ES2349046T3

ES2349046T3 - Métodos para purificar virus.

Info

Publication number: ES2349046T3
Application number: ES06006494T
Authority: ES
Inventors: John Chu-Tay Tang; Gary J. Vellekamp; Laureano L. Bondoc, Jr.
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2017-12-11
Also published as: EP1679368B1; ATE477320T1; IL130198A; JP2001506126A; DE69737364T2; WO1998026048A1; CA2274876A1; DE69737364D1; JP2005318898A; IL130198A0; EP0948601B1; JP2009022292A; AU5370598A; ES2283032T3; EP0948601A1; DE69739961D1; ATE353956T1; EP1679368A1

Abstract

Un método de purificación de adenovirus de una preparación viral, que comprende las etapas sucesivas de: a) someter la preparación viral a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de intercambio aniónico; y b) someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño, donde el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de exclusión por tamaño, donde el medio cromatográfico de intercambio aniónico y/o el medio cromatográfico de exclusión por tamaño se pone en contacto con un tampón que comprende sacarosa al 2-16%.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cultivo y la purificación de virus se han vuelto cada vez más importante para el desarrollo de vacunas y terapia génica. Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)) describieron una comparación de varios métodos para la purificación de adenovirus recombinantes, que incluían cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad por cinc inmovilizado, ultracentrifugación, concluyendo que el proceso preferido para la purificación de un adenovirus recombinante es el tratamiento con nucleasa de un lisado celular, seguido de filtración a través de filtros de membrana, seguida por cromatografía DEAE, seguida por cromatografía de afinidad por cinc. El documento EP0593339A se refiere a métodos de preparación de vacunas y antígenos de Hepatitis A. El documento WO 97/08298 se refiere a un proceso para la purificación de adenovirus y virus adenoasociados. El documento WO 98/00524 se refiere a un método para la producción de adenovirus recombinantes.

En vistas a la necesidad cada vez mayor de virus purificados, por ejemplo para su uso como vectores virales para terapia génica, serían altamente deseables métodos de purificación mejorados. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la invención es un método de purificación de adenovirus a

partir de una preparación viral que comprende: a) someter a la preparación viral a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el virus se eluye de un medio cromatográfico de intercambio aniónico; y b) someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño, en la que el adenovirus se eluye a partir de un medio cromatográfico de exclusión por tamaño, en el que el medio cromatográfico de intercambio aniónico y/o el medio cromatográfico de exclusión por tamaño se pone en contacto con un tampón que comprende sacarosa al 2-16%. La preparación viral puede ser un lisado celular, que se puede filtrar antes de la etapa A. El virus puede ser un adenovirus recombinante, tal como ACN53 (descrito en el documento WO

95/11984).

El medio de intercambio aniónico puede comprender grupos dietilaminoetilo en una estructura principal de poliestireno, poliacrilamida, celulosa, agarosa reticulada, tal como FRACTOGEL™-DEAE. El medio de exclusión por tamaño puede comprender un polisacárido reticulado y puede ser una mezcla de dextrano y agarosa reticulados. Un medio de exclusión por tamaño ejemplar es SuperdexRTM-200. El medio cromatográfico de intercambio aniónico puede lavarse extensivamente antes de la aplicación a la preparación viral.

El medio de exclusión por tamaño puede proporcionarse en una columna, que se prepara como un gradiente salino decreciente en fuerza iónica desde la parte superior de la columna hacia el fondo, teniendo la parte superior de la columna un tampón que tiene una fuerza iónica sustancialmente idéntica a aquella del producto de la etapa a.

Un aspecto adicional de la invención es un virus purificado mediante el método de la reivindicación 1. DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La presente invención se refiere a la purificación de un virus, particularmente adenovirus, que puede por ejemplo producirse por cultivo en un hospedador celular y después liberarse por lisis de las células y separación de los residuos celulares. El término “virus” incluye virus de tipo silvestre, mutantes y recombinantes, especialmente vectores adenovirales para la expresión de secuencias de ácidos nucleicos heterólogas.

Las realizaciones de la invención están incluidas en la estrategia general de cromatografía de adsorción de una preparación viral seguida de cromatografía de exclusión por tamaño. Típicamente la cromatografía de intercambio aniónico se realiza en una resina de intercambio aniónico que consiste en grupos básicos en cadenas laterales unidos a una estructura principal macromolecular. Los grupos básicos son grupos amino sustituidos preferiblemente, en particular grupos dialquilaminoalquilo inferiores en los que cada grupo alquilo inferior tiene de 1 a 4, preferiblemente 2, átomos de carbono y cada grupo alquilo tiene de 2 a 4, preferiblemente 2 átomos de carbono. La estructura principal puede estar compuesta de sílice o una matriz orgánica, por ejemplo agarosa, celulosa, poliacrilamida o poliestireno reticulados; se prefiere particularmente el uso de una resina de intercambio aniónico que consiste en grupos dimetilaminoetil (grupos DMAE) o especialmente grupos dietilaminoetil (grupos DEAE) en una estructura principal de agarosa reticulada; las resinas especialmente preferidas del tipo DEAE son aquellas comercializadas con el nombre comercial "Fractogel-DEAE", por ejemplo “FRACTOGEL™ EMD DEAE650M” y “FRACTOGEL™AE". En algunas realizaciones de la invención, la “estructura principal” puede ser un soporte sólido tal como un gránulo.

La resina de intercambio aniónico preferiblemente se lava intensivamente antes de cargar la preparación viral para eliminar conservantes tales como azida sódica y etanol y otros materiales excedentes, mediante el lavado de la columna con aproximadamente de 5 a 10 volúmenes de columna de una solución básica tal como NaOH 50 mM/NaCl 1 M, seguido por aproximadamente de 5 a 10 volúmenes de columna de una solución neutralizante tal como HCl 50 mM/NaCl 1 M, seguido por aproximadamente de 5 a 30 volúmenes de tampones de carga y/o elución. Opcionalmente, la columna se lava con un tampón de concentración salina más baja que el tampón de carga y/o elución antes del lavado con tampón de carga y/o elución.

Típicamente, una preparación viral tal como lisado celular se carga en el medio cromatográfico en una solución tamponada de aproximadamente pH 7,08,5, con una concentración salina de aproximadamente 100-360 mM. La sal es típicamente NaCl. En algunas realizaciones otros tampones tales como fosfato

o Tris se usan. Pueden eluirse preferentemente contaminantes lavando la columna con un tampón a una concentración salina de aproximadamente 250380 mM. El adenovirus puede eluirse después mediante una solución con una concentración salina de aproximadamente 360-600 mM. La sal es típicamente NaCl. Típicamente, aproximadamente de 5 a 50, más preferiblemente aproximadamente 30 volúmenes de tampón se usan para eluir el virus. Pueden recogerse fracciones y ensayarse respecto a la presencia de virus mediante la medida de la A260 o A280 y combinando las fracciones de pico; como alternativa, el eluyente que contiene el pico de A260 o A280 puede recogerse en una única fracción. Esta única fracción de A260 o A280 o fracciones combinadas en el eluyente que contienen el virus se denomina “combinación de intercambio aniónico” en el presente documento.

En la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño, se separan las moléculas de acuerdo con el tamaño en un lecho preparado con un medio poroso inerte, especialmente un medio de gel inerte, que es preferiblemente una mezcla de polisacáridos reticulados, por ejemplo, dextrano y agarosa reticulados en forma de gránulos esféricos. Las moléculas más grandes que los poros más grandes en los gránulos de gel hinchados no atraviesan los gránulos de gel y por tanto se mueven a través del lecho cromatográfico más rápido. Las moléculas más pequeñas, que entran en los gránulos de gel en distinto grado dependiendo de su tamaño y forma, se retrasan en su paso a través del lecho. Las moléculas, por tanto, se eluyen generalmente en el orden de tamaño molecular decreciente. Los virus, debido a su gran tamaño, generalmente eluyen en el volumen hueco. Por ejemplo, los adenovirus tienen un diámetro de aproximadamente 80 nm. Los medios adecuados para cromatografía de exclusión por tamaño de adenovirus incluyen, pero sin limitación, tales resinas como G6000PWXL (TosoHaas); SB-806 Alltech); SephacrylRTM S-400 HR, SephacrylRTM S-500 HR, SephacrylRTM S-1000 SF, Sephadex G-200, SegharoseRTM CL-2B; SuperdexRTM calidad prep. 200, SuperoseRTM calidad prep. 6 (Pharmacia); TSK 6000PWXL (Bodman) y Ultrahydrogel 2000 (Waters).

Cromatografía de “exclusión por tamaño” como se usa en el presente documento pretende incluir cromatografía de filtración de gel. Un medio de exclusión por tamaño particularmente preferido es aquel comercializado con el nombre comercial “SuperdexRTM200”; véase el Catálogo de Pharmacia, 1996, páginas 338-339, código nº 17-1043-01 (a granel) o 17-1069-01 ó 17-1071-01 (columnas preenvasadas). Puesto que una separación de grupo de virus de impurezas de peso molecular más bajo se consigue, el volumen de carga de los materiales de partida de la combinación de intercambio aniónico puede ser relativamente grande, por ejemplo, hasta el 20%, más preferiblemente el 15%, del volumen de lecho.

Los materiales ejemplares para la práctica de las etapas cromatográficas de exclusión por tamaño y de intercambio aniónico de la invención se proporcionan en la Tabla I. Los controles y variables ejemplares se proporcionan en las Tablas II y III.

Aniónico y Exclusión Por Tamaño

Tabla I: Materiales Ejemplares Usados En Cromatografía De Intercambio

Etapa de Purificación: Procedimiento Solución Usada

DEAE-FractogelRTM: Ajuste Salino NaCl 4 M

Equilibrio: NaCl 265 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón A)

Etapa de Purificación: Procedimiento Solución Usada

NaOH 50 mM, NaCl 1 M

HCl 100 mM, NaCl 1 M

Lavado 1: NaCl 265 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón A)

Lavado 2: NaCl 265 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón A)

NaCl 600 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón B)

Elución: NaCl 265 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón A)

SuperdexRTM 200: Equilibrio NaCl 130 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón C)

Elución: NaCl 130 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5 (Tampón C)

Tabla II: Control En proceso y Variables Operativas para la Cromatografía de Intercambio Aniónico

Procedimiento de Purificación: Variable Valor Recomendado

Todos los procedimientos: Temperatura 4-12ºC

Equilibrio 1) NaOH/NaCl 2) HCl/NaCl 3) Tampón A: Caudal Volumen pH del efluente Volumen pH del efluente Volumen pH del efluente < 5 cm/min. 5 volúmenes de columna 12,0 6 volúmenes de columna 8,0 10 volúmenes de columna equivalente al Tampón A ± 0,2 pH

Carga: Caudal Conductividad del suministro <5 cm/min. 20-30 ms

Lavado 1: Tampón A: Caudal Volumen <5 cm/min 4 volúmenes de columna

Lavado 2: Tampón A/Tampón B: Caudal Volumen <5 cm/min 8 volúmenes de columna

Elución: Tampón A/Tampón B: Caudal < 5 cm/min

Procedimiento de Purificación: Variable Valor Recomendado

Volumen: 30 volúmenes de columna

Selección de Fracción: A280 »fondo

Tabla III: Control En proceso y Variables Operativas de la Cromatografía de Exclusión por Tamaño

Procedimiento de Purificación: Variable Valor Recomendado

Todos los procedimientos: Temperatura 4-12ºC

Equilibrio Tampón C: Caudal Volumen pH del efluente < 1 cm/min. 1 volumen de columna equivalente al Tampón C ± 0,2 pH

Carga: Caudal Volumen Concentración <1 cm/min. 0,2 volúmenes de columna 30 A280/ml

Elución: Tampón C: Caudal Volumen < 1 cm/min 1 volumen de columna

Selección de Fracción: A280 »fondo

En una realización de la invención de virus se carga a partir de la combinación de intercambio aniónico en una columna de exclusión por tamaño. 5 En algunas realizaciones, la columna se prepara con un gradiente salino decreciente en fuerza iónica desde la parte superior hacia el fondo de la columna. Después de la carga, el virus se mueve hacia abajo a través del gradiente salino (puesto que el virus preferentemente no se adsorbe por la resina) y el cambio suave en la fuerza iónica evita el daño al virus. Después de

10 sobrepasar el gradiente salino, el virus se eluye en un tampón de baja salinidad (por ejemplo NaCl 0-200 mM). Estos tampones de baja salinidad incluyen, pero sin limitación, formulaciones para la administración o almacenamiento a largo plazo a los pacientes. En una realización preferida, columna cromatográfica de exclusión por

15 tamaño se equilibra con un tampón con baja concentración salina, por ejemplo, aproximadamente de 100 a 150 mM, especialmente aproximadamente NaCl 130 mM. Justo antes de cargar el suministro, se carga un gradiente salino, equivalente a una fracción moderada del volumen de lecho, por ejemplo del 10 al 20%, preferiblemente aproximadamente el 15%, de baja concentración salina

20 (NaCl aproximadamente 130 mM) a la concentración salina más alta del suministro (por ejemplo, NaCl de 400 a 450 mM, especialmente NaCl aproximadamente 420 mM).

Se realiza un único ensayo para determinar la calidad de la combinación DEAE-FractogelRTM y consecuentemente si debería usarse un gradiente salino. Este ensayo depende de la constancia de la relación A320/A260 de la

5 combinación DEAE-FractogelRTM diluida con un tampón adecuado de pH 7,5 en un periodo de pocos minutos (por ejemplo 5 minutos). Un tampón adecuado consiste en fosfato sodio 50 mM, pH 7,5, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2%, sin NaCl. Si la relación A320/A260 permanece constante sustancialmente durante un periodo de 5 minutos (por ejemplo, si aumenta en no más de 0,04), entonces

10 esa muestra es adecuada para la cromatografía de exclusión por tamaño en gradiente salino o isocrática. Si la relación de A320/A260 aumenta más de aproximadamente 0,04 durante este periodo, entonces esa combinación DEAE-Fractogel se realiza preferiblemente en una cromatografía de exclusión por tamaño en gradiente salino para mejorar el rendimiento. La Tabla IV

15 proporciona protocolos y materiales ejemplares para el uso de cromatografía de exclusión por tamaño en gradiente salino. Tabla IV: Protocolos y materiales ejemplares para el uso de cromatografía de exclusión por tamaño en gradiente salino

Etapa: Procedimiento Intervalo Típico Valores preferidos

Etapa(I): Equilibrar la columna con el tampón de baja salinidad NaCl de 100 a 150 mM NaCl 130 mM

Etapa (ii): Generar gradiente salino en la parte superior de la columna NaCl de (100-150) a (400500) mM; volumen de lecho del 10 al 20% NaCl de 130 a 450 mM; volumen de lecho del 15%

Etapa (iii): Cargar la combinación DEAE en la columna Volumen de lecho del 10 al 20% Volumen de lecho del 15%

Etapa (iv): Eluir el adenovirus con solución de alta salinidad NaCl de 400 a 500 mM NaCl de 450 mM

Etapa (v): Completar la elución del virus NaCl de 400 a 500 mM NaCl de 450 mM

El método de purificación de la presente invención es adecuado para el

20 aumento de escala (o la disminución de escala) y para la contención a gran escala. Se pueden usar procedimientos y directrices adecuados bien conocidos en la técnica y seguir para controlar el virus y prevenir situaciones de riesgo biológico: véase, por ejemplo, “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 3ª Edición, editado por Richman y McKinney, U.S. Department of Health and Human Services, publicado por el Center for Disease Control and the National Institute of Health, Washington, Dc, U.S. Government Printing Office, Mayo 1993.

Los adenovirus son preferiblemente adenovirus recombinantes, pero pueden incluir aislados clínicos, cepas de vacunas atenuadas y así sucesivamente.

Por tanto, por ejemplo, un adenovirus recombinante ejemplar que puede purificarse mediante el método de la invención es ACN53, que se describe en la solicitud de patente PCT nº WO 95/11984.

En la primera etapa, el vector adenoviral ACN53 se purifica mediante cromatografía de intercambio aniónico en una columna DEAE. Para esto, el virus se propaga típicamente en 293 células renales, se cultiva y se somete a concentración y ultrafiltración. Se congela el concentrado y se almacena a aproximadamente -20ºC hasta su uso. El concentrado congelado se descongela, se purifica por filtración a través de un filtro de 0,45 μm, la conductividad de la preparación se ajusta a NaCl aproximadamente 250-360 mM y se somete a cromatografía DEAE. Las soluciones que se usan en la cromatografía se enumeran en la Tabla I.

En la segunda etapa, el vector adenoviral ACN53 se purifica por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna SuperdexRTM-200. Las fracciones seleccionadas que contienen virus se identifican mediante A260 o A280 y se combinan. Las fracciones combinadas constituyen el grueso de vector adenoviral ACN53 purificado que después se esteriliza por filtración a través de un filtro de 0,2 μm y se almacena a aproximadamente -20ºC.

El virus en la combinación DEAE-FractogelRTM puede ser inestable debido a la presencia de una alta concentración salina (NaCl aproximadamente 420 mM). Se procesa preferiblemente inmediatamente o se almacena a 4-12ºC durante no más de aproximadamente 24 horas.

Las fracciones del perfil de elución que muestran el pico del vector adenoviral ACN53 como se determina mediante A260 o A280 se agrupan para un procesamiento adicional. La combinación de exclusión por tamaño se filtra a través de un filtro de 0,2 μm. Este filtrado, el grueso de vector adenoviral ACN53 purificado final, se transfiere después a botellas de plástico estériles (por ejemplo Teflón) y se almacenan a aproximadamente -20ºC. Los controles en proceso para esta etapa se enumeran en la Tabla III.

El aumento de pureza del vector adenoviral ACN53 a cada etapa del método de purificación puede seguirse mediante HPLC de Resource Q (véase Huyghe et al., Human Gene Therapy, Vol. 6 (noviembre 1995), pág. 1403-1416 a pág. 1405). La calidad del virus en las primeras y segundas combinaciones cromatográficas también se controla mediante métodos espectroscópicos. Las características de la relación de A260/A280 es 1,23-1,31:1 para el virus purificado final. La dispersión de luz que es el resultado del alto peso molecular del virus deriva de la relación de A320/A260 nm y también se usa para controlar las combinaciones cromatográficas. Las partículas de virus libres purificadas presentan una relación de dispersión de luz de aproximadamente 0,22-0,30:1.

Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la presente invención. Los hospedadores y vectores y otros materiales seleccionados, la concentración de reactivos, las temperaturas y los valores de otras variables son sólo para ejemplificar como la presente invención puede realizarse y no deben considerarse limitaciones de la misma. EJEMPLOS EXPERIMENTALES

A. Purificación de Pequeña Escala de Adenovirus

(1): Cromatografía de Intercambio Aniónico (DEAE-Fractogel)

Una columna DEAE-EMD FractogelRTM 650 M (E. Merck), 5 x 18 cm, se pre-equilibró con 5 volúmenes de lecho (B.V.) de NaOH 0,5 M / NaCl 1 M seguida de 6 B.V. de HCl 0,1 M / NaCl 1 M y después por 20 B.V. de Tampón A (NaCl 265 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5) a un caudal lineal de 2 cm/min. El suministro para esta columna derivó de 2 litros de solución de virus en bruto congelada, que se descongeló, se microfiltró a través de una membrana de 0,45 μ y se ajustó con un pequeño volumen de NaCl 4 M a una conductividad igual a aquella del Tampón A. El suministro se cargó en la columna a un caudal lineal de 1 cm/min. La columna se lavó con 4 B.V. de Tampón A. La columna después se lavó con 8 B.V. de Tampón A al 94%/Tampón B al 6% (idéntico al Tampón A excepto porque el NaCl era 600 mM). La columna se eluyó con 30 B.V. de un gradiente lineal de Tampón A al 94%/Tampón B al 6% hasta Tampón B al 100%. Las fracciones que contenían virus sustancial se combinaron para formar el suministro (“combinación DEAE”) para la siguiente columna.

(2): Cromatografía de Exclusión por Tamaño Isocrática (SuperdexRTM-200) La cromatografía de exclusión por tamaño se realizó en una columna

SuperdexRTM-200 (Pharmacia) 5 x 73 cm, pre-equilibrada con 0,5 B.V. de NaOH 0,5 M, 1 B.V. de H2O y 2 B.V. de un Tampón C (NaCl 130 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2% (p/v), fosfato sódico 50 mM a pH 7,5) a un caudal lineal de 0,6 cm/min. El suministro que consistía de 220 ml de combinación DEAE se cargó en la columna. Se eluyó ACN53 con Tampón C a un caudal lineal de 0,6 cm/min. Las fracciones con virus sustancial se combinaron, se pasaron a través de un microfiltro de 0,2 μ y se almacenaron. El concentrado de virus puede almacenarse a baja temperatura, por ejemplo, a 0-10ºC, preferiblemente aproximadamente 4ºC o si el volumen es pequeño, por ejemplo, menos de aproximadamente 50 ml, congelado a -80ºC.

(3): Cromatografía de Exclusión por Tamaño en Gradiente Salino (a). Ensayo de Dilución Salina

La combinación DEAE-FractogelRTM (0,4 ml) se mezcló con un tampón que consistía en fosfato sódico 50 mM, pH 7,5, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2%, sin NaCl (0,8 ml) y se introdujo inmediatamente en una cubeta de cuarzo y se midió para la absorbancia a 260 y 320 nm en un espectrómetro UV equipado con una matriz de fotodiodos. Se repitió la lectura, sin retirar la muestra de la cubeta, a intervalos de 1-2 minutos durante un periodo de 5 minutos. Si la relación de A320/A260 era constante sustancialmente durante este periodo, entonces esa combinación DEAE-FractogelRTM era adecuada para cromatografía de exclusión por tamaño en gradiente salino o isocrática. Si la relación de A320/A260 aumentó más de aproximadamente el 4% durante ese periodo, entonces la combinación DEAE-FractogelRTM necesitó cromatografía de exclusión por tamaño en gradiente salino para mejorar el rendimiento.

(b): Cromatografía de Exclusión por Tamaño en Gradiente Salino

Se realizó cromatografía en gradiente salino en una columna SuperdexRTM-200, 2,6 cm x 60 cm, pre-equilibrada con 0,5 B.V. de NaOH 0,5 M, 1 B.V. de H2O y 2 B.V. de Tampón C (fosfato sódico 20 mM, pH 8,0, NaCl 130 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2%). Inmediatamente antes de cargar la combinación DEAE, un gradiente lineal de Tampón C al 100% a Tampón D al 100% (fosfato sódico 20 mM, pH 8,0, NaCl 420 mM, MgCl2 2 mM, sacarosa al 2%) de 0,5 B.V. (48 ml) se aplicó a la columna SuperdexRTM-200. El suministro que consistía en 20 ml de una combinación DEAE que no había superado el ensayo anterior se cargó en la columna y se eluyó con Tampón D a un caudal lineal de 0,6 cm/min. Las fracciones con virus sustancial que eluyen en o cerca del volumen hueco se combinaron, se pasaron a través de un filtro de esterilización y se almacenaron a -80ºC. El rendimiento de la etapa fue del 60% y la relación A320/A260 fue 0,24:1.

B. Purificación a Gran Escala de Adenovirus

(1) Cromatografía de Intercambio Aniónico

El concentrado de vial congelado de la etapa de fermentación y recuperación se descongeló y se filtró a través de una membrana Durapore hidrófila de 0,45 μm en una cápsula Millipore 10” Opticap. El filtrado se recogió en un tanque cerrado. Para minimizar las pérdidas, el cartucho de filtro se lavó con aproximadamente 1,5 l de tampón J-1 (fosfato sódico 50 mM de pH 7,5, cloruro sódico 265 mM, cloruro magnésico 2 mM, sacarosa al 2% (p/v)) complementado con solución J-3 al 5,4% (p/p) (cloruro sódico 4 M). La concentración salina del filtrado se ajustó añadiendo solución J-3 al 5,4% (p/v) (cloruro sódico 4 M). Esta solución de suministro se aplicó después a una columna FractogelRTM EMD DEAE-650 M (diámetro de 7 cm, altura de lecho 14,8 cm, volumen de lecho 570 ml) pre-equilibrado con tampón J-1 (fosfato sódico 50 mM de pH 7,5, cloruro sódico 265 mM, cloruro magnésico 2 mM, sacarosa al 2% (p/v)). El Adenovirus se une a la resina de intercambio aniónico, mientras que la mayoría de medios e impurezas de célula hospedadora pasan a través de la columna en la carga consumida. La columna se lavó inicialmente con 4 volúmenes de lecho de tampón J-1 seguido de un segundo lavado isocrático de 8 volúmenes de lecho de tampón J-1 al 94% y tampón J-2 al 6% (fosfato sódico 50 mM pH 7,5, cloruro sódico 600 mM, cloruro magnésico 2 mM, sacarosa al 2% (p/v) para eliminar impurezas adicionales. El virus se eluyó de la columna con un gradiente lineal de 30 volúmenes de lecho de tampón J-2 del 6% al 100%. El pico de adenovirus del perfil de elución como se determina mediante A280 se recogió y combinó para procesamiento adicional. Los controles en proceso y parámetros operativos para la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se resumen en la Tabla V. Tabla V: Control en Proceso y Parámetros Operativos para la Cromatografía de

Intercambio Aniónico

Tamaño de columna: 7 cm de diámetro, 14,8 cm de altura de lecho, 570 ml de volumen de lecho

Procedimiento de Purificación: Parámetro Valor

Todos los procedimientos: Temperatura 3 a 9ºC

Equilibrio: Caudal < 4 cm/min.

Procedimiento de Purificación: Parámetro Valor

Volumen pH del Efluente: 22 Volúmenes de Columna Igual al Tampón J-1 (7,4)

Carga: Caudal Conductividad del Suministro 1 cm/min. 28,2 ms

Lavado 1: Caudal Volumen 2 cm/min 4 Volúmenes de Columna

Lavado 2: Caudal Volumen 2 cm/min 8 Volúmenes de Columna

Elución: Caudal Volumen 2 cm/min 30 Volúmenes de Columna

Selección de Fracción: A280 Área de pico

(2) Cromatografía de Exclusión por Tamaño

La combinación DEAE se aplicó inmediatamente a una columna de exclusión por tamaño Superdex-200RTM (14 cm de diámetro, 77 cm de altura de lecho, 11,9 l de volumen de lecho) pre-equilibrada con tampón K-1 (fosfato

5 sódico 20 mM pH 8,0, cloruro sódico 100 mM, cloruro de magnesio 2 mM, sacarosa al 2% (p/v)). La columna se eluyó con tampón K-1. El pico de adenovirus del perfil de elución como se determina mediante A280 se recogió y se combinó. Esta etapa de cromatografía consiguió una separación e intercambio de tampón de impurezas de peso molecular bajo del producto

10 adenoviral. Los controles en proceso y los parámetros operativos de la etapa de cromatografía de exclusión por tamaño se resumen en la Tabla VI. Tabla VI: Control en Proceso y Parámetros Operativos para la Cromatografía de Exclusión por Tamaño

Tamaño de columna: 14 cm de diámetro, 77 cm de altura de lecho, 11,9 l de volumen de lecho

Procedimiento de Purificación: Parámetro Valor

Todos los procedimientos: Temperatura 3 a 9ºC

Equilibrio: Caudal Volumen 0,43 cm/min. 2,3 Volúmenes de Columna

Carga: Caudal Volumen Concentración 0,43 cm/min. ≤0,09 Volúmenes de Columna. 2,7 A280/ml

Elución: Caudal 0,43 cm/min

Procedimiento de Purificación: Parámetro Valor

Todos los procedimientos: Temperatura 3 a 9ºC

Volumen: 1,5 Volúmenes de Columna

Selección de Fracción: A280 Área de pico

(3) Filtración de 0,2 μm Final

La combinación Superdex 200RTM se filtró a través de una membrana

Durapore hidrófila de 0,2 μm (Stericup, Millipore) de 2 a 15ºC. Esta etapa se

realizó en condiciones estériles en una cámara de bioseguridad. Debido a que

5 se usaron de varios dispositivos de filtración, los filtros individuales se combinaron y después se dividieron en alícuotas en recipientes autoclavados. Los recipientes de sustancia farmacológica a granel en solución se congelaron en un baño de hielo seco/etanol y se almacenaron aproximadamente a -20ºC.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de purificación de adenovirus de una preparación viral, que

comprende las etapas sucesivas de: a) someter la preparación viral a cromatografía de intercambio aniónico, en la que el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de intercambio aniónico; y b) someter el eluato de la etapa a) que contiene el adenovirus a cromatografía de exclusión por tamaño, donde el adenovirus se eluye de un medio cromatográfico de exclusión por tamaño,

donde el medio cromatográfico de intercambio aniónico y/o el medio cromatográfico de exclusión por tamaño se pone en contacto con un tampón que comprende sacarosa al 2-16%.
2.

El método de la reivindicación 1, en el que la preparación viral es un lisado celular.
3.

El método de la reivindicación 2, en el que el lisado celular se filtra antes de la etapa a).
4.

El método de la reivindicación 2, en el que el adenovirus es recombinante.
5.

El método de la reivindicación 1, en el que el adenovirus es ACN53.
6.

El método de la reivindicación 1, en el que el medio de intercambio aniónico comprende grupos dimetilaminoetilo o grupos dietilaminoetilo en una estructura principal de poliestireno, poliacrilamida, celulosa o agarosa reticulados.
7.

El método de la reivindicación 1, en el que el medio de exclusión por tamaño comprende un polisacárido reticulado.
8.

El método de la reivindicación 7, en el que el polisacárido reticulado es una mezcla de dextrano y agarosa reticulados.
9.

El método de la reivindicación 1, en el que el medio cromatográfico de intercambio aniónico se lava intensamente antes de la etapa a).

5 10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende adicionalmente la elución del adenovirus del medio cromatográfico de exclusión por tamaño en un tampón de baja salinidad, en el que el medio de exclusión por tamaño está en una columna que contiene un gradiente salino que disminuye en fuerza iónica desde la parte superior de la columna hacia el fondo

10 de la columna.
11. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa de adición de glicerol a una fracción combinada que contiene el adenovirus.