de
manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica,
celulosa, carbonato de magnesio y similares. Las composiciones toman
la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras,
cápsulas, polvos o formulaciones de liberación sostenida. Cuando la
ruta es tópica, la forma puede ser una crema, ungüento, pomada o
aereosol.
Una cantidad eficaz del agente terapéutico se
determina basándose en el objetivo deseado, por ejemplo (i)
inhibición de la proliferación de células tumorales, (ii)
eliminación o muerte de las células tumorales, (iii) vacunación, o
(iv) transferencia génica para la expresión a largo plazo de un gen
terapéutico. El término "dosis unitaria" se refiere a unidades
físicamente discretas adecuadas para su uso en un sujeto,
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la
composición terapéutica calculada para producir las respuestas
deseadas discutidas anteriormente, en asociación con su
administración, es decir, el régimen de tratamiento y la ruta
apropiada. La cantidad que ha de administrarse, tanto según el
número de tratamientos como la dosis unitaria, depende del sujeto
que ha de tratarse, el estado del sujeto y el resultado deseado. Se
esperan regímenes terapéuticos génicos múltiples, especialmente para
adenovirus.
Un vector adenoviral que codifica para un gen
supresor tumoral puede usarse para tratar pacientes de cáncer. Las
cantidades típicas de vector de adenovirus usados en la terapia
génica del cáncer es de 10^{3}-10^{15}
UFP/dosis, (10^{3}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6}, 10^{7},
10^{8}, 10^{9}, 10^{10},10^{11}, 10^{12}, 10^{13},
10^{14}, 10^{15}) en la que la dosis puede dividirse en varias
inyecciones en diferentes sitios dentro de un tumor sólido. El
régimen de tratamiento también puede implicar varios ciclos de
administración del gen de transferencia génica durante un periodo
de 3-10 semanas. La administración del vector
durante periodos de tiempo más largos, desde meses hasta años,
puede ser necesaria para el beneficio terapéutico continuo.
Un vector adenoviral que codifica para un gen
terapéutico puede usarse para vacunar seres humanos u otros
mamíferos. Normalmente, se administraría una cantidad de virus
eficaz para producir el efecto deseado, en este caso de la
vacunación, a un ser humano o mamífero de modo que se consiga la
expresión a largo plazo del transgén y se desarrolle una fuerte
respuesta inmune del huésped. Se prevé que será suficiente una serie
de inyecciones, por ejemplo, una inyección primaria seguida de dos
inyecciones de refuerzo, para inducir una respuesta inmune a largo
plazo. Una dosis típica será de desde 10^{6} hasta 10^{15}
UFP/inyección dependiendo del resultado deseado. Dosis bajas de
antígeno inducen generalmente una fuerte respuesta mediada por la
célula, mientras que dosis altas de antígeno inducen generalmente
una respuesta inmune mediada por el anticuerpo. Las cantidades
precisas de la composición terapéutica dependen también del juicio
del profesional y son exclusivas a cada individuo.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Debería
apreciarse por aquellos expertos en la técnica que las técnicas
descritas en los siguientes ejemplos representan técnicas
descubiertas por el inventor para funcionar bien en la práctica de
la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos
preferidos para su práctica.
Se usaron para los estudios células 293 (células
epiteliales de riñón embrionario humano) del banco celular maestro
("Master Cell Bank").
Se usó para la fase de crecimiento celular el
medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, 4,5 g/l de glucosa) + el
10% de suero bovino fetal (FBS). Para la fase de producción de
virus, la concentración de FBS en el DMEM se bajó al 2%.
El AdCMVp53 es un adenovirus humano de tipo 5,
alterado por ingeniería genética, incapaz de replicación, que
expresa la proteína natural p53 humana bajo el control del promotor
temprano inmediato de citomegalovirus (CMV).
Se utilizó un biorreactor Celligen (New
Brunswick Scientific, Co. Inc.) con 5 l de volumen total (3,5 l de
volumen de funcionamiento), para producir sobrenadante de virus
usando el cultivo de microsoporte. Se usó 13 g/l de microsoporte
recubierto de vidrio (SoloHill) para hacer crecer las células en el
biorreactor.
Las células 293 del banco celular maestro (MCB:
Master Cell Bank) se descongelaron y se expandieron en fábricas de
células (Nunc). Las células se separaron generalmente en una
confluencia de aproximadamente un 85-90%. Se
inocularon las células en el biorreactor a una concentración de
inoculación de 1 x 10^{5} células/ml. Se dejó que las células se
adhirieran a los microsoportes mediante agitación intermitente. Se
inició la agitación continua a una velocidad de 30 rpm, de 6 a 8 h
después de la inoculación de las células. Se cultivaron las células
durante 7 días con los parámetros del proceso fijados a pH = 7,20,
oxígeno disuelto (OD) = 60% de saturación de aire, temperatura =
37ºC. En el día 8, se infectaron las células con AdCMVp53 a una MDI
de 5. Después de cincuenta horas de infección con el virus, se
aumento la velocidad de agitación desde 30 rpm hasta 150 rpm para
facilitar la lisis de las células y la liberación del virus en el
sobrenadante. Se recogió el sobrenadante de virus después de 74 h
de infección. Luego se filtró el sobrenadante de virus para mayor
concentración/diafiltración.
También se usó un sistema biorreactor Cellcube™
(Coming-Costar) para la producción del virus
AdCMVp53. Está compuesto de un módulo de cultivo celular
desechable, una oxigenador, una bomba de recirculación del medio y
una bomba de medio para la perfusión. El módulo de cultivo celular
utilizado tiene un área superficial de cultivo de 21.550 cm^{2} (1
mer).
Las células 293 del banco celular maestro (MCB)
se descongelaron y expandieron en fábricas de células (Nunc). Las
células se separaron generalmente en una confluencia de
aproximadamente un 85-90%. Se inocularon las células
en el Cellcube™ según las recomendaciones del fabricante. Las
densidades de inoculación de células estuvieron en el intervalo de
1-1,5 x 10^{4}/cm^{2}. Se dejó que las células
crecieran durante 7 días a 37ºC bajo condiciones de cultivo de pH =
7,20, OD = 60% de saturación de aire. La tasa de perfusión del medio
se reguló según la concentración de glucosa en el Cellcube™. Un día
antes de la infección viral, se cambió el medio para la perfusión
des DMEM + 10% FBS a DMEM + 2% FBS. En el día 8, se infectaron las
células con el virus AdCMVp53 a una multiplicidad de infección
(MDI) de 5. Se detuvo el medio de perfusión durante 1 h
inmediatamente después de la infección y luego se reanudó durante
el periodo restante de la fase de producción de virus. Se recogió el
cultivo después de 45-48 h de infección.
Se utilizó Tween-20 (Fisher
Chemicals) a una concentración de un 1% (v/v) en tampón Tris 20 mM +
NaCl 0,25 M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 para lisar a las células
al final de la fase de producción de virus en el Cellcube™.
Primero se clarificaron el sobrenadante de virus
del biorreactor Celligen y la disolución de virus del Cellcube™
usando un filtro de profundidad (Preflow, Gelman Sciences), luego se
filtró a través de un filtro de 0,8/0,22 \mum (SuporCap 100,
Gelman Sciences).
Se utilizó la filtración de flujo tangencial
(TFF) para concentrar e cambiar el tampón del sobrenadante de virus
del biorreactor Celligen y de la disolución de virus del Cellcube™.
Se utilizó un mini casete Pellicon II (Millipore) de 300 K de
límite de peso molecular nominal (NMWC) para la concentración y
diafiltración. Primero se concentró la disolución de virus 10
veces. A esto le siguió un cambio de 4 volúmenes de muestra de
tampón con respecto al tampón Tris 20 mM + NaCl 1,0 M + MgCl_{2} 1
mM, pH = 9,00 utilizando el método de diafiltración a volumen
constante.
Se llevó a cabo una concentración/diafiltración
similar para el virus purificado en columna. Se utilizó una mini
casete Pellicon II de 100 K de NMWC en lugar de la casete de 300 K
de NMWC. Se realizó la diafiltración con respecto al tampón Tris 20
mM + NaCl 0,25 M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,0 o solución salina
tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS).
Se trató la disolución de virus
concentrada/diafiltrada con Benzonase™ (American International
Chemicals) a una concentración de 100 u/ml, a temperatura ambiente
durante toda la noche para reducir la concentración de ácido
nucleico contaminante en la disolución de virus.
Se purificó la disolución bruta de virus usando
doble ultracentrifugación en gradiente de CsCl usando un rotor SW40
en una ultracentrífuga Beckman (XL-90). Primero, se
colocaron 7 ml de la disolución bruta de virus encima de un
gradiente de CsCl escalonado hecho de una disolución de igual
volumen de 2,5 ml de disolución de CsCl 1,25 g/ml y 1,40 g/ml,
respectivamente. Se centrifugó el gradiente de CsCl a 35,000 rpm
durante 1 h a temperatura ambiente. Se recuperó la banda de virus
en la interfaz de gradiente. El virus recuperado se purificó
adicionalmente a través de una gradiente de CsCl isopícnico. Esto
se realizó mezclando la disolución de virus con al menos 1,5 veces
el volumen de la disolución de CsCl 1,33 g/ml. Se centrifugó la
disolución de CsCl a 35,000 rpm durante al menos 18 h a temperatura
ambiente. Se recuperó la banda inferior como el virus intacto. Se
sometió a diálisis el virus inmediatamente con respecto al tampón
Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 para extraer el CsCl. Se
almacenó el virus dializado a -70ºC para se uso futuro.
Se purificó la disolución de virus tratada con
Benzonase usando CII. Se utilizó una resina aniónica fuerte
Toyopearl SuperQ 650M (Tosohaas) para la purificación. Se utilizaron
un sistema de FPLC (Pharmacia) con una columna XK16 (Pharmacia)
para el desarrollo del método inicial. Se llevaron a cabo estudios
adicionales ampliados usando un sistema BioPilot (Pharmacia) con
una columna XK 50 (Pharmacia). En resumen, se empacó la resina en
las columnas y se lavó con NaOH 1 N, después se cargó con tampón B a
lo que siguió el acondicionamiento con tampón A. Los tampones A y B
estaban compuestos de Tris 20 mM + NaCl 0,25M + MgCl_{2} 1 mM, pH
= 9,00 y Tris 20 mM + NaCl 2M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00,
respectivamente. Se cargó la muestra de disolución viral en la
columna acondicionada, seguido de un lavado de la columna con el
tampón A hasta que la absorción UV alcanzó la referencia. Se eluyó
el virus purificado de la columna mediante el uso de un volumen de
10 columnas de gradiente lineal de NaCl.
Se desarrolló un procedimiento de análisis por
HPLC para evaluar la eficacia de la producción y purificación de
virus. Se obtuvo el tris (hidroximetil)aminometano (tris) de
FisherBiotech (número de catálogo BP154-1; Fair
Lawn, Nueva Jersey, EE.UU.); se obtuvo el cloruro de sodio (NaCl) de
Sigma (número de catálogo S-7653, St. Louis, MO,
EE.UU.). Ambos se usaron directamente sin purificación adicional. Se
realizaron los análisis por HPLC en un sistema de gradiente
analítico (Analytical Gradiente System) de Beckman, con el software
Gold Workstation (bomba binaria 126 y detector de diodos en serie
168) equipado con una columna de intercambio aniónico de TosoHaas
(7,5 cm x 7,5 mm DI, 10 \mum de tamaño de partícula, número de
catálogo 18257). Se utilizó una columna de intercambio aniónico
Resource Q (Pharmacia) de 1-ml para evaluar el
método desarrollado por Huyghe et al. usando su sistema de
tampón HEPES. Este método sólo se probó para el sistema
biorreactor.
Los tampones usados en el presente sistema de
HPLC fueron: Tampón A: tampón tris 10 mM, pH 9,0, Tampón B: NaCl
1,5 M en tampón A, pH 9,0. Se filtraron los tampones a través de un
filtro de cabeza de botella de 0,22 \mum de Coming (número de
catálogo 25970-33). Antes de la inyección se
filtraron todas las muestras a través de un FP Acrodisc PF de
0,8/0,22 \mum de Gelman Sciences (número de catálogo 4187).
Se inyecta la muestra en la columna de HPLC en
un volumen de 60-100 \mul. Después de la
inyección, se lava la columna (TosoHaas) con el 20% de B durante 3
min a una velocidad de flujo de 0,75 ml/min. Se inicia luego un
gradiente, en el que B se aumenta desde un 20% hasta un 50% durante
6 min. Luego se cambia el gradiente desde un 50% hasta un 100% de B
durante 3 min, seguido del 100% de B durante 6 min. Se cambian de
vuelta progresivamente las concentraciones de sal hasta el 20% otra
vez durante 4 min, y se mantienen al 20% de B durante otros 6 min.
El tiempo de retención del Adp53 es de 9,5 \pm 0,3 min con
A_{260}/A_{280} \cong 1,26 \pm 0,03. Se consigue la
limpieza de la columna después de cada serie cromatográfica mediante
la inyección de 100 \mul de NaOH 0,15 M y luego haciendo pasar el
gradiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para un sistema de cultivo celular de perfusión,
tal como el Cellcube™, la tasa de perfusión del medio juega un
papel importante en el rendimiento y la calidad del producto. Se
examinaron dos estrategias de perfusión del medio diferentes. Una
estrategia fue mantener la concentración de glucosa en el Cellcube™
\geq 2 g/l (tasa de perfusión alta). La otra fue mantener la
concentración de glucosa \geq 1 g/l (tasa de perfusión del medio
baja).
No se observaron cambios significativos en los
parámetros del cultivo, tales como pH, OD, entre las dos tasaes de
perfusión diferentes. Se produjeron aproximadamente cantidades
equivalentes de virus bruto (antes de la purificación) después de
recoger usando la disolución de lisis Tween-20 al 1%
como se muestra en la tabla 5. Sin embargo, se observó una
diferencia drástica en los perfiles de HPLC de las soluciones
virales de las series de producción de la tasa de perfusión del
medio alta y baja.
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Como se muestra en la figura 1, se produjo un
pico de virus muy bien separado (tiempo de retención de 9,39 min) a
partir de la disolución viral usando una tasa de perfusión del medio
baja. Se encontró que se obtuvo un virus de pureza y actividad
biológica adecuadas después de una purificación por cromatografía de
intercambio iónico de una única etapa de la disolución de virus
producida a una tasa de perfusión del medio baja. Por otro lado, no
se observó un pico de virus separado en el tiempo de retención de
9,39 min de la disolución viral producida usando una tasa de
perfusión del medio alta. Esto sugiere se produjeron contaminantes
que tienen el mismo perfil de elución que el virus a una tasa de
perfusión del medio alta. Aunque aún no está clara la naturaleza de
los contaminantes, se espera que los contaminantes estén
relacionados con la producción de proteínas de matriz extracelular
aumentada a una tasa de perfusión del medio alta (alta alimentación
de suero) de las células productoras. Estas características de
separación deficiente observadas en el HPLC crearon dificultades
para procesar la purificación por CII de proceso tal como se muestra
en los siguientes ejemplos. Como resultado, la tasa de perfusión
del medio usada durante el crecimiento celular y las fases de
producción de virus en el Cellcube™ tiene un efecto significativo
en la purificación por CII aguas abajo del virus. Se recomienda una
tasa de perfusión del medio baja. Esto produce no sólo producto
bruto fácil de purificar sino que también ofrece una producción más
económica debido al consumo del medio reducido.
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en experiencia previa, los inventores
evaluaron en primer lugar el método de
congelado-descongelado. Se recogieron las células
del Cellcube™ 45-48 h después de la infección.
Primero, se aisló el Cellcube™ del sistema de cultivo y se drenó el
medio gastado. Luego, se bombeó disolución de EDTA 50 mM al
Cellcube™ para separar las células de la superficie de cultivo. La
suspensión celular así obtenida se centrifugó a 1.500 rpm (Beckman
GS-6KR) durante 10 min. El sedimento de células
resultante se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato
de Dulbecco (DPBS). La suspensión celular se sometió a 5 ciclos de
congelado/descongelado entre un baño María a 37ºC y un baño de
etanol y hielo seco para liberar el virus de las células. Se analizó
el lisado celular bruto (CCL) así generado por HPLC.
La figura 2 muestra el perfil de HPLC. No se
observa ningún pico de virus al tiempo de retención de 9,32 min.
Por el contrario, se producen dos picos a los tiempos de retención
de 9,11 y 9,78 min. Este perfil sugiere que los otros contaminantes
que tienen un tiempo de elución similar al del virus existen en el
CCL e interfieren con la purificación del virus. Como resultado, se
observó una eficacia de purificación muy baja cuando se purificó el
CCL mediante CII usando FPLC.
Además de la baja eficiencia de purificación,
hubo una pérdida significativa de producto, durante la etapa de
recogida de células, hacia la disolución de EDTA tal como se indica
en la tabla 6. Aproximadamente se perdió el 20% del producto en la
disolución de EDTA, que se descartó. Además aproximadamente el 24%
del producto de virus bruto está presente en el medio gastado que
también se descartó. Por tanto, sólo el 56% del producto de virus
bruto está en el CCL. Además, el
congelado-descongelado es un proceso de alta
variación y con una capacidad de modificación de escala muy
limitada. Es necesario desarrollar un proceso de lisis celular más
eficaz con menor pérdida de producto.
Los datos se generaron de un Cellcube^{TM} de
1 mer.
\vskip1.000000\baselineskip
Los detergentes se han usado para lisar células
para liberar los orgánulos intracelulares. Consiguientemente los
inventores evaluaron el método de lisis por detergente para la
liberación del adenovirus. La tabla 7 enumera los 5 detergentes no
iónicos diferentes que se evaluaron para la lisis celular. Se
recogieron las células del Cellcube™ 48 h después de la infección
usando EDTA 50 mM. El sedimento de células se resuspendió en los
diferentes detergentes a varias concentraciones, enumeradas en la
tabla 7.
La lisis celular se llevó acabo o bien a
temperatura ambiente o bien en hielo durante 30 min. Se obtuvo una
disolución de lisis clara después de la centrifugación para eliminar
el precipitado y el residuo celular. Se trataron las disoluciones
de lisis con Benzonase y luego se analizaron mediante HPLC. La
figura 3 muestra los perfiles de HPLC de disoluciones de lisis de
los detergentes diferentes. Thesit y NP-40 tuvieron
rendimientos similares a Triton X-100. La
disolución de lisis generada a partir de Tween-20 al
1% dio la mejor resolución de virus y observándose la peor
resolución de virus con Brij-58. Se encontró la
lisis celular más eficaz a una concentración de detergente del 1%
(p/v). La temperatura de lisis no contribuyó significativamente a la
resolución de virus a las concentraciones de detergente examinadas.
Con el fin de simplificar el proceso, se recomienda la lisis a
temperatura ambiente. Se utilizó la disolución de lisis compuesta
por Tween-20 al 1% en Tris 20 mM + NaCl 0,25M +
MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 para la lisis celular y la recogida de
virus en el Cellcube™.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clarificó y filtró la disolución de virus de
la etapa de lisis antes de la concentración/diafiltración. Se
evaluaron las membranas TFF de diferentes NMWC, incluyendo 100K,
300K, 500K, y 1000K, para conseguir una concentración/diafiltración
eficaz. Se obtuvo el mayor flujo del medio, con pérdida de virus
mínima en el filtrado, con una membrana de 300K de NMWC. Membranas
con NMWC más grande ofrecieron un flujo del medio más alto, pero
dieron como resultado una mayor pérdida de virus en el filtrado,
mientras que membranas con NMWC más pequeños alcanzaron un flujo
del medio insuficiente. En primer lugar, se concentró la disolución
de virus 10 veces, que estuvo seguida de una diafiltración de 4
volúmenes de muestra con respecto al tampón Tris 20 mM + NaCl 0,25
M + MgCl_{2} 1 mM, pH = 9,00 usando el método de volumen
constante. Durante el proceso de concentración/diafiltración, se
mantuvo la caída de presión a través de la membrana a \leq 5 psi.
Se demostró un nivel consistente alto de recuperación de virus
durante la etapa de concentración/diafiltración como se muestra en
la tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se trató la disolución de virus, después de la
concentración/diafiltración, con Benzonase (nucleasa) para reducir
la concentración de ácido nucleico contaminante en la disolución de
virus. Se evaluaron diferentes concentraciones de trabajo de
Benzonase, que incluyeron 50, 100, 200, 300 unidades/ml, para la
reducción de las concentraciones de ácido nucleico. Con el fin de
simplificar el proceso, se llevó a cabo el tratamiento a
temperatura ambiente durante la noche. Se observó una reducción
significativa de el ácido nucleico contaminante que se puede
hibridar con el ADN genómico humano, después del tratamiento con
Benzonase.
La tabla 9 muestra la reducción de la
concentración de ácido nucleico antes y después del tratamiento con
Benzonase. Se analizó la disolución de virus por HPLC antes y
después del tratamiento con Benzonase. Como se muestra en la figura
4A y la figura 4B, se observó una reducción drástica en el pico de
ácido nucleico contaminante después del tratamiento con Benzonase.
Esto está de acuerdo con el resultado del ensayo de hibridación del
ácido nucleico. Debido a su eficacia, se utilizó una concentración
de Benzonase de 100 u/ml para el tratamiento de la disolución de
virus bruto.
Condición de tratamiento: concentración de
Benzonase: 100 u/ml, temperatura: temperatura ambiente, tiempo:
durante la noche.
Se observó un cambio considerable en el perfil
de HPLC antes y después del tratamiento con Benzonase. No se
detectaron picos de virus separado en el tiempo de retención de 9,33
min después del tratamiento con Benzonase. Al mismo tiempo, se
desarrolló un pico importante con adsorción alta, a 260 nm, en el
tiempo de retención de 9,54 min. Los resultados del ensayo de
titulación indicaron que el tratamiento con Benzonase no afectó
negativamente al título del virus y el virus permaneció intacto e
infeccioso después del tratamiento con Benzonase. Se dedujo que el
ácido nucleico celular liberado durante la etapa de lisis de células
interactuó con el virus y o bien formó agregados con el virus o
bien se adsorbió sobre la superficie del virus durante el
tratamiento con Benzonase.
Para minimizar la posible interacción del ácido
nucleico y el virus durante el tratamiento con Benzonase, se
añadieron diferentes concentraciones de NaCl a la disolución de
virus antes del tratamiento con Benzonase. No ocurrió ningún cambio
drástico en el perfil de HPLC después del tratamiento con Benzonase
en presencia de NaCl 1 M en la disolución de virus. La figura 5
muestra el perfil de HPLC de la disolución de virus después del
tratamiento con Benzonase en presencia de NaCl 1M. A diferencia de
lo mostrado en la figura 4B, todavía existe un pico de virus al
tiempo de retención de 9,35 min, después del tratamiento con
Benzonase. Este resultado indica que la presencia de NaCl 1M
previene la interacción del ácido nucleico con el virus durante el
tratamiento con Benzonase y facilita la purificación adicional del
virus del ácido nucleico contaminante.
La presencia de una carga negativa en la
superficie del adenovirus en condiciones de pH fisiológicas impulsó
la evaluación de los intercambiadores de iones aniónicos para la
purificación de adenovirus. Se utilizó el intercambiador de iones
aniónico fuerte Toyopearl SuperQ 650M para el desarrollo de un
método de purificación. Se evaluaron los efectos de la
concentración de NaCl y el pH del tampón de carga (tampón A) en la
purificación de virus utilizando el sistema FPLC.
Para la cromatografía de intercambio iónico, el
pH del tampón es uno de los parámetros más importantes y puede
tener influencias drásticas en la eficacia de la purificación. Con
respecto al pH y la conductividad del medio utilizado durante la
producción de virus, los inventores formularon Tris 20 mM +
MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,2 M, pH = 7,50 como tampón A. Se
acondicionó con tampón A una columna XK16 empacada con Toyopearl
SuperQ 650M con una altura de 5 cm.
Se cargó en la columna una muestra de 5 ml de
sobrenadante de virus concentrado/diafiltrado, tratado con
Benzonase, del biorreactor Celligen. Después de lavar la columna,
se llevó a cabo la elución con un gradiente lineal de más de 10
volúmenes de columna de la formulación de tampón B para alcanzar
Tris mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl 2M, pH = 7,50.
La figura 6 muestra el perfil de elución. Se
observan tres picos durante la elución sin una separación
satisfactoria entre ellos. Un estudio de control realizado con
medio acondicionado de células 293 (sin virus) mostró que los
primeros dos picos están relacionados con el virus. Se evaluó el
efecto del pH del tampón para mejorar adicionalmente la eficacia de
separación. Se aumentó el pH del tampón a 9,00 mientras que se
mantuvieron constantes las otras condiciones. Se observó una
separación muy mejorada, tal como se muestra en la figura 7,
comparada con la del tampón de pH 7,50. Las fracciones nº 3, nº 4,
y nº 8 se analizaron por HPLC.
Como se muestra en la figura 8, la mayoría de
virus se encontraron en la fracción nº 4, sin detectarse ningún
virus en las fracciones nº 3 y nº 8. Se encontró que la fracción nº
8 estaba principalmente compuesta por ácido nucleico contaminante.
Sin embargo, la purificación aún no era óptima. Aún hubo
superposición entre las fracciones nº 3 y nº 4 con contaminantes
detectados en la fracción nº 4.
Basándose en el cromatograma de la figura 7, se
dedujo que podría alcanzarse una mejora adicional en la purificación
del virus mediante el aumento de la concentración de sal en el
tampón A. Como resultado, los contaminantes presentes en la
fracción nº 3, que es anterior al pico de virus, pueden desplazarse
a la fracción de flujo no retenido. Se aumentó la concentración de
NaCl en el tampón A a 0,3 M mientras que se mantuvieron constantes
otras condiciones. La figura 9 muestra el perfil de elución en la
condición de NaCl 0,3 M en el tampón A.
Se logró una mejora drástica en la eficacia de
la purificación. Tal como se esperaba, se eliminó el pico de
contaminante observado en la figura 7 en la condición de sal
aumentada. Se analizaron por HPLC las muestras del sob. de virus
bruto, flujo a través, pico nº 1, y pico nº 2 y los resultados se
muestran en la figura 10. No se detectó ningún virus en la fracción
de flujo no retenido. La mayoría de los contaminantes presentes en
el material bruto se encontraron en el flujo a través. El análisis
por HPLC del pico nº 1 mostró un único pico de virus bien definido.
Este perfil de HPLC es equivalente al obtenido del virus purificado
en gradiente de CsCl doble. Los picos observados en los tiempos de
retención de 3,14 y 3,61 min en el virus purificado en gradiente de
CsCl son picos relacionados con glicerol. El virus purificado tiene
una razón A260/A280 de 1,27 \pm 0,03. Esto es similar al valor de
virus purificado en gradiente de CsCl doble así como también a los
resultados presentados por Huyghe et al. (1996). El pico nº 2
se compone principalmente de ácido nucleico contaminante. Basándose
en el resultado de la purificación, los inventores propusieron el
siguiente método para la purificación por CII del sob. de adenovirus
del biorreactor.
Tampón A: Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl
0,3 M, pH = 9,00
Tampón B: Tris 20 mM + MgCl_{2} 1 mM + NaCl
2M, pH = 9,00
Elución: gradiente lineal de 10 volúmenes de
columna
Siguiendo el desarrollo del método, se amplió la
escala de purificación de la columna XK16 (1,6 cm D.I.) a una
columna XK50 (5 cm D.I., ampliación de la escala por 10 veces)
utilizando el mismo método de purificación. Se logró un perfil de
elución similar en la columna XK50 tal como se muestra en la figura
11. Se analizó la fracción de virus por HPLC, lo que indicó una
pureza de virus equivalente a la obtenida de la columna XK16.
Durante los estudios de ampliación de la escala,
se encontró que era más conveniente y consistente usar la
conductividad para cuantificar la concentración de sal en el tampón
A. La conductividad óptima del tampón A está en el intervalo de 25
\pm 2 mS/cm a aproximadamente temperatura ambiente (21ºC). Se
analizaron las muestras producidas durante el proceso de
purificación junto con el virus purificado con CsCl doble por
SDS-PAGE.
Tal como se muestra en la figura 12, todas las
proteínas estructurales del adenovirus se detectan por
SDS-PAGE. El virus purificado por CII muestra
tinción equivalente a la del virus purificado por CsCl doble. Se
logró una reducción significativa en la concentración de albúmina
de suero bovino (BSA) durante la purificación. La concentración de
BSA en el virus purificado estuvo por debajo del nivel de detección
del ensayo de inmunotransferencia de tipo western, tal como se
muestra en la figura 13.
\newpage
Se determinó la reducción de la concentración de
ácido nucleico contaminante en la disolución de virus durante el
proceso de purificación usando el ensayo de inmunotransferencia en
líneas del ácido nucleico. Se utilizó el ADN genómico humano
marcado con ^{32}P como la sonda de hibridación (porque las
células 293 son células de riñón embrionario humano). La tabla 10
muestra la concentración de ácido nucleico en etapas diferentes del
proceso de purificación. Se redujo la concentración del ácido
nucleico en la disolución final de virus purificado a 60 pg/ml, una
reducción de aproximadamente 3,6 x 10^{6} veces comparada con el
sobrenadante de virus inicial. Se determinaron el título del virus
y la razón de infecciosos a partículas totales para el virus
purificado y se compararon los resultados con los de la purificación
en CsCl doble en la tabla 9. Tanto la recuperación de virus como la
razón partícula/UFP son muy similares entre los dos métodos de
purificación. Se puede aumentar adicionalmente el título de la
disolución de virus purificado en columna mediante la realización de
una etapa de concentración.
Además de la cromatografía de intercambio iónico
aniónica intensa, también se evaluaron otros modos de métodos
cromatográficos, para la purificación del virus AdCMVp53 (por
ejemplo la cromatografía de exclusión por tamaño, la cromatografía
de interacción hidrofóba, la cromatografía de intercambio catiónico,
o la cromatografía de afinidad iónica de metales). En comparación
con la resina Toyopearl SuperQ, todos esos modos de purificación
ofrecieron una purificación mucho menos eficaz con baja recuperación
de producto. Por tanto, se recomienda la resina Toyopearl SuperQ
para la purificación de AdCMVp53. Sin embargo, es probable que otros
intercambiadores aniónicos fuertes basados en la química de amonio
cuaternario sean adecuados para la purificación de AdCMVp53 con
algunas modificaciones del proceso.
Se desarrollaron dos métodos de producción
diferentes para producir el virus AdCMVp53. Uno estaba basado en el
cultivo de microsoportes en un biorreactor de tanque de agitado. El
otro estaba basado en un biorreactor Cellcube™. Como se describió
anteriormente, el método de purificación se desarrolló utilizando el
sobrenadante de virus bruto generado del biorreactor de tanque
agitado. Se notó que aunque se usaron el mismo medio, células y
virus para la producción de virus tanto en el biorreactor como en el
Cellcube™, la superficie de cultivo a la que las células se unieron
era diferente.
En el biorreactor, se hicieron crecer las
células en un microsoporte recubierto de vidrio, mientras que en el
Cellcube™ se hicieron crecer las células en superficie de cultivo de
poliestireno tratada de manera patentada. En el Cellcube™ se
utilizó la perfusión del medio constante, por otro lado, en el
biorreactor no se utilizó ninguna perfusión del medio. En el
Cellcube™, el producto de virus bruto se recogió en la forma de
células infectadas víricamente, lo que es diferente al sobrenadante
de virus recogido del biorreactor.
Se purificó el lisado celular bruto (CCL),
producido después de 5 ciclos de
congelado-descongelado de las células recogidas
infectadas víricamente, mediante CII usando el método descrito
anteriormente. De manera diferente al sobrenadantes de virus del
biorreactor, no se logró ninguna purificación satisfactoria para el
material del CCL generado del Cellcube™. La figura 14 muestra el
cromatograma. El resultado sugiere que la disolución de virus bruto
generado del Cellcube™ mediante el
congelado-descongelado de células recogidas no se
purifica fácilmente mediante el método de CII.
Se examinaron otros métodos de purificación,
incluyendo las cromatografías de interacción hidrofóba y de quelatos
metálicos, para la purificación de virus en el CCL.
Desafortunadamente no se observó ninguna mejora en la purificación
mediante ninguno de los métodos. Considerando las dificultades de la
purificación de virus en el CCL y las desventajas asociadas con la
etapa de congelado-descongelado en el proceso de
producción, los inventores decidieron investigar otros métodos de
lisis de células.
Tal como se describe en los ejemplos 1 y 3, se
utilizó el análisis de HPLC para seleccionar métodos de lisis
diferentes. Basándose en los resultados de HPLC, se empleó un tampón
de Tween-20 al 1% en Tris 20 mM + NaCl 0,25 M +
MgCl_{2} 1 mM, pH = 7,50 como el tampón de lisis. Al final de la
fase de producción de virus, en lugar de recoger las células
infectadas, se bombeó el tampón de lisis al Cellcube™ después de
drenar el medio gastado. Se lisaron las células y se liberó el virus
en el tampón de lisis mediante la incubación durante 30 min.
Después de la clarificación y filtración, se
concentró/diafiltró la disolución de virus y se trató con Benzonase
para reducir la concentración de ácido nucleico contaminante. Se
purificó la disolución de virus tratada mediante el método
desarrollado anteriormente, usando la resina Toyopearl SuperQ. Se
alcanzó una separación satisfactoria, similar a la obtenida usando
el sobrenadante de virus del biorreactor, durante la elución. La
figura 15 muestra el perfil de elución. Sin embargo, cuando se
analizó la fracción de virus en HPLC, se detectó otro pico, además
del pico de virus. El resultado se muestra en la figura 16A.
Para purificar adicionalmente el virus, se
volvió a purificar la fracción de virus recogida usando el mismo
método. Tal como se muestra en la figura 16B, la pureza de la
fracción de virus mejoró considerablemente después de la segunda
purificación. También se evaluó la cromatografía de quelatos
metálicos como un candidato para la segunda purificación. Se
alcanzaron mejoras similares en la pureza de virus a las observadas
con la segunda IEC. Sin embargo, por su simplicidad, se prefiere la
IEC como el método elegido para la segunda purificación.
Tal como se describe anteriormente en el ejemplo
2, la tasa de perfusión del medio empleada durante las fases de
crecimiento celular y producción de virus tiene un impacto
considerable en el perfil de separación de HPLC de la recogida de
virus bruto de Tween-20. Para la disolución de virus
producida a una tasa de perfusión del medio alta, se requieren dos
columnas de intercambio iónico para alcanzar la pureza de virus
requerida.
Basándose en la separación muy mejorada
observada en HPLC para la disolución de virus producida a tasa de
perfusión de medio baja, es probable que la purificación a través de
una columna de intercambio iónico pueda alcanzar la pureza de virus
requerida. La figura 17 muestra el perfil de elución usando la
disolución de virus bruto producida a tasa de perfusión de medio
bajo. Se obtuvo un pico de virus bien definido durante la elución.
El análisis en HPLC de la fracción de virus indica una pureza de
virus equivalente a la del virus purificado en gradiente de CsCl
después de una etapa de cromatografía de intercambio iónico. La
figura 18 muestra el resultado del análisis en HPLC.
Se analizó adicionalmente el virus purificado
mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo
western para BSA, e inmunotransferencia de tipo inmunotransferencia
en líneas de ácido nucleico para determinar la concentración de
ácido nucleico contaminante. Los resultados del análisis se muestran
en la figura 19A, la figura 19B y la figura 19C, respectivamente.
Todos esos análisis muestran que el virus purificado en columna
tiene una pureza equivalente comparado con el virus purificado en
gradiente de CsCl doble. La tabla 11 muestra el título de virus y
la recuperación antes y después de la purificación en columna. Con
el fin de compararlas, también se incluyó la recuperación de virus
típica alcanzada mediante la purificación en gradiente de CsCl
doble. Se alcanzaron recuperaciones de virus similares mediante
ambos métodos.
Se evaluó la capacidad dinámica de la resina
Toyopearl SuperQ para la purificación de la disolución de virus
recogida en Tween-20 producida a tasa de perfusión
de medio baja. Se empaquetaron cien ml de resina en una columna
XK50. Se purificó una cantidad diferente de disolución de virus
bruto a través de la columna usando los métodos descritos en el
presente documento.
Se analizaron en HPLC la eficacia de la ruptura
y purificación de virus. La figura 20 muestra los resultados del
análisis en HPLC. A un factor de carga de la columna superior a una
razón en volumen muestra/columna de 2:1, se redujo la pureza de la
fracción de virus. Los contaminantes coeluyeron con el virus. A un
factor de carga superior a 3:1, se observó la ruptura del virus en
el flujo a través. Por tanto, se propuso que la capacidad de carga
de trabajo de la resina estuviera en el intervalo de razón en
volumen muestra/columna de 1:1.
Una etapa de concentración/diafiltración después
de la purificación de la columna sirve no sólo para aumentar el
título de virus, si es necesario, sino también para cambiar al
sistema de tampón especificado para el producto de virus. Se empleó
una membrana TFF de 300K de NMWC para la etapa de concentración.
Debido a la ausencia de contaminantes proteicos y de ácidos
nucleicos en el virus purificado, se alcanzó un flujo de tampón muy
alto sin un descenso de presión perceptible a través de la
membrana.
Se alcanzó aproximadamente una recuperación de
virus del 100% durante esta etapa cambiando el tampón a Tris 20 mM
+ MgCl_{2} 1 mM + NaCl 0,15 M, pH = 7,50. También se cambió
satisfactoriamente el tampón del virus purificado por DPBS durante
la etapa de concentración/diafiltración. Puede determinarse el
factor de concentración mediante el título de virus que se desea en
el producto final y el título de la disolución de virus eluído de la
columna. Esta flexibilidad ayudará a mantener la consistencia del
producto final de virus purificado.
Debido a una eficacia de empaquetamiento
inferior al 100%, de adenovirus en células productoras, algunos
adenovirus defectuosos existen de manera general en la disolución
de virus bruto. Los virus defectuosos no tienen el ADN empaquetado
dentro de la cápside viral y por tanto pueden separarse del virus
intacto mediante ultracentrifugación en gradiente de CsCl basándose
en la diferencia de densidad. Es probable que fuera difícil separar
los virus defectuosos de los intactos basándose en cromatografía de
intercambio iónico asumiendo que ambos virus tienen una química de
superficie similar. La presencia de una cantidad excesiva de virus
defectuosos afectará a la calidad del producto purificado.
Para evaluar el porcentaje de partículas de
virus defectuoso presente, se sometieron los virus concentrados y
purificados a ultracentrifugación en CsCl isopícnica. Tal como se
muestra en la figura 21, se observó una banda débil sobre la banda
de virus intacto después de la centrifugación. Se recuperaron y
dializaron ambas bandas frente al tampón Tris 20 mM + MgCl_{2} 1
mM, pH = 7,50 para extraer el CsCl. Se analizaron los virus
dializados en HPLC y los resultados se muestran en la figura 22.
Ambos virus muestran tiempos de retención similares. Sin embargo,
el virus defectuoso tiene una razón A260/A280 inferior a la del
virus intacto. Esto es indicativo de menos ADN viral en el virus
defectuoso.
Los picos observados en los tiempos de retención
entre 3,02 y 3,48 min. se producen mediante el glicerol que se
añade a los virus (10% v/v) antes de la congelación a -70ºC. El
porcentaje del virus defectuoso fue inferior al 1% del virus total.
Es improbable que este bajo porcentaje de virus defectuoso afecte a
la razón de partículas totales con respecto a virus infeccioso
(UFP) en el producto de virus purificado. Se analizaron ambos virus
mediante SDS-PAGE (mostrado en la figura 19A).
Comparados con los virus intactos, los virus defectuosos carecen de
las proteínas de núcleo asociadas al ADN que aparecen en las bandas
a 24 y 48,5 KD. Este resultado está de acuerdo con la ausencia de
ADN en el virus defectuoso.
Basándose en los resultados del desarrollo del
proceso anterior, la presente invención propone un diagrama de
flujo de producción y purificación para AdCMVp53 tal como se muestra
en la figura 23. Se incluye la recuperación de virus en etapa y
acumulativa, con el rendimiento de virus correspondiente basado en
un Cellcube™ de 1-mero. La recuperación de virus
final es aproximadamente del 70 \pm 10%. Esto es aproximadamente 3
veces superior a la recuperación de virus notificada por Huyghe
et al. (1996) usando un intercambiador de iones DEAE y un
procedimiento de purificación cromatográfica de quelatos metálicos
para la purificación del adenovirus que codifica para la proteína
p53. Se produjeron aproximadamente 3 x 10^{12} UFP del producto
final de virus purificado de un Cellcube™ de
1-mero. Esto representa un rendimiento de producto
final similar comparado con el método de producción actual usando
la ultracentrifugación en gradiente de CsCl doble para la
purificación.
Se han realizado estudios de aumento de la
escala exitosos con el sistema Cellcube™ de 4-mero,
y actualmente están en proceso para evaluar la producción de virus
en el Cellcube™ de 16-mero. Se filtrará, concentrará
y diafiltrará la disolución de virus bruto producida usando un
cassette de Pellicon más grande. Se determinará la calidad y la
recuperación del virus. Después del tratamiento con Benzonase, se
purificará la disolución de virus bruto usando una columna de
BioProcess de 20 cm y una de 30 cm para el 4-mero y
16-mero, respectivamente.
(Ejemplo de
referencia)
Se adaptaron las células 293 a un medio libre de
suero IS293 comercialmente disponible (Irvine Scientific; Santa
Ana, CA) mediante la disminución secuencial de la concentración de
FBS en frascos T. Se descongelaron las células congeladas en un
vial de PDWB y se colocaron en medios DMEM con FBS al 10% en frascos
T-75 y se adaptaron las células a los medios IS 293
libres de suero en frascos T mediante la disminución de la
concentración de FBS en los medios secuencialmente. Después de 6
pases en los frascos T-75 se estimó que el % de FBS
era de aproximadamente del 0,019%. Se subcultivaron las células dos
veces más en los frascos T antes de que se transfirieran a los
frascos centrifugados.
Se transfirieron las células adaptadas a medios
libres de suero anteriores en los frascos T a un cultivo en
suspensión centrifugada de 250 ml libre de suero (100 ml de volumen
de trabajo) para el cultivo en suspensión. La densidad celular
inicial fue 1,18E + 5 cv/ml. Durante el cultivo celular la
viabilidad disminuyó y se observaron grandes grupos de células.
Después de 2 pases en los frascos T volvió a intentarse la
adaptación al cultivo en suspensión. En un segundo intento se
complementó el medio con heparina, a una concentración de 100 mg/l,
para prevenir la aglomeración de células y se aumentó la densidad
celular inicial hasta 5,22E + 5 cv/ml. Durante el cultivo de
células hubo cierto aumento de la densidad celular y se mantuvo la
viabilidad celular. Después se subcultivaron las células en los
frascos centrifugados durante 7 pases adicionales y durante los
pases se redujo progresivamente el tiempo de duplicación de las
células y al final de los siete pases fue de aproximadamente 1,3
días lo que es comparable a 1,2 días de las células en medio con FBS
al 10% en el cultivo celular unido. En el medio IS 293 libre de
suero complementado con heparina casi todas las
células existían como células individuales sin formar aglomerados de células en el cultivo en suspensión (tabla 12).
células existían como células individuales sin formar aglomerados de células en el cultivo en suspensión (tabla 12).
Para someter a prueba la producción de vectores
de Ad5-CMVp53 en el cultivo en suspensión libre de
suero, se hicieron crecer las células anteriores adaptadas al
cultivo en suspensión libre de suero en medio en 100 ml de IS293
complementado con Pluronic F-68 al 0,1% y heparina
(100 mg/l) en frascos centrifugados de 250 ml, se infectaron las
células a 5 MDI cuando las células alcanzaron las 1,36E + 06 células
viables/ml en el día 3. Se analizó el sobrenadante todos los días
para determinar las partículas virales de HPLC/ml después de la
infección. No se detectaron virus en otras muestras que no fueran
las del día 3. En el día 3 fue de 2,2E + 09 pv/ml. El ufp/ml en el
día 6 fue de 2,6 +/- 0,6E + 07 ufp/ml. Se estimó que la producción
de ufp por célula era de 19 lo que es aproximadamente 46 veces
inferior a la del cultivo unido en el medio complementado con suero.
Como control se comprobó el crecimiento de células en ausencia de
una infección.
Tal como se describió anteriormente, después de
demostrarse que las células producen los vectores de
Ad-p53, se propagaron las células en el medio IS293
libre de suero con F-68 al 0,1% y heparina 100 mg/l
en los frascos centrifugado para producir bancos de células
adaptadas a suspensiones libres de suero que contienen 1,0E + 07
células viables/ml/vial. Para recoger las células, se centrifugaron
cuando estaban a mitad de un crecimiento de fase logarítmica y la
viabilidad era superior al 90%, y se resuspendieron en el medio
IS293 complementado libre de suero, y se centrifugaron nuevamente
para lavar las células. Se resuspendieron luego de nuevo las
células en el medio de crioconservación que es IS293 frío con
F-68 al 0,1%, heparina 100 mg/l, DMSO al 10% y
metilcelulosa 0,1%, dando como resultado 1E + 07 células viables/ml.
Se transfirió la suspensión celular a viales de crioconservación
estériles y se sellaron y congelaron en un recipiente criogénico a
-70ºC durante la noche. Se transfirieron los viales a un
almacenamiento en nitrógeno líquido. La prueba de micoplasma fue
negativa.
Para reactivar las células congeladas se
descongeló un vial en 50 ml de medio IS293 libre de suero con
F-68 al 0,1% y heparina 100 mg/l en un
T-150. Desde ese momento se subcultivaron los
cultivos tres veces en frascos centrifugados de 250 ml. En el otro
estudio, se descongeló un vial en 100 ml de medio IS293
complementado libre de suero en un frasco centrifugado de 250 ml.
Desde ese momento éstos se subcultivaron en frascos centrifugados
libres de suero 2 veces. En ambos estudios las células crecieron muy
bien.
En la producción viral libre de suero previa en
el cultivo en suspensión en el frasco centrifugado la producción
viral por célula fue demasiado baja para que la producción en
suspensión libre de suero sea práctica. Se supuso que esto podría
deberse al agotamiento de nutrientes y/o la producción de
subproductos inhibidores. Para sustituir el medio gastado por medio
IS293 complementado libre de suero nuevo, se centrifugaron las
células en el día 3 y se resuspendieron en medio IS293 libre de
suero complementado con F-68 y heparina (100 mg/l) y
la densidad celular resultante era 1,20E + 06 cv/ml, y se
infectaron las células con vectores de Ad5-CMVp53 a
5 MDI. Las pv de HPLC extracelulares/ml eran 7,7E + 09 pv/ml en el
día 3, 1,18E + 10 pv/ml en el día 4, 1,2E + 10 pv/ml en el día 5 y
1,3E + 10 pv/ml en el día 6 y la ufp/ml en el día 6 eran 2,75 +/-
0,86E + 08 pvt/ml. La razón de partículas virales de HPLC con
respecto a las UFP fue aproximadamente de 47. Además las células se
han centrifugado y lisado con el mismo tipo de tampón de lisis
detergente que el usado en la recogida de CellCube. Las pv de
HPLC/ml celulares eran 1,6E + 10 pv/ml en el día 2, 6,8E + 09 pv/ml
en el día 3, 2,2E + 09 pv/ml en el día 4, 2,24E + 09 pv/ml en el día
5 y 2,24E + 09 pv/ml en el día 6.
La sustitución del medio gastado con un medio IS
293 complementado libre de suero nuevo, dio como resultado un
aumento significativo en la producción de vectores de
Ad-p53. La sustitución de medios aumentó la
producción de partículas virales de HPLC extracelulares a 3,6 veces
más que el nivel previo en el día 3 y la producción del título de
ufp extracelulares diez veces más que el nivel previo en el día 6.
Se estimó que la producción de vectores de Ad-p53
por célula era de aproximadamente 1,33E + 04 pv de HPLC.
Las partículas virales de HPLC intracelulares
llegaron a su punto más alto en el día 2 después de la infección y
luego el número de partículas disminuyó. Por otro lado las
partículas virales extracelulares aumentaron progresivamente hasta
el día 6 de recogida. Casi todos los vectores de Adp53 se produjeron
durante los 2 días después de la infección y se localizaban
intracelularmente y luego se liberaron los virus fuera de las
células. Casi la mitad de los virus se liberaron fuera de las
células en el sobrenadante entre el día 2 y el día 3 después de la
infección y la tasa de liberación disminuyó a lo largo del
tiempo.
Todas las células infectadas con vectores de
Ad-p53 perdieron su viabilidad al final de 6 días
después de la infección mientras que las células en ausencia de
infección fueron viables en un 97%. En presencia de la infección el
pH del medio gastado sin cambio de medio y con cambio de medio fue
de 6,04 y 5,97, respectivamente, mientras que el de ausencia de la
infección fue de 7,00 (tabla 12).
Para aumentar la producción de vectores de
Ad-p53, se utilizó un biorreactor CelliGen de 5 l
para proporcionar un ambiente más controlado. En el biorreactor
CelliGen de 5 l se controlaron el pH y el oxígeno disuelto así como
la temperatura. Se conectaron los gases de oxígeno y dióxido de
carbono a la válvula de solenoide para el suministro de oxígeno y
el ajuste de pH, respectivamente. Se implementó un agitador de tipo
hélice para un mejor mezclado pero generando un ambiente de baja
fuerza de corte. Se suministró aire todo el tiempo durante la
operación para mantener una presión positiva dentro del
biorreactor.
Para inocular el biorreactor se descongeló un
vial de células en 100 ml de medio libre de suero en un frasco
centrifugado de 250 ml y se expandieron las células en frascos
centrifugados de 250 o 500 ml. Se mezclaron 800 ml de inóculo
celular, hecho crecer en frascos de 500 ml, con 2700 ml de medio
nuevo en una garrafa de 10 l y se transfirieron al biorreactor
CelliGen mediante presión de gases. El volumen de trabajo inicial
del biorreactor CelliGen fue de aproximadamente 3,5 l de cultivo.
Se fijaron la velocidad de agitación del agitador de tipo hélice a
80 rpm, la temperatura a 37ºC, el pH a 7,1 al inicio y 7,0 después
de la infección y el OD al 40% todo el tiempo durante la serie.
La densidad celular inicial fue de 4,3E + 5
cv/ml (97% de viabilidad) y 4 días después, cuando la densidad de
células alcanzó 2,7E + 6 cv/ml (93% de viabilidad) se centrifugaron
las células y se resuspendieron las células en un medio nuevo y se
transfirieron al biorreactor CelliGen. Después del cambio de medio
la densidad celular fue de 2,1E+6 cv/ml y se infectaron las células
a una MDI de 10. Desde ese momento el OD cayó a menos del 40%. Para
mantener el OD por encima del 40%, se retiraron aproximadamente 500
ml de cultivo del biorreactor CelliGen para disminuir la demanda de
oxígeno del cultivo celular y se colocó la hélice superior cerca de
la superficie de contacto entre las fases gaseosa y líquida para
mejorar la transferencia de oxígeno mediante el aumento de la
renovación de la superficie. Desde ese momento pudo mantenerse el OD
por encima del 40% hasta el fin de la serie.
Para el control de pH, se utilizó gas CO_{2}
para acidificar el cultivo celular y disolución de NaHCO_{3} 1 N
para hacer el cultivo celular alcalino. Se fijó inicialmente el
control de pH a 7,10. El pH inicial del cultivo celular fue de
aproximadamente 7,41. Se consumieron aproximadamente 280 ml de la
disolución de NaHCO_{3} 1N hasta que el pH del cultivo celular se
estabilizó a aproximadamente pH 7,1. Después de la infección viral
del cultivo celular, se bajó el control de pH hasta pH 7,0 y se
cerró la línea de suministro de gas CO_{2} para reducir el
consumo de la disolución de NaHCO_{3}. El consumo de demasiada
disolución de NaHCO_{3} 1 N para el ajuste de pH aumentaría el
volumen del cultivo celular de una manera indeseable. Desde ese
momento se consumieron 70 ml de disolución de NaHCO_{3} 1 N y el
pH estuvo en el intervalo entre 7,0 y 7,1 durante la mayor parte del
tiempo de la serie. Se controló la temperatura entre 35ºC y
37ºC.
Después de la infección la viabilidad de las
células disminuyó a ritmo constante hasta el día 6 de la recogida
después de la infección. En el día de la recogida ninguna de las
células era viable. La producción viral volumétrica del biorreactor
CelliGen fue de 5,1E + 10 pv de HPLC/ml comparada con 1,3E + 10 pv
de HPLC/ml en el frasco centrifugado. El ambiente controlado en el
biorreactor CelliGen aumentó la producción de vectores de
Ad-p53 4 veces comparado con los frascos
centrifugados con sustitución de medio. Esto se debe tanto al
aumento de la densidad celular en el momento de infección desde
1,2E + 6 hasta 2,1E + 6 cv/ml como al aumento de producción viral
por célula desde 1,3E + 4 hasta 2,5E + 4 pv/ml. El 2,5E + 4 pv/ml
puede compararse al 3,5E + 4 pv/célula en el cultivo celular unido
complementado con suero.
En el primer estudio se hicieron crecer las
células de manera satisfactoria en un biorreactor con agitación
para la producción viral y se suministraron el oxígeno y el CO_{2}
mediante una superposición de gas en el espacio de aire de un
biorreactor. Sin embargo, este método limitará el aumento de escala
del sistema de cultivo celular por su transferencia de gases
ineficaz. Por tanto en el segundo estudio, para someter a prueba la
viabilidad del aumento de escala del cultivo en suspensión libre de
suero e investigar el crecimiento de células y la producción de
Ad-p53 en un biorreactor de burbujeo, se
suministraron gases de oxígeno CO_{2} puros mediante el burbujeo a
través del medio IS293 libre de suero complementado con
F-68 (0,1%) y heparina (100 mg/l).
Se burbujeó oxígeno puro a través del medio
líquido para suministrar el oxígeno disuelto a las células y se
controló el suministro de oxígeno puro mediante una válvula de
solenoide para mantener el oxígeno disuelto por encima del 40%.
Para un suministro de oxígeno eficaz pero minimizando el daño a las
células, se utilizó un difusor de aire sinterizado de acero
inoxidable con un tamaño de poro nominal que es aproximadamente de
0,22 micrómetros, para la administración de oxígeno puro. Se
suministró también el gas CO_{2} al medio líquido mediante el
burbujeo desde el mismo difusor y tubo que el oxígeno para mantener
el pH a aproximadamente 7,0. Para el control de pH se enganchó
también una disolución de Na_{2}CO_{3} (106 g/l) al biorreactor.
Se suministró aire al espacio de aire del biorreactor para mantener
una presión positiva dentro del biorreactor. Las otras
configuraciones del biorreactor fueron las mismas que en el primer
estudio.
Se desarrollaron células de inóculo de un vial
congelado. Se descongeló un vial de células congeladas (1,0E + 7
cv) en 50 ml de medio en un frasco T-150 y se
subcultivó 3 veces en 200 ml de medio en frascos centrifugados de
500 ml. Se mezclaron 400 ml de células de inóculo, hechas crecer en
2 de los frascos centrifugados de 500 ml, con medio IS293 con
F-68 y heparina en una garrafa de 10 l para adquirir
3,5 l de suspensión celular y se transfirió al biorreactor CelliGen
de 5 l.
La densidad celular inicial en el biorreactor
fue de 3,0E + 4 cv/ml. La densidad celular inicial es más baja que
en primer estudio. En el primer estudio se utilizaron cuatro de los
frascos centrifugados de 500 ml como el inóculo. Incluso con la
densidad celular inicial más baja, las células crecieron hasta 1,8E
+ 6 cv/ml en el día 7 en el ambiente con burbujeo y la viabilidad
fue del 98%. Durante los 7 días de crecimiento, la concentración de
glucosa disminuyó desde 5,4 g/l hasta 3,0 g/l y el lactato aumentó
desde 0,3 g/l hasta 1,8 g/l.
En el día 7, cuando la densidad celular alcanzó
1,8E + 6 cv/ml, se centrifugaron las células en el biorreactor y se
resuspendieron en 3,5 l de medio IS293 libre de suero nuevo con
F-68 y heparina en una garrafa de 10 l. Se
infectaron las células 293 con 1,25E + 11 ufp de
Ad-p53 y se trasfirieron al biorreactor CelliGen.
En el biorreactor, la viabilidad celular fue del 100% pero la
densidad de células fue de sólo 7,2E + 5 cv/ml. Hubo una pérdida de
células durante la operación de cambio de medio. El título viral en
el medio se midió como 2,5E + 10 pv de HPLC/ml en el día 2, 2,0E +
10 en el día 3, 2,8E + 10 en el día 4, 3,5E + 10 en el día 5 y 3,9E
+ 10 pv de HPLC/ml en el día 6 de recogida. El primer estudio en
biorreactor CelliGen con superposición de gases produjo 5,1E + 10
pv de HPLC/ml. La menor concentración de virus en la segunda serie
se debió probablemente a la densidad celular más baja en el momento
de la infección. Comparado al 7,2E + 5 cv/ml en la segunda serie,
se utilizaron 2,1E+6 cv/ml en la primera serie. En realidad se
estimó que la producción de Ad-p53 por célula en el
segundo biorreactor CelliGen de burbujeo era de 5,4E + 4 pv/célula,
que es la producción de células más alta jamás alcanzada hasta
ahora. La producción por célula en el primer biorreactor CelliGen
libre de suero sin burbujeo y en el frasco T complementado con
suero fue de 2,5E + 4 pv/célula y 3,5E + 4 pv/célula,
respectivamente.
Después de la infección viral, la viabilidad de
las células disminuyó desde el 100% hasta el 13% en el día 6 de
recogida. Durantes esos 6 días después de la infección la
concentración de glucosa disminuyó desde 5,0 g/l hasta 2,1 g/l y el
lactato aumentó desde 0,3 g/l hasta 2,9 g/l. Durante el periodo
completo de operación se consumieron aproximadamente 20 ml de
disolución de Na_{2}CO_{3} (106 g/l).
Los resultados experimentales muestran que es
técnica y económicamente factible producir Ad-p53 en
el biorreactor de burbujeo y agitado. El aumento de escala y la
operación de unidad a gran escala del biorreactor de burbujeo y
agitado están bien establecidas.
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Claims (40)
1. Método para preparar un composición de
adenovirus que comprende:
- a)
- hacer crecer células huésped proporcionando nutrientes a las células huésped mediante perfusión con un medio que contiene glucosa, en el que se regula la tasa de perfusión del medio para controlar la concentración de glucosa;
- b)
- infectar dichas células huésped perfundidas con un adenovirus;
- c)
- lisar dichas células huésped infectadas usando un detergente no desnaturalizante para producir una composición de lisado bruto que comprende el adenovirus; y
- d)
- purificar el adenovirus a partir de dicho lisado mediante un proceso que incluye una o más etapas de cromatografía, en las que al menos una etapa implica cromatografía de intercambio aniónico.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
las células huésped se recogen antes de la lisis.
3. Método según la reivindicación 1, en el que
se lisan las células mediante el detergente Thesit®,
NP-40®, Tween-20®,
Brij-58®, Triton X-100® u
octilglucósido.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho detergente está presente en
la disolución de lisis en una concentración de aproximadamente el 1%
(p/v).
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa a) se hacen
crecer las células en un biorreactor.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
el biorreactor es un reactor de agitación por inyección de aire o un
reactor con agitación.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa a) se cultivan
las células sobre microsoportes.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa a) se cultivan
las células mediante microencapsulación.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que en la etapa a) se cultivan las
células en un sistema de unión perfundido.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
se cultivan las células en un reactor de lecho fijo.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el reactor de lecho fijo comprende un soporte de matriz de
fibra.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que se perfunden las células en un
medio que contiene glucosa a una tasa para proporcionar una
concentración de glucosa inferior a 2,0 g/l, preferiblemente entre
aproximadamente 0,7 y 1,7 g/l.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en el momento de la infección
por virus se lleva a cabo un cambio de medio nuevo antes de la
infección por virus.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho lisado se somete a una
etapa diafiltración.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores; en el que la cromatografía comprende
una única etapa de cromatografía.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la etapa d) comprende además
un proceso que incluye reducir el nivel de ácidos nucleicos
contaminantes.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha cromatografía de
intercambio aniónico utiliza DEAE, TMAE, QAE, o PEI.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en el que dicha cromatografía de
intercambio aniónico utiliza Toyopearl Super Q 650M®, MonoQ®, Source
Q® o Fractogel TMAE®.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 17 ó 18, en el que se lleva a cabo dicha
cromatografía de intercambio iónico en un intervalo de pH de entre
aproximadamente 7,0 y aproximadamente 10,0.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además las etapas de
concentrar dicho lisado celular bruto, cambiar el tampón de dicho
lisado celular bruto, y reducir la concentración de ácidos nucleicos
contaminantes en dicho lisado celular bruto.
21. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las células huésped están
adaptadas para el crecimiento en medios libres de suero.
22. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se hacen crecer dichas
células huésped en medios libres de suero.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichas células huésped son
células en suspensión o adaptadas para su uso como células en
suspensión.
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho adenovirus comprende un
vector adenoviral que comprende un constructo génico exógeno.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
dicho constructo génico exógeno codifica para un gen
terapéutico.
26. Método según la reivindicación 25, en el que
dicho gen terapéutico codifica para ras antisentido,
myc antisentido, raf antisentido, erb
antisentido, src antisentido, fms antisentido,
jun antisentido, trk antisentido, ret
antisentido, gsp antisentido, hst antisentido,
bcl antisentido, abl antisentido, Rb, CFTR, p16, p21,
p27, p57, p73, C-CAM, APC, CTS-1,
zacl, scFV ras, DCC, NF-1,
NF-2, WT-1, MEN-1,
MEN-II, BRCA1, VHL, MMAC1, FCC, MCC, BRCA1,
IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-7, IL-8, IL-9,
IL-10, IL-11, IL-12,
GM-CSF, G-CSF, timidina cinasa o
p53, preferiblemente p53.
27. Método según la reivindicaciones 24, 25 ó
26, en el que dicho constructo génico está operativamente unido a un
promotor.
28. Método según la reivindicación 27, en el que
dicho promotor es SV40 IE, RSV LTR, \beta-actina,
CMV IE, tardío principal de adenovirus, F9-1 de
polioma, o tirosinasa.
29. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho adenovirus es un
adenovirus incompetente para la replicación.
30. Método según la reivindicación 29, en el que
el adenovirus carece al menos de una parte de la región E1,
preferiblemente al menos de una parte de la región E1A y/o E1B.
31. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichas células pueden
complementar la replicación.
32. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dichas células huésped son
células 293.
33. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se someten dichos medios a
diafiltración.
34. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha purificación implica
además el tratamiento del lisado celular con una nucleasa.
35. Método según la reivindicación 34, en el que
dicha nucleasa es Benzonase® o Pulmozyme®.
36. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de
concentración, empleando preferiblemente filtración a través de
membrana.
37. Método según la reivindicación 36, en el que
dicha filtración es filtración de flujo tangencial.
38. Método según la reivindicación 36, en el que
dicha filtración utiliza una membrana de NMWC de 100 a 300K,
celulosa regenerada o polietersulfona.
39. Método para la preparación de una
composición farmacéutica que comprende las etapas de:
- a)
- preparar una composición de adenovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 38, y
- b)
- formular la preparación adenoviral de la etapa a) para proporcionar una composición de adenovirus terapéutica.
40. Método según la reivindicación 39, en el que
dicha composición de adenovirus terapéutica comprende de 10^{3} a
10^{15} UFP/dosis.
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