CN115354033A

CN115354033A - 一种细胞裂解液、细胞裂解方法及该方法在收获aav的应用

Info

Publication number: CN115354033A
Application number: CN202210307580.3A
Authority: CN
Inventors: 焦鹏; 徐琦; 项涛; 余齐明; 林文龙
Original assignee: Shanghai Bibo Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Bibo Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-11-18

Abstract

本发明公开了一种细胞裂解液、细胞裂解方法及该方法在收获AAV的应用，其中细胞裂解液包括Triton X‑100、氯化镁、Pluronic F68、DNA水解酶等组分，该细胞裂解液特别适用于对哺乳动物细胞的裂解；适用细胞裂解液对细胞裂解的方法包括细胞培养、向培养容器内加入细胞裂解液，去除细胞壁碎片和其他杂质后得到目标产物；该方法步骤少，操作简单，特别适合在AAV工艺细胞裂解以收获AAV中的应用。

Description

一种细胞裂解液、细胞裂解方法及该方法在收获AAV的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种细胞裂解液、细胞裂解方法及该方法在收获AAV 的应用。

背景技术

目前，对于贴壁培养的细胞(特别是贴壁培养用于收获AAV的细胞)进行裂解的方法通常包括冻融法和传统法；冻融法的产品收率高，但需要对细胞进行多轮升温降温，操作麻烦；传统法则首先需要用蛋白酶和EDTA对贴壁培养的细胞脱壁处理，之后同过收集、离心、悬浮、物理或化学细胞裂解、离心和无菌过滤等多个步骤，还造成原料、人力的浪费，且产生的废弃物、污水等较多，对环境不友好；传统法由于操作步骤多，人员操作的失误率整体也会比较高，从而导致产品可能存在的污染、稳定性等问题；另外，传统法的产品收率低，且不适合大规模(＞200L)生产的应用。因此，如何在保证产物收率的前提下，简化操作步骤已克服前述确定，成为本领域需要解决的技术问题，尤其是在保证AAV收率的前提下，简化AAV 工艺的细胞裂解步骤。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞裂解液以及细胞裂解的方法，能够在保证目标产物收率的前提下，简化操作步骤、节约物料成本、节省人力成本、减少环境污染；尤其是该细胞裂解液和细胞裂解方法特别适用于AAV细胞裂解工艺。

为解决上述技术问题，本发明提供的细胞裂解液，包括如下组分：Triton X-100、氯化镁、Pluronic F68、DNA水解酶；通常，配制细胞裂解液的原料可以选用10％Triton X-100、 1M氯化镁、10％Pluronic F68和DNA水解酶，其中DNA水解酶可以选用Benzonase核酸酶；，另外，该细胞裂解液中通常还添加有缓冲液，优选地，缓冲液为PBS缓冲液；该细胞裂解液特别适用于对哺乳动物细胞的裂解，例如对HEK293细胞的裂解。

优选地，各组分的终浓度如下：

Triton X-100，其终浓度为0.5％-1.0％；

氯化镁，其终浓度为1mM-2mM；

Pluronic F68，其终浓度为0.01％-0.05％；

DNA水解酶，其终浓度为25-30单元/mL。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种细胞裂解的方法，包括如下步骤：

S1、贴壁培养细胞；

S2、培养完成后，将如权利要求1中所述的细胞裂解液加入步骤S1的细胞培养容器内进行细胞裂解；裂解后完成后，全部倒入无菌容器内；

S3、去除步骤S3中细胞裂解液所含的细胞壁碎片及颗粒性杂质，收获目标产物。

可理解地，该细胞裂解的方法，无需对贴壁培养的细胞进行脱壁处理，加入细胞裂解液后，贴壁培养的细胞均能够被裂解，裂解完成后，直接去除细胞壁碎片及颗粒性杂质，即可收获目标产物；省去了收集、离心、悬浮等步骤，很大程度上简化了细胞裂解的步骤，同时，节约了物料成本、节省了人力成本、减少了环境污染；另外，由于简化了步骤，人员操作的失误率也有所下降，使得产物的质量和稳定性得到了保障。进一步，可理解地，该方法也可以对非贴壁培养的细胞进行裂解。

优选地，所述步骤S1中，贴壁培养的温度为37±1℃，二氧化碳浓度为5±0.5％，培养时间为72±4h。

优选地，所述步骤S2中，细胞裂解液包括如下组分：

Triton X-100，其终浓度为0.5％-1.0％；

氯化镁，其终浓度为1mM-2mM；

Pluronic F68，其终浓度为0.01％-0.05％；

DNA水解酶，其终浓度为25-30单元/mL；

裂解的温度问37±1℃，裂解的时间为1±0.5h。

优选地，所述步骤S3中，去除细胞壁碎屑即颗粒性杂质包括如下步骤：

步骤S31、对步骤S2中裂解完成的产物进行离心或深层过滤；当采用离心收集时，离心条件为5000±1000xg；当采用深层过滤收集时，条件为60±10L/m²；

步骤S32、对步骤S31的产物进行无菌过滤，无菌过滤条件为0.2μm。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了前述细胞裂解方法在AAV细胞裂解工艺中，对贴壁培养的细胞进行裂解以收获AAV中的应用。

具体实施方式

下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一细胞裂解法在收获AAV中的应用

1、对4x 10stack CellStack所含的HEK细胞(含细胞与培养基约4升)进行质粒的转染后，在37摄氏度和5％的二氧化碳浓度条件下保持72±4小时。

2、配制细胞裂解液，如表1所示：

表1细胞裂解液和缓冲液配制

3、将上述配制好的细胞裂解液倒入细胞培养容器内进行细胞裂解，并在37℃下轻柔混合一小时。确保容器在振动平台上是稳定的；裂解完成后，倒入洁净的无菌容器内。

4、用的200mL PBS平衡缓冲液清洗容器，并将清洗液添加至收集的裂解物中，得到裂解细胞液。以备后续使用。

5、通过离心(5000xg)或深层过滤(60L/m2)以及0.2um无菌过滤除去细胞裂解液中的细胞壁碎片和其它颗粒性杂质。

利用本实施例的方法进行大规模生产时，收获AAV的收率如表2所示：

表2可知，本发明提供的方法和裂解液适用于大规模生产，且AAV收率高。

实施例二冻融法、传统法和本申请方法对比例

冻融法条件：细胞培养物在容器内三次冻融后,离心过滤；

传统法条件：将含有贴壁AAV细胞的培养容器中的细胞培养物，用0.025％胰蛋白酶、0.25 mM EDTA使细胞分离,以3750rpm转速进行离心后，用1xPBS缓冲液悬浮细胞，三次冻融；

本申请方法：直接向细胞培养容器加入0.5％Triton X-100,2mM MgCl2,0.01％Pluronic F68和25U/mL Benzonase裂解，离心后0.2μm过滤。

结果如表3所示：

表3实施例二实验结果

从结果可以看出，本申请的细胞裂解法AAV收率远高于传统法，与冻融法的收率相当。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims

1.一种细胞裂解液，其特征在于，包括如下组分：Triton X-100、氯化镁、PluronicF68、DNA水解酶，所述细胞裂解液用于裂解哺乳动物细胞。

2.如权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，各组分的终浓度如下：

Triton X-100，其终浓度为0.5％-1.0％；

氯化镁，其终浓度为1mM-2mM；

Pluronic F68，其终浓度为0.01％-0.05％；

DNA水解酶，其终浓度为25-30单元/mL。

3.如权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液用于裂解HEK293细胞。

4.一种细胞裂解的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、贴壁培养细胞；

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，贴壁培养的温度为37±1℃，二氧化碳浓度为5±0.5％，培养时间为72±4h。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，细胞裂解液包括如下组分：

Triton X-100，其终浓度为0.5％-1.0％；

氯化镁，其终浓度为1mM-2mM；

Pluronic F68，其终浓度为0.01％-0.05％；

DNA水解酶，其终浓度为25-30单元/mL；

裂解的温度问37±1℃，裂解的时间为1±0.5h。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，去除细胞壁碎屑即颗粒性杂质包括如下步骤：

步骤S31、对步骤S2中裂解完成的产物进行离心或深层过滤；

步骤S32、对步骤S31的产物进行无菌过滤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤S31中，离心条件为5000±1000xg；深层过滤的条件为60±10L/m²；

所述步骤S32中，无菌过滤条件为0.2μm。

9.如权利要求4所的方法在收获AAV的应用。